KR20180056478A - 알레르기 비염 항원의 진단용 마이크로어레이 키트 및 이의 제조방법 - Google Patents

알레르기 비염 항원의 진단용 마이크로어레이 키트 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기판상에 고정된 2 이상의 단백질 항원; 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체를 검출하는 2차 항체 및 형광 프로브로 구성된 제제를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단용 마이크로어레이 키트 및 상기 키트를 이용한 알레르기 비염의 항원 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 알레르기 비염 항원의 진단용 마이크로어레이 키트는 높은 민감도와 정확도로 다양한 항원을 동시에 검사할 수 있으므로, 알레르기 비염의 진단 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

알레르기 비염 항원의 진단용 마이크로어레이 키트 및 이의 제조방법 {A microarray kit for diagnosing antigens causing allergic rhinitis and preparation method thereof}
본 발명은 기판상에 고정된 2 이상의 단백질 항원; 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체를 검출하는 2차 항체 및 형광 프로브로 구성된 제제를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단용 마이크로어레이 키트 및 상기 키트를 이용한 알레르기 비염의 항원 진단 방법에 관한 것이다.
알레르기 비염은 코 점막이 특정 물질에 대하여 과민반응을 나타내는 것으로, 알레르기를 일으키는 집먼지 진드기, 꽃가루, 곰팡이, 애완동물의 털, 비듬, 바퀴벌레의 허물, 배설물 등의 원인 물질(항원)이 코 점막에 노출된 후, IgE 항체를 매개로 하는 여러 종류의 염증세포에 의하여 염증반응이 발생하는 질환이다. 연속적으로 일어나는 발작적인 재채기, 맑은 콧물, 코막힘 등의 세 가지 주요 증상을 특징으로 한다. 이러한 증상을 나타내며 IgE 매개 염증 반응이 확인되면 알레르기 비염으로 진단할 수 있다. 알레르기 비염은 평생 동안 지속되는 예가 많아서 적절한 예방과 치료가 중요하다. 알레르기 비염이 장기간 지속될 경우 만성 비염과 비슷한 변화를 보이게 되고, 중이염, 비용종, 부비동염 후각소실, 만성기침 등을 초래할 수 있으므로, 원인이 되는 물질을 피하는 환경요법(회피요법)은 가장 기본적이고 중요한 치료법으로 인식되고 있다.
이에 따라, 알레르기 비염이 의심되는 환자에서 질환을 야기하는 원인물질을 규명하기 위한 다양한 진단법이 이용되고 있다. 생체검사로는 피부반응검사, 항원유발검사 등이 수행되고 있는데, 이 중에서 피부반응검사는 반응성 유무로 원인물질을 규명할 수 있는 간편하면서도 경제적이고 진단적 가치가 높은 검사법으로 알려져 있다. 그러나, 피부 반응성이 떨어지는 영아나 노인, 약물의 사용으로 피부반응이 감소한 환자, 심한 습진, 두드러기 환자에게 적용하기 어려우며, 일중변동, 계절의 변화, 검사를 받는 부위에 영향을 받는 단점이 있었다.
이러한 단점을 극복하기 위하여, 최근에는 혈청 내 존재하는 항원 특이 IgE를 측정하는 방법이 사용되고 있다. 구체적으로, 한 종류의 항체를 선택하여 검사하는 방식의 방사선알레르기 흡착검사(radioallergosorbent test, RAST) 및 여러 종류의 항원를 한꺼번에 검사하는 다중 알레르기항원 검사법(multiple allergen simultaneous test, MAST) 등이 개발되어 사용되고 있다.
MAST 방식은 RAST 방식에 비해 동위원소를 사용하지 않고 비용이 저렴하다는 장점 때문에 가장 많이 사용되었으나, 주요 항원에 대한 낮은 민감도와 비교적 많은 혈청을 필요로 한다는 점, 오랜 검사시간이 소요되는 점 등이 문제점으로 지적되었다. 이에 따라, 여러 종류의 항원을 높은 민감도와 정확도로 동시에 진단할 수 있는 새로운 진단 방법의 개발이 필요한 실정이었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 알레르기 비염 항원의 진단 방법을 개발하고자 예의 노력연구한 결과, 검사의 표준으로 사용될 수 있는 35종의 단백질 항원을 포함하는 항원 진단 마이크로어레이 키트를 개발하였고, 이는 상기 복수의 항원에 대한 IgE 항체의 반응을 높은 민감도와 정확도로 동시에 검출할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 기판상에 고정된 2 이상의 단백질 항원; 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체를 검출하는 2차 항체 및 형광 프로브로 구성된 제제를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단용 마이크로어레이 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 상기 키트를 사용하여, 알레르기 비염 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 단백질 항원 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 측정된 반응 수준을 대조군 항원에 특이적으로 결합한 항체의 반응 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 기판상에 고정된 2 이상의 단백질 항원; 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체를 검출하는 2차 항체 및 형광 프로브로 구성된 제제를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단용 마이크로어레이 키트를 제공한다.
본 발명의 용어, "항원"은 '알러젠(allergen)'으로도 불리는, 알레르기 또는 특이과민증을 야기하는 물질을 의미한다. 비단백질 또는 단백질 등의 다양한 물질이 알러젠이 될 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 항원은 알레르기 비염을 야기하는 단백질일 수 있으며, 구체적으로 하나 이상의 에피토프(epitope)를 포함하며, 3차 이상의 구조를 갖는 단백질일 수 있다. 또한, '단백질 항원'과 동일한 의미로 혼용되어 명명될 수 있다.
상기 항원은 용이하게 입수 가능한 공지의 항원일 수 있고, 또는 물질의 추출물 형태일 수 있다. 구체적인 예로, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus Fumigatus), 클라도스포리오이데스(Cladosporioides), 칸디다 알비칸스(Candida Albicans), 알타나리아 알타나타(Alternaria Alternata), 알타나리아 테누이스(Alternaria Tenuis), 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides Farinae), 세로무늬진드기(Dermatophagoides Pteronyssinus), 개 비듬(Dog Dander), 고양이 비듬(Cat dander), 바퀴벌레(Blattella Germanica), 우산잔디(Bermuda), 아카시아(Acacia), 밀가루(Pane), 민들레(Dandelion), 재배호밀(Rye Cultivated), 자작나무(Birch), 쑥(Altermisia Vulgaris), 재(Ash), 계란(Egg White) 또는 우유(Milk Bovine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 키트는 상기 단백질 항원을 선택하여 포함하거나, 또는 이를 모두 포함할 수 있다.
또한, 상기 단백질 항원은 한국인 특이적인 것일 수 있다. 전술한 상기 항원은 한국에서 흔히 존재하는 알러젠이므로, 이를 포함하는 본 발명의 키트는 한국인에게서 호발하는 대부분의 알레르기 비염 항원을 진단할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질 항원은 기판상에 고정된 형태일 수 있으며, 상기 고정은 공유결합 또는 비공유결합을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 용어, "기판"은 단백질 항원이 위치하는 지지체를 의미하며, 구체적인 예로, 슬라이드, 시트, 마이크로 플레이트(microplate), 마이크로석 플레이트(microtitre plate), 트레이, 멤브레인, 파이버, 웰(well), 펠렛, 로드(rod), 스틱(stick), 튜브 또는 비드가 될 수 있다. 또한, 상기 기판은 플라스틱, 유리, 실리콘, 세라믹 또는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 셀룰로오스(cellulose) 또는 니트로셀룰로오스(nitrocellulose)의 소재로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가장 구체적인 예로, 상기 기판은 유리 슬라이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "1차 항체"는 특정 항원을 특이적으로 인식하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 1차 항체는 알레르기 비염 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 포함된 IgE일 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"는 전혈, 혈청 또는 혈장을 들 수 있으며, 더욱 구체적으로 혈청일 수 있으나, 알레르기 비염의 항원에 결합하는 IgE를 포함하고 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 알레르기 비염의 항원 진단용 마이크로어레이 키트는, 상기 단백질 항원; 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체의 항원-항체 반응을 검출할 수 있는데, 상기 항원-항체 반응은 2차 항체 및 형광 프로브로 구성된 제제에 의하여 검출될 수 있다.
본 발명의 용어, "2차 항체"는 항체를 인식하여 결합하는 항체를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, IgA, IgD, IgE, IgM, IgG, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 등의 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 2차 항체는 상기 1차 항체에 결합하는 항체를 의미할 수 있으며, 구체적으로 바이오틴(Biotin)이 접합된 항-IgE일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어, '접합'은 결합되어 부착되는 것을 의미하며, 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 용어, "프로브"는 항원-항체 반응을 검출하는 탐침자를 의미하며, 본 발명의 목적상, 상기 단백질 항원과 이에 결합한 1차 항체의 항원-항체 반응을 검출하는 형광 탐침자일 수 있다.
구체적인 예로, 알렉사 플루오르488(Alexa Fluor 488), 알렉사 플루오르 555(Alexa Fluor 555), R-피코에리쓰린(R-phycoerythrin), 아쿠아(Aqua), 텍사스-레드(Texas-Red), FITC, 로다민(rhodamine), 로다민 유도체(rhodamine derivative), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 유도체(fluorescein derivative), 케스케이드 블루(cascade blue), Cy5 또는 Cy3 등의 형광물질(fluorescer) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 가장 구체적인 예로, 스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 Cy3가 접합된 형태의 형광 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "알레르기 비염"은 코 점막이 특정 물질에 대하여 과민반응을 나타내어, 연속적인 재채기, 계속 흘러 내리는 맑은 콧물, 코막힘, 가려움증 등의 증상을 보이는 질환을 의미한다. 원인이 되는 물질, 즉 알러젠을 피하는 환경요법 또는 회피요법이 주 치료법으로 사용되고 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 확보한 총 35종의 알레르기 비염 검사용 항원을 유리 슬라이드에 고정하여 마이크로어레이 기반의 항원 칩 키트를 제작하였다(도 1 및 2). 이후, 상기 항원에 결합한 알레르기 비염 환자의 혈청에 포함된 IgE를 검출하기 위하여, 상기 IgE에 결합하는 항-IgE 항체 및 Cy3 형광물질을 사용하였고, 형광의 검출에는 바이오틴-스트렙타비딘(Biotin-Streptavidin)을 이용한 신호 증폭 방법을 이용하였다(도 3). 제작한 상기 키트는, 기존 항원 진단 검사 방법인 MAST 또는 피부 단자 검사와 80% 이상의 상관도를 보임을 확인하였고(도 5 및 6,) 또한 ImmunoCAP과 유사한 민감도를 가지고 알레르기 비염 항원을 진단할 수 있음을 확인하였다(도 7). 이는, 본 발명의 키트는 알레르기 비염을 유발하는 항원을 식별하는데 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태는 (a) 상기 키트를 사용하여, 알레르기 비염 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 단백질 항원 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 측정된 반응 수준을 대조군 항원에 특이적으로 결합한 1차 항체의 반응 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단 방법을 제공한다.
이때, 상기 용어 "항원", "1차 항체" 및 "알레르기 비염"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 항원-항체 반응을 측정하는 상기 (a) 단계는 광학적 검출법에 의해 수행될 수 있으며, 구체적인 예로, 형광 측정법(fluorescence measurement)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 반응 수준이 대조군 항원에 대한 것보다 증가하는 경우, 해당 항원을 알레르기 비염의 항원으로 판단할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이 키트는 높은 민감도와 정확도로 다양한 알레르기 비염 항원을 동시에 검사할 수 있으므로, 알레르기 비염의 진단 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 키트 제작에 사용된 유리 기판의 모습을 보여주는 이미지이다.
도 2는 본 발명의 키트 제작에 사용된 35종의 항원 및 상기 항원의 스포팅(spotting) 형태에 관한 것이다.
도 3은 본 발명의 키트를 이용한 알레르기 비염 항원의 진단 어세이 과정을 보여주는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 키트를 이용하여 환자의 시료를 검사한 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명의 키트를 이용한 항원의 진단과 MAST와의 상관성, 또는 SPT와의 상관성을 분석한 결과를 보여주는 그래프로, a는 진드기의 일종인 Dp(Derm pteronyssinus) 항원, b는 Df(Derm farinae) 항원에 관한 것이다.
도 6은 본 발명의 키트를 이용한 항원의 진단과 MAST와의 상관성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. 진드기의 일종인 Dp(Derm pteronyssinus) 또는 Df(Derm farinae) 항원에 대하여 분석하였다.
도 7은 본 발명의 키트를 이용한 항원의 진단과 MAST와의 상관성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. 자작나무(Birch-aldermix), 개의 비듬(Dog), 쑥(Mugwort), 곰팡이류(Alternaria alternata), 바퀴벌레(Cockroach), 고양이의 비듬(Cat), 환삼덩굴(Japanesehop), 서양민들레(Dandelion), 갈대(reed) 항원에 대하여 분석하였다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알레르기 비염 항원의 확보
알레르기 비염을 유발하는 항원을 진단하는 키트를 개발하기 위해, 먼저 검사용 항원을 확보하였다.
구체적으로, 항원의 품질을 유지할 수 있도록 상용화된 항원을 (주)원메디칼 사로부터 수급하였다. 이후, 확보한 항원의 반응성을 확인하기 위하여, 기존에 존재하는 제작된 마이크로어레이를 이용하여 IgE 검출 반응을 확인하였다. 이때, 항원 선정 조건으로서 검출 민감도가 높고, 교차반응(cross-reactivity)이 낮고, 표면 고정화 효율이 높고, 백그라운드 시그널이 낮은 특성을 우선으로 하였다.
또한, 한국 식품의약품안전처의 체외진단 의료기기 관련 규정 및 건강보험 요양 급여 기준을 참고로 하여 검사할 항원의 수를 총 35종으로 결정하였으며, 가천대학교병원과 랩지노믹스의원 검사센터에서 검사를 수행하여 얻어진 결과를 분석하여 한국인에게 가장 호발하는, 검사 대상이 되는 항원의 종류를 선정하였다.
그 결과, 키트 개발에 사용할 총 35종의 알레르기 비염 검사용 항원을 확보할 수 있었으며, 그 종류는 하기 표 1에 나열하였다.
키트의 개발에 사용한 항원의 종류
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1 Derm. pteronyssinus (Dp) 진드기 COM
2 Derm. farinae (Df) 진드기 COM
3 Alternaria alternata 곰팡이류 COM
4 Cladosporium(herbarum) 곰팡이류 COM
5 Aspergillus fumigatus 곰팡이류 COM
6 Dog 개 비듬 COM
7 Cat 고양이 비듬 COM
8 Milk 우유 COM
9 Mugwort 쑥 COM
10 OaK white 참나무 COM
11 Cockroach 바퀴벌레 COM
12 Ragweed, short 돼지풀 COM
13 Rye pollens 호밀풀 COM
14 Housedust 집먼지 COM
15 Crab 게 COM
16 Shrimp 새우 COM
17 Japanesehop 환삼덩굴 COM
18 Birch-aldermix 자작나무 COM
19 Bermuda grass 우산잔디 IHN
20 Acacia 아카시아 IHN
21 Japanese cedar 일본삼나무 IHN
22 Goldenrod 미역취 국화 IHN
23 Timothy grass 큰조아재비 IHN
24 Oxeye daisy 불란서 국화 IHN
25 Pigweed 털비름 IHN
26 Sycamore mix 플라타너스 IHN
27 Orchard grass 오리새 IHN
28 Ash mix 서양물푸레나무 IHN
29 Hazelnut 개암 IHN
30 Egg 달걀 COM
31 Dandelion 서양민들레 IHN
32 soybean 대두 COM
33 peach 복숭아 COM
34 reed 갈대 IHN
35 sallow willow 수양버들 IHN
실시예 2. 마이크로어레이 기반의 진단 키트의 설계 및 제작 방법
상기 실시예 1을 통해 확보한 항원을 이용하여 알레르기 비염 항원의 진단용 키트를 개발하고자, 이에 사용될 다양한 유리 기판을 테스트하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 다양한 작용기로 기능화된 유리 기판을 활용하여 고정화 성능, 에세이 성능을 평가하였다. 이때, 유리 기판 선정 조건으로서 항원의 표면 고정화 효율이 높고, 백그라운드 신호(background signal)가 낮은 특성을 우선으로 하였다.
그 결과, SCHOTT-H 슬라이드(Germany)가 가장 좋은 성능을 보임을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 SCHOTT-H 슬라이드 및 상기 실시예 1을 통해 선발한 35종의 항원을 이용하여 알레르기 비염 항원의 진단용 키트를 설계하였다.
구체적으로, 첨부 문서(문서 번호 : LabG-Allergen Chip-SOP001, 문서명 : 항원 칩 제작 SOP)에 설명된 바에 따라 키트를 제작하였다.
실시예 3. 항원의 진단 키트을 활용한 IgE 검출 에세이 프로토콜 개발
상기 실시예 2를 통해 제작한 항원의 진단 키트를 활용하여, 알레르기 비염 항원의 진단 프로토콜을 개발하고자 하였다.
구체적으로, 항원에 결합한 IgE 항체를 검출하기 위해, 민감도가 높은 형광을 이용하였다. 형광 물질로서 PE, TRITC 또는 Cy3 등을 테스트한 결과, Cy3가 가장 적절함을 확인하였으며, 형광의 검출 방법으로서 샌드위치 어세이(sandwich assay), 바이오틴-스트렙타비딘(Biotin-Streptavidin) 검출법 등을 테스트한 결과, 바이오틴-스트렙타비딘을 이용한 신호증폭 방법이 가장 적절함을 확인하였다.
이후, 하기 표 2 및 도 3에 정리한 바에 따른 과정을 갖는 프로토콜을 개발하였다.
Figure pat00001
구체적으로, 상기 표 2에 기재된 1 내지 4단계를 수행하였으며, 더욱 구체적으로 하기 (a) 내지 (i)단계를 수행하였다.
(a) 칩 웨팅(wetting) 및 항원 세척 단계: PBST(0.1% tween 20) 60㎕를 10분 동안 처리하여 칩을 세척하고, 30㎕만을 제거하였다.
(b) 블로킹 단계: 상기 칩에 4% BSA 30㎕를 처리하여 60분 동안 교반하였다
(c) 세척 단계: 상기 칩에 PBST(0.1% tween 20) 200㎕를 넣어 원래 용액을 제거하였다. 상기 용액의 60㎕를 제거하고, PBST 60㎕를 넣는 과정을 반복하였고, 짝수 번째의 반응 시간은 2분으로 하였다. 마지막으로, 상기 용액의 30㎕를 제거하였다.
(d) 혈청 처리 단계: 환자의 혈청 샘플 30㎕을 처리하여 섞어준 뒤, 60분 동안 교반하였다.
(e) 세척 단계: 상기 (c)의 세척 단계와 동일하게 진행하였다.
(f) 항체 처리 단계: 바이오틴이 접합된, PBST(0.1% tween 20) 및 0.4% BSA 버퍼가 포함된 용액을 이용하여 2x 이차 항체를 1:500의 농도로 희석하였고, 상기 희석된 항체 30㎕를 처리하고, 60분 동안 교반하였다.
(g) 세척 단계: 상기 (c)의 세척 단계와 동일하게 진행하였다.
(h) SA-Cy3 처리 단계: PBST(0.1% tween 20) 및 0.4% BSA 버퍼가 포함된 용액을 이용하여 2x SA-Cy3 형광물질을 1:500의 농도로 희석하였고, 상기 희석된 형광물질 30㎕를 처리하고, 60분 동안 교반하였다.
(i) 세척 단계: 상기 (c)의 세척 단계와 동일하게 진행하였다. 단, 반응 시간은 5분으로 하였고, 마지막으로 증류수로 2번 세척하였다.
실시예 4. 진단 키트의 성능 평가
실시예 4-1. 기존 키트와의 성능 비교
상기 실시예 2을 통해 제작한 항원의 진단 키트의 성능을 평가하기 위하여, 타사의 항원 칩(RayBiotech)과 그 성능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에 따른 어세이 진행 후, 형광 스캐너로 스캔하여 각 위치(spot)의 결과값을 확인하고 이로부터 혈중 IgE를 정량하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 항원 칩은 위-양성(false positive) 반응을 나타내지 않으며, 약 3시간 정도의 짧은 시간으로 검사를 수행할 수 있음을 확인하였다. 또한, 35종의 항원 중에서도, 특히 곰팡이류의 아스페르길루스 푸미가투스(Asp. Fumigatus), 클라도스포리오이데스(Cladosporioides), 칸디다 알비칸스(Candida Albicans), 알타나리아 알타나타(Alternaria Alternata), 알타나리아 테누이스(Alternaria Tenuis), 진드기류의 큰다리먼지진드기(D. Farinae), 세로무늬진드기(D. Pteronyssinus), 개 비듬(Dog Dander), 고양이 비듬(Cat dander 또는 Gatto Forfora), 바퀴벌레(Cockroach 또는 Blattella Germanica), 우산잔디(Bermuda), 아카시아(Acacia), 밀가루(Pane), 민들레(Dandelion), 재배호밀(Rye Cultivated), 자작나무(Birch), 쑥(Altermisia Vulgaris Mugwort), 재(Ash), 계란(Egg White), 우유(Milk Bovine) 등의 항원에 대하여 반응을 나타냄을 확인하였다.
반면에, 타사의 항원 칩에서는 3종의 항원에 대하여 위-양성이 검출되고, 챔버의 수가 많으면 수동 어세이(manual assay)를 수행하기에 어려우며, 약 9시간의 긴 시간이 소모됨을 확인하였다.
실시예 4-2. 기존 검사와의 상관성(correlation) 평가
실시예 4-2-1. MAST(multiple allergen simultaneous test), SPT(Skin prick test)와의 비교
제작한 항원 칩의 성능을 평가하기 위하여, 항원 칩의 IgE 항체 검출 능력을 평가하였다.
구체적으로, 알레르기 비염 환자로부터 분리한 혈청을 시료로 사용하였다. 환자의 시료는 양성과 음성이 고루 분포되도록 설정하였으며, 각각 50개 이상의 시료를 사용하였다. 특히, 알레르기 항원 중에서 발병 빈도가 높은 집먼지 진드기(house dust mite)에 대해서는 양성 검체가 10개 이상 포함되도록 하였다.
이후, 면역블롯(Immunoblot) 방식의 MAST(Advansure Alloscreen; LG Life Science, Seoul, Korea) 또는 피부 반응 시험(SPT)과의 검출 반응 성능을 비교하였다. 이때, 본 발명의 항원 칩에 의해 검출된 항원-항체 반응은 20000 이상의 신호 강도(Signal intensity)를 나타낸 경우에 양성, 및 MAST 또는 SPT에 의해 검출된 항원-항체 반응은 2 내지 3의 신호 강도를 나타내는 경우에 양성이라고 판단하였다. 또한, Dp(Derm pteronyssinus) 또는 Df(Derm farinae) 항원에 대한 인간 IgE 표준 물질을 단계적으로 희석하여, 최소 검출 농도를 통해 분석적 민감도를 분석하였고, 음성 검체를 이용하여 분석적 특이도를 분석하였다.
그 결과, 도 5의 a에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 항원 칩에 의해 검출된 Dp 항원에 대한 항체 반응은, MAST 또는 SPT에 의해 검출된 Dp 항원-IgE 항체 반응과 관련성이 높음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 항원 칩에 의해 검출된 Df 항원에 대한 항체 반응은, MAST 또는 SPT에 의해 검출된 Df 항원-IgE 항체 반응과 관련성이 높음을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 항원 칩은 기존의 진단 방법인 MAST 또는 피부 단자 검사 모두와 80% 이상의 상관도를 보임을 알 수 있었다.
실시예 4-2-2. MAST, ImmunoCAP과의 비교
제작한 항원 칩의 성능을 평가하기 위하여, 항원 칩의 IgE 항체 검출 능력을 평가하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 항원 칩은 MAST보다 ImmunoCAP과 더 높은 상관도를 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한, 도 7에서 볼 수 있듯이, 자작나무, 개, 쑥, 곰팡이류, 바퀴벌레, 고양이, 환삼덩굴, 서양민들레, 갈대 등의 다른 항원에 대해서도 ImmunoCAP과 높은 상관도를 가지고 있음을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 항원 칩은 ImmunoCAP과 유사한 민감도를 가지며, 여러 알레르기 비염 항원에 대한 항체 반응을 동시에 검출할 수 있으므로, 알레르기 비염을 유발하는 항원을 식별하는데 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 기판상에 고정된 2 이상의 단백질 항원; 및 이에 특이적으로 결합한 1차 항체를 검출하는 2차 항체 및 형광 프로브로 구성된 제제를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단용 마이크로어레이 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 항원은 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus Fumigatus), 클라도스포리오이데스(Cladosporioides), 칸디다 알비칸스(Candida Albicans), 알타나리아 알타나타(Alternaria Alternata), 알타나리아 테누이스(Alternaria Tenuis), 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides Farinae), 세로무늬진드기(Dermatophagoides Pteronyssinus), 개 비듬(Dog Dander), 고양이 비듬(Cat dander), 바퀴벌레(Blattella Germanica), 우산잔디(Bermuda), 아카시아(Acacia), 밀가루(Pane), 민들레(Dandelion), 재배호밀(Rye Cultivated), 자작나무(Birch), 쑥(Altermisia Vulgaris), 재(Ash), 계란(Egg White) 및 우유(Milk Bovine)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 1차 항체는 알레르기 비염 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 포함된 IgE인 것인, 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 시료는 혈청인 것인, 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제제는 상기 항원 및 이에 특이적으로 결합한 항체의 항원-항체 반응을 검출하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 2차 항체는 바이오틴(Biotin)이 접합된 항-IgE인 것인, 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 형광 프로브는 스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 Cy3가 접합된 형태인 것인, 키트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단백질 항원은 한국인 특이적인 것인, 키트
  9. (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 키트를 사용하여, 알레르기 비염 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 단백질 항원 및 이에 특이적으로 결합한 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 측정된 반응 수준을 대조군 항원에 특이적으로 결합한 항체의 반응 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알레르기 비염의 항원 진단 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 알레르기 비염 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 포함된 IgE인 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈청인 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 반응 수준이 대조군 항원에 대한 것보다 증가하는 경우, 해당 항원을 알레르기 비염의 항원으로 판단하는 것인, 방법.
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