KR20030004923A

KR20030004923A - 알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법

Info

Publication number: KR20030004923A
Application number: KR1020010040678A
Authority: KR
Inventors: 노건웅
Original assignee: (주)푸드바이오테크
Priority date: 2001-07-07
Filing date: 2001-07-07
Publication date: 2003-01-15
Also published as: EP1417486A4; US20040175330A1; EP1417486A1; JP2004533625A; KR100488131B1; WO2003005027A1; CN1527940A

Abstract

본 발명은 알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출 방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 칩은 여러 종류의 알레르기 유발원으로부터 추출한 각각의 조단백을 고형의 기판 상의 각 점에 부착시킨 것이다. 상기 기판을 알레르기 질환 환자로부터 얻은 검체와 반응시킴으로써, 여러 종류의 알레르기 유발원을 동시에 검출할 수 있으며, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류까지 검출할 수 있다.

Description

알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출 방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법 {Protein chip for diagnosis allergy and detecting method for allergen and antibody}

인체에 존재하는 면역 체계는 외부로부터 들어오는 이물질 등의 항원을 제거하도록 항체를 만들어낸다. 알레르기는 이 항원 항체 반응이 과민하게 나타나는 결과로, 대부분의 사람에게는 해롭지 않은 특정한 이물질에 대해 어떤 사람은 항체를만들어 냄으로써 나타나는 증상이다. 알레르기를 유발하는 항원이 인체 내로 침투하면, 이에 반응하여 항체들이 대량 생산되는데, 이들 항체로 직접 알레르기를 유발하는 IgE와 알레르기 유발을 억제하는 것으로 알려진 IgG₄및 일반 면역 반응을 유도하는 것으로 알려진 IgG 항체 등이 있다. 이들 항체 간의 상호 작용에 의해 기관지의 수축과 모세 혈관의 팽창이 유발되어 분비샘이 자극되고, 기침과 콧물 등의 알레르기 증상이 나타나게 된다. 알레르기에 의한 질환은 호흡기 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 아토피 피부염 및 접촉성 피부염 등이 있다.

알레르기의 치유 방법으로 항히스타민제 등을 이용하는 약물 요법 등이 있으나, 이는 일시적인 치료에 불과하며 부작용의 우려가 있다. 가장 바람직한 방법은 면역 기능을 강화하고, 항원이 될 수 있는 물질을 차단하는 것이다. 따라서 알레르기의 치유를 위해서는 알레르기 유발 물질의 검출이 무엇보다 중요하다.

기존에 일반적으로 행해지고 있는 알레르기 유발에 대한 검사 방법으로, 피부 반응 검사, 유발 검사 및 혈액 검사 등이 있다. 피부 반응 검사는 알레르기를 일으키는 물질을 피부에 직접 반응시켜 알레르기 반응이 나타나는지를 보는 검사이다. 이 방법은 간편하며 민감도가 높아 널리 사용되고 있으나, 환자가 심한 습진을 가졌거나 또는 항히스타민제 등 약제를 복용한 경우 피부 반응성을 저해하며, 효율적인 치료에 있어 중요한 정량적 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다.

유발 검사는 알레르기 유발원을 직접 사람의 눈, 코 및 기관지 내에 적용시켜 보거나 직접 섭취하여 반응을 관찰하는 방법이다. 이 방법은 환자에게 부담을줄 수 있는 검사이기 때문에 제한적으로 실시되고 있다.

혈액 검사는 혈액 내 총 호산구(eosinophil) 수와 IgE 수치 등을 측정하는 방법이다. 특히, FAST(Fluoroallergosorbent test) 등의 검사법은 환자의 피부나 투약 상태에 상관없이 정성 및 정량 분석이 가능하다. 그러나 이 방법은 검사할 수 있는 항체 종류가 한정되어 있으며, 피부 반응 검사에 비해 민감도가 떨어지고 가격이 비싸다는 단점을 안고 있다.

한편, 최근 활발히 개발 중인 단백질 칩은 질병 관련 단백질을 효율적으로 검색할 수 있게 하는 기술로 각광받고 있다. 대부분의 단백질 칩은 고형의 기판 상의 한 점(spot)에 하나의 순수 단백질만이 점적된 것이 보통이다. 그러나 알레르기의 경우 알레르기 유발원에 함유된 모든 조단백(crude protein)이 알레르기를 유발할 수 있기 때문에, 특정한 단백질 한 개만에 의한 검출로는 알레르기 유발 원인 검출으로서의 유용성이 없다.

이와 같이 기존의 방법은 하나의 알레르기 유발원에 대하여 그 유발 여부만을 조사하는 것이므로, 실제로 모든 알레르기를 유발하는 원인을 종합적으로 알아낼 수 없었다. 또한 기존의 방법은 알레르기를 유발하는 여러 가지 항체 중 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기에 직접 관여하는 구체적인 항체를 검사하는 것이 불가능하였다. 그러므로 알레르기를 효과적으로 진단하기 위해서는, 여러 종류의 알레르기 유발원을 동시에 검출하고, 또한 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관여하는 항체의 종류를 동시에 검사하여 정확한 원인을 밝힐 수 있게 하는 검출 방법이 요구되고 있다.

이에 본 발명은 동시에 여러 종류의 알레르기 유발원로부터 환자에게 알레르기를 유발할 수 있는 원인을 검출하게 하며, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 검출할 수 있게 하는 단백질 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 우유, 달걀 흰자, 달걀 노른자, 대두, 생마늘, 인공 위장관액을 처리한 익힌 마늘, 현미 및 율무로부터 추출한 조단백들을 SDS-PAGE 한 후 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 도이다.

도 2는 우유, 달걀 흰자, 달걀 노른자, 대두, 생마늘, 인공 위장관액을 처리한 익힌 마늘, 현미 및 율무로부터 추출한 조단백들에 대해 알레르기성 피부염 환자의 혈청을 사용하여 웨스턴 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명의 단백질 칩은 알레르기 유발원으로부터 추출한 각각의 조단백을 고형의 기판 상의 각 점에 부착시켜 만든다. 이렇게 만든 칩을 환자로부터 채취한 혈액 또는 체액 등의 검체와 반응시켜 알레르기 유발원을 검출하고, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 확인한다.

본 발명의 단백질 칩에 부착하는 조단백은 집먼지 진드기, 꽃가루, 동물의 털, 미생물을 포함하여 육류, 콩류, 곡물류, 구황식물류, 해물류, 버섯류, 채소류, 과일류, 유제품, 달걀 등 알레르기를 유발할 가능성이 있는 유기물로부터 추출한 조단백을 사용한다.

알레르기 유발원에 함유된 모든 단백질은 순수 단백질 뿐 아니라 비단백질계 질소 화합물을 모두 포함하여 알레르기를 유발할 수 있기 때문에, 정확한 진단 결과를 위해 본 발명에서는 한 알레르기 유발원이 함유한 모든 단백질을 포함하는 조단백을 고형의 기판 상의 한 점에 점적한다. 본 발명의 단백질 칩에 부착하는 조단백은 중성 염 용액, 에탄올, 약산 및 PBS 완충액(phosphate buffered saline)에 녹는 단백질들을 혼합한 것을 사용한다. 이렇게 함으로써 본 발명의 단백질 칩은 알레르기를 일으킬 가능성이 있는 유발원 내에서 알레르기를 유발할 수 있는 모든 조단백을 칩 상의 한 점 내에 부착시킬 수 있다.

본 발명의 단백질 칩에 부탁하는 조단백은 식품의 경우 날것과 함께 가공 또는 소화 과정을 거친 것을 각각 준비한다. 식품에 의한 알레르기는 식품의 원래 상태 뿐 아니라 실제로 섭취하기 위해 조리하거나 체내에서 소화된 상태에 의해서도 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 칩에 고정되는 조단백은 날것 상태의 식품으로부터 추출된 것과, 가열 과정 및 인공 위장관 액 처리 등의 생화학적 공정을 통해 실제로 알레르기를 유발할 수 있는 상태로 변형된 상태의 식품으로부터 추출된 것을 모두 사용한다.

본 발명에서 인공 위장관 액을 식품에 처리하는 과정은 다음과 같다. 날것 상태의 식품을 펩신(pepsin) 0.842㎎/㎖ , 염화나트륨(sodium choloride) 2.0㎎/㎖ , pH 1.2의 조성으로 이루어진 인공 위장관 액에 1:200(w/w)으로 혼합한 후, HCl을 첨가하여 37.5℃에서 30분간 처리한다. HCl의 작용을 중단시키기 위해 HCl과 동량으로 10M NaOH를 넣어 99℃에서 10분간 처리한다. 처리한 항원과 50㎎/㎖ 농도의 트립신(trypsin)의 비율이 1:200이 되도록 하여 37.5℃에서 처리한 후, 반응을 중단시키기 위해 99℃에서 10분간 처리한다.

본 발명에서 알레르기 유발원으로부터 조단백을 분리하는 과정은 다음과 같다. 대상 물질을 동결 건조 후 분말화시키고, 헥산(hexane)을 처리한 후펠렛(pellet)을 얻어 건조한다. 헥산 처리 과정을 2회 더 반복하여 시료로부터 지질을 제거한다.

얻은 분말을 0.5M NaCl의 중성 염 용액과 혼합하여 용출한 후 원심 분리하여 상층액을 얻고, 이를 증류수로 투석하여 동결 건조함으로써 중성 염 용액에 녹는 단백질을 얻는다.

상기 과정에서 상층액과 분리된 펠렛에 증류수를 첨가하여 용출한 후 원심 분리하여 다시 잔유물을 제거한 펠렛을 얻는다. 이를 70% 에탄올과 혼합하여 용출한 후 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 증류수로 투석하여 동결 건조함으로써 에탄올에 녹는 단백질을 얻는다.

상기 과정에서 상층액과 분리된 펠렛에 증류수를 첨가하여 용출한 후 원심 분리하여 다시 잔유물을 제거한 펠렛을 얻는다. 이를 1% 아세트산과 혼합하여 용출한 후 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 증류수로 투석하여 동결 건조함으로써 약산에 녹는 단백질을 얻는다.

상기 과정에서 상층액과 분리된 펠렛에 증류수를 첨가하여 용출한 후 원심 분리하여 다시 잔유물을 제거한 펠렛을 얻는다. 이를 PBS 완충액과 혼합하여 용출한 후 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 증류수로 투석하여 동결 건조함으로써 PBS 완충액에 녹는 단백질을 얻는다.

상기 각 단계에서 얻은 단백질을 모두 혼합한 것을 본 발명에서 사용하는 조단백으로 한다. 조단백을 정량하기 위해 브래포드 방법(Bradford assay)으로 정량하고, 웰(well)에 분주한 후 수작업 또는 장비를 사용하여 한 식품당 일정량의 조단백이 고형의 기판 상의 한 점에 점적한다.

본 발명에서 고형의 칩으로 사용될 수 있는 기판의 재질은 유리, 변형된 실리콘, 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리프로필렌(polyprophylene) 등 흔히 사용되는 중합체나 겔 등을 사용할 수 있다. 상기 기판의 표면은 단백질의 고정이 용이하도록 중합체, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속, 무기 유리 및 막 등으로 표면 처리할 수 있다. 상기 기판은 단백질을 고정시키는 지지체로서의 역할 뿐 아니라, 고정된 단백질 항원과 검체 내의 항체 간의 결합 반응이 일어나는 장소를 제공한다. 상기 기판의 규격 및 단백질이 기판 상에 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기기(spotting machine) 및 스캐너(scanner) 등의 장치에 따라 변화 가능하다.

본 발명에서 알레르기 유발원을 검출하는 방법은 상기 과정을 거쳐 제조된 칩 상의 조단백 항원들을 환자로부터 채취한 혈액 또는 체액 등의 기타 검체와 반응시켜 항원 항체 반응을 확인하는 것이다. 본 발명에서 특정한 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 검출하는 방법은 상기 알레르기 유발원을 검출하는 방법과 마찬가지이나, 이 과정에서 항체의 종류에 따라 각각 다른 발색 물질을 사용할 수 있으므로, 동시에 여러 색의 형광을 사용하여 여러 종류의 항체를 검색할 수 있다.

본 발명의 단백질 칩과 검체 간의 반응 결과를 판독하기 위해, 검사하고자 하는 항체에 선택적으로 결합할 수 있고 표식 물질이 부착된 2차 항체 또는 필요한경우 3차 항체를 사용한다. 표식 물질로는 발색 물질을 생성하는 효소, 방사성 동위 원소 및 형광 물질 등이 이용될 수 있다. 그러나 효소의 경우 민감도가 낮고, 방사성 동위 원소는 환경 문제 및 기타 보건상의 문제를 안고 있기 때문에, 민감도가 높으면서도 안전한 형광 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용가능한 형광 물질로 Cy3, Cy5, FITC, TRITC 등 기존에 사용되는 모든 형광 염색 시약을 들 수 있다. 각 형광 물질의 강도는 해당되는 파장에서 스캐너로 측정하여 파악한다.

본 발명의 단백질 칩은 신속하고 간편하게 여러 종류의 알레르기 유발원으로부터 환자에게 알레르기를 유발하는 원인을 검출하는 동시에, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 검출할 수 있게 하므로, 알레르기 진단을 위한 시간과 인력을 절감할 수 있다.

본 발명의 단백질 칩은 상당히 적은 양의 검체를 필요로 하므로 환자에게 부담을 거의 주지 않으며, 기존에는 어려웠던 소아나 영유아에 대한 검사도 용이하게 행할 수 있다. 기존에는 한 종류의 항체에 대한 검사에 최소 20 - 100 ㎕의 혈청을 필요로 하였으나, 본 발명의 단백질 칩을 이용할 때 60㎕의 혈청으로 최대 5000개의 항체들을 동시에 확인할 수 있다. 두 종류의 항체만을 검출한다고 가정할 경우에 약 1/3300 - 1/12000의 양으로 검사를 하게 되는 것으로, 기존에 비해 획기적으로 검체의 양을 줄일 수 있다.

본 발명의 단백질 칩은 알레르기 유발원에 함유된 주항원에 반응하는 항체 뿐 아니라 소수의 항원에 반응하는 항체까지 검출할 수 있으므로, 효율적인 치료를가능하게 할 수 있다.

본 발명의 단백질 칩은 알레르기를 유발하는 식품에 대한 검출에 있어서, 식품 그 자체 뿐 아니라 섭취를 위한 가열 가공 및 인공 위장관 액 처리 공정에 의해 얻어진 산물에 대해 검사할 수 있기 때문에, 실제로 인체 내의 알레르기 유발 상태와 그 원인을 정확하게 분석할 수 있다.

본 발명은 이하 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명되며, 실시예가 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1] 단백질 칩의 제조

1) 알레르기를 유발하는 식품으로부터 조단백의 분리

알레르기를 유발할 가능성이 있는 것으로 알려진 주요 식품들로부터 조단백을 분리하기 위해, 우유, 달걀 흰자, 달걀 노른자, 대두, 생마늘, 인공 위장관 액을 처리한 익힌 마늘, 현미 및 율무를 각각 150g 씩 준비하였다. 각 식품을 30시간 이상 동결 건조하여 수분을 제거하고 분쇄기로 갈아 분말화하였다. 건조된 시료에 헥산을 1 : 5(w/v)의 비율로 첨가하여 30분간 처리한 후 30분간 방치하여 상층액을 버리고 건조하였다. 상기 헥산 처리 과정을 2번 더 반복하여 지질을 제거하였다.

지질을 제거한 분말을 0.5M NaCl 용액과 1 : 4(w/v)의 비율로 혼합하여 4℃ 에서 3시간 용출한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 1시간 원심 분리하였다. 얻은 상층액을 반투막을 이용하여 증류수로 24시간 동안 투석하고 동결 건조하여, 중성 염 용액에 녹는 단백질을 얻었다.

상기 과정에서 상층액과 분리된 펠렛에 증류수를 첨가하여 1시간 용출한 후, 15000rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다. 얻은 펠렛을 70% 에탄올과 1 : 4의 비율(w/v)로 혼합하여 4℃에서 3시간 혼합한 후, 4℃ 에서 15,000rpm으로 1시간 원심분리하였다. 얻은 상층액을 반투막을 이용하여 증류수로 24시간 동안 투석하고 동결 건조하여, 에탄올에 녹는 단백질을 얻었다.

상기 과정에서 상층액과 분리된 펠렛에 증류수를 첨가하여 1시간 용출한 후, 15000rpm에서 1시간 동안 원심 분리하였다. 얻은 펠렛을 1% 아세트산과 1 : 4의 비율(w/v)로 혼합하여 4℃ 에서 3시간 stirring 한 후, 4℃ 에서 15,000rpm으로 1시간 동안 원심 분리하였다. 얻은 상층액을 반투막을 이용하여 증류수로 24시간 동안 투석하고 동결 건조하여, 약산에 녹는 단백질을 얻었다.

상기 과정에서 상층액과 분리된 펠렛에 증류수를 첨가하여 1시간 용출한 후, 15000rpm에서 1시간 동안 원심 분리하였다. 얻은 펠렛을 PBS용액과 1 : 4(w/v)의 비율로 혼합하여 4℃ 에서 3시간 용출한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 1시간 동안 원심 분리하였다. 얻은 상층액을 반투막을 이용하여 증류수로 24시간 동안 투석하고 동결 건조하여, PBS에 녹는 단백질을 얻었다.

상기 각 단계에서 얻은 단백질을 모두 혼합하여 조단백을 얻었다. 조단백을 정량하기 위해 브래포드 방법을 사용하였다. BSA(Bovine Serum Albumin)를 사용하여 표준 곡선(standard curve)을 얻고, 각 조단백을 발색 반응시킨 후 흡광도를 측정하여, 표준 곡선상에서 해당 흡광도와 일치하는 농도를 측정하였다. 각 조단백을 10㎍/㎖의 농도로 맞춘 후, 4-20% Tris-glycine precasting gel 상에서 125 V의 조건으로 90분간 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 전기영동이 끝난 gel을 쿠마시 블루(coommassie blue) 용액으로 밤새 염색한 후, 50%의 메탄올, 10%의 아세트산 및 40%의 물로 이루어진 용액으로 탈염색하여, 각 식품으로부터 조단백이 잘 분리되었음을 확인하였다(도 1). 마늘의 경우 가공된 상태는 날것에 비해 상당량의 조단백이 사라지는 것을 관찰할 수 있었다.

2) 본 발명의 단백질 칩의 제조

본 발명의 단백질 칩을 제조하기 위해, 각 식품으로부터 분리되어 10㎍/㎖의 농도로 조절된 조단백을 384 웰에 분주하였다. 스팟팅 기기로 Cartesian MicroSys 4100을 사용하였으며, 기기에 장착되어 있는 팁을 이용하여 다음 표 1의 배열 순서대로 희석한 각 조단백을 10 nl씩 슬라이드 표면에 점적하여 단백질 칩을 제작하였다.

	음성대조군	양성대조군	우유	달걀흰자	달걀노른자	대두	생마늘	익힌마늘	현미	율무
배열	원액	원액	원액	원액	원액	원액	원액	원액	원액	원액
	1/10	1/10	1/10	1/10	1/10	1/10	1/10	1/10	1/10	1/10
	1/100	1/100	1/100	1/100	1/100	1/100	1/100	1/100	1/100	1/100

[실시예 2] 본 발명의 단백질 칩을 이용한 알레르기 유발 식품의 검출

본 발명의 단백질 칩을 이용하여 알레르기를 유발하는 식품을 검출하기 위해, 상기 과정을 거쳐 제작된 단백질 칩을 1% BSA를 함유한 TBS-T (Tris Buffered Saline- 0.1% Tween 20)와 30분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. TBS-T 용액에 각 15분간 3회 세척한 후, 단백질 칩을 알레르기성 피부염이 있는 것으로 진단된 환자로부터 얻은 혈청 60㎕와 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 바이오틴이 결합된 Vector사의 anti-human IgE를 1:1000으로 희석하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 세척 후, Cy3가 결합된 Caltag사의 스트렙트아비딘을 1:1000으로 희석하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 단백질 칩의 판독을 위해, 표식 물질인 Cy3의 신호를 읽을 수 있는 기기로 Applied Precision 사의 ArrayWoRx을 사용하였고, 프로그램은 Biodiscovery 사의 Imagene을 사용하였으며, 그 판독 결과를 표 2에 나타내었다.

	형광 물질의 강도
희석 비율	원액	1/10 희석액	1/100 희석액	판 정
음성 대조군	-	5635.86	-	음 성
양성 대조군	-	45811.78	-	양 성
우 유	7640.71	9529.38	9588.97	음 성
달걀 흰자	120500.48	9166.24	7117.69	양 성
달걀 노른자	21244.61	11595.51	6269.52	양 성
대 두	13048.82	12232.13	8516.96	양 성
생 마 늘	30501.29	18947.53	8333.95	양 성
익힌 마늘	5932.04	9061.51	5635.86	음 성
현 미	9935.57	10069.98	8406.52	음 성

표 2에 나타난 바와 같이, 상기 환자의 혈청에는 달걀 흰자, 달걀 노른자, 대두, 생마늘 및 율무에 대한 항체가 존재함을 알 수 있었다.

[비교예] 기존의 방법에 의한 알레르기 유발 식품의 검출

1) FAST 검사에 의한 알레르기 유발 식품의 검출

상기 실시예 2의 환자에 대해 우유, 달걀 흰자, 달걀 노른자, 콩, 마늘, 쌀 및 보리를 대상으로, 외국으로부터 수입되어 현재 사용되고 있는 FAST 검사를 수행하였다(표 3).

항목	보리	쌀	익힌 마늘	마늘	콩	달걀 노른자	달걀 흰자	우유
측정치	66	45	-	121	63	11	8	20
판정	양성	음성	-	양성	양성	음성	음성	음성

표 3에서 나타난 바와 같이, 상기 환자는 콩, 마늘 및 보리에 대해 양성 반응을 나타냈다. 상기 방법에 의해 익힌 마늘에 대한 결과는 측정할 수 없었으며, 단지 마늘이라는 식품 전체에 대해 강한 양성 반응을 나타냈다.

2) 웨스턴 분석에 의한 식품의 알레르기 항원성 진단

실험적으로 항원 항체 반응의 진단이 가능한 웨스턴 분석을 이용하여, 상기 실시예 2의 환자에서 실제로 각 항원에 양성 반응을 보이는 혈청이 존재하는지를 확인하였다.

실시예 1과 동일한 방법으로 각 식품에서 추출한 조단백을 전기영동한 후, 젤을 NC(Nitrocellulose) 막에 16V로 3시간 30분 동안 전이(transfer)시켰다. 조단백이 전이된 NC 막을 0.5%의 탈지 분유(skim milk)를 함유한 PBS와 30분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. 환자로부터 추출한 혈청을 1:3으로 희석하여 1시간 동안 반응시킨 후, 바이오틴(biotin)이 결합된 Vector사의 anti-human IgE를 1:1000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 각 단계마다 PBS-T (Phosphate Buffered Saline - 0.1% Tween 20)으로 15분씩 3회 세척하고, Caltag사의 스트렙트아비딘 (streptavidin)을 1:1000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 15분간 세척하고 TMB(tetramethylbenzadin) 발색 시약을 이용하여 발색 양상을 확인하였다(도 2).

도 2에 나타난 바와 같이, 상기 환자의 혈청에는 달걀 노른자와 생마늘에 대한 항체가 존재함을 알 수 있었으며, 대두, 익힌 마늘 및 율무에서는 매우 미약한 양성 반응을 관찰할 수 있었다. 마늘의 경우 가공된 상태는 날것에 비해 알레르기 관련 항체들이 거의 반응하지 않음을 알 수 있었으며, 이는 도 1에 나타난 바와 같이 가공된 상태에서 대부분의 항원 조단백이 사라지는 결과와 일치하였다.

상기 실시예 2와 비교예에서, 달걀 흰자의 경우 비교예의 FAST와 웨스턴 분석 결과 음성으로 판별되었으나, 본 발명의 단백질 칩을 사용한 진단 결과에서는 양성 반응을 나타냈다. 그러므로 본 발명의 단백질 칩은 기존의 진단 시약에 비해 훨씬 민감도가 우수하며, 정확한 알레르기 진단이 가능함을 알 수 있다.

또한 마늘에 대한 진단 결과로 보아, FAST 등 기존의 방법으로는 한 식품에 대해 날것과 조리된 것을 구별하여 알레르기를 진단할 수가 없었으나, 본 발명의 단백질 칩을 이용하면 식품의 상태에 따른 알레르기 유발 정도의 차이를 파악할 수 있다.

[실시예 3] 본 발명의 단백질 칩을 이용한 특정 식품에 대한 알레르기를 유발하는 항체의 종류 검출

본 발명의 단백질 칩을 이용하여 특정 식품에 의한 알레르기 반응에 관여하는 구체적인 항체를 검출하기 위해, 각각의 항체에 대해 다른 종류의 형광 물질이 부착된 2차 항체를 사용하였다. 형광 물질은 사용한 2차 항체의 종류에 따라 Cy3와 FITC를 사용하였으며, 각각 543nm와 488nm의 파장에서 형광의 강도를 측정하였다.

그 결과, 항체의 종류에 따라 다른 파장에서 각각 결과를 얻을 수 있었으므로, 본 발명의 단백질 칩 이용시 동시에 여러 종류의 항체에 대한 검출이 가능함을 알 수 있었다.

본 발명의 단백질 칩은 매우 적은 양의 검체만으로도 여러 종류의 알레르기 유발원을 동시에 검출할 수 있고, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 구체적인 항체를 신속하고도 쉽게 검사할 수 있어, 알레르기 진단시 환자가 가지는 부담을 덜면서 경제적인 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 단백질 칩은 알레르기 유발원에 함유된 주항원에 반응하는 항체 뿐 아니라 소수의 항원에 반응하는 항체까지 검출할 수 있으며, 식품의 경우 그 자체 뿐 아니라 섭취시의 상태로 변형된 산물에 대해 검사할 수 있기 때문에, 알레르기 유발 원인을 실제적으로 상세하게 파악하여 치료의 방향을 제시할 수 있으며, 동시에 알레르기 환자도 가공 방법에 따라 안전하게 식품을 섭취할 수 있게 한다.

본 발명의 단백질 칩은 우리 나라 환자들이 실제로 섭취하는 식품의 다양한형태에 대한 검출이 가능하므로, 기존의 수입 진단 시약 사용시 나타나곤 하던 오진을 제거하고, 정확한 진단 결과를 기대할 수 있다.

본 발명의 단백질 칩은 알레르기 진단을 간편하게 자동화할 수 있어, 각 개인과 집단 별로 알레르기에 관련된 단백질의 프로파일을 데이터베이스화할 수 있을 뿐 아니라 각 식품에 따른 알레르기 유발 모델을 구축할 수 있으므로, 국가적 차원에서 국민들의 보건 관리에도 적극적으로 활용될 수 있다.

Claims

여러 종류의 알레르기 유발원으로부터 추출한 각각의 조단백을 고형의 기판 상의 각 점에 부착시킨 것을 특징으로 하는 알레르기 진단용 단백질 칩.
제 1항에 있어서, 상기 조단백은 알레르기 유발원으로부터 중성 염 용액, 에탄올, 약산 및 PBS 완충액에 녹는 단백질을 분리하고 이들을 혼합하여 얻은 것임을 특징으로 하는 알레르기 진단용 단백질 칩.
제 1항에 있어서, 상기 조단백은 날것 상태의 식품 또는 가열하거나 인공 위장관 액을 처리하여 변형시킨 상태의 식품으로부터 추출한 조단백임을 특징으로 하는 알레르기 진단용 단백질 칩.
제 3항에 있어서, 인공 위장관 액은 펩신 0.842㎎/㎖ , 염화나트륨 2.0㎎/㎖ , pH 1.2의 조성으로 이루어짐을 특징으로 하는 알레르기 진단용 단백질 칩.
제 1항 내지 제 4항의 단백질 칩을 알레르기 환자로부터 얻은 검체와 반응시켜 알레르기 유발원을 검출하는 방법.
제 5항에 있어서, 단백질 칩과 검체의 반응 후, 검사하고자 하는 항체에 선택적으로 결합할 수 있으며 형광 물질이 부착되어 있는 2차 항체 또는 3차 항체를 이용하여 반응 결과를 판독함으로써 알레르기 유발원을 검출하는 방법.
제 1항 내지 제 4항의 단백질 칩을 알레르기 환자로부터 얻은 검체와 반응시켜, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 검출하는 방법.
제 7항에 있어서, 단백질 칩과 검체의 반응 후, 검사하고자 하는 항체에 선택적으로 결합할 수 있으며 형광 물질이 부착되어 있는 2차 항체 또는 3차 항체를 이용하여 반응 결과를 판독함으로써, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 검출하는 방법.
제 8항에 있어서, 검사하고자 하는 항체 별로 각기 다른 형광 물질을 사용함으로써, 특정 알레르기 유발원에 의한 알레르기 반응에 관련된 항체의 종류를 검출하는 방법.