KR101087965B1 - 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물알레르기 유발성 식품의 검출 방법 - Google Patents

음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물알레르기 유발성 식품의 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101087965B1
KR101087965B1 KR1020047003322A KR20047003322A KR101087965B1 KR 101087965 B1 KR101087965 B1 KR 101087965B1 KR 1020047003322 A KR1020047003322 A KR 1020047003322A KR 20047003322 A KR20047003322 A KR 20047003322A KR 101087965 B1 KR101087965 B1 KR 101087965B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
food
antibody
allergens
egg
antigen
Prior art date
Application number
KR1020047003322A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20040040455A (ko
Inventor
모리마쓰후미키
다카하타요시히사
마쓰모토다카시
미야자와이즈미
시미즈무네시게
Original Assignee
닛뽄하무가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 닛뽄하무가부시키가이샤 filed Critical 닛뽄하무가부시키가이샤
Publication of KR20040040455A publication Critical patent/KR20040040455A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101087965B1 publication Critical patent/KR101087965B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 음식물 알레르겐을 검출하는 방법, 여기에 사용하는 항체 및 당해 항체를 제조하기 위한 항원을 제공한다. 본 발명의 항원은 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 미변성 및/또는 변성 물질로 이루어진 다수의 음식물 알레르겐의 혼합물이며, 또한 본 발명의 항체는 상기한 항원을 동물에 면역시켜 수득되는 항체이다. 또한, 본 발명의 음식물 알레르겐의 검출 방법은 상기한 항체를 사용하는 것이며, 이러한 방법에 따르면 음식물 알레르겐 및 음식물 알레르기 유발성 식품 등을 검출할 수 있으며, 음식물 알레르기 환자의 안전성 확보에 이바지할 수 있다.
음식물 알레르겐, IgE 항체, 항원, 음식물 알레르기 유발성 식품

Description

음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법{Food allergens, method of detecting food allergens and method of detecting food allergy-inducing foods}
본 발명은 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 미변성 및/또는 변성 물질로 이루어진 다수의 음식물 알레르겐의 혼합물, 당해 음식물 알레르겐 혼합물을 동물에게 면역시켜 수득되는 항체 및 당해 항체를 사용하는 음식물 알레르겐 및 당해 알레르겐을 함유하는 음식물 알레르기 유발성 식품 및 이들을 함유하는 식품의 검출 방법에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 음식물 알레르겐의 발병기구의 해명, 음식물 알레르겐의 저알레르겐화 기술의 개발, 저알레르겐화 기술의 유용성의 검증, 식품 및 식품 원재료 중에 혼재하는 음식물 알레르겐의 검출 및 식품 가공기계나 제조공정 등의 식품 제조환경 중에 존재하는 음식물 알레르겐의 검출 등에 활용할 수 있으므로, 음식물 알레르기 환자의 안전성 확보에 이바지할 수 있다.
음식물 알레르기는 식품 중에 함유되는 알레르기 유발물질(이하, 음식물 알레르겐)의 섭취가 일으키는 유해한 면역반응이며, 피부염, 천식, 소화관 장애, 아나필락시 쇼크 등을 일으킨다. 알레르기 반응은 작용기작의 상이함으로부터, I형 내지 IV형으로 분류되고 있지만, 음식물 알레르기는 주로 음식물의 섭취에 의해 체 내에 침입한 음식물 알레르겐과 IgE 항체가 반응하는 I형 알레르기에 의해서 야기된다. 그리고, 최근, 이러한 음식물 알레르기 환자가 증가되고 있어, 의학상 및 식품산업상 심각한 문제를 발생시키고 있다.
이러한 위험을 미연에 방지하기 위해 표시를 통한 소비자에의 정보제공 필요성도 높아지고 있으며, FAO/WHO 합동식품규격위원회(CODEX 위원회)는 알레르기 물자로서 공지되어 있는 8종류의 원재료를 함유하는 식품에서는 이것을 함유한다는 취지의 표시에 대해서 합의하여 가맹국에서 각국의 제도에 적합한 표시방법을 검토하는 것으로 했다(1999년 6월). 일본에서는 과거의 건강 위해 등의 정도, 빈도를 고려하여 중독인 알레르기 증상을 일으킨 실적이 있는 24개 품목의 식품에 대해 이의 표시방법이 정해졌다(2002년 4월부터 시행). 이와 같이, 이들의 표시제도는 알레르기 물질 또는 음식물 알레르겐 자체의 표시가 아니라 알레르기 물질 또는 음식물 알레르겐을 함유하는 식품(본원 명세서에서는 음식물 알레르기 유발성 식품이라고 칭한다)의 표시를 요구하는 것에 주목할 필요가 있다.
음식물 알레르기 유발성 식품으로서는 계란유, 우유류, 육류, 어류, 갑각류 및 연체동물류, 곡류, 콩류 및 너트류, 과실류, 야채류, 맥주 효모 또는 젤라틴 등이 공지되어 있다.
또한, 음식물 알레르기 유발성 식품에는 난알부민, 오보뮤코이드, 리소짐, 카제인, β-락토글로불린, α-락토알부민, 글루텐, α-아밀라제 억제인자 등의 음식물 알레르기를 유발하는 식품 성분도 포함된다.
또한, (1) 현시점에서는 물질명은 특정되어 있지만 음식물 알레르기를 유발 하는 식품이나 식품 성분(음식물 알레르겐)이 다수 존재하는 것으로 생각되고; (2) 음식물 알레르기를 유발하는 식품이나 식품 성분(음식물 알레르겐)은 음식물 알레르기 환자마다 상이하며 다양하고; 또한, (3) 하기 실시예에 기재된 바와 같이 음식물 알레르기를 유발하는 1종류의 식품 중에서조차 공지 및 미지의 음식물 알레르겐이 다수 존재한다. 그러나, 종래에는 이들 음식물 알레르기를 유발하는 다수의 식품이나 다수의 음식물 알레르겐을 간편하게 검출할 수 없었다.
식품은 식품의 소화성, 보존성, 기호성, 물성 등의 개선이나 살균 목적으로 가열, 동결, 건조, 염장, 발효, 효소처리 등의 처리(이하, 식품 가공처리)가 이루어져 제조된다. 이들 식품 가공처리는 단백질 등의 식품 성분에 작용하여 식품 성분의 분자 구조를 변화시키지만(예: 단백질의 변성), 이러한 식품 가공처리가 신규한 음식물 알레르겐을 발생시키는지 여부에 대해서는 종래부터 별로 검토되고 있지 않았다.
그러나, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명은 다음을 명백하게 했다: (1) 가열처리된 식품 성분도 알레르겐성이 있고, (2) 동일 식품이라도 가열처리되어 있지 않은 경우와 가열처리된 경우에는 알레르기를 유발하는 성분 또는 에피토프가 변화한다. 즉, a) 비가열 계란(卵) 항원, b) 상기 a)를 가열하여 제조한 가열 계란 항원, c) 다수의 음식물 알레르기 환자로부터 채취한 푸울 혈청(이하, 환자 푸울 혈청)과 a)를 혼합한 후의 혈청(비가열 계란 항원 제거 혈청), d) 환자 푸울 혈청과 b)를 혼합한 후의 혈청(가열 계란 항원 제거 혈청)을 제조하며, a)와 c) 또는 d)를 반응시킨 시험결과 및 b)와 c) 또는 d)를 반응시킨 시험결과로부터 비가 열 계란 항원 제거 혈청은 비가열 계란 항원과 항원 항체반응하지 않게 되지만 가열 계란 항원과는 원래와 동일하게 항원 항체반응하는 한편, 가열 계란 항원 제거 혈청은 가열 계란 항원과 항원 항체반응하지 않게 되지만 비가열 계란 항원과는 원래와 동일하게 항원 항체반응한다. 요약하면, 음식물 알레르기 환자는 가열 등의 식품 가공처리를 받은 식품에 대하여 특이적인 IgE 항체 및 식품 가공처리를 받지 않은 식품에 대해 특이적인 IgE 항체를 각각 가지고 있으며, 이들이 음식물 알레르기의 야기에 관계하고 있다고 생각된다.
그러나, 종래에는 식품 가공처리가 실시된 식품이나 식품 성분의 알레르겐성을 간편하게 검사할 수 없었다.
계란 단백질, 피너츠 단백질, 카제인, β-락토글로불린, 글루텐을 대상으로 하는 음식물 알레르겐 검사용 제품이 시판되고 있다(참조: 식품과 개발, Vo1. 35, p10-11). 그러나, 이들 제품의 일부 또는 전부에는 다음과 같은 문제점이 있었다: (1) 반드시 알레르기 환자가 인식하는 알레르겐을 검출할 이유는 없었으며, 환언하면, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 물질을 검출할 이유는 없었다; (2) 공지되고 또한 단일의 알레르겐밖에 검출할 수 없었다(단일 항체); (3) 단일의 알레르겐을 검출하는 단일 항체를 사용하는 검출 방법의 경우에는 당해 알레르겐 검출을 방해하는 물질을 함유하는 식품에는 적용할 수 없었다; (4) 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 단일 항체를 사용하는 검사방법을 사용하여 음식물 알레르기 유발성 식품을 정량하고자 하는 경우에는 반드시 정확한 정량치가 얻어지지 않았다; (5) 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 단일 항체를 사용하는 검출 방법의 경우에는 당해 알레르겐을 함유하지 않는 음식물 알레르기 유발성 식품의 검사에 적용할 수 없었다(예: 난백 부분에 존재하는 난알부민 등을 항원으로 하여 수득되는 단일 항체를 사용하는 검출법의 경우에는 난황이나 난황 마요네스 등의 검사에 적용할 수 없었다. 또한, 난황 성분이 음식물 알레르기를 발병하는 사례도 공지되어 있다.); (6) 식품의 가공처리에 의해 변성 또는 분자 개질된 알레르겐을 검출할 수 없었으므로 가공식품의 검사에는 적용할 수 없었다, (7) 미변성 및 변성 β-락토글로불린, 난알부민, α-카제인을 인식하는 모노클로날 항체가 보고되어 있지만(참조: 알레르기, Vol. 50, p309), 모노클로날 항체는 음식물 알레르겐 분자 중의 특정 에피토프밖에 인식하지 않으므로(엄밀하게는 1클론화 하이브리드마로 만들어진 모노클로날 항체는 1에피토프만을 인식한다), 식품의 제조공정에서 당해 에피토프가 제거 또는 분자 개질된 경우에는 모노클로날 항체를 사용하는 알레르겐성 판정법의 유용성은 감소되었다.
음식물 알레르기 환자의 혈청을 사용하는 방법으로서, 쌀 알레르기 환자의 혈청을 사용하는 알레르겐 분석법[참조: 일본 공개특허공보 제2000-65320호], 계란, 우유 알레르기 환자의 푸울 혈청을 사용하는 알레르겐 분석법(참조: 식육 과학, Vol, 39, p166-169)이 보고됐지만 대량의 환자의 사람 혈청이 필요하므로 병원 등의 한정된 시설에서는 이용할 수 있지만 대부분의 검사기관이나 식품 제조공장 등에서는 이용할 수 없었다.
마우스의 아나필락시 반응을 이용하는 음식물 알레르겐을 검사하는 방법(참조: FFI J., No. 180, p77-82)도 보고되어 있지만, 번잡한 조작을 요하는 동시에 실험동물을 유지 관리하지 않으면 대다수의 식품 제조공장에서는 이용할 수 없었다. 프로 시스템과 효소 표지 항체를 조합한 시스템이나 마이크로 전극을 이용한 알레르겐 센서도 개발됐지만(참조: 식품공업, Vol. 42, p53-56) 실용화되기까지는 해결해야 할 많은 과제가 남아 있다.
발명의 개시
본 발명은 종래 기술에 존재하는 상기 과제를 해결하기 위해 이루어진 것이며, 본 발명의 목적은 (1) 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 공지 및/또는 미지 및 미변성 및/또는 변성 물질로 이루어진 다수의 음식물 알레르겐의 혼합물(편의상, 본 발명의 제1 발명이라고 한다), (2) 당해 음식물 알레르겐의 혼합물을 동물에게 면역시켜 수득되는 항체(편의상, 본 발명의 제2의 발명이라고 한다), 및 당해 항체를 사용하는 음식물 알레르겐 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법(편의상, 본 발명의 제3 발명이라고 한다)을 제공하는 것이다.
도 1은 표준 항원과 환자 IgE 항체 및 표준 항원과 본 발명의 항표준 항원 항체의 반응성을 비교하는 도면이다.
도 2는 환자 혈청 중에는 미변성 및 변성 계란 단백질에 특이적인 IgE가 존재한다는 것을 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 제1 발명은,
(1-i) 음식물 알레르기 환자 푸울 혈청으로부터 IgE 항체 분획을 분리하고,
(1-ii) 식품 가공처리와 동일한 정도로 처리된 및/또는 처리되어 있지 않은 식품 또는 식품 성분(이하, 식품이라고 한다) 중에서 IgE 항체 분획과 반응하는 다수의 성분(환언하면, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐)을 친화 크로마토그래피 또는 면역 침강 등의 통상적인 면역학적 방법을 사용하여 채취한다.
또는, 본 발명의 제1 발명은,
(2-i) 통상적인 방법에 따라 식품 성분을 SDS-PAGE하여 멤브레인에 전사하고,
(2-ii) 당해 멤브레인, 환자 푸울 혈청, 표지화 항 인간 IgE 항체 및 염색 시약을 사용하여 웨스턴 블로팅하는(환언하면, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐의 프로파일을 작성한다) 동시에,
(2-iii) 당해 멤브레인, 식품 성분을 통상적인 방법으로 동물에 면역시켜 제조한 동물 혈청, 표지화 항 당해 동물 IgG 항체 및 염색 시약을 사용하여 웨스턴 블로팅하고, 또한
(2-iv) 양 웨스턴 블로팅상을 비교하여 전자에서는 염색되지 않지만 후자에서 염색되는 염색 밴드(환언하면, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하지 않는 다수의 비식품 알레르겐 성분)의 분자량을 측정하며,
(2-v) 상기 측정결과에 근거하여, 분자체 담체를 사용하는 겔 여과 크로마토그래피 등의 통상적인 방법으로 식품 성분으로부터 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐을 채취한다.
본 발명의 제2 발명은 제1 발명에 따라 수득된 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐(함유되는, 식품 가공처리된 및/또는 식품 가공처리를 하지 않은 음식물 알레르겐)을 동물에게 면역시켜 제조한 항 음식물 알레르겐 동물 항체이다(이하, 복합 항원을 인식하는 항체라고 칭하는 경우도 있다).
또한, 본 발명의 제3 발명은 당해 복합 항원을 인식하는 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 음식물 알레르겐 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법이다.
상기한 식품 가공처리와 동등한 처리 중에서 가열온도는 40℃ 내지 250℃, 바람직하게는 60℃ 내지 120℃이다. 그리고, 무처리를 포함시켜 2 내지 6단계의 상이한 온도대에 의해 처리한 것을 혼합하며, 이러한 혼합물로부터 본 발명의 제1 발명에 따라 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 음식물 알레르겐 분획을 채취하여 동물에게 면역시킨다.
또한, 음식물 알레르겐 검출 대상이 가열 처리된 식품으로 한정되는 경우에는 가열처리된 식품만으로 본 발명의 제1의 발명에 따라 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 음식물 알레르겐 분획을 채취하여 동물에 면역시킬 수 있다.
면역시키는 동물로서는 토끼, 염소, 양, 래트, 마우스, 기니어 피그, 말, 돼지 또는 닭 등을 예시할 수 있다. 면역 기간중은 부분 채혈하여 항 음식물 알레르 겐 항체가 생성되어 있는 것을 확인하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 중의 하나일 수 있다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이 음식물 알레르기를 유발하는 1종류의 식품중에는 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 공지 및 미지의 다수의 음식물 알레르겐이 함유되고 나서 이들 다수의 음식물 알레르겐을 동물에게 면역시킴으로써 다수의 음식물 알레르겐을 인식하는 다가 항체, 즉 복합 항원을 인식하는 항체를 용이하게 제조할 수 있다.
음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 음식물 알레르겐에 대한 동물 항체로서 당해 동물의 항혈청을 그대로 사용할 수 있다. 또한, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하지 않는 비음식물 알레르겐 분획을 사용하여 흡수조작을 실시하거나 동물 혈청의 IgG 분획을 통상적인 방법으로 정제하여 사용할 수 있다.
본 발명의 음식물 알레르겐 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법은 음식물 알레르겐을 함유하는 식품 및 이것을 함유하는 식품이면 특별히 한정되지 않고 적용할 수 있으며, 예를 들면 음식물 알레르기 유발성의 식품으로서는 계란류, 우유류, 육류, 어류, 갑각류 및 연체동물류, 곡류, 콩류 및 너트류, 과실류, 야채류, 맥주 효모 또는 젤라틴, 보다 상세하게는 계란류로서 난백, 난황, 우유류로서 밀크, 치즈, 육류로서 돼지고기, 쇠고기, 닭고기, 양고기, 어류로서 고등어, 전갱이, 정어리, 다랑어, 연어, 대구, 가자미, 이크라, 갑각류 및 연체동물류로서 게, 에피, 자색 조개, 물오징어, 낙지, 가재, 전복, 곡류로서 소맥, 쌀, 메밀, 귀리, 대맥, 오트밀, 옥수수, 수수, 좁쌀, 피, 콩류 및 너트류로서 대두, 피너츠, 카카오, 완두콩, 까치콩, 헨젤 너트, 브라질 너트, 아몬드, 코코너트, 호두, 과실류로서 사과, 바나나, 오렌지, 복숭아, 키위, 딸기, 멜론, 아보가드, 포도, 망고, 서양 너트, 참깨, 마스타드, 야채류로서 토마토, 당근, 감자, 시금치, 양파, 마늘, 죽순, 호박, 고구마, 셀러리, 파셀리, 참마, 송이버섯 또는 이들을 함유하는 식품 및 상기 식품의 구성 성분(예: 난알부민, 오보뮤코이드, 리소짐, 카제인, β-락토글로불린, α-락토알부민, 글루텐, α-아밀라제 억제제)을 들 수 있다. 또한, 이들 식품이 가열, 동결, 건조, 염장, 발효, 효소처리 등의 식품 가공처리가 실시되는지 여부의 구별은 묻지 않는다.
일반적으로 50% 이상의 확률로 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 알레르겐을 메이저 알레르겐으로, 그 이외에는 마이너 알레르겐이라고 호칭한다. 음식물 알레르기는 메이저 알레르겐만에 의해 야기될 이유는 없으며 마이너 알레르겐에 의해서도 야기된다. 또한, 환자에 따라서는 메이저 알레르겐에 감작되지 않지만 마이너 알레르겐에만 감작되는 경우도 있다. 따라서, 음식물 알레르겐의 검출 방법은 메이저 알레르겐 및 마이너 알레르겐 모두를 검출할 수 있는 것이 필요하다. 또한, 본 발명의 검출 방법은 음식물 알레르기 환자가 인식하는 다수의 알레르겐에 대해 미변성 및 변성한 것 모두를 검출할 수 있는 것이 필요하다.
이러한 요건을 만족시키는 항체를 제조하기 위해 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 하기의 것을 밝혀냈다.
즉, 식품 성분을 통상적인 방법에 따라 SDS-PAGE하여 멤브레인에 전사하며,
(i) 당해 멤브레인을 환자 푸울 혈청, 표지화 항 인간 IgE 항체 및 염색 시 약을 사용하여 웨스턴 블로팅하는(환언하면, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐의 프로파일을 작성한다) 동시에,
(ii) 당해 멤브레인을, 식품 성분을 통상적인 방법으로 동물에게 면역시켜 제조하는 동물 혈청, 표지화 항 당해 동물 IgG 항체 및 염색 시약을 사용하여 웨스턴 블로팅하며,
(iii) 양쪽 웨스턴 블로팅상을 비교하면 (1) 양자 공통하여 염색되는 염색 밴드와 (2) 전자에서는 염색되지 않지만 후자에서만 염색되는 염색 밴드(환언하면, 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하지 않는 다수의 비식품 알레르겐 성분)가 존재하는 것이 확인되며, 또한 (3) 전자에서 염색되는 염색 밴드의 분자량 분포와 후자에서만 염색되는 염색 밴드의 분자량 분포를 비교하면 후자에서만 염색되는 염색 밴드는 전자에서 염색되는 염색 밴드보다 고분자측 및/또는 저분자측에도 존재하는 것을 알았고, 따라서
(iv) 상기 시험결과에 기초하여 분자체 담체를 사용하는 겔 여과 크로마토그래피 등의 통상적인 방법을 사용하여 식품 성분으로부터 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐 분획을 채취하며 이것을 면역원으로서 동물에 면역시켜 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐에 대한 동물 항체를 제조한다. 동물 항체의 제조에 제공하는 동물은 토끼, 염소, 양, 래트, 마우스, 기니어 피그, 말, 돼지 또는 닭 등의 항온동물이며 이들 동물을 면역하는 방법은 당업자에게 공지된 방법일 수 있다.
본 발명의 음식물 알레르겐의 검출 방법은 상기와 같이 수득한 항체를 사용 하지만 마이크로 타이터 플레이트, PVDF막, 니트로셀룰로스막, 크로마토스트립, 시험관, 비드, 나일론막 등으로 고상화하여 사용할 수 있다. 또한, 엔자임이뮤노어세이법, 이뮤노블로팅법, 도트블로트법 또는 이뮤노크로마토그래피법 및 항체 칩법 등의 면역학적 수법에 적용할 수 있다.
본 발명의 음식물 알레르겐의 검출 방법은 상기한 바와 같이 식품 및 식품 가공기계나 제조공정 등의 식품 제조환경 중에 존재하는 다수의 알레르겐을 검출하는 것을 목적으로 하고 있다. 측정할 때에는 식품의 추출액이 적절하게 사용되며 추출 용액은 물, 인산 완충 생리 식염수, 트리스-염산 완충액 또는 알콜 등이 바람직하지만, 알레르겐이 함유되는 것이면 이들에 한정되지는 않는다. 또한, 공급 시험 식품으로부터 알레르겐의 추출효율을 개선시킬 목적으로, 필요에 따라, 알레르겐 추출 용액에 단백질 변성제(예: SDS 또는 우레아), SH기 함유 산화방지제(예: 2-머캅토에탄올) 등을 첨가할 수 있다. 식품 가공기계나 제조공정 등의 식품 제조환경의 닦아낸(swab) 액, 식품 제조환경의 공기를 은피(隱避) 병에 트랩핑한 검사액을 공급 시료로 하면 식품 가공기계나 제조공정 등의 식품 제조환경 중에 존재하는 다수의 알레르겐을 검출할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 피시험 물질의 검출원리는 엔자임이뮤노어세이법, 이뮤노블로팅법, 도트블로트법, 이뮤노크로마토법, 멀티형광마이크로비드법 등의 면역학적 수법이면 특정한 것에 한정되지 않는다. 예를 들면, 엔자임이뮤노어세이법으로서는 샌드위치 ELISA법, 경합법 및 직접법 등을 예시할 수 있다. 공급 시약 항체를 표지하는 경우에는 효소(예: 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 또는 β-갈락시 다제), 형광물질(예: 플루오레세인이소티아네이트), 생물 발광물질(예: 루시페린-루시페라제), 화학 발광물질(예: 루미놀, 아크리딘 유도체 또는 아다만탄 유도체), 비오틴, 아비딘, 금 콜로이드 또는 방사성 물질(예: 32P) 등을 사용할 수 있다.
하기에 본 발명의 검출 방법의 적절한 예로서 샌드위치 ELISA법, 경합법 및 직접법의 순서의 개략을 순차적으로 설명한다.
샌드위치 ELISA법에서는 우선, 본 발명의 다수의 알레르겐을 인식하는 항체(복합 항원을 인식하는 항체)의 표지물(표지화 항체)을 준비한다. 한편, ELISA 플레이트에 본 발명의 복합 항원을 인식하는 항체의 비표지화 항체를 흡착시키거나 화학적 결합법으로 고상화시킨다. 다음에, 고상의 항체 비흡착면을 당해 반응계에 영향을 주지 않는 단백질, 예를 들면, 젤라틴이나 토끼 혈청 알부민 등으로 블록킹 처리한다. 검사를 실시하는 식품 및 원료의 추출물 또는 식품의 제조환경으로부터 채취한 추출물(이하, 검체라고 한다) 또는 표준 항원을 고상에 첨가하고, 제1회째 항원 항체반응을 실시한다. 반응후, 세정하며 상기한 표지화 항체를 첨가하여 고상화한 항체에 보족(補足)된 알레르겐과 2회째 항원 항체반응을 실시한다. 다음에, 미반응의 표지화 항체를 세정, 제거하며 표지에 따른 검출시약(예: 퍼옥시다제를 표지로서 사용하는 경우에는 1,2-페닐디아민과 H2O2: 알칼리포스파타제를 표지로서 사용하는 경우에는 P-니트로페닐인산)을 가하여 표지와 검출시약의 반응 생성물의 양을 측정하여 알레르겐을 검출 또는 정량한다.
ELISA 플레이트에 첨가하는 표준 항원 또는 음식물 알레르기 유발성 식품( 예: 계란, 우유)의 양을 변화시킴으로써 표준 곡선이 얻어진다. 또한, 이러한 표준 곡선으로부터 공급 시험 시료 중의 음식물 알레르겐 또는 음식물 알레르기 유발성 식품의 양을 측정할 수 있다. 또한, 이의 측정치가 1ppm 이상인 경우에는 당해 공급 시험 시료는 음식물 알레르기 유발성 식품이라고 생각되고 있다.
또한, 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 단일 항원을 인식하는 항체와 당해 항체를 사용하여 제작한 표준 곡선으로부터 공급 시험 시료 중의 음식물 알레르겐을 측정하는 경우에는 당해 항체가 인식하는 에피토프와 미지의 공급 시험 시료 중에 존재하는 음식물 알레르겐 종류의 조합에 따라서는, (1) 음식물 알레르겐을 적절하게 정량할 수 있는 경우도 있지만, (2) 음식물 알레르겐을 적절하게 검출할 수 없는 경우도 있고, 또한 (3) 음식물 알레르겐 함유량이 1ppm 이하에서도 당해 음식물 알레르겐이 흡사 1ppm 이상 존재하는 것으로 정량되어 부적절한 판정을 가져오는 경우도 생긴다.
즉, 단일 항원을 인식하는 항체를 사용하는 검출법에서는 단일 항원을 인식하여 얻어지는 값으로부터 식품 알레르기 유발성 식품의 양으로 환산하지 않으면 안되므로 오차가 생기기 쉽다.
단일 항원으로서 오보뮤코이드와 난알부민을 예로 하면 이들은 전란중에 각각 약 4%와 약 2%가 함유되며 난백중에는 각각 2배인 약 8%와 약 4%가 함유된다. 그러나, 난황중에는 양자 모두 함유되지 않는다. 이러한 점으로부터, 오보뮤코이드 또는 난알부민만을 인식하는 검출계에서는, (1) 난황 단백질을 검출할 수 없는 한편, (2) 전란을 사용하여 제조한 표준 곡선을 난백의 측정에 적용하려고 하는 경우에는 실제의 함량보다 2배 정도 많게 환산되고, 또한 (3) 검출의 정량 범위를 초과하는 경우에는 이상하게 높은 값이 산출된다.
동일하게 전체 우유 단백질 중에 차지하는 카제인의 함량은 약 80%, β-락토글로불린의 함량은 약 10%이므로 카제인나트륨이나 유청(乳淸) 단백질 등이 사용되는 가공유를 단일의 항원을 인식하는 항체를 사용하여 정량하고자 하는 경우에는 정확한 정량치가 얻어지지 않는다는 문제점이 있다.
그러나, 본 발명의 복합 항원을 인식하는 항체는 이러한 문제는 생기지 않거나 적다.
경합법에서는 사용되는 항체가 인식하는 일정량의 알레르겐으로서 표준 항원을 직접 고상에 흡착시키며 당해 반응에 영향을 주지 않는 단백질로 블록킹 처리를 한 다음, 알레르겐을 인식하는 효소 표지 항체와 검체를 동시에 첨가한다. 일정 시간 반응시킨 다음, 세정하여 고상에서 비결합한 것을 제거하며 발색 기질을 가하여 효소와 반응시킨다. 반응 정지후, 검체의 첨가에 따른 효소 표지 항체의 고상화된 알레르겐과의 반응을 검출하면 양호하다.
직접법에서는 검체를 직접 고상에 흡착시켜 이의 반응계에 영향을 주지 않는 단백질로 블록킹 처리한 다음, 알레르겐을 인식하는 효소 표지 항체를 첨가, 반응시킨다. 이후에는 샌드위치법과 동일한 조작을 실시하며 검체중의 알레르겐을 검출한다.
상기한 샌드위치 ELISA법, 경합법 및 직접법 중의 어느 하나에서도 표지 효소-발색 기질의 조합을 표지 효소-형광 기질, 표지 효소-생물 발광기질 및 화학 발 광기질 등의 조합으로 변경할 수 있다. 이들 본 발명의 각 검출 방법에서의 다른 반응조건 등에 관해서는 이의 목적, 검체의 종류, 측정원리 등에 따라 당업자가 적절하게 결정할 수 있다.
본 발명의 알레르겐의 검출 방법에서는 식품 및 원료 추출액 중에 함유되는 0.1ng/ml 이상 내지 1.0ng/ml 이상의 알레르겐을 검출할 수 있으며, 매우 고감도로 알레르겐을 검출할 수 있다.
본 발명의 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 미변성 및/또는 변성 물질로 이루어진 다수의 음식물 알레르겐의 혼합물 및 이의 항체는 음식물 알레르겐의 발병 기구의 해명, 음식물 알레르겐의 저알레르겐화 기술의 개발에 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 음식물 알레르겐의 검출 방법은 저알레르겐화 기술의 유용성의 검증, 식품에 혼재하는 음식물 알레르겐의 검출 및 음식물 알레르기 유발성 식품, 및 식품 가공기계나 제조공정 등의 식품 제조환경 중에 존재하는 음식물 알레르겐의 검출 등에 활용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 음식물 알레르기 환자의 안전성 확보에 이바지할 수 있는 동시에, 최근 음식물 알레르기 환자의 증가에 따른 의학상 및 식품 산업상의 심각한 문제의 해결에 이바지할 수 있다.
하기에, 실시예를 가지고 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만 이들은 실 시예의 일례로서 기재한 것이며, 본 발명은 이들에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다. 또한, 기재에 사용되는 약호는 당해 기술분야에서 관용적인 약호에 의한 것이다.
실시예 1(각종 식품의 표준 항원의 제조)
(1) 계란, 메추리 알, 집오리 알
계란 1kg의 껍질을 벗기고 균일하게 균질화한 후에 동결건조시키고, 미분쇄하여 표준 계란 항원을 제조한다. 이의 10g에 10배량의 인산 완충 생리 식염수(Phosphate-buffered saline; 이하, PBS; pH 7.0)를 가하여 용해시키며 5개의 시험관에 분리 주입시켜 각각 무처리, 60℃, 80℃, 100℃와 120℃에서 30분 동안 가열처리하여 혼합하며 균일화하여 시료를 제조한다. 동일하게 메추리 알과 집오리 알로부터 시료를 제조한다.
(2) 우유
우유 1ℓ를 냉각하면서 교반하여 유지 덩어리를 응고시켜 탈지면으로 여과한다. 이러한 조작을 3회 반복하여 지방을 제거한 다음, 여액을 동결건조시키고 미분쇄하여 표준 우유 항원을 제조한다. 또한, 상기 (1)과 동일하게 하여 시료를 제조한다.
(3) 소맥, 쌀
소맥분 1kg에 5배량의 4M 우레아 첨가 0.1M 트리스-염산 완충액(pH 8.6)을 가하여 실온에서 2시간 동안 교반하면서 추출하고 원심분리 후의 상등액을 투석하여 동결건조시키고 미분쇄하여 표준 소맥 항원을 제조한다. 또한, 상기 (1)과 동일하게 하여 시료를 제조한다. 동일하게 쌀 가루로부터 시료를 제조한다.
(4) 메밀
메밀 1kg에 5배량의 1% NaCl 첨가 0.1M 트리스 염산 완충액(pH 8.4)을 가하여 실온에서 2시간 동안 교반하면서 추출하고, 원심분리 후의 상등액을 투석하여 동결건조시키고 미분쇄하여 표준 메밀 항원을 제조한다. 또한, 상기 (1)과 동일하게 하여 시료를 제조한다.
(5) 피너츠
피너츠 1kg을 분쇄하여 5배량의 헥산을 가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하면서 탈지시킨다. 이러한 조작을 3회 반복한 후, 헥산을 제거하고 5배량의 1% NaCl을 함유하는 0.1M 트리스-염산 완충액(pH 8.4)을 가하여 실온에서 2시간 동안 교반하면서 추출한다. 다음에, 원심분리 후의 상등액을 투석하여 동결건조시키고 미분쇄하여 표준 피너츠 항원을 제조한다. 또한, 상기 (1)과 동일하게 하여 시료를 제조한다.
(6) 대두
상기 (5)와 동일한 방법으로 대두로부터 표준 대두 항원을 제조한다. 또한, 상기 (1)과 동일하게 시료를 제조한다.
실시예 2 (각종 정제 음식물 알레르겐)
(1) 정제 계란 알레르겐
계란의 메이저 알레르겐인 난알부민에 10배량의 PBS(pH 7.0)를 가하여 용해시키고, 5개의 시험관에 분리 주입시켜 각각 무처리, 60℃, 80℃, 100℃와 120℃에서 30분 동안 가열처리하여 혼합하고 균일화하여 시료를 제조한다. 또한, 오보뮤코이드에 관해서도 동일하게 시료를 제조한다. 또한, 난알부민 및 오보뮤코이드는 난백 부분에 존재하는 단백질로서 공지되어 있다.
(2) 정제 우유 알레르겐
실시예 2(1)과 동일하게 카제인, β-락토글로불린 및 α-락토알부민에 대해서 시료를 제조한다. 또한, β-락토글로불린 및 α-락토알부민은 우유 호에이 중에 존재하는 단백질로서 공지되어 있다.
실시예 3(항체의 제조)
(1) 각종 표준 항원에 대한 토끼 항체의 제조
실시예 1에서 제조한 각 시료를 프로인트 완전 아쥬반드(제1회째 면역원으로서 사용) 또는 프로인트 불완전 아쥬반드(제2회째 이후의 면역원으로서 사용)와 유화하여 일본 백색종 토끼에 4 내지 6회 면역시킨다. 이 동안에 부분 채혈을 실시하여 공급 시험 항원에 대한 항체의 생성을 확인하고 전체 채혈을 실시하여 항체를 제조한다.
(2) 각종 정제 음식물 알레르겐에 대한 항체의 제조
상기와 동일하게 각종 정제 음식물 알레르겐에 대한 항체를 제조한다.
실시예 4(이뮤노블로팅법에 의한 각종 음식물 알레르겐의 검출)
(1) 환자 푸울 혈청 및 토끼 항체
계란, 우유 및 소맥에 대한 RAST(radioallergosorbent test) 스코어 2 이상(특이적 IgE 항체> O.7UA/ml)의 음식물 알레르기 환자 20예의 혈청을 등량씩 혼합하여 환자 푸울 혈청을 제조한다. 한편, 계란, 우유 및 소맥에 대한 토끼 항체는 실시예 3(1)에서 제조한 항체를 사용한다.
(2) 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
상기한 계란, 우유 및 소맥의 표준 항원을 2-머캅토에탄올 존재하에 3분 동안 가열하여 겔 농도 10%의 미니스라브겔을 사용하여 전기영동한 다음, PVDF(폴리비닐리덴디플루오리드) 막 위에 전기적으로 전사한다. 막의 일부는 금 콜로이드 염색 키트(BIO-RAD사제)에 의한 전체 단백질 밴드의 검출에 사용한다.
(3) 이뮤노스테이닝
상기한 PVDF 막을 1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 블록킹한다. 이어서, 전사막을 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS(PBST)로 세정하여 환자 푸울 혈청(100배 희석) 또는 토끼 항체(1000배 희석)와 실온에서 2시간 동안 반응시켜 세정하고 알칼리포스파타제 표지 염소 항 인간 IgE-ε쇄 항체(2500배 희석) 또는 알칼리포스파타제 표지 항 토끼 IgG 항체(4000배 희석)를 2차 항체로서 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 다음에, 전사막을 PBST로 세정하며 화학발광 기질인 4-메톡시-4(3-포스페이트페닐)스피로[1,2-디옥세탄-3,2-아다만탄]이나트륨 염(Lumi-Phos 530, 와코쥰야쿠고교사제)과 실온에서 30분 동안 반응시켜 알칼리포스파타제의 탈인산화 반응에 의해 생기는 발광을 감광 필름 위에서 검출한다.
이들 결과를 도 1에 도시한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 환자 혈청과 반응하는 밴드(도 1, 레인 1, 4, 7)가 다수 존재하며 각종 식품에는 환자 IgE가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐이 존재하는 것이 도시된다.
한편, 토끼 항체도 이들 환자 IgE가 인식하는 음식물 알레르겐을 인식한다(도 1, 레인 2, 5, 8)
양 혈청이 공통적으로 인식한 물질은 다음과 같다.
계란의 난알부민, 오보뮤코이드, 리소짐, 오보트랜스페린; 우유의 카제인, β-락토글로불린, α-락토알부민; 소맥의 글리아딘, α-아밀라제 억제제; 메밀의 132kDa, 84kDa, 27kDa, 11kDa 성분; 또한 피너츠의 107kDa, 72kDa, 35kDa, 28kDa 성분.
또한, 토끼 항체는 환자 IgE가 인식하지 않는 비음식물 알레르겐도 인식한다.
(4) 알레르겐의 농축·분획
알레르겐 이외의 물질를 인식하지 않는 항체를 다음 요령으로 제조한다.
환자 혈청으로 염색되는 염색 밴드의 분자량 분포와 동물 항체로 염색되는 염색 밴드의 분자량 분포를 비교하면 후자로만 염색되는 염색 밴드는 전자로 염색되는 염색 밴드보다 고분자측 및/또는 저분자측에도 존재하고 있다는 것을 알았다(도 1). 따라서, 겔 여과 크로마토그래피에 의해 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체 가 인식하는 다수의 음식물 알레르겐 분획의 분자량에 상당하는 분획을 표준 항원으로부터 채취하여(이하, 알레르겐 분획), 실시예 1과 동일하게 시료를 제조하고, 이것을 면역원으로서 동물에게 면역시켜 항알레르겐 분획 항체를 수득한다. 또한, 이러한 항체를 사용하여 상기와 동일하게 웨스턴 블로팅한 바, 이러한 항체는 대체적으로 환자 푸울 혈청이 인식하는 음식물 알레르겐을 인식하고 있다는 것이 확인된다(도 1, 레인 3, 6, 9).
또한, 이와 같은 알레르겐의 농축·분획은 이온 교환 크로마토그래피, 환자 IgE 항체를 이용한 면역 침강이나 친화 크로마토그래피에 의해 실시할 수 있다.
실시예 5(도트 블로트법에 의한 메이저 알레르겐 및 동 가열 완료물의 검출)
PBS로 평형화한 PVDF막을 도트 블로트 장치에 셋팅하고 메이저 알레르겐으로서 공지되어 있는 정제 알레르겐(난알부민, 오보뮤코이드, 오보트랜스페린, 리소짐, 카제인, β-락토글로불린, α-락토알부민, α-아밀라제 억제제, 글리아딘) 및 이들 가열 완료물을 흡착시킨다. 다음에, 3% RSA 첨가 TBS로 블로킹하여 TBST로 세정하고 실시예 4(4)에서 제조한 항 계란 알레르겐 분획 항체, 항 우유 알레르겐 분획 항체 또는 항 소맥 알레르겐 분획 항체(2000배 희석)를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 이어서, 비오틴 표지 염소 항 토끼 IgG 항체를 반응시키고 HRP 표지 아비딘(4000배)을 반응시켜 세정하고 화학 발광기질을 가하여 반응에 의해 생기는 빛을 감광 필름 위에서 검출한다.
상기한 항체는 메이저 알레르겐인 난알부민, 오보뮤코이드, 오보트랜스페린, 리소짐, 카제인, β-락토글로불린, α-락토알부민, α-아밀라제 억제제, 글리아딘을 인식한다. 또한, 상기한 항체는 상기한 정제 알레르겐의 가열 완료물도 인식한다.
실시예 6(샌드위치 ELISA법에 의한 계란, 우유 및 소맥 알레르겐의 검출)
(1) 항체
실시예 4(4)에서 제조한 항 계란 알레르겐 분획 항체, 항 우유 알레르겐 분획 항체 또는 항 소맥 알레르겐 분획 항체 및 이들로부터 통상적인 방법에 따라 제조한 비오틴 표지 항체를 하기의 시험에 제공한다.
(2) 마이크로 타이터 플레이트에서 항체의 코팅과 블록킹
상기한 항체(10㎍/ml) 100㎕를 ELISA 플레이트(Nunc사)에 분리 주입하고, 4℃에서 밤새 코팅하여 세정하고(150mM NaCl과 0.05% 트윈 20 첨가 20mM 트리스-염산 완충액, pH 7.4), 0.1% RSA(Sigma사) 첨가 트리스-염산 완충액(pH 7.4)으로 25℃에서 1시간 동안 블록킹한다.
(3) 계란, 우유 및 소맥 알레르겐의 검출
각 웰 중의 블록킹 용액을 제거하고 희석 용액(0.1% RSA, 150mM NaCl과 0.05% 트윈 20 첨가 20mM 트리스-염산 완충액, pH 7.4) 95㎕와 각종 식품의 PBS 추출액 5㎕를 가하여 25℃에서 2시간 동안 방치한다. 또한, 실시예 1에 기재된 계란, 우유 또는 소맥의 표준 항원도 동일하게 각 웰에 5㎕ 가하며 25℃에서 1시간 동안 방치한다. 각 웰을 세정액 300㎕로 5회 세정한 다음, 비오틴 표지화 항체(10000배 희석) 100㎕를 가하여 25℃에서 1시간 동안 방치한다. 세정후, 퍼옥시다제 표지 아비딘(2500배 희석) 100㎕를 가하여 25℃에서 30분 동안 방치한다. 다음에, 각 웰을 세정하고 3,3',5,5'-테트라메틸벤진 용액 100㎕를 가하여 25℃에서 30분 동안 차광하에 반응시킨다. 다음에, 1N 황산 100㎕를 가하고 반응을 정지시킨다. 각 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(주파장 450nm, 부파장 630nm)로 측정한다.
이들 측정결과를 표 1에 기재한다. 표 1에 기재된 바와 같이, 각종 식품 추출액 중의 계란, 우유 또는 소맥 알레르겐을 검출할 수 있다.
각종 식품의 계란, 우유 및 소맥의 검출 결과
공급 시험 식품 항 계란 알레르겐 분획 항체 항 우유 알레르겐 분획 항체 항 소맥 알레르겐 분획 항체
삶은 계란 ○ × ×
우유 × ○ ×
빵(시판품) × × ○
퓨린(시판품: 계란과 우유를 함유) ○ ○ ×
프렌치토스트(시판품: 계란, 우유 및 소맥을 함유) ○ ○ ○
○: 검출된 것을 나타낸다. ×: 검출되지 않은 것을 기재한다(이하의 표에서도 동일).
실시예 7 (샌드위치 ELISA법에 의한 음식물 알레르겐 검사 키트의 기초 성능시험)
(1) 표준 항원의 희석시험
실시예 6의 시험법에 따라 실시예 1에서 제조한 계란, 우유 및 소맥의 표준 항원을 정량한다. 이들 결과를 그래프 용지에 플롯팅할 때, 거의 원점을 통과하는 양호한 표준 곡선이 수득된다는 것이 확인된다.
(2) 동시 재현성 시험
상기한 시험법에 따라 표준 계란 항원에 관해서 검출 렌지 내의 5개의 농도로 검체 A 내지 E를 제조하고, 각각 5회씩 동시 재현성 시험을 실시했다. 이들 결과는 표 2에 기재된 바와 같으며, CV치는 5% 이하에서 양호한 동시 재현성을 나타낸다.
샌드위치 ELISA법에 의한 계란 표준 항원의 동시 재현성 시험
1 2 3 4 5 평균치 SD CV(%)
A 1.165 1.079 1.068 1.075 1.064 1.090 0.042 3.87
B 0.756 0.711 0.699 0.689 0.693 0.710 0.027 3.84
C 0.544 0.505 0.500 0.497 0.507 0.511 0.019 3.74
D 0.233 0.222 0.236 0.222 0.227 0.228 0.006 2.79
E 0.175 0.165 0.179 0.173 0.170 0.172 0.005 3.06

(3) 일(日)차 재현성 시험
상기한 시험법에 따라 표준 우유 항원에 관해 검출 렌지 내의 5개의 농도로 검체 A 내지 E를 제조하여 연속 5일간 일차 재현성 시험을 실시했다. 이들 결과는 표 3에 기재된 바와 같으며, CV치는 5% 이하에서 양호한 일차 재현성을 나타낸다.
샌드위치 ELISA법에 의한 우유 표준 항원의 일차 재현성 시험
1 2 3 4 5 평균치 SD CV(%)
A 2.356 2.387 2.346 2.321 2.241 2.330 0.055 2.37
B 1.353 1.306 1.274 1.246 1.254 1.287 0.044 3.40
C 0.956 0.949 0.928 0.921 0.899 0.931 0.023 2.45
D 0.295 0.292 0.275 0.281 0.278 0.284 0.009 3.10
E 0.195 0.183 0.186 0.184 0.182 0.186 0.005 2.82

이들 결과로부터, 본 검사법은 식품 및 이의 원재료 중에 함유되는 다수의 미변성 및 변성한 음식물 알레르겐을 신속하면서 안정적으로 검출할 수 있는 시스템인 것이 확인된다. 또한, 본 검출 방법은 0.5ng/ml 이상의 음식물 알레르겐 또는 음식물 알레르겐을 함유하는 식품을 검출할 수 있다.
실시예 8(음식물 알레르기 환자는 음식물 알레르겐의 미가열물 및 가열 완료물에 대한 IgE 항체를 보유하고 있다)
계란 알레르기를 예로 하여 음식물 알레르기 환자는 미가열 음식물 알레르겐 뿐만 아니라 가열처리 완료물에 대해서도 IgE 항체를 보유하는 것을 확인한다.
즉, 전란액(비가열 계란 항원)을 PBS에 용해시키고(1.0%, w/v) 이의 절반량을 120℃에서 30분 동안 가열처리하여(가열 계란 항원) 각각의 10배 희석액 100㎕를 ELISA 플레이트(Nunc사제)에 분리 주입시켜 코팅하고 세정하여 1% HAS 첨가 PBS로 블록킹하여 세정하여 미가열 계란 항원 플레이트와 가열 계란 항원 플레이트를 제조한다.
한편, 실시예 4(1)에 기재된 환자 푸울 혈청(1000배 희석)에 비가열 계란 항원 또는 가열 계란 항원을 첨가하고(1, 5, 50, 100, 500 및 1000ng/ml), 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 원심분리 상등액을 수득하여 2종류의 혈청을 제조한다. 이하, 전자를 비가열 계란 항원 제거 혈청, 후자를 가열 계란 항원 제거 혈청이라고 호칭한다.
그리고, 상기한 비가열 계란 항원 플레이트 또는 가열 계란 항원 플레이트에 비가열 계란 항원 제거 혈청 또는 가열 계란 항원 제거 혈청을 각각 100㎕ 분리 주입시켜 37℃에서 2시간 동안 반응시키고 PBST로 세정하고 비오틴 표지 염소 항 인간 IgG ε쇄 항체(2500배 희석) 100㎕를 분리 주입하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 PBST로 세정하고 알칼리포스파타제 표지 아비딘을 가하여(37℃, 30분) 발광기질을 가하여 발광 정도를 측정한다(루미노미터-CT-9000D, 다이아야트론사제). 그 결과를 도 2에 도시한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 가열 계란 항원 제거 혈청(도 2의 ○표시)은 비가열 계란 항원과 특이적으로 반응하지만(도 2 왼쪽) 가열 계란 항원과는 반응하지 않게 되었다(도 2 오른쪽). 한편, 비가열 계란 항원 제거 혈청(도 2의 ●표시)은 가열 계란 항원과 특이적으로 반응하지만(도 2 오른쪽) 비가열 계란 항원과는 반응하지 않게 되었다(도 2 왼쪽).
이러한 점으로부터, 음식물 알레르기 환자는 비가열 계란을 특이적으로 인식하는 IgE 항체를 보유하는 동시에, 가열 완료 계란을 특이적으로 인식하는 IgE 항체를 보유하고 있다는 것이 증명된다.
따라서, 음식물 알레르겐의 검출 방법은 비가열 알레르겐 뿐만 아니라 가열 완료 알레르겐 둘 다를 검출할 수 있는 방법이 아니면 안된다고 할 수 있다.
실시예 9(가열처리 항원을 면역시켜 수득한 항체에 의한 ELISA 강도의 증강)
실시예 4에 기재된 항 알레르겐 분획 항체를 사용하여 음식물 알레르겐을 측정하는 경우에도 상기 항체와 가열 처리 완료 공급 시험 검체를 반응시킬 때의 ELISA 강도(Optical density, OD치)는 상기 항체와 미가열 공급 시험 검체를 반응시킬 때의 것보다도 낮다는 문제점이 있다. 여기에는 (1) 가열처리 완료 검체로부터 추출되는 단백질 농도가 미가열 검체로부터 추출되는 단백질 농도보다 낮으며, (2) 검액 중의 단백질 농도를 동일하게 조정하여도 가열처리 완료 검체와 항체와의 반응성은 미가열 검체와 항체의 반응성보다 낮은 것이 관계된다고 생각한다. 따라서 가열처리 완료 검체와의 반응성을 증강한 항체의 제조법을 검토한다.
실시예 4(4)에 기재된 계란 알레르겐 분획을 120℃에서 30분 동안 오토클레이브 가열하여 냉각시키고, 4M 우레아 첨가 PBS를 가하여 균질화하며 이의 원심분리 상등액을 취하여 동결건조시키고 미분쇄하여 이것을 면역원으로서 실시예 3(1)과 동일하게 토끼 항체를 제조하며(이하, 항 오토클레이브 가열 계란 항원 항체), 실시예 6의 기재에 준해 실시예 8에 기재된 미가열 계란 항원 플레이트와 가열 계란 항원 플레이트를 반응시킨다. 또한, 실시예 4(4)에 기재된 항 알레르겐 분획 항체에 대해서도 동일한 조작을 실시했다.
이들 측정 결과를 표 4에 기재한다. 표 4에 기재된 바와 같이 오토클레이브 가열한 음식물 알레르겐 추출물을 면역원으로서 수득된 항체를 사용함으로써 미가열 계란 항원과 가열 계란 항원을 거의 동등한 ELISA 강도로 검출할 수 있게 되어 상기한 문제점을 극복할 수 있다.


가열처리 항원을 면역시켜 수득한 항체에 의한 ELISA 강도의 증강
공급 시험 항체 ELISA의 반응 강도
미가열 계란 항원 플레이트 가열 계란 항원 플레이트
항 계란 알레르겐 분획 항체 100 36
항 오토클레이브 가열 계란 항원 항체 100 118
항 계란 알레르겐 분획 항체와 표준 계란 항원 플레이트와의 ELISA 강도(OD치)를 100으로 하여 나타낸다.

실시예 10(음식물 알레르겐 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 측정-1)
본 발명의 복합 항원을 인식하는 항체(실시예 3에 기재된 항체)를 사용하는 동시에 실시예 7의 기재에 준하여 음식물 알레르겐을 함유하는 식품의 검출 여부를 조사한다. 또한, 실시예 7의 기재에 준하여 제작한 표준 곡선으로부터 정량하고, 이의 정량 지수(측정치/공급 시험량×100)를 비교한다. 난황, 난백, 난황 마요네스와 전란 마요네스에 관해 조사한 결과를 표 5에 기재한다.
표 5에 기재된 바와 같이 난백에 존재하는 물질을 면역원으로서 수득한 단일 항원만을 인식하는 항체의 경우에는 1) 난백을 검출할 수 있지만 난황을 검출할 수 없었으며, 또한, 2) 표준 곡선으로부터 구한 표준 계란 항원량의 정량치는 실제로 공급 시험량의 2배 내지 60배 초과였다.
한편, 본 발명의 복합 항원을 인식하는 항 표준 계란 항원 항체의 경우에는 3) 난황 및 난백 모두를 검출할 수 있으며, 또한 4) 표준 곡선으로부터 구한 표준 계란 항원량의 측정치는 실제로 공급 시험량과 거의 동일하였다.
이러한 점으로부터, 본 발명의 복합 항원을 인식하는 항 표준 계란 항원 항 체는 음식물 알레르기 유발성 식품인 계란 및 이의 가공식품 중의 계란 성분의 검출 또는 정량에 적용할 수 있다는 것을 알았다.
각종 항체를 사용하는 계란 및 계란 제품의 검출 및/또는 정량 여부
공급 시험 시료 판정 항목 복합 항원을 인식하는 항체(항표준 계란 항원 항체) 단일 항원을 인식하는 항체(항오보뮤코이드 항체) 단일 항원을 익식하는 항체(항난알부민 항체)
난황 검출 여부 ○ × ×
정량 지수 74-106
난백 검출 여부 ○ ○ ○
정량 지수 105-170 240-310 6,330-13,150
난황 마요네스 검출 여부 ○ × ×
전란 마요네스 검출 여부 ○ ○ ○
실시예 11 (음식물 알레르겐 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 측정-2)
실시예 10과 동일하게 하여 우유 호에이, 카제인, 락토페린과 카제인 가수 분해 펩티드에 관해 조사한 결과를 표 6에 기재한다.
표 6에 기재된 바와 같이, (1) 본 발명의 복합 항원을 인식하는 항 표준 우유 항원 항체는 음식물 알레르기 유발성 식품인 우유 및 이의 성분을 검출 또는 정량할 수 있었지만, (2) 우유의 호에이 부분 등에 존재하는 물질을 면역원으로서 수득한 단일 항원만을 인식하는 항체를 사용하는 경우에는 정량할 수 없었다. 또한, 표 6에서 △는 검출됐지만 정량 지수가 5 이하인 것을 나타낸다.
각종 항체를 사용하는 표준 우유 항원의 검출 및/또는 정량 여부
공급 시험 시료 판정 항목 복합 항원을 인식하는 항체(항표준 우유 항원 항체) 단일 항원을 인식하는 항체(항카제인 항체) 단일 항원을 익식하는 항체(항β-락토글로불린 항체)
우유 호에이 검출 여부 ○ × ○
정량 지수 160-230 320-1,080
카제인 검출 여부 ○ ○ ×
정량 지수 38-47 170-180
락토페린 검출 여부 ○ △ ×
카제인 가수분해 펩티드 검출 여부 ○ × △

Claims (8)

  1. 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하고, 섭취에 의해 음식물 알레르기를 일으키는 하기의 각 그룹에 기재되는 음식물 알레르겐의 미변성 및 변성 음식물 알레르겐으로 이루어지는 알레르겐 혼합물.
    (1) 계란의 난알부민, 오보뮤코이드, 리소짐 및 오보트랜스페린;
    (2) 우유의 카제인, β-락토글로불린 및 α-락토알부민;
    (3) 소맥의 글리아딘 및 α-아밀라제 억제제;
    (4) 메밀의 132kDa, 84kDa, 27kDa 및 11kDa 성분; 또는
    (5) 피너츠의 107kDa, 72kDa, 35kDa 및 28kDa 성분
  2. 제1항에 있어서, 음식물 알레르기 환자의 RAST(radioallergosorbent test) 스코어가 2 이상인 알레르겐 혼합물.
  3. 동물 유래의 항체이며 제1항에 따르는 미변성 및 변성 음식물 알레르겐을 인식하는 항체를 포함하는 항체 혼합물.
  4. 제3항에 따르는 항체 혼합물을 사용하는 음식물 알레르겐의 검출 방법.
  5. 제3항에 따르는 항체 혼합물을 사용하는 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 음식물 알레르기 유발성 식품이 계란, 우유, 소맥, 메밀, 피너츠 및 이들 중 하나 이상을 함유하는 식품인 방법.
  7. (i) 통상적인 방법에 따라 식품 성분을 SDS-PAGE하여 멤브레인에 전사하고,
    (ii) 당해 멤브레인, 환자 푸울 혈청, 표지화 항 인간 IgE 항체 및 염색 시약을 사용하여 웨스턴 블로팅하고,
    (iii) 동일하게, 당해 멤브레인, 식품 성분을 통상적인 방법으로 동물에 면역시켜 제조한 동물 혈청, 표지화 항 당해 동물 IgG 항체 및 염색 시약을 사용하여 웨스턴 블로팅하고, 또한
    (iv) 양 웨스턴 블로팅상을 비교하여 전자에서는 염색되지 않지만 후자에서 염색되는 염색 밴드의 분자량을 측정하며,
    (v) 상기 측정결과에 근거하여, 통상적인 방법으로 식품 성분으로부터 음식물 알레르기 환자의 IgE 항체가 인식하는 모든 음식물 알레르겐을 채취하는 공정으로 이루어지는 제1항에 따른 알레르겐 혼합물의 제조 방법.
  8. 제1항에 따른 알레르겐 혼합물로 동물을 감작시키는 것으로 이루어지는 제3항에 따른 항체 혼합물의 제조 방법.
KR1020047003322A 2001-09-05 2002-09-05 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물알레르기 유발성 식품의 검출 방법 KR101087965B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2001-00269592 2001-09-05
JP2001269592 2001-09-05
PCT/JP2002/009066 WO2003022876A1 (fr) 2001-09-05 2002-09-05 Allergenes alimentaires, procede de detection des allergenes alimentaires et procede de detection des aliments provoquant des allergies alimentaires

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117002565A Division KR20110018464A (ko) 2001-09-05 2002-09-05 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040040455A KR20040040455A (ko) 2004-05-12
KR101087965B1 true KR101087965B1 (ko) 2011-12-01

Family

ID=19095383

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047003322A KR101087965B1 (ko) 2001-09-05 2002-09-05 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물알레르기 유발성 식품의 검출 방법
KR1020117002565A KR20110018464A (ko) 2001-09-05 2002-09-05 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117002565A KR20110018464A (ko) 2001-09-05 2002-09-05 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물 알레르기 유발성 식품의 검출 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8361460B2 (ko)
EP (1) EP1440978B1 (ko)
KR (2) KR101087965B1 (ko)
CN (2) CN102993299B (ko)
CA (1) CA2459510C (ko)
WO (1) WO2003022876A1 (ko)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ549638A (en) 2004-03-05 2009-12-24 Prima Meat Packers Ltd Method of detecting allergen
BRPI0616405A2 (pt) * 2005-09-21 2011-06-21 Green Growth Coffee Inc torrefador de alimentos
US8211485B2 (en) 2007-06-06 2012-07-03 North Carolina A&T State University Process for preparing hypoallergenic and non-allergenic peanuts (Arachis hypogaea) utilizing an endopeptidase
US20100080870A1 (en) * 2007-06-06 2010-04-01 Mohamed Ahmedna Process for preparing hypoallergenic and/or non-allergenic peanut butter and associated products
CA2702561A1 (en) * 2007-10-07 2009-04-16 Jordan Scott Portable device for detecting food allergens
AU2010216932B2 (en) * 2009-02-23 2012-12-06 Prima Meat Packers, Ltd. Allergen detection method using immunochromatography
CN101899501B (zh) * 2010-02-10 2012-06-20 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
JP4624477B1 (ja) * 2010-02-18 2011-02-02 田中貴金属工業株式会社 加工食品中の豚肉検出法およびその検出キット
US20130040016A1 (en) * 2010-11-12 2013-02-14 Laura Lane BECKER Allergen-free compositions
CA2757787A1 (en) * 2010-11-12 2012-05-12 Laura Lane Becker Allergen-free compositions
WO2012142623A2 (en) * 2011-04-15 2012-10-18 Aliment Health, Inc. Antigen detection system and methods of use
CN102331497A (zh) * 2011-06-15 2012-01-25 天津医科大学 牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法
CN102520157A (zh) * 2011-12-22 2012-06-27 北京海瑞祥天生物科技有限公司 食物过敏原IgG抗体检测用微孔板、试剂盒、制备方法及检测方法
CN102621328B (zh) * 2012-03-14 2014-08-06 天津市南开医院 牛奶抗体谱诊断试剂盒
CN102960729A (zh) * 2012-12-13 2013-03-13 百岳特生物科技（上海）有限公司 用于调节淀粉分解酶活性的花生膜萃取物及其制备方法
US9939431B2 (en) 2013-03-29 2018-04-10 Nima Labs, Inc. Portable device for detection of harmful substances
US10466236B2 (en) 2013-03-29 2019-11-05 Nima Labs, Inc. System and method for detecting target substances
US10249035B2 (en) 2013-03-29 2019-04-02 Nima Labs, Inc. System and method for detecting target substances
US10254279B2 (en) 2013-03-29 2019-04-09 Nima Labs, Inc. System and method for detection of target substances
CN103983788B (zh) * 2014-05-28 2016-01-13 中生北控生物科技股份有限公司 用于特异性奶类过敏原IgE筛查的试纸条及其制备方法
CA2975230C (en) * 2015-01-30 2023-02-21 Cyrex Laboratories, Llc Simultaneous characterization of igg and iga antibodies to multiple food antigens and c1q-food protein immune complexes
EP3268733A4 (en) * 2015-03-09 2018-11-14 Nima Labs, Inc. Method and system for detecting allergens in a consumable
JP5894695B1 (ja) * 2015-05-25 2016-03-30 ホーユー株式会社 ウズラの卵アレルギーの抗原
CN105137062A (zh) * 2015-06-03 2015-12-09 章丘维他力医疗器械有限公司 一种免疫球蛋白e免疫比浊法检测试剂盒
KR20180043790A (ko) * 2015-07-22 2018-04-30 바이오메리카인코포레이티드 식품 민감도 시험에 근거하여 식품 권고를 제공하기 위한 시스템 및 방법
CN105181954A (zh) * 2015-10-12 2015-12-23 天津科技大学 一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法及其免疫分析方法
CA3014891A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Above the Fold, LLC Systems for tracking medications
CN105785047A (zh) * 2016-04-18 2016-07-20 南昌大学 一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法
EP3449255B1 (en) * 2016-04-26 2024-08-21 Biomerica, Inc. Compositions, devices, and methods of ulcerative colitis sensitivity testing
EP3467499A4 (en) * 2016-06-02 2020-02-19 Hoyu Co., Ltd. EIALLERGIEANTIGEN
CN106248956B (zh) * 2016-07-18 2017-12-29 南昌大学 一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法
US10656145B2 (en) 2016-12-09 2020-05-19 General Mills, Inc. Detection of allergens using surface-enhanced raman scattering
JP6368390B2 (ja) * 2017-02-03 2018-08-01 仙味エキス株式会社 魚類アレルギー耐性獲得の評価方法
US11408895B1 (en) 2018-04-09 2022-08-09 Hob Biotech Group Corp., Ltd. Allergen characterization, potent allergen product formulation, comprehensive allergen reagent, and allergy assay
US12000826B2 (en) 2018-05-25 2024-06-04 Anant RAMJI Methods for testing for food allergies and allergens in foods
CN110767309B (zh) * 2019-10-30 2024-02-06 中南大学湘雅三医院 一种基于比对分析的食物过敏原分析系统
CN111627522A (zh) * 2020-04-16 2020-09-04 郭睿 过敏原信息处理方法、装置、存储介质及计算机设备
CN113125739B (zh) * 2021-04-16 2022-07-26 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司 一种荧光芯片定量检测试剂盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69634558T2 (de) 1995-09-22 2006-02-16 Asahi Denka Kogyo K.K. Verfahren zur analyse von allergenen
JPH09136897A (ja) 1995-11-15 1997-05-27 Hitachi Chem Co Ltd 大豆抗原組成物、その製造法、抗大豆抗体の検出・測定方法及び大豆アレルギー診断薬
CA2193915C (en) 1995-12-28 2003-09-09 Michiko Watanabe Method for producing a hypoallergenic wheat flour
JPH11507840A (ja) 1995-12-29 1999-07-13 ユニバーシティ オブ アーカンソー ピーナッツアレルゲンおよび方法
JPH10191935A (ja) * 1997-01-17 1998-07-28 Nippon Ham Kk 食肉製品及びその製造方法
EP0981050A1 (en) 1998-08-14 2000-02-23 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Immunoassay for hazelnut allergens
JP2000065820A (ja) 1998-08-19 2000-03-03 Allergen Free Technology Kenkyusho:Kk タンパク質抽出用水溶液及び抽出方法並びにアレルゲン分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1592754A (zh) 2005-03-09
EP1440978B1 (en) 2013-01-23
US8361460B2 (en) 2013-01-29
CA2459510C (en) 2013-12-17
WO2003022876A1 (fr) 2003-03-20
EP1440978A4 (en) 2006-02-15
US20040265234A1 (en) 2004-12-30
CN102993299B (zh) 2017-04-12
CA2459510A1 (en) 2003-03-20
CN102993299A (zh) 2013-03-27
KR20040040455A (ko) 2004-05-12
KR20110018464A (ko) 2011-02-23
EP1440978A1 (en) 2004-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101087965B1 (ko) 음식물 알레르겐, 음식물 알레르겐의 검출 방법 및 음식물알레르기 유발성 식품의 검출 방법
EP1731907B1 (en) Method of detecting allergen
JP4958369B2 (ja) 食物アレルゲン、食物アレルゲンの検出方法及び食物アレルギー誘発性食品の検出方法
Monaci et al. Food allergens: Classification, molecular properties, characterization, and detection in food sources
EP1977755B1 (en) Shrimp allergen antishrimp allergen antibody and use thereof
CN113549141B (zh) 一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法
Blais et al. Multiplex enzyme immunoassay system for the simultaneous detection of multiple allergens in foods
Clemente et al. Use of the indirect competitive ELISA for the detection of Brazil nut in food products
Kleine-Tebbe et al. Molecular allergy diagnostic tests: development and relevance in clinical practice
Chen et al. Development of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of egg residues in processed food products
Zaffran et al. Immunoreactivity of biochemically purified amandin from thermally processed almonds (Prunus dulcis L.)
US20040175330A1 (en) Protein chip for diagnosis allergy and detection method for allergen and antibody
Khan et al. Development of a sandwich enzyme-linked immunosorbent kit for reliable detection of milk allergens in processed food
AU2009251002B2 (en) Food allergens, method of detecting food allergens and method of detecting food allergy-inducing foods
JP2009236809A (ja) アレルゲン特定用標準アレルゲン及びアレルゲン検出用抗体並びにその利用
TWI342784B (en) A mixture of food allergens and a method for preparing the same
Hessing et al. Antigenicity of legume proteins
Su Development of a specific, sensitive, and robust enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect trace amounts of almond (Prunus dulcis L.)
US7977063B2 (en) Method for determining an allergic response
JP2003294748A (ja) 卵成分検査用抗体及び検査方法並びに検査用キット
JP2023076420A (ja) クルミアレルゲンの検出方法
CN117092350A (zh) 检测含乳产品中的过敏原的方法及试剂盒
KR101508585B1 (ko) 효소 및 열 복합 처리를 통한 쌀의 알레르기 항원성 저감 방법
Cellerino et al. Milk protein detection in raw and cooked meat products using immunochemichal methods
Fukal et al. Distinguishing raw, pasteurized, UHT-treated and bath-sterilized commercial milks by their interaction with immunoprobes against caseins and whey proteins.

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150522

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151119

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161019

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171018

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181120

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191115

Year of fee payment: 9