CN102331497A - 牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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陈寅
常艳敏
许顺连
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本发明公开了一种牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法，属于酶联免疫法检测技术。本发明包括显色液A，显色液B，终止液，以及牛奶过敏的阴性和阳性质控血清；另将牛奶过敏原分别包被微孔板制成包被抗原和标记辣根过氧化物酶制成酶标抗原。这样设计的本发明改变传统的间接法ELISA检测模式，采用双抗原夹心法ELISA构建牛奶过敏原检测试剂盒。用于识别和捕获患者血清中的牛乳过敏特异性抗体，再通过催化底物显色来判断结果。克服了传统的间接法检测模式诸多不足，能降低检测本底、减少假阳性结果，检测操作时血清不需要预先稀释，因不需使用检测抗体，简化了制备方法。提高了检测特异度，同时节省了试剂和操作成本。

Description

牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及酶联免疫法检测技术，具体是一种牛奶过敏酶联免疫法检测模式，尤其是运用双抗原夹心法的原理，将别牛奶过敏原包被于反应板和标记辣根过氧化物酶，对牛奶过敏患者血清中的特异性抗体进行检测的牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法。 
背景技术
食物过敏是当今重大的卫生学问题，对人们的身体健康、生活质量造成严重的影响，对食物过敏的致病机理、检测、防治的研究日益受到重视。牛奶过敏是食物过敏中的主要类型之一，在婴幼儿中高发，严重威胁患儿的健康和生长发育。 
在牛奶中含有一种叫β-乳球蛋白质的物质是强过敏原，某些过敏体质的人，饮用牛奶后就会出现过敏表现。 
及早检测和确诊食物过敏，是该疾病防控的关键。食物过敏的致病机理主要为Ⅰ型超敏反应，机体对某种食物过敏时，会在体内产生特异性抗体（主要为IgE型），能特异性结合食物中导致过敏的成份——过敏原。目前，临床上常采用检测食物过敏特异性抗体来确定患者食物过敏的类型，而酶联免疫吸附实验（ELISA）是最为常用的体外检测方法，该方法中用于标记的酶通常是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，国内应用以后者居多。 
酶联免疫吸附实验根据原理分为双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法等类型。目前，国内外食物过敏ELISA检测方法普遍采用间接法，即将过敏原成份包被于固相载体，用其识别和捕获患者血清中的特异性抗体，再通过特异性抗体进一步结合酶标记抗体，进行显色反应来判断结果，从而确定患者是否对该成份过敏。首先，此类间接法食物过敏检测模式，只能在一定程度上保证结果的特异性，由于使用的酶标抗体能识别食物过敏特异性抗体所属的一类抗体，比如IgE型抗体，而血清中的IgE型抗体种类很多，与食物过敏有关的只是其中一部分，一旦无关的IgE抗体由于种种原因非特异地结合在固相载体上，就会同特异性抗体一道被抗IgE的酶标抗体所识别和结合，造成显色结果偏高，使检测本底偏高并产生假阳性结果。另一方面，由于间接法检测模式需要用到酶标抗体，其制备过程需要饲养、免疫动物、并采血收集抗体，这一过程费时费力，消耗大量的试剂和实验动物，提高了成本和工作量。 
双抗原夹心法是ELISA的检测模式之一，其原理是通过包被抗原和酶标记的抗原构成双抗原夹心结构，识别和捕获待测标本中能结合该抗原的特异性抗体。与间接法相比，双抗原夹心法不需要酶标记的抗体，而是换成了酶标记的抗原，因而省去了抗体制备的过程。同时，由于酶标抗原只识别特异性抗体而不与该抗体同一类型的其他抗体结合，从而提高了检测的特异性。但是，目前双抗原夹心法只见于人类免疫缺陷病毒（HIV）等生物活性分子的检测中，还未见有将其用于食物过敏检测的报道。 
发明内容
本发明就是为了克服食物过敏检测间接法的不足，而提供一种双抗原夹心法检测牛奶过敏的牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法 
本发明旨在建立一种双抗原夹心法ELISA检测牛奶过敏的模式，通过购买或自行提取获得高纯度的牛奶过敏原，用于包被微孔反应板和标记辣根过氧化物酶，制成包被抗原和酶标抗原，检测时用这两种抗原识别和捕获患者血清中的牛奶过敏的特异性抗体，形成“微孔板-包被抗原-特异性抗体-酶标抗原”的双抗原“夹心”，再通过酶催化底物的显色反应来判断结果，实现对血清中过敏特异性抗体的检测。检测过程中不需要酶标抗体而使用酶标记的过敏原（抗原），且用于标记酶的抗原和用于包被的抗原相同，大大简化了试剂的制备过程。
本发明是按照以下技术方案实现的。 
一种牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，包括显色液A，显色液B，终止液，以及牛奶过敏的阴性和阳性质控血清；其特点是还包括： 
a.包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板是用0.2mol/L的碳酸盐缓冲液，将β-乳球蛋稀释为50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中包被，室温包被过夜；加入封闭液180ul/孔4℃过夜，封闭微孔板中的未结合位点，拍干后通风晾干备用；
b.辣根过氧化物酶标记β-乳球蛋白抗原采用改良的过碘酸钠法，具体为将β-乳球蛋白0.3 mol/L 碳酸盐缓冲液中于4℃透析过夜，取出所得抗原加入已活化的β-乳球蛋白标记辣根过氧化物酶，反应1 h后用NaBH4溶液终止，将所得酶结合物粗品于平衡液4℃透析过夜，取出已透析酶结合物，上样于已平衡好的Sephadex G-200 凝胶柱，用平衡液洗脱，收集，用 0.45 μm的滤膜过滤除菌，分装，4 ℃保存备用。
所述牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，其封闭液是含2%牛血清白蛋白，5%蔗糖的磷酸盐缓冲液。 
所述牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，其平衡液是0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。 
所述牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，将牛奶过敏原进行辣根过氧化物酶标记。
一种如权利要求1所述方法制备的牛奶过敏原检测试剂盒，包括显色液A、显色液B，终止液，以及牛奶过敏的阴性和阳性质控血清；而该试剂盒还包括：包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板，辣根过氧化物酶标记的β-乳球蛋白抗原。 
这样设计的本发明，采用双抗原夹心法检测牛奶过敏血清中的特异性抗体，与间接法相比，由于使用了酶标抗原而非酶标抗体，酶标抗原不再识别和结合与特异性抗体同属一型的其他无关抗体，从而使检测的特异度进一步提高有利于降低假阳性结果和检测本底；另一方面，由于不需要酶标抗体，省去了饲养、免疫、采血、处死动物等制备抗体的过程，从而降低了成本和工作量；由于检测时患者血清不需要预先稀释，简化了检测步骤。 
附图说明
图1 为双抗原夹心法牛奶过敏ELISA体外诊断方法的原理示意图； 
图2 为双抗原夹心法检测牛奶过敏的操作方法示意图。
其中：1.聚苯乙烯微孔板        
2.固相于微孔板的牛奶过敏原（包被抗原）
3.待检者血清中的牛奶过敏特异性抗体
4.标记了辣根过氧化物酶的牛奶过敏原（酶标抗原）
5.辣根过氧化物酶
6.显色底物
Ⅰ：过敏原包被
Ⅱ：加入待测血清
Ⅲ：加入酶标记过敏原
Ⅳ：加入底物显色 。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明进一步说明。 
1.高纯度牛奶过敏原的获得 
牛奶中的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白等成分是引起过敏反应的主要过敏原，目前这些组分都有市售的高纯度的标注品，可进行订购获得，也可根据文献报道的纯化方法通过自行提取的方法获得，本实验室已经摸索出成熟的提取β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白等高纯度单一过敏原的纯化工艺。现以β-乳球蛋白为例对提取工艺进行介绍。
1.1材料和试剂： 
1.1.1所需材料
新鲜未加工牛奶；低温高速离心机；水浴锅；真空泵；葡聚糖凝胶（Sephadex-G200，Sephadex-DEAE-A50，美国DPC生物公司）；Mini p-4垂直凝胶电泳槽（北京凯元信瑞仪器有限公司）；电泳仪及转膜电泳槽（美国BIO-RAD公司）；全自动化学发光凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）；蛋白纯化设备（紫外检测仪、蛋白收集器、恒流蠕动泵 上海沪西分析仪器厂）；蛋白超滤装置（Stirred Ultrafiltration Cells 8010 Millipore）酶标分析仪（DNM－9602，北京普朗新技术有限公司）
1.1.2 相关试剂配方
1.1.2.1磷酸缓冲液（PB 0.01mol/L）
PB 0.1mol/L 
ddH2O 3.6L
NaH2PO4·2H2O 11.84g
Na2HPO4·12H2O 116g
磁力搅拌，充分溶解后加ddH2O定容至4L。
0.01mol/L的PB由0.1mol/L的PB用蒸馏水稀释10倍，并调节pH至6.8获得 
1.1.2.2 1mol/L NaCl的PB：
NaCl 58.5g
PB 0.01mol/L 1L
磁力搅拌，充分溶解
1.2 β-乳球蛋白提取过程
1.2.1制备脱脂奶(粗提)
新鲜未加工牛奶低温离心5000rpm，20min，吸去上层大部分脂肪，并用双层纱布过滤后即得脱脂奶。
1.2.2 等电点沉淀分离乳清与酪蛋白 
脱脂奶加入等量的磷酸缓冲液（PB）,用盐酸调pH至4.6，此时有固体成分（酪蛋白）析出，40℃水浴30min，使酪蛋白充分析出。8000rpm，30min，上清即为乳清，沉淀为酪蛋白，分别收集。乳清采用millipore ultra membrane 超滤器，以截流分子量10 000的超滤膜对进行正压超滤浓缩。
1.2.3凝胶层析分离乳清蛋白， 
选用sephadex G200凝胶，溶胀处理，脱气30分钟后装柱，用0.01M pH6.8的磷酸盐溶液（PB）平衡及洗脱，将浓缩乳清上样，收集各峰组分。通过SDS-PAGE电泳观察，含有分子量为18kDa（β-乳球蛋白）和14kDa（α-乳白蛋白）的组分。
1.2.1.4 离子交换层析分离β-乳球蛋白和α-乳白蛋白 
将浓缩乳清经sephadex G200凝胶层析后得到的只含有14kDa和18kDa蛋白的组分再次超滤浓缩后进行离子交换层析，选择DEAE sephadex A50凝胶，溶胀后脱气装柱，用0.01M pH6.8的PB充分平衡，用含浓度为0.1M—1M NaCl的PB进行梯度洗脱，收集各峰组分。通过电泳观察确定出只含有β-乳球蛋白的组分，超滤浓缩后储存备用。
2. β-乳球蛋白包被，制备酶标反应板（如图2中步骤Ⅰ） 
（此步骤同于食物过敏间接法ELISA的过敏原包被过程，即为常规的ELISA包被方法）
2.1所需材料和试剂
2.1.1 相关材料
96孔聚苯乙烯酶标板（图1中“1”）；牛血清白蛋白（BSA）；蔗糖；微量加样器。
2.1.2 相关试剂配方 
2.1.2.1 包被缓冲液（0.2mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.5）
NaHCO3 33.6g
ddH2O 1.8L
调pH至9.5，定容至2L，4℃保存备用
2.1.2.2磷酸盐缓冲液（PBS 0.01mol/L,pH7.4）
PB 0.1M 400ml
NaCl 34g
ddH2O 3.5L
调PH至7.4，加ddH2O定容至4L。
2.1.2.3封闭液（含2%BSA，5%蔗糖的PBS） 
BSA 2g
蔗糖 5g
PBS 100ml
    56℃灭活30min。
2.2 操作步骤 
用包被缓冲液将β-乳球蛋稀释为50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中，室温包被过夜；之后按180ul/孔的量加入封闭液4℃过夜,封闭微孔板中的未结合位点。拍干后通风晾干备用
3.乳球蛋白标记辣根过氧化物酶（HRP）
酶标抗原的制备采用改良的过碘酸钠法，为常规的成熟方法。
3.1所需材料和试剂 
3.1.1相关材料
HRP；透析袋（分子量截流范围10kDa）；葡聚糖凝胶（Sephadex-G200，美国DPC生物公司）；蛋白纯化设备（紫外检测仪、蛋白收集器、恒流蠕动泵 上海沪西分析仪器厂）；
3.1.2相关试剂配方
3.1.2.1  mol/L 碳酸盐缓冲液，pH 9.5
NaHCO3 100.8g
ddH2O 3.8L
调pH至9.5，定容至4L，4℃保存备用。
3.1.2.2　NaBH4溶液 
NaBH4 8mg
ddH2O 2ml
现用现配，剧毒，注意防护。
3.1.2.3平衡液（0.01 mol/L 的PBS（同上） 
纯化得到的适量浓度的抗原于0.3 mol/L 碳酸盐缓冲液中于4℃透析过夜；透析后取出抗原加入已活化的HRP，避光，搅拌，反应1 h后用NaBH4溶液终止。将酶结合物粗品于平衡液（0.01 mol/L 的PBS）于4℃透析过夜。之后取出已透析酶结合物，上样于已平衡好的Sephadex G-200 凝胶柱，用平衡液洗脱，收集，即得到纯化的酶标记抗原。用0.45 μm的滤膜过滤除菌，分装，4 ℃保存，并用实验测试最佳工作浓度。
4.双抗原夹心法ELISA检测牛奶过敏的体外诊断方法的建立 
以包被的β-乳球蛋白和酶标记的β-乳球蛋白构建双抗原夹心法，捕获患者血清中的过敏特异性抗体
4.1所需材料和试剂
4.1.1相关材料
酶标分析仪（DNM－9602，北京普朗新技术有限公司）；微量加样器
4.1.2相关试剂配方
4.1.2.1 酶标抗原稀释液
样品稀释液为处理的新生牛血清，简要程序为硫酸铵盐析去除球蛋白，经生理盐水透析平衡、灭活、过滤后分装，4℃保存备用。
4.1.2.2 10倍洗液 
ddH2O 140ml
Tris 12.12g
NaCl 17.72g
Proclin300 10ml
MgCl2（1mol/L） 2ml
ZnCl2（0.1mol/L） 2ml
用HCl或NaOH调pH使其在7.3~7.5，再加入4ml的Tween20，用去离子水定容至200ml，最后用0.2μm的滤膜过滤，用时10倍稀释。
4.1.2.3显色液A为市售商品 
ddH2O 450ml
醋酸钠 8.2g
柠檬酸 1.58g
30% H2O2 0.27ml
用1M柠檬酸或10M NaOH调pH至5.3，ddH2O定容至500ml，分装，4℃储存，
4.1.2.4显色液B为市售商品
ddH2O 400ml
EDTA 0.186g
柠檬酸 0.96g
10M NaOH 0.54ml
丙三醇 50ml
TMB-HC l 0.24g
上述反应注意避光，调节pH值3.0，用ddH2O  定容至500ml，分装4℃储存。
4.1.2.5终止液为市售商品 
ddH2O 400ml
12M浓H2SO4 13.9ml
混匀，用去离子水定容至500ml，分装4℃储存。
4.1.2.6 阳性质控血清 
从临床收集足量确诊的牛奶过敏患者血清，混合后作为阳性质控血清。
4.1.2.7 阴性质控血清 
从临床收集足量的正常人血清，混合后作为阴性质控血清。
4.2 操作步骤 
检测模式为一步法，检测时血清不需要预先稀释，在包被了β-乳球蛋白的微孔中加入10ul的血清原液和100ul的酶标记β-乳球蛋白，37 ℃孵育1 hour，洗板拍干后加入显色液A、B各50ul，室温避光反应15min，后加入终止液，以620nm为参考波长，测定450nm处的吸光度（A450）。以阴性质控血清的吸光度值（N）的2.1倍（2.1N）为区分阴阳性结果的临床分析界值，血清测定的吸光度值大于2.1N，则判断为阳性，提示患者为牛奶过敏，小于2.1N则为阴性。

Claims (4)

1. 一种牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，包括显色液A，显色液B，终止液，以及牛奶过敏的阴性和阳性质控血清；其特征在于：
a.包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板是用0.2mol/L的碳酸盐缓冲液，将β-乳球蛋稀释为50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中包被，室温包被过夜；加入封闭液180ul/孔4℃过夜，封闭微孔板中的未结合位点，拍干后通风晾干备用；
b.辣根过氧化物酶标记的β-乳球蛋白抗原，是将β-乳球蛋白0.3 mol/L 碳酸盐缓冲液中于4℃透析过夜，取出所得抗原加入已活化的β-乳球蛋白标记辣根过氧化物酶，反应1 h后用NaBH4溶液终止，将所得酶结合物粗品于平衡液4℃透析过夜，取出已透析酶结合物，上样于已平衡好的Sephadex G-200 凝胶柱，用平衡液洗脱，收集，用 0.45 μm的滤膜过滤除菌，分装，4 ℃保存备用。
2.根据权利要求1所述牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：封闭液是含2%牛血清白蛋白，5%蔗糖的磷酸盐缓冲液。
3. 根据权利要求2所述牛奶过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：平衡液是0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。
4.一种如权利要求1所述的牛奶过敏原检测试剂盒，包括显色液A、显色液B，终止液，牛奶过敏的阴性和阳性质控血清，其特征在于：该试剂盒还包括：包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板，辣根过氧化物酶标记的β-乳球蛋白抗原。
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CN109030836A (zh) * 2018-10-25 2018-12-18 苏州大学附属儿童医院 食物蛋白特异性IgA抗体检测ELISA试剂盒及其应用

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