CN113156106B - 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用 - Google Patents

一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113156106B
CN113156106B CN202110141751.5A CN202110141751A CN113156106B CN 113156106 B CN113156106 B CN 113156106B CN 202110141751 A CN202110141751 A CN 202110141751A CN 113156106 B CN113156106 B CN 113156106B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bgt
beta
colloidal gold
polyclonal antibody
venom
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110141751.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113156106A (zh
Inventor
李文辉
张云
陆慧娟
林博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Institute of Zoology of CAS filed Critical Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority to CN202110141751.5A priority Critical patent/CN113156106B/zh
Publication of CN113156106A publication Critical patent/CN113156106A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113156106B publication Critical patent/CN113156106B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/42—Poisoning, e.g. from bites or stings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物学免疫方法的测定技术领域，特别涉及一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用。所述检测卡是由PVC背板、硝酸纤维素膜(NC膜)、胶体金垫、样品垫、吸水滤纸组成，所述的样品垫为玻璃纤维，所述的胶体金垫上喷胶体金标记的兔抗β‑BGT多克隆抗体，所述的硝酸纤维素膜C线包被羊抗兔IgG多克隆抗体，T线包被兔抗β‑BGT多克隆抗体。本发明制备方法简单，特异性高，稳定性好，检测方法简单，也方便携带,可以快速检测银环蛇毒，5‑10分钟即可判断是否为银环蛇咬伤，可以为治疗蛇伤提供一个判断毒蛇咬伤的诊断工具，为患者争取更多的治疗时间,辅助临床抗蛇毒血清用量，并且经济实用。

Description

一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方 法及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的 检测卡、制备方法及其应用。
背景技术
临床上对蛇伤患者的治疗，需要及时处理伤口，开展对症治疗。毒蛇咬伤是一个全球 性的公共问题，世界卫生组织在2018年将蛇咬伤归类为高度优先被忽视的热带疾病(NTD)， 并指出抗蛇毒血清是治疗蛇伤的唯一有效解毒药。临床上对蛇伤患者的治疗，最紧要的是 准确判断咬伤蛇种，才能有针对性的注射特异性抗蛇毒血清。不同种毒蛇咬伤需要注射特 定的抗蛇毒血清，因每种毒蛇毒液含有不同的成分，致死组分也不一样。
在医院接诊时，常规的蛇种鉴定需要一系列的生化检测，耗费较长的时间，且很难准 确判定被何种毒蛇咬伤，容易错过蛇伤治疗的黄金治疗时间，造成更严重的并发症甚至死 亡。越早注射抗蛇毒血清，病人愈后越快、越好。目前医院可用的抗蛇毒血清有多价血清和单价血清：多价血清在无法准确辨别为何种毒蛇咬伤时使用，可以中和特定的几种蛇毒，但因蛋白含量过高引发的过敏及血清病也很严重；而注射单价抗蛇毒血清，可使受害者更迅速、有效地康复，且副作用最小。因此快速鉴别咬伤毒蛇种类可正确指导临床治疗注射特异性的抗蛇毒血清，造福患者。目前，蛇咬伤蛇种鉴定仍是蛇伤中毒临床治疗需要突破的一大瓶颈。
银环蛇毒液属于神经性毒，咬伤初期症状较轻，伤口小且无红肿流血，容易被忽视。 但神经性毒发病急，患者会出现无力嗜睡、呼吸困难，得不到及时治疗就会呼吸衰竭而亡。 银环蛇咬伤治疗的最佳时间是4-6小时。蛇伤患者多在山区、农村，蛇常出没在这些地方， 患者被咬后离医院较远，简单、快速地判断咬伤蛇种为救治病人提供更多的便利和生存的 可能。
在检测技术上，现有技术利用抗体检测抗原是相对特异性好、快速简单的方法。在许 多LFA(Lateral flow assay)研究中，单克隆抗体被用于在同一平台上捕获和包被单一抗原。然而，建立一个针对所有毒素家族的单克隆抗体库对蛇毒不起作用，因为它们的蛋白质组成复杂。一些研究通过使用物种特异性抗体(SSAb)设计了蛇毒检测条，这是一种超特异性抗体，以提高其灵敏度和特异性。然而，多步纯化不仅会导致更多特异性抗体的丢失，还会增加设备的成本。此外，这无疑限制了应用范围和跨区域使用的可能性。制备单 个蛇毒成分的单克隆抗体可以大大提高检测的特异性，但单抗本身也存在一些缺陷。单抗 相对于多抗的亲和力要弱，对酶标板的吸附性不够好，同时在进行酶或生物素标记的操作 中稳定性也较差。相比单克隆抗体的制备需要无菌的环境培养细胞，并进行细胞融合筛选 等步骤，多克隆抗体的亲和力强，对酶标板的吸附性较好，且制备方法简单、快速，无需 严格的技术手段。但是现有的免疫诊断技术大多是利用多克隆抗体检测毒素，由于不同蛇 毒多抗之间存在交叉反应，因此特异性较差。也就是说现有技术还没有发现特异性好，不 与其它蛇毒存在交叉反应的多克隆抗体。而且现有技术在制备抗体时，多采用甲醛脱毒抗 原大剂量多次免疫法。此方法不仅制备周期长，而且所需抗原剂量大，而天然银环蛇的排 毒量很低，天然毒素(抗原)来源困难。
但是专利号为201010610908.6β-银环蛇毒素检测试剂盒及其制备方法，采用胶体金 免疫层析技术制备β-银环蛇毒素检测试剂盒，试剂盒采用胶体金垫为胶体金标记的β-银 环蛇毒素单克隆抗体聚酯膜，硝酸纤维素膜上依次包被了β-银环蛇毒素单克隆抗体作为 检测线(T线)，羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线(C线)。其采用β-银环蛇毒素单克隆抗体。单克隆抗体制作复杂，多采用腹腔液收集，成本高，获取的抗体量远远低于多克隆抗体，此外单克隆抗体仅针对于β-BGT的某一抗原决定簇，然而β-BGT具有多个亚型，变 异程度大，不同地区的蛇种之间β-BGT在组成和含量上存在差异，因此仅用单抗来制备的 话，会导致漏检，或假阴性的情况出现。兔抗β-BGT多克隆抗体来源于实验用白兔，制作 成本低、耗时短、免疫一到两只白兔即可获取足够的多克隆抗体，并可以持续免疫，多次 获取免疫多克隆抗体。操作简单易于产业化，亲和力强，特异性高，稳定性好。单抗只识 别抗原特定区域，多抗对抗原的覆盖更全面，在检测时会更具有优势。
专利号为2009201261408的蛇毒鉴别胶体金试纸条的专利：设置有阳性对照条和阴性 对照条，阴性对照条与纤维薄膜之间的硝酸纤维素膜上设有1-4种蛇的种特异性抗体条， 纤维薄膜上段包裹有复合抗体。此专利使用复合抗体，且结构复杂，而且这4种抗体是否 分别对其蛇毒具有高度特异性，其中的一种或多种抗体可能存在对其他蛇毒的交叉特异 性，在检测时，会出现多条阳性条带，无法判断咬伤蛇种。
综上所述，目前我国并没有专一性快速检测银环蛇咬伤的快速诊断工具。因此，开发 一种快速识别是否为银环蛇咬伤的工具，非常必要。快速准确检测毒蛇咬伤患者为银环蛇 咬伤有助于医生尽早使用抗银环蛇毒血清，有效对症治疗。
确认银环蛇咬伤，这意味着受害者接受的手术干预更少，并且由于早期施用抗蛇毒血 清，预后更好。
发明内容
针对目前国内无快速检测蛇咬伤的诊断工具，本发明提供了一种利用胶体金免疫层析 法检测银环蛇毒的检测卡，技术方案如下：
一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡，其特征在于：所述检测卡是由样 品垫(1)、PVC底板(5)、NC膜(硝酸纤维素膜)(7)、胶体金垫(2)、吸水滤纸(4) 组成，所述的样品垫为玻璃纤维，所述的NC膜(硝酸纤维素膜)(7)包括控制线(C线) (3)和测试线(T线)(6)，所述的胶体金垫(2)上喷胶体金标记的兔抗β-BGT多克 隆抗体，所述的控制线(C线)(3)包被羊抗兔IgG多克隆抗体，所述的测试线(T线) (6)包被兔抗β-BGT多克隆抗体。
进一步地，所述的检测卡还包括外包装卡壳。
本发明还提供利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒检测卡的制备方法，包括以下步 骤：
(1)制备兔抗β-BGT多克隆抗体，准备羊抗兔IgG多克隆抗体；
(2)制备胶体金,并进行抗体标记，得到兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物；
(3)制备胶体金垫；
将兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物按1mL均匀铺在玻璃纤维上，再置干燥间，在36℃-38℃，湿度小于30％的条件下干燥16-18小时，制成胶体金垫；
(4)包被兔抗β-BGT多克隆抗体和羊抗兔IgG多克隆抗体
设定划膜仪划线参数1μL/cm，室温环境操作，湿度控制在40％-60％，分别用微量进 样器取浓度为0.1mg/ml的抗体、取浓度为0.5mg/ml羊抗兔IgG抗体，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口，将贴有硝酸纤维素膜的PVC底板置于划膜仪的往复运动平台上，开启 划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆兔抗β-BGT多克隆抗体(T线)、羊抗兔IgG多克隆抗体(C 线)，划线后于37℃的烘箱中干燥2小时，后放入干燥剂，密封，阴凉处存放，保存备用；
(5)样品垫的处理
将玻璃纤维浸泡于0.01M pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中20-40min，其中磷酸盐缓 冲溶液中含0.5-1.5％BSA，0.5-1.0％Tweeen20，于烘干箱中37℃烘干，保存，备用，
贴样品垫；使用切条机，将NC膜设计宽度为4mm进行切条，得到检测卡；将切好的检测卡放进外包装卡壳的下卡壳固定的位置，再放上卡壳的上卡盖，重合压紧。
进一步地，所述的胶体金是由氯金酸在柠檬酸三钠还原作用下制备成粒径20-30nm的 金溶胶。
进一步地，所述的兔抗β-BGT多克隆抗体是采用低剂量抗原快速免疫法制备得到。
进一步地，所述的低剂量抗原快速免疫法制备兔抗β-BGT多克隆抗体的方法，包括以 下步骤：
(1)首先从银环蛇粗毒中分离纯化并鉴定得到β-BGT，开始第一次免疫，进行β-BGT抗原甲醛脱毒处理，采用0.2％甲醛与抗原混匀，37度下脱毒5-7天，初次免疫时，使用 1mg脱毒后的β-BGT作为抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀成乳化液，多点免疫实验兔；
(2)10天后开始第二次免疫，也即加强免疫，将天然、未脱毒的8μgβ-BGT抗原与 弗氏不完全佐剂等体积混匀成乳化液，多点免疫实验兔；
(3)之后每隔一周采用步骤(2)中的方法加强免疫一次，共免疫2次；
(4)提取抗体，取第四次免疫后一周的兔血清，经protein A柱纯化，0.01M PBS透析、浓缩至1-2mg/ml，获得兔抗β-BGT多克隆抗体，-20℃保存。
进一步地，所述的柠檬酸三钠还原法制备胶体金的制备方法，包括以下步骤：
(1)取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；一边搅拌，一边加入1％柠檬酸三钠溶液1-2ml；
(2)待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸10-12min，冷却后，4℃避光保存，制得粒径20-30nm的金溶胶。
进一步地，所述的抗体标记方法，包括以下步骤：
(1)取1mL粒径20-30nm的金溶胶溶液于2mL试管中，加入0.2M K2CO37.0μl/ml 混匀，使pH为7.0-8.0；
(2)在上述溶液中加入兔抗β-BGT多克隆抗体，标记抗体蛋白含量为10μg/ml，混匀后静置10min；
(3)在上述溶液加入20μl/ml封闭液(0.01M PBS)，混匀后静置10min；
(4)将上述溶液在4℃、12000r/min离心5min；去掉上清液后，加入1/10体积的复溶液CS复溶,即得到兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物，所述复溶液CS为0.01M PB+1％BSA+5％蔗糖。
本发明还提供该银环蛇毒检测卡的应用，所述银环蛇毒检测卡可对毒蛇咬伤患者的生 物样本包括但不限于血液、血清、咬伤部位冲洗液进行检测，根据显色反应判断是否为银 环蛇咬伤。
进一步地，所述银环蛇毒检测卡可对明确为银环蛇毒蛇咬伤并使用抗银环蛇毒血清治 疗患者的生物样本包括但不限于血液、血清、咬伤部位冲洗液进行检测，并指导抗银环蛇 毒血清的用量。
同时，最新研究结果揭示了国产抗银环蛇毒血清并不能中和银环蛇毒已经产生的神经 毒性症状(Liang et al.In Vitro Neurotoxicity ofChinese Krait(Bungarusmulticinctus)Venom andNeutralizationby Antivenoms.Toxins 2021,13,49. https://doi.org/10.3390/toxins13010049)。提示抗银环蛇毒血清只可以中和游离的银环蛇毒，因此，本发明检测卡可用于检测患者血清中银环蛇毒的残留，指导抗银环蛇毒血清的用量。
本发明创造性地使用兔抗β-BGT多克隆抗体在检测卡中，并且在制作β-BGT兔多克隆抗体时，采用低剂量抗原快速免疫法，制备得到的抗体特异性好，能快速地识别银环蛇毒，而与其他蛇毒无明显交叉条带。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明从银环蛇粗毒中分离得到较纯的银环蛇毒素(Bungarotoxin，BGT)组分， 筛选出银环蛇粗毒中含量较高、相对特异的β-bungarotoxin(β-BGT)，制备β-BGT兔抗，可特异性地识别银环蛇毒，并且这种抗体与国内八种其他毒蛇毒液(眼镜蛇毒、竹叶 青毒、五步蛇毒、蝰蛇毒、蝮蛇毒、烙铁头毒为10mg/ml及以下,眼镜王蛇毒为2mg/ml 及以下,金环蛇毒为1mg/ml及以下)无交叉反应。
(2)本发明制备的检测卡可以快速检测到银环蛇毒，5-10分钟即可判断是否为银环 蛇咬伤，可以为临床治疗蛇伤提供一个判断蛇伤的诊断工具，为患者争取更多的治疗时间， 并指导抗银环蛇毒血清的用量。
(3)本发明制备的检测卡特异性高稳定性好，检测方法简单，也方便携带。
附图及附图说明
图1为β-BGT第四次、第五次、第八次免疫后兔血清经protein A柱纯化出β-BGT抗体 对银环蛇毒及β-BGT特异性识别的蛋白质印迹图；
图2为ELISA比较第四次、第五次、第八次免疫后β-BGT抗体的效价稳定性比较图；
图3为免疫前兔血清与9种蛇毒的交叉反应图，其中图中1-银环蛇毒；2-金环蛇毒；3- 竹叶青蛇毒；4-眼镜蛇毒；5-五步蛇毒；6-蝰蛇毒；7-烙铁头毒；8-眼镜王蛇毒；9- 蝮蛇毒(每种蛇毒5μg)；
图4为本发明制备的β-BGT抗体与9种蛇毒的交叉反应结果图；其中图中1-银环蛇毒；2- 金环蛇毒；3-竹叶蛇毒；4-眼镜蛇毒；5-五步蛇毒；6-蝰蛇毒；7-烙铁头毒；8-眼镜王蛇毒；9-蝮蛇毒(每种蛇毒5μg)；10-β-BGT(1μg)；
图5为间接ELISA评估抗体与9种蛇毒的交叉反应结果图，其中图中1-银环蛇毒；2-金 环蛇毒；3-眼镜蛇毒；4-眼镜王蛇毒；5-竹叶青毒；6-五步蛇毒；7-蝰蛇毒；8烙铁 头毒；9-蝮蛇毒；0-空白(每种蛇毒1μg)；
图6为夹心ELISA评估β-BGT抗体识别银环蛇毒最低检测限结果图；
图7为检测卡结构示意图；其中图中1-样品垫，2-胶体金垫，3-控制线(C线)，4-吸水 滤纸，5-PVC底板，6-测试线(T线)，7-NC膜(硝酸纤维素膜)；
图8为检测卡判读示意图；
图9为8种交叉物蛇毒检测结果图；
图10为银环蛇毒抗原梯度检测结果图。
具体实施方式
1.β-BGT兔多克隆抗体的制备
从银环蛇粗毒中分离得到较纯的银环蛇毒素(Bungarotoxin，BGT)组分，筛选出银环蛇粗毒中含量较高、相对特异的β-bungarotoxin(β-BGT)作为胶体金检测卡的候选 组分，制备β-BGT兔抗，发现β-BGT兔抗可特异性地识别银环蛇毒，并且发现β-BGT兔 抗与其他国内八种毒蛇毒液(眼镜蛇毒、竹叶青毒、五步蛇毒、蝰蛇毒、蝮蛇毒、烙铁头 毒为10mg/ml及以下,眼镜王蛇毒为2mg/ml及以下,金环蛇毒为1mg/ml及以下)无交 叉反应。
1.1低剂量抗原快速免疫法制备兔抗β-BGT多克隆抗体的方法，包括以下步骤：
1)：首先从银环蛇粗毒中分离纯化并鉴定得到β-BGT，开始第一次免疫，对1mgβ-BGT 进行甲醛脱毒处理，将脱毒后的β-BGT作为抗原与弗氏完全佐剂混匀乳化多点免疫实验 兔；
2)：10天后开始第二次免疫，使用天然、未脱毒的8μgβ-BGT抗原与弗氏不完全佐剂混匀乳化多点免疫实验兔，
3)：之后每隔7天使用S2步骤中的方法加强免疫一次，共免疫2次，
4)：提取抗体，取第四次免疫后一周的兔血清，经protein A柱纯化，0.01M PBS透析、浓缩至1-2mg/ml，获得兔抗β-BGT多克隆抗体，-20℃保存。
以上方法制备得到β-BGT多克隆抗体要求如表1所示。
表1 β-BGT多克隆抗体特征
项目 质量要求
外观 澄清、无沉淀析出
浓度 1-2mg/mL
纯度 经proteinA柱纯化后的IgG，纯度不低于90％
效价 大约1：1000000
本方法采用首次对抗原进行甲醛脱毒，随后3次采用小剂量天然无脱毒的抗原进行制 备β-BGT多克隆抗体。相对现有技术，每次需要消耗4mg以上的抗原，需要4次以上的免疫，至少需要42天时间。本发明方法全程只需要消耗大约1.024mg抗原，只需进行4 次免疫，即可获得特异稳定的抗体，效价稳定于1：1000000；36-38天时间就可以制备 得到特异性良好的β-BGT多克隆抗体。用本发明方法，每1毫升的兔血清可以提取7.0-8.0 毫克的特异性抗体，且只需通过protein A柱一步亲和纯化就可以获得该抗体，足以产生 500-600条检测卡。
本发明使用一种节约蛇毒样本，节省时间的免疫方法,得到效价稳定、特异性好的多克隆抗体。
1.2β-BGT兔多克隆抗体的稳定性
发明人使用β-BGT第四次、第五次、第八次免疫后兔血清经proteinA柱纯化出β -BGT抗体后，进行特异性检测。
结果显示如图1所示：说明所本发明方法制备的β-BGT抗体均较可特异性识别银环蛇毒，且杂带少。
同时使用ELISA:比较第四次、第五次、第八次免疫后β-BGT抗体的效价。抗体的 效价定义为：能够使底物发生显色反应时抗体最大稀释倍数的一半。
结果如图2所示：第四次、第五次、第八次免疫后β-BGT抗体的效价相近，因此，用于制备试纸条的β-BGT抗体可采用第四次免疫之后的任何一次抗体，可达相近的效价。说明本发明方法制备的β-BGT抗体稳定性较强。
1.3蛋白质印迹评估抗体特异性评估
具体步骤：分别取5μg银环蛇毒溶液和其他8种蛇毒溶液、1μgβ-BGT溶液分别与还原型上样缓冲液混匀(2个重复)，沸水煮样10min-15min后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 湿转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉常温封闭2h,2个重复样品孵育一抗4℃过夜，2个一抗 分别为β-BGT抗体、免疫前兔血清，TBST洗涤后常温孵育羊抗兔二抗2h,洗涤后滴加高灵 敏化学发光检测显色液，利用显影系统观察免疫条带。
结果显示制备的β-BGT多克隆抗体能特异地识别银环蛇毒而与其他蛇毒无明显交叉 条带，见图3和图4。
1.4间接ELISA评估抗体与9种蛇毒的交叉显色反应 9种蛇毒溶液用ELISA包被液稀释成10μg/ml的溶液，酶标板每孔加入100μl,4℃过夜， 倒掉包被液后加入3％sigma的BSA常温封闭2h,TBST清洗3-5次，分别加入100μl的1： 5000的1.4mg/mlβ-BGT抗体37℃孵育45min,TBST清洗3-5次后均加入100μl的1：5000 羊抗兔二抗37℃孵育45min，TBST清洗3-5次后加入100μlELISA显色液，显色20-30min 后肉眼终止加入50μlELISA终止液，直接观察杯孔颜色并拍照记录。
间接ELISA评估抗体与9种蛇毒的交叉反应，利用显色反应直接观察交叉反应情况如 图5。发现β-BGT抗体特异性识别银环蛇毒，银环蛇毒的杯孔显色最深，其他蛇毒无明显的光学变化。
综上所述，通过1.2-1.3蛋白质印迹评估抗体特异性和间接ELISA评估抗体与9种蛇 毒的免疫交叉反应，说明本发明方法制备的抗体特异性高，并与其它8种蛇毒无明显交叉 反应。
1.5夹心ELISA评估抗体检测限
将β-BGT抗体进行生物素标记，透析成0.01MPBS溶液待用。ELISA包被液将β-BGT抗体稀释成10μg/ml的溶液，酶标板每孔加入100μl,4℃过夜，倒掉包被液后加入3％sigma的BSA常温封闭2h,TBST清洗3-5次，加入100μl梯度稀释(1μg～0.1ng)的银环蛇粗毒， 37℃孵育90min,TBST清洗3-5次后均加入100μl的1：5000生物素的β-BGT抗体(2mg/ml) 常温孵育2h，TBST清洗3-5次后加入1；5000的链霉亲和素二抗常温孵育45min-2h，TBST 清洗3-5次后加入100μlELISA显色液，显色20-30min后肉眼终止加入50μlELISA终止液， 用酶标仪检测每孔450nm下的光吸收值。光吸收值结果见图6
结果显示：生物素的β-BGT抗体(2mg/ml)最低可检测到的蛇毒量约1-10ng。
分别取注射9种蛇毒小鼠的血清、注射部位组织液进行ELISA水平上的检测，结果发 现β-BGT抗体可以特异性检测出9种样本中的银环蛇毒样本。
2.羊抗兔IgG多克隆抗体的准备
羊抗兔IgG多克隆抗体为品牌Proteintech，货号SA00001-2的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)。
3.胶体金垫的制备
1)：取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；一边搅拌，一边加入1％柠檬酸三钠溶液1-2ml；
2)：待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸10min，冷却后，4℃避光保存，制得粒径20-30nm的金溶胶。制备良好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面 不应有漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色。
3)：取1mL粒径20-30nm的金溶胶溶液于2mL试管中，加入0.2M K2CO3 7.0μl/ml 混匀，使pH在7.0-8.0；在溶液中加入兔抗β-BGT多克隆抗体，标记抗体蛋白含量为10μg /ml，混匀后静置10min；再加入20μl/ml封闭液0.01M PBS，混匀后静置10-12min；4℃、 12000r/min离心5min；1/10体积的复溶液复溶,即为兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标 记物。
4)：将兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物按1mL均匀铺在玻璃纤维上，再置干燥间，在温度37度，湿度小于30％的条件下干燥16小时，制成胶体金垫。
4.利用胶体金免疫层析法检测银环蛇毒的检测卡的制备
4.1检测卡的制备以及使用
4.1.1检测卡的制备
1)包被兔抗β-BGT多克隆抗体和羊抗兔IgG多克隆抗体
设定划膜仪划线参数1μL/cm，室温环境操作，湿度控制在40％-60％，分别用微量进 样器取浓度为0.1mg/ml的兔抗β-BGT多克隆抗体、取浓度为0.5mg/ml羊抗兔IgG抗体，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口，将贴有硝酸纤维素膜的PVC底板置于划膜仪的往复 运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆兔抗β-BGT多克隆抗体(T线)、羊抗 兔IgG多克隆抗体(C线)，划线后于37℃的烘箱中干燥2小时，后放入干燥剂，密封，阴 凉处存放，保存备用；
2)样品垫的处理
将玻璃纤维浸泡于0.01M pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中20-40min，其中磷酸盐缓冲 溶液中含0.5-1.5％BSA，0.5-1.0％Tweeen20，于烘干箱中37℃烘干，保存，备用。
3)检测卡的组装
在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水滤纸， 先将NC膜贴在PVC背板上，吸水滤纸贴在NC膜上端，压住NC膜2mm，胶体金垫贴在NC 膜下端，压住NC膜2mm，最后粘贴样品垫；使用切条机，将NC膜设计宽度为4mm进行切 条，得到检测卡；将切好的检测卡放进外包装卡壳的下卡壳固定的位置，再放上卡壳的上 卡盖，重合压紧。得到检测卡如图7。
4.1.2检测卡的使用
1)负压法从患者伤口处吸取组织液或采集伤口冲洗液，粗略进行浓度测定。若浓度 处于50ng/ml-1mg/ml之间，可以直接取采集液取80-100μl缓慢滴加到检测卡的加样处，5-10min观察结果，双显示线则为银环蛇咬伤。若高于1mg/ml，进行两次测定：采集液 直接测定；使用生理盐水(专用稀释液)稀释采集液10-100倍在可信区间。两次测定均 为双显示线，则为银环蛇咬伤，若只有高浓度测定为双显示线，稀释后为单显示线，则可 能为其他眼镜蛇科毒蛇咬伤。
2)采集患者血清80-100μl直接滴加到检测卡的加样处，观察结果，出现双显示线表 明患者为银环蛇咬伤，出观单显示线，则为非银环蛇咬伤。
3)如果患者在咬伤后检测卡检测患者血清条带较明显，注射抗银环蛇毒血清后1-2 天再次对患者血清进行检测卡测试，如果条带明显减弱或为阴性结果，则为患者注射少量 抗银环蛇毒血清或不再进行注射；如果条带依旧很明显可以考虑注射相对足量的抗银环蛇 毒血清，从而指导抗银环蛇毒血清的用量。
4.1.3检测卡结果显示：
阴性结果只显示一条控制线，表示此样本非银环蛇毒或非银环蛇咬伤；阳性结果显示 两条线，表示此样本为银环蛇毒或银环蛇咬伤。阳性结果如图10所示。
4.2效果验证
(1)阳性参考品符合率
阳性参考品为PBS溶液梯度稀释的银环蛇毒，设置5个较低浓度梯度50-1000ng/mL银环蛇毒，向加样孔内分别加入100μL的参考品，5-10min内读取结果，其检测结果全部 为阳性，符合率为100％。
(2)阴性参考品符合率
抗体保存液0.01MPBS、采血站获得的正常人血清作为阴性参考品，向加样孔内分别加 入100μL，检测结果均为阴性，符合率为100％。
(3)交叉物检测结果
交叉物为国内其他八种毒蛇(金环蛇、眼镜蛇、眼镜王蛇、五步蛇、竹叶青、蝰蛇、蝮蛇、烙铁头)的粗毒溶液，当眼镜蛇毒、竹叶青毒、五步蛇毒、蝰蛇毒、蝮蛇毒、烙铁 头毒为10mg/ml及以下,眼镜王蛇毒为2mg/ml及以下,金环蛇毒为1mg/ml及以下，均 为阴性结果。可信区间在1mg/ml以下。
(4)最低检出限
将银环蛇毒抗原梯度稀释于人血清中，向加样孔分别加入100μL，5-10min读取结果,如图10所示。结果显示，检测卡最低可以检测到5ng的银环蛇毒。
(5)精密性
随机抽取5个检测卡，测定20ng的银环蛇毒，5-10分钟内读取结果，均为阳性结果，且 显色一致。
(6)小鼠模拟蛇伤实验
分别给3只20g小鼠腹腔注射12μg银环蛇毒(根据动物剂量用药换算公式，4.6mg银环 蛇毒注入70kg人体换算)，15min后分别取腹腔液100μL,直接用检测卡检测样本，均为阳性结果。6h后再分别取3只小鼠腹腔液100μL，直接用检测卡检测样本，均为阳性结 果,但显色较弱，表明此时小鼠体内游离的银环蛇毒较少，抗银环蛇毒血清只中和体内游 离银环蛇毒素，无法中和已经结合的毒素。两次检测结果的变化提示可以在临床上提供抗 银环蛇毒血清用量的参考依据。

Claims (3)

1.一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒检测卡的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备兔抗β-BGT多克隆抗体，准备羊抗兔IgG多克隆抗体；
所述的兔抗β-BGT多克隆抗体是采用低剂量抗原快速免疫法制备得到，其制备方法，包括以下步骤：
（1）首先从银环蛇粗毒中分离纯化并鉴定得到β-BGT，开始第一次免疫，进行β-BGT抗原甲醛脱毒处理，采用0.2%甲醛与抗原混匀，37度下脱毒5-7天，初次免疫时，使用1mg 脱毒后的β-BGT作为抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀成乳化液，多点免疫实验兔；
（2）10天后开始第二次免疫，也即加强免疫，将天然、未脱毒的8µg β-BGT抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀成乳化液，多点免疫实验兔；
（3）之后每隔一周采用步骤（2）中的方法加强免疫一次，共免疫2次；
（4）提取抗体，取第四次免疫后一周的兔血清，经protein A柱纯化，0.01M PBS透析、浓缩至1-2mg/ml，获得兔抗β-BGT多克隆抗体，-20℃保存；
S2：制备胶体金,所述的胶体金是由氯金酸在柠檬酸三钠还原作用下制备成粒径20-30nm的金溶胶；进行抗体标记，得到兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物；
S3：制备胶体金垫；
将兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物按1mL均匀铺在玻璃纤维上，再置干燥间，在36℃-38℃，湿度小于 30% 的条件下干燥 16-18 小时，制成胶体金垫;
S4：包被兔抗β-BGT多克隆抗体和羊抗兔IgG多克隆抗体
设定划膜仪划线参数1μL/cm，室温环境操作，湿度控制在40%-60%，分别用微量进样器取浓度为0.1mg/ml的抗体、取浓度为0.5mg/ml羊抗兔IgG抗体，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口，将贴有硝酸纤维素膜的PVC底板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆兔抗β-BGT多克隆抗体作为T线、羊抗兔IgG多克隆抗体作为C线，划线后于37℃的烘箱中干燥2小时，后放入干燥剂，密封，阴凉处存放，保存备用；
S5：样品垫的处理
将玻璃纤维浸泡于0.01M pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中20-40 min，其中磷酸盐缓冲溶液中含0.5-1.5％BSA，0.5-1.0％Tweeen20，于烘干箱中37℃烘干，保存，备用，
贴样品垫；使用切条机，将NC膜设计宽度为4mm进行切条，得到检测卡；将切好的检测卡放进外包装卡壳的下卡壳固定的位置，再放上卡壳的上卡盖，重合压紧。
2.根据权利要求1所述的利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒检测卡的制备方法，其特征在于：所述的柠檬酸三钠还原法制备胶体金的制备方法，包括以下步骤：
（1）取0.01%氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；一边搅拌，一边加入1%柠檬酸三钠溶液1-2ml；
（2）待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸10-12min，冷却后，4℃避光保存，制得粒径20-30nm的金溶胶。
3.根据权利要求1所述的利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒检测卡的制备方法，其特征在于：抗体标记方法包括以下步骤：
（1）取1mL粒径20-30nm的金溶胶溶液于 2mL 试管中，加入0.2M K2CO3 7.0µl/ml混匀，使pH为7.0-8.0；
（2）在上述溶液中加入兔抗β-BGT多克隆抗体，标记抗体蛋白含量为 10µg /ml，混匀后静置 10min；
（3）在上述溶液加入20µl/ml封闭液0.01M PBS，混匀后静置 10min；
（4）将上述溶液在4℃、12000r/min 离心5min；去掉上清液后，加入1/10 体积的复溶液CS复溶,即得到兔抗β-BGT多克隆抗体-胶体金标记物，所述复溶液 CS为0.01M PB+1% BSA+5%蔗糖。
CN202110141751.5A 2021-02-02 2021-02-02 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用 Active CN113156106B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110141751.5A CN113156106B (zh) 2021-02-02 2021-02-02 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110141751.5A CN113156106B (zh) 2021-02-02 2021-02-02 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113156106A CN113156106A (zh) 2021-07-23
CN113156106B true CN113156106B (zh) 2022-08-23

Family

ID=76879164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110141751.5A Active CN113156106B (zh) 2021-02-02 2021-02-02 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113156106B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637072B (zh) * 2021-08-20 2024-01-26 上海赛伦生物技术股份有限公司 一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法及其应用
CN113848318B (zh) * 2021-09-26 2024-03-12 福建农林大学 青环海蛇毒素竞争法胶体金/纳米花免疫层析检测卡
CN114152757B (zh) * 2021-12-21 2022-09-09 云南大学 一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法
CN114354525B (zh) * 2022-01-11 2023-09-05 云南大学 一种α-银环蛇毒素检测探针、一种非诊断目的检测α-银环蛇毒素的方法
CN114560934B (zh) * 2022-01-25 2022-12-23 北京弘进久安生物科技有限公司 特异性结合β-银环蛇毒素的单克隆抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102539766A (zh) * 2010-12-29 2012-07-04 北京宝瑞源科技孵化有限公司 β-银环蛇毒素检测试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201331528Y (zh) * 2009-01-14 2009-10-21 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 蛇毒鉴别胶体金标记试纸条
CN103823055B (zh) * 2013-12-02 2017-01-11 南京师范大学 一种快速检测虾蟹螺原体胶体金免疫层析试纸条及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102539766A (zh) * 2010-12-29 2012-07-04 北京宝瑞源科技孵化有限公司 β-银环蛇毒素检测试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Immunoreactivity and neutralization study of Chinese Bungarus multicinctus antivenin and lab-prepared anti-bungarotoxin antisera towards purified bungarotoxins and snake venoms;Bo Lin，et al.;《PLOS NEGLECTED TROPICAL DISEASES》;20201130;第14卷(第11期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113156106A (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113156106B (zh) 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用
CN111518176B (zh) 一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法
CN103820394B (zh) 抗吗啡单克隆抗体、产生该抗体的细胞株、吗啡检测试剂盒及其制作方法
CN102854324B (zh) 快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法以及采用的试纸条
CN110361547B (zh) 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途
WO2016121832A1 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット
CN102421799A (zh) 用于高分子脂联素分析的新型单克隆抗体及其应用
JPH01503331A (ja) モノカインの検査法
KR20170106371A (ko) 마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 검출법 및 키트
CN109705216B (zh) 一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用
CN1687134A (zh) 幽门螺杆菌HpaA和ureB单克隆抗体、免疫测定法和诊断试剂盒
CN110763843B (zh) 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用
Shou-fu et al. Evaluation of partially purified soluble egg antigens in colloidal gold immunochromatography assay card for rapid detection of anti-Schistosoma japonicum antibodies
CN101216493A (zh) 一种用于胎膜早破诊断的试纸条及试剂盒
CN111187349A (zh) 单克隆抗体的制备方法
CN115166238A (zh) 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条
CN115166239A (zh) 牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条
CN101407544A (zh) 抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用
CN111944049B (zh) Slc12a9抗体的制备方法及其应用
CN111220809B (zh) 一种检测鸡或鸭骨骼肌肌钙蛋白i的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法与应用
CN209656715U (zh) 一种人体口腔液免疫球蛋白总含量的检测装置
WO2001081927A1 (fr) Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier
KR20090054313A (ko) 폐흡충 특이 항원의 생산을 위한 단클론 항체 및 폐흡충증신속 진단 키트
CN115453127A (zh) 一种快速鉴定银环蛇毒的检测盒及其制备方法
KR102168417B1 (ko) 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant