CN101407544A - 抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗高尔基体蛋白抗体及其应用。本发明用重组人GP73蛋白免疫动物获得了抗GP73多克隆抗体和特异性针对GP73的单克隆抗体，并且建立了免疫组化染色及双抗体夹心ELISA法等多种检测临床组织切片和血清样本中GP73的方法。实验证实，本发明获得的多克隆和单克隆抗体可用于制备不同检测方法的多种GP73检测试剂。

Description

抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用

技术领域：

本发明涉及抗高尔基体蛋白抗体及其应用。具体涉及抗人高尔基体蛋白(以下简称为GP73)的特异性单克隆和多克隆抗体，以及用所述的单抗和多抗制备不同检测方法的多种GP73检测试剂的应用。

背景技术：

目前肝癌的诊断主要依靠血清肿瘤标志物检测、影像学和组织学检查，其中甲胎蛋白(AFP)是目前临床诊断原发性肝细胞癌的最主要实验室指标。AFP虽为诊断肝癌的首选指标，但其敏感性在33％～85％之间(平均为56.3％)，特异性为30.9％～80％(平均为55.4％)。在肝癌的早期，约有30％～50％的患者AFP呈阴性或水平较低。寻找敏感性高、特异性强的肿瘤标志物，对于肝癌的早期诊断、改善病人的预后是十分必要而迫切的。

高尔基蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是新近发现的一个分子量为73KDa，定位于高尔基体上的II型跨膜糖蛋白。采用免疫组化的研究方法证实在人类的上皮细胞有着GP73的少量表达，而在正常的肝脏中，GP73仅在胆管上皮细胞表达，肝细胞基本不表达。但是病变的肝组织，特别是在肝癌的早期，GP73呈现过表达并且其表达水平与肝癌的进展程度相关。

最新的研究显示，GP73的胞外段经过蛋白酶切，可以从高尔基体膜上释放到细胞外，并且采用Western-Blot或是质谱(SELDI-TOF MS)的方法，在肝癌病人的血清中可以检测到GP73。通过对Western蛋白条带灰度的半定量分析发现，在肝癌特别是早期肝癌的诊断上，其敏感性为69％～76.9％(平均73％)，特异性为75％～92％(平均为83.5％)，明显优于AFP，因此国内外的学者认为GP73有望成为取代AFP的一个新型肝癌诊断标志物。但是Western和质谱这两种检测方法具有以下缺点：一是不易进行准确定量，第二是费时且操作不便，因两种方法均过于专业化，只能作为实验室小样本理论研究，不适宜用于大样本、高通量的筛选和应用型研究，难以将GP73用于临床肝癌病人珍断。

相对于Western blot等方法，酶联免疫吸附试验(ELISA)具有敏感性更高、易操作、结果可以客观定量并且可以重复测定便于动态监测和费用相对低廉等优点，而被广泛应用于临床病人多种肿瘤标志物的血清学检测。

目前上市的抗GP73抗体多为多克隆抗体，是采用人工合成的GP73氨基或羧基末端的一段多肽免疫动物后获得的血清。如Santa Cruz Biotechnology，Inc所售的抗GP73的多克隆抗体，是用合成的GP73氨基或羧基末端的一段多肽免疫山羊后获得的。而目前所见的抗GP73单抗则是针对所有II型高尔基膜蛋白而非特异性针对GP73这一种蛋白所制备出来的。

目前尚无以重组人GP73蛋白为抗原制备抗GP73多抗和单抗，也未见采用双抗体夹心ELISA检测肝癌病人血清中GP73的报道。

发明内容：

本发明的目的是制备抗GP73多克隆抗体和特异性针对GP73的单克隆抗体，并且将所制备的单克隆抗体用于GP73的定性及定量检测，特别是用酶联免疫吸附试验等多种不同方法检测血清样本中GP73的含量。

本发明分别采用重组人GP73蛋白免疫家兔获得了抗GP73多克隆抗体；免疫小鼠后经杂交瘤技术和多轮筛选后获得了特异性针对GP73的单克隆抗体(anti-GP73mAb，取名为6A2)。

制备上述抗GP73单克隆抗体所用的杂交瘤细胞，命名为6A2。已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC-C200815，保藏时间：2008年4月22日。

所述抗GP73单克隆抗体6A2，其重链与轻链可变区如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。其中：

SEQ ID NO：1是抗GP73单克隆抗体重链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：2是抗GP73单克隆抗体重链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是抗GP73单克隆抗体轻链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：4是抗GP73单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。

本发明用上述抗GP73单克隆抗体6A2作为捕获抗体，用上述抗GP73多克隆抗体为检测抗体，建立了检测GP73蛋白的双抗体夹心ELISA法，具体操作方式如下：

1.用抗GP73单克隆抗体包被ELISA板，4℃过夜；

2.用PBST洗涤3次后，加入1％脱脂奶粉37℃封闭1.5小时；

3.加入用1％脱脂奶粉稀释的GP73蛋白标准品和待测样本，以1％脱脂奶粉为空白

对照室温孵育90min；

4.洗涤3次后，加入抗GP73兔血清(1∶1000)，室温90min；

5.洗涤3次后，加入1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG，室温90min；

洗涤后，加入底物pNPP，室温显色30min，测A405nm的OD值。

用本发明的抗GP73单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA法检测血清中GP73，具有如下优点：

1、灵敏度高，定量准确

本发明建立的双抗体夹心ELISA检测血清中GP73含量的最低检测限仅为0.25ng/ml。

2、操作简便、时间短

相对于Western等方法，采用夹心ELISA法测定血清中GP73的含量，操作简便、检测时间短。常规的Western blot需要2天的时间。采用我们建立的夹心ELISA方法，从血清加入预先包被好的ELISA板，到获得准确的GP73含量值，仅需6小时。

3、便于动态监测

可重复测定便于动态监测，因此更具临床应用价值。

本发明还用上述抗GP73单克隆抗体建立了多种用于GP73检测的其它方法，包括：免疫印迹(Western blot，图1)、免疫沉淀(IP，图2)和免疫组化试验(图3)。利用上述抗GP73单克隆抗体6A2进行的如下三个试验，均取得了满意的结果：

1、Western蛋白印记实验结果表明本发明获得的抗GP73单克隆抗体可以很好的识别重组的His-GP73。

2、通过免疫沉淀实验检测出肝癌患者和正常人外周血液中存在的GP73，证明本发明制备的抗体可以在众多的血清蛋白中，特异性识别天然构象的GP73，并与之结合。

3、免疫组化实验结果显示染色清晰，准确定位于高尔基体上，没有任何非特异性吸附，并且在免疫组化应用中，抗体的效价高达1∶1000。

用本发明获得的抗GP73单克隆抗体，利用双抗体夹心ELISA法(酶联免疫吸附试验)、Western蛋白印记实验、免疫沉淀、免疫组化等实验方法，可以分别制备四种不同的检测GP73的试剂。

如前述，本发明用纯化的重组人GP73蛋白免疫家兔获得了抗GP73多克隆抗体。该抗GP73多克隆抗体也可用于GP73的研究和检测试剂制备。

附图说明：

图1是免疫印迹实验，图中，1是阳性参照(抗His抗体)，2是最后一次免疫的小鼠血清，3是抗GP73单克隆抗体；

图2是血清样本免疫沉淀实验，图中，1.是阴性参照，2.阳性参照，3-5.肝癌病人血清；

图3是免疫组化试验，图中，A为低倍镜下所见(放大10倍)，B为高倍镜下所见(放大40倍)；

图4是检测血清中GP73含量的标准曲线，横坐标是吸光度(A405)，纵坐标是GP73蛋白标准品的浓度(ng/ml)；

图5是重组人GP73蛋白质谱报告。

生物材料保藏信息：

培养物名称：杂交瘤细胞6A2

保藏编号：CCTCC-C200815

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏时间：2008年4月22日。

具体实施方式：

实施例1GP73单克隆抗体的制备

1、重组人GP73蛋白的制备

取等量的3份冻存人肝癌组织(来自于南京医科大学第一附属医院)，加入1ml Trizol后匀浆，按照说明书中的方法提取总RNA后，经反转录成cDNA，采用PCR扩增GP73片段。正向引物为5’-GC GGATCC CTC CAG ACA CGG ATC ATG GAG CTG GAA GGC-3’，反向引物为5’-GCA AGC TTG GAG TGT ATG ATT CCG CTT TTC ACG CTG-3’，反应条件为：经94℃5min热启动，94℃1min，60℃1min，72℃2min，40个循环后72℃延长10min。产物进行琼脂糖电泳后发现有一长度约为1100bp的片段被扩增出来，经测序证实和BLAST对比后，证实序列完全正确为人GP73片段。

扩增后的GP73片段经T4连接酶过夜连接后，连接于T载体并转入大肠杆菌XL1-Blue.涂于LB平板37℃过夜培养，次日挑取单个克隆接种于LB培养基振荡培养至OD₆₀₀＝2.0，提取质粒分别进行PCR及测序，证实序列完全正确。经酶切后，再将GP73片段插入表达载体pET-28-a(+)，同样转入XL1-Blue，进行质粒的扩增及PCR、限制性酶切鉴定，并再次测序。经上述鉴定后，证明插入序列及阅读框架完全正确。将表达载体pET-28-a(+)-GP73转入感受态的表达菌BL21(DE3)，进行诱导表达。His-GP73的最佳表达条件为以0.4mMIPTG，37℃诱导6hr，重组蛋白主要存在于细菌的周质腔内。大量培养、诱导后，经超声裂解细菌，8000g离心30min，弃去沉淀，留取上清。用0.2μm滤膜过滤后，采用AKTA的FPLC蛋白纯化仪，经HisTrap^TM HP亲和层析柱(5ml，GE)纯化His-GP73蛋白。纯化后的His-GP73蛋白经质谱鉴定证实其氨基酸组成与人GP73序列完全相同(图5)。

2.小鼠的免疫接种

免疫动物为6周龄雌性BALB/c小鼠。第一次免疫时，首先将20μg His-GP73蛋白与等体积的2×聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液混合，经100℃加热10min变性，然后加入福氏完全佐剂(Sigma)0.25ml和PBS至总体积为0.5ml，经超声充分混匀后，腹腔注射免疫小鼠。以后每隔三周，将福氏完全佐剂改为不完全佐剂(Sigma)，以同样方法进行抗原处理，对小鼠分别进行第二和第三次免疫。第三次免疫后第10天，眼眶采血并分离血清，采用间接ELISA法测定效价。方法如下：用His-GP73(2μg/ml)包被ELISA板，4℃过夜。次日倾去包被液，用PBST洗板2次后，加入1％BSA 250μl/孔，37℃封闭1h。弃去封闭液后，加入自1∶2000开始倍比稀释的小鼠血清50μl/孔，室温作用90min。PBST洗板3次后，加入碱性磷酸酶标记的抗小鼠Ig G 50μl/孔，室温作用90min。PBST洗板4次后，加入显色底物pNPP 50μl/孔，室温放置30min后，405nm读取OD值，结果显示血清效价达到1∶128000以上。在第三次免疫4周后，对小鼠腹腔和尾静脉分别注射不含佐剂的40μg(天然和变性蛋白各20μg)His-GP73融合蛋白进行最后的追加免疫。3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞，用不含血清的DMEM培养基(Invitrogen)洗涤后，与小鼠骨髓瘤细胞(P3X63AF8/653)按2∶1比例，在50％聚乙二醇(PEG，pm 1500，Sigma)存在下进行细胞融合。1000rpm离心5min后，弃去上清，将细胞悬浮于预热的含有20％胎牛血清(FBS，Hyclone)和支持杂交瘤细胞生长的Supplement(ROCHE)、1％L-谷氨酰胺(Invitrogen)、0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)和1％青、链霉素(Invitrogen)的OPTI-MEM(Invitrogen)的HAT(Sigma)培养基中，按150μl/孔分种于10块96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

4.阳性克隆的筛选及亚克隆

细胞融合后培养至第7天，用His-GP73(2μg/ml)包被ELISA板，以1∶5000稀释最后一次免疫的小鼠血清为阳性对照，碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(Sigma)为二抗，采用常规的间接ELISA法，检测10块培养板中的阳性克隆。根据ELISA结果挑出阳性克隆，转种于24孔细胞培养板中，用含有HT(Sigma)的20％FBS OPTI-MEM培养基继续培养。3天后，取培养上清进行Western blot，进一步筛选阳性克隆。具体步骤如下：用总量为20μgHis-GP73进行SDS-PAGE后，将蛋白转至硝纤膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2小时后，将膜固定于专门的装置上，在每一孔内加入细胞培养上清650μl，同时取一孔加入1∶5000稀释的最后一次免疫小鼠血清为阳参，室温孵育90min。经PBST洗涤3次后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠酶标二抗(Sigma)室温孵育90min，经PBST洗涤4次后，用SuperSignal West Pico Trial Kit(PIERCE)进行信号检测。结合Western blot和ELISA检测结果，挑出一株Western和ELISA均为阳性的克隆，取名为6A2。采用有限稀释法对6A2进行亚克隆，并进一步扩大培养，用于制备单抗并冻存细胞。

5.单克隆抗体的制备及纯化：

将扩大培养后的6A2，转至25ml培养瓶中，用含有10％FBS的OPTI-MEM培养基进行培养。待细胞长至融合状态，将细胞转至75ml培养瓶中，并将培养基中的血清降至7.5％FBS。在后续的传代过程中，逐渐降低血清的浓度直至细胞生长在完全无血清的培养基中(Hybridoma-SFM medium，GIBCO)。经1300rpm离心5min，收集上清4℃保存。用15ml SFM培养基重悬细胞后，将细胞悬液加入生物反应器中继续培养，每周收集一次细胞培养上清。待收集100ml无血清培养上清后，用HiTrap protein G柱(5ml，GE)纯化单抗。上样缓冲液为20mM PBS(pH 7.0)，洗脱缓冲液为0.1M甘氨酸(pH 2.7)，中和缓冲液为1M Tris(pH 9.0)。

6.单克隆抗体的亚类鉴定和可变区序列测定：

纯化后的单抗用ROCHE公司的ISOSTRIP Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Cat#1493027)进行亚类鉴定，结果表明6A2为IgG1/κ。

扩增培养杂交瘤细胞6A2，用Trizol(Invitrogen，Cat#15596-026)提取细胞总RNA，经RT-PCR分别克隆并扩增出抗GP73单克隆抗体的重链与轻链可变区DNA片段，测序。

实施例2抗GP73多克隆抗体的制备

免疫动物为体重3kg成年雌性新西兰白兔2只。第一次免疫时，将100μg His-GP73蛋白与福氏完全佐剂(Sigma)0.5ml和PBS混合至总体积为1ml，超声充分混匀。每只白兔取5点，每点0.2ml，皮下多点注射。以后每隔三周，将福氏完全佐剂改为不完全佐剂(Sigma)，以同样方法进行对动物分别进行第二和第三次免疫。第三次免疫后第10天，耳缘静脉采血并分离血清，采用间接ELISA法测定效价(方法同小鼠血清效价测定)，结果显示血清效价达到1∶128000以上。处死动物，收集血清。将两只兔子的血清混合后，用HiTrap proteinG柱(5ml，GE)纯化血清，获得题述多克隆抗体。

实施例3～6是GP73单克隆抗体用于多种免疫检测的实验

实施例3Western蛋白印记实验

1.方法

用重组的His-GP73(0.1μg/lane)进行SDS-PAGE后，然后将蛋白转到硝纤膜上。5％脱脂奶粉室温封闭1小时后，按泳道将膜切成3等份，分别加入纯化后的实施例1制备的6A2单抗(1∶2000)、1∶5000稀释的最后一次免疫小鼠血清和1∶1000抗His抗体(Invitrogen)作为阳参，4℃过夜。次日倾去一抗后，用PBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠酶标二抗(1∶2000)室温孵育90min，倾去二抗，PBST洗膜4次，用ECL发光系统(PIERCE)进行信号检测。

2.结果与结论

应用我们制备的单抗及多克隆抗体所识别的蛋白条带与应用Invitrogen公司商品化的抗His抗体均能识别出重组的His-GP73蛋白，为一73KDa的条带，其大小与文献报道的GP73分子量相同。

上述结果说明我们制备的抗GP73单抗和多抗均能很好的识别重组的His-GP73，可以用于检测GP73的Western blot。

实施例4免疫沉淀实验

1.方法

Western试验证实我们制备的单抗6A2可以识别变性的GP73蛋白，但是要用于临床血清样本检测的夹心ELISA，要求6A2必须能够识别天然构象的GP73蛋白并与之结合，为此我们建立了检测血清中GP73的免疫沉淀法。

具体操作如下：取5μg 6A2与15μl Protein G混合，冰上放置半小时后，分别加入正常人和肝癌病人血清100μl及PBS至总体积为500μl，4℃混匀过夜。次日10000rpm离心2min，小心吸去上清，加入0.5ml PBS混匀洗涤，10000rpm离心2min，弃去上清。经2次洗涤后，加入20μl蛋白电泳上样缓冲液100℃加热10min变性后，进行SDS-PAGE。经转膜、5％脱脂奶粉封闭后，加入1∶2000稀释的抗GP73兔血清，4℃过夜。第二天用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体作为二抗，采用ECL发光系统进行信号检测。

2.结果与结论

与已有的文献报道采用质谱或Western blot检测的结果相似，采用我们制备的单抗所建立的免疫沉淀法，在正常人和肝癌病人的血清中均检测到了GP73，并且从条带的灰度上看，肝癌病人血清中GP73的含量高于正常人(见附图2)。由于血清中含有众多蛋白质，因此在文献报道的采用Western blot实验中，需要使用预制的梯度胶让各种蛋白成分得到一定程度的分离以便于GP73的检测。另外由于上样量所限，一些GP73含量较低的血清样本的Western条带仅仅是隐约可见，给后期结果分析带来很大不便。采用基于我们制备的单抗建立的免疫沉淀实验中，单抗特异性与GP73结合，可以有效地使GP73从血清蛋白中分离出来的同时得以浓集，含量很低的样本结果也清晰可见。

免疫沉淀实验不仅有效地证实了我们制备的单抗可以在众多的血清蛋白中，特异性识别天然构象的GP73并与之结合，而且这株抗体可用于所有关于GP73研究工作中所采用的免疫沉淀试验。本试验的结果也为后续夹心ELISA法的建立提供了可靠的实验资料，奠定研究基础。

实施例5免疫组化实验

最新的研究显示，同正常前列腺组织相比较，前列腺增生和前列腺癌组织中均有II型高尔基膜蛋白的高表达。我们以前列腺增生组织蜡块为阳性标本，进行了如下的试验，用于检验我们制备的单克隆抗体在临床组织蜡块免疫组化中的应用。

1.方法

1)前列腺增生石蜡切片采用常规方法烤片、脱蜡至水(标本为南京医科大学第一附属医院病理科保存的前列腺增生组织的蜡块)。

2)9.5ml pH9.0修复液(Vector，英国)加水定容至1000ml，微波高火加热10min，将切片放入修复液中，中火抗原修复20min，自然冷却至室温。

3)加入用羊血清1∶1000稀释的抗GP73单抗(6A2)，37℃孵育1小时或4℃过夜。

4)PBS洗片，5分钟×3次。

5)加3％H₂O₂，室温10min。

6)PBS洗片，5分钟×3次。

7)滴加HRP标记的抗小鼠抗体(福州迈新maxvision)，室温孵育30分钟。

8)PBS洗片，5分钟×5次，DAB显色2min。

9)自来水充分冲洗，复染，封片。

说明：在采用实施例1制备的单抗进行的免疫组化过程中，由于其特异性高，因此在抗原修复后，直接加入1∶1000稀释的单抗即可，无需预先封闭。

2.结果与结论

棕黄色阳性颗粒出现于前列腺腺上皮细胞朝向管腔侧的胞质中，与已有的文献报道采用抗II型高尔基膜蛋白抗体进行的免疫组化亚细胞定位相吻合。背景清晰，基底细胞及间质等均未见着色(见附图3)。

实验结果说明我们的单抗在免疫组化应用中定位准确，特异性强，适用于临床组织病理学的免疫检测。

实施例6双抗体夹心ELISA检测GP73蛋白方法的建立

1.双抗体夹心ELISA法的操作流程：

1)用抗GP73mAb(6A2，1μg/ml)100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。

2)用含有0.5％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次后，加入250μl/孔封闭液(1％脱脂奶粉)，37℃封闭1.5小时。

3)加入1％脱脂奶粉(20mMTris/0.1M NaCl，pH8.0)稀释的His-GP73蛋白标准品100μl/孔，以1％脱脂奶粉为空白对照，室温作用90min。

4)PBST洗涤3次后，加入用封闭液稀释的抗GP73兔血清(1∶1000)100μl/孔，室温作用90min。

5)PBST洗涤3次后，加入用封闭液1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG(Sigma)100μl/孔，室温作用90min。

6)PBST洗涤4次后，加入底物pNPP(KPL)100μl/孔，室温显色30min，酶标仪检测405nm的OD值。

2.双抗体夹心ELISA检测方法最适条件的确定

双抗体夹心ELISA采用抗GP73单抗(6A2)为捕获抗体，抗GP73多抗(兔血清)为检测抗体。酶标抗体为碱性磷酸酶标记的抗兔IgG。采用正交设计和方阵试验相结合，确定夹心ELISA的最佳反应条件。捕获抗体6A2设1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml三个浓度，抗GP73兔血清和酶标抗体分别设1∶1000、1∶2000、1∶5000三个稀释度。His-GP73设1μg/ml、0.1μg/ml和0.05μg/ml三个浓度。结果表明用1μg/ml 6A2包板，抗GP73兔血清为1∶1000，碱性磷酸酶标记的抗兔IgG为1∶2000效果最佳。

3.标准曲线制备和灵敏度确定

1)用抗GP73mAb(1μg/ml)100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。

2)PBST洗涤3次后，加入1％脱脂奶粉250μl/孔封闭，37℃1.5小时。

3)用1％脱脂奶粉进行倍比稀释His-GP73蛋白标准品，共6个浓度。分别为：8、4、

2、1、0.5、0.25ng/ml。将稀释好的蛋白标准品按100μl/孔加入到ELISA板中，以1％脱脂奶粉为空白对照。每个样本做2个复孔，室温作用90min。

4)PBST洗涤3次后，按100μl/孔加入1∶1000稀释的抗GP73兔血清，室温作用90min。

5)PBST洗涤3次后，加入1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG，室温作用90min。

6)PBST洗涤4次后，加底物室温显色30min，测定A405值。

7)以His-GP73蛋白标准品浓度为横坐标，以A405值为纵坐标，绘制标准曲线。以空白对照A405值的均数加3倍标准差为标准，根据标准曲线计算最低检测限。

4、结果与结论：

标准曲线在2ng/ml～0.25ng/ml之间线性关系良好，相关系数R2＝0.9934，最低检测限为0.25ng/ml(见附图4)。

我们采用基于抗GP73单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA，最低检测限达到了0.25ng/ml，说明该方法的灵敏度较高。

实施例7肝癌病人和正常人血清样本中GP73含量的测定比较

1、实验方法

1)用抗GP73mAb(1μg/ml)100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。

2)PBST洗涤3次后，加入1％脱脂奶粉250μl/孔封闭，37℃1.5小时。

3)用1％脱脂奶粉进行倍比稀释His-GP73蛋白标准品，共5个浓度。分别为：2、1.5、1、0.5、0.25ng/ml。取26份正常人血清和11份肝癌病人血清分别用1％脱脂奶粉作等体积稀释。以1％脱脂奶粉为空白对照，按100μl/孔将稀释好的蛋白标准品和血清样本分别加入ELISA板中，每个样本做2个复孔，室温作用90min。

4)PBST洗涤3次后，按100μl/孔加入1∶1000稀释的抗GP73兔血清，室温作用90min。

5)PBST洗涤3次后，加入1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG，室温作用90min。

6)PBST洗涤4次后，加底物室温显色30min，测定A405值。

7)以His-GP73蛋白标准品浓度为横坐标，以A405值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算血清样本中GP73的含量。

2、结果与结论：

26份正常人血清中GP73含量为(1.264±0.47)ng/ml，11份肝癌病人血清中GP73含量为(3.44±2.18)ng/ml。

采用我们建立的双抗体夹心ELISA法，无论是在正常人还是肝癌病人的血清中均可以有效地检测到GP73，并且可以准确定量。从测得的数据上看，正常人血清中GP73含量较低而且分布均匀，肝癌病人血清GP73含量仅有一例接近正常人均值，其余均明显高于正常人。

序列表

<110>曹伯良(Brian B.Cao)张爱霞

<120>抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>252

<212>DNA

<213>小鼠(Mouse)

<400>1

GACTTCAACA  TTAAAGACAC  CTATATGCAC  TGGATGAAGC  AGAGGCCTGA  ACAGGGCCTG       60

GAGTGGATTG  GAAGGATTGA  TCCTGCGAAT  GGTAATACTA  AATATGACCC  GAAGTTCCAG       120

GGCAAGGCCA  CTATAACAAC  AGACACATCC  TCCAACACAG  CCTACCTGCA  GCTCAGCAGC       180

CTGACATCTG  AGGACACTGC  CGTCTATTAC  TGTGCTAGAG  AGGACTATGG  TAACCTCTGG       240

TACTTCGATG  TC                                                               252

<210>2

<211>84

<212>PRT

<213>小鼠(Mouse)

<400>2

Asp Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro

1               5                   10                  15

Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn

            20                  25                  30

Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp

        35                  40                  45

Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu

    50                  55                  60

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Asn Leu Trp

65                  70                  75                  80

Tyr Phe Asp Val

             84

<210>3

<211>234

<212>DNA

<213>小鼠(Mouse)

<400>3

CAAAGTGTCA  GTACATCTAA  CTATAATTAT  ATTCACTGGT  ACCAACAGAA  ACCAGGACAG          60

CCACCCAAAC  TCCTCATCAA  GTATGCATCC  AACCTAGAAT  CTGGGGTCCC  TGCCAGGTTC          120

AGTGGCAGTG  GGTCTGGGAC  AGACTTCACC  CTCAACATCC  ATCCTGTGGA  GGAGGAGGAT          180

ACTGCAACAT  ATTACTGTCA  GCACAGTTGG  GAGATTCCGT  ACACGTTCGG  AGGG                234

<210>4

<211>78

<212>PRT

<213>小鼠(Mouse)

<400>4

Gln Ser Val Ser Thr Ser Asn Tyr Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln

  1              5                  10                  15

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu

            20                  25                  30

Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

         35                 40                  45

Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

    50                  55                  60

Tyr Cys Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

65                  70                  75

Claims (8)

1.抗GP73单克隆抗体，其重链与轻链可变区DNA序列和氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO：1是重链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：2是重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO：3是轻链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：4是轻链可变区氨基酸序列。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测GP73试剂中的应用。

3.权利要求2所述的应用，所述检测GP73试剂是酶联免疫吸附试验试剂。

4.权利要求2所述的应用，所述检测GP73试剂是免疫印迹试验试剂。

5.权利要求2所述的应用，所述检测GP73试剂是免疫沉淀试验试剂。

6、权利要求2所述的应用，所述检测GP73试剂是免疫组化试验试剂。

7.抗GP73多克隆抗体，特征是以重组人GP73蛋白为抗原制备的。

8.权利要求7所述的多克隆抗体在制备检测GP73试剂中的应用。

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