CN103333249A

CN103333249A - 一种抗前列腺特异性膜抗原（psma）的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN103333249A
Application number: CN2013102371618A
Authority: CN
Inventors: 段小波
Original assignee: GUANGZHOU KANGHE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU KANGHE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-10-02
Also published as: WO2014198223A1

Abstract

本发明公开了一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体由轻链和重链组成，其轻链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列分别如SEQIDNO：3-5所示，重链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列分别如SEQIDNO：6-8所示。本发明的抗PSMA特异单克隆抗体是一株具有高特异性和亲和力的单克隆抗体。它不仅能特异性的结合活的肿瘤细胞表面胞膜外的PSMA抗原，而且识其识别PSMA分子上一个稳定保守的抗原决定族，能够与降解的PSMA蛋白片段结合。该单克隆抗体只识别肿瘤组织和细胞，而与正常人体组织细胞没有反应。因此，它是一个理想的识别肿瘤特异标志物的单克隆抗体，在癌症治疗和诊断上都具有广泛的重要应用前景。

Description

一种抗前列腺特异性膜抗原（ PSMA ）的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体, 及其在制备前列腺癌和其它PSMA阳性肿瘤诊断和治疗药物中的应用。

背景技术

前列腺癌是当今严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，前列腺癌占全部男性癌症患者的11%，占全部男性癌症死亡人数的9%。根据世界卫生组织的数据，每年有近百万人被诊断为前列腺癌患者，死亡率仅次于肺癌占第二位。大约20%临床诊断前列腺癌的患者死于此病，当其发展至超过可切除范围时，多数患者出现症状时局部已属晚期或已有转移，目前没有治愈性的治疗方法，因此，前列腺癌的早期诊断和治疗仍然是目前有待攻克的医学难题。

前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）是一种较前列腺特异性抗原（PSA）更加敏感和特异的前列腺癌（PCa）肿瘤标记物。PSMA基因位于11号染色体的短臂上 (O'Keefe DS et al ，1998)，所有前列腺组织都表达PSMA (Silver DA，1997)。在正常的前列腺上皮细胞，PSMA主要表达成一种称为PSM的细胞质蛋白 (Su L，1995)。在前列腺癌中，PSMA mRNA的不同剪接导致表达成为一种含有750 个氨基酸的Ⅱ型跨膜糖蛋白(Israeli RS et al, 1993; Schmittgen TD et al 2003; Ghosh A et al 2004)。它也是一个球形大分子金属肽酶，分子量为100Kda，是zn依赖的外肽酶超家族成员之一 (Carter RE, 1996; Pinto JT et al 1996)。PSMA特异的表达于前列腺上皮，在前列腺外组织只有少量表达。在正常前列腺分泌上皮中表达呈异质性或低表达。随病情进展，PSMA的表达增高，在转移性和激素难治性肿瘤中的表达最高(Kawakami M et al 1993; Israeli RS et al, 1994; Sweat SD et al, 1998; Wright GL et al, 1996; Burger MJ et al 2002; Ross JS et al 2003)。PSMA在前列腺癌组织和多种实体瘤新形成的血管中会过度表达，而不表达于正常组织中的血管，是一种比较特异的肿瘤新生血管内皮细胞标记物。 PSMA水平在前列腺癌患者血清中也升高(Horoszewicz JS et al 1987; Holmes EH et al 1996; Troyer JK, 1995; Sokoloff RL, 2000)。PSMA在区分前列腺癌和其它类型恶性肿瘤的敏感度和特异性分别是65.9％和94.5％，所以PSMA仍然是前列腺癌细胞上—个相当敏感的、高度特异性的抗原物质。PSMA在抗雄激素的状态下的前列腺癌细胞上表达还会上调，其表达水平可能与前列腺癌不良的临床后果一致。如今，靶向制剂已成为制剂行业的潮流。PSMA可以作为免疫治疗的有用靶标分子，因为它符合以下标准：（1）表达主要局限于前列腺；（2）PSMA是在疾病的所有阶段都大量表达的蛋白质；（3）它位于细胞表面，但不会脱落进入循环；（4）表达与酶活性或信号传导活性相关。PSMA的肿瘤相关的血管内皮细胞的表达的特异性、在前列腺癌及其转移灶增高，使其成为具有较高前列腺组织器官特异性的新型肿瘤标志物，是前列腺基因治疗的理想靶标，已成为前列腺癌的研究热点，尤其以它为目标靶向治疗前列腺癌和其它癌症给人们带来很大的希望(Schülke N et al 2003)。

PSMA分为三个部分：胞内部分(氨基酸序列1一18)，跨膜部分(19—143)，胞外区域(44—750)。由于PSMA的靶向特异性，使其成为开发前列腺癌的诊断和治疗应用中的单克隆抗体（mAb）的重要抗原。PSMA最初是被单抗7El1、C5识别并定义的 (Horoszewicz et a1., 1987, Anticancer Res. 7:927-935; U.S. Pat. No. 5,162,504).。¹¹¹In一标记的单抗7Ell已获美国FDA批准，用于检测软组织中转移性前列腺癌，在市场上的商品名为ProstaScint™ (Cytogen, Philadelphia, PA)。但是，因为单抗7E11只识别PSMA细胞内的抗原决定基(Troyer JK et al, 1995)，也就是说只有在肿瘤细胞死亡、细胞膜破裂、细胞质PSMA暴露出来后，此类抗体才能与之结合。此类抗体无法结合活的细胞，使它们作为肿瘤治疗和诊断的价值大打折扣。也已发现，ProstaScint的确在确定软组织血管转移病灶的敏感性往往比确定骨病灶的敏感性高许多倍 (Rosenthal SA et al 2001)。因此，目前的研究集中在研发针对PSMA分子胞外区域更易接近肿瘤、副作用更少、清除率更快的治疗性抗体。目前与PSMA结合的人或人源化抗体已有报道（Yao.D等人（2002） Semin.Urol.Oncol.20:211-218；专利：WO 02/098897、WO 01/034903、WO 03/064606），这些抗体已经用于对前列腺癌细胞成像（Yao.D等人（2002） Semin.Urol.Oncol.20:211-218；Bander N.H.等人（2003） J.Urol.170:1717-1721）。抗-PSMA抗体也已经在前列腺癌治疗中用于治疗性干预，一般与化疗剂或放射性同位素联合使用。利用单克隆抗体结合放射性药物靶向PSMA胞外区域，以细胞毒素为基础的针对PSMA的免疫疗法等都已得到深入研究。证明它对前列腺癌动物模型显示了有效的抗癌效应。这些抗PSMA抗体在体外使LNCaP细胞的球粒减小，可以诱导表达PSMA的细胞凋亡，单剂量放射性标记的PSMA特异性单克隆抗体能够使异种移植荷瘤小鼠的肿瘤体积平均减少15-90％，并且这个剂量对动物没有产生毒性；单克隆抗体一auristatin(来源于海洋生物的环肽衍生物)结合物在体外和体内的雄性激素非依赖的前列腺癌模型上都有有效的和选择性的抗肿瘤活性 (Lopes AD et al 1990; McDevitt MR et al 2000; Ballangrud AM et al, 2001; Smith-Jones PM et al, 2003; Bander NH et al, 2003; Vallabhajosula S et al, 2004; Fracasso G et al, 2002)。同时，这些抗体可以使PSMA能快速地内陷，这不仅可以促进抗体依赖免疫细胞ADCs进入肿瘤内部，而且使抗体一药物结合物更容易进入细胞内部。然而，与许多抗肿瘤抗体药物一样，所有这些PSMA抗体，由于其巨大的分子（> 150kDa），将面临难以渗透到固体肿瘤。为了解决这个问题，已有研究选择性地结合到前列腺特异性膜抗原的多肽和核酸适体等较小的配体（<15 kDa的）的报道 (Aggarwal S et al, 2006; Lupold SE et al, 2002)。但是，迄今为止这些配体还没有已被证明可以作为试剂或药物来提高前列腺癌的诊断和治疗效力。因为，这些小配体面临人源化、体内快速被清除和易于产生耐药性等困难，使它们难于开发成为真正意义上的治疗药物。

本发明应用完整LNcaP肿瘤细胞免疫小鼠，通过应用细胞膜蛋白特异单抗的细胞ELISA（cELISA）和蛋白质组学分析，筛选制备了可一株识别PSMA胞外的抗原决定基，且可以结合有表达PSMA的活细胞的单克隆抗体。此抗体高度特异，它识别PSMA的一个高度稳定的抗原决定簇，只结合PSMA阳性细胞。它具有可以选择性地靶向非前列腺实体瘤新生的血管，用于影像学诊断和生物靶向治疗，放射性同位素标记的能精确定位前列腺癌的骨和软组织转移灶和做为载体制备的肿瘤特异性抗体药物的广阔应用前景。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体的编码基因。

本发明的另一个目的是提供含有上述单克隆抗体的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体在制备前列腺癌或/和其它PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于，所述轻链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列为：

CDR1：如SEQ ID NO:3所示，

CDR2：如SEQ ID NO:4所示，

CDR3：如SEQ ID NO:5所示；

所述重链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列为：

CDR1：如SEQ ID NO:6所示，

CDR2：如SEQ ID NO:7所示，

CDR3：如SEQ ID NO:8所示。

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的单克隆抗体在制备前列腺癌或/和其它PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

编码上述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列的基因。

编码上述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列的基因。

编码上述单克隆抗体的基因。

含有编码上述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列/重链可变区氨基酸序列/单克隆抗体氨基酸序列的基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系，转基因动植物或重组病毒和细菌。

分泌上述单克隆抗体的细胞系。

所述的基因、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、细胞系在制备前列腺癌或/和其它PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

具体技术手段包括：

1. 制备LNcaP细胞特异性单克隆抗体：体外培养获得前列腺癌LNcaP肿瘤细胞，体外固定灭活后，免疫Balb/c 小鼠；应用LNcaP肿瘤细胞单层固定的96孔细胞培养板，建立特异细胞ELISA（cELISA）测定免疫小鼠的特异性抗体应答；数次强化免疫后，取高效价抗体应答小鼠的脾脏，分离脾脏淋巴细胞，在体外与小鼠骨髓瘤细胞系NSO-1融合制备杂交瘤细胞；以前列腺癌肿瘤细胞 PC3, DU145 和 BPH-1为阴性对照，应用LNcaP特异细胞ELISA （cELISA）筛选出LNcaP特异阳性细胞株；通过线性稀释法获得稳定的杂交瘤细胞系；体外培养制备特异性单克隆抗体；在体外通过流式细胞仪、ELISA、免疫印迹和免疫沉淀等实验测定这些单克隆抗体与各种人正常细胞和肿瘤细胞的反应性，筛选出LNcaP细胞特异单克隆抗体；鉴定特异单克隆抗体的型和亚型。

2. 鉴定LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体的靶标分子：生物素化标记LNcaP细胞膜蛋白；应用LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体做免疫沉淀，通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹确定靶标膜蛋白的分子量；体外裂解LNcaP细胞，应用LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体做免疫沉淀，在体外俘获靶标膜蛋白分子；从抗体-靶标膜蛋白分子复合物SDS-PAGE电泳后的凝胶上切取靶标膜蛋白，酶切消化后，在MASCOT™ LC-MSMS 分析获得靶标膜蛋白多肽，通过蛋白质组学分析确定靶标膜蛋白分子。

3. LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体的特异性和在诊断前列腺癌上的应用：体外培养纯化制备特异性单克隆抗体。合成PSMA基因 cDNA，克隆到表达载体，制备PSMA重组蛋白，通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹实验测定LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体与PSMA的反应性。以同一亚型的小鼠抗体做对照，用此单克隆抗体在前列腺癌细胞和肿瘤组织切片做免疫组化测定其特异性；用生物素和荧光素标记LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体，测定其与活细胞的反应性。从分泌LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系提前总mRNA，通过RT-PCR扩增编码IgG的特异性抗体mRNA基因，测定其可变区的重链和轻链的基因序列，确定编码抗体CDRs的氨基酸序列。

基于上述抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体的氨基酸序列和其编码基因序列，可构建重组载体、表达盒、转基因细胞系、转基因动植物或重组蛋白、病毒和细菌等生物制品，用于生产基因工程抗体和制备各种药物、同位素、纳米颗粒、毒素和酶等具有诊断和治疗意义的靶向聚合物。

本发明的有益效果在于：

本发明的抗PSMA特异单克隆抗体是一株具有高特异性和亲和力的单克隆抗体。与其它PSMA单克隆抗体的制备方法不同，这株单抗是以完整肿瘤细胞作为抗原制备的，使其具备识别结合体内具有天然构象的PSMA抗原的能力。实验表明，它不仅能特异性的结合活的肿瘤细胞表面胞膜外的PSMA抗原，而且还能识别PSMA分子上一个稳定保守的抗原决定族，使其还能够与降解的PSMA蛋白片段结合；通过现有抗体基因数据库的对比发现，此抗体具有独特的抗原结合位点(CDRs)和构象；它具有高度的肿瘤特异性：它只识别肿瘤组织和细胞，而与正常人体组织细胞没有反应。因此，它是一个理想的识别肿瘤特异标志物的单克隆抗体，在癌症治疗和诊断上都具有广泛的重要应用前景：它不仅可以作为特异的PSMA抗体试剂，用于检查PSMA抗原的各种免疫学诊断、免疫组化病理诊断、体内外肿瘤细胞靶向诊断和捕获肿瘤干细胞等外，它还可以通过人缘化改造，赋予其具有直接启动生长抑制信号或诱导凋亡或间接激活宿主防御机制发挥抗肿瘤的活性；通过作为肿瘤特异靶向载体，与放射性核素、药物和毒素偶联制备抗肿瘤单克隆抗体免疫偶联物，如放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素等用于癌症治疗。

附图说明

图1为重组PSMA蛋白的表达制备（A：重组PSMA蛋白在大肠杆菌的表达，其中，M：蛋白分子量标志，1：大肠杆菌细胞裂解液，2-4：镍柱亲和层析纯化的重组PSMA蛋白洗脱液，5：镍柱亲和层析过滤液；B：重组PSMA蛋白在HEK293的表达，其中，M：蛋白分子量标志，1-3 ：镍柱亲和层析纯化的重组PSMA蛋白洗脱液）。

图2为SDS-PAGE 电泳分析特异单克隆抗体mAb L-186经 Protein G亲和层析纯化后的纯度（M：蛋白分子量标志物；1-2：特异单克隆抗体mAb L-186；3-4：和小鼠 IgG对照）。

图3为mAb L-186杂交瘤细胞上清液对LNCaP细胞全细胞裂解液的蛋白质印迹分析（1：分子量标志物，2-13依次为：DU145细胞，PC3细胞，He3907细胞，OKAR5细胞，A2780细胞，SKOV4细胞，OVAR3细胞，MCF7细胞，518A2细胞, colo320细胞,SW480细胞,MDA细胞,HT29细胞的全细胞裂解液，14为LNCaP细胞全细胞裂解液）。

图4为纯化的特异单克隆抗体mAb L-186从含有生物素标记膜蛋白的LNCaP细胞裂解液中免疫沉淀一个110 kDa蛋白。

图5为单克隆抗体mAb L-186从LNCaP细胞裂解液中免疫沉淀特异蛋白质的质谱分析。

图6为Western blot分析特异单克隆抗体mAb L-186与重组PSMA蛋白的反应性（1：特异单克隆抗体检测PSMA LNCaP细胞裂解液；2：重组PSMA蛋白；3：抗His标签抗体检测重组PSMA蛋白）。

图7为不同浓度单克隆抗体mAb L-186与前列腺癌LNCaP细胞和PC细胞的流式细胞仪分析。

图8为荧光标记的单克隆抗体mAb L-186与前列腺癌LNCaP细胞和PC细胞的反应性。

图9为特异单克隆抗体mAb L-186染色PSMA阳性的LNCaP细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下步骤所用到的试剂、质粒及菌株：限制性内切酶、Pfu DNA多聚酶、T4 DNA连接酶购自Promega；Exp Taq DNA聚合酶、DNA maker购自Takara；pET-22b（+）载体、大肠杆菌Rosetta（DE3）购自Novagen；E.coli DH5 α、Ni-NTA Agarose试剂盒购自Invitrogen；不完全DMEM 培养基购自赛默飞；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体购自博士德；TMB购自eBioscience 公司；骨髓瘤细胞NSO-1 购自ATCC；其它所用试剂盒为常规市售产品。

人前列腺癌细胞LNcaP购自购自美国ATCC公司（LNCaP clone FGC，ATCC编号CRL-1740 ）。

实验动物：BALB/c 雌鼠购自美国Charles River公司，体重20g左右，8周龄。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR 扩增、质粒提取、质粒转化、DNA 片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》( 第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J. 黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件进行。

1 ． PSMA 抗原制备

1.1 PSMA cDNA扩增及重组表达载体pDEST17-PSMA和高效瞬时表达载体pTT5-PSMA的构建

人前列腺癌细胞LNcaP购自购自美国ATCC公司（LNCaP clone FGC， ATCC编号CRL-1740 ），RNA的分离及cDNA的合成均按试剂盒操作指南进行。根据GenBank上公布的人PSMA序列（GenBank登录号为：NM_001193471.1）设计引物：P1:5’-caccaaatcctccaatgaagctactaac-（SEQ ID NO:9），P2: 5”-ttaggctacttcactcaaagtctctg-3’（SEQ ID NO:10）(引物中引入6个氨基酸的His标签)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司公司合成。取反转录cDNA链为模板进行PCR，一个2,136 碱基的PCR产物和经凝胶电泳纯化后，克隆到pENTR/D-TOPO 载体 (Invitrogen)，再穿梭克隆到表达载体pDEST17 和pTT5,得到重组表达载体pDEST17-PSMA 和pTT5-PSMA。分别转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中。筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定，测序结果表明重组表达载体pDEST17–PSMA和pTT5-PSMA构建成功。

1.2 重组PSMA蛋白在大肠杆菌的诱导表达

将pDEST17-PSMA转入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中，挑选单克隆菌落接种于含有50 μg/mL 氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的LB培养基中，置于37℃摇床中，200 r/min 培养至OD_600nm=0.6～0.8时，加入1mM IPTG，继续培养4～6小时诱导蛋白表达。

1.3 PSMA重组蛋白在人胚胎肾细胞HEK293EBNA高效瞬时表达：

将HEK-293 EBNA1细胞以3×10⁵个/ml的密度接种于Ex-Cell 293培养基中，放置于100rpm摇瓶或75rpm转瓶中在37℃、5%CO2的环境下培养3天，当细胞密度增为1.5~2×10⁶个/ml，细胞活力大于95%的情况下进行后续的转染工作。在无菌环境下取出所有细胞液，以1000rpm的转速离心5min，弃去所有培养上清并用新鲜的Ex-Cell 293培养基重悬细胞沉淀，同时调整细胞密度为20×10⁶个/ml，将高密度的细胞悬液置于摇瓶中保持低速振荡状态以免细胞抱团。缓慢向细胞液中滴加待转质粒pTT5-PSMA，用量为50μg/ml；质粒滴加完毕后，同样缓慢滴加PEI，用量为100μg/ml，将高浓度的转染细胞液置于摇瓶或转瓶中振荡孵育4h。孵育完毕后，使用Ex-Cell 293培养基稀释转染细胞的密度至1×10⁶个/ml，再加入1%的Pluronic F68完成整个转染过程。将细胞悬液置于37℃、5% CO₂摇瓶或转瓶的环境中培养5天即可收液。8000rpm离心30分钟除去细胞核及细胞及碎片，置于4℃保存过夜，次日用镍柱亲和层析纯化。

1.4 重组PSMA蛋白的纯化

4℃、8000 rpm离心5 min，弃上清，用高压灭菌的PBS洗涤菌体，重复一次。菌体用1/20菌液体积的PBS重悬，置冰上进行超声波破碎（功率400 W，工作5 s，间隔10 s）80次。超声后的悬液4℃、8000 rpm离心5 min，分别收集上清和沉淀，作SDS-PAGE电泳分析，观察目的蛋白在上清和沉淀中的含量，以此判定该蛋白以可溶形式还是包涵体形式表达。本发明表达的蛋白是以包涵体形式存在。取沉淀用包涵体洗涤缓冲液（50mM Tris、100mM NaCl、2M 尿素、1mM 二硫苏糖醇pH8.5）洗涤3次，每次4℃、6000g 离心10 分钟，弃上清。包涵体沉淀用包涵体裂解液（50mM Tris、100mM NaCl、8M 尿素、1mM 二硫苏糖醇pH8.5）溶解，室温搅拌1 小时。4℃、12000g 离心10 分钟，取上清，以1 ：500 比例缓慢加入到复性缓冲液（50mM Tris、100mM NaCl、0.5M L-精氨酸、3mM 还原型谷胱甘肽、0.3mM 氧化性谷胱甘肽pH 9.5）中，4℃静置48小时，复性蛋白用Millpore 公司的LabScale TEF system ~100 kDa 浓缩膜进行浓缩，蛋白浓缩液在透析缓冲液（50mM Tris、100mM NaCl pH9.0）中透析过夜。

用镍柱亲和层析（Ni-NTA Agarose试剂盒）纯化大肠杆菌表达浓缩后的复性蛋白和人胚胎肾细胞HEK293EBNA高效瞬时表达的重组PSMA蛋白，不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，在咪唑洗脱目洗脱液中得到纯度较高复性效果较好的PSMA蛋白洗脱液。将含有目的蛋白的洗脱液用Millipore 浓缩管进行浓缩和Bio-Rad 蛋白定量试剂盒进行定量，最后可以得到纯度大于 85%、浓度为1 mg/mL的PSMA重组蛋白。如图1重组PSMA蛋白的表达所示。

2．抗人PSMA蛋白单克隆抗体的制备

2.1 小鼠免疫及脾细胞的制备

培养的LNCaP细胞经预冷的PBS漂洗2 次后，用预冷的含4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA） PBS室温固定10分钟，经预冷的PBS漂洗2 次。将固定的LNCaP细胞稀释到终浓度为1X10⁷ 细胞每毫升。 0.5ml 细胞与等体积完全弗氏佐剂混合，充分混匀形成油包水状，取8-10周龄的BALB/c 雌鼠进行初次免疫，每只小鼠腹腔和皮下各注射100ul。以后间隔2周免疫一次，使用相同剂量固定的LNCaP细胞与等体积不完全弗氏佐剂混合。免疫5次后， LNCaP细胞ELISA检测小鼠血清效价不低于 1：100,000时，小鼠腹腔注射2X10⁶LNCaP细胞，三天后取小鼠脾细胞。

脾细胞的制备方法：将上述免疫后的BALB/c小鼠眼眶采血后脱臼处死，无菌取脾脏，过200目细胞筛，收集脾细胞悬液，冰浴中放置10 min后弃沉降物，4℃，750g 离心10 分钟，收集细胞，加入1 mL 红细胞裂解液（0.155M NH₄Cl，10mM KHCO₃，0.1mM Na₂EDTA pH7.4）作用5 分钟，加入20 mL不完全DMEM 培养基中止反应。4℃，750g 离心10 分钟，弃上清，细胞沉淀用20 mL不完全DMEM 培养基洗涤2 次，每次4℃，750g 离心10 分钟。弃上清，细胞沉淀用不完全DMEM 培养基重悬。

LNCaP细胞ELISA检测抗体效价的方法：在96孔细胞培养板上培养的LNCaP细胞形成90%的单层后，吸掉细胞培养液；每孔加200ul预冷的PBS轻轻漂洗2 次后，每孔加100ul预冷的含4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）PBS室温固定10分钟，用PBST（0.05% Tween20-PBS，pH 7.4）清洗3 遍，1%BSA 封闭，37℃ 孵育2 小时。PBST 清洗3遍，加入待测4倍比稀释的小鼠血清（实验组），设置6-7 个梯度，未免疫小鼠做阴性对照，100μl 每孔，37℃孵育1 小时。PBST 清洗3 遍，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体(1：10000 稀释)，37℃孵育1小时。PBST 清洗3 遍后加入TMB底物，100 μL每孔，避光显色10-15 分钟，加入终止液（1M HCl）100 μL每孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm 的吸光值（OD₄₅₀）及630nm 的吸光值(OD₆₃₀)，计算ΔOD450 ＝ OD450-OD630。与PBS 孔相比，实验组ΔOD450 与阴性对照组ΔOD450 的比值大于5倍的为阳性。

2.2 饲养细胞的制备

在细胞融合的前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞。将8 周BALB/c小鼠脱臼处死，无菌操作下，剪开腹部，吸取5mL DMEM不完全培养基注入腹腔，反复冲洗腹腔，吸回冲洗液并用DMEM 不完全培养基洗涤2 次，每次4℃ 300g 离心10 分钟，收集细胞用含10%小牛血清的DMEM 完全培养基重悬细胞，使浓度为2×10⁵/mL，加入96 孔板中，每孔100ul，37℃，5% CO₂ 条件下培养。

2.3 骨髓瘤细胞NSO-1的培养

复苏骨髓瘤细胞NSO-1，用8-氮鸟嘌呤筛选HGPRT 缺陷株，细胞融合时细胞要处于对数生长期，融合前用不完全的DMEM 培养基洗涤，每次4℃ 300g 离心10 分钟，收集细胞并用不完全的DMEM 培养基重悬。

2.4 细胞融合剂杂交瘤细胞的制备

取制备好的免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞NSO-1 于离心管中，分别取10⁸和2.5×10⁷，用不完全的DMEM培养基洗涤一次。离心后弃上清，轻轻弹散细胞，加入0.7 mL 40℃的PEG（分子量1500）溶液，PEG的终浓度为50% (W/V)，60 秒之后开始加入40℃预热的不完全DMEM 培养基（5分钟加完），首先加1 mL，1 分钟后加4 mL，二分钟后加入20 mL。4℃ 300g 离心10 分钟收集细胞，用2×HAT 培养基轻轻悬起细胞，使浓度为2×10⁶/mL。100 μL每孔加到含饲养细胞的96 孔板中，继续培养。每两天吸出上清100 μL，加入等体积的HAT 培养基(20% FCS、10mM sodium hypoxanthine、40mM aminopterin、1.6mM thymidine 的DMEM 培养基)。一周后，用HT培养基( 包含20% FCS、10mM sodiumhypoxanthine、1.6mM thymidine的DMEM 培养基) 培养2-3 周。当观察到杂交瘤细胞克隆长出时，用含20%小牛血清的DMEM 培养基培养，并用LNCaP 细胞ELISA 法检测是否有抗体分泌。接着用有限稀释法筛选阳性克隆，多次筛选后获得杂交瘤细胞株。连续体外培养2个月以上或者冻存6个月之后，细胞株仍能稳定和大量分泌抗人PSMA蛋白抗体，从而获取杂交瘤细胞株命名为mAb L-186。

2.5 单克隆抗体的制备

单克隆抗体的大量制备一般有两种方法，方法一，增殖培养法，杂交瘤细胞体外低血清培养2-3 天后大量收培养上清，上清中含有较高浓度的单克隆抗体。方法二，小鼠腹腔接种法，首先500 μL无菌的液体石蜡通过腹腔免疫8-10 周龄的BALB/C 鼠，一周之后腹腔注射1×10⁶ 杂交瘤细胞，7-10 天左右收集腹水，高速离心收集上清。通过上述方法获得的抗体，用Protein G 亲和层析方法纯化并进行SDS-PAGE 鉴定抗体纯度，如图2所示。经过纯化的单克隆抗体纯度高于90%，抗体的重链约为50kDa，轻链约为25kDa。用小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体mAb L-186 亚型为IgG1，轻链类型为κ链。

3. 单克隆抗体 mAbL-186 靶标分子的鉴定：

3.1. 单克隆抗体mAbL-186与肿瘤细胞的反应性

应用细胞ELISA法，对单克隆抗体mAbL-186与在96孔细胞培养板上培养的LNCaP细胞和其它33 肿瘤细胞以及人和动物细胞系的反应性进行了检测。这些细胞包括：前列腺癌细胞系(PC3，DU145和BPH-1)，卵巢癌细胞系(He3907，OKAR5，A2780，SKOV4和OVAR3)，乳腺癌细胞系(MCF7)，皮肤癌细胞系 (518A2，FB1)，结肠癌细胞系 (colo320，SW480，MDA，CACO2，RKO和HT29)，肺癌细胞系 (A549)，膀胱癌细胞系 (SW780，UMUC，J82，RT4)，人骨细胞系 (MG92)，猴子细胞系 (COS-1)，仓鼠细胞系 (BHK21，G9) 和小鼠细胞系 (OSE1.2.2，Shinoqi)。在96孔细胞培养板上培养这些细胞，当细胞形成80-90%的单层后，吸掉细胞培养液；每孔加200ul预冷的PBS轻轻漂洗2 次后，每孔加100ul预冷的含4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）PBS室温固定10分钟，用PBST（0.05% Tween20-PBS，pH 7.4）清洗3 遍，1%BSA 封闭，37℃ 孵育2 小时。PBST 清洗3遍，加入待测4倍比稀释的小鼠血清（实验组），设置6-7 个梯度，未免疫小鼠做阴性对照，100μl 每孔，37℃孵育1 小时。PBST 清洗3 遍，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体(1：10000 稀释)，37℃孵育1小时。PBST 清洗3 遍后加入TMB底物，100 μL每孔，避光显色10-15 分钟，加入终止液（1M HCl）100 μL每孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm 的吸光值（OD₄₅₀）及630nm 的吸光值(OD₆₃₀)，计算ΔOD450＝OD450-OD630。与PBS 孔相比，实验组ΔOD450 与阴性对照组ΔOD450 的比值大于5倍的为阳性。结果表明，单克隆抗体mAbL-186只与LNCaP肿瘤细胞反应，而与其它细胞没有交叉反应。

3.2．制备LNCaP细胞裂解物

培养的LNCaP细胞经预冷的PBS漂洗2 次，裂解液（Nonidet-P40 (NP40)缓冲液）中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂；吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask)。用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃摇动30 min。4℃离心 12,000 rpm，20 min。轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

3.3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

制备10％分离胶。将细胞裂解物和重组蛋白质样品与5×样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热 5－10min，取上清点样。8.0 ml，混匀；在不同的样品槽内分别加约20μl分子量标志物、细胞裂解物和重组蛋白质样品。上样后，稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需～1hr。卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上，每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。

3.4．蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到硝酸纤维素薄膜上。100V，1h(电流约为 0.3A)。用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。置膜于25 ml 封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）中1h，室温，摇动。用15mlTBS/T（含0.5% Tween-20的Tris 缓冲液，洗3次(5 min/T)。加入合适稀释度的一抗（Anti-His Tag 抗体），室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。用15mlTBS/T洗3次(5 min/T)。加入1:5,000稀释度的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗（样抗鼠IgG-HRP），室温孵育1h，缓慢摇动。用15mlTBS/T洗3次(5 min/T)。应用化学发光自显影试剂盒（美国Peierce产品），加入底物后在X-光片自显影。如图3 所示，单克隆抗体mAb L-186只识别LNCaP细胞，检测到一个约110 kDa的蛋白条带，而与其它几种肿瘤细胞-DU145，PC3，He3907，OKAR5，A2780，SKOV4，OVAR3，MCF7，518A2，colo320，SW480，MDA，HT29全细胞裂解液没有反应。

3.5．特异性单克隆抗体mAbL-186免疫沉淀LNcaP细胞膜特异蛋白质

培养的LNCaP细胞经预冷的PBS漂洗2 次后，加8ml含有40ul/ml生物素化试剂（美国，Amersham ECL Protein Biotinylation Module Cat #2202)，在平面摇动器上4°C培养30分钟。经预冷的PBS漂洗2 次后，加入5ml细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰浴裂解2-5分钟, 4℃，12,000g离心30 min后取上清；取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；进行SDS-PAGE, Western blotting分析。图4显示特异单克隆抗体mAb L-186从含有生物素标记膜蛋白的LNCaP细胞裂解液中免疫沉淀（IP）一个110 kDa蛋白。

3.6．应用特异性单克隆抗体mAbL-186免疫沉淀LNcaP细胞中特异蛋白质

为了用特异性单克隆抗体mAbL-186免疫沉淀制备大量LNcaP细胞中特异蛋白质，培养的LNCaP细胞经预冷的PBS漂洗2 次后，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰浴裂解30分钟，4℃，12,000g离心30 min后取上清；取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；进行SDS-PAGE。从抗体-靶标膜蛋白分子复合物在分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%的SDS-PAGE电泳分离抗体和靶标膜蛋白，考马氏亮蓝染色后，从凝胶上切取110kD的蛋白带。在PBS缓冲液中研磨凝胶释放出蛋白质；离心沉淀除去凝胶碎片，采用BSA 作标准曲线，用Bradford 法测定蛋白浓度。

3.7 单克隆抗体mAbL-186靶标分子的质谱分析鉴定

3.7.1 样品酶解：

取蛋白上清液复溶在20 μl 50mmol·L-1 NH4HCO3 溶液中，加入1 μl 20 mmol·L-1DTT，60℃水浴45 min；加入2 μl 20 mmol·L-1 碘乙酰胺溶液，避光室温放置30 min；再加入2 μl 20 mmol·L-1DTT，60℃水浴30 min；加入乙腈，终浓度达到10%左右；加入20 ng·μl-1 胰蛋白酶10 μl，37℃酶解12 h；加入0.1 μl 甲酸终止反应。

3.7.2 样品液相色谱分离：

用纳升级/毛细管液相色谱系统Ultimate（美国DIONEX 公司）分离消化后的多肽，采用pepmap100 C18 柱，缓冲液A：0.1%甲酸溶液。缓冲液B：含0.1%甲酸的95%乙腈溶液。试验前将各溶液过滤（0.22 μm 滤膜），在线脱气。系统为柱前分流，设置分流后流速200 nl·min-1，进样体积6 μl，自动进样器进样，室温运行。上样后，阀切换使上样液单独冲洗预柱，随后将预柱切换到分析柱流路开始洗脱。洗脱方法：3%B 液平衡色谱柱，上样后8%～50%B 液洗脱30 min，50%～60%B 液洗脱4 min，60%～95%B液洗脱4 min，95%B 液等梯度洗脱6 min。洗脱组分直接经电喷雾离子化进入质谱检测。

3.7.3 样品液相质谱分析：

用电喷雾-串联四极杆-飞行时间质谱ESI-Q-TOF（德国Bruker 公司）进行串联质谱分析：所有测定均在正离子方式下进行。雾化气体为氮气，碰撞气体为氮气，碰撞能量随前体离子电荷数不同智能优化。TOF 加速电压190V，MCP 检测器电压1 900 V，毛细管电压4 200 V。MS 谱质量扫描范围在0～2 400 Da，扫描时间2 s。选择每个MS 谱中前2 个强度最大且响应值大于1 000的肽段作串联质谱，MS/MS 谱质量扫描范围在0～2400 Da，扫描时间2 s。MS/MS 扫描时前体离子采用了动态排除原则，经串级分析的前体离子在5 min 内不再重复扫描。

3.7.4数据库检索：

MS/MS 数据通过MASCOT（http://www.matrixscience.com）搜索NCBInr 和EST数据库。搜索条件：胰酶消化，最大遗漏酶切位点1个，肽段质量精确度±0.1，MS/MS 质量精确度±0.1，固定修饰Carbamidomethyl（C）。通过蛋白质组学分析mAb L-186的靶标确定为前列腺特异膜蛋白抗原（prostate-specific membrane antigen，human folate hydrolase 1 isoform 1)（图5）。

4. PSMA 特异单克隆抗体 mAb L-186 的鉴定

4.1 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）分析特异单克隆抗体mAb L-186与原核和真核细胞表达的重组PSMA蛋白的反应性

将10ug在大肠杆菌表达的PSMA重组蛋白，放置在室温过夜，使部分重组蛋白质降解。分别取1ug在大肠杆菌表达的和在HEK293细胞表达的PSMA重组蛋白以及5ul降解后的蛋白质，按照3.3所描述的方法在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶做电泳(SDS-PAGE)。然后，转移到硝酸纤维素薄膜上，按照3.4所描述的方法进行蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）。如图6所示，mAb L-186 单克隆抗体不但能够特异性的结合PSMA重组蛋白，而且能够与降解后的PSMA重组蛋白片段结合，说明mAb L-186 单克隆抗体识别一个稳定的抗原决定簇。

4.2 PSMA特异单克隆抗体mAb L-186与活LNCaP肿瘤细胞的结合性

4.2.1流式细胞仪 (Flow Cytometer, FCM) 分析：用胰酶从细胞培养瓶消化分离LNCaP和PC3单层细胞，用冰冷的含0.01%叠氮钠的PBS洗3次；取一定量的LNCaP和PC3细胞悬液（约1X10⁶ 细胞／ml ）到离心管中，分别加入含1ug/ml，0.1ug/ml，0.01ug/ml和0.001ug/ml，特异的mAb L-186抗体或小鼠IgG1冰冷的PBS（含0.01%叠氮钠）；在冰浴放置1小时，待反应完全后用冰冷的含0.01%叠氮钠的PBS洗3次，洗去未结合抗体；再加入荧光标记的羊抗鼠IgG抗体，在冰浴放置1小时，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，待反应完全后用冰冷的含0.01%叠氮钠的PBS洗3次，洗去未结合抗体；以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。如图7所示，mAb L-186抗体能够与PSMA阳性的LNCaP细胞结合，但不与PSMA阴性的PC3 细胞结合。

4.2.2免疫荧光显微镜分析：

将盖玻片放置在6孔板中培养LNCaP和PC3细胞。待形成约80%单层细胞后，用冰冷的PBS漂洗盖玻片3次，每次5分钟；在4%多聚甲醛固定液中固定半小时；PBS洗3次，每次5分钟；加10%封闭血清或者1-10%BSA，室温，30-60分钟；加稀释的mABL-186抗体（3%BSA, PBS），4℃，过夜；PBS洗3次，每次5分钟；加1:1000稀释的荧光标记羊抗鼠抗体（3%BSA，PBS），室温30-60分钟；PBS洗3次，每次5分钟，室温；用Hoechst染色，5-10分钟，室温；PBS洗3次，每次5分钟；最后在荧光显微镜下观察检测。如图8所示，mAb L-186抗体能够结合到PSMA阳性的LNCaP细胞膜，但不与PSMA阴性的PC3 细胞结合。

4.3 PSMA特异单克隆抗体mAb L-186针对前列腺癌组织的免疫组化（HIC）分析：

10份诊断为前列腺癌的肿瘤和5份良性瘤的活体采取的前列腺组织用于检测mAB-186识别人体组织前列腺癌的特异性。将前列腺癌组织和癌旁肝组织均做成蜡快。所有的蜡快均切成5岬厚的切片，附贴在FISHER载玻片上。用一片已知的PSMA阳性的组织作为阳性对照。切片在56℃烘干2 h，在二甲苯中脱蜡(每次3分钟)2次并在5个梯度酒精和2个去离子水中进行水化(100％，100％，90％，70％，50％，0％，0％，每个5分钟)，在3％的双氧水／甲醇中浸泡30分钟以灭活内源性过氧化物酶的活性，然后在去离子水中(每次5分钟)和PBS中(每次3分钟)各清洗2次。将切片浸于10mmol／L，pH6．0的柠檬酸缓冲液中，微波照射10分钟(控制微波功率以使缓冲液温度在92℃～98℃)进行抗原修复。等缓冲液自然冷却至室温，将切片置于湿盒中，按以下顺序进行温育，间隔在PBS中的清洗(5分钟×4)：与用PBS／2％BSA稀释的5％的正常羊血清在室温中温育30分钟以阻断非特异性的蛋白结合，与用PBS／2％BSA 稀释的1：50的一抗(mAb L-186或鼠IgG1对照)在4℃ 温育过夜，与二抗(生物素标记的羊抗小鼠抗体)在室温中温育10分钟，与过氧化物酶标记的链霉卵白素在室温中温育10分钟，与酶作用底物(新配制的用PBS稀释的50％ DAB，0.04％氯化镍，0 002％过氧化氢)在室温中温育15分钟，最后用去离子水清洗以终止温育过程。切片然后在5个梯度酒精中脱水(50％，70％，90％，100％，100％)，在2个二甲苯中透明，用中性树胶封于盖玻片下，在光学显微镜下进行读片。所用的酶作用底物使得阳性PSMA蛋白表现为棕色的细致颗粒。切片的免疫组化染色程度被判为一，+，++，分别代表阴性(0％)，阳性(<10％)，强阳性(> =10％)。结果显示，mAb L-186能够特异性的识别人体前列腺癌组织，用于免疫组化的检测，它在所有来自10位诊断为前列腺癌患者的肿瘤组织均成不同程度的阳性，而5份良性瘤的前列腺组织为阴性。

4.4 PSMA 特异单克隆抗体 mAb L-186 的序列分析

复苏分泌抗单克隆抗体mAb L-186的杂交瘤细胞株，传至3代使细胞数目达2.8×10⁷/L后收获细胞。用TRIzol^TMReagents（购自TaKaRa公司）、氯仿和异丙醇抽提RNA后，以无水乙醇沉淀。以10μL RNA为模板，以Oligo（dT）20为随机引物，反转录合成cDNA第1链。用小鼠IgG引物库试剂盒（美国USBiological公司产品），在25 μL反应体系中，加入cDNA 2 μL，Back和For引物各1 μL进行PCR。在GeneAmp PCR System (Perlin Elmer公司产品) 上进行扩增，反应参数为：94℃变性60分，55℃退火60分，72℃ 延伸60分，30次循环。PCR产物用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。将琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物纯化(Qiagen,gel extraction kit) 后，克隆在末端T突出的 pEGMR-T Vector中，转化感受态细菌CM1601，挑选阳性克隆，抽提质粒DNA，T7及SP6通用引物在310 A全自动DNA序列分析仪(ABI)公司双向测序。通过IMGT Web （the international ImMunoGeneTics information system®， http://www.imgt.org,）的IMGT/V-QUEST序列分析软件对获得的序列进行分析；使用BLAST分别将V_H或V_L DNA序列与GenBank和EMBL数据库已收录序列进行碱基局部同源性比较。然后，以推导的V_H和V_L氨基酸序列与Kabat等总结的已知鼠抗体可变区氨基酸序列分类进行对比，确定抗体重链和轻链的互补决定区（CDRs）。测序结果表明，该抗体轻链可变区基因的长度为330 bp，编码110个氨基酸 (SEQ ID NO:1)，该抗体重链可变区基因的长度为354 bp，编码118个氨基酸(SEQ ID NO:2)。

轻链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列为：

CDR1：如SEQ ID NO:3所示，

CDR2：如SEQ ID NO:4所示，

CDR3：如SEQ ID NO:5所示；

所述重链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列为：

CDR1：如SEQ ID NO:6所示，

CDR2：如SEQ ID NO:7所示，

CDR3：如SEQ ID NO:8所示。

<110> 广州康合生物科技有限公司

<120> 一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp

100 105 110

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> human

<400> 2

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Val Pro Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Thr Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Leu Pro Phe Tyr Gly Thr Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> human

<400> 3

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> human

<400> 4

Ala Ser Thr Arg His Thr Gly

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> human

<400> 5

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> human

<400> 6

Asn Tyr Gly Leu His

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> human

<400> 7

Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Val Pro Phe Met

1 5 10 15

Ser

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> human

<400> 8

Thr Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

1 5

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caccaaatcc tccaatgaag ctactaac 28

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttaggctact tcactcaaag tctctg 26

Claims

1.一种单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于，所述轻链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列为：

CDR1：如SEQ ID NO:3所示，

CDR2：如SEQ ID NO:4所示，

CDR3：如SEQ ID NO:5所示；

所述重链可变区的3个互补决定区（CDR）的氨基酸序列为：

CDR1：如SEQ ID NO:6所示，

CDR2：如SEQ ID NO:7所示，

CDR3：如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.编码权利要求1或2所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列的基因。

4.编码权利要求1或2所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列的基因。

5.编码权利要求1或2所述单克隆抗体的基因。

6.含有权利要求3～5任一项所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系，转基因动植物或重组病毒和细菌。

7.分泌权利要求1或2所述单克隆抗体的细胞系。

8.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备前列腺癌或/和其它PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

9.权利要求3～5任一项所述的基因、权利要求6所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求8所述的细胞系在制备前列腺癌或/和其它PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。