CN116769029B - 一种抗孕酮单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗孕酮单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗体领域，具体是一种抗孕酮单克隆抗体及其应用。通过对单克隆抗体的效价、电泳图以及相关试剂盒测试表明，本发明所述的单克隆抗体在孕酮的检测中性能优秀，可以作为进一步生产、优化的对象。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体是一种抗孕酮单克隆抗体及其应用。
背景技术
孕酮又称黄体酮，黄体酮是类固醇生物合成途径中最有活性的化合物。它由男性的肾上腺和睾丸，女性的卵巢和胎盘生成。其主要代谢产物为孕二醇-3-糖苷酸。促黄体酮生成素（LH）控制黄体对黄体酮的合成和分泌。随着 LH 中期波动，黄体开始发育，黄体酮的水平随之增长。在排卵期的 5-8 天达到最高水平。如果没有怀孕，在行经前 4 天，降低至卵泡期水平。如果怀孕，黄体酮水平随着其主要来源胎盘的发育而持续增长，并贯穿整个妊娠期。在血液中，流动的黄体酮，大约有 1%不与蛋白质结合，有 1%与氨基球蛋白结合，约48%与白蛋白结合，其亲合力要高于其它类固醇激素。其余的 48%以其高亲合力与松结合球蛋白结合。黄体酮的主要作用是为子宫接受和持续妊娠作好准备，与催乳激素一起为乳房泌乳作好准备。在临床上，用检测黄体酮的方法来确认排卵，评价黄体酮缺损，检查诱导排卵程序的效率。
有文献表明，结合黄体酮的检测是除了子宫内膜活检以外可以正确评价黄体功能的一种方法，甚至可以替代子宫内膜活检。正常和异位妊娠都会提高黄体酮的水平。
血清黄体酮的测定也用来监控补偿疗法和估计妊娠初期自发流产的危险率。
目前国内化学发光技术按标记物不同，主要包括辣根过氧化物酶（HRP）发光体系、碱性磷酸酶（AP）发光体系、及吖啶酯（AE）直接发光体系。随着国产化学发光技术全自动化，管式磁微粒方法已经成为最主要的方法，而由于吖啶酯直接放光较酶促发光有诸多优势， 也成为最主要的发光体系。
吖啶酯-磁微粒体系有诸多优势：1）可有效节省成本：放免 1mg 抗体可以做十个左右试剂盒（100T），酶促板式发光可以做 20-40 个左右试剂盒，而基于吖啶酯-磁微粒体系的 化学发光可以做约 100 个试剂盒；2）孵育时间短、操作简便：磁微粒体系反应速度快， 15-30min 即可出报告。并且得益于全自动化学发光分析仪的发展，化学发光法在国内呈现快速发展的趋势。
但目前国内很难找到特异性好、亲和力高的抗孕酮单克隆抗体， 主要依赖进口的产品，因此急需开发一种高亲和力高特异性的抗孕酮单抗用于孕酮检测试剂盒的研发。
发明内容
为克服以上问题，本发明提供了一种特异性好，灵敏度高的抗孕酮单克隆抗体6TJ12，特征如下:
该单克隆抗体包括重链可变区上三个抗原互补决定区：CDR1、CDR2 与 CDR3 和轻链可变区上的 三个抗原互补决定区 CDR4、CDR5、CDR6；6 个抗原互补决定区 CDR1、CDR2、CDR3、 CDR4、CDR5 和 CDR6分 别 如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7 和 SEQ.ID.NO.8 所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1 所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ.ID.NO.2 所示。
本发明还提供了一种单克隆抗体包被磁微粒的方法，具体如下：
1）将1ml 10mg/mL 的粒径为 0.86μm 的磁微粒与10ml 的 MES 缓冲液加入到15ml的离心管中；
2）边涡旋边加入 1.5ml 的浓度为 10mg/ml 的 EDC 溶液；
3）室温反应0.5h后，加入1mg 单克隆抗体6TJ12；
4）室温反应 3h 后，磁分离并加入 10mL 0.2M 甘氨酸溶液；
5）室温反应 1h 后，磁分离并加入 10mL 2%BSA ，室温反应1h；
6）磁分离并用 5mL TBS-T 缓冲液清洗三次，再次磁分离弃上清后加入 10mL 缓冲液（0.2M PBS + 2%海藻糖+1%BSA）即制备获得包被了单克隆抗体6TJ12的磁微粒溶液。
此外，本发明还介绍了一种能特异性检测血清中孕酮含量的化学发光试剂盒。
有益效果：
本发明提供了一种抗孕酮单克隆抗体6TJ12，利用所述抗体制备的检测试剂盒具有很好的线性与准确度。
附图说明
图 1 为抗孕酮单克隆抗体 6TJ12 的纯化后的 SDS-PAGE 电泳图。
图2 为所述试剂盒检测孕酮标准品的标准曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施 方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是 本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。
1、抗孕酮单克隆抗体的制备。
该实施例中所使用的孕酮抗原（prog-BSA）以购买的方式获得。将孕酮抗原（75ug/只）与完全佐剂（75ug/ 只）溶于 PBS 中（0.5ml/只）。置于 2mlEP 管中震摇至完全乳化，分装于注射器中，对小鼠进行腹腔注射。
第一次加强在初次免疫后15天进行，加强注射剂量与初次免疫相同，加强步骤使用的佐剂为不完全福氏佐剂，加强其它流程与初次免疫完全一致，每次加强后 10 天，从小鼠眼角采血检测血清效价，评价免疫效果。鼠血处理方式为：室温搁置 3 小时后，3000 转/分离心 15 分钟，收集血清， 按照 1:100、1:300、1:900、1:2.7k、1:8k、1:24k 和 1:72k 的稀释比例溶于 Blocking Buffer，另选取 Blocking Buffer 作为空白对照，进行 ELISA检测。
第二次加强在第一次加强两周后进行，加强操作程序与第一次加强完全相同。
三周对小鼠进行终加强，终加强时抗原的剂量与初次免疫相同，终加强后 5 天，进行细胞融合。
将小鼠处死并取出脾脏置于细胞筛网中，将脾脏用剪刀剪碎并用 5mL DMEM 冲洗， 用 5mL 注射器推头研磨脾脏至完全碾碎。用 DMEM 冲洗推头与滤网，将脾细胞溶液转入 50ml 离心管，补充 DMEM 至 45mL。提前将 CO2培养箱 T-75 细胞培养瓶取出，轻拍 7-10 下使细胞脱离瓶壁。移入 50ml 离心管，并向原培养瓶中补充含有 10%FBS，1*HT 的DMEM 培养基，分别将脾细胞和 sp2/0 细胞离心管颠倒两次摇匀，离心 5min（1000 rpm），弃上清， 分别重悬脾细胞和 sp2/0 细胞，并分别加入 45ml DMEM。取 40μL 计数细胞。将细胞颠倒两次摇匀，再次离心，同时细胞计数。
分别将脾细胞和 sp2/0 细胞重悬，加入 30ml DMEM 至脾细胞离心管中，10mlDMEM 至 sp2/0 离心管中混匀，根据 sp2/0 细胞数量多少，按照 sp2/0 细胞:脾细胞 1:5的比例将 sp2/0 细胞与脾细胞混合。再次离心后弃上清重悬并静置一分钟。用 2ml 移液管取预热 15 分钟的 PEG1500 进行细胞融合，按照 1.0*108/ml 脾细胞的量然后将移液管口伸入细胞液中缓慢滴加，边加入边轻轻滑动移液管将细胞液搅拌均匀。将细胞静置 30秒，用准确的 1 分钟时间匀速滴加 1ml DMEM 至离心管中，边加入边轻轻摇动离心管。同样的操作方法，在第二个 1 分钟内滴加 2ml DMEM，在第三个 1 分钟内滴加 5ml 在第四个 1 分钟内滴加 10ml。补充 DMEM 至 50ml，离心5min（1000 rpm）。
将融合好的细胞重悬，以脾细胞 1.5-2*106/ml 的浓度溶于含有 30%FBS，1*B.S、2*H.A.T 的 DMEM 培养基中。100 μl/孔分装到饲养细胞板中。将分装好的细胞培养板放入CO2培养箱中培养。在细胞融合后第四天向培养板中补充 50μl 培养基，培养基成分为含有20%FBS、 1*B.S、10%HCF 的 DMED 培养基。在细胞融合后 7-14 天，当克隆生长到肉眼可以观测到大小时，ELISA 筛选阳性克隆孔。
将阳性的杂交瘤细胞由小瓶转出或将一个冻存管复苏，转移到中瓶。用含有 10%FBS， 1*B.S 的 DMEM 培养基培养 3-5 天，当细胞扩增到足以注射，1000 转/分离心 5 分钟，弃上清，用 DMEM 洗两次，每次洗后离心5min（1000 rpm），弃去上清。用 DMEM 重悬细胞，最终的细 胞浓度为 2-4x106cells/ml，在重悬后 1 小时内以 1-2*106cells/0.5ml/mouse 的剂量注入小鼠腹腔。所注射的小鼠需要在 14-30 天前免疫过液体石蜡，或是在7-32 天之前免疫过不完全福氏佐剂。每天观察小鼠的腹部，在注射细胞后 7-10 天后腹部出现明显肿胀后，每天连续采集腹水，直至小鼠死亡或停止产生腹水,将采集的腹水离心15min（4000rpm），取上清存于 4℃冰箱，一周内用蛋白A层析柱进行纯化。
利用 ELISA 抗体效价检测试剂盒对单抗6TJ12进行检测，结果如表 1 所示。
表1 抗孕酮单克隆抗6TJ12体效价检测结果
当效价检测结果 P/N＞2 时为阳性，从表 1 的结果可以看出 6TJ12 单克隆抗体的效价 达到了 1:243000以上，表明该单抗具有较好的活力，可以用于后续实验，纯化后抗体SDS-PAGE电泳图如说明书附图1所示。
2、单抗 6TJ12 包被磁微粒的制备。
将 15mL 的 EP 管用 MES 缓冲液（PH=5.0）润洗三次，再在管中加入 10ml 的MES 缓冲液（PH=5.0），取 1ml 磁微粒（Merk公司，0.86μm) 加 入 EP 管 中 ，涡旋振荡形成均一的磁微粒悬浮液，边震荡边加入 1.5ml EDC 溶 液 （10mg/ml），震荡反应 30min，加入 1mg 的单克隆抗体 6TJ12，室温震荡反应 3-4h，磁分离弃 掉后加入 10ml 0.2M 的甘氨酸溶液，室温孵育1h，磁分离弃掉液体之后加入10ml 2% BSA，室温孵育1h或2-8℃过夜，磁分离后加入 5mlTBS-T 缓冲液清洗磁珠三次，最后一次磁分离后加入 10ml PBS 缓冲液（含有 2%海藻糖，1%BSA），4℃保存备用。
3、孕酮检测试剂盒的检测效果。
利用磁微粒化学发光法（竞争法）对单克隆抗体的特异性与灵敏度进行测试。将上述包被了 6TJ12 的磁微粒稀释 40 倍作为试剂盒的磁微粒溶液组分，将制单抗所使用的孕酮抗原（prog-BSA）连接吖啶酯制备的标记抗体作为试剂盒的吖啶酯标记组分，将prog-BSA 用 20%胎牛血清配置为检测的校准品， 浓度为 0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、30ng/ml、60ng/ml，以校准品浓度为横坐标， 以各浓度对应的发光值为纵坐标，用四参数法绘制标准曲线。发光值结果如表 2 所示， 标准曲线如说明书附图 2所示。
标准曲线的确定。
实验方法：对校准品的 6 个浓度点进行 3 次重复检测，然后求出平均值，以浓度值为横坐标，发光值平均值为纵坐标绘制标准曲线。
表 2. 标准曲线发光值结果
如图 2 所示，标准曲线在四参数拟合之后 r=0.9993。
准确度验证。
实验方法，将浓度约为 40ng/mL（允许其浓度偏差为±20%）的样本 A，加入 到浓度范围在 1ng/mL-2.5ng/mL 的血清 B 中，所加入孕酮抗原与血清 B 之间的体积比为 1:9，根据公式（R——回收率，V——加 入样本 A 的体积，V0——加 入样本 B的体积,C——样本 A 和样本 B 混液的检测浓度，C0——样本 B 液的浓度，CS—— 样本 A 液的浓度）计算回收率 R， 回收率应在 85%-115%范围内。
表 3.回收率实验结果
表 3 结果表明该试剂盒准确度符合标准。
Claims (3)
1.一种能特异性识别人孕酮的单克隆抗体 6TJ12，其特征在于，该单克隆抗体包括重链可变区上三个抗原互补决定区：CDR1、CDR2 与 CDR3 和轻链可变区上的 三个抗原互补决定区 CDR4、CDR5、CDR6；6 个抗原互补决定区 CDR1、CDR2、CDR3、 CDR4、CDR5和 CDR6 分别如序列表中 SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7 和SEQ.ID.NO.8 所 示 ； 所 述 重 链 可 变 区 的 氨 基 酸 序 列 如 序 列 表 中SEQ.ID.NO.1 所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中 SEQ.ID.NO.2 所示。
2.一种单克隆抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，所述方法为：
1）将 1ml 10%的粒径为 0.86μm 的磁微粒与 10ml 的 MES 缓冲液加入到 15ml 的离心管中；
2）边涡旋边加入 1.5ml 的浓度为 10mg/ml 的 EDC 溶液；
3）室温反应 0.5h 后，加入 1mg 权利要求 1 所述的单克隆抗体 6TJ12；
4）室温反应 3h 后，磁分离并加入 10mL 0.2M 甘氨酸溶液；
5）室温反应 1h 后，磁分离并加入 10mL 2% BSA 溶液 ，室温反应 1h；
6）磁分离并用 5mL TBS-T 缓冲液清洗三次，再次磁分离弃上清后加入 10mL 缓冲液,所述缓冲液组分为0.2M PBS+2%海藻糖+1%BSA，即制备获得包被了单克隆抗体 6TJ12 的磁微粒溶液。
3.一种能特异性检测人血清中孕酮浓度的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求 2 所述的单克隆抗体包被磁微粒的方法所制备的包被了单克隆抗体 6TJ12 的磁微粒。
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