CN101294164B

CN101294164B - 重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用

Info

Publication number: CN101294164B
Application number: CN200710021657.6A
Authority: CN
Inventors: 侯亚义; 赵树立; 王庆苓; 黄亚红; 王会; 谢浩
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2007-04-23
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2027-04-23
Also published as: CN101294164A

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用。特征是通过大肠杆菌进行人中期因子(Midkine，MK)的原核表达，得到的重组蛋白30P-MK具有促进细胞增殖的生物活性，为MK在肿瘤、细胞生物学和神经系统等方面的研究提供基础；30P-MK蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选得到抗人MK单克隆抗体杂交瘤，所分泌的单抗为IgG1，通过对人肿瘤组织样品中中期因子Western-blotting和免疫组化的检测实验验证表明得到的单抗特异性强，背景低，可发展成为诊断试剂盒用于临床和实验室检测肿瘤组织和血清中MK的表达水平，为通过MK单抗靶向治疗肿瘤奠定了基础。

Description

重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及人中期因子MK的原核表达、单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术

1988年日本学者Kadomatsu等在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中发现Midkine(MK)基因，中文称为中期因子。早期研究发现中期因子是一种对细胞的生长和分化起重要作用的细胞因子。它能促进正常细胞的生长和分化，尤其可促进神经细胞的发育。近年对人肿瘤研究发现，MK具有诱导细胞转化、促有丝分裂、生血管、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等与肿瘤发生与发展密切相关的生物学功能，且在多种肿瘤组织中均有异常表达。

Konishi等对15例潜伏期前列腺肿瘤、16例PIN(膀胱上皮内瘤形成)及正常前列腺组织进行了免疫组化分析研究显示，80％潜伏期肿瘤和75％PIN有MK高度表达，而正常组织不表达或仅微弱表达MK。在结直肠癌的早期发生中，伴中度或重度发育异常的腺瘤，MK表达均明显高于轻度异常或正常组织。

本实验室通过RT-PCR和免疫组化的方法，检测9例正常胃镜组织、37例胃肿瘤组织及其相应的配对癌旁组织中MK的表达情况，对MK的表达进行定性、定量和定位分析，并进一步分析了MK表达水平与肿瘤临床病理之间的关系。RT—PCR定性分析表明，MK在胃癌组织中高表达(表达率为94.6％)，癌与癌旁MK表达有显著差异，而且癌与正常组织有显著差异；RT-PCR定量分析结果证实了定性分析的结果，而且发现MK的表达与肿瘤的临床分期及远处转移情况相关，而与肿瘤的组织分化、大小及淋巴结转移情况无关；免疫组化定位分析发现，MK蛋白广泛存在于肿瘤细胞的细胞质，此外，细胞核和核仁也有MK聚集，细胞外组织中腺泡处MK表达尤为明显。

国内外的研究结果均表明：MK与肿瘤的发生与发展密切相关，MK的表达与肿瘤发展的进程及严重程度也密切相关。而且由于MK在肿瘤形成的早期就有异常表达，MK检测将有可能应用于肿瘤的早期诊断。

由于目前尚缺乏特异性强的MK单克隆抗体检测和靶向治疗肿瘤的MK单克隆抗体药物，临床上对MK的免疫学检测都是用多克隆抗体，在检测过程中存在交叉反应、特异性低等不可避免的缺点。正是因为没有特异性高的人MK单克隆抗体，所以对MK的检测特别是血液、尿液中MK的检测受到了相当大的限制。本发明得到了一株特异性高的单克隆抗体，证明本发明可以用于肿瘤组织、血液、尿液中MK的特异性检测。并可以通过特异性结合MK而靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抗MK蛋白的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种特异性检测肿瘤病人血液、尿液和组织的检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种能靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞的单克隆抗体偶联物。作为靶向富含MK蛋白肿瘤细胞的治疗剂。

在本发明的第一个方面，提供了一种免疫球蛋白IgG1，其特征在于，它能特异性结合MK蛋白，所述MK蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。

在本发明的一个实例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。

在本发明的另一个实例中，所述的免疫球蛋白由小鼠杂交瘤细胞系9E10所产生，这种免疫球蛋白还包括人源化改造的MK单克隆抗体。

本发明的第二个方面，提供了能检测肿瘤组织中的MK蛋白含量的试剂盒，它含有上述免疫球蛋白或与这种免疫球蛋白形成的偶联物，其特征是该免疫球蛋白偶联物具有特异性结合MK蛋白的免疫球蛋白或活性片段及可以将药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、荧光素、纳米材料分别偶联到免疫球蛋白或活性片段上的偶联物。

本发明的第三方面，提供了上述免疫球蛋白或免疫球蛋白偶联物作为一种药物组合物，其特征是可靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤组织。

附图说明

图1显示的是经过表达、纯化的30P-MK的蛋白电泳分析。表明30P-MK为可溶性分泌表达，而且便于纯化。加样孔1指的是蛋白Marker，图左边标记的数字是对应条带的分子量；加样孔2是指未经过诱导的总蛋白上样，加样孔3是经过低温诱导的总蛋白上样，可以明显看出在17KD左右有明显的蛋白表达；加样孔4是指经过用1.2M洗脱液洗脱的蛋白电泳分析，可以看出还有一些少量杂蛋白；加样孔5是2M洗脱液的蛋白电泳分析，得到完全纯化的蛋白。

图2显示纯化的30P-MK具有促进NIH3T3细胞增殖活性，所有浓度的30P-MK蛋白对NIH3T3细胞有显著的促生长作用。而且当浓度在1ug/ml以下时这种促生长作用呈浓度依赖性，但当MK浓度超过1ug/ml时这种促进作用不再增加。

图3显示9E10抗体保存液的效价的检测，以100ng30P-MK为抗原包被，采用间接ELISA法检测抗体溶液的效价，其中抗体9E10保存液的效价为1/40960。其中A₄₉₂的值为9.999时表示此时的吸光值超过此仪器测量范围，0为阴性无关血清对照。

图4显示9E10抗体用于人组织MK的Western的检测，1泳道：人胃粘膜；2泳道：胃癌组织；3泳道：胃癌旁组织。在相同总蛋白的时候胃癌样品中MK表达明显高于胃正常组织和癌旁组织。结果表明抗体9E10可以用于人组织中MK表达的Western-blotting实验。

图5显示9E10抗体用于人胃肿瘤组织和正常胃组织的免疫组化实验，图5.1和图5.2为胃癌组织的试验组和阴性对照组；图5.3和图5.4分别为胃癌旁组织的实验组与阴性对照组；图5.5和图5.6分别胃正常胃组织和阴性对照组。从图上可以看出在细胞质、细胞间质中均出现特异的棕黄色染色，视为组织MK表达阳性；在细胞核及核仁区有明显的棕黄染色，视为细胞核及核仁MK阳性，而且从图上可以看出癌组织中的MK表达明显高于癌旁组织和正常组织。实验结果说明：单克隆抗体9E10可以用于人胃癌组织、癌旁组织中MK蛋白表达的免疫组化分析实验。

本发明经多年研究发现，MK蛋白与肿瘤发展进程及严重程度密切相关，可以作为肿瘤细胞的早期敏感性标志蛋白。

为了研究人肿瘤组织中MK的表达特性，发明人用pET30a(+)作为载体构建了重组表达人胃癌组织MK基因的菌株pET30a-MK，获得了大肠杆菌表达的人MK重组蛋白，但该载体表达的MK蛋白以包涵体的形式存在，这对蛋白的纯化和活性带来了很大的影响。因此，发明人用PCR的方法合成了pel信号肽，用以替换pET30a(+)载体中的Tag序列，将pET30a(+)载体进行改造，使克隆在pel信号肽后面的MK基因的表达蛋白定位到胞质中，以分泌蛋白的形式表达，这将更有利于克隆基因的表达产物保持原有的生物学活性，利于纯化。将此工程菌株命名为30P-MK。对菌株30p-MK进行扩大培养后，经IPTG诱导表达产生的总的可溶蛋白用Heparin Sepharose 4B亲和柱纯化，用Cell Counting Kit-8试剂盒(DOjinDO公司)证明30p-MK蛋白具有促进NIH3T3细胞增殖的基本生物学活性。

用重组表达的30p-MK融合蛋白通过免疫Balb/c小鼠、取浆细胞与SP2/0细胞融合、杂交瘤的筛选等经典单克隆抗体制备方法得到一株亲和力高、特异性好的单克隆抗体杂交瘤细胞株，进行两次亚克隆后液氮冻存，此株单抗编号为9E10，其亚类为IgG1。

对9E10杂交瘤细胞扩大培养后，取培养上清用于人肿瘤样品中MK的免疫组化、Western的检测。

根据本发明：其特征是构建的30p-MK为可溶性表达，且具有NIH3T3促进细胞增殖的活性。

根据本发明：其特征是得到的9E10单克隆抗体可以用于肿瘤组织的免疫组化检测MK蛋白的表达实验。

根据本发明：其特征是得到的9E10单克隆抗体可以用于肿瘤组织的Western blotting检测MK蛋白的表达实验。

本发明的9E10单克隆抗体或其片段可特异性结合肿瘤细胞的MK蛋白、肿瘤患者血液、尿液中的MK蛋白。可用于靶向结合治疗，例如通过直接或间接地将MK单克隆抗体或其片段与化学治疗剂、纳米材料或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。

本发明包括：具有MK单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有MK单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其它蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及人源化片段。只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、荧光标记物、纳米材料和其它诊断或治疗分子与MK单抗或其片段结合形成的偶联物。本发明还包括与MK单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明MK单抗重链和轻链序列可以用常规方法测定，本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab片段、抗体重链、抗体轻链、遗传工程改造的单链Fv分子，或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的人源化抗体。

本发明提供了编码MK蛋白的cDNA，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。本发明还提供了上述免疫球蛋白或片段的DNA分子，这些DNA分子序列可以如上用常规技术获得，一旦获得了有关序列，按本领域技术人员已知的常规方法来获得有关序列，并通过常规方法通过载体转化适当的宿主细胞以使其能够表达蛋白质。

本发明还提供了一种MK蛋白质的单克隆抗体检测试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段，可用于肿瘤患者血液、尿液、肿瘤组织中MK蛋白浓度的检测，已完成37例胃癌组织及其癌旁组织和9例正常胃组织的免疫组化和western blotting的检测。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段免疫偶联物，这些药物组合物与给药方式相匹配，可以被制成针剂形式，溶液宜在无菌条件下制造，例如MK单克隆抗体同金纳米壳球体结合后，在近红外光的激发下，热疗杀死肿瘤细胞。

本发明参照附图及以下实施例，进一步阐述本发明，这些实施例的目的仅用于说明本发明而不是为了以任何方式限制本发明。

实施例1：重组MK蛋白抗原的制备和活性的验证

1、引物设计

根据pelB信号肽序列，设计两条引物，在引物的两端分别引入NdeI和NcoI酶切位点，用于pET30a-MK菌株质粒的改造。

pelB—5引物：

5’tatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccc3’peIB—3引物：

5’catgggccatcgccggctgggcagcgaggagcagcagaccagcagcagcggtcggcagcaggtatttca3’pelB信号肽序列

catatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgccccagccggccgatggccccatgg

2、对pET30a-MK载体的改造

将保存的pET30a-MK质粒、pel信号肽序列用NdeI和NcoI，37℃，3小时双酶切后，1％的凝胶电泳30min后，对目的条带用胶回收试剂盒(BioFlux公司)胶回收后，用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化DH5a感受态细胞，涂LB/Kan^r液体培养基，到长出转化菌落时挑单菌落于LB/Kan^r液体培养基37℃培养后，抽提质粒进行PCR鉴定，经鉴定阳性的菌送博亚测序，测序正确的划平板，挑单菌落扩大培养后分装，—70℃保存。改造后的菌株储存号为：pET30P-MK。

3、蛋白纯化：挑阳性单菌落于LB/Kan^r液体培养基扩大培养至OD值为0.6时加IPTG，37℃、4小时诱导蛋白表达；离心收集菌体，用50mmol/L Tris-Cl pH7.5悬浮，加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上作用30分钟后，用超声波破碎菌体，最后离心收集上清。用Heparin Sepharose4B层析柱纯化。平衡和洗涤均用50mmol/LTris-Cl pH7.5。然后分别用含0.6M、1.2M、2M的NaCl的50mmol/L Tris-Cl pH7.5液梯度洗脱，洗脱液进行SDS-PAGE检测收集蛋白的纯度，取2M洗脱液透析后冻干保存。

4、用Cell Counting Kit-8试剂盒(DOjinDO公司)验证MK蛋白对NIH3T3细胞的增值活性：将处于对数生长期的NIH3T3细胞用DMEM培养基调节成2×10⁵/ml的细胞悬液，100ul/孔接种于96孔板，37℃、5％CO₂培养箱中培养4h。弃去培养液(DMEM+10％小牛血清)。100ul/孔加入含不同浓度MK的培养液(0.25、0.5、1、2ug/ml)，每一点浓度设6孔，并设不含MK的培养液作为对照组。24h后去培养液，每孔加5微升CCK-8试剂.继续37℃、5％CO₂培养4h，酶标仪检测A450值。测定结果用单因素方差分析统计不同浓度MK重组蛋白对NIH3T3细胞生长活性的影响。

结果

(1)构建的pET30P-MK载体的相关序列(见序列表)。

(2)经过Heparin Sepharose4B层析柱纯化后，2M洗脱液中得到较纯的MK蛋白(附图1)。

(3)30P-MK蛋白促进NIH3T3细胞增殖活性的验证：酶标仪测定各组A450吸光度结果表明，与对照组相比，所有浓度的30P-MK蛋白对NIH3T3细胞有显著的促生长作用。而且当浓度在1ug/ml以下时这种促生长作用呈浓度依赖性，但当MK浓度超过1ug/ml时这种促进作用不再增加(附图2)。

制备的重组MK蛋白具有基本的天然MK的基本活性，满足MK用于细胞生物学、肿瘤、神经系统等研究的基本特征。

实施例2：抗MK单克隆抗体的的制备、亚类的鉴定

1、免疫动物

取纯化冻干的20微克30P-MK重组蛋白用100微升无菌PBS缓冲液溶解，加入福氏完全佐剂100微升混匀，对6周龄、雌性Balb/c小鼠进行皮下常规免疫；3周后取20微克MK重组蛋白用100微升无菌PBS溶解后，加入福氏不完全佐剂100微升混匀，腹腔注射；7天后用间接ELISA(100纳克30P-MK蛋白包被)测效价，效价为1/10240，30天后20微克/只MK蛋白用100微升无菌PBS溶解后，尾静脉注射追加免疫。

2、细胞融合与阳性孔的筛选及其克隆

追加免疫3天后收集免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5：1的比例混合，在37℃水浴中，加入1毫升的50％PEG-1000(sigma)融合90秒，然后分别依次在30秒内加入1毫升、3毫升、6毫升直至总体积到40毫升的RPMI-1640(Gibco)不完全培养基；离心后加HAT选择性培养液悬浮，铺入10块96孔培养板中，37℃，5％CO₂选择培养杂交瘤细胞。15天后取上清进行ELISA筛选阳性克隆，得到6株阳性克隆，将筛选的阳性克隆孔的杂交瘤细胞作有限稀释，进行2次亚克隆，冻存稳定的杂交瘤细胞株。

3、单克隆抗体的腹水制备、纯化及其保存

取8周龄的Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷(sigma)0.5毫升，10天后腹腔注射1x10⁶个杂交瘤细胞，于10—14天后收集腹水，4℃静置过夜，3000rpm离心10min，收集上清即为单抗腹水。在腹水中加入2倍体积的0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液稀释腹水，调PH至4.8，按每毫升稀释液加1微升辛酸的比例，于室温搅拌下逐滴加入辛酸，4℃静置2h，15000g离心30min，弃沉淀，调节PH至7.2，加入终浓度为45％的饱和硫酸氨，4℃搅拌30min后，静置1h，10000g，10min离心，沉淀用等体积的无菌PBS融解后，用100倍体积的PBS透析5次，10000g离心30min，测定蛋白含量后，分装，加等体积甘油-20℃冻存备用。

4、效价测定和单抗亚型的鉴定

抗体保存液的效价：以100ng30P-MK为抗原包被，采用间接ELISA法检测抗体溶液的效价，其中抗体9E10保存液的效价为1/40960(见附图3)。用鼠mAb亚型鉴定试剂盒ImmunoType TMKit对9E10抗体进行亚型鉴定为IgG1。

实施例3：人胃癌组织中MK检测

1、Western blotting：①、取正常的胃组织(1泳道)、胃癌患者的癌组织(2泳道)及相应的癌旁组织(3泳道)加相应体积PBS研磨后，分别取100ug总蛋白跑15％的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳；②、100V，2h，转硝酸纤维素膜；5％脱脂奶粉室温封闭2h；③、用9E10(1∶1000)单克隆抗体孵育两个小时；TBST洗4次(10分钟/次)后；④、加羊抗鼠IgG-HRP(博士德，1/1000稀释)，室温孵育1.5小时；TBST洗4次(10分钟/次)后。⑤、用EZ-ECL试剂盒(Biological Industries)来验证9E10单抗的特异性。

2、免疫组化：①、载玻片经2％盐酸酒精处理后，包被多聚赖氨酸；将37例胃癌组织及其癌旁组织和9例正常胃组织经OCT包埋后，做5微米冰冻切片，切片室温风扇吹干。②、用10％的中性缓冲福尔马林液固定30分钟；蒸馏水洗二次，每次5min；③、用30％H₂O₂1份+纯甲醇50份混合溶液，室温浸泡30分钟，用来灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，每次5min；④、滴加5％BSA封闭液，室温60min，甩去多余液体。⑤、滴加9E10单抗(PBS梯度稀释选择得到合适的工作稀释度为1∶1280)，以PBS作为阴性对照，湿盒中37℃1h；用PBS(pH＝7.4)洗5min×3次。⑥、滴加羊抗鼠IgG-HRP(博士德，1/1000稀释)，37℃60min，PBS(pH＝7.4)洗3次，每次3分钟。⑦、用DAB显色试剂盒(博士德)显色，显微镜下控制显色时间，3-5min，用水冲洗终止显色。⑧、常规苏木精复染1-2分钟后，自来水冲洗残余染液后，1％盐酸/75％酒精混合液分色，1％氨水返蓝后镜下观察。⑨、蒸馏水洗后，常规梯度酒精脱水、二甲苯处理后，封片，显微镜观察，统计分析。

结果：

1、蛋白印记实验：在胃正常组织、胃癌组织和胃癌旁组织中都有特异的蛋白印记条带。且从条带上分析得知肿瘤组织中的MK表达明显较正常组织和癌旁组织中高。实验结果说明：单克隆抗体9E10完全可以用于人胃癌组织、癌旁组织中MK蛋白的Western实验分析(见附图4)。

2、免疫组化实验：在细胞质、细胞间质中均出现特异的棕黄色染色，视为组织MK表达阳性；在细胞核及核仁区有明显的棕黄染色，视为细胞核及核仁MK阳性。在37例胃癌组织及其相应的癌旁组织和9例正常组织中，检测出有30例胃癌组织、26例癌旁组织和1例正常组织有不通程度的MK表达阳性。实验结果说明：单克隆抗体9E10可以用于人胃癌组织、癌旁组织中MK蛋白表达的免疫组化分析实验(见附图5)。

实施例4：MK单克隆抗体与纳米材料结合形成免疫偶联物靶向作用于肿瘤细胞

用HEPES缓冲液(PH＝7.4)把金纳米壳球体稀释到OD.₅₃₀为0.8；把抗体9E10用HEPES缓冲液稀释到适当浓度；然后把两种溶液按比例混合后，室温放置20min，加入0.5ml、1％的聚乙二醇(防止形成聚合体)室温放置5分钟后，离心(6000rpm)，沉淀用PBS稀释后4℃保存。在BALB/c裸鼠前肢腋皮下接种5×10⁶个BGC细胞，两周后待肿瘤直径约1.5cm时，随机分为对照组(注射100ul生理盐水)、单抗对照组(100ul的100ng/ml)、抗体-金纳米壳球体复合物组(100ul的2.4×10¹¹个金纳米粒子/ml)，尾静脉注射，注射后6小时后，肿瘤处皮肤用聚乙烯乙二醇擦试以便光可以最大渗入组织，用近红外光照射激发3分钟，连续10天。最后一次治疗后处死小鼠，量肿瘤的直径，统计分析。

其中抗体—金纳米偶连物组的肿瘤平均直径从刚开始的1.55CM减少到0.13CM；单抗对照组的肿瘤平均直径从原来的1.49CM增加到5.6CM；而生理盐水对照组的肿瘤平均直径由1.53CM增加到7.25CM。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限范围。

30P-MK序列表

<110>南京大学

<120>重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用

<140>200710021657.6

<141>2007-04-23

<160>1

<210>1

<211>444

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Figure 415432DEST_PATH_RE-S07121657620070929D000011

Claims

1.一种重组质粒载体，其特征是该载体为pET30P-MK，它含有适合于在大肠杆菌中可溶性表达的人中期因子(midkine，MK)，具有如下所示的核苷酸序列

CATATGGGCCATCGCCGGCTGGGCAGCGAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTATTTCCATGGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCCGGGGAGCGAGTGCGCTGAGTGGGCCTGGGGGCCCTGCACCCCCAGCAGCAAGGATTGCGGCGTGGGTTTCCGCGAGGGCACCTGCGGGGCCCAGACCCAGCGCATCCGGTGCAGGGTGCCCTGCAACTGGAAGAAGGAGTTTGGAGCCGACTGCAAGTACAAGTTTGAGAACTGGGGTGCGTGTGATGGGGGCACAGGCACCAAAGTCCGCCAAGGCACCCTGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCAGTGCCAGGAGACCATCCGCGTCACCAAGCCCTGCACCCCCAAGACCAAAGCAAAGGCCAAAGCCAAGAAAGGGAAGGGAAAGGACCTCGAG。

2.一种具有生物活性的蛋白30P-MK，其是权利要求1的重组质粒载体在大肠杆菌中表达的具有生物活性的融合重组蛋白，具有促进NIH3T3细胞的增殖活性。