CN101891815A

CN101891815A - Ck19单克隆抗体、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN101891815A
Application number: CN2009100517604A
Authority: CN
Inventors: 孙兵; 潘荣; 曹刘丽; 季永镛; 田林
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2029-05-22
Also published as: CN101891815B

Abstract

本发明涉及CK19单克隆抗体、其制备方法及用途，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株、包含CK19单克隆抗体的免疫偶联物、检测条或试剂盒。本发明的单克隆抗体是用原核系统表达的CK19抗原免疫动物制得的，具有生产工艺简单、成本低的特点，且所得的单克隆抗体亲和力高、可用于胆管癌的临床检测。

Description

CK19单克隆抗体、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及免疫学和生物医药领域。更具体而言，本发明涉及抗CK19单克隆抗体的制备及其用途。

背景技术

细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)是构成细胞骨架的一种中间丝状物，几乎所有上皮细胞均可被其表达，用双相胶电泳可将人类上皮细胞角蛋白分离出20个条带，分别命名为CK1～20，用单抗进行免疫组化分析证实20种不同的角蛋白多肽在组织的分布具有特异性。当上皮细胞癌变时，CK组成不变但含量异常升高，20个细胞角蛋白中许多成员的片段已作为肿瘤的血清学标志物，肿瘤细胞中含量最丰富的是CK19，临床上多以CK19和CK20作为靶基因。其中细胞角蛋白19片断(CK19)的研究最为引人注目。

CK19属酸性(I型)细胞角蛋白，分子量为40kDa，是单层上皮细胞特有的细胞骨架结构，在所有的单层上皮细胞中表达，在淋巴结和血细胞中不表达。CK19mRNA基因定位于人染色体17q21～q23，编码细胞角蛋白19亚型。作为循环上皮细胞的一个标志物，它也是早期癌症微转移研究中运用最多的分子标志之一。CK19与CK7一起被称为胆管型CK。CK19对肝细胞不着色，对胆管上皮和胆管癌(ICC)具有特异性染色，是目前诊断ICC最好的免疫组化标志物。

目前，临床上用的针对CK19的抗体主要是用MCF-7细胞系免疫动物制备而来的，该方法制备工艺繁琐，筛出特异性抗体的难度较大，成本相对较高。

因此，本领域迫切需要开发出可简单有效地生产高纯度、高亲和力CK19单克隆抗体的方法，以及由该方法提供的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的之一正是在于提供一种生产CK19单克隆抗体的方法。本发明的领域目的在于提供由本发明方法制备的CK19单克隆抗体及其用途。

在本发明的第一方面中，提供了一种CK19特异性单克隆抗体，所述的抗体的亚型为IgG1，κ。

在本发明的一个实施方式中，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925。

在本发明的另一优选例中，所述的单克隆抗体特异地累积于胆管上皮或胆管癌中。

在本发明的另一优选例中，所述的单克隆抗体是用原核系统表达的CK19抗原免疫动物制得的。

在本发明的第二方面中，提供了一种产生CK19特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自：CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925。

在本发明的第三方面中，提供了一种制备本发明单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)构建特异性表达CK19蛋白的原核表达系统；

(b)由所述原核表达系统产生CK19蛋白；

(c)用步骤(b)中所产生的CK19蛋白免疫动物；

(d)用被免疫动物的脾细胞制备特异性表达CK19的杂交瘤细胞；和

(e)从步骤(d)的杂交瘤细胞中制得本发明所述的单克隆抗体。

在本发明的一个实施方式中，所述原核表达系统是大肠杆菌表达系统。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括在步骤(d)之前，对CK19蛋白进行纯化的步骤。

在一个优选例中，纯化所用的方法是包涵体变性纯化，且在用8M尿素溶解包涵体之前先用2M尿素洗涤包涵体，再用8M尿素溶解包涵体Ni柱亲和纯化，从而使得纯化所得蛋白的纯度高于未用2M尿素洗涤的纯化所得的蛋白。

在本发明的第四方面中，提供了一种制备CK19特异性单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：

(1)培养杂交瘤细胞系CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925，使之分泌单克隆抗体；

(2)分离步骤(1)中获得的单克隆抗体。

在本发明的第五方面中，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有本发明的单克隆抗体，以及选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

在本发明的第六方面中，提供了一种检测条或检测试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体、本发明的免疫偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。

在一个优选例中，所述可检测标记物选自：胶体金标记、荧光标记、同位素标记、酶标记，优选所述酶标记为HRP酶标。

在本发明的第七方面中，提供了本发明单克隆抗体或本发明免疫偶联物在制备用于检测样品中CK19存在的检测条或检测试剂盒中的用途。

在一个优选例中，所述检测条或检测试剂盒用于检测：胆管癌或早期癌症微转移。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：CK19蛋白原核表达的技术路线示意图。其中，提交数据的标准如下：

DNA图谱：1kb，100bp标记物(marker)、基因引物和TA引物PCR(克隆到T载体)、基因引物和双酶切(克隆到表达载体)

SDS-PAGE：标记物、未诱导、诱导后、上清、沉淀、纯化后纯度验证

重组质粒DNA图谱：标记物，重组质粒(50μl，conc：300μg/ml)，只保存用于大量纯化的表达质粒

甘油菌保存：15％甘油保存(方法见方案protocol)。

图2：由肝癌组织PCR扩增cDNA的TaqPCR产物的电泳图(1％琼脂糖凝胶)。其中，左侧为分子量标记M，右侧所示为CK19(约1.3kb)。

图3：表达质粒ck19-pet28a构建中的载体引物TaqPCR验证的电泳图(核酸胶电泳：琼脂糖胶)。其中，1-8所示为不同的克隆，M为分子量标记，7号为阳性克隆(扩增出大小正确的目的片段)。

图4：由图3的7号克隆抽取的ck19-pet28a质粒的双酶切验证的电泳图(核酸胶电泳：琼脂糖胶)。

图5：快速诱导蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图6：Ni-NTA变性亲和层析柱纯化蛋白的检测结果。

图7：蛋白质印迹法(Western blot)检测抗原的结果，其中所用一抗为抗his单抗(购自TIANGEN公司)。

图8：蛋白质印迹法检测S-66-5、S-71-9和S-163-6三株单抗的原核表达CK19蛋白的结果。

图9：CK19单克隆抗体应用胆管癌组织切片的胆管癌免疫组化。其中，三角箭头所指区域为癌组织，开放式箭头所指为癌旁组织(即为阴性对照)。

生物材料保藏

本发明的杂交瘤细胞系已于2009年4月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学)，其培养物名称与对应的保藏号如下所示：

培养物名称	保藏编号
		杂交瘤细胞株S-66-5	CCTCC-C200923
杂交瘤细胞株S-71-9	CCTCC-C200924
		杂交瘤细胞株S-163-6	CCTCC-C200925

具体实施方式

本发明人经长期而深入的研究，构建了特异性表达CK19蛋白的原核表达系统，并利用该表达系统所产生的CK19蛋白作为抗原免疫动物制备了对CK19具有高亲和力的单克隆抗体。在此基础上，发明人完成了本发明。

具体而言，本领域中已知原核表达系统存在目的蛋白纯化困难、以及原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低的缺陷。因此，本领域在CK19抗体制备时，采用的是真核表达系统，例如MCF-7细胞系。然而，采用真核表达系统制备工艺繁琐，筛选出特异性抗体的难度极大，成本也较高。

本发明人通过研究意外地发现，通过构建CK19原核表达系统不仅可获得易于纯化的CK19蛋白，且所述蛋白对CK19具有高亲和力，可用于制造和筛选特异性的亲和力高的抗体。并且，免疫组化结果显示，用本发明方法制备的单克隆抗体特异性针对CK19，可以用于临床胆管癌的病理学检测。

CK19原核表达系统及其表达的CK19蛋白

如本文所用，术语“原核表达系统”是指以原核细胞为表达宿主表达目的蛋白的系统，该术语与“真核表达系统”相对。代表性的原核表达系统是大肠杆菌(E.coli)表达系统大肠杆菌表达系统，大肠杆菌因其遗传学、生物化学和分子生物学方面已被充分了解而成为原核表达基因工程蛋白的首选表达系统。

由本发明CK19原核表达系统产生的CK19蛋白具有高亲和力和对CK19蛋白的高特异性，可用于制造和筛选特异性的亲和力高的抗体。与真核表达系统(如MCF-7表达系统)相比，本发明的CK19表达系统具有表达量高、易于扩大再生产、成本低廉等优点。

在本发明的方法中，优选对所获得的CK19蛋白进行纯化以提供高纯度的蛋白产品。可采用本领域中熟知的蛋白质纯化方法，这些方法包括但不限于：蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析。

在本发明中还提供了一种改进的纯化方法，所述方法基于包涵体变性纯化，在用8M尿素溶解包涵体之前先用2M尿素洗涤包涵体，再用8M尿素溶解包涵体Ni柱亲和纯化。研究结果表明，用2M尿素洗涤纯化所得的CK19蛋白的纯度高于未用2M尿素洗涤的纯化所得的蛋白。

单克隆抗体及杂交瘤细胞系

本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明由原核表达产生的CK19抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)，单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(proteinA-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

在本发明的实施方式中，提供了用本发明原核表达的CK19制备而得的三种抗CK19的单克隆抗体：杂交瘤细胞株S-66-5(保藏编号：CCTCC-C200923)、杂交瘤细胞株S-71-9(保藏编号：CCTCC-C200924)和杂交瘤细胞株S-163-6(保藏编号：CCTCC-C200925)，经鉴定它们的亚型均为IgG1，κ。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约10⁶-10⁷个杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

在获得CK19单克隆抗体后，可对其进行标记或进一步修饰，例如可采用胶胶体金标记、荧光标记、同位素标记、酶标记等进行标记，优选所述酶标记为HRP酶标(曾立波、陈连康等《关于建立度冷丁单克隆抗体的研究》第三届全国毒物分析学术交流会论文选，289-294，中国人民公安大学出版社2000年9月；朱立平、陈学清《免疫学常用实验方法》人民军医出版社2000年3月；Ed Harlow，David Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual.1999)。

检测板或检测试剂盒

可将本发明的单克隆抗体用于制备检测CK19存在或浓度的检测板或检测试剂盒。采用本发明的检测板和检测试剂盒可检测与CK19表达相关的疾病或征状，例如：胆管癌、早期癌症微转移等。

本发明的检测板或试剂盒可采用本领域常用的检测板或检测试剂盒材料，采用常规的检测板或试剂盒制备方法制成。

例如，本发明的检测板，可包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被带有有色标记或其它可观测标记(例如胶体金标记)的本发明抗CK19单克隆抗体。硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；所述的检测线为抗CK19单克隆抗体，检测线所在的区域为检测区；所述的质控线为羊抗鼠多克隆抗体，质控线所在的区域为质控区。因此，测试条上的检测物依次为：预包被的单克隆抗体、检测线和质控线。

本发明的检测板或检测试剂盒所针对的生物样品可以是获自患者的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等，优选为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液等适于检测的各种形式存在，例如在结合免疫组织化学的检测中，优选采用石蜡切片标本。优选在采集样品前，所述患者未经临床治疗。

用于本发明中的检测方法优选免疫组织化学检测法，该方法可极为简便而有效地检测并确定样品中表达的状况，非常适用于临床应用。

可根据多种检测原理和方法，按照需要在试剂盒中配备检测所需的试剂或试剂组。在本发明中，“试剂组”是指包含了检测所需的多种试剂的试剂组合。

此外，本发明的试剂盒还可根据需要包括：容器、对照物(包括阳性或阴性对照)、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。

本发明的优点

1.本发明采用原核蛋白表达系统来制备CK19抗原，具有表达量高、易于扩大再生产、成本低廉等优点；

2.用本发明原核系统表达出的CK19抗原免疫动物制备单克隆抗体，生产工艺简单，可以筛选出特异性的亲和力高的抗体，生产成本相对较低；

3.本发明的单克隆抗体可特效性地用于临床胆管癌的病理学检测。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》ew York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.CK19蛋白的原核表达

CK19蛋白的原核表达的总体技术路线可参见图1，其具体步骤如下：

(1)基因克隆

参考《分子克隆实验指南》记载的方法，从人肝癌组织中抽取RNA，然后进行反转录。

使用CK19特异性引物进行PCR扩增：

引物1(正义引物)：5’-TCCCGCGAATCGCAGCTTCT-3’

引物2(反义引物)：5’-AAAGGACAGCAGAAGCCCCAGAGC-3’。

PCR体系：50μl

2×pfu PCR Master Mix 25μl

模板(抽提的RNA) 2μl

引物1 2μl

引物2 2μl

ddH₂O 19μl

PCR步骤：

94℃ 4min

72℃ 7min

4℃ 5min

PCR产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳法进行，所用凝胶为1％琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TIANGEN公司的100bp-1500bp范围的标记物。电泳结果如图2所示，结果显示由从肝癌组织PCR扩增cDNA的TaqPCR产物中包含大小约为1.3Kb的CK19。

然后将PCR扩增产物克隆到T载体(购自Promega公司)里测序(在Invitrogen公司测序)。测序结果表明，序列正确。

(2)表达质粒ck19-pet28a的构建

将步骤(1)中获得的CK19目的片段基因连接(参考Sambrook等人《分子克隆实验指南》)到表达载体pet28a中，然后转化入DH5a中，随机挑取8个克隆进行载体引物PCR验证。

PCR验证实验的条件如下：

PCR体系：25μl

2×Taq PCR Master Mix 12.5μl

模板(菌液) 2μl

引物1 1μl

引物2 1μl

ddH₂O 8.5μl

PCR步骤：

94℃ 4min

72℃ 7min

4℃ 5min

PCR验证结果如图3所示，结果显示电泳图谱中7号泳道所对应的克隆为阳性克隆，其中扩增出大小正确的目的片段(即CK19)。

将上述的7号克隆在卡那霉素抗性(50ug/ml)的LB培养基中摇菌培养(37℃，8-12小时)，用小抽试剂盒(购自TIANGEN公司)抽取ck19-pet28a质粒，双酶切(BamH I和Sal I，购自宝生物公司)验证目的基因是否正确连在载体上。结果如图4所示，结果显示在1.3KB大小处有目的带，证明目的基因正确连在载体上。

(3)CK19蛋白诱导表达

1.用步骤2中所得的表达质粒转化BL21菌后，用IPTG快速诱导表达。目的基因所编码的蛋白约为40KD，PET-28a载体上，目的蛋白加上载体上His tag等，整个蛋白的大小是47KD左右，即重组蛋白最后的分子量约为47KD。

快速诱导的目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。具体实验过程如下：

a.挑取单克隆菌落(表达质粒转化BL21后挑取的克隆)于7ml含有相应抗生素(卡那霉素，50ug/ml)LB培养液的50ml培养管中，37℃振荡培养过夜(8-16h)；

b.37℃下，用0.1mM、0.5mM或1mM的IPTG诱导蛋白表达：取700μl过夜摇菌，加入7ml含有相应抗生素LB培养液(卡那霉素，50ug/ml)的50ml离心管中，于OD₆₀₀＝0.4～0.6时，加入相应浓度的IPTG；

c.诱导前，在37℃培养的菌液中取1ml未诱导的菌液作为对照，按1ml菌液×OD₆₀₀×100μl的比例加入2×上样缓冲液，例如1ml OD₆₀₀为0.4的菌需加入40μl的缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样；

d.诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD₆₀₀，10000rpm，离心1分钟，去除上清后，加入相应体积(如c中计算)的2×上样缓冲液；

e.根据蛋白质分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶；将收集的菌液在水(100℃)中煮5分钟，取10μl上样；在120V的电压下，进行浓缩胶电泳，提高电压至150V，进入分离胶(12％胶浓度)电泳，直到染料刚好走到胶底；

f.取下胶，用考马斯亮蓝染色至少30分钟，然后用脱色液脱色。

各种浓度IPTG快速诱导的电泳结果如图5所示，结果显示不同浓度IPTG诱导后，蛋白表达量无明显区别。因此，在本实验中选择低浓度IPTG诱导，将IPTG的诱导浓度设定为0.1mM。

(4)蛋白纯化

A.实验步骤

a.挑单克隆的菌落(用来诱导的克隆保藏的甘油菌)于50ml含有相应的抗生素LB培养液中，37℃振荡培养过夜；

b.取过夜培养的菌液，以1∶100的比例(v/v)加入到1000ml含有相应的抗生素(卡那霉素，50ug/ml)LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.4～0.6；

c.加入IPTG诱导剂至终浓度为0.1mM，37℃振荡培养4h左右；

d.4℃，7000rpm离心15分钟，去上清，将沉淀置于冰上，用冰上预冷的1×PBS(pH 7.0)重悬沉淀，每100ml菌液加入4ml 1×PBS。加入PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C₇H₇FO₂S，分子量为174.19，上海双向西巴斯科技有限公司)至终浓度为1mM，以抑制裂解物中的蛋白酶；

e.将重悬的沉淀置于冰上超声(JY92-II超声波破碎仪，宁波新芝公司)破碎：200W，10s超声，15s间隔，30循环，重复三次(共90循环)，每次循环之间间隔2～3分钟，注意防止泡沫产生；

f.4℃，12000rpm离心10分钟，取沉淀纯化。由于蛋白是表达在包涵体中，可采用变性亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)(纯化所用试剂盒购自GE公司)：

1.取超声后的1ml样，用缓冲液B重悬后，置于旋转混匀器上洗脱8小时。

2.离心，15000rpm，10min，沉淀用1ml的1×PBS重悬，取40ul加2×上样缓冲液用于跑SDS-PAGE看纯度，结果显示洗脱后，杂蛋白明显减少，但为了提高纯度，仍然用变性亲和层析柱(Ni-NTA琼脂糖)接着纯化其余的目的蛋白。

3.要纯化的样品用缓冲液B洗脱8h后，离心，15000rpm，10min，4℃。

4.沉淀用8mol/L尿素重悬，8mol/L尿素洗后，则包涵体溶解，目的蛋白溶于其中。

5.离心，15000rpm，10min，4℃。取上清，0.2um滤膜中过滤。

6.亲和层析柱的处理：先用1×PBS洗净柱子上的乙醇，再加入珠子1ml左右(取珠子前涡旋混合)，用1×PBS洗珠子两次后，用8mol/L尿素再洗一次珠子。

7.加刚才过滤后的样品过柱。

8.样品过柱后，加珠子等体积的洗脱缓冲液与珠子混30分钟以上，过柱，留洗脱液，反复两次

9.上10ul样，跑SDS-PAGE，染色，脱色看纯化后纯度。

(裂解缓冲液可以使包含体裂解释放出蛋白质，并使蛋白质结合到Ni珠上，洗涤缓冲液可以将杂蛋白洗脱下来，洗脱缓冲液可以将目的蛋白从珠子上洗脱下来)

g.用电泳和蛋白质印迹法(一抗为抗his单抗，购自TIANGENG公司)按常规方法检测实验各步骤中的样品中的蛋白质。

B.实验结果与分析

图6所示为实验过程中各步骤取样的电泳结果，其中第一泳道为分子量标记(14KD-94KD)，第二泳道为未经IPTG诱导时的样品，第三泳道为经IPTG诱导4小时的样品，第四泳道为经超声破碎后的上清液样品，第五泳道为经超声破碎后的沉淀样品，第六泳道为经Ni-NTA变性亲和层析柱纯化的蛋白样品。

图7所示为实验过程中各步骤取样的蛋白质印迹检测结果，其中第一道为未经IPTG诱导时的样品，第二道为经IPTG诱导4小时的样品，第三道为经超声破碎后的上清液样品，第四泳道为经超声破碎后的沉淀样品，第五泳道为经Ni-NTA变性亲和层析柱纯化的蛋白样品。

结果显示，IPTG诱导后产生了所需分子量的目标产物CK19蛋白，该蛋白存在于超声破碎样品的沉淀中，经Ni-NTA变性亲和层析柱纯化处理后已基本去除杂质，获得纯CK19蛋白。

通过上述纯化获得15mg纯CK19蛋白，用于进一步的抗体制备。

实施例2.单克隆抗体的制备

实验步骤：

(1)动物免疫：用实施例1中所获得的纯化的重组CK19抗原免疫BALB/C小鼠(8-12周，雌雄不限，实验动物中心，5只)。免疫三次，每次间隔一个月左右。方法具体如下：

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8-12周，雌雄不限。抗原为上述CK19蛋白。抗原原液浓度：1mg/ml，Balb/c小鼠免疫剂量：100ugCK19每只每次。注射方式为肌肉多点注射。使用时用PBS或生理盐水稀释。免疫程序；0，3，6周三次免疫。融合前三天取100ug加PBS稀释到0.5ml腹腔注射，做回忆刺激。末次免疫三天后，分离脾细胞用于融合。

(2)杂交瘤的制备和筛选：取免疫三次后的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG进行融合，经间接ELISA方法筛选和克隆后，得到杂交瘤细胞株；

a.骨髓瘤细胞株的培养

采用SP2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，且其本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10-15h。融合细胞选择在对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性大于95％)。骨髓瘤细胞株再融合前先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基为2×10⁵/ml，次日一般为对数生长期细胞。

b.饲养细胞的培养

在体外培养条件下，细胞的生长以来适当的细胞密度。因而，在培养融合细胞活细胞克隆化培养时，还需加其它饲养细胞(feeder cell)。所用饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冰冻培养液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中有巨噬细胞和其它细胞。

饲养细胞调至1×10⁵/ml，提前一天置板孔中培养。

c.细胞融合

回忆刺激后三天融合。

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可以从1∶2到1∶10不等，我们用1∶4的比例，保证了两种细胞在融合前都具有较高的活性。

d.有限稀释法

筛选阳性株选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能持续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔)，按Poission法计算，应用的36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0％-20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体分泌量，所用筛选用免疫所用抗原。首先把抗体的分泌量按照OD₄₅₀＞1划分为阳性和阴性孔，对阳性克隆进行克隆化；连续三次克隆化均为100％阳性的克隆，再选做扩大培养或冻存。

(3)腹水的制备：每只小鼠腹腔注射0.5ml pristine，7-10天后腹腔注射10⁶个杂交瘤细胞/只小鼠，再过7-10天后取腹水。方法具体如下：

取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

(4)抗体纯化：将步骤(3)中所得的腹水先用硫酸铵盐析法(《分子克隆实验指南》)初步纯化后，再用G蛋白免疫亲和层析进一步纯化。

a.过滤

取3ml腹水4000转/秒离心，0.2um滤嘴过滤。

b.交换缓冲液

根据凝胶过滤的原理，大分子量蛋白先洗脱出来，小分子量离子滞后洗脱出来的原理。旨在将蛋白与原来的离子环境分开。方法具体如下：

(a)用5-10倍柱体积0.02M磷酸盐缓冲液洗涤脱盐柱，将脱盐柱内部保护液彻底洗干净。洗涤速度5ml/min。

(b)将过滤好的样品用注射器注入脱盐柱，3ml/min。

(c)用注射器将0.02M磷酸盐缓冲液注入脱盐柱，洗出液每1.5ml离心管收集1ml。直到洗出液OD₂₈₀＜0.08。将所得洗脱液中OD₂₈₀值＞0.2的样品收集起来并且混合。缓冲液交换完毕。

c.抗体纯化

(a)准备20个1.5ml离心管，每个离心管中加入100ul 1MTris-HCl(pH＝8.0)溶液。用来盛装后来的洗脱液。

(b)用5-10倍柱体积0.02M磷酸盐缓冲液洗涤G蛋白抗体回收柱，将柱内部保护液彻底洗干净。洗涤速度5ml/min。

(c)将缓冲液交换完毕的样品用注射器注入G蛋白抗体回收柱，1ml/min。收集流出液。

(d)重复第二步操作两次。

(e)用注射器将0.02M磷酸盐缓冲液注入脱盐柱，直到洗出液OD₂₈₀＜0.08。

(f)用0.1M甘氨酸-HCl，pH＝2.7洗脱该柱，1ml/min。洗出液用准备好的1.5ml离心管每个盛装1ml。直到洗出液OD₂₈₀＜0.08。将所得洗脱液中OD₂₈₀值＞0.2的样品收集起来并且混合。用pH试纸检测收集液的pH值，用1MTris-HCl(PH＝8.0)溶液调整到7.0左右。测完浓度后分装。

实验结果：

通过上述步骤，获得了三株特异性分泌抗CK19抗体的杂交瘤细胞株：S-66-5、S-71-9和S-163-6(即CCTCC-C200923、CCTCC-C200924和CCTCC-C200925)，经鉴别其亚型均为IgG1，κ。

实施例3.单克隆抗体的功能检测

A.采用蛋白质印迹法，以实施例2中所得三株单克隆抗体检测原核表达CK19蛋白。

实验结果如图8所示，结果显示所得的三株单克隆抗体可以很好的识别免疫原。

B.利用实施例2中所得的三株单克隆抗体对胆管癌组织样品进行免疫组化检测

胆管癌组织样品获自东方肝胆医院病理科。根据常规方法进行免疫组化实验的方法。

结果如图9所示，结果显示这三株单克隆抗体都能特异性识别胆管癌上皮的CK19抗原(深灰色部分代表阳性染色)。

该结果表明，通过本发明获得的单克隆抗体可用于临床胆管癌的病理学检测，也可用于特异性表达CK19的其它病症的检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>CK19单克隆抗体、其制备方法及用途

<130>092114

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1513

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(136)..(1338)

<400>1

cgcccctgac accattcctc ccttcccccc tccaccggcc gcgggcataa aaggcgccag 60

gtgagggcct cgccgctcct cccgcgaatc gcagcttctg agaccagggt tgctccgtcc 120

gtgctccgcc tcgcc atg act tcc tac agc tat cgc cag tcg tcg gcc acg 171

Met Thr Ser Tyr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Thr

1 5 10

tcg tcc ttc gga ggc ctg ggc ggc ggc tcc gtg cgt ttt ggg ccg ggg 219

Ser Ser Phe Gly Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Arg Phe Gly Pro Gly

15 20 25

gtc gcc ttt cgc gcg ccc agc att cac ggg ggc tcc ggc ggc cgc ggc 267

Val Ala Phe Arg Ala Pro Ser Ile His Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly

30 35 40

gta tcc gtg tcc tcc gcc cgc ttt gtg tcc tcg tcc tcc tcg ggg gcc 315

Val Ser Val Ser Ser Ala Arg Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala

45 50 55 60

tac ggc ggc ggc tac ggc ggc gtc ctg acc gcg tcc gac ggg ctg ctg 363

Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Val Leu Thr Ala Ser Asp Gly Leu Leu

65 70 75

gcg ggc aac gag aag cta acc atg cag aac ctc aac gac cgc ctg gcc 411

Ala Gly Asn Glu Lys Leu Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala

80 85 90

tcc tac ctg gac aag gtg cgc gcc ctg gag gcg gcc aac ggc gag cta 459

Ser Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Leu Glu Ala Ala Asn Gly Glu Leu

95 100 105

gag gtg aag atc cgc gac tgg tac cag aag cag ggg cct ggg ccc tcc 507

Glu Val Lys Ile Arg Asp Trp Tyr Gln Lys Gln Gly Pro Gly Pro Ser

110 115 120

cgc gac tac agc cac tac tac acg acc atc cag gac ctg cgg gac aag 555

Arg Asp Tyr Ser His Tyr Tyr Thr Thr Ile Gln Asp Leu Arg Asp Lys

125 130 135 140

att ctt ggt gcc acc att gag aac tcc agg att gtc ctg cag atc gac 603

Ile Leu Gly Ala Thr Ile Glu Asn Ser Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp

145 150 155

aat gcc cgt ctg gct gca gat gac ttc cga acc aag ttt gag acg gaa 651

Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr Glu

160 165 170

cag gct ctg cgc atg agc gtg gag gcc gac atc aac ggc ctg cgc agg 699

Gln Ala Leu Arg Met Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg

175 180 185

gtg ctg gat gag ctg acc ctg gcc agg acc gac ctg gag atg cag atc 747

Val Leu Asp Glu Leu Thr Leu Ala Arg Thr Asp Leu Glu Met Gln Ile

190 195 200

gaa ggc ctg aag gaa gag ctg gcc tac ctg aag aag aac cat gag gag 795

Glu Gly Leu Lys Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu

205 210 215 220

gaa atc agt acg ctg agg ggc caa gtg gga ggc cag gtc agt gtg gag 843

Glu Ile Ser Thr Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Gln Val Ser Val Glu

225 230 235

gtg gat tcc gct ccg ggc acc gat ctc gcc aag atc ctg agt gac atg 891

Val Asp Ser Ala Pro Gly Thr Asp Leu Ala Lys Ile Leu Ser Asp Met

240 245 250

cga agc caa tat gag gtc atg gcc gag cag aac cgg aag gat gct gaa 939

Arg Ser Gln Tyr Glu Val Met Ala Glu Gln Asn Arg Lys Asp Ala Glu

255 260 265

gcc tgg ttc acc agc cgg act gaa gaa ttg aac cgg gag gtc gct ggc 987

Ala Trp Phe Thr Ser Arg Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Gly

270 275 280

cac acg gag cag ctc cag atg agc agg tcc gag gtt act gac ctg cgg 1035

His Thr Glu Gln Leu Gln Met Ser Arg Ser Glu Val Thr Asp Leu Arg

285 290 295 300

cgc acc ctt cag ggt ctt gag att gag ctg cag tca cag ctg agc atg 1083

Arg Thr Leu GLn Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met

305 310 315

aaa gct gcc ttg gaa gac aca ctg gca gaa acg gag gcg cgc ttt gga 1131

Lys Ala Ala Leu Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly

320 325 330

gcc cag ctg gcg cat atc cag gcg ctg atc agc ggt att gaa gcc cag 1179

Ala Gln Leu Ala His Ile Gln Ala Leu Ile Ser Gly Ile Glu Ala Gln

335 340 345

ctg ggc gat gtg cga gct gat agt gag cgg cag aat cag gag tac cag 1227

Leu Gly Asp Val Arg Ala Asp Ser Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln

350 355 360

cgg ctc atg gac atc aag tcg cgg ctg gag cag gag att gcc acc tac 1275

Arg Leu Met Asp Ile Lys Ser Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr

365 370 375 380

cgc agc ctg ctc gag gga cag gaa gat cac tac aac aat ttg tct gcc 1323

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Gln Glu Asp His Tyr Asn Asn Leu Ser Ala

385 390 395

tcc aag gtc ctc tga ggcagcaggc tctggggctt ctgctgtcct ttggagggtg 1378

Ser Lys Val Leu

400

tcttctgggt agagggatgg gaaggaaggg acccttaccc ccggctcttc tcctgacctg 1438

ccaataaaaa tttatggtcc aagggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1498

aaaaaaaaaa aaaaa 1513

<210>2

<211>400

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Thr Ser Tyr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Thr Ser Ser Phe Gly

1 5 10 15

Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Arg Phe Gly Pro Gly Val Ala Phe Arg

20 25 30

Ala Pro Ser Ile His Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Ser

35 40 45

Ser Ala Arg Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Tyr Gly Gly Gly

50 55 60

Tyr Gly Gly Val Leu Thr Ala Ser Asp Gly Leu Leu Ala Gly Asn Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp

85 90 95

Lys Val Arg Ala Leu Glu Ala Ala Asn Gly Glu Leu Glu Val Lys Ile

100 105 110

Arg Asp Trp Tyr Gln Lys Gln Gly Pro Gly Pro Ser Arg Asp Tyr Ser

115 120 125

His Tyr Tyr Thr Thr Ile Gln Asp Leu Arg Asp Lys Ile Leu Gly Ala

130 135 140

Thr Ile Glu Asn Ser Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu

145 150 155 160

Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr Glu Gln Ala Leu Arg

165 170 175

Met Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Val Leu Asp Glu

180 185 190

Leu Thr Leu Ala Arg Thr Asp Leu Glu Met Gln Ile Glu Gly Leu Lys

195 200 205

Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Ile Ser Thr

210 215 220

Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Gln Val Ser Val Glu Val Asp Ser Ala

225 230 235 240

Pro Gly Thr Asp Leu Ala Lys Ile Leu Ser Asp Met Arg Ser Gln Tyr

245 250 255

Glu Val Met Ala Glu Gln Asn Arg Lys Asp Ala Glu Ala Trp Phe Thr

260 265 270

Ser Arg Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Gly His Thr Glu Gln

275 280 285

Leu Gln Met Ser Arg Ser Glu Val Thr Asp Leu Arg Arg Thr Leu Gln

290 295 300

Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met Lys Ala Ala Leu

305 310 315 320

Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gln Leu Ala

325 330 335

His Ile Gln Ala Leu Ile Ser Gly Ile Glu Ala Gln Leu Gly Asp Val

340 345 350

Arg Ala Asp Ser Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln Arg Leu Met Asp

355 360 365

Ile Lys Ser Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Ser Leu Leu

370 375 380

Glu Gly Gln Glu Asp His Tyr Asn Asn Leu Ser Ala Ser Lys Val Leu

385 390 395 400

Claims

1.一种CK19特异性单克隆抗体，所述的抗体的亚型为IgG1，κ。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925。

3.一种产生CK19特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自：CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925。

4.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)构建特异性表达CK19蛋白的原核表达系统；

(b)由所述原核表达系统产生CK19蛋白；

(c)用步骤(b)中所产生的CK19蛋白免疫动物；

(e)从步骤(d)的杂交瘤细胞中制得权利要求1所述的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核表达系统是大肠杆菌表达系统。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(d)之前，对CK19蛋白进行纯化的步骤。

7.一种制备CK19特异性单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：

(2)分离步骤(1)中获得的单克隆抗体。

8.一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有权利要求1所述的单克隆抗体，以及选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

9.一种检测条或检测试剂盒，其含有权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求5所述的免疫偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。

10.权利要求1所述单克隆抗体或权利要求5所述的免疫偶联物在制备用于检测样品中CK19存在的检测条或检测试剂盒中的用途。