CN110988357A - 用于早期肝纤维化诊断的标志物、试剂盒及用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种肝纤维化早期诊断标志物、试剂盒及用途，其中肝纤维化早期诊断标志物包括细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21‑1中的至少一种，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体样本中与对照样本中差异表达。本申请肝纤维化早期诊断标志物能够实现早期肝纤维化的诊断。

Description

用于早期肝纤维化诊断的标志物、试剂盒及用途

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，具体而言，本申请涉及一种用于早期肝纤维化诊断的标志物、试剂盒及用途。

背景技术

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展共有的病理改变和必经之路。纤维化发生是预测慢性肝脏损伤和疾病进展的重要因素，检测肝纤维化的早期发生非常重要。

肝纤维化的临床诊断方法包括两大类。一类是有创检查，即肝穿刺活组织检查；另一类是无创检查，包括血清分子标志物和影像学检查。

肝穿刺活组织检查是目前临床上检测肝纤维化分期诊断的金标准，但是肝穿刺活组织检查是一种有创检查，而且肝纤维化在肝脏组织中分布不均匀，一次肝穿刺取的活组织数量有限，特别是在早期肝脏损伤而发生肝纤维化时，活检组织病理结果对肝纤维化程度的判断仍有一定的误差，且难以反复取材动态观察。

影像学检查对肝纤维化的诊断也有一定帮助，但由于早期肝纤维化的形态学变化不明显，因此对早期纤维化的诊断仍然困难。

现有技术中，尽管血清分子标志物与肝脏炎症活动、肝脏代谢等状态有关，但不能准确反映肝纤维化程度，特别是在早期肝纤维化检测方面的能力不足。

发明内容

本申请的目的旨在提供一种用于早期肝纤维化诊断的标志物、试剂盒及用途。

为了实现上述目的，本申请提供以下技术方案：

一种肝纤维化早期诊断标志物，包括细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体样本中与对照样本中差异表达。

优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中，细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体肝脏组织样本中与对照肝脏组织样本中差异表达。

优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中，细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体肝脏组织样本中与对照肝脏组织样本中表达上调。

优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体血清样本中与对照血清样本中差异表达。

优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体血清样本中与对照血清样本中的表达上调。

优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中，所述细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体血清样本中的蛋白浓度上调。

优选地，所述蛋白浓度通过酶联免疫吸附试验测得。

本申请还提供一种肝纤维化早期诊断标志物用于制备早期肝纤维化诊断和/或疗效监控检测试剂盒的用途。

本申请还提供一种肝纤维化早期诊断测试试剂盒，其包含上述的肝纤维化早期诊断标志物的定量检测试剂。

相比现有技术，本申请的方案具有以下优点：

1.本申请将在早期肝纤维化组织内异常表达明显的细胞角蛋白19确定为研究对象，找出了与早期肝纤维化密切相关的细胞角蛋白19及其片段CYFRA21-1，并通过选择细胞角蛋白19及其片段CYFRA21-1中的至少一种，实现早期肝纤维化诊断。

2.本申请将细胞角蛋白19及其片段CYFRA21-1与其他肝纤维化相关的临床诊断标志物对比后发现，细胞角蛋白19及其片段CYFRA21-1都能稳定与肝纤维化相关。进一步地，血清中细胞角蛋白19及其片段CYFRA21-1在肝纤维化发生的早期阶段的被检出率明显高于其他已知的标志物(细胞角蛋白18-M65、细胞角蛋白18-M30、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶)。本申请的早期肝纤维化诊断标志物采用细胞角蛋白19及其片段CYFRA21-1，区别于其他肝纤维化相关的临床标志物，能够更好地预测肝组织胆管反应和纤维化的发生，能够更好地检测早期肝纤维化。

3.本申请还通过研究肝纤维化早期诊断标志物在受试体血清样本与对照血清样本的表达差异，确定了本申请肝纤维化早期诊断标志物作为早期肝纤维化无创诊断的潜在可能。

本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是DDC模型小鼠肝组织的胆管反应程度情况图；

图2是K19+和SOX9+细胞的分布面积的定量分析图；

图3是DDC模型小鼠肝组织的纤维化情况图；

图4是DDC、TAA、MCD模型血清中K19及其片段CYFRA21-1的表达情况统计图；

图5是DDC模型血清中K18-M65、K18-M30、ALT和AST的表达情况统计图；

图6是TAA模型血清中K18-M65、K18-M30、ALT和AST的表达情况统计图；

图7是MCD模型血清中K18-M65、K18-M30、ALT和AST的表达情况统计图；

图8是DDC、TAA和MCD模型中胆管反应和纤维化在组织水平上的相关系数大小热力图。

图9是DDC、TAA和MCD模型中血清K19、CYFRA21-1、K18-M65、K18-M30、ALT、AST与组织中DR和纤维化相关系数大小的热力图。

具体实施方式

下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能解释为对本申请的限制。此外，如果已知技术的详细描述对于示出本申请的特征是不必要的，则将其省略。

一种肝纤维化早期诊断标志物，包括细胞角蛋白19(K19)和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体样本中与对照样本中差异表达。

在本申请的一个实施例中，所述肝纤维化早期诊断标志物中，细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体肝脏组织样本中与对照肝脏组织样本中差异表达。优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中，细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体肝脏组织样本中与对照肝脏组织样本中表达上调。

在本申请的另一个实施例中，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体血清样本中与对照血清样本中差异表达。优选地，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体血清样本中与对照血清样本中的表达上调。

具体地，所述肝纤维化早期诊断标志物中，所述细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体血清样本中的蛋白浓度上调。所述蛋白浓度通过酶联免疫吸附试验测得。

本申请将在早期肝纤维化组织内异常表达明显的K19确定为研究对象，找出了与早期肝纤维化密切相关的K19及其片段CYFRA21-1，并通过选择K19及其片段CYFRA21-1中的至少一种，实现早期肝纤维化诊断。进一步地，本申请还通过研究肝纤维化早期诊断标志物在受试体血清样本与对照血清样本的表达差异，确定了本申请肝纤维化早期诊断标志物作为早期肝纤维化无创诊断的潜在可能。

下面通过动物模型对本申请肝纤维化早期诊断标志物进行验证：

通过喂养7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠构建慢性肝纤维化模型，具体地，通过喂食含有0.1％1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,DDC)的饲料，构建DDC模型；通过喂食含300mg/L硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)的灭菌水，构建TAA模型。通过喂食蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-and-choline deficient,MCD)饲料，构建MCD模型。每个模型每个时间点实验小鼠数量为4-5只，对照组小鼠喂食普通饲料和灭菌水。分别于喂养的1w，2w，4w，6w，8w，12w或16w留取DDC组、TAA组、MCD组和对照组的肝组织和血清样本。

胆管反应(ductular reaction，DR)是肝胆细胞损伤的修复反应，包括小叶间胆管增生、基质变化和炎症细胞浸润。K19是胆管反应的相关指标，下面通过组织学观察K19和胆管反应分子SOX9与早期肝纤维化发生的形态学和程度的相关性，实验结果请参见图1至图4：

图1示出了采用含0.1％(w/w)DDC饲料喂养小鼠，于1w，2w，4w，8w留取肝组织进行观察得到的实验结果。由图A和图B知，肝组织汇管区出现了DR的K19+、SOX9+阳性细胞，也就是说，DDC模型肝组织中出现了显著的胆管反应。

图2示出了K19+、SOX9+细胞的分布面积的定量分析图。图2显示的柱状图中，每组数据(1w、2w、3w、4w、8w)由左到右分别表示：K19+的对照组(Con-K19+)、K19+组、SOX9+组与SOX9+的对照组(Con-SOX9+)。由图知，与对照组相比，K19+、SOX9+细胞的分布面积随着肝纤维化持续而显著增加，这说明随肝纤维化持续，胆管反应更加明显。

图3示出了DDC模型肝组织中的纤维化情况，由左至右分别是对照组(control)第1w的情况，以及DDC实验组第1w至第8w的情况。其中，由A图知，HE染色(苏木精-伊红染色)显示DDC喂养小鼠肝组织的炎症和胆管增殖的程度随时间增加而增加。由B图知，天狼星红阳性染色显示肝组织中胶原纤维的沉积，汇管区-汇管区纤维桥接的形成。C图显示了α-SMA+阳性细胞的分布。由图3知，DDC模型肝组织中出现了显著的纤维化。

根据图1至图3的免疫组化染色和天狼猩红染色定量化分析可知：三种模型肝组织中均出现了不同程度的胆管反应和纤维化，并且胆管反应和纤维化随着模型肝纤维化持续时间的延长其表达强度和分布范围逐渐增加。其中，DDC组的胆管反应和纤维化出现时间最早，1w时K19+、SOX9+面积分别是对照组的4.41倍、8.06倍。在8w是25.24倍、29.09倍(P﹤0.05)。说明K19+的表达量和胆管反应的程度呈正相关。

下面通过具体实施例对本申请肝纤维化早期诊断标志物进行验证：

表1本申请肝纤维化早期诊断标志物对早期肝纤维化的诊断结果

*表中w表示时间单位周。

**表中，ALT表示丙氨酸转移酶，AST表示天冬氨酸转移酶，K18表示细胞角蛋白18，K18-M65表示细胞角蛋白18的裂解片段M65，K18-M30表示细胞角蛋白18的裂解片段M30。

表1的数据统计表明，随肝纤维化的持续，本申请肝纤维化早期诊断标志物在血清中1w-8w的表达均上调(部分标志物的具体表达情况参见图4至图7)，并且均发生了纤维化。因此，通过检测本申请肝纤维化早期诊断标志物在血清中的表达，能够预测早期纤维化的发生。

进一步地，下面通过分子水平观察本申请肝纤维化早期诊断标志物中各组分与早期肝纤维化发生的相关性，并对K19及其片段CYFRA21-1的表达情况进行统计，K18-M65、K18-M30、ALT和AST作为对照标志物一并进行统计，实验结果请参见图4至图5：

其中，分别采用相应的K19定量检测试剂盒、CYFRA21-1定量检测试剂盒、K18-M65定量检测试剂盒、K18-M30定量检测试剂盒对K19及其片段CYFRA21-1、K18-M65、K18-M30进行蛋白浓度检测。ALT和AST的含量采用自动生化分析仪检测。

下面以K19的浓度检测为例，对本申请肝纤维化早期诊断标志物的指标水平检测进行说明：

1)采血：用水合氯醛0.2ml/10g腹腔内注射麻醉小鼠，腹部正中切大十字口，在下腔静脉采血。

2)处理血样：将血样在37℃恒温下静置1h，1000r/min离心10分钟，取上清待测。

3)工作液的准备：

标准液的配制：采用鼠K19定量检测试剂盒，取出一支标准品，于10000rpm离心30秒。用1ml样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混匀得到标准品S7，放置备用。取7支1.5ml离心管按S0-S6的顺序依次排列标记，在7支离心管各加入250μl样本稀释液。吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀。从S6中吸取250μl到第二个离心管中(S5)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为样本稀释液。

洗涤工作液的配制：按1:25倍用去离子水对浓洗涤液进行稀释。

生物素标记抗体工作液：按1:100倍用生物素标记抗体稀释液对生物素标记抗体液进行稀释。

辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：按1:100倍用辣根过氧化酶标记亲和素稀释液对辣根过氧化物酶标记亲和素进行稀释。

4)K19浓度的检测：

将实验用到的试剂移至室温平衡至少30分钟，配制标准液、洗涤工作液、生物素标记抗体工作液和辣根过氧化物酶标记亲和素工作液备用。

分别设置标准品孔、待测样品孔。每孔分别加入标准品或待测样品50μl，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育45分钟。

弃去孔内液体，甩干，洗板4次，每次浸泡30秒，200μl/孔，甩干。

每孔加入生物素标记抗体工作液50μl，覆上新的板贴，37℃温育30分钟。

弃去孔内液体，甩干，洗板4次，每次浸泡30秒，200μl/孔，甩干。

每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液50μl，覆上新的板贴，37℃温育15分钟。

弃去孔内液体，甩干，洗板4次，每次浸泡30秒，200μl/孔，甩干。

依序每孔加入TMB显色(TMB，中文名称3,3',5,5'-四甲基联苯胺)A液和B液混合液100μl，37℃避光显色15～30分钟。

依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。

在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长测定各孔的光密度(OD值)。

5)数据分析：

将标准品及样本值减去S0孔数值后，利用Curve Expert软件绘制曲线：以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)，在对数坐标纸上绘出标准曲线。利用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样本的OD值代入方程式，计算出样本浓度。计算得到的样本浓度乘以相应的稀释倍数即为血清样本中K19的实际浓度。

除采用试剂盒检测的方法外，还可以用常规血清免疫学方法或者质谱等物质成分检测方法对本申请肝纤维化早期诊断标志物进行表达水平的检测。

图4显示了DDC、TAA、MCD模型血清中K19及其片段CYFRA21-1的表达。该表达结果通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测得。由图A至图F知，与对照组(Control)相比，DDC、TAA、MCD血清中K19及其片段CYFRA21-1的水平主要呈现上升的趋势。

图5至图7分别显示了DDC、TAA、MCD模型血清中K18-M65、K18-M30、ALT和AST的表达。该表达结果通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测得。由图A至图L知，与对照组(Control)相比，DDC、TAA、MCD血清中K18-M65、K18-M30、ALT和AST的水平主要呈现上升的趋势。

图4至图7的ELISA结果显示：三种模型中血清K19、CYFRA21-1、K18-M65、K18-M30、ALT和AST的表达均随着纤维化持续主要呈不断上升的趋势。

由表1、图4至图7的实验结果可知，通过检测本申请肝纤维化早期诊断标志物在血清中的表达能够诊断早期肝纤维化。

下面通过组织中胆管反应相关分子与纤维化相关分子的相关系数大小热力图，分析DDC模型(DDC model)、TAA模型(TAA model)和MCD模型(MCD model)中胆管反应和纤维化在组织水平上的相关性。图8中，图A，图C和图E显示了组织天狼猩红+区域面积、α-SMA+区域面积、纤维化分级分别与组织K19+、SOX9+区域面积的相关系数大小热力图。图B，图D和图F显示了组织中胆管反应相关分子K19、SOX9、K7、HNF1βmRNA与组织中纤维化相关分子α-SMA、TGFβ1mRNA的相关系数大小热力图。图9中，三个模型中血清K19分子及其片段CYFRA21-1与组织中K19+、SOX9+阳性区域面积均具有显著的正相关关系(r﹥0.4，P<0.05for all)；同样，在三个模型中血清K19、CYFRA21-1与组织中DR相关分子K19、SOX9、K7、HNF1βmRNA(r﹥0.4，P<0.05for all)均具有显著的正相关关系。近似地，三个模型中血清K19分子及其片段CYFRA21-1与α-SMA+、天狼猩红+、纤维化评分标识的组织纤维化显著正相关(r﹥0.4，P<0.05for all)，同时也与组织中纤维化相关分子α-SMA、TGFβ1mRNA(r﹥0.4，P<0.05for all)均呈显著正相关。不同于血清K19分子及其片段CYFRA21-1，血清K18-M65分子及其片段K18-M30与组织中DR和纤维化的相关性在三种模型中不一致甚至不相关。血清中ALT和AST的结果与血清K18-M65分子及其片段K18-M30相似。由图8和图9知，DDC、TAA和MCD模型中DR和纤维化在组织水平上显著相关，也就是说，通过检测胆管反应相关分子的发生，一定程度上能够预测早期纤维化的发生。以上结果证明DDC、TAA和MCD处理小鼠血清中K19及其片段CYFRA21-1的指标水平优于K18-M65、K18-M30、ALT、AST，能够更好地预测肝组织DR和纤维化的发生，提示血清中K19及其片段CYFRA21-1有望成为预测肝脏疾病中DR发生发展无创评估的有效指标。

总的来说，本申请通过采用与组织中DR和纤维化的相关性较大的K19及其片段CYFRA21-1对早期纤维化进行诊断，有利于从不同角度对早期肝纤维化进行诊断，从而提高早期肝纤维化诊断的准确性。综上，通过检测本申请肝纤维化早期诊断标志物在血清中的表达，能够有效预测早期肝纤维化。

本申请还提供一种肝纤维化早期诊断标志物用于制备早期肝纤维化诊断和/或疗效监控检测试剂盒的用途。

本申请还提供一种肝纤维化早期诊断测试试剂盒，其包含上述的肝纤维化早期诊断标志物的定量检测试剂。

通过本申请肝纤维化早期诊断标志物在血清中的表达，能够有效预测早期肝纤维化，因此，将本申请肝纤维化早期诊断标志物用于制备早期肝纤维化诊断，和/或疗效监控检测试剂盒，临床上能够实现早期肝纤维化高效的无创检测，具有广泛的实用性。

以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (9)

1.一种肝纤维化早期诊断标志物，包括细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体样本中与对照样本中差异表达。

2.根据权利要求1所述的肝纤维化早期诊断标志物，其特征在于，所述肝纤维化早期诊断标志物中，细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体肝脏组织样本中与对照肝脏组织样本中差异表达。

3.根据权利要求2所述的肝纤维化早期诊断标志物，其特征在于，所述肝纤维化早期诊断标志物中，细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体肝脏组织样本中与对照肝脏组织样本中表达上调。

4.根据权利要求1所述的肝纤维化早期诊断标志物，其特征在于，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体血清样本中与对照血清样本中差异表达。

5.根据权利要求4所述的肝纤维化早期诊断标志物，其特征在于，所述肝纤维化早期诊断标志物中至少一种在受试体血清样本中与对照血清样本中的表达上调。

6.根据权利要求5所述的肝纤维化早期诊断标志物，其特征在于，所述肝纤维化早期诊断标志物中，所述细胞角蛋白19和细胞角蛋白19的片段抗原CYFRA21-1中的至少一种在受试体血清样本中的蛋白浓度上调。

7.根据权利要求6所述的肝纤维化早期诊断标志物，其特征在于，所述蛋白浓度通过酶联免疫吸附试验测得。

8.如权利要求1-7任一项所述的肝纤维化早期诊断标志物用于制备早期肝纤维化诊断和/或疗效监控检测试剂盒的用途。

9.一种肝纤维化早期诊断测试试剂盒，其包含如权利要求1-7任一项所述的肝纤维化早期诊断标志物的定量检测试剂。

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