WO2023008427A1 - 慢性肝疾患における肝発癌の診断マーカー - Google Patents

慢性肝疾患における肝発癌の診断マーカー Download PDF

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WO2023008427A1
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隼人 疋田
悠太 明神
徹郎 竹原
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Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the risk of developing a disease using a diagnostic marker for the disease, and specifically to a method for evaluating the risk of developing hepatocarcinogenesis in chronic liver disease.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Various chronic liver diseases such as chronic hepatitis B and C, and non-alcoholic steatohepatitis cause liver cancer.
  • Chronic liver disease is classified into viral chronic liver disease and non-viral chronic liver disease.
  • Viral chronic liver disease is mainly classified into hepatitis C caused by the hepatitis C virus and hepatitis B caused by the hepatitis B virus.
  • Non-viral chronic liver disease is classified into fatty liver disease and autoimmune liver disease.
  • Hepatitis C With the advent of direct-acting antivirals (hereinafter referred to as "DAAs"), new therapeutic agents for hepatitis C, the hepatitis C virus (HCV) has been eliminated in many cases. became. After elimination of the hepatitis C virus, there is a risk of hepatic carcinogenesis, precisely, liver cancer even after achieving sustained virological response (hereinafter referred to as "SVR”) (Non-Patent Document 5). In many cases of hepatitis C, regular imaging and blood tests are performed after treatment has ended.
  • DAAs direct-acting antivirals
  • Hepatitis B HBs antigen-positive patients are estimated to be about 296 million people worldwide as of 2019, and about 820,000 people die annually from cirrhosis and liver cancer caused by hepatitis B virus (HBV).
  • HBV hepatitis B virus
  • NUC nucleic acid analogues
  • cases of carcinogenesis are observed even in cases of low HBV DNA levels.
  • the incidence of liver cancer after HBs antigen disappearance is 0.0368/year.
  • the incidence of liver cancer in HBs antigen persistently positive cases is 0.1957/year, and the incidence of liver cancer is significantly high (Non-Patent Document 10).
  • Factors that increase the risk of carcinogenesis include age (40 years or older), gender (male), high viral load, alcohol drinkers, family history of liver cancer, co-infection with HCV, HDV and/or HIV, progression of liver fibrosis, and liver fibrosis. reduction in platelet count, genotype C, core promoter mutation, etc., which reflect the progression of dysplasia (Non-Patent Document 11).
  • Non-Patent Document 11 Non-Patent Document 11
  • Fatty liver disease refers to a disease in which fat accumulates in 5% or more of hepatocytes.
  • Fatty liver disease is further classified into nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and secondary fatty liver.
  • NAFLD nonalcoholic fatty liver disease
  • non-alcoholic means that the drinking amount is converted to ethanol and is less than 30 g/day for men and less than 20 g/day for women.
  • NAFLD is further classified into nonalcoholic fatty liver (NAFL) histologically without hepatocellular damage and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) histologically with hepatocellular damage and inflammation.
  • NAFL nonalcoholic fatty liver
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • Secondary fatty liver is alcoholic, drug-induced (amiodarone, methotrexate, tamoxifen, steroids, valproic acid, antiretroviral drugs, etc.), disease-related (hepatitis C (genotype 3), Wilson's disease, lipodystrophy, starvation). , parenteral nutrition, Reye syndrome, acute fatty liver of pregnancy, HELLP syndrome), congenital metabolic disorders (a ⁇ -lipoproteinemia, hemochromatosis, ⁇ 1-antitrypsin deficiency, lecithin-cholesterol acyltransferase deficiency, lysosome production) lipase deficiency, etc.) and others (after pancreaticoduodenectomy).
  • Non-Patent Documents 12 and 13 As a result of comparative examination of prognosis, it has been reported that whether or not fibrosis progresses is more important for prognosis than whether it is NAFL or NASH (Non-Patent Document 14). From another prognostic comparison study, there is also a report that patients with advanced hepatic fibrosis have a poor prognosis (Non-Patent Document 15). From the results of studies on the etiology of primary liver cancer in Japan from 1995 to 2015, it has been clarified that hepatocarcinogenesis is increasing against the background of non-viral liver disease (Non-Patent Document 16).
  • FIB-4 index As well as a marker for predicting the development of liver cancer from non-viral liver disease has been reported (Gastroenterology. 2018 Dec;155(6):1828-1837.e2), but its diagnostic ability is not sufficient. , further stratification techniques are needed.
  • Non-Patent Document 17 Oxidative stress induces C>A/G>T gene mutation (Non-Patent Document 17), and this mutation pattern is observed at a higher rate in liver cancer than in other cancers (Non-Patent Document 18).
  • Growth Differentiation Factor 15 belongs to the TGF- ⁇ superfamily, and its expression increases in response to oxidative stress and mitochondrial stress (Non-Patent Documents 19-22).
  • GDF15 is elevated in advanced hepatic fibrosis cases, and high GDF15 levels are reported to be a poor prognostic factor in liver cancer cases (Non-Patent Document 23).
  • Non-Patent Document 1 Sagnelli E, et al. Infection. 2020 Feb;48(1):7-17.
  • Non-Patent Document 2 Zhang CH, et al. Liver Int. 2022 doi: 10.1111/liv.15251.
  • Non-Patent Document 3 Hikita H, et al. J Hepatol. 2012 Jul;57(1):92-100.
  • Non-Patent Document 4 Hikita H, et al. Cancer Prev Res (Phila). 2015 Aug;8(8):693-701.
  • Non-Patent Document 5 Janjua NZ et al., J Hepatol 2017;66:504-513.
  • Non-Patent Document 6 Watanabe T et al., J Med Virol 2020;92:3507-3515.
  • Non-Patent Document 7 Kanwal F, Singal AG, Gastroenterology 2019;157:54-64.
  • Non-Patent Document 8 Nagata H et al., J Hepatol 2017;67:933-939.
  • Non-Patent Document 9 Liaw YF, et al. N Engl J Med. 2004;351:1521-1531.
  • Non-Patent Document 10 Simonetti J, et al. Hepatology. 2010;51:1531-1537.
  • Non-Patent Document 11 Yim HJ, Lok AS.
  • Non-Patent Document 12 Tokushige, K, et al. Hepatology Research.2021;51:1013-1025.
  • Non-Patent Document 13 Yoshiji, H. et al. J Gastroenterol, 2021;56:593-619.
  • Non-Patent Document 14 Angulo P, et al. Gastroenterology. 2015;149:389-97.
  • Non-Patent Document 15 Hagstrom H, et al. J Hepatol. 2017;67:1265-1273.
  • Non-Patent Document 16 Tateishi R, et al. J Gastroenterol. 2019;54:367-376.
  • Non-Patent Document 17 van Loon B, et al. DNA Repair (Amst) 2010;9:604-16
  • Non-Patent Document 18 Guichard C, et al. Nat Genet 2012;44:694-8.
  • Non-Patent Document 19 Han ES, et al. Physiol Genomics. 2008;34:112-26.
  • Non-Patent Document 20 Tsai VWW et al., Cell Metab 2018;28:353-368.
  • Non-Patent Document 21 Kim J et al., Nat Metab 2021;3:410-427.
  • Non-Patent Document 22 Kang SG et al., iScience 2021;24:102181
  • Non-Patent Document 23 Myojin Y et al., Gastroenterology 2021;160:1741-1754.
  • the purpose of the present invention is to provide a novel biomarker that predicts the development of liver cancer from chronic liver disease.
  • Further objects of the present invention include hepatocarcinogenesis after SVR in hepatitis C, hepatocarcinogenesis under NUC administration in hepatitis B, and hepatocarcinogenesis from NAFLD, comprising said novel biomarkers,
  • hepatocarcinogenesis after SVR in hepatitis C hepatocarcinogenesis under NUC administration in hepatitis B
  • hepatocarcinogenesis from NAFLD comprising said novel biomarkers
  • the present inventors proceeded with studies to achieve the above object, and discovered that the level of GDF15 protein in serum or the level of GDF15 transcripts in liver tissue can predict carcinogenesis from chronic liver disease, and thus completed the present invention. Completed.
  • the present invention provides a method for evaluating a subject's risk of developing liver cancer.
  • the method of the present invention comprises: (1) measuring the subject's GDF15 level; (2) A step of associating the GDF15 level with the risk of developing liver cancer.
  • the subjects are subjects who have achieved hepatitis C virus (HCV) sustained negative conversion (SVR), subjects who are on NUC for hepatitis B, and subjects who have developed NAFLD It can be at least one type of subject selected from the group consisting of examiners.
  • HCV hepatitis C virus
  • SVR sustained negative conversion
  • NUC NUC for hepatitis B
  • NAFLD NAFLD
  • the risk of developing liver cancer in the subject when the GDF15 level of the subject is equal to or higher than a preset cutoff value, the risk of developing liver cancer in the subject is high. It serves as an index, and when it is less than the cutoff value, it can be used as an index that the risk of developing liver cancer in the subject is low.
  • the GDF15 level measured in step (1) is the level of GDF15 protein in serum or plasma and/or liver tissue or circulating blood can be the level of the GDF15 transcript of .
  • the cutoff value may be set based on statistical analysis or ROC analysis of the GDF15 level.
  • the level of GDF15 measured in step (1) may be the level of GDF15 protein in serum.
  • the cut-off value may be the median level of the GDF15 protein in the subject for each individual chronic liver disease. It may be determined from the ROC curve for chronic liver disease.
  • the cutoff value of the serum GDF15 protein level can be about 1400 pg/mL for hepatitis C patients who have achieved SVR.
  • a cut-off value for GDF15 can be about 845 pg/mL for hepatitis B patients on NUC.
  • a cutoff value for GDF15 can be about 2000 pg/mL for NAFLD patients.
  • the level of GDF15 protein in the serum can be determined by ELISA.
  • the cutoff values of AFP and FIB-4 index can be further combined for determination.
  • the AFP and FIB-4 index cut-off values are about 5 ng/mL and It may be about 3.25. For subjects who developed NAFLD, it may be about 5 ng/mL and about 2.67, respectively.
  • kits for measuring a subject's GDF15 level for use in the methods of the present invention.
  • Kits of the invention comprise anti-GDF15 antibodies and/or primer pairs or probes for specifically detecting GDF15 transcripts.
  • the present invention provides a diagnostic agent for evaluating a subject's risk of developing liver cancer by the method of the present invention.
  • the diagnostic agents of the present invention include anti-GDF15 antibodies and/or primer pairs and probes for specifically detecting GDF15 transcripts.
  • the present invention comprises the steps of: (1) measuring the GDF15 level of a subject; (2) Use of GDF15 as a biomarker for evaluating a subject's risk of developing liver cancer, comprising the step of associating the GDF15 level with the risk of developing liver cancer.
  • the subject is a subject who has achieved hepatitis C virus (HCV) persistent negative conversion (SVR), It can be at least one type of subject selected from the group consisting of subjects undergoing NUC administration for hepatitis B and subjects who have developed NAFLD.
  • HCV hepatitis C virus
  • SVR persistent negative conversion
  • the present invention provides a method for evaluating the risk of developing liver cancer in a subject according to the present invention, in order to examine the presence or absence of liver cancer in a subject who has been evaluated as having a high risk of developing liver cancer.
  • a stratified method for screening a subject for liver cancer is provided, comprising testing at a higher frequency than a subject who has not been tested.
  • the presence or absence of the development of liver cancer may be examined based on the findings of ultrasound, contrast-enhanced CT images, MRI and/or liver biopsy tissue.
  • Subjects evaluated to have a high risk of developing liver cancer may be examined for the presence or absence of the development of liver cancer based on the findings of ultrasound, contrast-enhanced CT images, and MRI.
  • Subjects evaluated to have a low risk of developing liver cancer are not tested for the presence or absence of the development of liver cancer, or the method for evaluating the risk of developing liver cancer in a subject of the present invention.
  • Tumor marker tests alone can also be done at regular intervals.
  • blood tumor markers include GDF15, AFP ( ⁇ -fetoprotein), AFP-L3 (LCA (lentil lectin) strong binding fraction), and PIVKA-II (protein induced by vitamin K absence or antagonist II).
  • GDF15 AFP ( ⁇ -fetoprotein), AFP-L3 (LCA (lentil lectin) strong binding fraction
  • PIVKA-II protein induced by vitamin K absence or antagonist II.
  • the present invention provides a method for preventing liver cancer, comprising administering a drug for preventing the development of liver cancer to a subject evaluated to have a high risk of developing liver cancer by the liver cancer screening method of the present invention.
  • the present invention provides a medicament for preventing the development of liver cancer in a subject evaluated as having a high risk of developing liver cancer by the liver cancer screening method of the present invention.
  • subjects can be limited to those with a BMI value of less than 25 kg/m 2 .
  • the present invention it is possible to highly accurately evaluate the risk of developing liver cancer based on the GDF15 level of the subject. Accordingly, it is possible to carry out a stratified liver cancer screening method for a subject, which includes examining the presence or absence of liver cancer by tests with different frequencies and/or contents depending on the risk of developing liver cancer. can.
  • Pyramid graph showing the distribution of GDF15 levels in stored serum collected at each time point of a derived cohort of hepatitis C patients who achieved SVR.
  • the vertical axis indicates serum GDF15 levels (pg/mL).
  • the graph on the left shows the distribution of GDF15 levels in serum collected before treatment (Pre Treatment), and the graph in the center shows the distribution of GDF15 levels in serum collected at the end of treatment (End of Treatment),
  • the graph on the right shows the distribution of the GDF15 level in serum collected 24 weeks after the achievement of SVR (Post 24 weeks).
  • An asterisk (*) indicates a significant difference of p ⁇ 0.0001 by Turkey Kramer test between each of the three graphs in FIG.
  • the vertical axis represents the serum GDF15 level (pg/mL), and the horizontal axis represents the relative mRNA level of GDF15 (arbitrary units, AU).
  • Pyramid graph showing the distribution of serum GDF15 levels for each fibrosis score group of hepatitis C patients who achieved SVR.
  • the vertical axis indicates the serum GDF15 level (pg/mL).
  • the horizontal axis is serum GDF15 level (pg/mL), and the vertical axis is age (A), hemoglobin (B), platelet count (C), AST (D), ALT (E), ⁇ GTP (F), eGFR. (G), representing albumin (H), prothrombin time (I), AFP (J) and ALBI score (K).
  • Table detailing derived cohort cases of hepatitis C patients who achieved SVR. Graph showing changes in liver cancer incidence over time in a derivation cohort of hepatitis C patients who achieved SVR.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer, and the horizontal axis represents the observation period (months).
  • Pyramid graph showing the distribution of GDF15 levels. The vertical axis indicates serum GDF15 levels (pg/mL). From the left, three time points, Pre Treatment, End Of Treatment, and Post 24 weeks after achieving SVR, groups with and without liver cancer development (Present) shows the distribution of GDF15 levels in the serum of An asterisk (*) indicates that there is a significant difference of p ⁇ 0.005 by Turkey Kramer test between graphs indicating the presence of liver cancer (Present) and the absence (Absent) at the time points in FIG. 6-2.
  • the vertical axis represents the serum GDF15 level (pg/mL), and the horizontal axis represents the observation period including 1 year before the onset of liver cancer (-1 year) and the end of observation at the onset of liver cancer.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer
  • the horizontal axis represents the observation period (months).
  • the arrows of "GDF15 HIGH” and “GDF15 LOW” point to graphs showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer in the high GDF15 group and the low GDF15 group, respectively.
  • (D) represents the area under the curve (AUC) of the ROC curve.
  • (E) represents the cut-off value, sensitivity and specificity calculated from the ROC curve of the GDF15, AFP and FIB-4 indices for predicting the development of liver cancer.
  • A is a graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer in the high AFP group and the low AFP group in hepatitis C patients who achieved SVR.
  • B is a graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer in the high FIB-4 index group and the low FIB-4 index group in hepatitis C patients who achieved SVR.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer
  • the horizontal axis represents the observation period (months).
  • "AFP HIGH”, “AFP LOW”, "FIB4-index HIGH” and "FIB4-index LOW” arrows indicate high AFP group, low AFP group, high FIB-4 index group and low FIB-4 index group, respectively.
  • a graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer is indicated.
  • High risk group (3 points) and intermediate risk group (1-2 points) in patients with hepatitis C who achieved SVR stratified by a scoring system where each high GDF15, AFP and FIB-4 index is 1 point ) and the low-risk group (0 points) graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer, and the horizontal axis represents the observation period (months).
  • the "High”, “Middle” and “Low” arrows indicate graphs showing the time course of cumulative liver cancer incidence in the high-risk group, middle-risk group and low-risk group, respectively. Table showing case details of the validation cohort of Hepatitis C patients who achieved SVR.
  • A is a graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer in the high GDF15 group and the low GDF15 group in hepatitis C patients who achieved SVR.
  • B is a graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer in the high AFP group and the low AFP group in hepatitis C patients who achieved SVR.
  • C is a graph showing changes over time in the cumulative incidence of liver cancer in the high FIB-4 index group and the low FIB-4 index group in hepatitis C patients who achieved SVR.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer
  • the horizontal axis represents the observation period (months).
  • "GDF15 HIGH”, “GDF15 LOW”, “AFP HIGH”, “AFP LOW”, “FIB4-index HIGH” and “FIB4-index LOW” arrows indicate high GDF15 group, low GDF15 group and high AFP group, respectively.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer, and the horizontal axis represents the observation period (weeks).
  • the "High”, “Middle” and “Low” arrows indicate graphs showing the time course of cumulative liver cancer incidence in the high-risk group, middle-risk group and low-risk group, respectively.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer, and the horizontal axis represents the observation period (weeks).
  • the "High” arrow represents a graph showing the time course of the cumulative incidence of liver cancer in a group with low AFP and FIB-4 indices but high GDF15 levels.
  • the “Low” arrow represents a graph showing the time course of the cumulative incidence of liver cancer in a group with both low AFP and FIB-4 indices and low GDF15 level.
  • the vertical axis represents the cumulative incidence of liver cancer, and the horizontal axis represents the observation period (weeks).
  • the "High” arrow represents a graph showing the change over time in the cumulative incidence of liver cancer in a group with both high AFP and FIB-4 indices and high GDF15 levels.
  • the “Low” arrow represents a graph showing the time course of the cumulative incidence of liver cancer in a group with high AFP and FIB-4 indexes but low GDF15 levels. Scatter plot of pooled sera from criteria-selected hepatitis B cases on NUC.
  • Black circles represent non-carcinogenic cases, and white circles represent carcinogenic cases.
  • the vertical axis represents the concentration (ng/mL) of GDF15 in the stored serum.
  • the vertical axis represents the carcinogenesis rate, and the horizontal axis represents the observation period (days).
  • Table of patient demographics across cohorts of hepatitis B cases on NUC grouped by median serum concentration of GDF15 (0.833 ng/mL).
  • surface which grouped the patient background of the whole hepatitis B case cohort during NUC administration by the presence or absence of carcinogenesis of liver cancer.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Table showing demographics of patients with NAFL or NASH Table showing patient demographics grouped into patients with NAFL and patients with NASH. Graph showing changes in liver cancer incidence over time across patient cohorts with NAFL or NASH. Scatter plot of serum concentration of GDF15 for each case grouped into Brunt Stage types 0-4 for liver fibrosis. Scatter plot examining the correlation between serum concentration of GDF15 and Fib-4 index in patients with NAFL or NASH. Table showing hazard ratios for various attributes, blood markers, Fib-4 index, etc. of patients with NAFL or NASH.
  • the vertical axis represents the concentration (ng/mL) of GDF15 in the stored serum. All 9 cases of developed liver cancer were primary hepatocellular carcinoma (HCC). Scatter plot of stored sera from 170 cohorts of Example 3 with extended observation period. Black circles represent non-carcinogenic cases and gray circles represent carcinogenic cases. The vertical axis represents the concentration (ng/mL) of GDF15 in the stored serum. Of the 8 cases of liver cancer that developed, 7 cases were primary hepatocellular carcinoma (HCC), and the 1 case indicated by the arrow was cholangiocellular carcinoma (CCC). Incidence rate of liver cancer in 183 cases of Ogaki Municipal Hospital. Liver cancer incidence in the cohort of Example 3 with extended observation period.
  • HCC primary hepatocellular carcinoma
  • a total of 353 cases from the Ogaki Municipal Hospital cohort and the cohort of Example 3 with an extended observation period were analyzed for the presence or absence of carcinogenesis 5 years after the stored serum points.
  • graph. A total of 353 cases from the Ogaki Municipal Hospital cohort and the cohort of Example 3 with an extended observation period were subjected to ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis over time regarding the presence or absence of carcinogenesis 7 years after the storage serum point.
  • graph. A graph showing changes over time in the incidence of liver cancer with a cutoff value of 2.00 ng/mL for a total of 353 cases in the Ogaki Municipal Hospital cohort and the cohort of Example 3 with an extended observation period.
  • GDF15 is a cytokine belonging to the transforming growth factor (TGF) beta superfamily, and is a protein consisting of 308 full-length amino acids. It is highly expressed in the placenta, but weakly expressed in normal tissues other than the placenta. Rapidly up-regulated during inflammation.
  • TGF transforming growth factor
  • the amino acid sequence of human GDF15 protein and the nucleotide sequence of GDF15 mRNA have been published as NCBI Reference Sequences: NP_004855.2 and NM_004864.4, respectively, and can be isolated by a method known per se.
  • the GDF15 level refers to the level of GDF15 protein and/or GDF15 transcript.
  • GDF15 protein and GDF15 transcript levels refer to the content of GDF15 protein and GDF15 mRNA, respectively, in a fixed amount of sample.
  • the biological species of the GDF15 protein and GDF15 transcript are the same as the biological species of the subject.
  • the levels of the GDF15 protein and the GDF15 transcript can be expressed in a manner known to those skilled in the art according to the measurement method described below, for example, it may be expressed as the concentration of the GDF15 protein and the GDF15 transcript, or the concentration of the standard sample. It may be expressed as a relative value based on the measured value.
  • the method for measuring GDF15 protein levels uses an immunological technique based on antibodies specific for the GDF15 protein.
  • Antibody arrays flow cytometric analysis, radioisotope immunoassay (RIA), ELISA (Engvall E, Methods in Enzymol. 1980;70:419-439.), Western blotting, immunohistochemical assays for measuring GDF15 protein levels.
  • Tissue staining enzyme immunoassay (EIA method), fluorescence immunoassay (FIA), immunochromatographic method, immunoturbidimetric method, immunonephelometric method and the like can be used.
  • EIA method enzyme immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • immunochromatographic method immunoturbidimetric method
  • immunonephelometric method and the like can be used.
  • ELISA is preferred because of its sensitivity and ease of implementation. Details of the ELISA are described in the Examples.
  • Methods for measuring GDF15 transcript levels include Northern blotting, RNase protection assay, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (Weis JH et al., Trends in Genetics 1992;8:263-264.). a quantitative real-time RT-PCR method (HeldCA et al., Genome Research 1996;6:986-994.) and the like can be used. However, the quantitative real-time RT-PCR method is preferred from the viewpoint of sensitivity and ease of implementation. Details of the quantitative real-time RT-PCR method are described in the Examples.
  • a subject in the present invention may be any mammal, preferably a mammal with chronic liver disease.
  • Mammals include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, laboratory animals such as rabbits, pets such as dogs and cats, livestock such as cows, pigs, goats, horses and sheep, monkeys, orangutans and Examples include primates such as chimpanzees and humans, and humans are particularly preferred.
  • Chronic liver disease herein includes, but is not limited to, viral hepatitis and fatty liver disease.
  • Viral hepatitis includes, but is not limited to, hepatitis C and hepatitis B.
  • Fatty liver disease includes, but is not limited to, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and secondary fatty liver.
  • NAFLD includes, but is not limited to, nonalcoholic fatty liver (NAFL) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH).
  • Subjects in the present invention include patients with chronic liver disease who need to be evaluated for the risk of developing liver cancer.
  • Subjects of the present invention include, but are not limited to, post-SVR subjects in hepatitis C, subjects under NUC administration in hepatitis B, subjects suffering from NASH.
  • Hepatitis C Guidance 2019 Update American Association for the Study of Liver Diseases- Infectious Diseases Society of America Recommendations for Testing, Managing, and Treating Hepatitis C Virus Infection. Hepatology 2020;71:686-721. 2020;73:1170-1218.).
  • non-alcoholic fatty liver disease NAFLD/NASH clinical practice guidelines 2020 Edited by the Society of Diseases and the Japanese Society of Hepatology, revised 2nd edition, published in November 2020, Nankodo (https://www.jsge.or.jp/guideline/guideline/pdf/nafldnash2020.pdf), English version (Tokushige 2021;51:1013-1025. and Tokushige, K. et al. Journal of Gastroenterology 2021;56: 951-963.). As defined by the house.
  • tests to determine the presence or absence of liver cancer development from chronic viral hepatitis, fatty liver disease and other liver diseases include liver cancer clinical practice guidelines (edited by the Japan Society of Hepatology, 2017 edition, supra). according to authoritative liver cancer expert definitions.
  • determining the risk of developing liver cancer includes performing evaluation and testing in light of certain criteria. Specifically, subjects who have not developed liver cancer after achieving SVR for HCV, subjects who have not developed liver cancer during treatment with NUC administration for HBV, and NAFL, NASH and other fatty liver diseases
  • a risk of developing liver cancer in the future in a subject with chronic liver disease but not developing liver cancer means to determine whether or not there is, and includes determining whether or not there is a risk of developing liver cancer, and determining the level of the risk of developing liver cancer.
  • subjects are stratified according to the degree of risk of developing liver cancer, and resources for liver cancer screening tests are allocated to subjects with a higher risk of developing liver cancer than subjects with a low risk of developing liver cancer.
  • One purpose is to provide a gradient distribution to the subject.
  • the risk of developing liver cancer is associated with the subject's GDF15 level. Specifically, whether the subject's GDF15 level is higher or lower than a preset cutoff value serves as an indicator of whether the subject's risk of developing liver cancer is high or low.
  • the cut-off value in the present invention is determined by preparing a database that traces the individual GDF15 levels and the presence or absence of liver cancer development for evaluation populations of chronic liver disease patients, and the GDF15 levels of liver cancer patients and liver cancer non-developers. is preset based on statistical analysis or ROC analysis of the data.
  • the cut-off value is determined by statistical analysis, for example, the median value, arithmetic mean or other mean value of the GDF15 level data of the evaluation group can be used.
  • the cutoff value based on ROC analysis is 1.0 on the vertical axis (sensitivity or true positivity) of the ROC curve graph, and 1.0 on the horizontal axis (1- Specificity) can be the GDF15 level of the point on the ROC curve that has the smallest distance from the point where the specificity) is 0.0, or derived from the Youden index of the ROC curve (Cancer 1950;3:32-35.) can be a cut-off value
  • the evaluation population database of chronic liver disease patients may be used for setting a cutoff value in the method of evaluating the risk of developing liver cancer in a subject of the present invention without any changes.
  • a new chronic liver disease patient including the subject of the present invention, is incorporated into the evaluation population, and the database of the evaluation population of chronic liver disease patients is updated as appropriate, while the liver cancer of the subject of the present invention It may be used for setting a cut-off value in a method for evaluating onset risk.
  • the cut-off value for predicting the onset of liver cancer determined by the ROC curve in the observational study of the inventors of the present invention is was included in the numerical range of 90% or more and 110% or less of the median GDF15 level of Therefore, the median value may be used as the cutoff value.
  • the cutoff value of the serum GDF15 protein level can be about 1400 pg/mL for hepatitis C patients who have achieved SVR. .
  • a cut-off value for GDF15 can be about 845 pg/mL for hepatitis B patients on NUC.
  • a cutoff value for GDF15 can be about 2000 pg/mL for NAFLD patients.
  • the cutoff values of AFP and FIB-4 index can be further combined for determination.
  • the AFP and FIB-4 index cutoff values may be about 5 ng/mL and about 3.25, respectively, for hepatitis C patients who have achieved SVR.
  • the method for evaluating the risk of developing liver cancer in a subject of the present invention will be described separately as a method based on the GDF15 protein level of the subject and a method based on the GDF15 transcript level of the subject. .
  • a method for evaluating the risk of developing liver cancer in a subject with chronic liver disease based on the GDF15 protein level A method for evaluating the onset risk, (1) measuring the subject's GDF15 protein level; (2) A method is provided, comprising the step of associating the GDF15 protein level with the risk of developing liver cancer.
  • the subject's GDF15 protein level is measured using the subject's serum or plasma sample.
  • Subject's plasma and serum can be prepared by a method known per se from a peripheral blood sample collected from the subject. These may be appropriately diluted using a known buffer solution or the like depending on the means for measuring the GDF15 protein level. ) may be diluted 75- to 100-fold or more using an attached dilution buffer or the like. If it takes time from blood collection to measurement, it is possible to measure plasma and/or serum that has been cryopreserved.
  • the level of GDF15 protein in step (1) can be measured by an immunological method using an antibody that specifically recognizes GDF15 protein (ie, GDF15-specific antibody).
  • Immunological methods include antibody array, flow cytometry analysis, radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA (Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)), Western blotting, immunohistochemical staining, enzyme Immunoassay (EIA method), fluorescence immunoassay (FIA), immunochromatographic method, immunoturbidimetric method, immunonephelometric method and the like can be mentioned, but ELISA is preferable from the viewpoint of sensitivity and ease of implementation.
  • Specific recognition of antigen X by an antibody means that the affinity of the antibody for antigen X in the antigen-antibody reaction is stronger than the affinity for antigens other than antigen X.
  • an antibody that specifically recognizes antigen X may be abbreviated as “anti-X antibody” or "X-specific antibody”.
  • the GDF15-specific antibody may be either a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a binding fragment thereof.
  • the antibody may be directly or indirectly labeled with a labeling substance.
  • labeling substances include fluorescent substances (eg, FITC, rhodamine), radioactive substances (eg, 32 P, 35 S, 14 C, 3 H), enzymes (eg, alkaline phosphatase, peroxidase), colored particles (eg, metal colloids). particles, colored latex), biotin, and the like.
  • the antibody can be used in a soluble state that is not bound to anything else, it may be bound to a solid phase.
  • solid phase examples include plates (e.g., microwell plates), tubes, beads (e.g., plastic beads, magnetic beads), chromatography carriers (e.g., water-absorbent substrates such as nitrocellulose membranes, Sepharose), membranes (eg, nitrocellulose membrane, PVDF membrane), gel (eg, polyacrylamide gel), metal membrane (eg, gold membrane), and the like.
  • plates, beads, chromatographic carriers and membranes are preferably used, and plates are most preferably used because they are easy to handle.
  • binding to the solid phase may be direct binding to the solid phase, or indirect binding to the solid phase using a substance known per se.
  • a phosphate buffer solution such as bovine serum albumin (BSA) or bovine milk protein is brought into contact with the solid phase, and the solid phase surface portion not coated with the antibody is removed. Blocking with the aforementioned BSA, cow milk protein or the like is generally performed.
  • the contact of the GDF15-specific antibody with plasma or serum derived from the subject is not particularly limited in terms of mode, order, specific method, etc., as long as these antibodies can interact with GDF15 in plasma or serum.
  • Contacting can be achieved, for example, by adding plasma or serum to a plate on which antibodies are immobilized.
  • proteins in plasma or serum may be separated by means such as SDS-PAGE, transferred to a membrane, fixed, and then brought into contact with an antibody.
  • the time for which such contact is maintained is not particularly limited as long as it is sufficient for the antibody and GDF15 contained in plasma or serum derived from the subject to bind and form a complex, but usually , several seconds to ten hours.
  • the temperature conditions for the contact are usually 4°C to 50°C, preferably 4°C to 37°C, most preferably room temperature of about 15°C to 30°C.
  • the pH condition for the reaction is preferably 5.0 to 9.0, more preferably a neutral range of 6.0 to 8.0.
  • the commercially available GDF15 protein is used, and the ELISA results of the dilution series are quantified by fluorescence, color development, or other reaction to easily determine the absolute value of the concentration of the GDF15 protein, for example, pg /mL.
  • step (2) the level of GDF15 protein in plasma and/or serum of the subject measured in step (1) is associated with the risk of developing liver cancer.
  • Associating the level of GDF15 protein in plasma and/or serum with the risk of developing liver cancer refers to determining whether the subject's data suggests (or indicates) the risk of developing liver cancer. .
  • the association between the subject's data and the risk of developing liver cancer is usually performed by comparing the subject's data with the data of patients with chronic liver disease other than the subject.
  • the group in which the level of GDF15 protein is higher than the preset cutoff value (high GDF15 group) has a higher risk of developing liver cancer than the group lower than the preset cutoff value (low GDF15 group). It became clear. This makes it possible to evaluate the risk of developing liver cancer in a subject.
  • the method for evaluating the risk of developing liver cancer of the present invention may include the step of determining the risk of developing liver cancer by a cutoff value of the GDF15 protein level, wherein the GDF15 protein level of the subject is equal to or higher than the cutoff value. If so, the subject's risk of developing liver cancer is high, and if the subject's GDF15 protein level is less than the cutoff value, the subject's risk of developing liver cancer is low. Further, the cut-off value can be the median GDF15 protein level of the population of subjects.
  • the adnominal "about” that modifies a numerical value means a numerical range of 90% or more and 110% or less of the numerical value.
  • “1400 pg/mL” refers to a numerical range of 1260 pg/mL or more and 1540 pg/mL or less.
  • the cutoff value determined as the median serum GDF15 protein level in hepatitis C patients who have achieved SVR may be about 1400 pg/mL.
  • the cut-off value in hepatitis C patients who achieved SVR determined as the serum concentration of GDF15 at which the Youden index was maximized by the ROC curve, was 1448 pg/mL, determined as the median value. This is because it falls within a numerical range of 90% or more and 110% or less of the cutoff value of 1400 pg/mL.
  • the cutoff values of AFP and/or FIB-4 index can be further combined for determination.
  • AFP and FIB-4 index can be used in combination to determine.
  • AFP can be used in combination with GDF15 for determination. This is because a method for stratifying the risk of developing liver cancer in subjects who have achieved SVR after DAA treatment using AFP and FIB-4 index as markers has been known.
  • Prior art known to those skilled in the art has used cut-off values for the AFP and FIB-4 indices of 5 ng/mL and 3.25, respectively.
  • a method for evaluating the risk of developing liver cancer in a subject with chronic liver disease based on the GDF15 transcript level A method for evaluating the risk of developing liver cancer, (1) measuring the subject's GDF15 transcript level; (2) A method is provided, comprising the step of associating the GDF15 transcript level with the risk of developing liver cancer.
  • the subject's GDF15 transcript level is measured using the subject's biological tissue, serum or plasma sample.
  • the biological tissue includes, but is not limited to, percutaneous biopsy (needle biopsy), endoscopic biopsy, and surgical biopsy. can be obtained.
  • the biological tissue is preferably liver tissue. Circulating GDF15 transcripts or portions thereof in serum or plasma samples can also be measured.
  • RNA can be isolated from a biological sample according to routine methods. General methods for extracting RNA are well known in the art and are described in molecular Disclosed in Biology Laboratory Protocols. Specifically, RNA isolation can be performed using commercially available purification kits such as RNeasy columns (Qiagen, Hulsterweg, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • RNA for example, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative real-time RT-qPCR, etc.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Complementary DNA is prepared from RNA using a GDF15-specific primer by reverse transcription reaction, and using the complementary DNA as a template, a reaction solution containing a GDF15-specific PCR primer pair and a fluorescence-labeled probe is amplified with a real-time PCR device, and fluorescence is quantified. can do.
  • the relative value of the measured GDF15 transcript in RNA from the subject sample to be measured relative to the measured GDF15 transcript in control RNA at the same concentration can be quantified.
  • Arbitrary Units (AU) can be used in the case of the relative value of the measured value of the GDF15 transcript.
  • the primer pair and probe for specifically detecting the GDF15 transcript used in step (1) can be synthesized based on the nucleotide sequence of human GDF15 mRNA published as NCBI Reference Sequence: NM_004864.4.
  • Base lengths of primers and probes are not particularly limited.
  • the primer comprises a forward primer containing one of a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the human GDF15 mRNA and a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the human GDF15 mRNA, and the other is a reverse primer.
  • the base length of each primer can be 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides.
  • the probe includes a portion of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the human GDF15 mRNA, and the base length of the probe ranges from 10 nucleotides to the entire length of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the human GDF15 mRNA, preferably. can be 20-150 nucleotides.
  • Primer pairs and probes for specifically detecting GDF15 transcripts used in step (1) may be natural nucleic acids such as RNA and DNA, and may optionally combine natural nucleic acids with chemically modified nucleic acids or pseudo-nucleic acids.
  • Examples of chemically modified nucleic acids and pseudo-nucleic acids include PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; registered trademark), methylphosphonate-type DNA, phosphorothioate-type DNA, 2'-O-methyl-type RNA, and the like.
  • primers and probes may be labeled with fluorescent substances and/or quencher substances, or radioactive isotopes (e.g., 32 P, 33 P, 35 S), biotin or (strept)avidin, or magnetic beads. It may be labeled or modified with a modifier. Labeling substances are not limited, and commercially available ones can be used. For example, fluorescent substances such as FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, Cyanine3, Cyanine5, Cyanine7, FAM, HEX, VIC, fluorescamine and its derivatives, and rhodamine and its derivatives can be used. AMRA, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, or BHQ-3 can be used as quencher substances.
  • the labeling positions of the labeling substances in the primers and probes may be appropriately determined according to the properties of the modifying substance and the purpose of use. In general, the 5' or 3' end is often modified. Also, one primer and one probe molecule may be labeled with one or more labeling substances.
  • the design of the nucleotide sequences of primers and probes and the selection of labeling substances are known, and molecular biology such as Sambrook, J and Russell, DW, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). are disclosed in the experimental protocol book.
  • step (2) the level of the subject's GDF15 transcript measured in step (1) is associated with the risk of developing liver cancer.
  • Associating the level of the GDF15 transcript with the risk of developing liver cancer means determining whether or not the subject's data suggests (or indicates) the risk of developing liver cancer.
  • the association between the subject's data and the risk of developing liver cancer is usually performed by comparing the subject's data with the data of patients with chronic liver disease other than the subject.
  • the level of the GDF15 transcript is higher than the preset cutoff value (high GDF15 group) group lower than the preset cutoff value (low GDF15 group) than the risk of developing liver cancer revealed to be high. This makes it possible to evaluate the risk of developing liver cancer in a subject.
  • the method for assessing the risk of developing liver cancer of the present invention may include the step of determining the risk of developing liver cancer by a cutoff value of the GDF15 transcript level, wherein the GDF15 transcript level of the subject is the cutoff value If the GDF15 transcript level of the subject is less than the cutoff value, the subject's risk of developing liver cancer is determined to be low. Further, the cutoff value can be the median GDF15 transcript level of the population of subjects.
  • the method for assessing the risk of developing liver cancer of the present invention may include the step of determining the risk of developing liver cancer by a cutoff value of the GDF15 transcript level, wherein the GDF15 transcript level of the subject is the cutoff value If the GDF15 transcript level is less than the cutoff value, the risk of developing liver cancer in the subject is high. Further, the cutoff value can be the median GDF15 transcript level of the population of subjects.
  • the cutoff values of AFP and FIB-4 index can be further combined for determination. This is because a method for stratifying the risk of developing liver cancer in subjects who have achieved SVR after DAA treatment using AFP and FIB-4 index as markers has been known. Prior art known to those skilled in the art has used cut-off values for the AFP and FIB-4 indices of 5 ng/mL and 3.25, respectively.
  • kits for Measuring GDF15 Levels in Subjects for Use in the Methods of the Present Invention provides kits for measuring GDF15 levels in subjects for use in the methods of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises anti-GDF15-specific antibodies and/or primer pairs and probes for specifically detecting GDF15 transcripts.
  • the anti-GDF15-specific antibody contained in the kit of the present invention is described in "1.
  • the primer pair and probe for specifically detecting the GDF15 transcript contained in the kit of the present invention are described in "2. Based on the GDF15 transcript level in subjects suffering from chronic liver disease. Methods for assessing a subject's risk of developing liver cancer" section.
  • the present invention uses the method of the present invention to evaluate the risk of developing liver cancer in a subject with chronic liver disease provide diagnostics for
  • the diagnostic agent of the present invention includes anti-GDF15 antibodies and/or primer pairs and/or probes for specifically detecting GDF15 transcripts.
  • the risk of developing liver cancer of the subject is evaluated based on the GDF15 protein level of the subject suffering from chronic liver disease.
  • method for For the primer pair and / or probe for specifically detecting the GDF15 transcript contained in the diagnostic agent of the present invention the "2. GDF15 transcript level of subjects suffering from chronic liver disease Method for assessing the risk of developing liver cancer in said subject based on the method" section.
  • GDF15 as a biomarker for assessing the risk of developing liver cancer in a subject
  • the present invention provides the use of GDF15 as a biomarker for assessing the risk of developing liver cancer in a subject.
  • the steps involved in the use of GDF15 of the present invention are described in "1. Method for assessing the risk of developing liver cancer in a subject with chronic liver disease based on the GDF15 protein level. and "2. Methods for assessing the risk of developing liver cancer in a subject with chronic liver disease based on the GDF15 transcript level in said subject" sections.
  • Example 1 Liver cancer development risk assessment in subjects who achieved hepatitis C virus (HCV) persistent negative conversion (SVR).
  • HCV hepatitis C virus
  • SVR persistent negative conversion
  • Antiviral therapy and SVR DAA treatment was carried out with a protocol of asunaprevir and daclatasvir for 24 weeks, sofosbuvir and ledipasvir for 12 weeks, ombitasvir and paritaprevir plus ritonavir for 12 weeks, sofosbuvir and ribavirin for 12 weeks, elbasvir and grazoprevir for 12 weeks.
  • SVR refers to undetectable HCV RNA levels 24 weeks after the end of treatment. All cases were treated in accordance with the Japanese Society of Hepatology guidelines for the treatment of chronic HCV infection.
  • the follow-up start date is the date DAA treatment ended. Endpoints were the date of onset of liver cancer or the date of final follow-up liver cancer surveillance imaging. The overall survival endpoint was the date of death from all causes or the date of last follow-up.
  • Sera test Sera from enrolled cases were stored in a -80°C freezer at Osaka University at the time points determined by the prospective study protocol.
  • Serum GDF15 concentrations were determined using a human enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (#DGD150, R&D systems, Minneapolis, Minn.) according to the manufacturer's protocol. Absorbance was determined on a Varioscan LUX (Thermo Scientific, Waltham, Mass.).
  • the cases were divided into two groups with a median pretreatment serum GDF15 level of 1400 pg/mL. As the details of the cases of the high GDF15 group and the low GDF15 group are shown in FIG. Blood glucose, HbA1c, AFP, FIB-4 index and ALBI scores were high, HCV RNA levels, hemoglobin, eGFR and albumin were low. A correlation between the serum GDF15 level and the fibrosis score was observed (Fig. 4-1). A correlation between serum GDF15 levels and FIB-4 index values was observed (Fig. 4-2).
  • the serum GDF15 level is different from old age (Figure 4-3A), high AST ( Figure 4-3D), low eGFR (Figure 4-3G), low albumin (Figure 4-3H) and high A correlation was also observed with the ALBI score (FIGS. 4-3K).
  • liver cancer In the derivation cohort, 49 cases developed liver cancer after DAA treatment within the observation period of the present invention. The details are shown in FIG. The incidence of liver cancer in the derivation cohort was 1.59% at 1 year, 2.85% at 2 years, and 5.02% at 3 years (Fig. 6-1). Patients with post-treatment liver cancer developed serum GDF15 levels at any of the three time points: Pre Treatment, End Of Treatment, and 24 weeks after achieving SVR (Post 24 weeks). It was higher than non-symptomatic cases (Fig. 6-2). The GDF15 level at the onset of liver cancer showed no significant change compared to the GDF15 level one year before the onset of liver cancer (Fig. 6-3). This suggests that serum GDF15 levels may reflect the severity of liver disease at that time in each case, unlike tumor markers such as AFP and PIVKA2.
  • the 1, 2 and 3-year cumulative liver cancer incidence rates were 2.80%, 4.44% and 8.31%, respectively, in the high GDF15 group, and 0.47%, 1.0%, respectively, in the low GDF15 group. 12% and 1.93%.
  • the 1-, 2-, and 3-year cumulative liver cancer incidence rates were significantly lower in the low GDF15 group than in the high GDF15 group (Fig. 6-4).
  • Serum GDF15 level may be a novel biomarker for predicting liver cancer development after DAA treatment.
  • pretreatment variables associated with liver cancer development were analyzed by the Cox Hazard model. Cases with a FIB-4 index greater than 3.25 (>3.25) are based on past findings (Gastroenterology 2017; 153: 996-1005. e1001. and Hepatology 2007; 46: 32-36.) A case of advanced hepatic fibrosis was considered. Other variables were assigned to two groups based on median or historical findings (Clin Gastroenterol Hepatol 2014;12:1186-1195.).
  • AFP as a tumor marker
  • GDF15 level As a tumor marker
  • FIB-4 index as fibrosis progression calculated by age
  • AST ALT and platelets
  • ALBI score calculated by albumin and bilirubin parameters.
  • a multivariate Cox regression model was selected. Among these parameters, AFP (J Med Virol 2020;92:3507-3515. and J Hepatol 2017;67:933-939.), FIB-4 index (Gastroenterology 2017;153:996-1005.e1001., J Med Virol 2020;92:3507-3515. and J Hepatol 2017;68:25-32.) and ALBI score (Dig Liver Dis 2019;51:681-688.) are risk factors for liver cancer after HCV elimination is known.
  • High GDF15 (HR 2.52 95% CI 1.17-6.09), high AFP (HR 2.26 95% CI 1.16-4.69) and high FIB-4 index (HR 2.40 95% CI 1.18-5.24) independently increased the risk of developing HCC. (Fig. 7). No significant difference was observed in the predictive power of liver cancer development among AFP, FIB-4 index and GDF15 (Fig. 8). The cumulative liver cancer incidence rate was 8-9% over 3 years in the high AFP group or high FIB-4 index group, and 2-3% over 3 years in the low AFP group or low FIB-4 index group (Fig. 9A and B).
  • the cutoff values of the GDF15, AFP and FIB-4 indices for predicting the development of liver cancer were determined by the ROC curve on the Youden index (Cancer 1950;3:32-35.)
  • the cutoff values of the serum GDF15, AFP and FIB-4 indices were The values were 1448 pg/mL, 6.020 ng/mL and 3.025, respectively (Fig. 8E). These cut-off values were similar to pretreatment median serum GDF15 levels of 1400 pg/mL, 5 ng/mL and 3.25 (Fig. 7).
  • the total score for each case was calculated, with 1 point for each high GDF15, AFP and FIB-4 index.
  • a score of 0 was defined as a low risk group
  • a score of 1 or 2 was defined as an intermediate risk group
  • a score of 3 was defined as a high risk group.
  • the cumulative risk of developing liver cancer for 1, 2 and 3 years is 0%, 0.40% and 0.40% for the low risk group, and 1.18%, 1.89% and 4.44% for the intermediate risk group, respectively. , 4.95%, 8.26%, and 13.2% in the high-risk group (Fig. 10).
  • a scoring system using GDF15 levels, AFP and FIB-4 index can stratify the risk of developing liver cancer in the validation cohort.
  • the risk of developing liver cancer was stratified by a scoring system using GDF15 levels, AFP and FIB-4 index.
  • the scoring system was validated using a validation cohort of 751 cases for which only pre-DAA serum was available. In the validation cohort, 39 cases developed liver cancer after DAA treatment during the observation period (Fig. 11).
  • the cumulative incidence of liver cancer in the low GDF15 group, low AFP group and low FIB-4 index group was significantly lower than in the high GDF15 group, high AFP group and high FIB-4 index group, respectively (FIGS. 13A-C).
  • the total score for each case was calculated, with 1 point for each high AFP and FIB-4 index of known markers.
  • a score of 0 was defined as a low risk group
  • a score of 1 was defined as a middle risk group
  • a score of 2 was defined as a high risk group.
  • the degree of stratification of the Kaplan-Meier curve for each risk group was rough, and even in the low-risk group, the incidence of liver cancer comparable to that in the intermediate-risk group was observed.
  • the low-risk group in the known marker AFP and FIB-4 index only scoring system was divided into a group with both low AFP and FIB-4 indices but high GDF15 levels and a group with both low AFP and FIB-4 indices. value, and the GDF15 level is also low value group, as shown in Figure 15-2, both AFP and FIB-4 index is low, and GDF15 level is also low in the group of liver cancer The onset rate became 0.
  • both AFP and FIB-4 indexes are low, but the incidence of liver cancer is about 7% in a group with high GDF15 level, and stratification by low AFP and low FIB-4 index alone is not enough. It was confirmed that the risk of developing liver cancer after DAA treatment is not sufficiently low.
  • the examples of the present invention are retrospective studies using stored serum, and bias related to the availability of serum cannot be denied. To dispel this concern, we compared the derivation cohort and the validation cohort and showed at least no significant difference in liver cancer incidence. In addition, Myojin, Y. et al. (Aliment Pharmacol Ther. 2022; 55: 422-433) randomly distributed the cases of the derivation cohort and validation cohort of this example to 3: 2. Derivation cohort (964 cases) and validation cohort (642 cases), the cut-off values determined by the ROC curve of the serum GDF15, AFP and FIB-4 indices as the maximum Youden index were 1350 pg/mL, 5 ng/mL and 3.5 pg/mL, respectively. was 25. These values were similar to the median serum GDF15 levels before treatment in this example.
  • Example 2 Evaluation of the risk of developing liver cancer in subjects who have not developed liver cancer during treatment with NUC administration for hepatitis B virus (HBV)A.
  • Materials and Methods (1) Case Population Subject to Investigation Subjects of the investigation in this example are nucleic acid analog (NUC)-administered cases with preserved serum whose long-term course can be investigated.
  • NUC nucleic acid analog
  • the criteria for selecting stored serum are that there is a history of NUC administration for 8 months or more at stored serum points (if there are multiple stored serum points, the oldest serum point among applicable serum points), and stored serum points and serum HBV DNA less than 3.0 logIU/ml.
  • patients with a history of liver cancer at the time of serum points and patients with liver diseases other than hepatitis B are excluded.
  • NUC nucleic acid analogue
  • Serum GDF15 levels were higher in patients who developed liver cancer during treatment with NUC administration for HBV than in patients who did not develop liver cancer.
  • a scatter plot of the serum concentration of GDF15 in the cases under treatment with NUC administration, a graph showing the patient background, and a graph showing the time course of the incidence of liver cancer in the entire cohort of this time are shown in FIGS. 16, 17 and 18, respectively.
  • the cohort-wide median and 25%-75% interval of serum concentrations of GDF were 0.833 ng/mL and 0.555-1.206 ng/mL.
  • FIG. 19 is a table in which patient backgrounds are grouped by median serum concentration of GDF15 (0.833 ng/mL).
  • FIG. 20 is a table in which patient backgrounds are grouped according to the presence or absence of onset of liver cancer.
  • Figures 21 and 22 are graphs of the results of ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis over time regarding the presence or absence of carcinogenesis at 5 and 10 years from the stored serum points for GDF15, Fib4, AFP and Plt, respectively. is.
  • the vertical axis of each graph represents sensitivity or true positivity
  • the horizontal axis represents false positivity (1-specificity)
  • AUC represents the area under the ROC curve of each graph (Area under the curve).
  • FIG. 23 shows a graph showing changes over time in the incidence of liver cancer using a cutoff value (0.845 ng/mL) determined from the ROC curve as the maximum Youden index.
  • FIG. 24 shows the results of univariate/multivariate analysis of factors contributing to carcinogenesis by cox proportional hazards model.
  • Figure 25 shows that the results of multivariate analysis were good, and each score was given to cases with cutoff values of 5 ng / mL and 0.845 ng / mL or more for each of the two markers, AFP and GDF15.
  • the cases are grouped and plotted to represent a graph showing the time course of the incidence of liver cancer. Therefore, stratification by a scoring system using the novel biomarker GDF15 alone or GDF15 in combination with the known marker AFP was shown to be useful for predicting the development of liver cancer in HBV patients undergoing treatment with NUC administration.
  • the serum concentration marker of GDF15 is useful for predicting hepatic carcinogenesis even in subjects who have not developed liver cancer during treatment with NUC administration for hepatitis B virus (HBV). .
  • Example 3 Liver cancer development risk assessment for subjects with NAFL or NASH but not liver cancer A.
  • Materials and methods (1) Case population to be investigated This is a case with stored serum. However, patients with a history of liver cancer at the time of serum points and patients with liver diseases other than NAFLD are excluded.
  • NAFL non-alcoholic fatty liver
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NAFLD/NASH Clinical Guidelines 2020 (edited by the Japanese Society of Gastroenterology and the Japan Society of Hepatology, revised 2nd edition) , published in November 2020, Nankodo (https://www.jsge.or.jp/guideline/guideline/pdf/nafldnash2020.pdf)), English version (Tokushige, K. et al. HepatologyResearch.2021;51: 1013-1025. and Tokushige, K. et al. Journal of Gastroenterology 2021;56: 951-963.), which were treated according to guidelines available at the time.
  • FIG. 26 is a scatter plot of serum concentrations of GDF15 in patients with NAFL or NASH.
  • black circles represent non-liver cancer cases, and white circles represent liver cancer-developed cases.
  • Five of the six cases of liver cancer that developed were primary hepatocellular carcinoma (HCC), and the one indicated by the arrow was cholangiocellular carcinoma (CCC).
  • Figure 27 is a table showing patient demographics of patients with NAFL or NASH.
  • Figure 28 is a table showing patient demographics grouped into patients with NAFL and patients with NASH. As shown in Figure 28, the cohort-wide median and 25%-75% interval of serum concentrations of GDF in patients with NAFL were 1.07 ng/mL and 0.69-1.49 ng/mL.
  • Figure 29 is a graph showing the time course of liver cancer incidence across patient cohorts with AFL or NASH.
  • Fig. 30 is a scatter diagram of the serum concentration of GDF15 for each case grouped into types 0 to 4 of Brunt Stage.
  • the Jonckheere-Terpstra trend test was used to verify the tendency of the serum concentration of GDF15 to increase in each group as the stage progressed from Brunt Stage type 0 to type 4, the significant difference P was 0.003. Therefore, from FIG. 30, a significant correlation was observed between the serum concentration of GDF15 and fibrosis.
  • FIG. 31 is a scatter plot examining the correlation between the serum concentration of GDF15 and the Fib-4 index in patients with NAFL or NASH.
  • the significant difference P was less than 0.0001 and the coefficient of determination R2 was 0.245, indicating a significant correlation.
  • FIG. 32 is a table showing the hazard ratios of various attributes, blood markers, Fib-4 index, etc. of patients suffering from NAFL or NASH.
  • the P-value for GDF15 is less than 0.0001, significantly lower than any other attribute, blood marker, Fib-4 index, etc.
  • FIG. 33 is a graph of the results of ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis over time regarding the presence or absence of carcinogenesis 5 years after the storage serum point for each of the GDF15 and Fib-4 indexes.
  • the vertical axis of each graph represents sensitivity or true positivity
  • the horizontal axis represents false positivity (1-specificity)
  • AUC represents the area under the ROC curve of each graph (Area under the curve).
  • 34-1 and 34-2 represent graphs showing changes over time in liver cancer incidence with cutoff values of 2.00 ng/mL and 1.35 ng/mL, respectively.
  • 2.00 ng/mL is the cut-off value determined from the ROC curve of carcinogenesis within 5 years in a cohort of NAFL or NASH patients assuming that the Youden index is the maximum value.
  • 1.35 ng/mL is the cutoff value determined from the ROC curve from the derivation cohort of hepatitis C patients who achieved SVR in Example 1 assuming the Youden index to be the maximum value. It was shown that stratification with a cutoff value of 2.00 ng/mL greatly contributes to the prediction of liver cancer incidence in NAFL and NASH.
  • the serum concentration marker of GDF15 is useful for predicting hepatic carcinogenesis even for subjects suffering from NAFLD including NAFL and NASH.
  • Example 4 Study with Additional Cohort of Ogaki Municipal Hospital 183 cases of Ogaki Municipal Hospital were added and further studied.
  • Case population to be investigated This is a case with stored serum. However, patients with a history of liver cancer at the time of serum points and patients with liver diseases other than NAFLD are excluded.
  • Results Figures 35-1 and 35-2 show patient backgrounds of Ogaki Municipal Hospital and Example 3 cohort with extended observation period, respectively.
  • Fig. 36-1 is a scatter diagram of serum concentrations of GDF15 in patients suffering from NAFLD at Ogaki Municipal Hospital.
  • black circles represent non-liver cancer cases
  • gray circles represent liver cancer-developed cases. All 9 cases of developed liver cancer were primary hepatocellular carcinoma (HCC).
  • FIG. 36-2 is a scatter plot of serum concentrations of GDF15 in patients with NAFLD in the cohort of Example 3 with extended observation period.
  • black circles represent non-liver cancer cases
  • gray circles represent liver cancer-developed cases.
  • 7 cases were primary hepatocellular carcinoma (HCC)
  • the 1 case indicated by the arrow was cholangiocellular carcinoma (CCC).
  • HCC primary hepatocellular carcinoma
  • Figures 37-1 and 37-2 show changes in liver cancer incidence over time in the Ogaki Municipal Hospital cohort and the cohort of Example 3 with an extended observation period, respectively.
  • Figures 38-1, 38-2 and 38-3 show carcinogenesis at 5 years and 7 years from the storage serum point, respectively, in the Ogaki Municipal Hospital cohort and the cohort of Example 3 with an extended observation period. It is a graph of the results of ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis over time for the presence or absence of The vertical axis of each graph represents sensitivity or true positivity, the horizontal axis represents false positivity (1-specificity), and AUC represents the area under the ROC curve of each graph (Area under the curve).
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in the incidence of liver cancer in patients with liver cancer.
  • 2.00 ng/mL is the cut-off value determined as the maximum Youden index from the ROC curve of a cohort of NAFLD patients observed for 5 years.
  • 1.74 ng/mL is the cut-off value determined as the maximum Youden index from the ROC curve of a cohort of NAFLD patients observed for 7 years. It was shown that stratification with cutoff values of 2.00 ng/mL and 1.74 ng/mL greatly contributes to the prediction of liver cancer incidence in NAFLD.
  • the present invention it is possible to more accurately evaluate a subject's risk of developing liver cancer based on the GDF15 level.
  • subjects are stratified according to the evaluated degree of risk of developing liver cancer, and subjects with a high risk of developing liver cancer undergo a liver cancer screening test at a higher frequency than subjects with a low risk of developing liver cancer. can be graded as follows: Therefore, it is possible to reduce both the examination burden on individual subjects and the medical economic loss for society as a whole.

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Abstract

本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法は、（１）被検者のＧＤＦ１５レベルを測定する工程と、（２）前記ＧＤＦ１５レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程とを含む。工程（１）で測定されるＧＤＦ１５レベルが予め設定したカットオフ値以上の場合には前記被検者の肝癌発症リスクが高いことの指標となり、前記カットオフ値未満の場合には前記肝癌発症リスクが低いことの指標となる。本発明は、本発明の方法に使用するための被検者のＧＤＦ１５レベルを測定するためのキット、及び、抗ＧＤＦ１５特異的抗体を含む、被検者の肝癌発症リスクを評価するための診断薬も提供する。

Description

慢性肝疾患における肝発癌の診断マーカー
　本発明は、疾患の診断マーカーを用いる疾患の発症リスクを評価するための方法に関し、具体的には、慢性肝疾患における肝発癌の発症リスクを評価するための方法に関する。
　Ｂ型及びＣ型慢性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎などの各種慢性肝疾患は肝癌を引き起こす（非特許文献１及び２）。各種慢性肝疾患では肝細胞障害が認められ、持続的な肝細胞障害による肝発癌には酸化ストレスが関与している（非特許文献３及び４）。慢性肝疾患は、ウイルス性慢性肝疾患と非ウイルス性慢性肝疾患とに分類される。ウイルス性慢性肝疾患は、主にＣ型肝炎ウイルスによるＣ型肝炎と、Ｂ型肝炎ウイルスによるＢ型肝炎とに分類される。非ウイルス性慢性肝疾患は、脂肪性肝疾患と、自己免疫性肝疾患とに分類される。
　Ｃ型肝炎
　Ｃ型肝炎に対する新規治療薬である直接型抗ウイルス薬（direct acting antivirals、以下、「ＤＡＡｓ」という。）の登場により多くの症例でＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が排除されるようになった。Ｃ型肝炎ウイルス排除後、正確には、持続陰性化（sustained virological response、以下、「ＳＶＲ」という。）達成後も肝発癌、正確には、肝癌発症のリスクがある（非特許文献５）ので、Ｃ型肝炎の多くの症例で治療終了後に定期的な画像検査や血液検査を行っている。しかし、近年ＤＡＡｓ治療の普及によりＳＶＲを達成した症例が増大しており、全てのＳＶＲ達成症例に一律の定期検査を行うのは医療経済上問題がある。そこで肝発癌リスクを層別化して、肝発癌リスクの高い集団を重点的に検査する必要がある。血液検査で腫瘍マーカーとして、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、血小板や年齢から計算されるＦＩＢ－４インデックス（Ｆｉｂ－４、ＦＩＢ４又はＦｉｂ４とも表記する。非特許文献６－８）等が発癌予測に使用されるが、その診断能は十分ではなく、より精密な層別化技術が必要である。
　Ｂ型肝炎
　ＨＢｓ抗原陽性患者は２０１９年時点で世界に２．９６億人程度と推定され、年間約８２万人がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を原因とする肝硬変や肝癌で死亡している。核酸アナログ製剤（ＮＵＣ）により血清中のＨＢＶ　ＤＮＡを低下させることで肝癌発症のリスクは減じるが、ＨＢＶ　ＤＮＡ低値例においても、発癌症例を認める（非特許文献９）。ＨＢｓ抗原消失後の肝癌の発症率は０．０３６８／年である。一方でＨＢｓ抗原持続陽性例の肝癌の発症率は０．１９５７／年であり、有意に肝癌の発症率は高い（非特許文献１０）。発癌リスクが高くなる因子として、年齢（４０歳以上）、性別（男性）、高ウイルス量、飲酒者、肝癌の家族歴、ＨＣＶ、ＨＤＶ及び／又はＨＩＶの共感染、肝線維化進展、肝線維化進展を反映する血小板数の低下、ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｃ、コアプロモーター変異などが挙げられる（非特許文献１１）。しかし、これらの因子を加味してもＮＵＣ投与下での肝癌発症の予測は困難であり、新たな肝発癌マーカーは臨床上重要である。
　脂肪性肝疾患
　非ウイルス性肝疾患の多くは脂肪性肝疾患（いわゆる脂肪肝）である。脂肪性肝疾患は、肝細胞の５％以上に脂肪が蓄積した疾患をいう。脂肪性肝疾患はさらに非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と二次性脂肪肝とに分類される。ここで非アルコール性とは、飲酒量をエタノールに換算して男性で３０ｇ／日、女性で２０ｇ／日未満をいう。ＮＡＦＬＤはさらに組織学的に肝細胞障害を伴わない非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と、組織学的に肝細胞障害及び炎症を伴う非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とに分類される。二次性脂肪肝は、アルコール性、薬物性（アミオダロン、メトトレキサート、タモキシフェン、ステロイド、バルプロ酸、抗レトロウイルス薬など）、疾患性（Ｃ型肝炎（ｇｅｎｏｔｙｐｅ３）、Ｗｉｌｓｏｎ病、脂肪萎縮症、飢餓状態、非経口的栄養、Ｒｅｙｅ症候群、急性妊娠脂肪肝、ＨＥＬＬＰ症候群）、先天性代謝異常性（無βリポタンパク血症、ヘモクロマトーシス、α1アンチトリプシン欠損症、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、ライソゾーム産生リパーゼ欠損症など）その他（膵頭十二指腸切除術後）に分類される。
　日本の人口を１億２７００万人とすると、その約３０％の３～４千万人がＮＡＦＬＤを罹患し、その約１０％がＮＡＳＨを罹患していると推定されている。この罹患者数は、Ｃ型肝炎（２００万人）、Ｂ型肝炎（１００万人）及びアルコール性肝炎（２００万人）のいずれよりも多く、ウイルス性肝炎の総数にほぼ匹敵するか超える罹患者数である。
　ＮＡＦＬの症例にはゆっくりではあるが線維化が進展する症例もあるのに対し、ＮＡＳＨの症例には、線維化が進展し、肝硬変・肝発癌に至る症例がある。しかし両者の間では相互移行があることが知られている（非特許文献１２及び１３）。予後を比較検討した結果から、ＮＡＦＬであるかＮＡＳＨであるかより、線維化進展しているかどうかが予後には重要との報告がある（非特許文献１４）。別の予後比較の検討から、肝線維化進展症例は予後が悪いとの報告もある（非特許文献１５）。１９９５年～２０１５年の日本における初発肝癌の成因の検討結果から、非ウイルス性肝疾患を背景とした肝発癌が増加していることが明らかにされている（非特許文献１６）。
　非ウイルス性肝疾患からの肝癌発症予測マーカーもＦＩＢ－４インデックスの有用性も報告されているが（Gastroenterology. 2018 Dec;155(6):1828-1837.e2）、その診断能は十分ではなく、さらなる層別化技術が必要である。
　酸化ストレスはＣ＞Ａ／Ｇ＞Ｔ遺伝子変異を誘導するが（非特許文献１７）、この変異パターンは肝がんでは他の癌に比して高率に認め（非特許文献１８）、肝発癌への酸化ストレスの関与が示唆されている。増殖分化因子１５（Growth Differentiation Factor 15、ＧＤＦ１５）は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属し、酸化ストレス及びミトコンドリアストレスに反応して発現が増大する（非特許文献１９－２２）。ＧＤＦ１５は肝線維化進展症例で上昇しており、肝癌症例ではＧＤＦ１５高値が予後不良因子として報告されている（非特許文献２３）。しかし、ＧＤＦ１５が、Ｃ型肝炎におけるＳＶＲ後の肝癌発症、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与下での肝癌発症、ＮＡＳＨからの肝癌発症を含む慢性肝疾患と関係するかどうかは全く知られていない。
非特許文献１：Sagnelli E, et al. Infection. 2020 Feb;48(1):7-17.
非特許文献２：Zhang CH, et al. Liver Int. 2022 doi: 10.1111/liv.15251.
非特許文献３：Hikita H, et al. J Hepatol. 2012 Jul;57(1):92-100.
非特許文献４：Hikita H, et al. Cancer Prev Res (Phila). 2015 Aug;8(8):693-701.
非特許文献５：Janjua NZ et al., J Hepatol 2017;66:504-513.
非特許文献６：Watanabe T et al., J Med Virol 2020;92:3507-3515.
非特許文献７：Kanwal F, Singal AG, Gastroenterology 2019;157:54-64.
非特許文献８：Nagata H et al., J Hepatol 2017;67:933-939.
非特許文献９：Liaw YF, et al. N Engl J Med. 2004;351:1521-1531.
非特許文献１０：Simonetti J, et al. Hepatology. 2010;51:1531-1537.
非特許文献１１：Yim HJ, Lok AS. HEPATOLOGY 2006;43:S173-S181.
非特許文献１２：Tokushige, K, et al. Hepatology Research.2021;51:1013-1025.
非特許文献１３：Yoshiji, H. et al. J Gastroenterol, 2021;56:593-619.
非特許文献１４：Angulo P, et al. Gastroenterology. 2015;149:389-97.
非特許文献１５：Hagstrom H, et al. J Hepatol. 2017;67:1265-1273.
非特許文献１６：Tateishi R, et al. J Gastroenterol. 2019;54:367-376.
非特許文献１７：van Loon B, et al. DNA Repair (Amst) 2010;9:604-16
非特許文献１８：Guichard C, et al. Nat Genet 2012;44:694-8.
非特許文献１９：Han ES, et al. Physiol Genomics. 2008;34:112-26.
非特許文献２０：Tsai VWW et al., Cell Metab 2018;28:353-368.
非特許文献２１：Kim J et al., Nat Metab 2021;3:410-427.
非特許文献２２：Kang SG et al., iScience 2021;24:102181
非特許文献２３：Myojin Y et al., Gastroenterology 2021;160:1741-1754.
　本発明の目的は、慢性肝疾患からの肝癌発症を予測する新規バイオマーカーを提供することである。本発明のさらなる目的は、該新規バイオマーカーを含む、Ｃ型肝炎におけるＳＶＲ後の肝発癌と、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与下での肝発癌と、ＮＡＦＬＤからの肝発癌とを含むが、これらに限定されない、慢性肝疾患からの肝発癌のリスク評価及び／又は層別化のための新規技術を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく検討を進め、血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベル又は肝組織中のＧＤＦ１５転写産物のレベルにより慢性肝疾患からの発癌が予測できることを発見し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法を提供する。本発明の方法は、
（１）被検者のＧＤＦ１５レベルを測定する工程と、
（２）前記ＧＤＦ１５レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程と
を含む。
　本発明の方法において、前記被検者は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）持続陰性化（ＳＶＲ）を達成した被検者、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与中の被検者、及びＮＡＦＬＤを発症した被検者からなる群から選択される少なくとも１種類の被検者とすることができる。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、前記被検者のＧＤＦ１５レベルが、予め設定したカットオフ値以上の場合には前記被検者の肝癌発症リスクが高いことの指標となり、前記カットオフ値未満の場合には前記被検者の肝癌発症リスクが低いことの指標とすることができる。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、工程（１）で測定されるＧＤＦ１５レベルは、血清又は血漿中のＧＤＦ１５タンパク質のレベル、及び／又は、肝組織又は循環血中のＧＤＦ１５転写産物のレベルとすることができる。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、前記カットオフ値は、前記ＧＤＦ１５レベルの統計解析又はＲＯＣ解析に基づいて設定されてもよい。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、工程（１）で測定されるＧＤＦ１５のレベルは血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルであってもよい。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、前記カットオフ値は、個々の慢性肝疾患ごとの被検者のＧＤＦ１５タンパク質のレベルの中央値であってもよく、個々の慢性肝疾患のＲＯＣ曲線から決定してもよい。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、前記血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルのカットオフ値は、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者について約１４００ｐｇ／ｍＬとすることができる。ＧＤＦ１５のカットオフ値はＮＵＣ投与中のＢ型肝炎患者について約８４５ｐｇ／ｍＬとすることができる。ＧＤＦ１５のカットオフ値はＮＡＦＬＤ患者について約２０００ｐｇ／ｍＬとすることができる。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、前記血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルはＥＬＩＳＡ法によって決定することができる。
　本発明の方法において、前記肝癌発症リスクを判定する工程では、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値を更に組み合わせて判定することができる。
　本発明の方法において、前記ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値は、Ｃ型肝炎のＳＶＲを達成した被検者及びＢ型肝炎におけるＮＵＣ投与中の被検者についてそれぞれ、約５ｎｇ／ｍＬ及び約３．２５であってもよい。ＮＡＦＬＤを発症した被検者については、それぞれ、約５ｎｇ／ｍＬ及び約２．６７であってもよい。
　本発明は、本発明の方法に使用するための被検者のＧＤＦ１５レベルを測定するためのキットを提供する。本発明のキットは、抗ＧＤＦ１５抗体、及び／又は、ＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対若しくはプローブを含む。
　本発明は、本発明の方法によって被検者の肝癌発症リスクを評価するための診断薬を提供する。本発明の診断薬は、抗ＧＤＦ１５抗体、及び／又は、ＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及びプローブを含む。
　本発明は、（１）被検者のＧＤＦ１５レベルを測定する工程と、
　（２）前記ＧＤＦ１５レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程とを含む、ＧＤＦ１５の被検者の肝癌発症リスクを評価するためのバイオマーカーとしての使用を提供する。
　本発明のＧＤＦ１５の被検者の肝癌発症リスクを評価するためのバイオマーカーとしての使用において、前記被検者は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）持続陰性化（ＳＶＲ）を達成した被検者、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与中の被検者、及びＮＡＦＬＤを発症した被検者からなる群から選択される少なくとも１種類の被検者とすることができる。
　本発明は、本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法によって、肝癌発症リスクが高いと評価された被検者を肝癌の有無を調べるために肝癌発症リスクが低いと評価された被検者より高い頻度で検査することを含む、層別化された被検者の肝癌スクリーニング方法を提供する。前記肝癌発症の有無は、超音波、造影ＣＴ画像、ＭＲＩ及び／又は肝生検組織の所見に基づいて調べてもかまわない。肝癌発症リスクが高いと評価された被検者については、前記肝癌発症の有無を超音波、造影ＣＴ画像及びＭＲＩの所見に基づいて調べてもかまわない。肝癌発症リスクが低いと評価された被検者については、前記肝癌発症の有無を調べるための検査をしない、あるいは、本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法を含む、血液腫瘍マーカーの検査のみを一定間隔で行うこともできる。ここで血液腫瘍マーカーは、ＧＤＦ１５の他、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡＦＰ－Ｌ３（ＬＣＡ（レンズマメ・レクチン）強結合性分画）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ（protein induced by vitamin K absence or antagonist II）を含むが、これらに限らない。
　本発明は、本発明の肝癌スクリーニング方法によって、肝癌発症リスクが高いと評価された被検者に対して、当該肝癌発症の予防薬を投与することを含む、肝癌の予防方法を提供する。本発明は、本発明の肝癌スクリーニング方法によって肝癌発症リスクが高いと評価された被検者の肝癌の発症を予防するための医薬を提供する。
　本発明のＣ型肝炎についての肝癌スクリーニング方法において、被検者は、２５ｋｇ／ｍ２未満のＢＭＩ値の者に限定することができる。
　本発明によれば、被検者のＧＤＦ１５レベルに基づいて、肝癌発症リスクを高精度で評価することが可能となる。これにより、被検者のうち、肝癌発症リスクに応じて異なる頻度及び／又は内容の検査により肝癌の有無を調べることを含む、層別化された被検者の肝癌スクリーニング方法を実施することができる。
ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出及び検証コホートの症例の詳細を示す表。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートの各時点で採取された保存血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示すピラミッドグラフ。縦軸は、血清ＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）を示す。左のグラフは治療前（Pre Treatment）に採血された血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示し、中央のグラフは治療終了時（End of Treatment）に採血された血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示し、右のグラフはＳＶＲ達成２４週後（Post 24 weeks）に採血された血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示す。アスタリスク（＊）は、図２－１の３つのグラフのそれぞれの間でTurkey Kramer検定によるｐ＜０．０００１の有意差があることを示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者のＤＡＡ治療前の保存肝組織中のＧＤＦ１５のｍＲＮＡレベルと、保存血清中のＧＤＦ１５レベルとの相関を示すグラフ。縦軸は血清中のＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）、横軸はＧＤＦ１５の相対的ｍＲＮＡレベル（arbitrary units、ＡＵ）を表す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の高ＧＤＦ１５群及び低ＧＤＦ１５群の症例の詳細を示す表。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の線維化スコア群ごとの血清中ＧＤＦ１５レベルの分布を示すピラミッドグラフ。縦軸は血清中のＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）を示す。左から、線維化スコア（Ｆ０～Ｆ４）群それぞれの血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示す。アスタリスク（＊）は、図４－１のそれぞれのグラフの間でone-way ANOVA後のTest for linear trend検定によるｐ＜０．０００１の有意差があることを示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の血清中のＧＤＦ１５レベルとＦＩＢ－４インデックス値との相関関係を示すグラフ。縦軸は血清中のＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）、横軸はＦＩＢ－４インデックス値を表す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の血清中ＧＤＦ１５レベルとさまざまなパラメーターとの相関関係を示すグラフ。横軸は血清中のＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）、縦軸は、年齢（Ａ）、ヘモグロビン（Ｂ）、血小板数（Ｃ）、ＡＳＴ（Ｄ）、ＡＬＴ（Ｅ）、γＧＴＰ（Ｆ）、ｅＧＦＲ（Ｇ）、アルブミン（Ｈ）、プロトロンビン時間（Ｉ）、ＡＦＰ（Ｊ）及びＡＬＢＩスコア（Ｋ）を表す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホート症例の詳細を示す表。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートでの肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の治療前（Pre Treatment）、治療終了時（End Of Treatment）及びＳＶＲ達成２４週後（Post 24 weeks）の３つの時点での、肝癌発症の有無による血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示すピラミッドグラフ。縦軸は、血清ＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）を示す。左から、治療前（Pre Treatment）、治療終了時（End Of Treatment）及びＳＶＲ達成２４週後（Post 24 weeks）の３つの時点での、肝癌発症の有（Present）無（Absent）ごとの群の血清中のＧＤＦ１５レベルの分布を示す。アスタリスク（＊）は、図６－２の時点での、肝癌発症の有（Present）無（Absent）のグラフの間でTurkey Kramer検定によるｐ＜０．００５の有意差があることを示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の肝癌発症症例ごとの肝癌発症１年前及び肝癌発症時の血清中のＧＤＦ１５レベルの変動を示すグラフ。縦軸は血清中のＧＤＦ１５レベル（ｐｇ／ｍＬ）、横軸は肝癌発症１年前（-1 year）及び肝癌発症時（End of Observation）を含む観察期間を表す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の高ＧＤＦ１５群及び低ＧＤＦ１５群における累積肝癌発症率を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。“GDF15 HIGH”及び“GDF15 LOW”の矢印は、それぞれ、高ＧＤＦ１５群及び低ＧＤＦ１５群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを指し示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートにおける肝癌発症後のハザード比を示す表。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者のＧＤＦ１５（Ａ）、ＡＦＰ（Ｂ）及びＦＩＢ－４インデックス（Ｃ）の肝癌発症予測のＲＯＣ曲線を示すグラフ。（Ｄ）はＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を表す。（Ｅ）はＧＤＦ１５、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスの肝癌発症予測のＲＯＣ曲線から計算したカットオフ値、感度及び特異度を表す。 Ａは、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高ＡＦＰ群及び低ＡＦＰ群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。Ｂは、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高ＦＩＢ－４インデックス群及び低ＦＩＢ－４インデックス群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。Ａ、Ｂとも、縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。“AFP HIGH”、“AFP LOW”、“FIB4-index HIGH”及び“FIB4-indexLOW”の矢印は、それぞれ、高ＡＦＰ群、低ＡＦＰ群、高ＦＩＢ－４インデックス群及び低ＦＩＢ－４インデックス群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを指し示す。 ＧＤＦ１５、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがそれぞれ高値の場合１点とするスコアリングシステムにより層別化したＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高リスク群（３点）、中リスク群（１－２点）及び低リスク群（０点）の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。“High”、“Middle”及び“Low”の矢印は、それぞれ、高リスク群、中リスク群及び低リスク群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを指し示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の検証コホートの症例の詳細を示す表。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の検証コホートでの累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。 Ａは、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高ＧＤＦ１５群及び低ＧＤＦ１５群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。Ｂは、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高ＡＦＰ群及び低ＡＦＰ群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。Ｃは、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高ＦＩＢ－４インデックス群及び低ＦＩＢ－４インデックス群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。Ａ、Ｂ、Ｃとも、縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。“GDF15 HIGH”、“GDF15 LOW”、“AFP HIGH”、“AFP LOW”、“FIB4-index HIGH”及び“FIB4-index LOW”の矢印は、それぞれ、高ＧＤＦ１５群、低ＧＤＦ１５群、高ＡＦＰ群、低ＡＦＰ群、高ＦＩＢ－４インデックス群及び低ＦＩＢ－４インデックス群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを指し示す。 本発明のスコアリングシステムによるＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における高リスク群（３点）、中リスク群（１－２点）及び低リスク群（０点）の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（月）を表す。“High”、“Middle”及び“Low”の矢印は、それぞれ、高リスク群、中リスク群及び低リスク群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを指し示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートについて、本発明のスコアリングシステムによる高リスク群（２点）、中リスク群（１点）及び低リスク群（０点）の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（週）を表す。“High”、“Middle”及び“Low”の矢印は、それぞれ、高リスク群、中リスク群及び低リスク群の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを指し示す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートについて、既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがともに低値の群におけるＧＤＦ１５レベル高値集団及び低値集団の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（週）を表す。“High”の矢印は、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスはともに低値だが、ＧＤＦ１５レベルが高値の集団の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。“Low”の矢印は、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがともに低値で、かつ、ＧＤＦ１５レベルも低値の集団の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。 ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートについて、既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがともに高値の群におけるＧＤＦ１５レベル高値集団及び低値集団の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。縦軸は累積肝癌発症率、横軸は観察期間（週）を表す。“High”の矢印は、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスはともに高値で、かつ、ＧＤＦ１５レベルも高値の集団の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。“Low”の矢印は、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがともに高値だが、ＧＤＦ１５レベルは低値の集団の累積肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。 基準に沿って選択されたＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例の保存血清の散布図。黒丸は非発癌症例、白丸は発癌症例を表す。縦軸は保存血清中のＧＤＦ１５の濃度（ｎｇ/ｍＬ）を表す。 ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体の患者背景を示す表。 ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体の肝癌の発癌率の経時変化を示すグラフ。縦軸は発癌率、横軸は観察期間（日数）を表す。 ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体の患者背景をＧＤＦ１５の血清濃度の中央値（０．８３３ｎｇ／ｍＬ）によって群分けした表。 ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体の患者背景を肝癌の発癌の有無によって群分けした表。 ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体において、ＧＤＦ１５、Ｆｉｂ４、ＡＦＰ及びＰｌｔについてそれぞれ保存血清ポイントから５年での発癌の有無の経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフである。各グラフの縦軸は感度又は真の陽性度、横軸は偽陽性度（１－特異度）を表し、ＡＵＣはそれぞれのグラフのＲＯＣ曲線下の面積（Area under the curve）を表す。 ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体において、ＧＤＦ１５、Ｆｉｂ４、ＡＦＰ及びＰｌｔについてそれぞれ保存血清ポイントから１０年での発癌の有無の経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフである。各グラフの縦軸は感度又は真の陽性度、横軸は偽陽性度（１－特異度）を表し、ＡＵＣはそれぞれのグラフのＲＯＣ曲線下の面積（Area under the curve）を表す。 ＲＯＣ曲線から算出されるカットオフ値（０．８４５ｎｇ／ｍＬ）を用いた、ＮＵＣ投与中のＢ型肝炎症例コホート全体における肝癌の発症率の経時変化を示すグラフ。 cox 比例ハザードモデルによる、発癌に寄与する因子の単変量/多変量解析の結果を示す表。 ＡＦＰ及びＧＤＦ１５の２種類のマーカーのそれぞれのカットオフ値５ｎｇ/ｍＬ及び０．８４５ｎｇ／ｍＬ以上の症例に１点ずつ得点を与えて得点ごとに症例をグループ分けしてプロットした、肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。 ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のＧＤＦ１５の血清濃度の散布図。黒丸が肝癌非発症例、白丸が肝癌発症例を表す。発症した肝癌６症例中５例は、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であったが、矢印で示した１例は胆管細胞癌（ＣＣＣ）であった。 ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者の患者背景を示す表。 ＮＡＦＬを罹患している患者とＮＡＳＨを罹患している患者とに群分けした患者背景を示す表。 ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者コホート全体での肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。 肝線維化についてBrunt Stageの０～４型に群分けした症例ごとのＧＤＦ１５の血清濃度の散布図。 ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のＧＤＦ１５の血清濃度及びＦｉｂ－４インデックスの相関を調べた散布図。 ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のさまざまな属性、血液マーカー、Ｆｉｂ－４インデックス等のハザード比を示す表。 ＧＤＦ１５及びＦｉｂ－４インデックスについてそれぞれ保存血清ポイントから５年での発癌の有無についての経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフ。 ２．００ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。 １．３５ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。 大垣市民病院１８３例の患者背景 観察期間を延長した実施例３のコホート１７０例の患者背景 大垣市民病院１８３例のＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者の保存血清の散布図。黒丸は非発癌症例、灰色の丸は発癌症例を表す。縦軸は保存血清中のＧＤＦ１５の濃度（ｎｇ/ｍＬ）を表す。発症した肝癌９症例は、全て原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であった。 観察期間を延長した実施例３のコホート１７０例の保存血清の散布図。黒丸は非発癌症例、灰色の丸は発癌症例を表す。縦軸は保存血清中のＧＤＦ１５の濃度（ｎｇ/ｍＬ）を表す。発症した肝癌８症例中７例は、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であったが、矢印で示した１例は胆管細胞癌（ＣＣＣ）であった。 大垣市民病院１８３例の肝癌発症率。 観察期間を延長した実施例３のコホートの肝癌発症率。 大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートの合計３５３例それぞれ保存血清ポイントから５年での発癌の有無についての経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフ。 大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートの合計３５３例それぞれ保存血清ポイントから７年での発癌の有無についての経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフ。 大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートの合計３５３例について２．００ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。 大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートの合計３５３例について１．７４ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする肝癌発症率の経時変化を示すグラフ。
定義
　本発明において、ＧＤＦ１５とは、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ベータスーパーファミリーに属するサイトカインで、全長アミノ酸３０８個からなるタンパク質である。胎盤に高発現するが、胎盤以外の正常組織では発現は弱い。炎症の際に急激に上向き調節される。ヒトＧＤＦ１５タンパク質のアミノ酸配列、及び、ＧＤＦ１５ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれ、NCBI Reference Sequence: NP_004855.2及びNM_004864.4として公表されており、自体公知の方法により単離することができる。
　本発明において、ＧＤＦ１５レベルとは、ＧＤＦ１５タンパク質及び／又はＧＤＦ１５転写産物のレベルを指す。ＧＤＦ１５タンパク質及びＧＤＦ１５転写産物のレベルとは、一定量の試料中の、それぞれ、ＧＤＦ１５タンパク質及びＧＤＦ１５ｍＲＮＡの含有量を表す。本発明では、ＧＤＦ１５タンパク質及びＧＤＦ１５転写産物の生物種は被検者の生物種と同一である。ＧＤＦ１５タンパク質及びＧＤＦ１５転写産物のレベルは、後述の測定手法に応じて当業者に公知の様式で表すことができ、例えば、ＧＤＦ１５タンパク質及びＧＤＦ１５転写産物の濃度として表現してもよく、また標準試料の測定値を基準とする相対値として表現してもよい。
　ＧＤＦ１５タンパク質レベルの測定方法には、ＧＤＦ１５タンパク質に対して特異的な抗体に基づく免疫学的手法を使う。ＧＤＦ１５タンパク質レベルの測定には、抗体アレイ、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ（Engvall E, Methods in Enzymol. 1980;70:419-439.）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、免疫比ろう法等を用いることができる。しかし、感度及び実施しやすさの観点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡの詳細は実施例で説明する。
　ＧＤＦ１５転写産物レベルの測定方法には、ノーザンブロッティング法、ＲＮａｓｅプロテクション・アッセイ法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）（Weis JH et al.,Trends in Genetics 1992;8:263-264.）；定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法（Held CA et al.,Genome Research 1996;6:986-994.）等を用いることができる。しかし、感度及び実施しやすさの観点から定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法が好ましい。定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法の詳細は実施例で説明する。
　本発明における被検者は、任意の哺乳動物であってよいが、好ましくは慢性肝疾患を有する哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類及びウサギなどの実験動物、イヌ及びネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジなどの家畜、サル、オランウータン及びチンパンジーなどの霊長類並びにヒトなどが挙げられ、特にヒトが好ましい。ここで慢性肝疾患は、ウイルス性肝炎及び脂肪性肝疾患を含むが、これらに限らない。ウイルス性肝炎は、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎を含むが、これらに限らない。脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び二次性脂肪肝を含むが、これらに限らない。ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を含むが、これらに限らない。本発明における被検者は、肝癌発症のリスクを評価する必要のある、慢性肝疾患患者を含む。本発明の被検者は、Ｃ型肝炎におけるＳＶＲ後の被検者、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与下の被検者、ＮＡＳＨを罹患している被検者を含むが、これらに限定されない。
　本発明において、慢性肝疾患と、慢性肝疾患からの肝癌発症の有無を調べる検査とは、例えば、非特許文献３及び４に詳細に説明されている。
　本発明において、ＨＣＶの持続陰性化（ＳＶＲ）及びＳＶＲを達成するための治療、ＳＶＲ達成後の肝癌発症の有無を調べる検査については、それぞれ、Ｃ型肝炎治療ガイドライン（日本肝臓学会肝炎診療ガイドライン作成委員会編、第８版、２０２０年７月発行（https://www.jsh.or.jp/lib/files/medical/guidelines/jsh_guidlines/C_v8_20201005.pdf）、同英語版（Hepatology Research 2020; 50: 791-816.））及び肝癌診療ガイドライン（日本肝臓学会編、２０１７年版、２０１７年１０月発行（https://www.jsh.or.jp/medical/guidelines/jsh_guidlines/medical/examination_jp_2017.html）、同英語版（https://www.jsh.or.jp/English/examination_en/guidelines_hepatocellular_carcinoma_2017.html））、Ghany MG,及びMorgan TR.（Hepatitis C Guidance 2019 Update: American Association for the Study of Liver Diseases-Infectious Diseases Society of America Recommendations for Testing, Managing, and Treating Hepatitis C Virus Infection. Hepatology 2020;71:686-721.）、Clinical Practice Guidelines Panel （EASL recommendations on treatment of hepatitis C: Final update of the series. J Hepatol 2020;73:1170-1218.）を含むが、これらに限らない、権威ある肝炎及び／又は肝癌の専門家による定義に従う。
　本発明において、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与による治療については、日本肝臓学会編Ｂ型肝炎治療ガイドライン（第３．４版）２０２１年５月（https://www.jsh.or.jp/lib/files/medical/guidelines/jsh_guidlines/B_v3.4.pdf）、同英語版（Hepatology Research, 2020; 50: 892-923.）を含むが、これらに限らない、権威ある肝炎の専門家による定義に従う。
　本発明において、脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）については、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ診療ガイドライン２０２０（日本消化器病学会・日本肝臓学会編、改訂第２版、２０２０年１１月発行、南江堂（https://www.jsge.or.jp/guideline/guideline/pdf/nafldnash2020.pdf））、同英語版（Tokushige, K. et al. HepatologyResearch.2021;51:1013-1025.及びTokushige, K. et al. Journal of Gastroenterology 2021;56: 951-963.）を含むが、これらに限らない、権威ある肝炎の専門家による定義に従う。
　本発明において、ウイルス性慢性肝炎、脂肪性肝疾患その他の肝疾患からの肝癌発症の有無を調べる検査については、肝癌診療ガイドライン（日本肝臓学会編、２０１７年版、前出）を含むが、これらに限らない、権威ある肝癌の専門家による定義に従う。
　本発明において肝癌発症リスクを判定するとは、一定の基準に照らした評価、検査を行なうことを含む意である。具体的には、ＨＣＶについてＳＶＲ達成後、肝癌を発症していない被検者、ＨＢＶについてＮＵＣ投与による治療中で肝癌を発症していない被検者、及びＮＡＦＬ、ＮＡＳＨその他の脂肪性肝疾患を罹患しているが肝癌を発症していない被検者を含むが、これらに限定されない、慢性肝疾患を罹患しているが肝癌を発症していない被検者が、将来、肝癌を発症するおそれがあるか否かを判定することを意味し、肝癌発症リスクを有するか否かを判定すること、及びその発症リスクの高低を判定することが含まれる。本発明における肝癌発症リスクの判定は、特に、肝癌発症リスクの程度に応じて被検者を層別化して、肝癌スクリーニング検査のリソースを、肝癌発症リスクの低い被検者より肝癌発症リスクの高い被検者に傾斜配分することを１つの目的とする。
　本発明において肝癌発症リスクは、被検者のＧＤＦ１５レベルと関連付けられる。具体的には、被検者のＧＤＦ１５レベルが予め設定したカットオフ値と比較して、高いか、低いかが、被検者の肝癌発症リスクが高いか低いかの指標となる。
　本発明におけるカットオフ値は、慢性肝疾患患者の評価用集団について、個々のＧＤＦ１５レベルと、肝癌発症の有無とについて追跡したデータベースを用意して、肝癌発症者と肝癌非発症者とのＧＤＦ１５レベルのデータの統計解析又はＲＯＣ解析に基づいて予め設定される。前記カットオフ値を統計解析により決定する場合には、例えば、前記評価用集団のＧＤＦ１５レベルのデータの、中央値、算術平均その他の平均値を用いることができる。前記カットオフ値をＲＯＣ解析により決定する場合には、例えば、ＲＯＣ解析に基づくカットオフ値は、ＲＯＣ曲線グラフの縦軸（感度又は真の陽性度）が１．０で、横軸（１－特異度）が０．０の点との距離が最小となるＲＯＣ曲線上の点のＧＤＦ１５レベルとすることができ、あるいは、ＲＯＣ曲線のYoudenインデックス（Cancer 1950;3:32-35.）から導かれるカットオフ値とすることができる。慢性肝疾患患者の評価用集団のデータベースは、一度確立した後は全く変更せずに、本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価する方法におけるカットオフ値の設定に用いてもよい。あるいは、本発明の被検者を含む、新たな慢性肝疾患患者を前記評価用集団に組み込んで、慢性肝疾患患者の評価用集団のデータベースを適宜更新しながら、本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価する方法におけるカットオフ値の設定に用いてもよい。本願明細書の実施例で説明するとおり、本件の発明者らの観察研究でＲＯＣ曲線によって決定した肝癌発症予測のカットオフ値は、本件の発明者らの観察研究での被検者の血清中のＧＤＦ１５レベルの中央値の９０％以上、かつ、１１０％以内の数値範囲に含まれていた。そこで、前記カットオフ値として前記中央値を採用してもかまわない。
　本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法において、前記血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルのカットオフ値は、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者について約１４００ｐｇ／ｍＬとすることができる。ＧＤＦ１５のカットオフ値はＮＵＣ投与中のＢ型肝炎患者について約８４５ｐｇ／ｍＬとすることができる。ＧＤＦ１５のカットオフ値はＮＡＦＬＤ患者について約２０００ｐｇ／ｍＬとすることができる。本発明の方法において、前記肝癌発症リスクを判定する工程では、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値を更に組み合わせて判定することができる。本発明の方法において、前記ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値は、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者についてそれぞれ、約５ｎｇ／ｍＬ及び約３．２５であってもよい。
　以下では、本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法は、被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルに基づく方法と、被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルに基づく方法とにわけて説明する。
１．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法
　本発明の１つの実施態様は、慢性肝疾患を罹患した被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法であって、
（１）前記被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルを測定する工程と、
（２）前記ＧＤＦ１５タンパク質レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程と
を含む、方法を提供する。
　被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルは、被検者の血清又は血漿サンプルを用いて測定される。被検者の血漿及び血清は、被検者から採取した末梢血試料から自体公知の方法で調製することができる。これらはＧＤＦ１５タンパク質レベルの測定手段に応じて公知の緩衝液等を用いて適宜希釈してもよく、例えばＧＤＦ１５タンパク質のヒト酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キット（#DGD150, R&D systems, Minneapolis, MN）等に付属の希釈緩衝液等を用いて７５～１００倍あるいはそれ以上に希釈してもよい。採血から測定まで時間がかかる場合は、血漿及び／又は血清を凍結保存しておいたものを測定することが可能である。
　工程（１）におけるＧＤＦ１５タンパク質のレベルは、ＧＤＦ１５タンパク質を特異的に認識する抗体（即ち、ＧＤＦ１５特異的抗体）を用いて、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、抗体アレイ、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、免疫比ろう法等を挙げられるが、感度及び実施しやすさの観点からＥＬＩＳＡが好ましい。
　抗体による抗原Ｘの「特異的な認識」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Ｘに対するアフィニティが、抗原Ｘ以外の抗原に対するアフィニティよりも強いことを意味する。本明細書において、抗原Ｘを特異的に認識する抗体を「抗Ｘ抗体」又は「Ｘ特異的抗体」と略記する場合がある。
　ＧＤＦ１５特異的抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またこれらの結合性断片であってもよい。
　前記抗体は、直接的又は間接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例、ＦＩＴＣ、ローダミン）、放射性物質（例、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、着色粒子（例、金属コロイド粒子、着色ラテックス）、ビオチンなどが挙げられる。
　また、前記抗体は、他に何も結合していない可溶性の状態で用いることも可能であるが、固相に結合していてもよい。「固相」としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、ニトロセルロースメンブレンなどの吸水性基材、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦ膜）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）、金属膜（例、金膜）などが挙げられる。なかでも、プレート、ビーズ、クロマトグラフィー用担体及びメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。上記結合としては、共有結合、イオン結合、物理的吸着などが挙げられ、特に限定されないが、共有結合及び／又は物理的吸着が十分な結合強度を得られるため好ましい。また固相への結合は、固相に直接結合してもよいし、自体公知の物質を利用して間接的に固相に結合していてもよい。また、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や牛ミルク蛋白などのリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記ＢＳＡや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることが一般に行われる。
　ＧＤＦ１５特異的抗体と、被験者由来の血漿又は血清との接触は、これらの抗体と血漿中又は血清中のＧＤＦ１５が相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法などは特に限定されない。接触は、例えば抗体が固相化されたプレートに血漿又は血清を添加することでなされ得る。また例えば、血漿中又は血清中のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの手段によって分離し、メンブレンに移して固定した後、抗体と接触させることによってもなされ得る。
　なお、かかる接触を保つ時間は、前記抗体と、被検者由来の血漿又は血清中に含まれるＧＤＦ１５とが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常、数秒～十数時間である。また、接触を行なう温度条件としては、通常４℃～５０℃であり、４℃～３７℃が好ましく、１５℃～３０℃程度の室温が最も好ましい。さらに、反応を行なうｐＨ条件は、５．０～９．０が好ましく、特に６．０～８．０の中性域が好ましい。
　ＧＤＦ１５タンパク質のレベルの測定においては、市販のＧＤＦ１５タンパク質を用いて、その希釈系列のＥＬＩＳＡ結果を蛍光、発色その他の反応で定量することにより、容易にＧＤＦ１５タンパク質の濃度の絶対値を、例えば、ｐｇ／ｍＬ単位で測定することができる。
　次に、工程（２）では、工程（１）において測定した被検者の血漿中及び／又は血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルと肝癌発症リスクとを関連付ける。血漿中及び／又は血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルと肝癌発症リスクとを関連付けるとは、被検者のデータが肝癌発症リスクを示唆（又は指示）するものであるか否かを決定することをいう。
　被検者のデータと肝癌発症リスクとの関連付けは、通常、被検者のデータと、被検者以外の慢性肝疾患の患者のデータを比較して行う。本発明の実施例に示すとおり、ＧＤＦ１５タンパク質のレベルが、予め設定したカットオフ値より高い群（高ＧＤＦ１５群）は予め設定したカットオフ値より低い群（低ＧＤＦ１５群）より肝癌発症リスクが高いことが明らかになった。これにより、被検者の肝癌発症リスクを評価することが可能となる。
　本発明の肝癌発症リスクを評価するための方法は、ＧＤＦ１５タンパク質レベルのカットオフ値により肝癌発症リスクを判定する工程を含んでもよく、ここで前記被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルが前記カットオフ値以上であれば前記被検者の肝癌発症リスクは高く、前記被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルが前記カットオフ値未満であれば前記被検者の肝癌発症リスクは低いとすることができる。さらに、前記カットオフ値は前記被検者の集団のＧＤＦ１５タンパク質レベルの中央値とすることができる。
　本明細書において数値について修飾する連体詞「約」は、当該数値の９０％以上、かつ、１１０％以内の数値範囲であることを意味する。例えば、「１４００ｐｇ／ｍＬ」とは、１２６０ｐｇ／ｍＬ以上１５４０ｐｇ／ｍＬ以内の数値範囲を指す。
　本発明の方法において、ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者における血清中のＧＤＦ１５タンパク質レベルの中央値として決定したカットオフ値は約１４００ｐｇ／ｍＬであってもかまわない。本願明細書の実施例では、前記ＲＯＣ曲線によってYoudenインデックスが最大値となるＧＤＦ１５の血清濃度として決定したＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者におけるカットオフ値は１４４８ｐｇ／ｍＬで、前記中央値として決定したカットオフ値１４００ｐｇ／ｍＬの９０％以上、かつ、１１０％以内の数値範囲内に含まれるからである。
　本発明の方法において、前記肝癌発症リスクを判定する工程では、ＡＦＰ及び／又はＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値を更に組み合わせて判定することができる。ＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者については、ＧＤＦ１５に加えて、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスを併用して判定することができる。ＮＵＣによる治療中のＢ型肝炎患者については、ＧＤＦ１５に加えて、ＡＦＰを併用して判定することができる。従来から、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスをマーカーとして用いるＤＡＡ治療後ＳＶＲ達成した被検者の肝癌発症リスクの層別化方法が知られていたからである。当業者に知られた従来技術では、前記ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値は、それぞれ、５ｎｇ／ｍＬ及び３．２５が用いられてきた。
２．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法
　本発明の１つの実施態様は、慢性肝疾患を罹患した被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法であって、
（１）前記被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルを測定する工程と、
（２）前記ＧＤＦ１５転写産物レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程と
を含む、方法を提供する。
　被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルは、被検者の生体組織、血清又は血漿サンプルを用いて測定される。前記生体組織は、例えば、経皮的生検（針生検）、内視鏡下生検、外科的生検を含むが、これらに限定されない方法によって被検者の生体組織の一部を採取して得ることができる。本発明の被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法においては、生体組織は、肝組織が好ましい。血清又は血漿サンプルに含まれる循環ＧＤＦ１５転写産物又はその一部を測定することもできる。被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルを測定するためには、常法に従い、ＲＮＡを生体試料から単離することができる。ＲＮＡを抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知であり、Sambrook, J及びRussell, DWによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual（3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）等の分子生物学の実験プロトコール書に開示されている。具体的には、ＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen, Hulsterweg, Germany）などの市販の精製キットを用いて、製造業者の指示に従ってＲＮＡ単離を行うことができる。
　単離したＲＮＡからＧＤＦ１５転写産物レベルを測定するためには、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲ法等を用いることができる。ＲＮＡからＧＤＦ１５特異的プライマーを用いて逆転写反応で相補ＤＮＡを調製し、該相補ＤＮＡを鋳型として、ＧＤＦ１５特異的ＰＣＲプライマー対及び蛍光標識プローブを含む反応液をリアルタイムＰＣＲ装置で増幅し蛍光を定量することができる。具体的には、Thunderbird qPCR Master Mix（東洋紡、大阪、日本）及びTaqManプローブ（ヒトＧＤＦ１５、Hs00171132_m1, human beta actin Hs 9999902_m3, Applied Biosystems, Waltham, MA）を用いる定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により解析することができる。ＧＤＦ１５転写産物レベルの測定において、予め合成したＧＤＦ１５のｍＲＮＡ又はその一部の精製ＲＮＡの濃度を測定して、その希釈系列をリアルタイムＰＣＲ装置で増幅し蛍光を定量することにより、ＲＮＡ中のＧＤＦ１５転写産物の濃度の絶対値を定量することができる。代替的には、同一濃度の対照ＲＮＡ中のＧＤＦ１５転写産物の測定値に対する測定対象の被検者サンプル由来のＲＮＡ中のＧＤＦ１５転写産物の測定値の相対値を定量することができる。ＧＤＦ１５転写産物の測定値の相対値の場合には、任意単位（Arbitrary Units, AU）を単位とすることができる。
　工程（１）に用いるＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及びプローブは、NCBI Reference Sequence: NM_004864.4として公表されているヒトＧＤＦ１５ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて合成することができる。プライマー及びプローブの塩基長は特に限定されない。前記プライマーは、前記ヒトＧＤＦ１５ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の一部のヌクレオチド配列と、前記ヒトＧＤＦ１５ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の一部のヌクレオチド配列とのうち一方をフォワードプライマーに含み、他方をリバースプライマーに含むことができる。プライマーの塩基長はそれぞれヌクレオチド１０～５０個、好ましくは１５～３０個とすることができる。前記プローブは、前記ヒトＧＤＦ１５ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の一部を含み、プローブの塩基長はヌクレオチド１０個から前記ヒトＧＤＦ１５ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全長までの範囲、好ましくは、ヌクレオチド２０～１５０個とすることができる。
　工程（１）に用いるＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及びプローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡ等の天然核酸の他、必要に応じて天然核酸と化学修飾核酸や擬似核酸を組み合わせることもできる。化学修飾核酸や擬似核酸には、例えば、PNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等が挙げられる。また、プライマー及びプローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質、又は放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）等の標識物質、あるいはビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質を用いて標識又は修飾してもよい。標識物質は、限定されず、市販のものを用いることができる。例えば、蛍光物質であればFITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等を用いることができる。クエンチャー物質であれば、AMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3等を用いることができる。プライマー及びプローブにおける標識物質の標識位置は、その修飾物質の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよい。一般的には、5’又は3’末端部に修飾されることが多い。また、１本のプライマー及びプローブ分子が１種類以上の標識物質で標識されていてもかまわない。プライマー及びプローブのヌクレオチド配列の設計、標識物質の選択は公知であり、Sambrook, J及びRussell, DWによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual（3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）等の分子生物学の実験プロトコール書に開示されている。
　次に、工程（２）では、工程（１）において測定した被検者のＧＤＦ１５転写産物のレベルと肝癌発症リスクとを関連付ける。ＧＤＦ１５転写産物のレベルと肝癌発症リスクとを関連付けるとは、被検者のデータが肝癌発症リスクを示唆（又は指示）するものであるか否かを決定することをいう。
　被検者のデータと肝癌発症リスクとの関連付けは、通常、被検者のデータと、被検者以外の慢性肝疾患を罹患した患者のデータを比較して行う。本発明の実施例に示すとおり、ＧＤＦ１５転写産物のレベルが、予め設定したカットオフ値より高い群（高ＧＤＦ１５群）は予め設定したカットオフ値より低い群（低ＧＤＦ１５群）より肝癌発症リスクが高いことが明らかになった。これにより、被検者の肝癌発症リスクを評価することが可能となる。
　本発明の肝癌発症リスクを評価するための方法は、ＧＤＦ１５転写産物レベルのカットオフ値により肝癌発症リスクを判定する工程を含んでもよく、ここで前記被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルが前記カットオフ値以上であれば前記被検者の肝癌発症リスクは高く、前記被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルが前記カットオフ値未満であれば前記被検者の肝癌発症リスクは低いとすることができる。さらに、前記カットオフ値は前記被検者の集団のＧＤＦ１５転写産物レベルの中央値とすることができる。
　本発明の肝癌発症リスクを評価するための方法は、ＧＤＦ１５転写産物レベルのカットオフ値により肝癌発症リスクを判定する工程を含んでもよく、ここで前記被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルが前記カットオフ値以上であれば前記被検者の肝癌発症リスクが高く、前記被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルが前記カットオフ値未満であれば前記被検者の肝癌発症リスクが低いとすることができる。さらに、前記カットオフ値は前記被検者の集団のＧＤＦ１５転写産物レベルの中央値とすることができる。
　本発明の方法において、前記肝癌発症リスクを判定する工程では、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値を更に組み合わせて判定することができる。従来から、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスをマーカーとして用いるＤＡＡ治療後ＳＶＲを達成した被検者の肝癌発症リスクの層別化方法が知られていたからである。当業者に知られた従来技術では、前記ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値は、それぞれ、５ｎｇ／ｍＬ及び３．２５が用いられてきた。
３．本発明の方法に使用する、被検者のＧＤＦ１５レベルを測定するためのキット
　本発明は、本発明の方法に使用する、被検者のＧＤＦ１５レベルを測定するためのキットを提供する。本発明のキットは、抗ＧＤＦ１５特異的抗体、及び／又は、ＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及びプローブを含む。本発明のキットに含まれる抗ＧＤＦ１５特異的抗体については、本明細書の「１．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法」に説明するとおりである。本発明のキットに含まれるＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及びプローブについては、本明細書の「２．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法」のセクションに説明するとおりである。
４．本発明の方法によって慢性肝疾患を罹患した被検者の肝癌発症リスクを評価するための診断薬
　本発明は、本発明の方法によって慢性肝疾患を罹患した被検者の肝癌発症リスクを評価するための診断薬を提供する。本発明の診断薬は、抗ＧＤＦ１５抗体、及び／又は、ＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及び／又はプローブを含む。本発明の診断薬に含まれる抗ＧＤＦ１５特異的抗体については、本明細書の「１．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法」に説明するとおりである。本発明の診断薬に含まれるＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対及び／又はプローブについては、本明細書の「２．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法」のセクションに説明するとおりである。
５．ＧＤＦ１５の被検者の肝癌発症リスクを評価するためのバイオマーカーとしての使用
　本発明は、ＧＤＦ１５の被検者の肝癌発症リスクを評価するためのバイオマーカーとしての使用を提供する。本発明のＧＤＦ１５の使用に含まれる工程については、本明細書の「１．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５タンパク質レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法」、及び、「２．慢性肝疾患を罹患した被検者のＧＤＦ１５転写産物レベルに基づいて該被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法」のセクションに説明するとおりである。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　実施例１　Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）持続陰性化（ＳＶＲ）を達成した被検者の肝癌発症リスク評価
Ａ．材料及び方法
（１）調査対象の症例集団
　Osaka Liver Forumに参加する２６の医療機関のＣ型肝炎症例がベースライン時に登録され、日本肝臓学会のガイドライン（Hepatol Res 2020;50:791-816.）に準拠してインターフェロンフリーのＤＡＡ治療を受けた。Ｂ型肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスの重複感染、非代償性肝硬変、又は、他の肝疾患（自己免疫性肝炎又は原発性胆汁性胆管炎等）の合併症例、肝移植後症例、又は、２０歳未満の症例は登録から除外した。２０１７年１２月までに合計２８４０名のＣ型肝炎症例が登録され、ＤＡＡ治療を終了した。前記２８４０名の症例のうち、ＳＶＲを達成しなかった症例、ベースライン時の血清が入手不可能な症例、及び、肝癌治療歴のある症例を除いた残りの２０施設１６０９名の症例が本発明の対象となった。このうち８２３名の症例はＤＡＡ治療前に肝生検を実施していた。その組織学的解析はＭｅｔａｖｉｒスコアにより行われた。
（２）臨床研究審査
　本発明に参加する症例全員がインフォームドコンセント書面を提出した。本発明のデザインはヘルシンキ宣言を遵守する。本発明の患者情報及び試料の収集プロトコールは大阪大学附属病院臨床研究倫理審査委員会および各施設の倫理委員会で承認され（IRB 14148，14419，15080，15325，16314，16494，12449）、解析のプロトコールは大阪大学附属病院治験審査委員会で承認された（IRB No.17032）。
（３）抗ウイルス治療及びＳＶＲ
　ＤＡＡ治療は、asunaprevir及びdaclatasvir２４週間、sofosbuvir及びledipasvir１２週間、ombitasvir及び paritaprevir、ritonavir併用１２週間、sofosbuvir及びribavirin１２週間、elbasvir及び grazoprevir１２週間のプロトコールで実施した。本発明においてＳＶＲとは、治療終了２４週間後にＨＣＶのＲＮＡレベルが検出不能であることをいう。症例全員が、ＨＣＶ慢性感染症の治療に関する前記日本肝臓学会のガイドラインに準拠して処置された。
（４）フォローアップ及び肝癌サーベイランス
　ＤＡＡ治療開始前の症例は全員が超音波、ＣＴ及び／又はＭＲＩ検査を受診し、肝癌発症症例を除外した。ＤＡＡ治療中の症例は血液学、生化学及びウイルス学的検査を含む血液検査を２週ごとに受けた。治療後の症例は超音波及び／又はＣＴ／ＭＲＩを使う肝癌サーベイランスを６カ月ごとに行った。ＥＡＳＬ－ＥＯＲＴＣ（European Association for the Study of the Liver - European Organisation for Research and Treatment of Cancer）、及び、ＡＡＳＬＤ（American Association for the Study of Liver Diseases）の推奨に従い、典型的な造影ＣＴ画像及び／又はＭＲＩにより診断された（J Hepatol 2012;56:908-943.及びHepatology 2018;67:358-380.）。画像が肝癌の診断に限界がある場合には、腫瘍の標的生検が行われ、組織学的に診断された。フォローアップ開始日はＤＡＡ治療終了日である。エンドポイントは、肝癌が発生した日、又は、最終フォローアップの肝癌サーベイランス画像検査の日とした。全生存率のエンドポイントは、すべての原因で死亡した日、または最後のフォローアップを行った日とした。
（５）血清検査
　登録された症例の血清は、プロスペクティブ・スタディ・プロトコルで決められた時点で、大阪大学の－８０℃フリーザーに保管された。血清中のＧＤＦ１５濃度は、メーカーのプロトコールに従って、ヒト酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キット（#DGD150, R&D systems, Minneapolis, MN）を用いて調べた。吸光度はVarioscan LUX（Thermo Scientific, Waltham, MA）で調べた。
（６）ｍＲＮＡ発現解析
　肝組織ＲＮＡはＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen, Hulsterweg, Germany）により抽出され、相補ＤＮＡに逆転写された。メッセンジャーＲＮＡ発現は、Thunderbird qPCR Master Mix（東洋紡、大阪、日本）及びTaqManプローブ（ヒトＧＤＦ１５、Hs00171132_m1, human beta actin Hs 9999902_m3, Applied Biosystems, Waltham, MA）を用いる定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により解析された。標的遺伝子発現はベータ－アクチンで正規化された。
（７）統計解析
　パラメトリック及び非パラメトリック値の比較のための統計解析は、それぞれ、Student t検定及びMann-Whitney U検定で行った。one-way ANOVAと、その後のTurkey-Kramerの事後検定またはKruskal-Wallis検定が、それぞれ、パラメトリック及び非パラメトリック多重比較のために実施された。肝癌発症率の解析には、ＤＡＡ終了日を指標とし、肝癌発症、死亡、または２０２０年１２月３１日以前の肝癌サーベイランスの最終日のいずれか早い方まで症例を追跡し、Kaplan-Meier曲線を示した。2群間の肝癌発症率の比較にはlog-rank検定を用いた。肝癌予測の解析にはロジスティック回帰分析を、肝癌発症リスクの比較にはCox比例ハザードモデルをそれぞれ用いた。解析にはPrism ver 8.4.2 for Windows（Graph Pad PRISM RRID; SCR_014242）を使用した。
Ｂ．結果
（１）ＤＡＡ治療後肝癌発症症例は血清ＧＤＦ１５レベルが肝癌非発症症例より高かった。
　肝癌治療歴のない症例が，治療終了時及び治療終了後２４週の両方の時点の保存血清が存在する導出（Derivation）コホートと、いずれかの時点の保存血清が存在しない検証（Varidation）コホートとに２分された。導出及び検証コホートの症例の詳細を図１に示す。
　導出コホートでは、治療前（Ｐｒｅ又はPre Treatment）、治療終了時（ＥＯＴ）ＳＶＲ達成２４週後（ｐ２４ｗ又はPost 24 weeks）の３つの時点での保存血清が存在する。該３つの時点の保存血清中のＧＤＦ１５レベルを解析した結果、ＤＡＡ治療後の血清ＧＤＦ１５レベルは、治療前より低下した（図２－１）。なお、ＤＡＡ治療前の肝組織が凍結保存されていた５５症例では、血清中のＧＤＦ１５レベルと肝におけるＧＤＦ１５の発現との間に弱い相関関係が認められた（図２－２）。
　治療前の血清中ＧＤＦ１５レベルの中央値である１４００ｐｇ／ｍＬで症例を２群に分割した。図３に高ＧＤＦ１５群及び低ＧＤＦ１５群の症例の詳細を示すとおり、治療前高ＧＤＦ１５群は、治療前低ＧＤＦ１５群より、高齢で、血小板数が少なく、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、トリグリセリド、空腹時血糖、ＨｂＡ１ｃ、ＡＦＰ、ＦＩＢ－４インデックス及びＡＬＢＩスコアが高く、ＨＣＶのＲＮＡレベル、ヘモグロビン、ｅＧＦＲ及びアルブミンが低かった。血清中ＧＤＦ１５レベルは線維化スコアとの相関関係が認められた（図４－１）。血清中ＧＤＦ１５レベルはＦＩＢ－４インデックス値との相関関係が認められた（図４－２）。図４－３に示すとおり、血清中ＧＤＦ１５レベルは、高齢（図４－３Ａ）、高ＡＳＴ（図４－３Ｄ）、低ｅＧＦＲ（図４－３Ｇ）、低アルブミン（図４－３Ｈ）及び高ＡＬＢＩスコア（図４－３Ｋ）とも相関関係が認められた。
　導出コホートでは、本発明の観察期間内にＤＡＡ治療後に肝癌を発症したのは４９症例であった。その詳細を図５に示す。導出コホートでの肝癌発症率は、１年間で１．５９％、２年間で２．８５％、そして、３年間で５．０２％であった（図６－１）。治療後肝癌発症症例は、、治療前（Pre Treatment）、治療終了時（End Of Treatment）及びＳＶＲ達成２４週後（Post 24 weeks）の３つの時点のいずれにおいても、血清ＧＤＦ１５レベルが治療後肝癌非発症症例より高かった（図６－２）。肝癌発症時のＧＤＦ１５レベルは、肝癌発症１年前のＧＤＦ１５レベルと比べて有意な変化は認められなかった（図６－３）。このことは、血清ＧＤＦ１５レベルが、ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ２のような腫瘍マーカーとは異なり、各症例のその時点での肝疾患の重篤性を反映している可能性を示唆する。
　１、２及び３年間の累積肝癌発症率は、高ＧＤＦ１５群では、それぞれ、２．８０％、４．４４％及び８．３１％で、低ＧＤＦ１５群では、それぞれ、０．４７％、１．１２％及び１．９３％であった。１、２及び３年間の累積肝癌発症率は、低ＧＤＦ１５群が高ＧＤＦ１５群より有意に低かった（図６－４）。
（２）血清ＧＤＦ１５レベルはＤＡＡ治療後の肝癌発症を予測する新規バイオマーカーの可能性がある。
　肝癌発症を予測するバイオマーカーとしての治療前の血清ＧＤＦ１５レベルを検討するために、肝癌発症に関連する治療前の変数をCox Hazardモデルによって解析した。ＦＩＢ－４インデックスが３．２５を超える（＞３．２５）症例が、過去の知見（Gastroenterology 2017;153:996-1005.e1001.、及び、Hepatology 2007;46:32-36.）に基づいて肝線維化進行症例と見なされた。他の変数は、中央値又は過去の知見（Clin Gastroenterol Hepatol 2014;12:1186-1195.）に基づいて２つの群に割り付けられた。単変量解析により、高齢、低血小板、高ＡＳＴ、高ＡＬＴ、低アルブミン、低プロトロンビン活性、高ＡＦＰ、高血清ＧＤＦ１５、高ＦＩＢ－４インデックス及び高ＡＬＢＩスコアは肝癌発症リスクの増大との関連が認められた（図７）。
　性別と、腫瘍マーカーとしてのＡＦＰと、ＧＤＦ１５レベルと、年齢、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び血小板により計算される線維化の進行度としてのＦＩＢ－４インデックスと、アルブミン及びビリルビンにより計算されるＡＬＢＩスコアというパラメーターを多変量Cox回帰モデルに選択した。これらのパラメーターのうち、ＡＦＰ（J Med Virol 2020;92:3507-3515.及びJ Hepatol 2017;67:933-939.）、ＦＩＢ－４インデックス（Gastroenterology 2017;153:996-1005.e1001.、J Med Virol 2020;92:3507-3515.及びJ Hepatol 2017;68:25-32.）及びＡＬＢＩスコア（Dig Liver Dis 2019;51:681-688.）はＨＣＶ排除後の肝癌のリスク因子であることが既知である。高ＧＤＦ１５値（HR 2.52 95% CI 1.17-6.09）、高ＡＦＰ（HR 2.26 95% CI 1.16-4.69）及び高ＦＩＢ－４インデックス（HR 2.40 95%CI 1.18-5.24）は、独立に肝癌発症リスク増大と関連していた（図７）。ＡＦＰ、ＦＩＢ－４インデックス及びＧＤＦ１５の間で肝癌発症の予測力に有意な差は認められなかった（図８）。累積肝癌発症率は、高ＡＦＰ群又は高ＦＩＢ－４インデックス群が３年間で８－９％であり、低ＡＦＰ群又は低ＦＩＢ－４インデックス群が３年間で２－３％であった（図９Ａ及びＢ）。
　ＧＤＦ１５、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスの肝癌発症予測のカットオフ値をYoudenインデックス（Cancer 1950;3:32-35.）でのＲＯＣ曲線によって決定すると、血清ＧＤＦ１５、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値は、それぞれ、１４４８ｐｇ／ｍＬ、６．０２０ｎｇ／ｍＬ及び３．０２５であった（図８Ｅ）。これらのカットオフ値は、治療前の血清中ＧＤＦ１５レベルの中央値である１４００ｐｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ及び３．２５（図７）と類似していた。
　肝癌発症リスクを層別化するために、ＧＤＦ１５、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがそれぞれ高値の場合１点として、各症例の合計点を計算した。そして点数０を低リスク群、点数１又は２を中リスク群、点数３を高リスク群とした。１、２及び３年間の累積肝癌発症リスクは、それぞれ、低リスク群が０％、０．４０％及び０．４０％、中リスク群が１．１８％、１．８９％及び４．４４％、高リスク群が４．９５％、８．２６％、１３．２％であった（図１０）。
　低リスク症例２４８名中肝癌を発症したのは１名であった。当該症例のＢＭＩは３１．４ｋｇ／ｍ２で、ＨｂＡ１ｃは６．４％であった。日本ではＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２を超える集団は希少で、本発明でもＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２を超える症例は導出コホート及び検証コホートの両方とも２．５％であった。そこで、ＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２を超える症例での肝癌発症リスク予測にＧＤＦ１５が通常のＢＭＩの症例と同様に有効かどうかを検討することは今後の課題である。
（３）ＧＤＦ１５レベル、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスを用いるスコアリングシステムは検証コホートの肝癌発症リスクを層別化できる。
　導出コホートの研究では、肝癌発症リスクがＧＤＦ１５レベル、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスを用いるスコアリングシステムによって層別化された。ＤＡＡ治療前の血清しか利用可能でない７５１症例の検証コホートを用いて本スコアリングシステムを検証した。検証コホートでは、観察期間中にＤＡＡ治療後肝癌を発症したのは３９症例であった（図１１）。検証コホートでの肝癌発症率は、１年間で１．９５％、２年間で４．５４％、３年間で５．８２％であった（図１２）。導出コホートと検証コホートとでは累積肝癌発症率に有意差は認められなかった（ｐ＝０．５７）。低ＧＤＦ１５群、低ＡＦＰ群及び低ＦＩＢ－４インデックス群は、累積肝癌発症率が、それぞれ、高ＧＤＦ１５群、高ＡＦＰ群及び高ＦＩＢ－４インデックス群より有意に低かった（図１３Ａ～Ｃ）。
　本スコアリングシステムは高リスク集団と低リスク集団とを絞り込んで、肝癌発症リスクを明確に層別化した（図１４）。１、２及び３年間の累積肝癌発症リスクは、それぞれ、高リスク群（３点、Ｎ＝１８３）で６．１２％、１３．４３％、１４．２％、中リスク群（１－２点、Ｎ＝３２２）で１．０％、２．９１％、５．５２％であった。重要なことは、低リスク群（０点、Ｎ＝２３６）では肝癌を全く発症しなかった点である（図１４）。
　新規バイオマーカーのＧＤＦ１５を既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスと併用するスコアリングシステムによるＳＶＲ後の肝発癌リスク層別化の意義をより明確にするために、以下では、本発明の導出コホートについて、既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのみを用いるスコアリングシステムによるＳＶＲ後の肝発癌リスク層別化結果と比較した。
　導出コホートについて、既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがそれぞれ高値の場合１点として、各症例の合計点を計算した。そして点数０を低リスク群、点数１を中リスク群、点数２を高リスク群とした。図１５－１に示すとおり、リスク群ごとのカプランマイヤー曲線の層別化の程度は粗く、低リスク群であっても中リスク群に比肩する肝癌発症率が認められた。
　既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのみのスコアリングシステムでの低リスク群を、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスはともに低値だが、ＧＤＦ１５レベルが高値の集団と、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがともに低値で、かつ、ＧＤＦ１５レベルも低値の集団とに層別化すると、図１５－２に示すとおり、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスがともに低値で、かつ、ＧＤＦ１５レベルも低値の集団では肝癌発症率が０となった。したがって、新規バイオマーカーのＧＤＦ１５を既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスと併用するスコアリングシステムによるＳＶＲ後の肝発癌リスク層別化によって、低ＧＤＦ１５、低ＡＦＰ及び低ＦＩＢ－４インデックス群については、肝癌発症症例がないことから、ＤＡＡ治療後肝癌発症リスクが非常に低いことが本発明の結果初めて立証された。
　これに対し、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスはともに低値だが、ＧＤＦ１５レベルが高値の集団では肝癌発症率が１年間で約７％もあり、低ＡＦＰ及び低ＦＩＢ－４インデックスによる層別化だけではＤＡＡ治療後の肝癌発症リスクは十分低いとはいえないことが確認された。
　既知マーカーのＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのみのスコアリングシステムでの高リスク群を、ＧＤＦ１５レベルが高値の集団とＧＤＦ１５レベルが低値の集団とに層別化すると、図１５－３に示すとおり、ＤＡＡ治療後の肝癌発症率は、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスはともに高値だが、ＧＤＦ１５レベルが低値の集団と、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスはともに高値で、ＧＤＦ１５レベルも高値の集団とでは大きく差が開いた。これは、ＤＡＡ治療後の肝癌発症率の予測には、ＧＤＦ１５による層別化のほうがＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスの既知マーカーによる層別化よりも寄与することを示している。以上の解析から、新規バイオマーカーであるＧＤＦ１５を含むスコアリングシステムの有用性が立証された。
　なお本発明の実施例は、保存血清を用いる後ろ向き研究であり、血清の利用可能性に関連するバイアスを否定できない。この懸念を払拭するために、導出コホートと検証コホートとを比較して、少なくとも肝癌発症率には有意差がないことを示した。またMyojin, Y.ら（Aliment Pharmacol Ther. 2022;55:422-433）は、本実施例の導出コホート及び検証コホートの症例をランダムに３：２に振り分けた導出コホート（９６４症例）及び検証コホート（６４２症例）について解析したところ、血清ＧＤＦ１５、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのＲＯＣ曲線によってYoudenインデックスが最大値となるとして決定されたカットオフ値は、それぞれ、１３５０ｐｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ及び３．２５であった。これらの数値は、本実施例の治療前の血清中ＧＤＦ１５レベルの中央値と類似していた。
　実施例２　Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）についてＮＵＣ投与による治療中で肝癌を発症していない被検者の肝癌発症リスク評価
Ａ．材料及び方法
（１）調査対象の症例集団
　本実施例の調査対象は、長期経過が調査可能な保存血清のある核酸アナログ（ＮＵＣ）投与症例である。ここで、保存血清の選択基準は、保存血清ポイント（複数存在する場合は該当する中で最も古い血清についての保存血清ポイント）で８か月以上のＮＵＣ投与歴があること、及び、保存血清ポイントで血清ＨＢＶ　ＤＮＡ　３．０　ｌｏｇＩＵ／ｍｌ未満の症例であることである。ただし、血清ポイント時点で肝癌既往歴のある患者と、Ｂ型肝炎以外の肝疾患の合併する患者とを除外する。
　（２）臨床研究審査
　　本発明のデザインはヘルシンキ宣言を遵守する。本発明の患者情報及び試料の収集、解析プロトコールは大阪大学附属病院臨床研究倫理審査委員会で承認され（IRB 17032）、大阪大学医学部附属病院を含む各施設で実施許可を得ている。
　（３）抗ウイルス治療
　核酸アナログ製剤（ＮＵＣ）治療のプロトコールは、日本肝臓学会編『B型肝炎治療ガイドライン』(第１版)2013年4月～（第3.4版）2021年5月（https://www.jsh.or.jp/lib/files/medical/guidelines/jsh_guidlines/B_v3.4.pdf）、同英語版（Hepatology Research, 2020; 50: 892-923.）などのうち、その時期に利用可能なガイドラインに準拠して治療された。具体的にはＮＵＣ治療開始後は、その時期に使用可能なＮＵＣの内服を継続した。
　（４）フォローアップ及び肝癌サーベイランス
　ＨＢＶについてＮＵＣ投与による治療中の患者のフォローアップ及び肝癌サーベイランスは、ＨＣＶの抗ウイルス治療患者のフォローアップ及び肝癌サーベイランスに準じて実施された。
　（５）血清検査及び統計解析
　ＨＢＶについてＮＵＣ投与による治療中の患者の血清検査及び統計解析は、ＨＣＶの抗ウイルス治療患者の血清検査及び統計解析と同様に実施された。
Ｂ．結果
（１）ＨＢＶについてＮＵＣ投与による治療中の肝癌発症症例は血清ＧＤＦ１５レベルが肝癌非発症症例より高かった。
　ＮＵＣ投与による治療中の症例のＧＤＦ１５の血清濃度の散布図、患者背景及び今回のコホート全体での肝癌発症率の経時変化を示すグラフを、それぞれ、図１６、図１７及び図１８に示す。図１６及び図１７に示すとおり、ＧＤＦの血清濃度のコホート全体での中央値及び２５％－７５％区間は０．８３３ｎｇ／ｍＬ及び０．５５５－１．２０６ｎｇ／ｍＬであった。
　図１９は、患者背景をＧＤＦ１５血清濃度の中央値（０．８３３ｎｇ／ｍＬ）によって群分けした表である。図２０は、患者背景を肝癌発症の有無によって群分けした表である。図２１及び図２２は、ＧＤＦ１５、Ｆｉｂ４、ＡＦＰ及びＰｌｔについてそれぞれ保存血清ポイントから５年及び１０年での発癌の有無についての経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフである。各グラフの縦軸は感度又は真の陽性度、横軸は偽陽性度（１－特異度）を表し、ＡＵＣはそれぞれのグラフのＲＯＣ曲線下の面積（Area under the curve）を表す。図２３は、ＲＯＣ曲線からYoudenインデックスが最大値となるとして決定されるカットオフ値（０．８４５ｎｇ／ｍＬ）を用いた、肝癌の発症率の経時変化を示すグラフを表す。図２４は、cox 比例ハザードモデルによる、発癌に寄与する因子の単変量/多変量解析の結果を表す。図２５は、多変量解析の結果が良好であったＡＦＰ及びＧＤＦ１５の２種類のマーカーのそれぞれのカットオフ値５ｎｇ/ｍＬ及び０．８４５ｎｇ／ｍＬ以上の症例に１点ずつ得点を与えて得点ごとに症例をグループ分けしてプロットし、肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。そこで、新規バイオマーカーのＧＤＦ１５単独又はＧＤＦ１５を既知マーカーのＡＦＰと併用するスコアリングシステムによる層別化は、ＮＵＣ投与による治療中のＨＢＶ患者の肝癌発症予測に有用であることが示された。
　以上の結果から、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）についてＮＵＣ投与による治療中で肝癌を発症していない被検者についても、ＧＤＦ１５の血清濃度のマーカーは肝発癌予測に有用であることが証明された。
　実施例３　ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患しているが肝癌を発症していない被検者の肝癌発症リスク評価
Ａ．材料及び方法
　（１）調査対象の症例集団
　本実施例の調査対象は、２０１２年から２０２０年に肝生検でＮＡＦＬＤと診断された症例のうち、その後の経過が調査可能な肝生検時の保存血清のある症例である。ただし、血清ポイント時点で肝癌既往歴のある患者と、ＮＡＦＬＤ以外の肝疾患の合併する患者とを除外する。
　（２）臨床研究審査
　本発明に参加する症例全員がインフォームドコンセント書面を提出した。本発明のデザインはヘルシンキ宣言を遵守する。本発明の患者情報及び試料の収集、解析プロトコールは大阪大学附属病院臨床研究倫理審査委員会で承認され（IRB 17032、19551）、大阪大学医学部附属病院を含む各施設で実施許可を得ている。
　（３）ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの治療
　非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）については、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ診療ガイドライン２０２０（日本消化器病学会・日本肝臓学会編、改訂第２版、２０２０年１１月発行、南江堂（https://www.jsge.or.jp/guideline/guideline/pdf/nafldnash2020.pdf））、同英語版（Tokushige, K. et al. HepatologyResearch.2021;51:1013-1025.及びTokushige, K. et al. Journal of Gastroenterology 2021;56: 951-963.）どのうち、その時期に利用可能なガイドラインに準拠して治療された。
　（４）フォローアップ及び肝癌サーベイランス
　ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のフォローアップ及び肝癌サーベイランスは、ＨＣＶの抗ウイルス治療患者のフォローアップ及び肝癌サーベイランスに準じて実施された。
　（５）血清検査及び統計解析
　ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者の血清検査及び統計解析は、ＨＣＶの抗ウイルス治療患者の血清検査及び統計解析と同様に実施された。
Ｂ．結果
　図２６は、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のＧＤＦ１５の血清濃度の散布図である。図２６の散布図では、黒丸が肝癌非発症例、白丸が肝癌発症例を表す。発症した肝癌６症例中５例は、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であったが、矢印で示した１例は胆管細胞癌（ＣＣＣ）であった。図２７は、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者の患者背景を示す表である。図２８は、ＮＡＦＬを罹患している患者とＮＡＳＨを罹患している患者とに群分けした患者背景を示す表である。図２８に示すとおり、ＮＡＦＬを罹患している患者のＧＤＦの血清濃度のコホート全体での中央値及び２５％－７５％区間は１．０７ｎｇ／ｍＬ及び０．６９－１．４９ｎｇ／ｍＬであり、ＮＡＳＨを罹患している患者のＧＤＦの血清濃度のコホート全体での中央値及び２５％－７５％区間は１．４１ｎｇ／ｍＬ及び０．９８－１．９４ｎｇ／ｍＬであった。図２９は、ＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者コホート全体での肝癌の発症率の経時変化を示すグラフである。
　図３０は、Brunt Stageの０～４型に群分けした症例ごとのＧＤＦ１５の血清濃度の散布図である。Brunt Stageの０型から４型までステージが進行するにしたがって、各群のＧＤＦ１５の血清濃度が上昇する傾向性をJonckheere-Terpstra trend testで検証したところ、有意差Ｐは０．００３であった。そこで図３０から、ＧＤＦ１５の血清濃度と線維化とは有意な相関が認められた。
　図３１は、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のＧＤＦ１５の血清濃度及びＦｉｂ－４インデックスの相関を調べた散布図である。有意差Ｐは０．０００１未満、決定係数Ｒ２は０．２４５で、有意な相関が認められた。
　図３２は、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨを罹患している患者のさまざまな属性、血液マーカー、Ｆｉｂ－４インデックス等のハザード比を示す表である。図３２から明らかなとおり、ＧＤＦ１５のＰ値は０．０００１未満で、他のいずれの属性、血液マーカー、Ｆｉｂ－４インデックス等よりも格段に低い。
　図３３は、ＧＤＦ１５及びＦｉｂ－４インデックスについてそれぞれ保存血清ポイントから５年での発癌の有無についての経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフである。各グラフの縦軸は感度又は真の陽性度、横軸は偽陽性度（１－特異度）を表し、ＡＵＣはそれぞれのグラフのＲＯＣ曲線下の面積（Area under the curve）を表す。ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨ患者のコホートでは、５年間の経過観察を行った７６症例中肝癌を発症した症例は５例であった。そしてＡＵＣの比較から、Ｆｉｂ－４インデックスよりもＧＤＦ１５のほうが５年以内のの肝癌発症の予測能が高いことが示された。
　３４－１及び３４－２は、それぞれ、２．００ｎｇ／ｍＬ及び１．３５ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。２．００ｎｇ／ｍＬは、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨ患者のコホートの５年以内の発癌のＲＯＣ曲線からYoudenインデックスが最大値となるとして決定されるカットオフ値である。１．３５ｎｇ／ｍＬは、実施例１のＳＶＲを達成したＣ型肝炎患者の導出コホートからのＲＯＣ曲線からYoudenインデックスが最大値となるとして決定されるカットオフ値である。２．００ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする層別化はＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの肝癌発症率の予測に大きく寄与することが示された。
　以上の結果から、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤを罹患している被検者についても、ＧＤＦ１５の血清濃度のマーカーは肝発癌予測に有用であることが証明された。
　実施例４　大垣市民病院のコホートを追加した検討
　大垣市民病院１８３例を追加してさらに検討した。
Ａ．材料及び方法
　（１）調査対象の症例集団
　本実施例の調査対象は、２００５年から２０２０年に肝生検でＮＡＦＬＤと診断された症例のうち、その後の経過が調査可能な肝生検時の保存血清のある症例である。ただし、血清ポイント時点で肝癌既往歴のある患者と、ＮＡＦＬＤ以外の肝疾患の合併する患者とを除外する。
　（２）臨床研究審査
　本発明に参加する症例全員がインフォームドコンセント書面を提出した。本発明のデザインはヘルシンキ宣言を遵守する。本発明の患者情報及び試料の収集、解析プロトコールは大阪大学附属病院臨床研究倫理審査委員会で承認され（IRB 17032）、大阪大学医学部附属病院と大垣市民病院で実施許可を得ている。
　（３）ＮＡＦＬＤの治療
　ＮＡＦＬＤの治療は実施例３と同様に行った。
　（４）フォローアップ及び肝癌サーベイランス
　ＮＡＦＬＤを罹患している患者のフォローアップ及び肝癌サーベイランスは、ＨＣＶの抗ウイルス治療患者のフォローアップ及び肝癌サーベイランスに準じて実施された。
　（５）血清検査及び統計解析
　ＮＡＦＬＤを罹患している患者の血清検査及び統計解析は、ＨＣＶの抗ウイルス治療患者の血清検査及び統計解析と同様に実施された。
　Ｂ．結果
　図３５－１及び図３５－２は、それぞれ、大垣市民病院及び観察期間を延長した実施例３のコホートの患者背景を示す。
　図３６-１は、大垣市民病院におけるＮＡＦＬＤを罹患している患者のＧＤＦ１５の血清濃度の散布図である。図３６-１の散布図では、黒丸が肝癌非発症例、灰色の丸が肝癌発症例を表す。発症した肝癌９症例は、全て原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であった。図３６－２は、観察期間を延長した実施例３のコホートにおけるＮＡＦＬＤを罹患している患者のＧＤＦ１５の血清濃度の散布図である。図３６-２の散布図では、黒丸が肝癌非発症例、灰色の丸が肝癌発症例を表す。発症した肝癌８症例中７例は、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であったが、矢印で示した１例は胆管細胞癌（ＣＣＣ）であった。
　図３７－１及び図３７－２は、それぞれ、大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートの肝癌発症率の経年変化を示す。
　図３８－１、図３８－２及び図３８－３は、それぞれ、大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートを合わせて、それぞれ保存血清ポイントから５年及び７年での発癌の有無についての経時的なＲＯＣ（受信者動作特性）曲線解析を行った結果のグラフである。各グラフの縦軸は感度又は真の陽性度、横軸は偽陽性度（１－特異度）を表し、ＡＵＣはそれぞれのグラフのＲＯＣ曲線下の面積（Area under the curve）を表す。
　図３９－１及び図３９－２は、それぞれ、大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートを合わせて、ＧＤＦ１５について２．００ｎｇ／ｍＬ及び１．７４ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする肝癌発症率の経時変化を示すグラフを表す。２．００ｎｇ／ｍＬは、５年間の観察期間のＮＡＦＬＤ患者のコホートのＲＯＣ曲線からYoudenインデックスが最大値となるとして決定されるカットオフ値である。１．７４ｎｇ／ｍＬは、７年間の観察期間のＮＡＦＬＤ患者のコホートのＲＯＣ曲線からYoudenインデックスが最大値となるとして決定されるカットオフ値である。２．００ｎｇ／ｍＬ、１．７４ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とする層別化はＮＡＦＬＤの肝癌発症率の予測に大きく寄与することが示された。
　以上の結果から、大垣市民病院コホート及び観察期間を延長した実施例３のコホートを合わせた検討でも、ＧＤＦ１５の血清濃度のマーカーは肝発癌予測に有用であることが証明された。
　本出願は、２０２１年７月２６日付けで日本国に出願された特願２０２１－１２１８７３と、２０２２年５月２３日付けで日本国に出願された特願２０２２－０８４１３２とを基礎としており、ここで言及することにより、その内容の全てが本明細書に組み込まれるものである。
　本発明により、ＧＤＦ１５レベルに基づき被検者の肝癌発症リスクをより高精度で評価することが可能となる。また、評価された肝癌発症リスクの程度に応じて被検者を層別化して、肝癌発症リスクの高い被検者が肝癌発症リスクの低い被検者よりもり高い頻度で肝癌スクリーニング検査を受診するように傾斜配分することができる。そのため、被検者個人の検査の負担と、社会全体としての医療経済上のロスとをともに軽減することができる。

Claims (14)

  1. 　（１）被検者のＧＤＦ１５レベルを測定する工程と、
    　（２）前記ＧＤＦ１５レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程とを含む、
    被検者の肝癌発症リスクを評価するための方法。
  2. 　前記被検者は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）持続陰性化（ＳＶＲ）を達成した被検者、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与中の被検者、及びＮＡＦＬＤを発症した被検者からなる群から選択される少なくとも１種類の被検者である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記被検者のＧＤＦ１５レベルが、予め設定したカットオフ値以上の場合には前記被検者の肝癌発症リスクが高いことの指標となり、前記カットオフ値未満の場合には前記被検者の肝癌発症リスクが低いことの指標となる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　ＧＤＦ１５レベルは、血清又は血漿中のＧＤＦ１５タンパク質のレベル、及び／又は、肝組織又は循環血中のＧＤＦ１５転写産物のレベルである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記カットオフ値は、前記ＧＤＦ１５レベルの統計解析又はＲＯＣ解析に基づいて設定される、請求項３に記載の方法。
  6. 　前記カットオフ値は、前記被検者のＧＤＦ１５レベルの中央値か、前記被検者のＲＯＣ曲線のYoudenインデックスが最大値となるＧＤＦ１５レベルの数値かである、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記被検者はＨＣＶのＳＶＲを達成した被検者であり、前記ＧＤＦ１５レベルのカットオフ値はＧＤＦ１５タンパク質の血清濃度約１４００ｐｇ／ｍＬであるか、前記被検者はＢ型肝炎におけるＮＵＣ投与中の被検者であり、前記ＧＤＦ１５レベルのカットオフ値はＧＤＦ１５タンパク質の血清濃度約８４５ｐｇ／ｍＬであるか、前記被検者はＮＡＦＬＤを発症した被検者であり、前記ＧＤＦ１５レベルのカットオフ値はＧＤＦ１５タンパク質の血清濃度約２０００ｐｇ／ｍＬである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記血清中のＧＤＦ１５タンパク質のレベルはＥＬＩＳＡ法によって決定される、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記被検者はＨＣＶのＳＶＲを達成した被検者であり、前記血清中のＧＤＦ１５レベルのカットオフ値は約１４００ｐｇ／ｍＬであり、前記肝癌発症リスクを判定する工程では、ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値を更に組み合わせて判定する、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　前記ＡＦＰ及びＦＩＢ－４インデックスのカットオフ値は、それぞれ、５ｎｇ／ｍＬ及び３．２５である、請求項９に記載の方法。
  11. 　抗ＧＤＦ１５特異的抗体、及び／又は、ＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対若しくはプローブを含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法に使用するための被検者のＧＤＦ１５レベルを測定するためのキット。
  12. 　抗ＧＤＦ１５特異的抗体、及び／又は、ＧＤＦ１５転写産物を特異的に検出するためのプライマー対若しくはプローブを含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法に使用するための診断薬。
  13. 　（１）被検者のＧＤＦ１５レベルを測定する工程と、
    　（２）前記ＧＤＦ１５レベルと、肝癌発症リスクとを関連付ける工程とを含む、
    被検者の肝癌発症リスクを評価するためのバイオマーカーとしてのＧＤＦ１５の使用。
  14. 前記被検者は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）持続陰性化（ＳＶＲ）を達成した被検者、Ｂ型肝炎におけるＮＵＣ投与中の被検者、及びＮＡＦＬＤを発症した被検者からなる群から選択される少なくとも１種類の被検者である、請求項１３に記載の使用。
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