CN111393526A - 抗gdf15中和性单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了两株抗GDF15中和性单克隆抗体及其应用。提供了具有中和活性的抗体G1和G2的轻链和重链可变区，本发明通过杂交瘤技术制备了小鼠抗GDF15单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高特异性的抗GDF15的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高特异性、高亲和力的抗GDF15单克隆抗体。通过构建简便稳定的抗体中和作用检测体系，首次鉴定出两株具有中和活性的GDF15单克隆抗体。基于对GDF15的免疫调节作用的研究，通过建立淋巴细胞和肿瘤细胞的共培养体系和小鼠荷瘤模型分别在体外和体内水平验证了中和性单克隆抗体对肿瘤生长的抑制作用，为在肿瘤免疫治疗和代谢相关疾病等应用打下基础。

Description

抗GDF15中和性单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及单克隆抗体，尤其是两株抗GDF15中和性单克隆抗体及其应用。
背景技术
生长分化因子15(Growth differentiation factor 15，GDF15)是转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)超家族的远端成员之一，又名巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)、胎盘骨形态发生蛋白(PLAB)、胎盘转化生长因子β(PTGFβ)、非甾体抗炎药激活基因-1(NAG-1)、前列腺衍生长因子(PDF)等。正常生理条件下GDF15水平很低，而在心血管、肿瘤和炎症相关疾病发生时GDF15水平显著升高，且与疾病的不良预后密切相关。
1.GDF15的分子特征
GDF15是TGF-β超家族的远端成员之一，其基因含两个外显子和一个内含子，在种属间高度保守。GDF15分子包括信号肽、前肽区和羧基端的成熟区。区别于其它超家族成员，GDF15独特的链内羧基端半胱氨酸结构域。GDF15前体多肽通过羧基端的链间二硫键形成稳定的同源二聚体，水解除去氨基端前肽后产生并分泌成熟的25kDa同源二聚体。其编码的成熟蛋白具有由7个保守的羧基端半胱氨酸残基构成的半胱氨酸结。GDF15启动子具有很多转录因子的调节位点，如HIF1α、p53、EGR-1和Sp1等。GDF15还是p53、EGR-1和AKT/GSK-3β途径的下游重点靶基因。
2.GDF15在食欲调节、肥胖和代谢中的作用
大量临床研究表明，GDF15与由代谢紊乱所致的肥胖症、胰岛素抵抗、厌食症和体重减轻等相关疾病有关。其高表达与妊娠期厌食、炎症反应引发的厌食以及晚期肿瘤病人的恶液质(厌食、消瘦)密切相关。GDF15转基因小鼠相比于正常小鼠表现出消瘦和食欲下降，并且注射外源GDF15也可抑制小鼠的食欲体重。2017年8月，诺和诺德(Novo Nordisk)，杨森(Janssen)，礼来(Eli Lilly)和默克(Merck)四家制药公司同时报道了GDF15的受体为胶质细胞神经营养因子样受体α(Glial-cell-derived neurotrophic factors familyreceptor a-like，GFRAL)，该受体缺失能完全抑制GDF15的食欲抑制和体重调节功能。在体重调节和代谢调控方面GDF15已成为研究热点之一，其作为控制体重的药物研发的价值也值得进一步关注。
3.GDF15与炎性反应和肿瘤微环境中的免疫调节
GDF15在许多炎症相关疾病如急性感染、肿瘤、心血管疾病中显著上调。但是GDF15对炎症发生发展的作用以及对免疫细胞的影响的报道不多，仍需结合慢性炎性反应和急性炎性反应的相关环境因素展开进一步的研究。关于GDF15在免疫调节方面的研究较少，目前主要集中在巨噬细胞上。GDF15与巨噬细胞的生物学功能紧密相关，能够通过上调巨噬细胞的氧化功能调控巨噬细胞的分型，导致巨噬细胞的M2型极化。M2型巨噬细胞在抗肿瘤免疫中发挥抑制作用，能够通过分泌大量免疫抑制性细胞因子从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。在GDF15的其它免疫调节作用的研究上，申请人团队前期首次鉴定出GDF15是肝癌诱导Regulatory T cells(Tregs)生成的一个关键分子，证明GDF15能够诱导Tregs生成并且能够上调Tregs的抑制功能，同时还说明GDF15对巨噬细胞，NK细胞以及DC功能的影响。
因此，这些研究证明GDF15是一个对多种免疫细胞发挥抑制作用的分子，可以作为肿瘤免疫治疗的潜在靶标，其阻断将有效提高抗肿瘤免疫反应。
发明内容
本发明的目的在于提供抗GDF15中和性单克隆抗体及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一株抗GDF15中和性单克隆抗体G1，包括轻链和重链，
所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Arg-Ala-Ser-Glu-Asn-Ile-Tyr-Ser-Asn-Leu-Ala；
CDR2：Val-Ala-Thr-Asn-Leu-Val-Asp；
CDR3：Gln-His-Phe-Trp-Gly-Thr-Pro-Trp-Thr；
所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Ser-Ala-Tyr-Ala-Trp-Asn；
CDR2：Tyr-Ile-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys-Ser；
CDR3：Gly-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Tyr。
优选地，该单克隆抗体G1轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
优选地，该单克隆抗体G1编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
本发明还公开了一株抗GDF15中和性单克隆抗体G2，包括轻链和重链，
所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Arg-Aln-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Tyr-Met-His；
CDR2：Aln-Thr-Ser-Asn-Leu-Aln-Ser；
CDR3：Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Pro-Phe-Thr；
所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Asp-Tyr-Tyr-Ile-Asn；
CDR2：Glu-Ile-Tyr-Pro-Gly-Ser-Gly-Asn-Thr-Tyr-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly；
CDR3：Val-Arg-Aln-Leu-Leu-Arg-Pro-Leu-Aln-Met-Asp-Tyr。
优选地，该单克隆抗体G2的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示
优选地，该单克隆抗体G2的编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示。
本发明还公开了上述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1或抗GDF15中和性单克隆抗体G2在制备抗肿瘤药物或肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明还公开了上述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1或抗GDF15中和性单克隆抗体G2在制备代谢疾病相关药物中的应用。
优选地，所述的代谢疾病包括肥胖症、厌食症或恶病质症。
本发明还公开了上述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1或抗GDF15中和性单克隆抗体G2在以非疾病治疗诊断目的的免疫学检查分析中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的抗GDF15中和性单克隆抗体G1和G2，是两株高亲和力高特异性的抗GDF15中和性单克隆抗体。可用于肿瘤的免疫治疗和机体能量调节等方面的研究，为肿瘤的免疫治疗和肥胖症、厌食症及恶病质等代谢相关疾病提供新方法、新策略。
2、本发明提供抗GDF15中和性单克隆抗体G1和G2的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列。
3、分析获得轻链、重链可变区的CDR区，在此基础上为构建高特异性、高亲和力的抗GDF15嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
附图说明
图1为抗GDF15单克隆抗体腹水效价测定结果；其中，A为抗体G1对应的杂交瘤制备的腹水效价结果；B为抗体G2对应的杂交瘤制备的腹水效价结果；
图2为抗GDF15单克隆抗体的纯化结果；其中，A为AKTA FPLC层析纯化系统亲和层析结果，第一道峰为上样未结合样品，第二道峰为PH2.7 glycine洗脱液洗脱后的样品；B为SDS-PAGE图，Ⅰ为亲和层析前样品，Ⅱ为亲和层析后样品；
图3为SPR测定抗GDF15单克隆抗体G15A对GDF15重组蛋白的亲和力检测结果；其中，A为抗体G1的亲和力各浓度梯度结合曲线及亲和力参数；B为抗体G2的亲和力各浓度梯度结合曲线及亲和力参数
图4为Real-time PCR实验检测抗GDF15单克隆抗体G1和G2中和活性的结果；
图5为流式细胞术实验检测抗GDF15单克隆抗体G1和G2中和活性的结果；其中，A和B为naive CD4 T细胞在Mock(TCR)和GDF15刺激的基础上，分别加入抗体G1和G2处理，流式细胞术检测Treg细胞比例(CD4 gated,CD25+FOXP3+％)的结果；C和D分别为对应A和B的流式细胞术检测的Treg细胞比例的柱形统计图；
图6为共培养实验检验抗GDF15单克隆抗体的抑瘤功能的结果；其中，A为xCELLigence RTCA阻抗测定法(ACEA Biosciences)测定的hepa1-6-OVA实时存活结果图；B为第140h时hepa1-6-OVA细胞存活统计图；
图7为MC38小鼠荷瘤模型检测抗GDF15单克隆抗体的抑瘤效果的结果；其中，A为MC38小鼠原位癌模型瘤体结果展示；B为瘤重分析；C为G1单抗组各体肿瘤生长曲线；D为对照组个体肿瘤生长曲线；E为对照组和G1单抗组肿瘤生长曲线对比结果；
图8为肝癌原位癌小鼠模型检测检测抗GDF15单克隆抗体的抑瘤效果的结果；其中，A为原位癌模型28d后解剖出的肝脏中瘤体大小；B为小动物活体成像展示；C为对照组和用药组肿瘤生长曲线对比，与Control组比较P<0.001。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明采用商品化的GDF15重组蛋白(R&D,9279-GD)为抗原免疫Balb/c小鼠，筛选出能够稳定分泌高特异性抗GDF15单抗杂交瘤细胞株，制备腹水获得高特异性抗GDF15mAb；并确认和标记出该基因序列和相应蛋白序列的CDR序列，为抗GDF15嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体特异性和活性检测，以及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1、抗GDF15中和性单克隆抗体的制备和纯化
1.1小鼠抗原免疫
采用商品化GDF15重组蛋白(R&D,9279-GD)为抗原免疫Balb/c小鼠，将抗原与弗氏佐剂等体积混合，充分研磨至油包水的乳糜状液体。免疫需三次，初次免疫小鼠使用的抗原量为10～50ug/只小鼠，加入弗氏佐剂充分乳化后多点注射，一般0.8-1ml/只小鼠，0.2～0.3ml/注射点。第二次免疫在初次免疫四周后，注射抗原的剂量、方法、途径与初次免疫相同。第三次免疫在第二次免疫三周后进行，注射抗原剂量与第一次相同，不加弗氏佐剂，将抗原溶于生理盐水中进行腹腔注射，7-10天后采血测其效价。间隔2-3周后，经腹腔注射抗原加强免疫，3天后处死动物取脾细胞进行细胞融合。
1.2细胞融合与杂交瘤的培养
取5～6×107个处于对数生长期，生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10比例在室温下进行融合：30s加入37℃预热的1ml 50％PEG 4000，边加边搅拌；将细胞吸入吸管内作用90s；匀速加入预热的37℃不完全培养基，终止PEG作用，连续每2min分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml 800rpm离心6min。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞)的培养体系，使用HAT选择性培养基，调整血清浓度为10％-20％，加入NaHCO3-Na2CO3缓冲体系和HEPES，在37℃、5％-10％CO2孵箱培养。
1.3阳性杂交瘤的筛选
待克隆出现后，采取间接法酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，挑选出阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。杂交瘤建系标准如下：(1)连续四次克隆化阳性率为100％；(2)体外连续传代3个月仍具有稳定的抗体分泌能力。
1.4产生腹水及腹水效价测定
制备腹水：腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)于Balb/c鼠，可使小鼠腹腔巨噬细胞活化产生IL-6等细胞因子。一周后腹腔注射5×105个杂交瘤细胞，接种后7-10天可产生腹水。本次实验在注射杂交瘤细胞一周后，小鼠处于频临死亡状态，处死小鼠尽可能吸取腹水；
腹水效价测定：采用酶联免疫吸附实验(ELISA)对纯化前腹水进行效价测定。包被抗原为浓度为1ug/ml～10ug/ml的GDF15商品化重组蛋白，待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后单克隆抗体。筛选出的高亲和力单克隆抗体，腹水效价检测结果如图1所示，抗GDF15中和性单克隆抗体G1(以下简称抗体G1)对应的杂交瘤制备的腹水效价可达10-7，抗GDF15中和性单克隆抗体G2(以下简称抗体G2)对应的杂交瘤制备的腹水效价可达10-6。一般采用间接ELISA检测腹水效价达1×10-5以上的抗体即可使用，因此筛选出的两株单克隆抗体是具有较高效价的可用抗体。
1.5抗体的纯化
采用硫酸铵盐析法，经40％饱和硫酸铵沉淀后，透析袋(分子截流量：10000KD)4℃透析过夜。再使用AKTA FPLC层析纯化系统，以protein A+G Agarose(P2019-10ml)层析柱进行单克隆抗体的亲和纯化，并用SDS-PAGE分析纯化效果。腹水纯化结果如图2所示，以抗GDF15中和性单克隆抗体G1为例，A为AKTA FPLC层析纯化系统亲和层析结果，第一道峰为上样未结合样品，第二道峰为PH2.7 glycine洗脱液洗脱后的样品，经过亲和层析纯化后，获得了单一的洗脱峰；B为SDS-PAGE图，Ⅰ为亲和层析前样品，Ⅱ为亲和层析后样品。该结果显示亲和层析后，获得了纯度较高的单克隆抗体。
2、抗GDF15单克隆抗体的鉴定
2.1单克隆抗体测序获得抗体亚型和序列
将生产抗体用的杂交瘤细胞养成一定规模(细胞数>3×106个)后，用Trizol裂解细胞，用Quick-RNA MicroPrep Kit试剂盒提取杂交瘤细胞裂解液总RNA，琼脂糖凝胶电泳分离RNA，再通过Clontech SMARTer RACE 5'/3'kit试剂盒进行5'RACE从而获得cDNA，以其为模板,用
Figure BDA0002431762490000081
Max DNA Polymerase进行PCR扩增，提取抗体V区cDNA，交由测序公司测序。通过测序获知抗体G1的亚型为IgG1，抗体G2的亚型为IgM。并分别获得抗体的可变区氨基酸序列以及对应的碱基序列，同时使用Kabat方法标记出抗体氨基酸序列和对应碱基序列的CDR区。
2.3单克隆抗体的亲和力和效价测定
通过使用表面离子共振技术(surface plasmon resonance，SPR)来测定GDF15单克隆抗体与GDF15分子的结合情况。将商品化的GDF15重组蛋白(R&D,9279-GD)作为固定相，将筛选出的抗体作为流动相，以梯度浓度上样，通过SPR仪器检测其相互作用，结果使用TraceDrawer(Ridgeview Instruments ab,Sweden)软件分析，以One To One模型进行分析，结果如图3所示，从图中的浓度梯度结合曲线及亲和力参数(KD)可以看出，筛选出的两株GDF15单克隆抗体与GDF15均具有较强的结合能力，抗体G1的亲和力高达7.14×10-8，抗体G2的亲和力高达5.72×10-7，均符合抗体使用标准。
3、抗GDF15单克隆抗体中和性的鉴定
3.1Real-time PCR法验证单克隆抗体的中和功能
基于前期研究，GDF15可以显著上调Hepa1-6细胞的VIM基因的mRNA水平，由此构建了GDF15中和性抗体的Real-time PCR法验证体系。将筛选出的抗体(1ug/ml)添加到该体系中，发现抗体G1和抗体G2均能够明显抑制GDF15上调VIM的mRNA表达水平，结果如图4，该结果证明筛选到的两株抗体均具有中和GDF15生物学活性的作用。
3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析
基于前期研究，GDF15能够诱导上调
Figure BDA0002431762490000091
CD4+T细胞的Foxp3蛋白水平，从而诱导
Figure BDA0002431762490000092
CD4+T细胞向调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg cells)细胞分化，由此构建了GDF15中和性抗体的流式细胞术验证体系。在GDF15诱导
Figure BDA0002431762490000093
CD4+T细胞的培养体系中加入筛选出的抗体，通过流式细胞术检测Foxp3的表达水平，结果显示加入抗体后，GDF15上调Foxp3表达的生物学功能受到了抑制，并且该抑制作用随着抗体浓度的增加显示出剂量依赖性，如图5，可以证明筛选得到的抗体G1和抗体G2均具有中和GDF15生物学活性的作用。
4、GDF15中和单抗的药效验证
4.1共培养体系评价GDF15中和性单克隆抗体对肿瘤细胞生长的抑制作用
基于前期研究基础，GDF15能够诱导
Figure BDA0002431762490000101
CD4+T细胞向Treg细胞分化，而Treg细胞能够抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，为评价GDF15中和性单克隆抗体是否能够阻断GDF15的免疫调节功能从而促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤，构建了如下的T细胞和肿瘤细胞的共培养体系：
1)Hepa1-6-OVA细胞：用lipo3000转染试剂(Invitrogen)将pCI-neo-mOVA(Addgene plasmid#25099)质粒转染Hepa1-6肿瘤细胞中，使用400ug/ml G418(diyibio)进行压力筛选，最终获得稳定表达的Hepa1-6-OVA细胞。
2)OT-1CD8 T细胞：从OT-I TCR转基因小鼠的脾脏中分离出脾脏T细胞，使用CD8a(Ly-2)MicroBeads(Miltenyi Biotec)磁珠分选获得OT-1CD8 T细胞，用10nmol ml- 1OVA257-264 peptide(MCE)和100u/ml IL-2刺激72h.
3)Naive CD4+T细胞：从C57BL/6小鼠中分离出脾脏T细胞，使用Naive CD4+T CellIsolation Kit(Miltenyi Biotec)磁珠分选获得Naive CD4+T细胞，在GDF15和TCR(5μgml-1包被的anti-CD3，2μg ml-1anti-CD28和100u/ml IL-2)刺激的基础上，加入GDF15中和性单克隆抗体，检测其阻断效果。由于抗体可变区的测序显示G1抗体为IgG1，G2抗体为IgM。而一般情况下IgG的亲和力较高且适合后期的人源化改造，因此选择G1抗体作为该步骤所使用的验证抗体。
将上述hepa1-6-OVA细胞按1×104/孔接种在96孔板上，用xCELLigence RTCA阻抗测定法(ACEA Biosciences)以1h为间隔进行细胞计数，实时监测Hepa1-6-OVA细胞观察实时存活情况。培养30h后，按照2:1:2的比例，将预先刺激好的OT-1CD8+T和Naive CD4+T添加到hepa1-6-OVA的孔板中，继续监测细胞存活情况110h。通过第29h时的细胞计数对各时间点的细胞计数进行归一化处理，获得归一化细胞指数(Normalized cell index)，分析细胞存活情况。
结果如图6所示，GDF15组由于OT-1CD8+T杀伤功能被抑制，hepa1-6-OVA细胞存活多，加入抗体G1后，GDF15诱导naive CD4+T为Treg的能力被阻断，hepa1-6-OVA细胞被OT-1CD8+T杀伤，存活减少。该结果验证了GDF15中和性单克隆抗体G1能够中和GDF15，阻断其对Treg细胞的诱导分化作用，从而促进杀伤性T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
4.2MC38小鼠荷瘤模型检测GDF15中和单抗的抑瘤效果
选用6-8周的雄性C57小鼠10只构建移植瘤模型。将培养状态良好的MC38细胞处理为单细胞悬液，用预冷的DMEM培养基和Matrigel按1：1等体积混合后，将细胞重悬至1×107\ml(此过程应低温操作，以避免matrigel凝固)，在每只C57小鼠背部皮下注射0.5mlMC38细胞混悬液。10d后待皮下明显成瘤后，给小鼠打耳标并测量瘤体积，根据肿瘤体积的大小通过分层随机分组，每组五只，共两组。肿瘤体积计算公式：V＝L×S2×0.5，其中L为肿瘤的纵径，S为横径。从10d起，每5d测量一次瘤体积，并腹腔给药，对照组腹腔注射125ugIgG,单抗组腹腔注射125ug G1，两组给药均用100ul生理盐水稀释；测量四次后，处死小鼠，解剖出瘤体，测量瘤重。实验结果参见图7，结果发现，相对于对照组，单抗组生长曲线较为缓慢(图中C、D、E)，说明使用的G1单抗具有明显的抑瘤效果。给药四次后，对瘤体进行测量发现治疗组肿瘤体积比对照组有明显的缩小(图中A和B)，治疗组瘤重(0.94±0.48g)也明显小于对照组瘤重(1.82±0.56g)，抑瘤率为50.62％，MC38小鼠荷瘤模型中对照组及单抗组的抑瘤率结果如下表1所示，实验结果说明了G1抗体具有抑制肿瘤生长的效果。
表1
Figure BDA0002431762490000111
与Control组比较，**P<0.01(n＝5，
Figure BDA0002431762490000121
)
4.3肝癌原位癌小鼠模型检测GDF15中和单抗的抑瘤效果
选用6-8周的雄性C57小鼠16只，用于构建肝癌原位癌模型。在接种肿瘤前，在小鼠剑突以下的腹部待接种部位预先剔除毛发，将hepa1-6-luc细胞处理为单细胞悬液，加入等体积Matrigel胶重悬备用。小鼠采用苯巴比妥钠麻醉后，剑突下开腹1-2cm，将肝小心挤出，每只小鼠注射3×106个细胞，注射体积约50ul，缓慢注射，防治漏液，注射完毕后，分别缝合腹膜和表皮,并打上耳标。术后第3d进行小动物活体成像，按照成像结果根据原位肝癌肿瘤大小通过分层随机分组。分别为给药组和对照组，分组后在术后第7d、14d、21d进行小动物活体成像，并将成像结果收集分析。术后第5d开始腹腔给药，在第5d、12d、19d给药三次，对照组腹腔注射100ul生理盐水(内含IgG 125ug)，单抗组腹腔注射100ul生理盐水稀释的125ug G1抗体。28d后处死小鼠，解剖出肝脏肿瘤观察大小。实验结果参见图8，结果显示，相比于对照组，单抗组在给予G1单抗治疗后，肿瘤的生长明显受到抑制(图中C)，给药组肿瘤的体积明显小于对照组(图中A和B)。结果表明G1单抗在原位肝癌模型中有着良好的抑瘤效果。
综上所述，本发明通过杂交瘤技术制备了小鼠抗GDF15单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高特异性的抗GDF15的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高特异性、高亲和力的抗GDF15单克隆抗体，并通过构建简便稳定的抗体中和作用检测体系，首次鉴定出两株具有中和活性的GDF15单克隆抗体。基于对GDF15的免疫调节作用的研究，通过建立淋巴细胞和肿瘤细胞的共培养体系以及小鼠荷瘤实验分别从体外和体内水平验证了该中和性单克隆抗体对肿瘤生长的抑制作用，为抗体的人源化及其在肿瘤免疫治疗和代谢相关疾病等应用中打下基础。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 抗GDF15中和性单克隆抗体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr
1 5 10 15 20
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln
25 30 35 40
Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Val Asp Gly Val Pro Ser
45 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly
85 90 95 100
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15 20
Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln
25 30 35 40
Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr
45 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95 100
Asp Ala Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
105 110 115
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Aln Ile Leu Ser Aln Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
1 5 10 15 20
Met Thr Cys Arg Aln Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
25 30 35 40
Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Aln Thr Ser Asn Leu Aln Ser Gly Val Pro Aln Arg
45 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Aln Glu
65 70 75 80
Asp Aln Aln Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser
85 90 95 100
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
105
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Aln Glu Leu Aln Arg Pro Gly Aln Ser Val Lys Leu
1 5 10 15 20
Ser Cys Lys Aln Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg
25 30 35 40
Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr
45 50 55 60
Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Aln Thr Leu Thr Aln Asp Lys Ser Ser Ser Thr Aln Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Aln Val Tyr Phe Cys Aln Arg Val Arg
85 90 95 100
Aln Leu Leu Arg Pro Leu Aln Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
105 110 115 120
Ser
<210> 5
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga aaatatttac agtaatttag catggtttca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct agtctatgtt gcaacaaact tagtagatgg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240
gaagattttg ggacttatta ttgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 6
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcacaggcta ctcaatcacc agtgcttatg cctggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtag cactagctac 180
aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240
ctgcagttca attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagagggggg 300
gacgcagagg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348
<210> 7
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgctt ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgttagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc caccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120
actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtgagg 300
gcattactac ggcctctcgc tatggattat tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363

Claims (10)

1.一株抗GDF15中和性单克隆抗体G1，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Arg-Ala-Ser-Glu-Asn-Ile-Tyr-Ser-Asn-Leu-Ala；
CDR2：Val-Ala-Thr-Asn-Leu-Val-Asp；
CDR3：Gln-His-Phe-Trp-Gly-Thr-Pro-Trp-Thr；
所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Ser-Ala-Tyr-Ala-Trp-Asn；
CDR2：Tyr-Ile-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys-Ser；
CDR3：Gly-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Tyr。
2.如权利要求1所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1，其特征在于，该单克隆抗体G1轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.如权利要求1所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1，其特征在于，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
4.一株抗GDF15中和性单克隆抗体G2，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Arg-Aln-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Tyr-Met-His；
CDR2：Aln-Thr-Ser-Asn-Leu-Aln-Ser；
CDR3：Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Pro-Phe-Thr；
所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Asp-Tyr-Tyr-Ile-Asn；
CDR2：Glu-Ile-Tyr-Pro-Gly-Ser-Gly-Asn-Thr-Tyr-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly；
CDR3：Val-Arg-Aln-Leu-Leu-Arg-Pro-Leu-Aln-Met-Asp-Tyr。
5.如权利要求4所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G2，其特征在于，该单克隆抗体G2的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
6.如权利要求4所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G2，其特征在于，该单克隆抗体G2的编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示。
7.权利要求1所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1或权利要求2所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G2在制备抗肿瘤药物或肿瘤免疫治疗药物中的应用。
8.权利要求1所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1或权利要求2所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G2在制备代谢疾病相关药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的代谢疾病包括肥胖症、厌食症或恶病质症。
10.权利要求1所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G1或权利要求2所述的抗GDF15中和性单克隆抗体G2在以非疾病治疗诊断目的的免疫学检查分析中的应用。
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