JP7346576B2 - 抗ｏｘ４０モノクローナル抗体とその応用 - Google Patents

抗ｏｘ４０モノクローナル抗体とその応用 Download PDF

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Description

CCTCC CCTCC C2018197 CCTCC CCTCC C2018198
本開示は、生物医学の分野に関する。より詳細には、本開示は、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体及びその使用に関する。
ＣＤ１３４及びＴＮＦＲＳＦ４としても知られるＯＸ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の表面にのみ発現する。ヒトＯＸ４０は、分子量４７～５１ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質であり、２４９個のアミノ酸で構成され、膜外領域、膜貫通領域、及び膜内領域は、それぞれ１８８個、２４個、及び３７個のアミノ酸でそれぞれ構成されている。その対応する遺伝子は、ヒト染色体１ｐ３６に位置する。ＯＸ４０シグナルは、下流のＮＦ－ｋＢ、ＰＩ３Ｋ、及びＰＫＢ経路を活性化することができ、これらの経路の継続的な活性化は、最終的にＴ細胞の生存期間を延ばし、メモリーＴ細胞を増殖させ、Ｔ細胞の細胞殺傷能力を促進する。更に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化と活性を阻害することによって、腫瘍微小環境における免疫抑制効果を改善し、エフェクターＴ細胞の機能を更に強化することができる。
治療の標的としてのＯＸ４０は、更なる改善を必要とする。
本開示は、関連技術における技術的問題の１つを少なくともある程度解決することを目的とする。このために、本開示の目的は、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を提供することである。本開示によって提供されるＯＸ４０抗体は、癌及び感染症を治療するための免疫応答を増強するため、又は癌ワクチンのアジュバントとして使用することができる。
本開示の第１の態様によれば、本開示は、以下のうちの少なくとも１つを含む抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する：（１）ＧＦＴＦＳＤＹＹ（配列番号１８）、ＩＳＤＧＧＳＮＴ（配列番号１９）、及びＡＲＲＧＴＧＴＧＦＧＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＥＮＩＹＳＴ（配列番号２１）、ＡＡＴ、及びＱＨＦＷＧＩＰＷＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（２）ＧＹＴＦＴＮＹＤ（配列番号２３）、ＩＹＰＥＤＧＳＴ（配列番号２４）、及びＡＲＤＴＲＧＹＦＤＹ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＳＳＶＮＹ（配列番号２６）、ＹＴＳ、及びＱＱＦＴＳＳＰＷＴ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（３）ＧＤＳＩＴＳＧＹ（配列番号２８）、ＩＳＦＳＧＮＴ（配列番号２９）、及びＡＲＹＰＹＳＹＳＮＷＤＹＡＭＤＹ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＱＦＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹ（配列番号３１）、ＷＡＳ、及びＨＱＹＹＳＹＰＬＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（４）ＧＤＳＩＴＩＧＦ（配列番号３３）、ＩＮＹＳＧＳＳ（配列番号３４）、及びＡＲＳＧＴＤＬＤＹ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）、ＬＶＳ、及びＷＱＧＴＨＦＰＲＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（５）１以上の保存的アミノ酸変異を有する（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列。本開示の実施形態によれば、１以上の保存的アミノ酸変異を有する（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列は、好ましくは、１つの保存的アミノ酸変異を有するアミノ酸配列、２つの保存的アミノ酸変異、又は３つの保存的アミノ酸変異を有するアミノ酸配列である。
本開示の実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片は、更に、以下を含むことができる：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｅ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域以外のアミノ酸配列領域に１以上の保存的アミノ酸変異を有する（ａ）～（ｄ）のいずれか。本開示の実施形態によれば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域以外のアミノ酸配列領域に１以上の保存的アミノ酸変異を有する（ａ）～（ｄ）のいずれかは、１つの保存的アミノ酸変異、２つの保存的アミノ酸変異、又は３つの保存的アミノ酸変異を有することができる。
本開示の実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体である。
本開示の第２の態様によれば、本開示は、本開示の第１の態様に係る抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、以下のうちの少なくとも１つを有する：配列番号９に示されるヌクレオチド配列及び配列番号１０に示されるヌクレオチド配列；配列番号１１に示されるヌクレオチド配列及び配列番号１２に示されるヌクレオチド配列；配列番号１３に示されるヌクレオチド配列及び配列番号１４に示されるヌクレオチド配列；配列番号１５に示されるヌクレオチド配列及び配列番号１６に示されるヌクレオチド配列。
本開示の第３の態様によれば、本開示は、本開示の第２の態様に係るポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。前記発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含み、前記発現ベクターは、プラスミド、例えば、前記ポリヌクレオチドを挿入させることができる環状二本鎖ＤＮＡであることができ、前記発現ベクターはまた、ウイルスベクターであることができ、前記ポリヌクレオチドを前記ウイルスゲノムに挿入させることができる。特定の発現ベクターを宿主細胞に導入して自律的に複製させることができ、また特定の発現ベクターを宿主細胞に導入すると、宿主細胞のゲノムに組み込まれるため、宿主ゲノムと共に複製することができる。
本開示の実施形態によれば、前記発現ベクターは、更に、以下の技術的特徴を含むことができる。
本開示のいくつかの実施形態において、発現ベクターは、更に、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御するための、ポリヌクレオチドに動作可能に連結された制御エレメントを含む。「動作可能に連結された」とは、転写制御配列及び翻訳制御配列などのベクター内の制御エレメントが、外来遺伝子の転写及び翻訳を調節するという期待される機能を行うことができるように、外来遺伝子をベクターに連結することを意味する。言及するまでもなく、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、異なるベクターに独立して挿入することができ、より一般的には、同一のベクターに挿入することができる。
本開示のいくつかの実施形態では、制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターのうちの少なくとも１つを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
本開示の第４の態様によれば、本開示は、本開示の第３の態様の実施形態のいずれかに係る発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。本明細書において、組換え細胞は、発現ベクターが導入された細胞を意味する。組換え細胞は、特定の対象の細胞を意味するだけでなく、係る細胞の子孫細胞も意味することが理解される。変異又は環境の影響により、その後の継代である種の変化が生じることがあり得るので、係る子孫細胞は親細胞と完全には同一ではない可能性があるが、本明細書で言及される組換え細胞の範囲に含まれる。
本開示の第５の態様によれば、本開示は、本開示の第１の態様の実施形態のいずれかに係る抗体又はその抗原結合断片を調製するための方法を提供する。この方法は、本開示の第４の態様に係る組換え細胞を培養することを含む。
本開示の第６の態様によれば、本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の調製における、ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は組換え細胞の使用を提供する。本開示の実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、本開示の第２の態様に係るポリヌクレオチドであり、前記発現ベクターは、本開示の第３の態様に係る発現ベクターであり、前記組換え細胞は、本開示の第４の態様に係る組換え細胞である。
本開示の第７の態様によれば、本開示は、以下から選択される少なくとも１つであるハイブリドーマ細胞を提供する：ハイブリドーマ細胞ＨＸ０１１－９Ｃ１２、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託番号Ｃ２０１８１９７で２０１８年９月２７日寄託；ハイブリドーマ細胞ＨＸ０１１－１Ｄ９、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託番号Ｃ２０１８１９８で２０１８年９月２７日寄託。
本開示の第８の態様によれば、本開示は、ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体の調製におけるハイブリドーマ細胞の使用であって、前記ハイブリドーマ細胞は、本開示の第７の態様に係るハイブリドーマ細胞である使用を提供する。
本開示の第９の態様によれば、本開示は、自己免疫疾患又は癌の治療のための医薬の調製における、抗体又はその抗原結合断片、ポリヌクレオチド、発現ベクター、組換え細胞、又はハイブリドーマ細胞の使用を提供する。前記医薬は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又はＢ細胞リンパ腫細胞を含むが、これらに限定されない腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することができる。更に、前記医薬は、関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、乾癬、増殖性ループス腎炎、肉芽腫性ミオパチー、及び多発性筋炎を含むが、これらに限定されない自己免疫疾患の治療にも使用することができる。
本開示の実施形態によれば、前記抗体又はその抗原結合断片は、本開示の第１の態様に係る抗体又はその抗原結合断片であり、前記ポリヌクレオチドは、本開示の第２の態様に係るポリヌクレオチドであり、前記発現ベクターは、本開示の第３の態様に係る発現ベクターであり、前記組換え細胞は、本開示の第４の態様に係る組換え細胞であり、前記ハイブリドーマ細胞は、本開示の第７の態様に係るハイブリドーマ細胞である。
本開示の第１０の態様によれば、本開示は、抗体又はその抗原結合断片、ポリヌクレオチド、発現ベクター、組換え細胞、又はハイブリドーマ細胞を含む医薬組成物を提供する。本開示の実施形態によれば、前記抗体又はその抗原結合断片は、本開示の第１の態様に係る抗体又はその抗原結合断片であり、前記ポリヌクレオチドは、本開示の第２の態様に係るポリヌクレオチドであり、前記発現ベクターは、本開示の第３の態様に係る発現ベクターであり、前記組換え細胞は、本開示の第４の態様に係る組換え細胞であり、前記ハイブリドーマ細胞は、本開示の第７の態様に係るハイブリドーマ細胞である。
本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体は、対象への投与に適した医薬組成物に含有させることができる。一般に、これらの医薬組成物は、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などを含み得る。具体的な例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せのうちの１以上であることができる。多くの場合、医薬組成物は、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含有する。言及するまでもなく、薬学的に許容される担体はまた、抗体の保存寿命又は効力を延ばすために、湿潤剤、乳化剤、防腐剤、又は緩衝液などの少量の補助物質を含むことができる。
例えば、本開示の抗体は、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）に適した医薬組成物に含有させることができる。これらの医薬組成物は、様々な形態で調製することができ、例えば、液体溶液（例えば、注射液及び輸液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、及び坐剤を含むが、これらに限定されない液体、半固体、及び固体の剤形で調製することができる。典型的な医薬組成物は、注射液及び輸液の形態である。抗体は、静脈内注入若しくは注射、又は筋肉内若しくは皮下注射によって投与することができる。
本開示の第１１の態様によれば、本開示は、ＯＸ４０に結合することができる薬剤を同定するための方法を提供し、前記方法は、本開示の第１の態様の実施形態のいずれかに係る抗体又はその抗原結合断片を、候補薬剤の存在下で抗原と接触させ、前記抗体又はその抗原結合断片の前記抗原に対する第１の結合量を決定することと、本開示の第１の態様の実施形態のいずれかに係る抗体又はその抗原結合断片を、前記候補薬剤の非存在下で前記抗原と接触させ、前記抗体又はその抗原結合断片の前記抗原に対する第２の結合量を決定することとを含み、前記抗原が、ＯＸ４０又はその断片であり、前記第２の結合量が前記第１の結合量よりも多いことは、前記候補薬剤がＯＸ４０に結合できることを示す方法である。前記候補薬剤の非存在下での前記抗体の前記抗原との結合量を求め、前記候補薬剤添加後の前記抗体の前記抗原との結合量を求め、求めた２つの結合量の差を求める。抗体の抗原への結合量の減少は、前記候補薬剤がＯＸ４０抗原に競合的に結合できることを示すので、ＯＸ４０に結合できる薬剤を同定することができる。
本開示の第１２の態様によれば、本開示は、薬剤の組合せを提供し、前記組合せは、（１）抗体又はその抗原結合断片、ポリヌクレオチド、発現ベクター、組換え細胞、ハイブリドーマ細胞と、（２）前記（１）以外の免疫促進剤とを含み、前記抗体又はその抗原結合断片は、本開示の第１の態様に係る抗体又はその抗原結合断片であり、前記ポリヌクレオチドは、本開示の第２の態様に係るポリヌクレオチドであり、前記発現ベクターは、本開示の第３の態様に係る発現ベクターであり、前記組換え細胞は、本開示の第４の態様に係る組換え細胞であり、前記ハイブリドーマ細胞は、本開示に係る第７の態様のハイブリドーマ細胞である。
本開示の実施形態によれば、前記（１）以外の免疫促進剤は、抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ－３抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、Ｔｉｍ３抗体、又はＰＤ－Ｌ１抗体から選択される少なくとも１つである。これらの免疫促進剤は、特定の標的に結合することができる。これらの免疫促進剤と抗ＯＸ４０抗体との組合せ又は併用により、併用療法は、低用量で治療効果を発揮することができる。
本開示の第１３の態様によれば、本開示は、本開示の第１の態様に記載の抗体又はその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。
本開示の実施形態によれば、前記癌を治療するための方法において、前記癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、又はＢ細胞リンパ腫からなる群から選択される。
本開示の前記及び／又は更なる態様及び利点は、以下の図面と共に実施形態の説明から明らかとなり、理解が容易となる。
図１は、本開示の実施形態に係る９Ｃ１２抗体の速度論的パラメータの結果を示すグラフである。 図２は、本開示の実施形態に係る８Ａ７抗体の速度論的パラメータのグラフである。 図３は、本開示の実施形態に係る種特異的結合のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 図４は、本開示の実施形態のＦＡＣＳ法にしたがって行った、９Ｃ１２のＯＸ４０に対する結合活性の検出結果を示すグラフである。 図５は、本開示の実施例に係る、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激してＩＦＮ－γを分泌させるＯＸ４０抗体の結果を示すグラフである。 図６は、本開示の実施形態に係る、ＯＸ４０のＪｕｒｋａｔ－ＮＦκＢ－ＯＸ４０レポーター遺伝子法によるＯＸ４０抗体活性の検出結果を示すグラフである。 図７は、本開示の実施形態に係る実験動物の腫瘍体積の変化を示すグラフである。
生物学的保存
ハイブリドーマ細胞ＨＸ０１１－９Ｃ１２は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（中国、武漢、武漢大学）に寄託番号Ｃ２０１８１９７で２０１８年９月２７日に寄託された。
ハイブリドーマ細胞ＨＸ０１１－１Ｄ９は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（中国、武漢、武漢大学）に寄託番号Ｃ２０１８１９８で２０１８年９月２７日に寄託された。
詳細な説明
本開示の実施形態を以下に詳細に説明する。実施形態の例は、添付図面に示され、同一又は類似の参照番号は、同一又は類似の要素又は同一又は類似の機能を有する要素を示す。添付図面を参照して以下に説明する実施形態は例示であり、本開示を説明することを意図しているが、本開示を限定するものとして解釈すべきではない。
標的としてのＯＸ４０の治療効果を改善するために、本開示は、抗ＯＸ４０抗体及び薬剤療法における抗体の使用を提供する。本開示によって提供される抗ＯＸ４０抗体は、自己免疫疾患又は癌を治療するために用いることができる。本明細書において、抗ＯＸ４０抗体はまた、ＯＸ４０抗体として、又は必要に応じて、単離された抗ＯＸ４０抗体として発現させることができる。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ又は組換えＤＮＡ法によって調製されたモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない実質的に相同な抗体の集団から得られる抗体を意味する。本明細書において、「抗ＯＸ４０抗体」は「ＯＸ４０抗体」とも称される。
本明細書において、用語「抗体」は、ジスルフィド結合を介して内部連結した、４本のポリペプチド鎖、２本の重鎖及び２本の軽鎖から構成される免疫グロブリン分子である。各重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域から構成される。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、更に、超可変領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる相補性決定領域を含むことができる。
抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗原（ｈＯＸ４０）に特異的に結合する能力を保持する抗体断片を含む。
具体的には、本明細書に記載される癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頸部癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、血液系の癌、又は制御されていない細胞増殖を特徴とするその他の疾患又は状態を意味する。
本明細書において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、乾癬、増殖性ループス腎炎、肉芽腫性ミオパチー、及び多発性筋炎などであり得る。
本開示の態様によれば、本開示は、以下のうちの少なくとも１つを含む抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する：（１）ＧＦＴＦＳＤＹＹ（配列番号１８）、ＩＳＤＧＧＳＮＴ（配列番号１９）、及びＡＲＲＧＴＧＴＧＦＧＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＥＮＩＹＳＴ（配列番号２１）、ＡＡＴ、及びＱＨＦＷＧＩＰＷＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（２）ＧＹＴＦＴＮＹＤ（配列番号２３）、ＩＹＰＥＤＧＳＴ（配列番号２４）、及びＡＲＤＴＲＧＹＦＤＹ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＳＳＶＮＹ（配列番号２６）、ＹＴＳ、及びＱＱＦＴＳＳＰＷＴ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（３）ＧＤＳＩＴＳＧＹ（配列番号２８）、ＩＳＦＳＧＮＴ（配列番号２９）、及びＡＲＹＰＹＳＹＳＮＷＤＹＡＭＤＹ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＱＦＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹ（配列番号３１）、ＷＡＳ、及びＨＱＹＹＳＹＰＬＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（４）ＧＤＳＩＴＩＧＦ（配列番号３３）、ＩＮＹＳＧＳＳ（配列番号３４）、及びＡＲＳＧＴＤＬＤＹ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びにＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）、ＬＶＳ、及びＷＱＧＴＨＦＰＲＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（５）１以上の保存的アミノ酸置換を有する（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列。
「保存的アミノ酸置換」は、生物学的、化学的、又は構造的な類似性を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換を意味する。生物学的な類似性とは、置換がＯＸ４０の生物学的活性を損なわせないことを意味する。構造的な類似性とは、アラニン、グリシン、セリンなどの類似した長さの側鎖を有するアミノ酸、又は類似したサイズの側鎖を有するアミノ酸を意味する。化学的な類似性とは、同一の電荷、即ち、親水性又は疎水性の性質を有するアミノ酸を意味する。例えば、疎水性残基であるイソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンが相互に置換される。或いは、リジンにはアルギニンなどの極性アミノ酸が置換し、アスパラギン酸にはグルタミン酸、アスパラギンにはグルタミン、スレオニンにはセリン、などのように置換する。
本開示の実施形態によれば、本開示は、抗ＯＸ４０抗体を提供し、その重鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＹ、配列番号１８）、ＣＤＲＨ２（ＩＳＤＧＧＳＮＴ、配列番号１９）、ＣＤＲＨ３（ＡＲＲＧＴＧＴＧＦＧＹ、配列番号２０）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有し、軽鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＬ１（ＥＮＩＹＳＴ、配列番号２１）、ＣＤＲＬ２（ＡＡＴ）、ＣＤＲＬ３（ＱＨＦＷＧＩＰＷＴ、配列番号２２）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有する。
本開示の特定の実施形態において、抗体は９Ｃ１２であり、その重鎖アミノ酸配列（配列番号１）は、以下：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＳＮＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＧＴＧＴＧＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
であり、その軽鎖アミノ酸配列（配列番号２）は、以下：
ＤＩＶＬＴＱＴＴＡＳＬＳＶＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＴＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＡＡＴＮＬＶＡＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＳＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＦＷＧＩＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
である。ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められた抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域の配列に下線が施されている。
本開示の特定の実施形態によれば、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号９）によってコードされる。
ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
本開示の特定の実施形態によれば、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１０）によってコードされる。
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
本開示の実施形態によれば、本開示は、更に、別の抗ＯＸ４０抗体を提供し、その重鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＮＹＤ、配列番号２３）、ＣＤＲＨ２（ＩＹＰＥＤＧＳＴ、配列番号２４）、ＣＤＲＨ３（ＡＲＤＴＲＧＹＦＤＹ、配列番号２５）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有し、その軽鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＬ１（ＳＳＶＮＹ、配列番号２６）、ＣＤＲＬ２（ＹＴＳ）、ＣＤＲＬ３（ＱＱＦＴＳＳＰＷＴ、配列番号２７）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有する。
本開示の特定の実施形態では、抗体は１Ｄ９であり、その重鎖アミノ酸配列（配列番号３）は、以下：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＬＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＤＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＥＤＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＮＳＡＶＹＦＣＡＲＤＴＲＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
であり、その軽鎖アミノ酸配列（配列番号４）は、以下：
ＤＩＶＭＴＱＴＴＡＩＭＳＡＳＬＧＥＫＶＴＭＳＣＲＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＳＤＡＳＰＫＬＷＩＹＹＴＳＮＬＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＧＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＦＴＳＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＦＫＲ
である。ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められた抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域の配列に下線が施されている。
本開示の実施形態によれば、配列番号３に示される重鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１１）によってコードされる。
ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＡＣＡＣＧＴＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
本開示の特定の実施形態によれば、配列番号４に示される軽鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１２）によってコードされる。
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＴＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧ
本開示の実施形態によれば、本開示は、別の抗ＯＸ４０抗体を提供し、その重鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＨ１（ＧＤＳＩＴＳＧＹ、配列番号２８）、ＣＤＲＨ２（ＩＳＦＳＧＮＴ、配列番号２９）、ＣＤＲＨ３（ＡＲＹＰＹＳＹＳＮＷＤＹＡＭＤＹ、配列番号３０）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有し、その軽鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＬ１（ＱＦＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹ、配列番号３１）、ＣＤＲＬ２（ＷＡＳ）、ＣＤＲＬ３（ＨＱＹＹＳＹＰＬＴ、配列番号３２）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有する。
本開示の特定の実施形態において、抗体は８Ａ７であり、その重鎖アミノ酸配列（配列番号５）は、以下：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＳＨＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＹＬＧＹＩＳＦＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＩＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＰＹＳＹＳＮＷＤＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
であり、その軽鎖アミノ酸配列（配列番号６）は、以下：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＶＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＦＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＨＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
である。ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められた抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域の配列に下線が施されている。
本開示の特定の実施形態によれば、配列番号５に示される重鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１３）によってコードされる。
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＴＡＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
本開示の特定の実施形態によれば、配列番号６に示される軽鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１４）によってコードされる。
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ
本開示の実施形態によれば、本開示は、更に、別の抗ＯＸ４０抗体を提供し、その重鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＨ１（ＧＤＳＩＴＩＧＦ、配列番号３３）、ＣＤＲＨ２（ＩＮＹＳＧＳＳ、配列番号３４）、ＣＤＲＨ３（ＡＲＳＧＴＤＬＤＹ、配列番号３５）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有し、その軽鎖可変領域は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められたアミノ酸配列として、ＣＤＲＬ１（ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ、配列番号３６）、ＣＤＲＬ２（ＬＶＳ）、ＣＤＲＬ３（ＷＱＧＴＨＦＰＲＴ、配列番号３７）のアミノ酸配列を含む３つの超可変領域を有する。
本開示の特定の実施形態では、抗体は９Ｄ７であり、その重鎖アミノ酸配列（配列番号７）は、以下：
ＥＶＫＬＥＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＳＧＤＳＩＴＩＧＦＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＹＭＧＹＩＮＹＳＧＳＳＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＳＧＴＤＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
であり、その軽鎖アミノ酸配列（配列番号８）は、以下：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
である。ＩＭＧＴナンバリングシステムにしたがって決められた抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域の配列に下線が施されている。
本開示の実施形態によれば、配列番号７に示される重鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１５）によってコードされる。
ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＧＴＡＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＣＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
本開示の一実施形態によれば、配列番号８に示される軽鎖アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１６）によってコードされる。
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ
本開示の一実施形態によれば、抗ＯＸ４０抗体はまた、抗体９Ｃ１２、１Ｄ９、８Ａ７、及び９Ｄ７のアミノ酸配列のいずれかに対して９０％以上の相同性を有する配列、好ましくは９５％以上の相同性を有する配列、より好ましくは９８％以上の相同性を有する配列、更により好ましくは９９％以上の相同性を有する配列であることができる。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、抗体９Ｃ１２、１Ｄ９、８Ａ７、及び９Ｄ７のアミノ酸配列のいずれかに対して、１つの保存的アミノ酸置換、２つの保存的アミノ酸置換、又は３つの保存的アミノ酸置換、或いは更に多くの保存的アミノ酸置換を有することができる。
本明細書の抗ＯＸ４０抗体はまた、必要に応じてキット又は他の診断試薬の一部とすることができる。キットは、アンタゴニスト、抗ＯＸ４０抗体又は薬剤参照物質、タンパク質精製カラム、免疫グロブリンアフィニティ精製バッファ、細胞アッセイ希釈剤、指示書又は文書などのいずれか１以上を含むことができる。抗ＯＸ４０抗体は、各種診断試験で使用することができ、例えば、各種疾患又は薬剤、毒素、その他のタンパク質の存在を、インビトロ又はインビボで検出することができる。例えば、対象の血清又は血液を検出するために用いて、関連する疾患を試験することができる。係る関連する疾患は、各種癌、炎症症状、又は自己免疫疾患などのＯＸ４０関連疾患を含むことができる。言及するまでもなく、本明細書に提供される抗体はまた、癌のラジオイムノアッセイ及びラジオイムノセラピーに使用することができる。
本開示の実施形態を以下に詳細に説明する。以下に説明する実施形態は例示的なものであり、本開示を説明するためにのみ使用され、本開示を限定するものとして理解されるべきではない。更に、明示的に述べられていない限り、以下の実施例で使用される試薬はいずれも市販されている、又は文献若しくは公知の方法にしたがって合成することができる。記載のない反応条件も当業者であれば容易に理解する。
実施例１ ＯＸ４０ハイブリドーマ細胞株の樹立
ｈＯＸ４０の完全長アミノ酸配列にしたがって、分子生物学的方法により、以下のアミノ酸配列を有するヒト融合タンパク質ｈＯＸ４０－ＨＩＳを調製した。
ＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７）
次いで、調製したｈＯＸ４０－ＨＩＳ融合タンパク質を抗原として使用し、アジュバントを添加し、マウスを免疫感作して、ｈＯＸ４０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体とハイブリドーマ細胞株とを取得した。方法は、以下の通りである。
１．マウスの免疫と細胞融合
抗原として使用される、調製済みのｈＯＸ４０－ＨＩＳ融合タンパク質をＰＢＳに溶解し、タンパク質溶液を得た。適切な量のタンパク質溶液を、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合及び乳化し、４週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの複数箇所に抗原を皮下注射した。２週間後、適切な量のタンパク質溶液を、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合及び乳化し、マウスに２回目の皮下免疫をした。その後、３回目と４回目の免疫は、３週間ごとに行った。４回目の免疫の３日後、脾臓を細胞融合のために取り出した。
融合する細胞を５日目～１０日目まで培養して、９６ウェル培養プレートのウェル中のクローン化細胞クラスターを含む培養上清を吸引し、酵素結合免疫吸着測定法によって抗体含量を検出した。抗体の分泌に応じて、高力価且つ高特異的の細胞株をスクリーニングした。
選択した細胞株をサブクローニングして、ｈＯＸ４０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌する安定な細胞株を得た。
取得した安定な細胞株を低１０％ＩｇＧ含有ウシ胎児血清で培養した。培養から７～１０日後に、細胞培養上清を回収し、Ｈｉ－ＴｒａｐプロテインＡ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティクロマトグラフィーカラムを使用して抗体を精製し、対応するハイブリドーマ抗体を得た。精製したハイブリドーマ抗体は、その後の実験でそのまま使用した。
前記ハイブリドーマ抗体は、アミノ酸配列決定によって、以下の４つのタイプを含む。
抗体９Ｃ１２、その重鎖アミノ酸配列が配列番号１であり、その軽鎖アミノ酸配列が配列番号２である。
抗体１Ｄ９、その重鎖アミノ酸配列が配列番号３であり、その軽鎖アミノ酸配列が配列番号４である。
抗体８Ａ７、その重鎖アミノ酸配列が配列番号５であり、その軽鎖アミノ酸配列が配列番号６である。
抗体９Ｄ７、その重鎖アミノ酸配列が配列番号７であり、その軽鎖アミノ酸配列が配列番号８である。
実施例２ ｈＯＸ４０ハイブリドーマ細胞株のｃＤＮＡ配列の取得
ハイブリドーマ細胞株の全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）法で抽出し、オリゴｄＴプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１８０６４－０１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅によって、実施例１の各抗体の重鎖及び軽鎖のＤＮＡ断片を取得し、クローニングベクターに連結し、クローンを選択してシークエンシングした。シークエンス結果を比較して、正確な配列を検証した。
ＰＣＲ増幅によって得られた抗体９Ｃ１２の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号９に示され、軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１０に示される。
ＰＣＲ増幅によって得られた抗体１Ｄ９の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１１に示され、軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１２に示される。
ＰＣＲ増幅によって得られた抗体８Ａ７の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示され、軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４に示される。
ＰＣＲ増幅によって得られた抗体９Ｄ７の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１５に示され、軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１６に示される。
実施例３ ＥＬＩＳＡ法によるｈＯＸ４０特異的抗体の検出
実施例１で調製されたハイブリドーマ抗体について、ｈＯＸ４０に対する各種抗体の特異的結合を、以下の工程で検出した。
１）抗原のコーティング：ｈＯＸ４０－ＨＩＳ抗原を濃度０．６μｇ／ｍｌに調整し、１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングする。
２）１％ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈）で３７℃で２時間ブロッキングし、１×ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０、１％）で３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させる。
３）一次抗体の添加：４種の抗体を濃度２μｇ／ｍｌに調製し、２μｇ／ｍｌを出発濃度として、１：５の比で７種の勾配濃度に希釈する（即ち、濃度はそれぞれ、２μｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌ、０．１２８ｎｇ／ｍｌ）。調製した一次抗体をそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳをブランク対照群として用いた。
４）二次抗体の添加：ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させ、１：５０００の比に希釈したＨＲＰ酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を、１ウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
５）発色：ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させる。ＴＭＢ発色試薬を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で５～１５分間反応させる。
６）発色停止：２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、発色反応を停止させる。
７）読み取り：マイクロプレートリーダーの各ウェルの吸光度の検出に、４５０ｎｍ吸光度を用いる。
ＥＬＩＳＡの試験結果を表１に示す。表中、ＥＣ５０値は、最大の効果をもたらす半分の濃度、即ち、最大の効果の５０％をもたらし得る濃度を表す。表１から、４種のモノクローナル抗体がいずれも、ｈＯＸ４０に特異的に結合し、結合力は、１０．８ｎＭ～０．０１７ｎＭであることが分かる。１Ｄ９抗体と比較して、９Ｃ１２抗体、８Ａ７抗体、及び９Ｄ７抗体が、より優れた特異的結合効果を示している。
表１ ｈＯＸ４０に結合するモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結果
実施例４ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ分子相互作用装置を用いた、ＯＸ４０抗体の速度論的パラメータの決定
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ分子相互作用装置を使用して、各種薬剤と各種標的タンパク質との間の相互作用の速度論と親和性定数を検出することができる。２５０ｎＭのｈＯＸ４０－ＨＩＳ抗原（ヒストン修飾ｈＯＸ４０抗原）をＧＬＭチップの表面に固定化し、ＰＢＳＴで平衡化した後、ＰＢＳＴで２倍希釈し、それぞれ５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、０ｎＭとした抗体９Ｃ１２に結合させ、次いで、ＰＢＳＴ中で解離させた。同一の検出方法で用いて、それぞれ３０８、１５４、７７、３８．５、１９．２５、０ｎＭの濃度で８Ａ７抗体を検出した。
９Ｃ１２及び８Ａ７の実験的に測定された速度論的パラメータを表２に示し、結果を図１及び図２に示す。
表２ 各抗体の速度論的パラメータ
表２中、ｋａ（１／Ｍｓ）は結合速度定数、ｋｄは解離速度定数、ＫＤは平衡定数、Ｒｍａｘはチップ表面の最大結合容量、Ｃｈｉ２はカイ二乗検定値を表す。会合速度定数及び解離速度定数は、抗原の抗体に対する結合のしにくさの程度を表す。
前記値から、９Ｃ１２抗体は８Ａ７抗体よりもｈＯＸ４０－ＨＩＳ抗原に結合し易いことが分かる。
実施例５ ＯＸ４０抗体の種特異的研究
ヒトＯＸ４０抗原、サルＯＸ４０抗原、マウスＯＸ４０抗原をそれぞれコーティングに用いて、ＯＸ４０抗体が異なる種のＯＸ４０タンパク質と交差反応するかどうかを、以下の工程によって検出した。
１）抗原のコーティング：ヒトＯＸ４０抗原、サルＯＸ４０抗原、マウスＯＸ４０抗原を０．２５μｇ／ｍｌの濃度に調整し、１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングする。
２）１％ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈）を使用し、３７℃で２時間ブロッキングし、１×ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０、１％）で３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させる。
３）一次抗体の添加：抗体９Ｃ１２を濃度２μｇ／ｍｌに調整する。２μｇ／ｍｌを出発濃度として、１：５の比で、４種の抗体を７種の勾配濃度に希釈する（即ち、濃度はそれぞれ、２μｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌ、０．１２８ｎｇ／ｍｌ）。ＰＢＳをブランク対照群として用いた。調製した一次抗体をそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
４）二次抗体の添加：ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させ、１：５０００に希釈したＨＲＰ酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を、１ウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
５）発色：ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させる。ＴＭＢ発色試薬を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で５～１５分間反応させる。
６）発色停止：５０μｌ／ウェルで２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加し、発色反応を停止させる。
７）読み取り：マイクロプレートリーダーの各ウェルの吸光度の検出に、４５０ｎｍ吸光度を用いる。
結果を表３及び図３に示す。９Ｃ１２抗体は、ヒトＯＸ４０抗原及びサルＯＸ４０抗原と同様の親和性で結合し、マウスＯＸ４０抗原と交差反応しない。
表３：種特異的結合のＥＬＩＳＡ結果
実施例６ ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）法による、９Ｃ１２とｈＯＸ４０との結合活性の検出
本実験では、２９３Ｔ－ＯＸ４０を安定的にトランスフェクトした細胞株を実験細胞として使用し、ＦＡＣＳ法を使用して細胞膜表面のｈＯＸ４０タンパク質への９Ｃ１２の結合を検出した。具体的な手順は、以下の通りである。
ｈＯＸ４０を発現している２９３Ｔ細胞を消化し、最終濃度１０６細胞／ｍｌに調製した。各群の細胞懸濁液１００μｌを１．５ｍｌのＥＰチューブに添加した。各種濃度の９Ｃ１２抗体（１００００ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１時間、氷上でインキュベートした。１時間後、ＨＢＳＳで１回洗浄した。各群に、調製したＡＰＣヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を添加し、２０分間氷上で暗所にてインキュベートし、ＨＢＳＳで１回洗浄し、最後に２００μｌのＨＢＳＳで懸濁し、細胞を試験した。
細胞膜表面での９Ｃ１２とｈＯＸ４０との結合活性をＦＡＣＳ法で検出した。結果を以下の図４と表４に示す。
表４ ＦＡＣＳ法によって検出した９Ｃ１２とｈＯＸ４０との結合活性の結果
図４と前記表の統計的結果から、９Ｃ１２抗体は、細胞膜表面のｈＯＸ４０に、２．８４ｎＭのＥＣ５０で結合することが分かる。
実施例７ インビトロでのＯＸ４０抗体によるヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の共刺激に関する研究
新鮮なヒト血液４０ｍｌを用いて、リンパ球分離液でヒトＰＢＭＣを分離した。最初にＣＤ１４単球を、ＣＤ１４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号：１３０－０５０－２０１）で正極で選択し、残りの細胞を、ＣＤ４陰極選択磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号：１３０－０９６－５３３）で選択して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２μｇ／ｍｌのＰＨＡ－Ｌ（Ｓｉｇｍａ）及び２００ＩＵ／ｍｌのヒト組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ）を添加し、６ウェルプレートに、１×１０６細胞／ウェル含有ＰＢＭＣ完全培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｌｋ Ｇｒｅｅｎ））を入れ、３７℃の５％ＣＯ２インキュベートで４８時間インキュベートした。
翌日、９６ウェルプレートの各ウェルに２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＦｃγ特異的ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）（又は２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＦｃγ特異的ＩｇＧと２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ））を含有するＰＢＳ溶液１００μｌを添加した。コーティングのため、プレートを冷蔵庫で４℃にて一晩インキュベートした。翌日、上清を除去し、ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを、インキュベータ中、３７℃で５％ＣＯ２下にて９０分間ブロッキングした。完了後、各ウェルから上清を再度除去し、ＰＢＳ溶液２００μｌを添加し洗浄して、保管した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、ＰＢＭＣ完全培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌに調整した。コーティングしたウェルに、１ウェル当たり１００μｌで懸濁液を添加した後、５０μｌのＣＤ３抗体ＯＫＴ３（２ｎｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び５０μｌの各種濃度（１μｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌで１０倍希釈）のＯＸ４０抗体又は５０μｌのＰＢＭＣ完全培地を添加し、十分に混合した。プレートを、インキュベータ中、３７℃で５％ＣＯ２下にて７２時間インキュベートした。
７２時間後に上清を回収し、上清中のＩＦＮ－γの発現を、ＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡ検出キット（Ｄａｙｏｕ、カタログ番号：ＤＫＷ１２－１０００－０９６）で検出した。
図５に示すように、ＯＸ４０抗体は、ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する能力を有し、ＩＦＮ－γの発現を促進することができる。
実施例８ ２細胞ルシフェラーゼレポーター遺伝子法に基づく、ＯＸ４０抗体の生物活性の検出
本実施例では、２細胞レポーター遺伝子のセットを生物活性アッセイに使用して、ＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０を介してシグナル伝達を行う能力を評価した。Ｔ細胞の活性化の量は、ＮＦκＢシグナル伝達経路に応答できる刺激による、ルシフェラーゼの過剰発現によって測定される。即ち、ＮＦκＢシグナル伝達経路はＯＸ４０抗体によって刺激され、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦκＢルシフェラーゼレポートが生成される。ＮＦκＢシグナル伝達はＯＸ４０の下流で起こり、Ｔ細胞活性化の他の測定値、例えば、増殖及びサイトカイン放出と相関し得る。Ｔ細胞の活性化量は、ルシフェラーゼの量を検出することで測定することができる。
具体的な手順は、以下の通りである。
レンチウイルスを使用して、ＣＤ３２Ａを安定的に発現できる２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ）と、ヒトＯＸ４０を安定的に発現でき、ＮＦκＢシグナル伝達経路によって調節されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦκＢ－ＯＸ４０）を構築した。２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ細胞をトリプシン処理した後、完全培地に再懸濁し、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍｌに調整した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦκＢ－ＯＸ４０細胞を１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、完全培地に再懸濁し、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍｌに調整した。
９６ウェル中、２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ細胞とＪｕｒｋａｔ－ＮＦκＢ－ＯＸ４０細胞の懸濁液５０μｌを各ウェルに添加し、十分に混合した。次いで、１００μｌの各種濃度のＯＸ４０抗体（９Ｃ１２抗体及び１Ｄ９抗体、濃度１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ）又は１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＪｕｒｋａｔ細胞完全培地１００μｌを添加し、十分に混合した。インキュベータ中、３７℃で５％ＣＯ２下にて一晩２０時間インキュベートした。
翌日、混合物を１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を破棄した。ホタルルシフェラーゼ検出キット（メーカー：Ｂｉｙｕｎｔｉａｎ、カタログ番号：ＲＧ００５）の溶解液１００μｌを各ウェルに添加し、室温で３０分間振とうして、細胞を溶解し、ルシフェラーゼを放出させた。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、各ウェルから上清９０μｌを除去し、白色の不透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に添加した。各ウェルの上清に１００μｌの発色溶液を添加した後、完全に機能するマイクロプレート検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、モデル：ＥｎＶｉｓｏｎ）に入れて、その自発光強度を検出した。
結果を図６に示す。結果は、９Ｃ１２抗体及び１Ｄ９抗体がいずれも、ヒトＯＸ４０を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦκＢ－ＯＸ４０レポーター細胞に、有意な刺激効果を及ぼすことを示す。
実施例９ ＭＣ３８マウス結腸直腸癌におけるＯＸ４０抗体の、Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスモデルにおける抗腫瘍効果
具体的な手順は、以下の通りである。
ＭＣ３８細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマウス結腸癌細胞であり、Ｓｈｕｎ Ｒａｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＯＸ４０Ｌタンパク質分子と相互作用するマウス由来のＯＸ４０タンパク質分子が、遺伝子工学技術によって部分的にヒト由来のタンパク質に置き換わったマウスモデルであり、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
ＰＢＳに再懸濁したＭＣ３８細胞を、Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスの右側腹部に５×１０５細胞／０．１ｍＬの濃度で、１頭当たり０．１ｍＬの量で皮下接種した。平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３に達したところで、腫瘍体積と重量が中程度のマウスを選択し、各グループ５頭ずつ、均等に４つの実験群に分けた。群分け当日に投与を開始した。具体的な投与スケジュールは、以下の表に示す。Ｇ１群には、対照群としてＰＢＳを投与した。
表５：薬力学の実験設計
表６は、各処置群における担腫瘍マウスの腫瘍増殖阻害を示す。
表６：腫瘍増殖阻害効果
表６中、ＴＧＩ（腫瘍増殖阻害値）は腫瘍体積阻害率を表し、動物の腫瘍増殖に対する薬剤の阻害効果を評価するために使用される。ＴＧＩ値は、以下のように計算される。
ＴＧＩ値（％）＝（１－実験群の相対腫瘍体積／対照群の相対腫瘍体積）＊１００％
相対腫瘍体積は、薬剤処置期間後の腫瘍体積の変化値である。
Ｇ２群を例にとると、ＴＧＩ値は、以下のように計算される。２３日目のＧ２群の腫瘍体積変化値を２３日目の対照群の腫瘍体積変化値で除して差を求め、次いで、１からその値を減じ、ＴＧＩ値を得る。
表６から、８Ａ７抗体、１Ｄ９抗体、９Ｃ１２抗体のいずれを使用するかにかかわらず、いずれも良好な腫瘍阻害率を示している。特に、９Ｃ１２抗体は、より高い腫瘍阻害率とより優れた治療効果を示す。
図７は、様々な時点で測定された担腫瘍マウスの腫瘍体積、即ち、各種薬剤で処置されたマウスの腫瘍増殖曲線を示す。図７から、ＰＢＳ対照群と比較して、８Ａ７抗体処置、１Ｄ９抗体処置、又は９Ｃ１２抗体処置がいずれも、マウスにおいて腫瘍体積の有意な抑制を示したことが分かる。更に、８Ａ７抗体と比較して、１Ｄ９抗体と９Ｃ１２抗体は、より高い腫瘍抑制効果を示した。
本明細書中、用語「第１の」及び「第２の」は、説明目的でのみ使用され、相対的な重要性を示したり暗示したり、示された技術的特徴の数を黙示的に示すものとして理解することはできない。したがって、「第１の」及び「第２の」で定義された特徴は、明示的又は黙示的に、特徴の少なくとも１つを含み得る。本開示の説明において、「複数の」は、特に明記しない限り、少なくとも２つ、例えば、２つ、３つなどを意味する。
本明細書の記載において、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「実施例」、「特定の実施例」、又は「いくつかの実施例」などの用語に言及する記載は、実施形態又は実施例に関連して記載される特定の特徴、構造、材料、又は特性を意味し、本開示の少なくとも１つの実施形態又は実施例に含まれる。本明細書において、前記用語の概要は、必ずしも同一の実施形態又は実施例に関連している訳ではない。更に、記載された特定の特徴、構造、材料、又は特性は、任意の１以上の実施形態又は実施例で、適切な方法で組み合わせることができる。更に、当業者であれば、互いに矛盾することなく、本明細書に記載される異なる実施形態又は実施例及び異なる実施形態又は実施例の特徴を組み合わせることができる。
本開示の実施形態について、前述し、記載してきたが、前記実施形態は例示であり、本開示を限定するものとして解釈するべきではないことが理解される。当業者であれば、本開示の範囲内で、前述された実施形態及び実施例を解釈することができる。実施形態は、変更、修正、置換、及び変形を受ける。

Claims (16)

  1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことを特徴とする抗ＯＸ４０抗体。
  2. 前記抗ＯＸ４０抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体。
  3. 請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、
    前記ポリヌクレオチドは、配列番号１をコードする配列番号９に示されるヌクレオチド配列、及び配列番号２をコードする配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
  5. 宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を制御するための、前記ポリヌクレオチドに動作可能に連結された制御エレメントを更に含む、請求項４に記載の発現ベクター。
  6. 前記制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターのうちの少なくとも１つを含む、請求項５に記載の発現ベクター。
  7. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５に記載の発現ベクター。
  8. 請求項４から７のいずれかに記載の発現ベクターを含むことを特徴とする組換え細胞。
  9. 請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体を調製するための方法であって、請求項８に記載の組換え細胞を培養することを含むことを特徴とする方法。
  10. ハイブリドーマ細胞ＨＸ０１１－９Ｃ１２、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託番号Ｃ２０１８１９７で２０１８年９月２７日に寄託され、
    請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ細胞。
  11. 請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４から７のいずれかに記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え細胞、又は請求項１０に記載のハイブリドーマ細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  12. ＯＸ４０に結合することができる薬剤を同定するための方法であって、
    請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体を、候補薬剤の存在下で抗原と接触させ、前記抗ＯＸ４０抗体の前記抗原に対する第１の結合量を決定することと、
    請求項１から２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体を、前記候補薬剤の非存在下で前記抗原と接触させ、前記抗ＯＸ４０抗体の前記抗原に対する第２の結合量を決定することとを含み、
    前記抗原が、ＯＸ４０であり、
    前記第２の結合量が前記第１の結合量よりも多いことは、前記候補薬剤がＯＸ４０に結合できることを示すことを特徴とする方法。
  13. （１）請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４から７のいずれかに記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え細胞、又は請求項１０に記載のハイブリドーマ細胞と、
    （２）前記（１）以外の免疫促進剤と、
    を含むことを特徴とする薬剤の組合せ。
  14. 前記（１）以外の免疫促進剤が、抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ－３抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、Ｔｉｍ３抗体、又はＰＤ－Ｌ１抗体から選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の薬剤の組合せ。
  15. 癌を治療するための、請求項１又は２のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４から７のいずれかに記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え細胞、又は請求項１０に記載のハイブリドーマ細胞。
  16. 前記癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、又はＢ細胞リンパ腫から選択される、請求項１５に記載の抗ＯＸ４０抗体、ポリヌクレオチド、発現ベクター、組換え細胞、又はハイブリドーマ細胞。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017514461A (ja) 2014-03-31 2017-06-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体及び使用方法
WO2018112346A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-ox40 antibodies and their uses
JP2018520657A (ja) 2015-05-29 2018-08-02 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｘ４０に対する抗体およびその使用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX353931B (es) * 2011-07-11 2018-02-02 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticuerpos que se unen a ox40 y sus usos.
AU2012299421B2 (en) * 2011-08-23 2016-02-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-OX40 antibodies and methods of using the same
TW201619200A (zh) * 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
AU2016256911B2 (en) * 2015-05-07 2022-03-31 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of use thereof
CN108299560B (zh) * 2017-01-13 2019-07-19 泰州翰中生物医药有限公司 抗pd-1的单克隆抗体及其应用
CN108218990B (zh) * 2017-12-29 2021-03-02 南京优迈生物科技有限公司 分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017514461A (ja) 2014-03-31 2017-06-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体及び使用方法
JP2018520657A (ja) 2015-05-29 2018-08-02 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｘ４０に対する抗体およびその使用
WO2018112346A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-ox40 antibodies and their uses

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