TW202342528A - 抗人類ｃｘｃｌ１抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種藉由產生包含阻礙腫瘤微環境(TME)的形成或抑制其形成之TME的變化而發揮抗腫瘤效果的物質。本發明係有關於一種具有特定之CDR序列的抗人類CXCL1之抗體或其抗體片段。
Description
本發明係有關於一種抗人類CXCL1之抗體或其抗體片段及其用途。
癌症為發生於多數臟器之疾病，係全世界罹患者數極高的疾患。作為癌症治療方法，一般可舉出外科療法、放射線療法、化學療法(包含由抗體構成的抗癌劑)。尤為實質癌時，作為根治治療，大多數係以外科手術切除最為有效，使用抗癌劑之治療亦常於切除前後輔助使用。
目前已有多種對各種癌症有效的抗癌劑上市，而使用於治療。近年來，對於抗癌劑，透過去除免疫抑制作用，使免疫細胞活化而發揮抗腫瘤效果者、抑制腫瘤內的血管新生而發揮抗腫瘤效果等藉由與直接抑制癌細胞的增殖或生存之現存型式的抗腫瘤活性不同的作用機制之抗腫瘤劑的開發備受矚目。
其中之一有藉由改變腫瘤微環境(TME)而發揮抗腫瘤效果的抗腫瘤劑。TME係指藉由在腫瘤組織中，癌細胞與間質細胞・間質成分彼此相互混合而彼此造成影響所形成之有利於腫瘤的環境，近年來已逐漸闡明此TME的形成會對腫瘤的增殖、抗藥性機構發揮重要的作用(例如參照非專利文獻1)。因此，咸認改變TME，可抑制癌細胞的增殖抑制，甚而抑制腫瘤的惡化，而持續進行著重於TME的形成之抗腫瘤劑的開發。
構成TME之間質細胞的一種有源自骨髓之間葉系幹細胞(BM-MSC)。已知BM-MSC會對體液性因子的產生，或透過分化成癌症相關纖維母細胞，產生膠原蛋白等細胞外基質而形成TME形成發揮重要的作用(例如參照非專利文獻2)。細胞外基質除作為癌細胞增殖的基礎外，亦會成為以癌細胞為直接標的之現有的化學療法藥物的障礙。因此，研判將參與TME形成之BM-MSC自TME排除，能有助於抑制腫瘤增殖或發揮作為化學療法藥物之功效(例如參照非專利文獻3)。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Lillian Sun et.al., JCI Insight, 2019 Apr 4;4(7)
[非專利文獻2] Hiroaki Kasashima et. Al., Am. J. Pathol., Vol.186, No.11, November 2016
[非專利文獻3] Augustin Le Naour et.al., J. Mol. Biol., Vol.12(3), pp.202-2015, 2020
[非專利文獻4] Krishna Mohan Sepuru et.al., J.Biol Chem. 2016 Feb 19;291(8):4247-55
[發明所欲解決之課題]
於此種狀況下，吾人便期望開發出藉由產生包含阻礙腫瘤微環境(TME)的形成或抑制其形成之TME的變化而發揮抗腫瘤效果的物質等。
[解決課題之手段]
本發明係考量上述狀況而完成者，茲提供以下所示抗人類CXCL1抗體及其抗體片段，以及其用途(醫藥組成物等)等。
[1]一種抗人類CXCL1之抗體，其中，
(a)重鏈可變區(VH)之互補性決定區(CDR)1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號2、3及4所示胺基酸序列、或
序列編號2、34及4所示胺基酸序列
所構成，且
輕鏈可變區(VL)之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號6、7及8所示胺基酸序列
所構成，
(b)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號10、11及12所示胺基酸序列
所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號14、15及16所示胺基酸序列、
序列編號14、36及16所示胺基酸序列、
序列編號14、38及16所示胺基酸序列、或
序列編號14、40及16所示胺基酸序列
所構成，
(c)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號18、19及20所示胺基酸序列、
序列編號18、42及20所示胺基酸序列、
序列編號18、44及20所示胺基酸序列、
序列編號18、46及20所示胺基酸序列、
序列編號18、48及20所示胺基酸序列、
序列編號18、50及20所示胺基酸序列、
序列編號18、52及20所示胺基酸序列、
序列編號18、54及20所示胺基酸序列、
序列編號18、56及20所示胺基酸序列、
序列編號18、58及20所示胺基酸序列、
序列編號18、60及20所示胺基酸序列、或
序列編號18、62及20所示胺基酸序列
所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號22、23及24所示胺基酸序列
所構成，或者，
(d)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號26、27及28所示胺基酸序列、
序列編號26、64及28所示胺基酸序列、或
序列編號26、66及28所示胺基酸序列
所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號30、31及32所示胺基酸序列
所構成。
[2]一種抗體，其中，
(a)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號2、34及4所示胺基酸序列所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號6、7及8所示胺基酸序列所構成，
(b)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號10、11及12所示胺基酸序列所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號14、36及16所示胺基酸序列所構成，
(c)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號18、54及20所示胺基酸序列所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號22、23及24所示胺基酸序列所構成，或者，
(d)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號26、64及28所示胺基酸序列所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號30、31及32所示胺基酸序列所構成。
[3]一種抗人類CXCL1之抗體，其中，
(a)重鏈可變區(VH)之胺基酸序列係由序列編號1或33所示胺基酸序列所構成，且輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列係由序列編號5所示胺基酸序列所構成，
(b)VH之胺基酸序列係由序列編號9所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號13、35、37或39所示胺基酸序列所構成，或者，
(c)VH之胺基酸序列係由序列編號17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號21所示胺基酸序列所構成。
[4]一種抗人類CXCL1之抗體，其中，
(a)重鏈可變區(VH)之胺基酸序列係由序列編號68或69所示胺基酸序列所構成，且輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列係由序列編號70或71所示胺基酸序列所構成，
(b)VH之胺基酸序列係由序列編號72或73所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號74或75所示胺基酸序列所構成，
(c)VH之胺基酸序列係由序列編號76或77所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號78或79所示胺基酸序列所構成，或者，
(d)VH之胺基酸序列係由序列編號25、63或65所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號29或67所示胺基酸序列所構成。
[5]一種抗人類CXCL1之抗體，其中，
(a)VH之胺基酸序列係由序列編號68所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號70所示胺基酸序列所構成，
(b)VH之胺基酸序列係由序列編號72所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號74所示胺基酸序列所構成，
(c)VH之胺基酸序列係由序列編號76所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號78所示胺基酸序列所構成，或者，
(d)VH之胺基酸序列係由序列編號63所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號67所示胺基酸序列所構成。
[6]如上述[1]、[2]、[4]及[5]中任一項之抗體，其中抗體為人類抗體。
[7]如上述[1]~[6]中任一項之抗體，其中抗體係具有抗腫瘤活性。
[8]如上述[1]~[7]中任一項之抗體，其係用於腫瘤的治療或預防。
[9]如上述[7]或[8]之抗體，其中腫瘤係伴有間質增生。
[10]如上述[7]~[9]中任一項之抗體，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
[11]如上述[10]之抗體，其中人類胃癌為胃硬癌。
[12]如上述[1]~[6]中任一項之抗體，其係具有阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之活性。
[13]一種抗體片段，其係源自於如上述[1]~[12]中任一項之抗體。
[14]一種醫藥組成物，其係包含如上述[1]~[12]中任一項之抗體、及/或如上述[13]之抗體片段。
[15]如上述[14]之醫藥組成物，其係用於腫瘤的治療或預防。
[16]如上述[15]之醫藥組成物，其中腫瘤係伴有間質增生。
[17]如上述[15]或[16]之醫藥組成物，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
[18]如上述[17]之醫藥組成物，其中人類胃癌為胃硬癌。
[19]如上述[14]~[18]中任一項之醫藥組成物，其進一步包含選自由具抗腫瘤活性之化合物、具殺細胞活性之化合物及免疫檢查點抑制劑所成群組的至少1種以上，或者與前述至少1種以上組合使用。
[20]如上述[14]之醫藥組成物，其係用於阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移。
[21]一種腫瘤之治療或預防方法，其係包含對對象投予如上述[1]~[12]中任一項之抗體、及/或如上述[13]之抗體片段，或者如上述[14]~[19]中任一項之醫藥組成物。
[22]如上述[21]之方法，其中腫瘤係伴有間質增生。
[23]如上述[21]或[22]之方法，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
[24]如上述[23]之方法，其中人類胃癌為胃硬癌。
[25]一種阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之方法，其係包含對對象投予如上述[1]~[12]中任一項之抗體、及/或如上述[13]之抗體片段，或者如上述[20]之醫藥組成物。
[26]一種腫瘤的治療、預防或診斷用套組，其係包含如上述[1]~[12]中任一項之抗體、及/或如上述[13]之抗體片段。
[27]如上述[26]之套組，其中腫瘤係伴有間質增生。
[28]如上述[26]或[27]之套組，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
[29]如上述[28]之套組，其中人類胃癌為胃硬癌。
[30]一種人類CXCL及/或小鼠CXCL與醣胺聚醣(GAG)之結合抑制劑或結合抑制劑，其係包含如上述[1]~[12]中任一項之抗體、及/或如上述[13]之抗體片段。
於此，作為該人類CXCL不予限定，可舉出例如人類CXCL1、人類CXCL2、人類CXCL3及人類CXCL5；作為小鼠CXCL不予限定，可舉出例如小鼠CXCL1。
[發明之效果]
根據本發明，可提供一種可誘發阻礙或抑制腫瘤微環境(TME)的形成等之TME的變化的抗人類CXCL1抗體及其片段。本發明之抗人類CXCL1抗體及其片段係例如具有抗腫瘤活性，在可使用於腫瘤的治療或預防等屬有用者。
又，根據本發明，亦可提供包含該抗人類CXCL1抗體或其片段的醫藥組成物或套組等。
[實施發明之形態]
以下詳細說明本發明。本發明之範圍不受此等說明所限，對於以下例示以外者，在不損及本發明意旨的範圍亦可適宜變更實施。
此外，本說明書係包含作為本案優先權主張之基礎的日本特願2022-011107號說明書(2022年1月27日申請)全體。又，本說明書中所引用的所有刊物，例如先前技術文獻及公開公報、專利公報以外的專利文獻係併入本說明書中作為參照。
1.本發明之概要
CXCL1(C-X-C motif chemokine ligand 1)係CXC家族的成員，亦已知作為角質細胞衍生趨化因子(KC：keratinocyte-derived chemokines)或生長相關致癌基因(GRO：growth-related oncogene)。CXCL1係由巨噬細胞、嗜中性球及上皮細胞表現，然而亦已知其會於數種類型的人類癌症中亢進，而特異性地結合於CXC趨化因子受體之CXCR2(C-X-C Motif Chemokine Receptor 2)。
本發明為抗人類CXCL1(HuCXCL1)之抗體(抗HuCXCL1抗體)或其抗體片段，除HuCXCL1外，亦可結合於其他人類CXC家族。又，本發明係如前述，其特徵為該抗體中之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的互補性決定區(CDR)1、CDR2及CDR3之胺基酸序列、或者VH及VL全體之胺基酸序列係由特定的序列所構成。
本發明之抗HuCXCL1抗體及其抗體片段係可誘發腫瘤微環境(TME)的變化，阻礙或抑制TME的形成，而具有抗腫瘤活性者。詳而言之，構成TME之間質細胞的一種有源自骨髓之間葉系幹細胞(BM-MSC)，此BM-MSC對建構TME發揮重要的作用。而且，BM-MSC朝腫瘤部的遷移對癌細胞或由腫瘤部放出之CXCL1與在BM-MSC表現之CXCR2的訊息傳遞顯示重要的作用。本發明之抗HuCXCL1抗體及其抗體片段藉由特異性地辨識癌細胞或由腫瘤部放出之CXCL1，抑制CXCL1與CXCR2的訊息傳遞，而阻礙或抑制BM-MSC朝腫瘤部的遷移(即阻礙或抑制TME的形成)。其結果，本發明之抗HuCXCL1抗體及其抗體片段係具有抗腫瘤效果。
如後述實施例所示，本發明之抗HuCXCL1抗體係從多達約10,000種的抗HuCXCL1抗體殖株中，重複多次各種實驗及探討，而篩選出作為上述具有抗腫瘤效果者。本發明之抗HuCXCL1抗體及其抗體片段對腫瘤(尤為伴有間質增生之腫瘤)的治療或預防等係屬有用且實用性優良。
2.抗HuCXCL1之抗體(抗HuCXCL1抗體)
(1) 抗原的調製
HuCXCL1之胺基酸序列(序列編號81)之資訊係例如於Uniprot之網頁(https://www.uniprot.org/)以「Primary (citable) accession number：P09341」公開，或者於NCBI (GenBank)之網頁(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以「Accession number：AAP35526」公開。此外，編碼HuCXCL1之胺基酸序列的鹼基序列(序列編號80)之資訊係於NCBI(GenBank)之網頁以「Accession number：BT006880」發布。
作為抗原，可使用包含HuCXCL1之胺基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或胜肽(亦簡稱胜肽)。
作為抗原之胜肽的製作方法可為化學合成或藉由使用大腸菌等的基因工程手法之合成，可利用本業者熟知之方法。
進行胜肽的化學合成時，可藉由胜肽的週知合成方法來合成。又，其合成可應用固相合成法及液相合成法任一種。亦可使用市售胜肽合成裝置(例如島津製作所製：PSSM-8等)。
以基因工程方式合成胜肽時，係首先設計、合成編碼該胜肽之DNA。該設計及合成可例如以包含全長HuCXCL1基因之載體等為模板，使用設計成可合成期望的DNA區域之引子，藉由PCR法來進行。又，亦可基於該胜肽之胺基酸序列，基因合成5’末端插入有Kozak轉譯起始序列、3’側插入有轉譯終止密碼子的DNA(利用GENEWIZ公司之服務等)。然後，藉由將上述DNA連結至適當的載體而得到蛋白質表現用重組載體，再將此重組載體以目標基因可表現的方式導入宿主中而得到轉形體(Molecular cloning 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012))。
載體係使用可於宿主微生物自律地增殖的嗜菌體或質體。再者，亦可使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的製作，只要將純化之DNA以適當的限制酶切斷，插入至適當的載體DNA之限制酶部位等而連結於載體即可。轉形所使用之宿主，只要是可表現目標基因者則不特別限定。可舉出例如細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。亦可使用山羊等哺乳動物作為宿主。重組載體對宿主之導入方法為週知者。然後，培養前述轉形體，自其培養物中採取作為抗原使用之胜肽。「培養物」係指(a)培養上清液、(b)培養細胞或者培養菌體或其粉碎物任一者。
培養後，目標胜肽在菌體內或細胞內產生時，藉由將菌體或細胞粉碎而萃取出胜肽。又，當目標胜肽在菌體外或細胞外產生時，則直接使用培養液，或藉由離心分離等去除菌體或細胞。其後，藉由單獨或適宜組合使用用於胜肽之分離純化的一般的生物化學方法、例如硫酸銨沉澱、凝膠過濾、離子交換層析法、親和層析法等，可分離純化目標胜肽。
作為抗原之胜肽亦可藉由使用無細胞合成系統的體外轉譯而得。此時，可利用以RNA為模板之方法與以DNA為模板之方法(轉錄/轉譯)此2種方法。無細胞合成系統可使用市售系統，例如Expressway
TM系統(Invitrogen公司)、PURESYSTEM(註冊商標；Post Genome研究所)、TNT系統(註冊商標；Promega公司)等。
如上述所得之胜肽亦可結合於適當的載體蛋白質，例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)、人類甲狀球蛋白、雞伽瑪球蛋白等。
又，抗原可為在HuCXCL1之胺基酸序列(序列編號81)或前述之其部分序列中1或多個胺基酸缺失、取代或加成之胺基酸序列所構成的胜肽。亦可使用例如HuCXCL1之胺基酸序列或其部分序列中1或多個(較佳為1個或數個(例如1個~10個，更佳為1個~5個))胺基酸缺失、1或多個(較佳為1個或數個(例如1個~10個，更佳為1個~5個))胺基酸被其他胺基酸取代，或者加成1或多個(較佳為1個或數個(例如1個~10個，更佳為1個~5個))其他胺基酸之胺基酸序列所構成的胜肽。
用於導入至細胞等的基因可舉出HuCXCL1蛋白質或者其部分片段或編碼此等變異型蛋白質或片段的基因。此種基因可使用例如具有序列編號80所示之鹼基序列或其部分序列者。
又，用於導入至細胞等的基因亦可使用與和序列編號80所示之鹼基序列互補之序列在高度嚴格的條件下雜交且編碼具有與HuCXCL1同樣的活性之蛋白質的鹼基序列、或其部分序列。
「高度嚴格的條件」係指雜交後之洗淨時的條件，意指緩衝液的鹽(鈉)濃度為10~500mM、溫度為42℃~72℃，較佳為上述鹽濃度為50~300mM、溫度為55~68℃下之條件。
要對基因導入變異，可藉由Kunkel法或Gapped duplex法等週知手法，使用例如利用部位特異的突然變異誘發法之變異導入用套組，例如GeneTailor
TMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司製)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：Takara Bio公司製)來進行。
(2) 多株抗體的製作
將調製之抗原投予至哺乳動物以達免疫。哺乳動物不特別限定，可舉出例如大鼠、小鼠及兔子等，其中較佳為小鼠。
每隻動物的抗原投予量可根據有無佐劑而適宜設定。佐劑可舉出弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫可主要注入至靜脈內、腳掌、皮下、腹腔內等來進行。又，就免疫的間隔，不特別限定，係以數日至數週間隔，較佳為每隔1週，以1~10次，較佳為2~3次進行免疫。然後，自最終免疫日起3~7日後，以酵素免疫測定法(ELISA或EIA)或放射性免疫測定法(RIA)等測定抗體價，並於顯示期望抗體價之該日採血，可獲得抗血清。上述抗體之採取方法中，需要純化抗體時，可適宜選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析法等週知之方法、或組合此等方法而予以純化。其後以ELISA法等測定抗血清中之多株抗體的反應性。
(3) 單株抗體的製作
(3-1) 抗體產生細胞的採取
本發明之抗HuCXCL1抗體不特別限定，較佳為單株抗體。
將調製之抗原投予至哺乳動物，例如大鼠、小鼠及兔子等以達免疫。每隻動物的抗原投予量可根據有無佐劑而適宜設定。佐劑係與上述相同。免疫手法亦與前述相同。然後，自最終免疫日起1~60日後，較佳為1~14日後採取抗體產生細胞。抗體產生細胞可舉出脾臟細胞、淋巴節細胞及末梢血細胞等，其中較佳為淋巴節細胞及脾臟細胞。
(3-2) 細胞融合
為獲得融合瘤(抗體產生細胞株)，而進行抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合。作為與抗體產生細胞融合之骨髓瘤細胞，可使用小鼠等動物之一般可取得的株化細胞。作為所用細胞株，較佳為具有藥劑選擇性，且具有在未融合的狀態下於HAT選擇培養基(包含次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷)中無法生存，僅能在與抗體產生細胞融合之狀態下生存之性質者。
骨髓瘤細胞可舉出例如P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8 (X63)、P3-X63-Ag8.U1(P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1(NS1)及Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等小鼠骨髓瘤細胞株。骨髓瘤細胞的選擇可適宜考量與抗體產生細胞的相容性來進行。
其次，使骨髓瘤細胞與抗體產生細胞進行細胞融合。細胞融合係於不含血清之DMEM及RPMI-1640培養基等的動物細胞用培養基中，將1×10
6~1×10
7個/mL的抗體產生細胞與2×10
5~2×10
6個/mL的骨髓瘤細胞混合。抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞比(抗體產生細胞：骨髓瘤細胞)不特別限定，通常較佳定為1：1~10：1，更佳為3：1。其次，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應。細胞融合促進劑可使用例如平均分子量1,000~6,000道爾頓(D)之聚乙二醇等。又，亦可使用利用電刺激(例如電穿孔法)之市售細胞融合裝置，使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞進行融合。
(3-3) 融合瘤的篩選及選殖
自細胞融合處理後的細胞中篩選出目標融合瘤。作為其方法，係將細胞懸浮液，以例如含胎牛血清之RPMI-1640培養基等適當稀釋後，播灑於微量滴定盤上，對各井孔添加選擇培養基，然後適當更換選擇培養基來進行培養。其結果，以選擇培養基開始培養後，自14日前後可獲得長出的細胞，其為雜交瘤形態。
其次，在長出之融合瘤的培養上清液中，篩選與HuCXCL1反應之抗體是否存在。融合瘤的篩選只要依循一般方法即可，不特別限定。例如，可採取以融合瘤形態生成之井孔所含之培養上清液的一部分，並藉由ELISA、EIA及RIA等來進行篩選。
融合細胞的選殖可藉由有限稀釋法等來進行。藉由流式細胞儀等判定對HuCXCL1顯示強烈反應性的抗體，選擇可產生其之融合瘤而樹立作為殖株。
(3-4) 單株抗體的採取
作為培養樹立之融合瘤，且自所得之培養物採取單株抗體之方法，可採用一般的細胞培養法或腹水形成法等。「培養」係指使融合瘤在培養皿或培養瓶中生長，或者使融合瘤如下述般在動物的腹腔內增殖之意。
於細胞培養法中，可將融合瘤在含10%胎牛血清之RPMI-1640培養基、MEM培養基或無血清培養基等的動物細胞培養培養基中，以一般的培養條件(例如37℃、5%CO
2濃度)培養7~14日，自其培養上清液中取得抗體。
若為腹水形成法時，係對與源自骨髓瘤細胞之哺乳動物同種的動物之腹腔內投予約1×10
7個融合瘤，使融合瘤大量增殖。然後，較佳於2~3週後採取腹水。
上述抗體之採取方法中，需純化抗體時，可適宜選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾、親和層析法等週知之方法、或組合此等方法而予以純化。
(3-5) 具有抗腫瘤活性之殖株的篩選
本發明之抗HuCXCL1抗體較佳為例如具有抗腫瘤活性之抗體。
於此，「抗腫瘤活性」係指殺死腫瘤細胞(癌細胞)之活性或抑制腫瘤成長之活性。抗腫瘤活性較佳可舉出例如抑制癌細胞的增殖之活性或抑制腫瘤血管新生之活性。又，本發明之抗體可發揮抗腫瘤活性之人類腫瘤(腫瘤細胞)的種類可舉出確認有HuCXCL1的表現之週知之各種人類腫瘤，不特別限定，較佳為伴有間質增生之腫瘤。更具體而言，該人類腫瘤較佳可舉出人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌等各種人類腫瘤中的1種或2種以上，更佳為人類胃癌，特佳為胃硬癌。再者，上述腫瘤的種類可為復發癌或轉移癌，本發明之抗體對此等腫瘤均可發揮優良的抗腫瘤活性。
in vivo之抗腫瘤活性的確認可例如透過使用將期望的腫瘤細胞移植至小鼠的皮下之荷癌小鼠(荷癌動物治療模型)，並對此小鼠投予如前述所得之抗體來進行。此時，抗體之投予可於腫瘤細胞移植後隨即進行(prevention模型)，亦可確認移植腫瘤達既定體積後進行(treatment模型)。投予方法不特別限定，可定為例如每3日、1週、10日或2週以1次或者單次(僅1次)、5~20mg/kg體重進行腹腔內投予等。如採prevention模型時，可根據腫瘤形成頻率與腫瘤體積來評定有無抗腫瘤活性及其程度。如採treatment模型時，則可根據腫瘤體積來評定有無抗腫瘤活性及其程度。
本發明中的抗HuCXCL1抗體，可舉出例如
(a)重鏈可變區(VH)之互補性決定區(CDR)1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號2、3及4所示胺基酸序列、或
序列編號2、34及4所示胺基酸序列
(其中較佳為序列編號2、34及4所示胺基酸序列)
所構成，且
輕鏈可變區(VL)之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號6、7及8所示胺基酸序列
所構成之抗體，或
(b)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號10、11及12所示胺基酸序列
所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號14、15及16所示胺基酸序列、
序列編號14、36及16所示胺基酸序列、
序列編號14、38及16所示胺基酸序列、或
序列編號14、40及16所示胺基酸序列
(其中較佳為序列編號14、36及16所示胺基酸序列)
所構成之抗體，或
(c)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號18、19及20所示胺基酸序列、
序列編號18、42及20所示胺基酸序列、
序列編號18、44及20所示胺基酸序列、
序列編號18、46及20所示胺基酸序列、
序列編號18、48及20所示胺基酸序列、
序列編號18、50及20所示胺基酸序列、
序列編號18、52及20所示胺基酸序列、
序列編號18、54及20所示胺基酸序列、
序列編號18、56及20所示胺基酸序列、
序列編號18、58及20所示胺基酸序列、
序列編號18、60及20所示胺基酸序列、或
序列編號18、62及20所示胺基酸序列
(其中較佳為序列編號18、54及20所示胺基酸序列)
所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號22、23及24所示胺基酸序列
所構成之抗體，或
(d)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號26、27及28所示胺基酸序列、
序列編號26、64及28所示胺基酸序列、或
序列編號26、66及28所示胺基酸序列
(其中較佳為序列編號26、64及28所示胺基酸序列)
所構成，且
VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由
序列編號30、31及32所示胺基酸序列
所構成之抗體等。
又，本發明中之抗HuCXCL1抗體亦較佳可舉出前述委託之由各種融合瘤所產生的抗體(抗HuCXCL1單株抗體)。
(3-6) 抗HuCXCL1抗體之抗原決定位
本發明中之抗HuCXCL1抗體之抗原決定位(抗原決定基)只要是抗原之HuCXCL1的至少部分區域即可。辨識該區域(與該區域或包含該區域之部分結合)之抗HuCXCL1抗體可更有效果地發揮例如如後述之抗HuCXCL1抗體之特性而為有用者。
又，結合於本發明中之抗HuCXCL1抗體所結合(辨識)的抗原決定位區域之抗體亦包含於本發明。
(3-7) 抗HuCXCL1抗體之特性
本發明之抗HuCXCL1抗體係如前述，為具有抗腫瘤活性之抗體，較佳為例如在荷癌動物模型中顯示腫瘤成長抑制活性之抗體等。該腫瘤成長抑制活性較佳以更低用量顯示，例如相對於荷癌動物模型，係以20mg/kg體重以下(較佳為10mg/kg體重以下，更佳為5mg/kg體重以下，更佳為1mg/kg體重以下)的投予量為佳。
於此，腫瘤成長抑制活性(%)可例如根據下述式算出。
腫瘤成長抑制活性(%)=100-[(抗體投予群的腫瘤體積或腫瘤重量)÷(對照群的腫瘤體積或腫瘤重量)]×100
且，本發明之抗HuCXCL1抗體係如前述，較佳為具有表現CXCR2的細胞(具體而言為BM-MSC等)之遷移阻礙或抑制活性之抗體。
於此，CXCR2表現細胞之遷移阻礙或抑制活性(%)可例如藉由下式算出。
遷移阻礙或抑制活性(%)=100-[(每單位面積之抗體投予群的遷移細胞數)÷(每單位面積之對照群的遷移細胞數)]×100
再者，本發明之抗HuCXCL1抗體不特別限定，解離常數(Kd值)較佳為1.0×10
-10M以下，更佳為1.0×10
-11M以下，再更佳為1.0×10
-12M以下。於此，抗體的結合力(親和性)可例如藉由Scatchard解析或所稱Biacore之表面電漿子共振感測器，以解離常數(Kd值)、解離速率常數(Kdiss [1/Sec])、結合速率常數(Kass [1/M.Sec])來測定。Biacore裝置可舉出例如Biacore 3000、Biacore 2000、Biacore X、Biacore J、Biacore Q(皆為Biacore公司)等。抗體其解離常數(Kd值)愈小則結合力(親和性)愈高而較佳。Kd值係由Kdiss及Kass此兩參數來決定，例如可由式：Kd[M]=Kdiss/Kass表示。
(4) 基因重組抗體、及抗體片段
(4-1) 基因重組抗體
本發明之抗HuCXCL1抗體的較佳樣態之一可舉出基因重組抗體。基因重組抗體不予限定，可舉出例如嵌合抗體、人類化抗體(人類化抗體)及人類抗體(完全人類抗體)等。
嵌合抗體(即人類型嵌合抗體)係將小鼠由來抗體之可變區連結(接合)於源自人類之恆定區的抗體(茲參照Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等)；在製作嵌合時，可藉由基因重組技術容易地建構，俾可獲得如此連結之抗體。
製作人類化抗體時，係從小鼠抗體之可變區將互補性決定區(CDR)移植至人類可變區，使架構區(FR)由人類來源物所構成、CDR由小鼠來源物所構成，而製作再構成之可變區(所謂CDR嫁接(CDR移植))。其次，將此等人類化之再構成人類可變區連結於人類恆定區。此種人類化抗體之製作方法係於該領域廣為人知(Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；日本特表平4-502408號公報(參照日本專利第2828340號公報；Queen等人)等)。
於此，作為嵌合抗體之本發明之抗HuCXCL1抗體較佳可舉出例如
(a)重鏈可變區(VH)之胺基酸序列係由序列編號1或33所示胺基酸序列所構成，且輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列係由序列編號5所示胺基酸序列所構成之抗體，或
(b)VH之胺基酸序列係由序列編號9所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號13、35、37或39所示胺基酸序列所構成之抗體，或
(c)VH之胺基酸序列係由序列編號17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號21所示胺基酸序列所構成之抗體等。
再者，作為人類化抗體之本發明之抗HuCXCL1抗體較佳可舉出例如
(a)重鏈可變區(VH)之胺基酸序列係由序列編號68或69所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號68所示胺基酸序列)所構成，且輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列係由序列編號70或71所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號70所示胺基酸序列)所構成之抗體，或
(b)VH之胺基酸序列係由序列編號72或73所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號72所示胺基酸序列)所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號74或75所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號74所示胺基酸序列)所構成之抗體，或
(c)VH之胺基酸序列係由序列編號76或77所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號76所示胺基酸序列)所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號78或79所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號78所示胺基酸序列)所構成之抗體等。
人類抗體(完全人類抗體)，一般而言V區域之抗原結合部位的超可變區(Hyper Variable region)、V區域之其他部分及恆定區的構造係具有與人類之抗體相同的構造。惟，超可變部位亦可源自於其他動物。製作人類抗體之技術亦為週知者，對於與人類共通之基因序列，既已確立藉由基因工程手法來製作之方法。人類抗體可例如藉由：使用具有包含人類抗體之H鏈及L鏈的基因之人類染色體片段的人類抗體產生小鼠之方法(參照Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等)，或取得人類抗體資料庫選出之源自嗜菌體展示之人類抗體的方法(參照Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431 等)來取得。
或者，人類抗體亦可使用：利用人類ADLib技術(WO 2015/167011所記載之資料庫)，由特異性地結合於期望的抗原(於本發明中為HuCXCL1)之殖株所產生(甚或經純化)之抗體。
於此，作為人類抗體之本發明之抗HuCXCL1抗體可較佳舉出例如
VH之胺基酸序列係由序列編號25、63或65所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號63所示胺基酸序列)所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號29或67所示胺基酸序列(其中較佳為序列編號67所示胺基酸序列)所構成之抗體等。
上述嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體較佳為抗體Fc區域中之N-糖苷鍵複合型糖鏈為岩藻糖未結合於該糖鏈之還原末端的N-乙醯葡糖胺之糖鏈者；詳而言之，可舉出在抗體分子的Fc區域具有該岩藻糖的1位未α結合於N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺的6位之糖鏈的基因重組抗體分子所構成之抗體。若為此種抗體，可提升ADCC活性。此外，此點(抗體Fc區域中之N-糖苷鍵複合型糖鏈的特徵)對於前述多株抗體及單株抗體亦同樣地較佳。
(4-2) 抗體片段
本發明之抗HuCXCL1抗體之片段(部分片段)亦屬包含於本發明之抗體者。於此，本發明之抗體片段係與本發明之抗HuCXCL1抗體同為具有對HuCXCL1之結合活性者(即可結合於HuCXCL1者)，較佳為具有如前述之阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之活性，或者抗腫瘤活性者。
該抗體之片段係指抗HuCXCL1多株抗體或抗HuCXCL1單株抗體的部分區域(即源自本發明之抗HuCXCL1抗體之抗體片段)，可舉出例如Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv(variable fragment of antibody)、單股抗體(H鏈、L鏈、H鏈V區及L鏈V區等)、scFv、diabody(scFv二聚體)、dsFv(二硫鍵穩定化V區)，以及至少一部分包含互補性決定區(complementarity determining region：CDR)之胜肽等。
Fab係將抗體分子以蛋白質分解酵素木瓜蛋白酶進行處理而得之片段當中，H鏈之N末端側約半部與整條L鏈以二硫鍵鍵結之分子量約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。又，亦可藉由將編碼抗體之Fab的DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，再將該載體導入至原核生物或真核生物中使其表現來製造Fab。
F(ab’)
2係將抗體分子以蛋白質分解酵素胃蛋白酶進行處理而得之片段當中，略大於Fab經由鉸鏈區之二硫鍵而鍵結者，且分子量約10萬之具有抗原結合活性的抗體片段。又，亦可使後述之Fab形成硫醚鍵或二硫鍵來製作。
Fab’係將上述F(ab’)
2之鉸鏈區的二硫鍵切斷之分子量約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。又，亦可藉由將編碼抗體之Fab’的DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，再將該載體導入至原核生物或真核生物中使其表現來製造Fab’。
scFv係使用適當的胜肽連結子(P)將1條重鏈可變區(VH)與1條輕鏈可變區(VL)連結之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且具有抗原結合活性的抗體片段。scFv可透過取得編碼抗體之VH及VL的cDNA，建構編碼scFv之DNA，並將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，再將該表現載體導入至原核生物或真核生物中使其表現來製造。
diabody係scFv經二聚化之抗體片段，且具有二價抗原結合活性的抗體片段。二價抗原結合活性可相同或定為其中一者不同的抗原結合活性。diabody可透過取得編碼抗體之VH及VL的cDNA，將編碼scFv之DNA建構成P之胺基酸序列的長度為8殘基以下，並將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，再將該表現載體導入至原核生物或真核生物中使其表現來製造。
dsFv係指將VH及VL中的各1個胺基酸殘基取代為半胱胺酸殘基之多肽經由該半胱胺酸殘基間的二硫鍵鍵結而成者。取代為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依循Reiter等人所示之方法(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)，基於抗體之立體構造預測來選擇。dsFv可透過取得編碼抗體之VH及VL的cDNA，建構編碼dsFv之DNA，並將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，再將該表現載體導入至原核生物或真核生物中使其表現來製造。
包含CDR之胜肽係包含VH之CDR(CDR1~3)及VL之CDR(CDR1~3)中的至少1區域以上而構成，更佳為包含全部VH之CDR者及包含全部VL之CDR者，特佳為包含全部VH及VL之CDR(共6區)者。CDR之胺基酸序列較佳可舉出前述VH及VL之CDR1~3的各種胺基酸序列。包含多個CDR之胜肽可直接或經由適當的胜肽連結子結合。包含CDR之胜肽可藉由建構編碼抗體之VH及VL之CDR的DNA，並將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，再將該表現載體導入至原核生物或真核生物中使其表現來製造。又，包含CDR之胜肽亦可藉由Fmoc法(茀基甲氧基羰基法)及tBoc法(第三丁氧基羰基法)等化學合成法來製造。
作為本發明之抗體片段，可為以原本形狀包含N-糖苷鍵複合型糖鏈為岩藻糖未結合於該糖鏈之還原末端的N-乙醯葡糖胺的糖鏈之抗體Fc區域的一部分或全部的抗體片段；又，亦可為上述抗體片段與N-糖苷鍵複合型糖鏈為岩藻糖未結合於該糖鏈之還原末端的N-乙醯葡糖胺的糖鏈之抗體Fc區的一部分或全部的融合蛋白質。若為此種抗體片段，由於可大幅提升ADCC活性而較佳。
以下，於本說明書中之說明中，上述抗體片段亦為包含於本發明之抗HuCXCL1抗體者。
3.多核苷酸、重組載體及轉形體
於本發明中，亦可提供上述本發明之抗HuCXCL1抗體或編碼該抗體片段之多核苷酸(基因、DNA)。作為該多核苷酸，具體而言較佳為包含編碼作為上述本發明之抗HuCXCL1抗體或抗體片段之例示而顯示之各胺基酸序列的鹼基序列的多核苷酸。又，本發明之多核苷酸可為僅由編碼本發明之抗HuCXCL1抗體或抗體片段之多核苷酸所構成者，亦可為部分包含該多核苷酸，此外亦包含基因表現所需之週知鹼基序列(轉錄啟動子、SD序列、Kozak序列、終止子等)者，並不予限定。
作為編碼本發明之抗HuCXCL1抗體或抗體片段之多核苷酸，對應轉譯後之各個胺基酸的密碼子不特別限定，可為轉錄後包含表示一般使用於人類等哺乳類的密碼子(較佳為高使用頻率密碼子)之核苷酸DNA者；又，亦可為包含表示一般使用於大腸菌或酵母等微生物，或植物等的密碼子(較佳為高使用頻率密碼子)之核苷酸DNA者。
本發明中，亦可提供包含上述本發明之多核苷酸的重組載體，或包含該重組載體的轉形體。
載入作為重組載體使用之表現載體的多核苷酸(基因、DNA)，可視需求預先於上游連結轉錄啟動子、SD序列(宿主為原核細胞時)及Kozak序列(宿主為真核細胞時)，亦可於下游連結終止子；此外，也可預先連結增強子、剪接訊息、聚A加成訊息、選擇標記等。此外，上述轉錄啟動子等的基因表現所需之各要素可起初包含於該多核苷酸，原本包含於表現載體時可加以利用，各要素之使用樣態不特別限定。
對表現載體載入該多核苷酸之方法可採用例如使用限制酶之方法或使用拓樸異構酶之方法等週知之利用基因重組技術的各種方法。又，作為表現載體，只要是例如質體DNA、嗜菌體DNA、反轉錄轉座子DNA、反轉錄病毒載體、人工染色體DNA等可保持本發明之抗HuCXCL1抗體或編碼其抗體片段之多核苷酸(基因、DNA)者則不予限定，可適宜選擇適於所用宿主細胞的載體來使用。
其次，藉由將建構之上述重組載體導入至宿主而得到轉形體並加以培養，可使本發明之抗HuCXCL1抗體或其抗體片段表現。此外，本發明中所稱「轉形體」，係指對宿主導入外來基因者，包含例如藉由對宿主導入質體DNA等(轉形)而導入外來基因者，以及藉由使宿主感染各種病毒及嗜菌體(形質導入(轉導))而導入外來基因者。
作為宿主，只要是導入上述重組載體後，可表現本發明之抗HuCXCL1抗體或其抗體片段者則不予限定，可適宜選擇，可舉出例如人類或小鼠等各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等週知之宿主。
以動物細胞為宿主時，可使用例如人類纖維母細胞、人類胎兒腎細胞、HEK293細胞、293F細胞、CHO細胞、猿猴細胞COS-7、Vero、小鼠L細胞、大鼠GH3、人類FL細胞等。又，亦可使用Sf9細胞、Sf21細胞等昆蟲細胞。
以細菌為宿主時，可使用例如大腸菌、枯草菌等。
以酵母為宿主時，可使用例如釀酒酵母(
Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(
Schizosaccharomyces pombe)等。
以植物細胞為宿主時，可使用例如菸草BY-2細胞等。
獲得轉形體之方法不予限定，可考量宿主與表現載體的種類之組合而適宜選擇，較佳可舉出例如電穿孔法、脂轉染法、熱衝擊法、PEG法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法，以及感染DNA病毒或RNA病毒等各種病毒之方法等。
所得轉形體中，重組載體所含之多核苷酸的密碼子型可與所用宿主的密碼子型一致或相異，而不予限定。
4.醫藥組成物等
本發明之抗HuCXCL1抗體係有用於作為醫藥組成物所含之有效成分。
本發明之抗HuCXCL1抗體由於具有抗腫瘤活性，而較佳使用於腫瘤的治療用及/或預防用，從而，該醫藥組成物係有用於作為腫瘤的治療用及/或預防用，甚而診斷用之醫藥組成物。亦即，本發明之抗HuCXCL1抗體係有用於作為腫瘤治療劑及腫瘤診斷劑所含之有效成分。此外，本發明中，上述腫瘤的治療亦包含阻礙腫瘤的成長及抑制其成長之意義；具體而言，例如若為腫瘤治療劑，亦包含腫瘤的成長阻礙劑及成長抑制劑之形態。
又，本發明之醫藥組成物亦可為用於阻礙或抑制CXCR2表現細胞(具體而言為BM-MSC等)的遷移之組成物。
本發明之醫藥組成物較佳以含有本發明之抗HuCXCL1抗體作為有效成分，且進一步含有藥學上可容許之擔體的醫藥組成物之形態提供。又，本發明之醫藥組成物亦可與已知藥劑，例如具有抗腫瘤活性之化合物(例如順鉑)、具有殺細胞活性之化合物及免疫檢查點抑制劑(例如PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑、PD-L2抑制劑等)之任1種或2種以上併用。就併用樣態，例如本發明之醫藥組成物可為進一步包含該化合物之樣態，亦可為與該化合物組合使用之樣態，而不予限定。藉由此種併用，可獲得更高的抗腫瘤效果。此外，上述免疫檢查點抑制劑係所謂亦稱PD-1路徑拮抗劑者，包含表現於T細胞上之PD-1，或可阻礙或抑制其配位子之PD-L1或PD-L2的免疫抑制訊息者。作為PD-1路徑拮抗劑，具體而言可舉出抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、PD-1細胞外結構域、PD-L1細胞外結構域、PD-L2細胞外結構域、PD-1-Ig(PD-1細胞外結構域與Ig之FC區域的融合蛋白質)、PD-L1-Ig、PD-L2-Ig等，其中較佳為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體，更佳為抗PD-1抗體及抗PD-L1抗體。上述各抗體可為例如F(ab’)2、Fab’、Fab及Fv片段之形態。上述各抗體係包含習知或市售任一種抗體，例如抗PD-1抗體可例示派姆單抗(Pembrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)、賽米普利單抗(Cemiplimab)、多塔利單抗(Dostarlimab)及津貝瑞單抗(Zimberelimab)等；抗PD-L1抗體可例示阿替珠單抗(Atezolizumab)、度伐單抗(Durvalumab)、阿維單抗(Avelumab)等。上述各抗體亦包含生物仿製藥。
作為本發明之醫藥組成物之適用對象的疾病(人類腫瘤)可舉出可看出HuCXCL1的表現之週知之各種人類腫瘤。更具體而言，該人類腫瘤較佳可舉出人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌 、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌等各種人類腫瘤中的1種或2種以上，更佳為人類胃癌，特佳為胃硬癌。此等腫瘤可單獨發生或併發2種以上。又，對象腫瘤可為復發癌或轉移癌，本發明之醫藥組成物(且本發明之抗HuCXCL1抗體)亦可有效使用於作為復發癌或轉移癌的治療劑、預防劑及診斷劑。
所稱「藥學上可容許之擔體」，可舉出賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、安定劑、保存劑、緩衝劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、黏稠劑、矯味劑、助溶劑或者其他添加劑等。透過使用此種擔體的1種以上，調製可注射劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑或者糖漿等形態之醫藥組成物。此等醫藥組成物可口服或非口服投予。用於非口服投予的其他形態係包含含有1種以上之活性物質，根據常用方法配成的注射劑等。若為注射劑時，可藉由溶解或懸浮於生理食鹽水或市售注射用蒸餾水等藥學上可容許之擔體中來製造。
尤其將源自本發明之抗HuCXCL1抗體之抗體片段(其中的低分子物質)投予至生物體內時，除上述外，亦可使用膠體分散系。膠體分散系可望有提高化合物(抗體片段)於生物體內的穩定性之效果，或對特定的臟器、組織或細胞有效輸送化合物之效果。膠體分散系只要是通常使用者即可，不予限定，可舉出聚乙二醇、高分子複合體、高分子凝聚物、奈米膠囊、微球、微珠及水中油系乳化劑、微胞、混合微胞及以包含微脂體之脂質為基底的分散系，較佳為具有對特定的臟器、組織或細胞有效輸送化合物之效果的多個微脂體、人工膜之小胞(Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem.et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698)。
本發明之醫藥組成物的投予量係隨患者的年齡、性別、體重及症狀、治療效果、投予方法、處理時間、或者醫藥組成物所含之本發明之抗HuCXCL1抗體及抗體-藥劑複合體的種類等而異。通常按成人每人每次能以600μg至6000mg的範圍投予，但不限定於此範圍。
例如藉由注射劑投予時，可對人類患者，在投予1次時，按體重每1kg，將100μg~100mg的量，按每日平均投予1次~數次，亦可採用較佳為每3日、1週、10日或2週投予1次，或者單次(合計投予次數為1次)投予之樣態。投予形態可舉出靜脈內注射、皮下注射、皮內注射、肌肉內注射或者腹腔內注射等，較佳為靜脈內注射。又，注射劑亦可視情況調製成非水性的稀釋劑(例如聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸浮劑或者乳濁劑。此種注射劑的無菌化可藉由使用濾器之過濾殺菌、摻合殺菌劑等來進行。注射劑可調製成用時調製之形態。亦即，可藉由冷凍乾燥法等調成無菌固體組成物，且於使用前溶解於無菌注射用蒸餾水或其他溶劑來使用。
此外，本發明亦提供一種供治療、預防及/或診斷腫瘤，或者用於製造阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之醫藥(藥劑)的前述本發明之抗HuCXCL1抗體的使用。又，本發明亦提供一種用於治療、預防及/或診斷腫瘤，或者用於阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移的前述本發明之抗HuCXCL1抗體。
再者，本發明係提供一種以使用前述本發明之抗HuCXCL1抗體(即對對象(患者)投予)為特徵的腫瘤的治療、預防及/或診斷方法、或者阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之方法；又，係提供一種用於治療、預防及/或診斷腫瘤，或者用於阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移的前述本發明之抗HuCXCL1抗體的使用。
又，本發明之抗HuCXCL1抗體可阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移；作為其作用機制，研判係包含可阻礙或抑制各種CXCL(CXCLs)與醣胺聚醣(GAG)的結合之機能(參照後述實施例11)。因此，本發明亦提供一種包含本發明之抗HuCXCL1抗體之CXCLs與GAG的結合抑制劑或結合抑制劑，或以使用本發明之抗HuCXCL1抗體(亦包含對對象投予)為特徵之CXCLs與GAG之結合阻礙方法或結合抑制方法，或用於製造CXCLs與GAG之結合阻礙或結合抑制之醫藥(藥劑)的前述本發明之抗HuCXCL1抗體的使用，或用於阻礙或抑制CXCLs與GAG之結合的前述本發明之抗HuCXCL1抗體的使用。於此，上述CXCLs不予限定，例如人類CXCL可舉出人類CXCL1、人類CXCL2、人類CXCL3及人類CXCL5，小鼠CXCL可舉出小鼠CXCL1。
5.腫瘤的診斷用或檢測用套組等
本發明之抗HuCXCL1抗體，除腫瘤的治療及/或預防用套組、或者CXCR2表現細胞的遷移阻礙或抑制用套組之形態外，亦能以腫瘤的診斷用或檢測用套組之形態提供。就作為診斷或檢測對象之腫瘤的具體例，可同樣地適用前述之說明。
該診斷及檢測可例如藉由使本發明之抗HuCXCL1抗體與採取自生物體的樣品(下稱生物樣品)反應，並檢測反應之抗體的訊息來進行。由於可確認HuCXCL1會表現於各種腫瘤細胞，因此HuCXCL1亦可作為各種腫瘤標記而利用。測出之抗體的訊息係作為生物樣品中之抗原量(即HuCXCL1量或游離HuCXCL1量)的指標。使用本發明之抗體之腫瘤的診斷及檢測係首先使作為檢體之採取自受試者的生物樣品，例如作為檢查對象的組織片或血液等與本發明之抗體藉由抗原抗體反應而結合。其次，基於已結合之抗體量的測定結果，藉由測定生物樣品中的目標抗原量來進行。該測定只要依循週知之免疫學測定方法來進行即可，可使用例如免疫沉降法、免疫凝聚法、標記免疫測定法、免疫比懸浮法、西方墨點法、流式細胞法等。於標記免疫測定法中，抗體之訊息，除了以使用標記抗體直接測得的標記量表示外，亦可將已知濃度或者已知抗體價的抗體調成標準液而相對地表示。亦即，可藉由測定計測定標準液與檢體，以標準液的值為基準相對地表示生物樣品中的抗體訊息。標記免疫測定法可舉出例如ELISA法、EI法、RIA法、螢光免疫測定(FIA)法、化學發光免疫測定法(Luminescence immunoassay)等。其中尤以ELISA法，因簡便且靈敏度高而較佳。
能以如上述所得之檢測結果為指標來評定或診斷腫瘤的狀態。例如，將檢測結果超過既定的基準值者判定為腫瘤陽性、為既定的基準值以下者判定為腫瘤陰性；若為陽性時，可判斷為可能發生任何腫瘤，而評定腫瘤的狀態。於此，腫瘤的狀態係指有無罹患腫瘤或其進行度，可舉出有無發生腫瘤、惡化度、惡性度、有無轉移及有無復發等。
於上述評定之際，腫瘤的狀態可選擇1種，亦可組合選擇多種。有無腫瘤的評定可基於所得檢測結果，以既定的基準值為界線判斷是否罹患腫瘤來進行。腫瘤的惡性度係作為表示癌等的程度是否惡化之指標，亦可基於檢測結果，分類期數(Stage)來評定，或者分類早期癌或進行性癌來評定。例如，亦能以檢測結果為指標來評定屬早期癌或進行性癌。腫瘤的轉移能以檢測結果為指標，根據在遠離原發病灶的位置之部位是否出現新生物來評定。復發可根據在發作間期或緩解後檢測結果是否再次超出既定的基準值來評定。
本發明之套組除包含本發明之抗HuCXCL1抗體外，亦可包含標記物質、或者固定抗體或其標記物之固相化試劑等。抗體之標記物質係指由酵素、放射性同位素、螢光化合物及化學發光化合物等所標記者。本發明之套組除上述構成要素外，亦可包含供實施本發明之檢測的其他試劑，例如當標記物為酵素標記物時，可包含酵素基質(發色性基質等)、酵素基質溶解液、酵素反應停止液、或者檢體用稀釋液等。又，亦可包含各種緩衝液、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反應容器(微量離心管等)、阻斷劑(Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等血清成分)、洗淨劑、界面活性劑、各種平板、疊氮化鈉等防腐劑及實驗操作手冊(說明書)等。
以下舉出實施例更具體地說明本發明，惟本發明非限定於此等。
[實施例1]
[1]抗人類CXCL1(HuCXCL1)之單株抗體的樹立
[1-1]HuCXCL1蛋白質(抗原)的製作
基於HuCXCL1蛋白質之胺基酸序列(Uniprot註冊編號：P09341；序列編號81)，基因合成出5’末端插入有Kozak轉譯開始序列、3’側插入有轉譯終止密碼子的DNA(利用GENEWIZ公司之服務)。
使用「In-Fusion HD Cloning Kit」(Takara Bio公司)，將合成之DNA插入「pcDNA3.4」(Thermo Fisher Scientific公司)的選殖位點，而得到HuCXCL1表現載體。
其次，以HuCXCL1表現載體作為導入質體，使用「Expi293 expression system」(Thermo Fisher Scientific公司)進行暫時性表現。暫時性表現後，回收培養上清液，進行使用「HiTrap ProteinG HP管柱」(Cytiva公司)的親和純化。將凝膠過濾純化的溶出區分以SDS-PAGE法確認為譜帶，回收可確認譜帶之區分，作為HuCXCL1純化蛋白質使用。
[1-2]小鼠免疫
抗體製作係基於以下方法，將HuCXCL1蛋白質對小鼠免疫來進行。免疫係對MRL/MpJJmsSlc-lpr/lpr、BALB/ cAJcl、ICR(Sankyo Labo Service公司、日本CLEA公司)此3系統之小鼠進行。
將抗原與佐劑「Titer MaxGold」(TiterMax公司)混合，以每隻小鼠的抗原投予量成為100μg的方式進行腳底靜脈投予。投予後，於7日及10日後以每隻小鼠的抗原投予量成為10μg的方式以與上述同樣的方法進行追加免疫。
[1-3]融合瘤製作
使用分離自免疫後的小鼠之淋巴節細胞製作抗HuCXCL1之單株抗體。
免疫結束後，由小鼠採取膝膕窩淋巴節而調製細胞懸浮液後，將其與SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞混合，使用電氣式細胞融合裝置「ECFG21」(Nepa Gene公司)進行電氣式細胞融合。
將融合後的細胞懸浮於「ClonaCell TM-HY MediumD」(STEM CELL公司)，播種於塑膠培養皿中。播種後，將8~10日後所形成的群落，在預先分注有融合瘤用培養基的96井孔塑膠孔盤中分離，使用其培養上清液進行抗體的體外篩選。此外，融合瘤用培養基係使用相對於RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific公司)，添加有1/50量的Nutridoma-CS(Merck公司)及1/50量的HAT Supplement (Thermo Fisher Scientific公司)者。
[1-4]人類無限制(Ad lib)系統
後述之殖株名「028-8-12」之抗體為使用人類ADLib技術(WO2015/167011所記載之資料庫)，由特異性地結合於CXCL1之殖株所產生的人類抗體。
[實施例2]
[2]根據in vitro試驗系之抗體的篩選
使用實施例1中所得之融合瘤及利用上述ADLib技術所得之純化抗體進行抗體的篩選。篩選係以下述3種方法進行。
[2-1]結合活性
藉由將用於免疫之抗原(HuCXCL1蛋白質)直接凝固於孔盤的ELISA法來評定融合瘤所產生之抗體的HuCXCL1結合性。
對96井孔孔盤按每1井孔各添加50μL之含有3μg/mL之HuCXCL1的磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate-buffered saline；PBS)，於4℃下靜置一夜。去除固相液後，作為阻斷反應，對各井孔添加含有2%脫脂牛奶及0.05% Tween-20的PBS(下稱阻斷液)，於室溫下靜置1小時。去除阻斷液後，按每1井孔各添加50μL之融合瘤或者DT40的培養上清液，於室溫下使其反應1小時。去除培養上清液，以含0.05% Tween-20之PBS進行洗淨後，將經HRP標記之二次抗體以阻斷液稀釋而添加，於室溫下使其反應1小時。洗淨後，添加作為發色基質液之TMB(Dako公司)使其發色，10分鐘後添加1N硫酸而呈現反應，測定450nm的吸光度。
篩選約10,000殖株的結果，選定對HuCXCL1具有特強結合力的500個殖株作為陽性殖株。
[2-2] Ca2⁺Flux assay
藉由Ca2
+Flux assay來評定經由G蛋白質偶聯受體(GPCR)之HuCXCL1刺激性訊息傳遞的抑制活性。HuCXCL1的受體之人類CXCR2(HuCXCR2)表現細胞係購入AequoScree/CXCR2(PerkinElmer公司)而使用。AequoScree/CXCR2細胞係穩定地共同表現CXCR2與鈣離子敏感性發光蛋白質水母素之重組細胞株，能以水母素的發光量測定受體刺激所伴隨之細胞內鈣離子的變化。
將AequoScren/CXCR2細胞懸浮於含0.1%BSA之DMEM/F-12 with HEPES, w/o phenol red (Thermo Fisher Scientific公司)(下稱分析緩衝液)，調整成按每1ml為2.29×10
6細胞。對其添加作為水母素之發光基質的5μM之腔腸素h(SIGMA-ALDRICH公司)，於室溫下反轉培養5小時後，用分析緩衝液稀釋3倍，進而反轉培養1個半小時。
對96井孔孔盤添加每1ml為100ng的HuCXCL1後，按每1井孔添加60μL之融合瘤、DT40培養上清液或者純化自培養上清液之抗體，靜置於室溫下30分鐘。對其按每1井孔添加50μL之以上述方法調製之AequoScree/CXCR2細胞懸浮液，隨後立即測定發光強度。
篩選出如前述選擇出之約500殖株的結果，選定特別可強力抑制伴有HuCXCL1所產生之受體刺激之細胞內鈣離子的變化，亦即對於HuCXCL1具有強烈中和活性的約個80個殖株作為陽性殖株。
再者，針對上述選定之80個殖株，算出HuCXCL1中和的50%效果濃度(EC50)。EC50係依以下方法評定。
AequoScrenn/CXCR2細胞係以與前述同樣的方法調整。對96井孔孔盤添加每1ml為100ng的HuCXCL1後，添加每1ml為100μg、50μg、15μg、5μg、1.5μg、0.5μg、0.15μg或0.05μg的純化抗體，靜置於室溫下30分鐘。對其按每1井孔添加50μL之AequoScree/CXCR2細胞懸浮液，隨後立即測定發光強度。EC50係由所得用量反應曲線算出。
[2-3]遷移抑制活性(Migration assay)
針對具有對HuCXCL1之中和活性的80個殖株評定抗HuCXCL1之HuCXCR2表現細胞的遷移抑制活性。
細胞之趨化性係以博登量測器方式測定，測定Kit係購入QCM Chemoraxis Cell Migration Assay(SIGMA-ALDRICH公司)使用。HuCXCR2表現細胞係使用AequoScrenn/CXCR2細胞。等型控制組抗體與山羊抗HuCXCL1多株抗體(下稱AF275)係由R&D公司購入使用。
HuCXCR2表現細胞用不含血清之培養液於37℃培養一夜後，予以懸浮於分析緩衝液，調整成每1ml為2×10
6細胞。對博登量測器的上室添加HuCXCR2表現細胞浮游液，對下室僅添加分析緩衝液或者每1ml包含200ng的HuCXCL1，且包含純化抗體或者不含純化抗體的溶液，於37℃培養一夜。
培養後，將上室以PBS洗淨，添加至添加有Cell Detachment Solution(SIGMA-ALDRICH公司)之新的下室並靜置於37℃下30分鐘，將黏著於上室之膜底的遷移細胞剝離。
對遷移細胞浮游液按每1井孔添加75μL的4×Lysis Buffer(SIGMA-ALDRICH公司)，靜置於室溫20分鐘後，以激發波長480 nm/螢光波長520 nm測定螢光。篩選前述之約80個殖株，評定CXCR2細胞之遷移抑制活性。
根據抗HuCXCL1之結合活性、抗EC50及HuCXCL1之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性的評定，選定15種在體外具有機能性的抗體。將此等之結果示於下述表A。
[2-4]與其他動物物種的交叉性
[2-4-1]對CyCXCL1的結合活性
茲評定對食蟹獼猴(Cynomolgus monkey)之CXCL1 (CyCXCL1)的結合活性。
除將HuCXCL1蛋白質之胺基酸序列改為CyCXCL1蛋白質之胺基酸序列(UniProt註冊編號：Q0EAC3；序列編號82)以外，係與前述[1-1]所記載之方法同樣地製作CyCXCL1蛋白質(抗原)。
對CyCXCL1的結合活性的評定係以ELISA法進行。除將在孔盤中固化的蛋白質由HuCXCL1蛋白質改為CyCXCL1蛋白質以外，係以與前述[2-1]同樣的方法算出吸光度，評定抗原結合活性。對CyCXCL1之吸光度為對HuCXCL1之吸光度的80%以上者係為具有交叉性而評為「○」、未達80%者則評為「×」，記載於上述表A。
[2-4-2] 對CyCXCL1之中和活性
對CyCXCL1之中和活性的評定係以水母素的發光量測定細胞內鈣離子相對於CyCXCL1之AequoScrenn/CXCR2細胞的變化。
AequoScrenn/CXCR2細胞係以與前述[2-2]同樣的方法調製。對96井孔孔盤添加每1ml為100ng的CyCXCL1後，添加每1ml為10μg的純化抗體並靜置於室溫下30分鐘。對其按每1井孔添加50μL之AequoScree/CXCR2細胞懸浮液，隨後立即測定發光強度。
完全抑制CyCXCL1之水母素的發光的抗體係視為具有交叉性而評為「○」，完全未抑制水母素的發光的抗體則評為「×」而記載於上述表A。
[2-5]彙整
自前述選定之15種抗體中，考量與CyCXCL1的交叉性，選定4種殖株抗體(5A-5E11､4A-2F7､1A-7H10、及028-8-12)作為候選抗體。
此外，可知5A-5E11及4A-2F7亦會結合於人類CXCL2、3及5，且1A-7H10、及028-8-12亦會結合於人類CXCL2及3。
[實施例3]
[3] 具有in vivo活性之抗體的評定(1)
[3-1] OCUM-12原位移植模型的製作
為了以OCUM-12原位移植異種移植模型評定前述4種候選抗體於體內的CXCR2遷移抑制活性與抗腫瘤活性，而製作OCUM-12原位移植模型。
小鼠係由日本CLEA股份有限公司購入5~6週大之母裸鼠(BALB/cAJcl-nu/nu)而使用。人類癌細胞係由公立大學法人大阪提供胃癌細胞株OCUM-12而使用。
OCUM-12細胞係以對D-MED(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)添加10%之胎牛血清(FBS；SIGMA-ALDRICH公司)與1/100量的青黴素-鏈黴素混合液(Nacalai Tesque股份有限公司)的培養基來培養。移植細胞係以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA(Thermo Fisher Scientific公司)剝離，並用PBS洗淨後，按每隻將4×10
5個細胞移植至小鼠胃壁。
[3-2]抗腫瘤活性試驗
於上述移植的次日將各個體隨機分群(每群8或6隻)，將作為控制組的PBS，且將4種候選抗體(1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11、028-8-12)與候選抗體以外的3種抗體(1A-3C6、1A-2H3、4A-5B11)以20mg/kg的用量投予至小鼠腹腔內。又，將作為控制組的小鼠IgG1以20mg/kg的用量，且將候選抗體當中的3種(5A-5E11、1A-4H10、4A-7G7)以20mg/kg的用量投予至小鼠腹腔內。此等抗體之投予，後續係以每週2次的頻率實施至試驗結束。在移植開始經過3週的時間點，宰殺小鼠作為犧牲動物，以游標卡尺分別測定形成於胃壁之腫瘤的短徑與長徑。腫瘤大小係以1/2短徑(mm)×1/2長徑(mm)×3.14算出。將其結果示於圖1A、2A、3A。
如此等結果所示，1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11及028-8-12投予群與PBS投予群相比，可顯著抑制腫瘤的增殖。
[3-3]CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗
摘出上述[3-1]中之腫瘤大小的測定後的胃，使用10%中性緩衝福馬林液(和光純藥工業公司)於室溫下固定一夜後，置換為PBS。其後，委託Applied Medical Research公司進行石蠟包埋、切片的製作。將製作之胃腫瘤切片以抗CXCR2抗體進行組織免疫染色來評定於體內之CXCR2細胞遷移抑制活性。切片經過去石蠟及再水合處理後，進行內生性過氧化酶去活處理。抗原活化處理後，進行使用包含2%脫脂牛奶及0.1%Tween-20之PBS的阻斷，使作為一次抗體之經阻斷液稀釋成0.3μg/mL的抗CXCR2抗體(Biorbyt公司)於4℃下反應一夜。以含0.1%Tween-20之PBS洗淨後，使作為二次抗體之HRP標記山羊抗兔子IgG抗體(Abcam公司)於室溫下反應1小時。以洗淨液洗淨後，使用簡單染色DAB溶液(Nichirei、5052)發色。經染色之組織以Explore (Olympus公司)攝得影像後，使用成像軟體CellSens (Olympus公司)算出每單位面積之CXCR2陽性細胞。將其結果示於圖1B、2B、3B。
如此等結果所示，1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11、1A-3C6、4A-5B11及028-8-12投予群與PBS或者小鼠IgG1(mIgG1)抗體投予群相比，可顯著抑制CXCR2表現細胞的遷移。
[3-4]彙整
in vivo試驗中4種候選抗體(1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11、028-8-12)具有充分的遷移抑制活性，且具有抗腫瘤效果。另一方面，即使為於體外可抑制CXCR2表現細胞之遷移抗體，仍有於體內無法看出遷移抑制活性之抗體(1A-2H3、4A-7G7)，或即使於體內有CXCR2表現細胞之遷移抑制活性但仍無法看出抗腫瘤效果之抗體(1A-3C6、4A-5B11)(圖1~3)。由此等研判，要使CXCR2表現細胞之遷移抑制效果達到抗腫瘤效果，需有一定程度以上之遷移抑制活性。
[實施例4]
[4]具有in vivo活性之抗體的評定(2)
[4-1]根據OCUM-2MLN原位移植模型之候選抗體的藥效評定
針對候選抗體中的3種(4A-2F7、5A-5E11、028-8-12)，以OCUM-2MLN原位移植異種移植模型評定in vivo抗腫瘤活性。以下示出評定方法。
小鼠係由日本Charles River股份有限公司購入5~6週大之母裸鼠(BALB/cAJcl-nu/nu)而使用。人類癌細胞係使用胃癌細胞株OCUM-2MLN。
OCUM-2MLN細胞係以對D-MEM(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)添加10%之胎牛血清(FBS；NICHIREI BIOSCIENCE公司)、1/100量的青黴素-鏈黴素混合液(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)與1/100量的Sodium pyruvate solution(SIGMA-ALDRICH公司)的培養基來培養。移植細胞係以0.05 w/v%胰蛋白酶/0.53mmol/ L EDTA・4Na Solution(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)剝離，並用PBS洗淨後，按每隻將1×10
6個細胞移植至小鼠胃壁。於移植的次日將各個體隨機分群(每群5~8隻)，將作為控制組的PBS(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)，且將受試藥物(候選抗體)以20mg/kg的用量投予至小鼠腹腔內。受試藥物之投予，後續係以每週2次的頻率實施至試驗結束。在移植開始經過3週的時間點，宰殺小鼠作為犧牲動物，以游標卡尺分別測定形成於胃壁之腫瘤的短徑與長徑。腫瘤大小係以短徑(mm)×長徑(mm)算出。將其結果示於圖4。根據圖4，尤其是4A-2F7及5A-5E11與控制組相比可顯著抑制腫瘤的增殖。
[參考例]根據CXCR2抑制劑之低分子化合物(Navarixin)之抑制CXCR2表現細胞的遷移與抗腫瘤活性
作為可作用於CXCR2且可抑制CXCL1-CXCR2訊息的低分子化合物有Navarixin。Navarixin已知可於體外抑制CXCR2表現細胞的遷移。因此，便使用OCUM-12原位移植模型，評定於體內抑制CXCR2表現細胞的遷移與抗腫瘤活性。Vehicle係使用含20% 2-羥丙基-β-環糊精(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)之超純水。Navarixin (MedChemExpress)係溶解於含20% 2-羥丙基-β-環糊精之超純水，以100mg/kg/日的用量、1日1次，連續5日後2日停藥之時程進行口服投予。Navarixin的投予，於OCUM-12原位移植異種移植模型中可顯著抑制CXCR2表現細胞的遷移(圖5A)，但未看出抗腫瘤活性(圖5B)。
如此，可知亦有即使為可抑制CXCL1-CXCR2訊息並抑制CXCR2表現細胞之遷移的物質，仍無法看出抗腫瘤效果者。
[實施例5]
[5]抗體序列解析
基於以下方法，對4種候選抗體(1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11、028-8-12)各者進行其免疫球蛋白基因可變區的序列解析。
擴大培養融合瘤細胞，藉由TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit(ThermoFisher Scientific)進行cDNA合成。
將合成之cDNA用於模板，藉由PCR法擴增抗體可變區序列。此外，重鏈及輕鏈皆是使用可辨識可變區上游及恆定區顆粒的引子來擴增。
將所得DNA片段載入Zeroblunt TOPO TA Cloning and Sequencing kit(ThermoFisher Scientific)之套組隨附之載體進行選殖，進行DNA序列解析。
針對所得之抗體序列，依循Kabat等人之方法(Sequences of Proteins of Immunolosical Interest, Fifthedition, NIH Publivation No.91-3242, US, Department of Health and Human Services, 1991)來決定CDR區域。
將經解析之抗體序列及其CDR區域序列的概要示於下述表1。
此外，以下表中的簡稱具有下述意義。
VH：重鏈可變區
CDRH：重鏈CDR
VL：輕鏈可變區
CDRL：輕鏈CDR
[實施例6]
[6]小鼠・人類嵌合抗體的製作與胺基酸改變
針對候選抗體中的3種(1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11)，基於前述[5]中所得之抗體序列製作小鼠重鏈・輕鏈可變區與人類IgG1重鏈・κ左恆定區之嵌合抗體(下稱小鼠・人類嵌合抗體)。
針對各抗體序列，在製作與前述[5]中解析之胺基酸序列相同者的同時，嘗試改變CDR區域之胺基酸。
此外，028-8-12抗體由於為人類抗體，而未進行嵌合抗體的製作，僅嘗試改變CDR區域及VL區域之胺基酸。
將施予CDR之序列改變的抗體序列及其原本的序列示於下述表2。
將基於上述表2之序列的各抗體之重鏈及輕鏈的組合示於下述表3~6。
藉由抗原固相ELISA、Ca2
+Flux Assay來評定根據重鏈及輕鏈之組合所得之各胺基酸改變抗體之抗原結合活性及中和活性，確認全胺基酸改變抗體具有與改變前之嵌合親抗體(VH/VL)同等的抗原結合活性、中和活性。由此等胺基酸改變抗體當中，根據改變之胺基酸的特性選定下述表7所示之改變抗體。
[實施例7]
[7]人類化抗體的製作
其次，針對1A-7H10、4A-2F7、5A-5E11進行選定之前述改變抗體(人類嵌合抗體)序列的人類化。
由各抗體可變區之序列，進行根據CDR移植法的人類化。人類化序列的設計係基於已知之論文(Tsurushita et al., Design of humanized antibodies: From anti-Tac to Zenapax. Methods, 36:69-83, 2005)所記載之方法來實施。
首先藉由常用方法作成小鼠抗體之三維分子模型。其次，基於此分子模型，推定架構區的胺基酸序列當中，研判對形成CDR之構造為重要者之殘基、及研判對與抗原反應為必需者之殘基。與此同時，自人類抗體重鏈可變區及輕鏈可變區之cDNA序列資料庫當中，搜尋與各抗HuCXCL1抗體之重鏈可變區、輕鏈可變區相同性高的序列。其後，設計搜尋之人類抗體序列之架構部分的序列與連結各抗HuCXCL1抗體之CDR序列的序列，對其進一步移植研判對形成CDR構造或與抗原反應為必者之殘基之序列，而設計出人類化抗體序列。設計之序列係如下述表8所示。人類化抗體序列所具有之CDR序列係與原本之小鼠・人類嵌合抗體者相同，係與前述表中之序列編號相同的序列。表8中，底線部係表示CDR。
由人類化序列之組合獲得各殖株、VH1/VL1、VH2/VL1、VH2/VL1及VH2/VL2此4種抗體。藉由抗原固相ELISA、Ca2
+Flux Assay評定此等人類化抗體之抗原結合活性、中和活性，確認其任意組合皆具有與原本的嵌合抗體(mh1A-7H10_VH1/VL、mh4A-2F7_VH/VL1、mh5A-5E11_VH7/VL)同等的抗原結合活性、中和活性(圖6、7A、7B)。由此，可知此等人類化抗體與原本的嵌合抗體同等地具有in vitro之HuCXCL1結合活性及HuCXCL1刺激性訊息傳遞之抑制活性(CXCR2表現細胞之遷移抑制活性)。由此等人類化抗體中，選定改變之胺基酸與人類抗體序列之架構部分相同性更高的抗體。將選定之各抗體之組合與序列編號示於下述表9。
[實施例8]
[8]人類化抗體及改變人類化抗體之in vivo評定試驗
諸如上述，製作於體內具有CXCR2遷移抑制活性與抗腫瘤活性之小鼠抗體3殖株的人類化抗體(以下分別稱為Hu1A-7H10、Hu4A-2F7、Hu5A-5E11，且將此等總稱為人類化抗體)。又，製作對藉由ADLib技術取得之人類抗體028-8-12之CDR區域及VL區域實施胺基酸改變的改變人類抗體1殖株(下稱028-8-12或改變人類化抗體)。
以OCUM-12原位移植異種移植模型評定人類化抗體之in vivo抗腫瘤活性及CXCR2遷移抑制活性。以下示出評定方法。
小鼠係由日本CLEA股份有限公司購入5~6週大母裸鼠(BALB/cAJcl-nu/nu)而使用。人類癌細胞係由大阪公立大學提供胃癌細胞株OCUM-12而使用。
OCUM-12細胞係以對D-MED(FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)添加10%之胎牛血清(以下記為FBS；SIGMA-ALDRICH公司)與1/100量的青黴素-鏈黴素混合液(Nacalai Tesque股份有限公司)的培養基來培養。移植細胞係以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA(Thermo Fisher Scientific公司)剝離，並用PBS洗淨後，按每隻將4×10
5個細胞移植至小鼠胃壁。於移植的次日將各個體隨機分群(一群8隻)，將受試抗體以400μg/head的用量投予至小鼠腹腔內。PBS係自移植的次日起以每週2次的頻率進行腹腔投予200μL達3週。受試藥物之投予，後續係以每週2次的頻率實施至試驗結束。在移植開始經過3週的時間點，宰殺小鼠作為犧牲動物，以游標卡尺分別測定形成於胃壁之腫瘤的短徑與長徑。腫瘤大小係以1/2短徑(mm)×1/2長徑(mm)×3.14算出。
摘出測定後的胃，使用10%中性緩衝福馬林液(和光純藥工業公司)於室溫下固定一夜後，置換為PBS。其後，委託Applied Medical Research公司進行石蠟包埋、切片的製作。將製作之胃腫瘤切片以抗CXCR2抗體進行組織免疫染色來評定於體內之CXCR2細胞遷移抑制活性。切片經過去石蠟及再水合處理後，進行內生性過氧化酶去活處理。抗原活化處理後，進行使用包含2%脫脂牛奶及0.1%Tween-20之PBS(下稱阻斷液)的阻斷，使作為一次抗體之經阻斷液稀釋1667倍的抗CXCR2抗體(Biorbyt公司)於4℃下反應一夜。以含0.1%Tween-20之PBS洗淨後，使作為二次抗體之HRP標記山羊抗兔子IgG抗體(Abcam公司)於室溫下反應1小時。以洗淨液洗淨後，使用簡單染色DAB溶液(Nichirei、5052)發色。經染色之組織以Explore(Olympus公司)攝得影像後，使用成像軟體CellSens(Olympus公司)算出每單位面積之陽性細胞。
[8-1]人類化抗體及改變人類化抗體之in vivo CXCR2表現細胞遷移抑制活性
上依循述，測定人類化抗體Hu1A-7H10、Hu4A-2F7、Hu5A-5E11及改變人類化抗體028-8-12之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性。將其結果示於圖8A及圖9A。如此等結果所示，人類化抗體Hu1A-7H10、Hu4A-2F7、Hu5A-5E11及改變人類化抗體028-8-12投予群與hIgG1抗體投予群相比，可顯著抑制CXCR2表現細胞的遷移。
[8-2]人類化抗體及改變人類化抗體之in vivo抗腫瘤活性
依循上述，測定人類化抗體Hu1A-7H10、Hu4A-2F7、Hu5A-5E11及改變人類化抗體028-8-12的腫瘤面積。將其結果示於圖8B及圖9B。如此等結果所示，Hu1A-7H10、Hu4A-2F7、Hu5A-5E11及028-8-12投予群與hIgG1抗體投予群相比，顯著抑制腫瘤面積增加。
如以上所述，於in vivo試驗中人類化3抗體(Hu1A-7H10、Hu4A-2F7、Hu5A-5B11)及改變人類化抗體(028-8-12)與hIgG1抗體相比具有充分的遷移抑制活性，且具有抗腫瘤效果。
[實施例9]
[9] OCUM-12原位移植預防模型中之人類化抗體Hu5A-5E11的用量反應性試驗
以OCUM-12原位移植異種移植預防模型評定抗體用量與in vivo抗腫瘤活性及CXCR2遷移抑制活性的反應性。預防模型係指自腫瘤移植的次日起開始投予抗體的模型。小鼠、細胞、移植法及抗腫瘤活性，以及CXCR2遷移抑制活性之評定法係採用與前述[8]同樣的方法。受試抗體係使用Hu5A-5E11，將20, 60, 100, 200 或者400μg/head的用量自移植的次日起以每週2次的頻率進行腹腔投予3週。PBS則將200μL自移植的次日起以每週2次的頻率進行腹腔投予3週。
[9-1] Hu5A-5E11之in vivo CXCR2表現細胞遷移抑制活性
圖10A示出其結果。如其結果所示，比起投予PBS，Hu5A-5E11以20μg/head以上的用量即顯著抑制CXCR2表現細胞的遷移，顯示最小藥效用量為20μg/head以下。遷移抑制效果經觀察有以60μg/head以上的用量即到達極限的傾向。
[9-2] Hu5A-5E11之in vivo抗腫瘤活性
圖10B示出評定結果。如此等結果所示，比起投予PBS，Hu5A-5E11以60μg/head以上的用量即顯著抑制腫瘤面積。
[實施例10]
[10]OCUM-12原位移植治療模型中的Hu5A-5E11用量反應性試驗
若將OCUM-12細胞移植至小鼠胃壁，則於移植7日後即形成腫瘤組織像、CXCR2細胞分布與移植21日同等的確立之腫瘤。因此，將移植7日後起開始投予受試藥物之模型作為治療模型。
以OCUM-12原位移植異種移植治療模型評定抗體用量與in vivo抗腫瘤活性及CXCR2遷移抑制活性的反應性。小鼠、移植法及抗腫瘤活性，以及CXCR2遷移抑制活性之評定法係採用與前述[8]同樣的方法。受試藥物係使用Hu5A-5E11。受試藥物的投予係自移植7日後開始，將20, 60, 100, 200或者400μg/head的用量以每週2次的頻率進行腹腔投予3週。PBS則將200μL自移植7日後以每週2次的頻率進行腹腔投予3週。在移植起經過4週的時間點，宰殺小鼠作為犧牲動物來進行評定。
[10-1] Hu5A-5E11的in vivo CXCR2表現細胞遷移抑制活性
圖11A示出評定結果。如此結果所示，比起投予PBS，Hu5A-5E11以20μg/head以上的用量即顯著抑制CXCR2表現細胞的遷移，顯示最小藥效用量為20μg/head以下。遷移抑制效果經觀察有以60μg/head以上的用量即到達極限的傾向。
[10-2] Hu5A-5E11的in vivo抗腫瘤活性
圖11B示出評定結果。如此結果所示，比起投予PBS，Hu5A-5E11以60μg/head以上的用量即顯著抑制腫瘤面積。
自移植次日或7日後以投予人類化Hu5A-5E11的2種模型來評定in vivo用量反應性。其中任一模型，比起投予PBS，人類化Hu5A-5E11以20μg/head以上的用量均顯著抑制CXCR2表現細胞的遷移。又，以60μg/head以上的用量即顯著抑制腫瘤面積。
[實施例11]
[11] 根據ELISA之Hu5A-5E11之HuCXCL1~3及5或MsCXCL1,2與醣胺聚醣(GAG)的結合抑制活性評定
以肝素、硫酸乙醯肝素為主的醣胺聚醣(下稱GAG)於生物體內係以蛋白聚糖的形式存在，表現於各種細胞的細胞表面。GAG帶有強負電荷，藉由與趨化因子、細胞激素、增殖因子等其他蛋白質(下稱配位子)直接結合而有助於標的受體附近區域之配位子的濃縮、受體與配位子之複合體的穩定化、蛋白酶之配位子分解的防護等，於生物體機能發揮重要的作用。而且，已根據動物模型或細胞研究闡明GAG與趨化因子的交互作用會決定趨化因子的濃度梯度，且此濃度梯度可誘導、控制CXCR2表現細胞朝組織的輸送(或朝組織的細胞遷移)(參照前述非專利文獻4)。
因此，Hu5A-5E11對CXCLs與GAG之結合所造成的作用係藉由將用於免疫之抗原(HuCXCL1蛋白質)或者HuCXCL2,3,5及MsCXCL1,2蛋白質直接固化於孔盤的ELISA法來評定。HuCXCL1以外之CXCLs係由PROTEINTECH公司購入而使用。經生物素標記之硫酸乙醯肝素及肝素則由PG Research公司購入而使用。
對96井孔孔盤按每1井孔各添加50μL之含有3μg/mL之HuCXCL1,2,3,5, MsCXCL1、10μg/mL之MsCXCL2的磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate-buffered saline；PBS)，於4℃下靜置一夜。去除固相液後，作為阻斷反應，對各井孔添加含0.05% Tween-20之PBS(下稱阻斷液)，於室溫下靜置30分鐘。去除阻斷液後，按每1井孔各添加50μL之用阻斷液稀釋成0~10μg/mL之濃度的Hu5A-5E11或者含HuIgG1抗體之溶液，於室溫下使其反應30分鐘。去除抗體溶液後，添加經阻斷液稀釋成10μg/mL的濃度之經生物素標記的肝素或硫酸乙醯肝素，於室溫下使其反應2小時。洗淨後，將經HRP標記之二次抗體用阻斷液稀釋而添加，於室溫下使其反應40分鐘。添加作為發色基質液之TMB(Dako公司)使其發色，添加1N硫酸呈現反應，測定450nm的吸光度。CXCLs與GAG的結合率係以將未添加抗體時所得之吸光度設為100%時的比算出。
圖12A及圖12B示出評定結果。Hu5A-5E11其隨抗體濃度變化抑制HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1與GAG的結合。
[實施例12]
[12] 根據FACS之Hu5A-5E11之HuCXCL1~3及5或與MsCXCL1和細胞的結合抑制活性評定
趨化因子可透過與細胞表面的GAG直接結合而達穩定化，能有效傳遞對受體的訊息。由前述[11]顯示Hu5A-5E11可抑制CXCLs與GAG的結合。因此，其次，便針對Hu5A-5E11能否抑制CXCLs與細胞的結合，藉由FACS之流式細胞儀以螢光強度進行測定來評定經螢光標記之CXCLs與細胞的結合。細胞係使用使HuCXCR2強制表現的HEK293細胞。HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1係將前述[11]之蛋白質以APC而標記使用。
培養細胞經剝離後，用PBS洗淨，以成為5.0×10
5cells/mL的方式懸浮於含1% BSA之PBS(下稱FACS buffer)。經APC標記之各配位子與Hu5A-5E11以最終濃度分別成為10μg/mL、16.7μg/mL的方式混合並使其於室溫下反應30分鐘後，添加至細胞懸浮液並於冰上使其反應30分鐘。以FACS buffer洗淨後，再懸浮於含1%之7-AAD、0.5%之BSA及2mM EDTA的PBS，藉由前述流式細胞儀測定螢光強度。
其結果，Hu5A-5E11隨抗體濃度變化而使細胞的螢光強度減少。由此顯示，Hu5A-5E11可抑制HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1與CXCR2、GAG的結合，且可抑制與細胞本身的結合。
由實施例2的結果確認，Hu5A-5E11可中和HuCXCL1而抑制對CXCR2的訊息傳遞。又，由實施例11及12的結果確認，Hu5A-5E11可抑制GAG與HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1的結合，及抑制HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1與細胞表面的結合。由此等結果推測，Hu5A-5E11非僅可中和HuCXCL1，亦可透過抑制HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1與細胞表面的結合而抑制CXCR2細胞遷移。再者，推測可抑制經由HuCXCL1,2,3,5及MsCXCL1與GAG之於生物體內的趨化因子濃度梯度的形成而對CXCR2細胞遷移至包含腫瘤之組織造成影響。
[產業上可利用性]
根據本發明，可提供一種可誘發阻礙或抑制腫瘤微環境(TME)的形成等之TME的變化的抗人類CXCL1抗體及其片段。本發明之抗人類CXCL1抗體及其片段係例如具有抗腫瘤活性，在可使用於腫瘤的治療或預防等屬有用者。又，根據本發明，亦可提供包含該抗人類CXCL1抗體或其片段的醫藥組成物或套組等。
[圖1A]為表示抗體之抗腫瘤活性試驗的結果的圖。
[圖1B]為表示抗體之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗的結果的圖。
[圖2A]為表示抗體之抗腫瘤活性試驗的結果的圖。
[圖2B]為表示抗體之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗的結果的圖。
[圖3A]為表示抗體之抗腫瘤活性試驗的結果的圖。
[圖3B]為表示抗體之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗的結果的圖。
[圖4]為表示OCUM-2MLN原位移植模型中之抗體之藥效評定的結果的圖。
[圖5A]為表示CXCR2抑制劑(Navarixin)之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗的結果的圖。
[圖5B]為表示CXCR2抑制劑(Navarixin)之抗腫瘤活性試驗的結果的圖。
[圖6]為表示人類及人類化抗體之抗原結合活性試驗的結果的圖。
[圖7A]為表示人類及人類化抗體之抗原中和活性試驗的結果的圖。
[圖7B]為表示人類及人類化抗體之抗原中和活性試驗的結果的圖。
[圖8A]為表示OCUM-12原位移植預防模型中之人類抗體及人類化抗體(Hu4A-2F7、Hu5A-5E11、ADLib#028-8-12)之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗的結果的圖。
[圖8B]為表示OCUM-12原位移植預防模型中之人類抗體及人類化抗體(Hu4A-2F7、Hu5A-5E11、ADLib#028-8-12)之抗腫瘤活性試驗的結果的圖。
[圖9A]為表示OCUM-12原位移植預防模型中之人類化抗體(Hu1A-7H10)之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性試驗的結果的圖。
[圖9B]為表示OCUM-12原位移植預防模型中之人類化抗體(Hu1A-7H10)之抗腫瘤活性試驗的結果的圖。
[圖10A]為表示OCUM-12原位移植預防模型中之人類化抗體Hu5A-5E11之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性用量反應性試驗的結果的圖。
[圖10B]為表示OCUM-12原位移植預防模型中之人類化抗體Hu5A-5E11之抗腫瘤活性用量反應性試驗的結果的圖。
[圖11A]為表示OCUM-12原位移植治療模型中之人類化抗體Hu5A-5E11之CXCR2表現細胞之遷移抑制活性用量反應性試驗的結果的圖。
[圖11B]為表示OCUM-12原位移植治療模型中之人類化抗體Hu5A-5E11之抗腫瘤活性用量反應性試驗的結果的圖。
[圖12A]為表示ELISA之Hu5A-5E11之CXCLs與肝素的結合抑制活性的評定結果的圖。
[圖12B]為表示ELISA之Hu5A-5E11之CXCLs與硫酸乙醯肝素的結合抑制活性的評定結果的圖。
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Claims (30)
- 一種抗人類CXCL1之抗體，其中， (a)重鏈可變區(VH)之互補性決定區(CDR)1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號2、3及4所示胺基酸序列、或 序列編號2、34及4所示胺基酸序列 所構成，且 輕鏈可變區(VL)之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號6、7及8所示胺基酸序列 所構成， (b)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號10、11及12所示胺基酸序列 所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號14、15及16所示胺基酸序列、 序列編號14、36及16所示胺基酸序列、 序列編號14、38及16所示胺基酸序列、或 序列編號14、40及16所示胺基酸序列 所構成， (c)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號18、19及20所示胺基酸序列、 序列編號18、42及20所示胺基酸序列、 序列編號18、44及20所示胺基酸序列、 序列編號18、46及20所示胺基酸序列、 序列編號18、48及20所示胺基酸序列、 序列編號18、50及20所示胺基酸序列、 序列編號18、52及20所示胺基酸序列、 序列編號18、54及20所示胺基酸序列、 序列編號18、56及20所示胺基酸序列、 序列編號18、58及20所示胺基酸序列、 序列編號18、60及20所示胺基酸序列、或 序列編號18、62及20所示胺基酸序列 所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號22、23及24所示胺基酸序列 所構成，或者， (d)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號26、27及28所示胺基酸序列、 序列編號26、64及28所示胺基酸序列、或 序列編號26、66及28所示胺基酸序列 所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由 序列編號30、31及32所示胺基酸序列 所構成。
- 一種抗體，其中， (a)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號2、34及4所示胺基酸序列所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號6、7及8所示胺基酸序列所構成， (b)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號10、11及12所示胺基酸序列所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號14、36及16所示胺基酸序列所構成， (c)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號18、54及20所示胺基酸序列所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號22、23及24所示胺基酸序列所構成，或者， (d)VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號26、64及28所示胺基酸序列所構成，且 VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列係分別依序由序列編號30、31及32所示胺基酸序列所構成。
- 一種抗人類CXCL1之抗體，其中， (a)重鏈可變區(VH)之胺基酸序列係由序列編號1或33所示胺基酸序列所構成，且輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列係由序列編號5所示胺基酸序列所構成， (b)VH之胺基酸序列係由序列編號9所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號13、35、37或39所示胺基酸序列所構成，或者， (c)VH之胺基酸序列係由序列編號17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號21所示胺基酸序列所構成。
- 一種抗人類CXCL1之抗體，其中， (a)重鏈可變區(VH)之胺基酸序列係由序列編號68或69所示胺基酸序列所構成，且輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列係由序列編號70或71所示胺基酸序列所構成， (b)VH之胺基酸序列係由序列編號72或73所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號74或75所示胺基酸序列所構成， (c)VH之胺基酸序列係由序列編號76或77所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號78或79所示胺基酸序列所構成，或者， (d)VH之胺基酸序列係由序列編號25、63或65所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號29或67所示胺基酸序列所構成。
- 一種抗人類CXCL1之抗體，其中， (a)VH之胺基酸序列係由序列編號68所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號70所示胺基酸序列所構成， (b)VH之胺基酸序列係由序列編號72所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號74所示胺基酸序列所構成， (c)VH之胺基酸序列係由序列編號76所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號78所示胺基酸序列所構成，或者， (d)VH之胺基酸序列係由序列編號63所示胺基酸序列所構成，且VL之胺基酸序列係由序列編號67所示胺基酸序列所構成。
- 如請求項1、2、4及5中任一項之抗體，其中抗體為人類抗體。
- 如請求項1~6中任一項之抗體，其中抗體係具有抗腫瘤活性。
- 如請求項1~7中任一項之抗體，其係用於腫瘤的治療或預防。
- 如請求項7或8之抗體，其中腫瘤係伴有間質增生。
- 如請求項7~9中任一項之抗體，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
- 如請求項10之抗體，其中人類胃癌為胃硬癌。
- 如請求項1~6中任一項之抗體，其係具有阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之活性。
- 一種抗體片段，其係源自於如請求項1~12中任一項之抗體。
- 一種醫藥組成物，其係包含如請求項1~12中任一項之抗體、及/或如請求項13之抗體片段。
- 如請求項14之醫藥組成物，其係用於腫瘤的治療或預防。
- 如請求項15之醫藥組成物，其中腫瘤係伴有間質增生。
- 如請求項15或16之醫藥組成物，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
- 如請求項17之醫藥組成物，其中人類胃癌為胃硬癌。
- 如請求項14~18中任一項之醫藥組成物，其進一步包含選自由具抗腫瘤活性之化合物、具殺細胞活性之化合物及免疫檢查點抑制劑所成群組的至少1種以上，或者與前述至少1種以上組合使用。
- 如請求項14之醫藥組成物，其係用於阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移。
- 一種腫瘤之治療或預防方法，其係包含對對象投予如請求項1~12中任一項之抗體、及/或如請求項13之抗體片段，或者如請求項14~19中任一項之醫藥組成物。
- 如請求項21之方法，其中腫瘤係伴有間質增生。
- 如請求項21或22之方法，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
- 如請求項23之方法，其中人類胃癌為胃硬癌。
- 一種阻礙或抑制CXCR2表現細胞的遷移之方法，其係包含對對象投予如請求項1~12中任一項之抗體、及/或如請求項13之抗體片段，或者如請求項20之醫藥組成物。
- 一種腫瘤的治療、預防或診斷用套組，其係包含如請求項1~12中任一項之抗體、及/或如請求項13之抗體片段。
- 如請求項26之套組，其中腫瘤係伴有間質增生。
- 如請求項26或27之套組，其中腫瘤為選自由人類胃癌、人類胰臟癌、人類乳癌、人類肺癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌及人類膽管癌所成群組的至少1種。
- 如請求項28之套組，其中人類胃癌為胃硬癌。
- 一種人類CXCL及/或小鼠CXCL與醣胺聚醣之結合抑制劑或結合抑制劑，其係包含如請求項1~12中任一項之抗體、及/或如請求項13之抗體片段。
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