KR102451588B1 - Prl3 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 regenerating liver-3 (PRL3)의 포스파타아제에 결합하는 인간화 항체 및 암 치료를 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 또한, 세포에서 PRL3의 세포 위치를 결정하는 인비트로 (in vitro) 방법이 청구되며, 상기 세포 표면에서 PRL3의 발현은 세포가 암인 것을 나타낸다.

Description

PRL3 항체
본 발명은 PRL3에 결합하는 인간화 항체에 관한 것이다.
암은 기본적으로 무질서한 유전자 발현 질환으로 암 관련 사망의 주요 원인 (2) 인 전이를 향한 다단계 진행으로 이어진다 (1). 축적된 증거는 단백질 타이로신 포스파타아제 (PTP)가 전이 진행을 촉진하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다 (3). 우리는 1998년에 regenerating liver-3 (PRL-3; PTP4A3로도 알려짐)의 포스파타아제를 PRL-1, PRL-2, 및 PRL-3의 3개의 멤버로 구성된 이중-특이적 PTPs의 PRL 패밀리 멤버 (4)로 확인하였다. 2001년 Vogelstein 그룹은 PRL-3가 전이성 결장암 샘플에서는 특이적으로 높게 증가하지만, 원발암 및 정상 결장 상피에서는 그렇지 않은 전이-관련 포스파타아제로 특정되었다 (5). PRL-3는 최근 독립적인 전체적 유전자 발현 연구 (6)에서 포도막 흑색종 환자에서 전이 재발의 가장 중요한 예측인자로 확인되었다. 임상적으로, 증가된 PRL-3 mRNA 발현 수준은 결장암, 위암, 유방암, 난소암 및 폐암을 포함하여 다중암의 높은 전이 잠재력 및 나쁜 예후와 관련있는 것으로 나타났다 (7).
PRL은 프레닐화 C-말단을 통해 세포막과 엔도좀의 세포질 표면에 국한 (localized)된다 (8). PRL-3는 세포증식, 상피간엽이행 (EMT), 침윤, 운동성, 혈관신생, 및 생존을 포함하는 여러 단계의 악성 형질전환을 촉진한다는 증거가 있다 (9). 분자적으로, PRL-3는 PTEN의 하향 조절을 통하여 간접적으로 PI3K/Akt 경로를 활성화시키고 (10), 다수의 상류 수용체 타이로신 키나아제의 구성적 활성화를 통해 종양성 ERK 및 SRC 신호를 활성화시키는 것으로 나타났다 (11-13).
높은 PRL-3 수준이 증가된 GC 침윤성 및 전이와 관련이 있다는 것을 발견한 2004년 PRL-3는 GC 진행과 처음으로 연결되었다 (14). 그 이후, PRL-3는 원발성 위암종의 최대 70%에서 과발현되는 것으로 보고되었으며, 높은 PRL-3 발현은 GC 환자의 모든 종양 단계에서 수술 후 생존기간의 단축과 관련이 있었다 (15, 16). PRL-3의 이러한 예후 잠재력은 GC가 전 세계적으로 암 사망률의 세 번째 주요 원인으로 매년 70만 명이 넘는 위암 관련 사망자가 발생하므로 (2) 특히 중요하다. 이는 초기 단계에 질병의 무증상 성질 및 질병의 발견 지연과 함께 치료 후 재발율이 높기 때문이다 (17). 높은 실패율에도 불구하고, 근본적인 수술은 GC의 표준 치료법으로 남아 있으며, 보조 화학요법은 절제수술 전 및/또는 후에 종종 고려된다 (18, 19). 그럼에도 불구하고, 화학요법에 의한 전반적인 생존율은 여전히 좋지 않고, 다른 활동적인 비암성 세포의 비특이적 표적화 때문에 바람직하지 않은 부작용이 동반된다 (17). 이를 위해, 암세포의 성장과 생존에 관여하는 특정 분자를 선택적으로 저해할 수 있는 잠재역 때문에 종양 특이적 생물학적 제제를 이용한 표적 치료법이 항암제 개발의 초점으로 부상하였다. 현재의 항체요법은 항체가 일반적으로 세포에 들어가기에는 너무 크다고 여겨져서 세포 외 (세포 표면 또는 분비된) 단백질만을 표적으로 하므로, 포스파타아제, 키나아제, 및 전사인자와 같은 많은 세포 내 치료 표적이 남아 있다. 예를 들어 GC에서, HER2/neu 수용체 길항제 트라스투주맙 (허셉틴)은 세포 표면 HER2/neu 수용체를 발현하는 GC, 특히 전이성 위암 또는 위식도접합부 선암의 13-20%를 표적으로 승인되었다 (20, 21). 그러나, 중간 정도의 반응에도 불구하고 환자들은 종종 트라스투주맙에 내성을 나타내어 (22), 그 효능을 방해한다. 따라서, GC에 대한 대체 표적 치료법이 매우 필요하며 적극적으로 추구되고 있다.
2008년에 우리는 세포 내 PRL-1 및 PRL-3 종양항원 (oncoantigens)을 표적하는 새로운 항체요법을 보고하였다 (23). 그 보고서에서 우리는 항-PRL-3 항체가 PRL-3 (PRL-1은 아님)을 발현하는 암세포의 실험적 전이를 억제하고, 항-PRL-1 항체가 PRL-1 (PRL-3은 아님)을 발현하는 암세포를 억제하는 것을 보여주었다. 따라서, 이러한 세포 내 종양단백질을 표적으로 할 때 치료 효능에 대한 특정 항체-항원 인식에 대한 엄격한 요건을 확립하였다. 이에 우리는 2011년에 야생형 C57BL/6 및 트랜스제닉 자연적 유방암 MMTV-PyMT 마우스에서 항체요법 또는 예방접종을 통해 추가의 내인성 및 외인성 세포 내 '종양-특이적 항원'을 표적으로 하는 이 새로운 개념의 타당성과 유효성을 검증하였다 (24). 우리와 Ferrone은 세포 내로의 항체 침투, 외인성 항원에 대한 항체 결합 및/또는 MHC-결합 항원-유래 펩타이드의 항체 인식을 포함하여 세포 내 종양 항원 (TA)-특이적 항체의 항종양 활성에 대한 3가지 메커니즘을 제안하였다 (25, 26).
PRL-3 발현 종양을 표적으로 하는 쥐 및 키메라 (27) 항-PRL-3 항체의 성공에 이어, 우리는 여기서 접근 방식을 다음의 4가지 주요 측면에 대하여 좀 더 임상적으로 관련된 설정으로 해석한다: 1) 마우스 또는 키메라 항체 대신에 PRL-3 인간화 항체 (PRL3-zumab)의 사용; 2) 마우스 암 세포주 대신에 인간 암 세포주의 표적화; 3) 마우스 꼬리 정맥 전이 모델 대신에 임상적으로 연관된 동소 (orthotopic) 위암 모델의 개발; 및 4) PRL3-zumab 치료 효능을 모니터링하기 위해 잠재적인 대용 바이오마커의 동정. 우리는 위 종양 형성을 억제하기 위한 새로운 종류의 인간화 항체의 첫번째 예를 입증하였다. 우리의 결과는 암 치료제의 새로운 시대를 열어준 항체요법으로 세포 내 종양단백질을 표적할 수 있는 가능성을 보여준다.
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Figure 112019004194439-pct00002
51. C. Rubio-Perez, D. Tamborero, M. P. Schroeder, A. A. Antoln, J. Deu-Pons, C. Perez-Llamas, J. Mestres, A. Gonzalez-Perez, N. Lopez-Bigas, In silico prescription of anticancer drugs to cohorts of 28 tumor types reveals targeting opportunities. Cancer Cell 27, 382-396 (2015). 52. J. S. de Bono, A. Ashworth, Translating cancer research into targeted therapeutics. Nature 467, 543-549 (2010). 53. J. Li, K. Guo, V. W. C. Koh, J. P. Tang, B. Q. Gan, H. Shi, H. X. Li, Q. Zeng, Generation of PRL-3- and PRL-1-specific monoclonal antibodies as potential diagnostic markers for cancer metastases. Clin Cancer Res 11, 2195-2204 (2005).
요약
표적 외의 효과는 암 치료에 대한 주요 임상적 우려 사항이다. 우리는 종양-특이적인 세포 내 PRL-3, 즉 다양한 인간 암에서 증가된 발암성 포스파타아제에 대
Figure 112019004194439-pct00003
, S. Hardy, M. L. Tremblay, Inside the human cancer tyrosine phosphatome. 한 최초의 인간화 항체 (PRL3-zumab)를 제조하였다. 우리는 위암 (GC)에 초점을 맞추어, 증가한 PRL-3 mRNA 수준이 GC 환자의 전체적인 생존기간의 단축과 유의한 상관관계가 있다는 독립적인 증거를 제공한다. PRL-3 단백질은 신선-동결 GC 종양의 85%에서 과발현되었으나, 검사된 환자-매치 정상 위 조직에서는 그렇지 않았다. 인간 GC 세포주를 사용하여 임상적으로 연관있는 동소 (orthotopic) 위암 모델을 확립하고 PRL3-zumab은 PRL-3-양성 (PRL-3+) 종양의 성장을 특이적으로 억제하지만, PRL-3-음성 (PRL-3-) 종양은 그렇지 않다는 것을 입증하였다. PRL-3-zumab은 단독요법으로 5- 플루오로우라실 (5-FU)과 병용 또는 5-FU 단독보다 치료 효능이 더 우수하였다. PRL3-zumab은 PRL-3+ 종양 조직에서 특이적으로 강화되고, PRL-3+ 종양 미세환경에 대한 면역세포 모집을 촉진한다. 예상외로, 우리는 여러 종류의 인간 암 소변의 62% 및 PRL-3+ 유래의 암 소변의 100%에서 분비된 PRL-3 종양단백질을 발견하였으나, PRL-3- 종양을 보유한 마우스에서는 그렇지 않았다. 또한, 소변의 PRL-3 수준은 PRL3-zumab의 효과적인 치료 후에 유의하게 감소하였다. 소변의 PRL-3은 향후 여러 암종에서 PRL3-zumab 치료의 치료 반응 모니터링을 위한 잠재적인 진단 및 대용 바이오마커로 고려될 수 있다. 우리는 또한 PRL-3 항체가 어떻게 세포 내 PRL-3 항원에 결합할 수 있는지에 대한 행동 메커니즘 (MOA)을 조사하였다. 실제로 '세포 내 종양단백질'은 암에서 '세포 외 종양단백질'로 세포 표면에 재국소화 (re-localized)될 수 있으므로, 세포 외 종양표적에 대하여 항체의 통상적인 경로를 통해 종양 제거의 합리적인 기초를 따른다고 결론을 내렸다. 일관되게, 우리는 PRL3-zumab이 숙주 FcγII/III 수용체 상호작용, 완전한 항체 활성, 및 증가된 M1 (M2는 아님) 대식세포, B 림프구, 숙주 면역을 향상시키는 자연살해세포를 필요로 하는 PRL-3 '세포 내' 항원을 발현하는 종양을 차단하는 것을 발견하였다. 이 결과는 '세포 내 종양단백질'을 표적하는 항체의 MOA는 실제로 종양을 제거하기 위한 고전적인 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 또는 식세포 (ADCP) 경로를 통한 '세포 외 종양단백질'을 표적하는 유사 원리를 따른다는 것을 시사한다.
마지막으로, 110개의 신선-냉동 인간 종양 조직 또는 이들의 매치된 정상 조직을 사용하여, PRL-3이 9종의 다른 종류의 인간 암 : 간, 폐, 결장, 유방, 위, 방광, 전립선, AML, 및 신장 환자 종양 샘플에서 평균 78% 이상에서 광범위하게 과발현되지만, 매치되는 정상 조직에서는 그렇지 않은 우수한 종양 특이적 종양표적임을 추가로 확인하였다. 따라서, PRL-3는 암의 유용한 바이오마커가 될 수 있고, 암 치료를 위한 보편적인 표적이 될 수 있다. PRL-3는 고형암에 유용한 바이오마커를 제공할 수 있다.
본 발명은 PRL3에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드가 또한 개시된다. 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩타이드는 분리 및/또는 정제된 형태로 제공될 수 있고, 연구, 치료 및 진단에 사용하기에 적합한 조성물로 제제화될 수 있다. 특히, 본 발명은 PRL3에 결합하는 인간화 항체 및 특히 PRL3 길항 항체에 관한 것이다.
일 예에서, 본 발명의 항체는 PRL3의 기능을 억제한다. 일 예에서, 항체는 PRL3의 단백질 타이로신 포스파타아제 (PTP) 기능을 억제한다. 일 예에서, 항체는 ADCC 및/또는 ADCP를 유도한다. 일 예에서, 항체는 FcRII 및/또는 FcRIII와 같은 Fc 수용체에 결합할 수 있다. 일 예에서, 세포에 대한 항체의 결합은 B 세포, NK 세포, 또는 대식세포, 바람직하게는 M1 대식세포와 같은 세포에 대한 면역세포의 모집을 유도한다.
본 발명의 일 관점에서, 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되고, 항체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 i) 내지 iii), 또는 아미노산 서열 iv) 내지 vi), 또는 바람직하게는 아미노산 서열 i) 내지 vi)을 포함할 수 있다:
i) KASQSVEDDGENYMN (서열번호 4)
ii) AASNLES (서열번호 5)
iii) QQSNEDPFT (서열번호 6)
iv) GYTFTNYYMH (서열번호 1)
v) WIYPGNVNTYYNEKFRG (서열번호 2)
vi) EEKNYPWFAY (서열번호 3)
또는 서열 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체를 포함할 수 있다.
항체, 또는 항원 결합 단편은 다음의 CDR을 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: KASQSVEDDGENYMN (서열번호 4)
LC-CDR2: AASNLES (서열번호 5)
LC-CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 6)
항체, 또는 항원 결합 단편은 다음의 CDR을 포함하는 하나 이상의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
HC-CDR1: GYTFTNYYMH (서열번호 1)
HC-CDR2: WIYPGNVNTYYNEKFRG (서열번호 2)
HC-CDR3: EEKNYPWFAY (서열번호 3)
항체는 도 7에 제시된 CDR을 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 항체는 도 7에 제시된 CDR을 포함하는 하나 이상의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변영역 (VL) 또는 도 7에 제시된 VL 사슬 아미노산 서열의 아미노산 서열 중 하나와 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나에 대해 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 VL 사슬 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 다음의 CDR 서열을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: KASQSVEDDGENYMN (서열번호 4)
LC-CDR2: AASNLES (서열번호 5)
LC-CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 6)
항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 하나 이상의 중쇄 가변영역 (VH) 또는 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나에 대해 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 VH 사슬 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 다음의 CDR 서열을 포함할 수 있다:
HC-CDR1: GYTFTNYYMH (서열번호 1)
HC-CDR2: WIYPGNVNTYYNEKFRG (서열번호 2)
HC-CDR3: EEKNYPWFAY (서열번호 3)
항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변영역 (또는 도 7에 제시된 VL 사슬 아미노산 서열의 아미노산 서열 중 하나와 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열) 및 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 하나 이상의 중쇄 가변영역 (또는 도 7에 제시된 VH 사슬 아미노산 서열의 아미노산 서열 중 하나와 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열)을 포함할 수 있다.
항체는 PRL3에 결합할 수 있다. 항체는 선택적으로 전술한 아미노산 서열 성분을 가질 수 있다. 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 또는 IgM, 바람직하게는 IgG일 수 있다. 일 실시예에서, PRL3에 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 선택적으로 분리된 인비트로 (in vitro) 복합체가 제공된다.
본 발명의 일 관점에서, 분리된 중쇄 가변영역 폴리펩타이드가 제공되며, 상기 중쇄 가변영역 폴리펩타이드는 다음의 CDR을 포함한다:
HC-CDR1: GYTFTNYYMH (서열번호 1)
HC-CDR2: WIYPGNVNTYYNEKFRG (서열번호 2)
HC-CDR3: EEKNYPWFAY (서열번호 3)
본 발명의 일 관점에서, 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 상기:
중쇄는 HC-CDR1 서열 (서열번호 1), HC-CDR2 서열 (서열번호 2), HC-CDR3 서열 (서열번호 3)에 대해 각각 85% 이상 서열 상동성을 갖는 HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3을 포함하며, 경쇄는 LC-CDR1 서열 (서열번호 4), LC-CDR2 서열 (서열번호 5), LC-CDR3 서열 (서열번호 6)에 대해 각각 85% 이상 서열 상동성을 갖는 LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3을 포함한다.
일부 실시예에서, 서열 상동성의 정도는 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 선택적으로 분리된 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 상기:
중쇄 서열은 도 7에 제시된 중쇄 서열과 85% 이상 서열 상동성을 가지며, 경쇄 서열은 도 7에 제시된 경쇄 서열과 85% 이상 서열 상동성을 갖는다.
일부 실시예에서, 서열 상동성의 정도는 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드는 HCFR1:HC-CDR1:HCFR2:HC-CDR2:HCFR3:HC-CDR3:HCFR4의 배열에 따라 CDR 사이의 가변영역 중쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다. 프레임워크 서열은 인간 콘센서스 (consensus) 프레임워크 서열로부터 유래될 수 있다.
일 예에서, 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드는 다음으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함한다:
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV (서열번호 29);
WIYPGNVNTYYNEKFR (서열번호 30);
ASTAYMELSSLRSE (서열번호 31); 및/또는
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT (서열번호 32).
본 발명의 일 관점에서, 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변영역 폴리펩타이드와 선택적으로 조합된 분리된 경쇄 가변영역 폴리펩타이드가 제공되며, 경쇄 가변영역 폴리펩타이드는 다음의 CDR을 포함한다:
LC-CDR1: KASQSVEDDGENYMN (서열번호 4)
LC-CDR2: AASNLES (서열번호 5)
LC-CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 6)
일 실시예에서, 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드는 LCFR1:LC-CDR1:LCFR2:LC-CDR2:LCFR3:LC-CDR3:LCFR4의 배열에 따라 CDR 사이의 가변영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다. 프레임워크 서열은 인간 콘센서스 (consensus) 프레임워크 서열로부터 유래될 수 있다.
일 예에서, 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드는 다음으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다:
QSPSSLSASVGDRVT (SEQ ID NO: 26);
KASQSVEDDGENYMNWYQQK (SEQ ID NO: 27); 및/또는
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT (SEQ ID NO: 28).
일 예에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드는 다음으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모든 아미노산 서열을 포함한다:
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV;
WIYPGNVNTYYNEKFR;
ASTAYMELSSLRSE;
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT;
QSPSSLSASVGDRVT;
KASQSVEDDGENYMNWYQQK; 및/또는
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT.
항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나 또는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변영역 (VL) 및/또는 중쇄 가변영역 (VH)을 포함할 수 있으며, 다음의 CDR 서열을 포함한다:
LC-CDR1: KASQSVEDDGENYMN (서열번호 4)
LC-CDR2: AASNLES (서열번호 5)
LC-CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 6)
HC-CDR1: GYTFTNYYMH (서열번호 1)
HC-CDR2: WIYPGNVNTYYNEKFRG (서열번호 2)
HC-CDR3: EEKNYPWFAY (서열번호 3)
그리고, 다음 서열 중 하나 이상을 포함한다:
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV;
WIYPGNVNTYYNEKFR;
ASTAYMELSSLRSE;
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT;
QSPSSLSASVGDRVT;
KASQSVEDDGENYMNWYQQK; 및/또는
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT.
항체는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나 또는 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 775%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변영역 (VL) 및/또는 중쇄 가변영역 (VH)을 포함할 수 있다.
상기 항체는 다음으로부터 선택되는 경쇄 가변영역 (VH): 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25, 또는 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 항체는 다음으로부터 선택되는 경쇄 가변영역 (VH): 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 또는 서열번호 22, 또는 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 항체는 다음으로부터 선택되는 경쇄 가변영역 (VL): 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 또는 서열번호 15, 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 또는 서열번호 15의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 다음으로부터 선택되는 경쇄 가변영역 (VL): 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12, 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함한다.
항체는 다음의 CDR 서열을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: KASQSVEDDGENYMN (서열번호 4)
LC-CDR2: AASNLES (서열번호 5)
LC-CDR3: QQSNEDPFT (서열번호 6)
HC-CDR1: GYTFTNYYMH (서열번호 1)
HC-CDR2: WIYPGNVNTYYNEKFRG (서열번호 2)
HC-CDR3: EEKNYPWFAY (서열번호 3)
그리고, 다음 서열 중 하나 이상을 포함한다:
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV;
WIYPGNVNTYYNEKFR;
ASTAYMELSSLRSE;
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT;
QSPSSLSASVGDRVT;
KASQSVEDDGENYMNWYQQK; 및/또는
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT
그리고, PRL3에 결합할 수 있으며, PRL3의 생물학적 기능을 길항할 수 있다.
일 실시예에서, 항체, 또는 항체 결합 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중 하나로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 항체, 또는 항체 결합 단편은 쥐 불변영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, , IgG1, IgG2A, IgG2B 및 IgG3 중 하나로부터 선택될 수 있다.
항체는 전체 항체, 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편인 것이 바람직하다. 항체 또는 항체 단편은 CH1 및 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 CH2 도메인을 포함한다. 항체는 CH1 및 CH2 도메인 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 Fab’, F(ab)’2 단편이 아니며, 및/또는 scFv가 아니고 및/또는 미니바디가 아니다. 바람직하게는, 항체는 IgG 면역글로불린이다.
일 관점에서, 치료 대상은 면역능력이 있다. 개체는 면역능력이 있는 것으로 결정되어질 수 있다. 개체가 NK 세포 및/또는 B 세포를 생성하는 것으로 결정되어질 수 있다. 개체는 사이토카인의 투여를 통해, 또는 NK 세포 및/또는 B 세포의 생산 및/또는 활성화를 감소시키는 것으로 알려진 제제의 투여를 중단함으로써 NK 세포 및/또는 B 세포의 생산 및/또는 활성화를 자극하도록 치료될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 조성물, 예를 들어 약학적 조성물 또는 약제가 제공된다. 상기 조성물은 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다.
핵산은 도 7에 제시된 서열, 또는 유전적 암호 (code)의 결과로 디제너레이트 (degenerate)된 코딩 서열을 암호화하거나, 또는 이와 서열 상동성이 70% 이상, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 선택적으로 하나를 가지는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
항체는 PRL3에 결합할 수 있다. 항체는 아미노산 서열 KAKFYN 및/또는 HTHKTR을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 항체는 두 서열 모두에 결합할 수 있다.
본 발명의 일 관점에서, 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 다른 관점에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 숙주세포는 진핵 세포 또는 포유류 세포, 예를 들어 Chinese Hamster Ovary (CHO), 또는 인간 또는 원핵세포, 예를 들어 대장균일 수 있다.
본 발명의 일 관점에서, 본원에 기재된 것과 같은 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드의 제조방법이 제공되며, 상기 방법은 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주세포를 배양하는 단계 및 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 관점에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드는 치료에 사용하기 위해, 또는 의학적 치료 방법으로 제공된다. 본 발명의 다른 관점에서, 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드는 T 세포 기능 장애의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 본 발명의 또 다른 관점에서, T 세포 기능 장애의 치료에 사용하기 위한 약제 또는 약학적 조성물의 제조에서 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 관점에서, PRL3를 함유하거나, 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계, 및 PRL3와 항체 또는 항원 결합 단편의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에서, 개체의 질환 또는 상태를 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 인비트로 (in vitro)에서 개체로부터의 샘플과 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계, 및 PRL3와 항체 또는 항원 결합 단편의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 관점에서, 인비트로 (in vitro)에서 PRL3의 검출을 위한 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 용도가 제공된다. 본 발명의 다른 관점에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 인비트로 (in vitro) 진단제로서의 용도가 제공된다.
본 발명의 방법에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 어떤 관점에서, 항체는 바람직하게는 PRL1 또는 PRL2와 같은 다른 PRL 포스파타아제보다 PRL3에 특이적으로 결합한다.
항체는 IgG 일 수 있다. 약 140 내지 160kDa, 바람직하게는 약 150kDa의 분자량을 가질 수 있다.
일 실시예에서, 항체는 PRL3-ZUMAB일 수 있다.
또한, 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본원에 개시된 바와 같은 인간화 항체 또는 항원 결합 단편의 용도가 본원에 개시된다.
다른 관점에서, 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 인간화 항체 또는 항체 결합 단편이 제공된다. 항체는 종양 형성 억제 및/또는 종양의 전이를 억제하는데 유용할 수 있다. 항체는 종양의 크기를 줄이는데 유용할 수 있다. 치료된 개체는 치료 받지 않은 개체 또는 치료전 동일한 개체와 비교하여 예를 들어, 특정 종양의 크기가 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소하거나, 또는 종양의 수가 감소하거나, 또는 둘다 나타낼 수 있다.
또한, 본원에 개시된 인간화 항체 또는 항체 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다.
암은 PRL3 발현 또는 과발현 암일 수 있다. 암은 위암일 수 있다.
인간화 항체 또는 항체 결합 단편은 정맥 내 투여될 수 있다. 치료될 암에서 떨어져 있는 위치에 투여될 수 있다.
일부 방법에서 환자는 이전에 화학요법, 특히 5-FU와 같은 항대사제 치료를 받지 않았다. 일부 경우에, 환자는 이전에 그러한 치료를 받지 않았거나, 또는 위암과 같은 암에 대해 그러한 치료를 받지 않았다. 일부 경우에, 항체는 다른 약제와 함께 투여되지 않는다 (즉, 항체 단독요법). 일부 경우에, 항체는 5-FU와 함께 투여되지 않는다.
일부 방법에서, 환자는 면역 체계가 손상되지 않은 것으로 결정되어 졌다. 특히, 환자는 정상 범위 내의 백혈구 수를 가지는 것으로 결정되어 졌다. 특히, 환자는 백혈구 감소증을 가지지 않는 것으로 결정되었다. 환자는 정상 범위 내의 호중구, 림프구, 단핵구, 적혈구 또는 혈소판 수치를 갖는 것으로 결정되어 질 수 있다. 환자는 손상된 명역 체계를 가지지 않는 것으로 알려진 개체의 수치 또는 확립된 정상 수치의 대조군과 유의한 차이가 없는 백혈구 수치, 호중구, 림프구, 단핵구, 적혈구 또는 혈소판 수치를 가질 수 있다. 예를 들어, 환자는 마이크로리터의 혈액 당 약 4,500 내지 약 10,000개의 백혈구를 갖는 것으로 결정되어 진다.
일 관점에서, 본 발명은 인간화 항-PRL3 항체 또는 항체 단편으로 치료하기 위한 환자를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자의 소변 샘플에서 PRL3의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 상기 방법은 환자의 소변 샘플에서 PRL3의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일 예에서, 환자는 위, 비인두, 방광, 폐, 유방 또는 전립선 암을 가질 수 있다.
일 예에서, 개체는 PRL3 과발현 암의 가족력이 있거나, PRL3 과발현 암의 발병 가능성이 있는 것으로 확인되었다. 일 예에서, 개체는 PRL3 과발현 암을 가지고 있으며, 암의 전이 위험이 있는 것으로 간주된다.
다른 관점에서, 여기에는 PRL3의 세포 국소화 (localisation)를 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 세포 표면에서 세포 PRL3의 증가된 비율은 개체가 암을 가진다는 것을 나타낸다. 본원은 세포에서 PRL3의 세포 국소화 (localisation)을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 세포 표면에서 PRL3의 발현은 세포가 암성임을 나타낸다.
방법은 세포 표면상의 PRL3의 존재 또는 증가가 개체가 암을 가지는 것을 나타내는 암의 진단 방법을 포함한다. 일 예에서, 세포에서의 PRL3의 양은 비암성 대조군 샘플과 동일하지만, 비암성 대조군과 비교하여 PRL3의 위치 (localisation)는 변화될 수 있다.
다른 방법은 세포가 암인지 아닌지 여부를 결정하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 세포의 표면에서 PRL3의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 대조군 세포와 비교하여 PRL3의 수준 또는 비율이 증가하면 개체는 암이 있거나, 또는 암이 발생할 수 있음을 나타낼 수 있다.
방법은 샘플에서 PRL3의 세포 위치 (localisation)에 기초하여, 항암 치료를 위한 개체의 선택을 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 그렇게 선택된 개체에 항암 치료요법을 투여하는 단계를 포함한다.
일 예에서, 방법은 2개 이상의 시점에서 취해진 환자의 2개 이상의 샘플에서 PRL3의 세포 위치를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 표면의 PRL3 양의 변화는 개체에서 암의 증가 또는 감소를 나타낼 수 있다. 시간 경과에 따른 세포 표면 PRL3의 증가는 개체에 암이 유발되었거나, 또는 암이 악화되었음을 나타낼 수 있다. 시간 경과에 따른 세포 표면 PRL3의 감소는 암이 감소했거나, 또는 치료요법이 암을 치료하였음을 나타낸다. 세포 표면에서 PRL3의 증가 또는 변화없는 수준은 추가 또는 대체의 항암 요법이 필요하다는 것을 나타낸다. 따라서, 세포 표면에서 PRL3의 수준은 추가, 또는 대안적인 항암 요법을 위한 개체를 선택하는데 사용될 수 있다.
세포 표면에서 PRL3의 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상의 증가는 개체가 암을 가지고 있거나, 및/또는 세포가 암이거나, 또는 개체가 치료를 위해 선택되어야 함을 나타낼 수 있다. 세포 표면에서 PRL3의 수준은 대조군과 비교될 수 있다.
샘플은 혈액 샘플 또는 혈청 샘플일 수 있다. 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 암은 종양 또는 종양을 둘러싼 조직의 샘플일 수 있다. 방법은 샘플을 수득하는 단계를 포함할 수 있거나, 또는 방법은 개체로부터 이전에 수득한 샘플에 대해 수행될 수 있다.
진단 및 검출 방법은 인비트로 (in vitro) 또는 생체 외 (ex vivo)에서 수행될 수 있으며, 경우에 따라 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함하지 않는다.
본 발명의 원리를 설명하는 실시예 및 실험은 첨부된 도면을 참조하여 설명 될 것이다.
도 1은 위 종양(gastric tumors)에서 고도로(highly) 발현되는 새로운 종양타겟(oncotarget)인 PRL-3에 관한 것이다. (A) FVB/야생형 마우스(1열 내지 15열)의 다양한 정상 조직 및 FVB/MMTV-PyMT 마우스 (16열 및 17열)에서의 자발적인 유방 및 전이성 폐종양에서의 PRL-3의 웨스턴 블라팅. 블랏은 PRL-3-zumab, HSP70, 로딩 컨드롤(loading control)를 가지고 탐침 되었다. (B) SGSet1 GC 환자 코호트에서 PRL-3 mRNA 발현의 Kaplan-Meier 생존 분석. n=183; p=0.002, log-rank test. (C) 인간의 원발성 위 종양 대(vs) GC 환자들에서의 환자-일치되는 정상 조직(n) 20쌍의 PRL-3에 대한 전체 웨스턴 블롯 분석. Mr, 상대 분자량(kDa).
도 2는 PRL3-zumab은 PRL-3 양성(+) 동소(orthotopic) 위 종양을 특이적으로 차단하는 것을 나타낸다. (A) 22개 인간 GC 세포주의 내인성 PRL-3에 대한 웨스턴 블라팅. 후속 동물 모델을 위해 선택된 종양형성의 PRL-3 양성(+) 및 PRL-3 음성(-) 세포주는 별표 (*)와 함께 빨간색으로 표시하였다. Mr. 상대 분자량 (kDa). (B) Balb/C 누드 마우스의 실험적 동소(orthotopic) GC 모델의 개요. (C) PRL3-zumab 처리는 PRL-3 양성(+) SNU-484 동소 위 종양의 성장을 억제한다. 패널 a-b, 실험 종료 시점의 마우스 외양 (28 일). 화살표는 처리하지 않은 마우스에서 복부 팽창을 표시한다. 패널 c-d, 종양 구역이 있는 절개된 위를 검은 색 선으로 표시함. Bar, 10 ㎜. (D) PRL3-zumab을 처리하지 않은 군과 PRL3-zumab을 처리한 군에서의 28 일째 평균 위 종양 체적. 군 당 n = 8; p = 0.01, t- test; 평균 ± S.D를 나타내는 데이터. (E) PRL3-zumab을 처리하지 않은 군 (적색 줄) 과 PRL3-zumab을 처리한 군 (검은 줄)의 Kaplan Meier 생존 분석. 군 당 n = 4; p = 0.006, log-rank test. p 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
도 3은 PRL3-zumab은 PRL-3 음성(-) 동소(orthotopic) 위 종양에서는 치료 효과가 없다는 것을 나타낸다. (A) PRL3-zumab의 처리는 PRL- 3-MKN45 동소(orthotopic) 위 종양 성장을 차단할 수 없다. 패널 a-b, 실험 종료 시점의 마우스 외양 (56 일). 패널 c-d, 종양 구역이 있는 절개한 위를 검은 색 선으로 표시함. Bar, 10 ㎜. (B) PRL3-zumab을 처리하지 않은 군과 PRL3-zumab을 처리한 군에서의 56 일째 평균 위 종양 체적. 군 당 n = 5; p = 0.4, t- test; 평균 ± S.D를 나타내는 데이터. (C) PRL3-zumab을 처리하지 않은 군 (적색 줄)의 마우스와 PRL3-zumab을 처리한 군 (검은 줄)의 마우스에 대한 Kaplan Meier 생존 분석. 군 당 n = 4; p = 0.3, log-rank test. (D) 4개의 인간 GC 세포주의 동소 모델에서의 PRL3-zumab 처리 결과의 요약. p 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였다. (E) MKN45-PRL3 동소 위 종양에서의 평균 위 종양 체적 28 일. N = 4 (처리하지 않음) 또는 5 (처리함)' p = 0.00002, t-test' 평균 ± SEM을 나타내는 데이터.
도 4는 PRL3-zumab 단독 요법이 PRL3-zumab 및 5-플루오로우라실 (5FU)의 병용 요법 또는 5-FU 단독 요법보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다. PBS 대조군 (1 군), PRL3-zumab 단일 요법군 (2 군), PRL3-zumab + 5-FU 병용 요법군 (3 군), 또는 5- FU 단독 요법군(4 군). (A) 28 일째에 각 처리 군에서 마우스의 위를 절제하고, 동소 종양 부위를 검은 색 선으로 표시하였다. Bar, 10 ㎜. 우측 패널, 28 일째 각 군의 평균 위 종양 체적. 군 당 n = 5; 군 1과 비교할 때 각 군에 대해 표시된 p- 값; t-test; 평균 ± S.D를 나타내는 데이터. (B) 치료 시작 전 (0 일) 및 실험 종료시 (28 일)에 처리된 마우스 군에서 Giemsa로 염색 된 혈액 도말의 대표 이미지. 백혈구 (WBC)는 파란색으로 염색됨. Bar, 40 ㎛. 오른쪽 패널, 28 일째 각 마우스의 혈액 도말로부터의 백혈구 수. 군 당 n = 5; 1 군과 비교할 때 각 군에 대해 표시된 p- 값; , t- test; 평균 ± S.D를 나타내는 데이터. p 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였다. (C) 다양한 치료 요법의 종료 시점에서 마우스 군의 혈액학적 프로파일 (28 일). 빨간색으로 표시된 값은 BALB/c 누드 마우스에 대한 정상 참조 범위를 벗어난 특이치이다 (35).
도 5는 세포 내 PRL-3 암 단백질은 세포 배양 배지로 분비 될 수 있으며 암 소변의 62 %에는 존재하지만 정상 소변에는 존재하지 않음을 나타낸다. (A) 표시된 GC 세포주의 매치된 용해물 및 조건 배양 배지에서 존재하는 PRL-3의 웨스턴 블라팅. CANX, calnexin. (B) 모든 암 환자 및 연구 된 정상 개체의 소변 샘플에서 PRL-3 양성의 % 요약. (C-F)(C) 정상인 및 GC 환자, (D) 비인두 암 환자, (E) 방광암 환자 및 (F) 폐암 환자의 소변에서 PRL-3에 대한 대표적인 웨스턴 블라팅. Mr, 상대 분자량 (kDa).
도 6은 효과적인 PRL3-zumab 치료는 요로 PRL-3의 손실을 가져오고, 종양 내 축적 및 면역 효과기들의 모집이 관여함을 나타낸다. (A) PRL-3 양성(+) SNU484 또는 PRL-3 음성(-) MKN45 동소(orthotopic) 위 종양을 보유하고 처리하지 않은 또는 PRL3-zumab을 처리한 마우스에서 일치 소변 및 종양 샘플에서 PRL-3 단백질에 대한 웨스턴 블로팅. 위 패널, 28 일 (SNU-484) 또는 56 일 (MKN45)에 절제된 위. (B) 다양한 치료를 받은 마우스의 동소(Orthotopic) SNU-484 및 MKN45 종양 조직의 동결절편을 PRL3-zumab (패널 a-f, bar, 20 ㎛)을 이용한 면역조직화학염색, 또는 B 세포 (패널 e-l) 및 NK 세포 (패널 m-r, bar, 50 ㎛) 마커들에 대한 면역 형광 분석. 녹색, B 및 NK 세포 마커의 CD45R / B220 및 CD335 / Nkp46 염색; 파란색, DAPI 핵 염색. (C) PRL-3 양성(+) 암 세포에 대한 PRL3-zumab의 작용 기전을 설명하는 모델 : 1) 비전형적인 분비 (엑소좀 내 PRL-3) 또는 괴사 또는 apoptotic PRL-3 양성(+) 종양 세포들 (자유 PRL-3)로부터의 자발적 누출을 통해 외재화 된 PRL-3 항원은 2) 종양의 오목(niches) 안에 PRL3-zumab 결합 및 면역 복합체 축적을 위한 미끼 역할을 하여 3) 결과적으로 항-종양 효과를 위한 효과기 NK 및 B 세포의 모집 및 활성화를 초래한다.
도 7은 CDR의 위치를 나타내는 인간화 항체 서열. (A) 중쇄 서열 (B) 경쇄 서열.
도 8은 쥐의 항체 클론에 대한 서열 (A) 클론 #223 및 (B) 클론 #318
도 9는 인간 PRL3 서열
도 10은 PRL-3zumab 서열 분석. (A) CDR 영역 (회색 박스)을 식별하고 중요한 도메인 서열 (클리어 박스)을 식별하는 인간화 서열의 경쇄 서열 정렬. (B) CDR 영역 (회색 박스)을 식별하고 중요한 도메인 서열 (클리어 박스)을 확인하는 인간화 서열의 중쇄 서열 정렬.
도 11은 PRL-3가 인간의 위 종양에서 강하게 발현되나, 정상적인 성인 인간 조직에는 발현되지 않는 것을 나타낸다. (A) 다양한 기관의 (a) 다수의 정상적인 인간 조직과 (b) PRL-3 발현에 대한 GC 환자의 위 종양 및 정상 위 조직의 면역 조직 화학 염색. Bar, 50㎛.
도 12는 PRL3-zumab은 PRL-3에 특이적으로 결합하지만, 밀접하게- 관련된 PRL-1 또는 PRL-2에는 결합하지 않는 것을 나타낸다. (A-C) PRL3-zumab 특이성 분석을 위하여 PRL-1, PRL-2 및 PRL-3 단백질의 인간 이소형을 사용하였다. (a) PRL3-zumab 또는 항-GST 항체로 재조합 GST-PRL1, GST-PRL2 및 GST-PRL3의 웨스턴 블라팅. (b) 재조합 GST-PRL1, GST-PRL-2 및 GST-PRL-3 단백질을 사용하여 PRL3-zumab에 대한 ELISA. (c) PRL3-zumab를 사용한 GFP-PRL1, GFP-PRL2 또는 GFP-PRL3 세포를 과발현하는 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포의 면역형광염색. Bar, 40㎛.
도 13은 PRL3-zumab은 마우스에서 PRL-3 양성(+) 동소(orthotopic) 위 종양의 종양 성장을 억제하는 것을 나타낸다. 8 주령의 수컷 BALB/C 누드 마우스에게 동소(orthotopic) 위 종양을 유도하기 위해 PRL-3 양성 NUGC-4 또는 IM-95 세포주를 이식하였다. 실험이 끝나면 육안으로 보이는 종양 (검은 색으로 표시)을 측정하고 체적을 비교하였다. (a) PRL3-zumab을 처리하지 않은 마우스와 PRL3-zumab을 처리한 마우스의 IM-95 종양이 있는 위. 가장 오른쪽 패널, PRL3-zumab을 처리하지 않은 마우스 및 PRL3-zumab 처리 마우스에서 IM-95 종양의 평균 종양 체적을 나타내는 차트. p = 0.008, t- test, n = 6, 평균 ± S.D를 나타내는 데이터. Bar, 10㎜. (b) PRL3-zumab을 처리하지 않은 마우스와 PRL3-zumab을 처리한 마우스의 NUGC-4 종양이 있는 위. 가장 오른쪽 패널, PRL3-zumab을 처리하지 않은 마우스 및 PRL3-zumab 처리 마우스에서 IM-95 종양의 평균 종양 체적을 나타내는 차트. p = 0.003, t- test; n = 4, 평균 ± S.D를 나타내는 데이터. Bar, 10㎜. (C) 인간 IgG 이소타입 컨트롤이 아닌 PRL3-zumab는 생체 내에서 PRL3 양성 위 종양 성장을 억제한다. 8 주령의 수컷 BALB/C 누드 마우스에게 PRL3 양성 SNU-484 종양을 이식하고, 처리하지 않은, 인간 IgG 처리 (hIgG) 및 PRL3-zumab 처리 마우스를 만들었다. P <0.001, one-way ANOVA; 군당 n = 4, 평균 ± SEM을 나타내는 데이터. *** p <0.001, Tukey의 사후 검사 (처리하지 않은 군 대 처리한 군).
도 14는 수술 후 PRL3-zumab 치료는 PRL-3 양성(+) 종양의 재발을 억제하는 것을 나타낸다. (A) PRL-3 양성(+) SNU-484 세포에 의해 형성된 이종 이식 종양은 종양 절제술 전에 3 주 동안 성장시켰다. 이어서, 마우스를 위약 (치료하지 않은) 또는 PRL3-zumab (처리한) 군으로 나누고, 7 주간 격주로 처리하여 종양 재성장을 모니터 하였다. 패널 a, 3 주 끝에서의 종양 보유 마우스 외양. 패널 b, 종양의 외과적 절제술 후 마우스의 외양, 하부 패널에 해부된 종양이 나타난다. 종양의 외과적 절제 후 mouse 외양, 해부 된 종양은 하부 패널에 나타난다. 패널 c-d, 절제 및 처리 후 7 주째 마우스 외양. Panel e, 절제 부위에서 재발한 종양. 패널 f, 처리된 마우스에서 종양 재발은 없었다. Bar, 10 ㎜. (B) 처리하지 않은 (n = 10) 및 처리 한 (n = 8) 마우스 군의 Kaplan Meier 무 재발(recurrence-free) 생존 분석. P <0.001, log-rank test.
도 15은 PRL3-zumab은 위장 내로 이식 된 PRL-3 양성(+) HCT116 대장암 세포에 의해 형성된 국소 및 전이성 복부 종양을 억제한다. HCT116-luc2 세포를 마우스의 위 장막하층에 이식하여 위 오목(niche)으로의 2 차 대장암 전이를 모방하였다. PRL3-zumab 치료는 위의 오목(niche)에서 HCT116-luc2 종양의 성장을 감소시켰다. (A)접종 후 3 주간의 전 생체 내 종양 성장에 대한 IVIS 이미징. (B) (A)의 마우스를 전체 동물의 IVIS 강도 변화에 대해 분석하였다. 군당 n = 4; p <0.001, 양방향 ANOVA. (C) 3 주차 말에 절제된 종양의 종양 무게 (D) (C)의 위를 IVIS 강도의 차이에 대해 분석하였다. 군당 n = 4; p = 0.01, t- test; 평균 ± SEM을 나타내는 데이터. (E) 3 주차 말에 복벽 내 전이성 종양 무게. (F) (E)의 위를 IVIS 강도의 차이에 대해 분석하였다. 군당 n = 4; p = 0.0003, t- test; 평균 ± SEM을 나타내는 데이터.
도 16은 엑소좀-관련 PRL-3는 방광암 환자의 소변에 존재한다는 것을 나타낸다. 방광암 환자의 소변 샘플에서 정화된 엑소좀 분획을 PRL3 CD63 엑소좀 마커에 대한 항체로 분석하였다.
도 17은 SGSet1 환자 코호트의 임상 특징.
도 18은 SGSet1 환자 코호트에서 PRL-3 발현의 단변량 및 다변량 Cox 회귀 분석
도 19는 PRL3 종양 단백질은 암 세포에서 분비되어 PRL3-zumab에 대한 미끼 역할을 하는 것을 나타낸다. (A) 48 시간 동안 무 혈청 배지에서 위암 (GC) 세포 배양 후 세포 내 단백질 풀 (세포 용해물) 및 세포 외 단백질 풀 (농축 배양 배지)에서의 PRL3 단백질 발현의 분석. 세포 외 단백질 분석을 위해, 5 접시의 GC 세포로부터의 조건화 된 배지 (50 ㎖)에서 먼저 사균 및 세포 파편을 제거하고, 원심 농축 (최종 부피 ~ 0.2 ㎖)을 수행 하였다. (B) 다양한 치료 대상 마우스의 동소 SNU-484 및 MKN45 종양 조직의 동결절편을 항-인간 IgG 항체를 사용하여 PRL3-zumab에 대한 면역 조직 화학 법으로 분석 하였다. Bar, 20μ <μM.
도 20은 PRL-3는 생체 내에서 종양 세포의 표면에서 고도로 상향 조절되지만 시험관 내에서 배양 된 암 세포에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. (a) 시험관 내 배양 세포 및 생체 외 종양 세포의 세포-표면 프로파일에 대한 세포 계측 분석을 위한 실험 개요. (b) 대조 (투명), PRL3-zumab (분홍), 또는 cetuximab (CTX, 회색) 항체로 수행한 세포 표면 염색의 대표 히스토그램. 양성 게이트 (% pos)는 대조 염색으로부터 유추 된 배경 신호를 뺀 후에 결정되었다. (c) (b)에서와 같이, 시험 된 다른 항체에 대한 세포 표면 양성 집단의 %. 평균±SEM을 나타내는 데이터. (d) EGFR 및 PRL-3에 대한 웨스턴 블라팅으로, 배양 된 세포와 종양에서의 단백질의 수준 변화를 비교하여 된 것을 나타낸다. GAPDH, 로딩 컨트롤.
도 21은 동소 간 종양의 PRL3-zumab 억제는 숙주 FcγII / III 수용체 결합을 필요로 한다는 것을 나타낸다. (a) 동소 간 종양 모델의 개요. (b) 6 개의 인간 암 세포주에서의 PRL-3 발현의 웨스턴 블라팅 데이터. GAPDH, 로딩 컨트롤. (c) 동소 PRL-3 양성(+) MHCC-LM3 간 종양을 보유한 마우스는 위약 (치료되지 않음)에 비해 주 2 회 100㎍/dose로 PRL3-zumab을 처리(치료)한 경우, 5 주 후에 종양 무게를 감소시켰다. Bar, 10 ㎜. (d) 처리 35 일째, 처리하지 않은 군과 처리한 군에서의 평균 간 종양 부피 . p = 0.0001, t- test; 평균 ± SEM을 나타내는 데이터. (e) 처리하지 않은 (붉은 선) 군 및 처리한 (검은 선) 군의 Kaplan Meier 생존 분석. p = 0.002, log-rank test. (f) PRL3-zumab 대 PRL3-minibody의 도메인 구조 및 숙주 면역 세포에서 Fc 수용체 (FcR)에 관여하는 능력을 묘사하는 만화. 2.42G2 단클론 항체 (mAb)는 FcR 차단제로서 작용하여 손상되지 않은 IgG가 FcR에 결합하는 것을 방지한다.
도 22는 숙주 FcγII / III 수용체와의 상호 작용은 NK 세포, B 세포 및 M1 대 식세포의 종양 오목(niche)으로의 PRL3-zumab 유도성 모집에 필수적임을 나타낸다. 다양한 치료를 받은 마우스의 동소 MHCC-LM3 간 종양 조직 동결절편을 (a) F4/80 (pan-macrophage), (b) CD206 (M2 대식세포), (c) CD86 (M1 대식세포), (d) CD45/B220 (B 세포), 또는 (e) CD335 (NK 세포)에 대한 항체로 면역형광법에 의해 분석하였다. 종양 침윤 점수는 재료 및 방법에 설명한 방법으로 계산하였다. * p <0.05, one-way ANOVA; 평균 ± SEM을 나타내는 데이터. (g) 35 일째에 위약 (치료되지 않음), PRL3-zumab 단독, 2.4G2 mAb, PRL3-zumab + 2.4G2 mAb 병용 요법, 인간 IgG 또는 PRL3-미니 바디로 처리한 마우스의 절제된 간을 촬영하여 종양 체적을 측정 하였다. 동소(Orthotopic) 종양 부위는 검은 선으로 표시하였다. BAr, 10 mm. 35 일째 각 군의 평균 간 종양 부피. p = 0.003, one-way ANOVA(일원 분산 분석); 평균 ± SEM을 나타내는 데이터.
도 23은 PRL-3가 여러 종양에서 종종 과발현되는 일반적인 oncotarget임을 나타낸다. (a-e) (a) 간 종양, (b) 폐 종양, (c) 대장 종양, (d) 유방 종양 및 (e) 신장 종양의 종양 (T) 대 환자 일치 정상 조직 (n) 쌍의 PRL-3의 전체 웨스턴 블랏 분석. (f-j) 일치하는 정상 조직이 없는 추가 환자 시료에서 (f) 신장 종양, (g) 방광 종양, (h) 급성 골수성 백혈병 (AML), (i) 위 종양 및 (j) 전립선 종양의 전체 웨스턴 블라팅 분석. GAPDH, 로딩 컨트롤. 상대 분자량 (kDa)은 각 결과 세트의 오른쪽에 표시함.
도 24는 PRL3-zumab이 PRL-3 양성(+) 암 세포를 직접 저해 할 수 있는지 분석하는 시험관 내 분석.
도 25는 (scFv-CH3) 2 PRL3-minibody의 효능은 동소 PRL-3 양성(+) SNU-484 위 종양에 대한 것이었다.
설명
항체
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 PRL3 (항원)에 결합하고, 선택적으로 5pM 내지 8pM, 바람직하게는 6-7pm, 바람직하게는 약 6.3pM 범위의 Kd를 갖는다. 일 예에서, 상기 항체는 약 7 x 10-5s-1의 오프율 (off rate)을 가진다. 예를 들어, 약 1x10-5s-1 내지 1x10-6s-1이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 PRL3에 결합하지만, PRL1 또는 PRL2에는 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 항체는 분리된 형태로 제공될 수 있다.
"항체"는 이의 단편 또는 유도체, 또는 합성 항체 또는 합성 항체 단편을 포함한다.
단클론 항체 기술과 관련하여 오늘날의 기술을 고려할 때, 항체는 대부분의 항원을 준비할 수 있다. 항원-결합 부분은 항체 (예를 들어 Fab 단편) 또는 합성 항체 단편 (예를 들어 단일 사슬 Fv 단편 [ScFv])의 일부일 수 있다. 선택된 항원에 적합한 단클론 항체는 공지된, 예를 들어 "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)에 개시된 기술에 의해 제조될 수 있다. 키메라 항체는 Neuberger 등 (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)에 의해 논의되었다.
단클론 항체 (mAb)는 본 발명의 방법에서 유용하며, 항원의 단일 에피토프를 특이적으로 표적하는 항체의 균질한 집단이다. 따라서, PRL3에 결합하는 mAb는 암 치료에 유용할 수 있다.
Fab 및 Fab2와 같은 항체의 항원 결합 단편은 또한 유전적으로 조작된 항체 및 항체 단편으로 제공될 수 있다. 항체의 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 도메인은 항원 인식에 관여하며, 초기 프로테아제 분해 실험에 의해 처음으로 인식되었다. 추가 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 발견되었다. 설치류 기원의 가변 도메인이 인간 기원의 불변 도메인에 융합된 결과로 생성되는 항체는 설치류 모항체의 항원 특이성을 보유할 수 있다 (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855).
본 발명에 따른 항체 및 항체 결합 단편은 인간화되어 있다. 인간화 항체는 단백질 서열이 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키도록 변형된 비인간 종에서 유래된 항체이다. "인간화" 과정은 일반적으로 인간에게 투여하기 위해 개발된 단클론 항체에 적용된다. "인간화"의 과정은 특정 항체를 개발하는 과정이 마우스와 같은 비인간 면역계에서의 생성을 포함할 때 필요할 수 있다. 그러한 항체는 인간 환자에게 투여될 때 면역원성이 될 수 있기 때문이다. 인간화는 분자의 Fab 부분에서 선택적 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 또는, 인간화는 적절한 CDR 코딩 절편을 인간 항체 스캐폴드에 삽입하는 것을 포함할 수 있다.
항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고 불변 도메인과는 독립적이며, 하나 이상의 가변 도메인을 모두 포함하는 항체 단편의 박테리아 발현을 포함하는 실험으로부터 알려졌다. 이들 분자는 Fab-유사 분자 (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자 (Skerra 등 (1988) Science 240, 1038); VH 및 VL 파트너 도메인이 가요성 (flexible) 올리고펩타이드로 연결된 단쇄 Fv (ScFv) 분자 (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879) 및 분리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 (dAbs) (Ward et al (1989) Nature 341, 544)를 포함한다. 그들의 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성과 관련된 기술에 대한 일반적인 리뷰는 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293- 299에서 찾아볼 수 있다.
"ScFv 분자"는 VH 및 VL 파트너 도메인이 공유결합으로 연결, 예를 들어 가요성 (flexible) 올리고펩타이드에 의해 연결된 분자를 의미한다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 대장균에서 발현되어 분비될 수 있으므로, 상기 단편을 다량으로 용이하게 생산할 수 있다.
전체 항체 및 F (ab')2 단편은 "2가 (bivalent)"이다. "2가 (bivalent)"는 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2 개의 항원 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 단 하나의 항원 결합 부위를 갖는 1가 (monovalent)이다. PRL3에 결합하는 합성 항체는 또한 당업계에 잘 알려진 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
항체는 변형되지 않은 모항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 향상된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙 과정에 의해 제조될 수 있다. 친화도-성숙 항체는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 Marks et al.,Rio /Technology 10:779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad . Sci . USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol . 154(7):331 0-15 9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)에 의해 제조될 수 있다.
발명에 따른 항체는 바람직하게는 PRL3에 특이적으로 결합한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화력 및/또는 더 긴 지속 시간으로 표적에 결합한다. 일 실시예에서, 비관련 표적에 대한 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사면역측정법 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤10nM, ≤1nM 또는 ≤100pM 중 하나의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 표적에 대한 항체의 결합 친화도는 종종 해리 상수 (Kd)로 기재된다. 결합 친화도는 항체 및 항원 분자의 Fab 버전으로 수행되는 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
발명에 따른 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 "길항제" 항체일 수 있다. PRL3의 차단은 PRL3의 포스파타아제 활성을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 일 예에서, 항체는 PRL3에 결합하지만, PRL3의 활성에는 반드시 영향을 주지는 않는다.
특정 방법에서, 항체는 PRL3-ZUMAB 또는 PRL3-ZUMAB의 변이체이다. RL3-ZUMAB는 다음의 CDR 서열을 포함한다:
경쇄:
LC-CDR1 : (서열번호 4)
LC-CDR2 : (서열번호 5)
LC-CDR3 : (서열번호 6)
중쇄:
HC-CDR1 : (서열번호 1)
HC-CDR2 : (서열번호 2)
HC-CDR3 : (서열번호 3)
CDR 서열은 Kabat 정의에 의해 결정된다.
본원에 기재된 바와 같은 CDR을 갖는 항체 분자의 구조는 일반적으로 항체 분자 또는 이의 실질적인 부분의 중쇄 또는 경쇄 서열일 것이며, 여기서 CDR은 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR에 대응하는 위치에 위치한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987, 및 이의 업데이트 문헌에 의해 결정된다. 이 데이터베이스를 조회하기 위해 많은 학술 및 상업 온라인 자료를 이용할 수 있다. 예를 들어, Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 및 현재 관련 웹사이트인 bioinf.org.uk/abs/simkab.html의 온라인 자료를 참고할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 PRL3-ZUMAB 또는 서열번호 1 내지 6 중 하나의 CDR을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체에서, 6개 CDR 서열 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개가 변할 수 있다. 변이체는 6개 CDR 서열 중 1개 또는 2개에서 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
항-PRL3-ZUMAB 클론의 VH 및 VL 사슬의 아미노산 서열을 도 7에 나타내었다.
경쇄 및 중쇄 CDR은 또한 다수의 상이한 프레임워크 영역과 관련하여 특히 유용할 수 있다. 따라서, LC-CDR1-3 또는 HC-CDR1-3을 갖는 경쇄 및/또는 중쇄는 대안적인 프레임워크 영역을 가질수 있다. 적합한 프레임워크 영역은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 참조된 M. Lefranc & G. Lefranc (2001) "The Immunoglobulin FactsBook", Academic Press에 기재되어 있다.
본 명세서에서, 항체는 도 7의 하나 이상의 VH 및/또는 VL 아미노산 서열과 높은 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 및/또는 VL 사슬을 가질수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 PRL3에 결합하고, 도 7에 제시된 아미노산 서열 중 하나의 VH 사슬 아미노산 서열에 대해 서열 상동성이 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬을 가진다.
본 발명에 따른 항체는 검출 가능하게 표지되거나, 또는 적어도 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사성 원자 또는 유색의 분자 또는 형광 분자 또는 임의의 다른 방법으로 용이하게 검출될 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 적합한 검출 가능한 분자는 형광 단백질, 루시퍼라제, 효소 기질 및 방사성 표지를 포함한다. 결합 모이어티 (moiety)는 검출 가능한 표지로 직접 표지되거나 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 결합 모이어티 (moiety)는 그 자체가 표지된 다른 항체에 의해 검출될 수 있는 비표지 항체일 수 있다. 또한, 2차 항체는 비오틴에 결합될 수 있고, 비오틴에 대한 표지된 스트렙타비딘의 결합은 1차 항체를 간접적으로 표지하는데 사용된다.
다양한 항체 단편이 본원에 기재되어 있지만, 항체는 바람직하게는 항체 결합 단편 (Fab) 및 결정화 가능한 단편 (Fc)을 함유하는 전체 항체이다. 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성될 수 있다. 이는 항체의 항원 특이성을 제공하는 가변 단편 (Fv) 및 불변 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 단편은 바람직하게는 CH2 도메인을 포함한다. 항체의 CH2 도메인은 작용기 기능을 중재하고, 항체 안정성을 보존하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 항체 단편은 Fab', F(ab)'2, scFv 또는 미니바디가 아닌 것이 바람직하다.
발명에 따른 항체 및 단편은 바람직하게는 Fcγ (Fc- 감마) 수용체, 바람직하게는 FcγII (CD32) 및 FcγIII (CD16) 수용체와 상호 작용할 수 있다.
검출 방법
본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 PRL3에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 그러한 방법은 항체 또는 항원 결합 단편과 PRL3이 결합된 복합체의 검출을 포함할 수 있다. 이와 같이 일 실시예에서, PRL3를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 항체 또는 항원 결합 단편과 PRL3의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
적합한 방법 포맷은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 샌드위치 분석, 즉 ELISA와 같은 면역분석법을 포함한다. 상기 방법은 항체, 또는 항원 결합 단편, 또는 PRL3, 또는 둘 모두를 검출 가능한 표지, 예를 들어 형광, 발광 또는 방사성 동위원소로 표지하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 종류의 방법은 PRL3의 검출 및/또는 정량화를 필요로 하는 질병 또는 상태의 진단 방법의 기초를 제공할 수 있다. 이러한 방법은 환자 샘플에서 인비트로에서 수행되거나, 환자 샘플의 처리 후에 수행될 수 있다. 샘플이 수집되면, 환자는 인비트로 방법으로 진단을 수행하기 위해 출석할 필요가 없고, 따라서 상기 방법은 인간 또는 동물의 몸에서 실행되지 않는 방법일 수 있다.
이러한 방법은 환자 샘플에 존재하는 PRL3의 양을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 진단에 이르는 과정의 일부로서 상기 결정된 양을 표준 또는 기준치와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 진단 또는 예후의 정확성을 높이거나, 또는 여기에 설명된 검사를 사용하여 얻은 결과를 확인하기 위해 본원에 기재된 진단 테스트와 함께 다른 진단 테스트를 사용할 수 있다.
PRL3의 샘플에서의 검출은 환자의 암 상태를 진단, 암 상태의 경향을 진단, 또는 암 상태의 예후 (예후 예측)를 제공하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 진단 또는 예후는 양성 또는 악성일 수 있는 기존의 (이전에 진단된) 암의 상태와 관련될 수 있으며, 의심되는 암의 상태와 관련될 수 있거나, 또는 환자의 암 상태 (이전에 진단되지 않았을 수 있는)에 대한 스크리닝과 관련될 수 있다.
샘플은 모든 조직 또는 체액에서 채취할 수 있다. 샘플은 다음을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다: 혈액의 양; 피브린 응고 및 혈액 세포의 제거 후에 수득 된 혈액의 유체 (fluid) 부분을 포함할 수 있는 개체의 혈액으로부터 유래된 혈청의 양; 조직 샘플 또는 생검; 또는 상기 개체로부터 분리된 세포.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게 인비트로 (in vitro)에서 수행된다. 용어 "인비트로 (in vitro)"는 배양된 세포의 실험을 포함하는 것으로 의도된 반면, 용어 “인비보 (in vivo)"는 손상되지 않은 다세포 생물체 실험을 포함하는 것으로 의도된다.
치료의 적용
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩타이드 및 이러한 제제를 포함하는 조성물은 의학적 치료 방법에 사용하기 위해 제공될 수 있다. 치료는 치료가 필요한 질병 또는 상태를 갖는 피험자에게 제공될 수 있다. 상기 질병 또는 상태는 전이암을 포함하는 암일 수 있다.
항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드의 투여는 바람직하게는 "치료학적 유효량"이며, 이것은 개체에게 유익을 나타내기에 충분하다. 실제 투여량, 및 투여의 속도 및 시간적 처리는 치료되는 질환의 본질 및 중증도에 달려있다. 치료의 처방, 예를 들어 복용량 결정 등은 일반의 및 다른 전문의의 책임하에 있으며, 일반적으로 치료할 장애, 개별 환자의 상태, 전달 장소, 투여 방법 및 의사에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 상기 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 찾을 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 치료를 받지 않은 사람과 비교하여, 치료가 적용되는 개체의 측정 가능한 기준의 개선을 적절하게 가능하게 한다
이 목적을 위해, 암의 진행 또는 환자의 복지를 반영하는 다수의 기준이 지정될 수 있다. 유용한 기준에는 종양 사이즈, 종양 치수, 종양의 최대 치수, 종양 수, 종양 마커 (알파-페토 단백질과 같은)의 존재, 전이 정도 또는 수 등이 포함될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 치료된 개체는 적절한 분석 또는 검사에 의해 측정했을 때 종양의 크기 또는 수의 감소를 보일 수 있다. 치료된 개체는 예를 들어 치료받지 않은 사람과 비교하여, 특정 종양의 크기, 또는 종양 수, 또는 두가지 모두 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 감소한다.
증식성 질환이라는 용어는 본원에서 세포주기의 조절을 필요로 하는 임의의 장애를 포함하는 넓은 의미로 사용된다. 특히, 증식성 장애에는 악성 및 종양전 장애가 포함된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 다음와 같은 선암의 치료 또는 진단과 관련하여 특히 유용하다: 소세포 폐암 및 신장, 자궁, 전립선, 방광, 난소, 결장 및 유방의 암. 예를 들어, 치료할 수 있는 악성종양에는 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 골수종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 림프관내피육종, 혈관육종, 내피육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 림프관육종, 활막종, 중피종, 평활근 육종, 횡문근 육종과 같은 육종, 대장암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 편평세포암, 기저세포암, 선암, 한선암종, 피지선암종, 유두암종, 유두선암, 낭성선암, 수질암종, 기관지암종, 신장암, 간암, 담관암종, 배아암종, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 수모세포종, 두개인두종, 희소돌기아교종, 망막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종이 포함된다.
본 발명의 목적에서, 용어 "암"은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 급성 림프성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질암, 항문암, 방광암, 혈액암, 골암, 뇌암, 유방암, 여성 생식기 암, 남성 생식기 암, 중추 신경계 림프종, 자궁경부암, 소아 횡문근육종, 소아육종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장 및 직장암, 결장암, 자궁내막암, 장궁내막육종, 식도암, 안암, 담낭암, 위암, 위장관암, 모낭 세포성 백혈병, 두경부암, 간세포암, 호 지킨병, 하인두암, 카포시육종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 악성 섬유 성 조직구종, 악성 흉선종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 골수종, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경계 암, 신경아세포종, 비호지킨 림프종, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음낭암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질 세포 종양, 원발성 CNS 림프종, 전립선암, 직장암, 호흡기계암, 망막모세포종, 타액선 암, 피부암, 소장암, 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 비뇨기계 암, 자궁 육종, 질암, 혈관계 암, 발덴스트룀 거대글로불린혈증 및 윌름 종양.
치료는 암의 증상을 완화시킬 수 있거나, 또는 암을 완전히 치료할 수 있다. 치료는 암의 진행을 늦추거나, 또는 암 증상의 악화를 예방할 수 있다.
약학적으로 유용한 조성물 및 약제의 제형
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩타이드는 임상적 용도를 위한 약학적 조성물로 제제화될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 약학적으로 유용한 조성물의 제조를 위한 방법이 또한 제공되며, 이러한 제조 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 본원에 기재된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 분리하는 단계; 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 분리된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계.
예를 들어, 본 발명의 추가의 양태는 T 세포 기능 장애를 치료하는데 사용하기 위한 약제 또는 약학 조성물을 제형화 또는 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 약학 적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합하여 약학 조성물 또는 약제를 제제화하는 것을 포함한다.
암
암은 불필요한 세포 증식 (또는 불필요한 세포 증식으로 나타나는 모든 질병), 신생물 또는 종양 또는 불필요한 세포 증식, 신생물 또는 종양의 증가된 위험 또는 경향일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있으며, 1차 또는 2차 (전이성) 일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있으며, 모든 조직에 위치할 수 있다. 조직의 예는 부신, 부신수질, 항문, 맹장, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계 (뇌를 포함 또는 포함하지 않음) 소뇌, 자궁경관, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피세포 (예: 신장 상피), 담낭, 식도, 신경교세포, 심장, 회장, 공장, 신장, 눈물샘, 후두, 간, 폐, 임파선, 림프절, 림프 모세포, 상악골, 종격동, 장간막, 자궁 근층, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 이하선, 말초신경계, 복막, 흉막, 전립선, 타액선, S상 결장, 피부, 소장, 연조직, 비장, 위, 정소, 흉선, 갑상선, 혀, 편도선, 기관, 자궁, 외음부, 백혈구를 포함한다.
치료할 종양은 신경계 또는 비신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양은 중추 신경계 또는 말초 신경계에서 유래할 수 있다. 즉, 신경아교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 상행부종, 신경초종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 희소돌기아교세포종. 비신경계 암/종양은 다른 비신경 조직에서 유래할 수 있으며, 예를 들어, 악성종양, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비호지킨 림프종 (NHL), 호 지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS), 피부 T 세포 림프종 (CTCL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 간암, 표피 암종, 전립선 암종, 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암종, NSCLC, 혈액암 및 육종을 포함한다.
특히 바람직한 양태에서, 암은 PRL3 발현 암이다. 일 예에서, 암은 PRL3 과발현 암이다. 즉, 암은 PRL3의 과발현과 관련이 있거나, 또는 PRL3의 과발현에 기인한다. PRL3는 암에서 기능할 필요는 없지만, 대신 암세포의 표지 또는 인공물 (artefact)일 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 암은 위암, 비인두암, 방광암, 폐암, 유방암 또는 전립선 암이다. 암은 급성 골수성 백혈병, 결장암 또는 난소암일 수 잇다. 일 예에서, 암은 전이암이다.
동시 또는 순차적 투여
조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 병용하여, 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드 및 항 감염제 또는 화학요법제 (치료제)는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드로의 치료는 화학요법을 동반할 수 있다.
동시 투여란 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드 및 치료제를 함께, 예를 들어 두가지 제제를 함유하는 약학적 조성물 (복합 제제)로서 또는 서로 직후에 투여하는 것을 말하며, 경우에 따라 동일한 투여 경로, 즉 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관을 통해 투여하는 것을 말한다.
순차적 투여는 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드 또는 치료제 중 하나의 투여는 다른 약제의 별도 투여에 의해 주어진 시간 간격 후에 투여하는 것을 말한다. 일부 실시 예에서는, 두 제제가 동일한 경로로 투여될 필요는 없다. 시간 간격은 임의의 시간 간격 일수 있다.
화학요법
화학요법은 약물 또는 이온화 방사선 (예를 들어, X- 선 또는 γ- 선을 이용한 방사선요법)으로 암을 치료하는 것을 말한다. 바람직한 양태에서, 화학요법은 약물 치료를 의미한다. 약물은 화학물질, 예를 들어 소분자 약제, 항생제, DNA 인터카레이트 (intercalator), 단백질 억제제 (즉, 키나아제 억제제), 또는 생물학적 제제, 예를 들어 항체, 항체 단편, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 핵산 (즉, DNA, RNA), 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질일 수 있다. 약물은 약학 조성물 또는 약제로서 제제화될 수 있다. 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 하나 이상의 약물 (예를 들어, 하나 이상의 활성제)을 포함할 수 있다.
치료는 하나 이상의 약물 투여를 포함할 수 있다. 약물은 단독으로 또는 다른 치료와 병용하여, 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 화학요법은 두 가지 약물의 투여를 포함하는 병용요법일 수 있으며, 이들 중 하나 이상은 암을 치료할 수 있다.
화학요법은 하나 이상의 투여 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 비경구, 정맥내 주사, 경구 또는 종양내 투여.
화학요법은 치료 계획 (regime)에 따라 투여될 수 있다. 치료 계획은 의사 또는 의료 종사자에 의해 준비될 수 있는 화학요법 투여의 예정된 시간표, 플랜, 계획 또는 일정일 수 있으며, 치료가 요구되는 환자에게 적합하도록 맞춰질 수 있다.
치료 계획은 다음 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 환자에게 투여할 화학요법의 유형; 각 약물 또는 방사선 용량; 투여 사이의 시간 간격; 각 치료의 기간; 치료 휴일의 수와 성격, 있을 경우에. 병용 치료를 위해 각 약물을 투여하는 방법을 나타내는 단일 치료 계획이 제공 될 수 있다.
화학요법 약물은 다음에서 선택될 수 있다:
ㆍ 시스플라틴, 카보플라틴, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파마이드와 같은 알킬화제;
ㆍ 아자치오퓨린 또는 메르캅토퓨린과 같은 퓨린 또는 피리미딘 항대사물질
ㆍ 빈카 알칼로이드 (예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신), 포코필로톡신, 에토포시드, 테니포시드, 파클리탁셀 (탁솔TM), 도세탁셀과 같은 알칼로이드 및 테르페노이드;
ㆍ 제1형 토포이소머라제 억제제 캄프토테신 이리노테칸 및 토포테칸, 또는 제2형 토포이소머라제 억제제 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니 포시드와 같은 토포아이소머라제 억제제;
ㆍ 닥티노마이신, 독소루비신 (AdriamycinTM), 에피루비신, 블레오마이신, 라파마이신과 같은 항종양 항생제 (예: 안트라사이클린 항생제);
ㆍ 항-TEG-3 항체, 항-VEGF, 항-TNFα, 항-IL-2, 항-GpIIb/IIIa, 항-CD-52, 항-CD20, 항-RSV, 항-HER2/neu(erbB2) 항-TNF 수용체, 항-EGFL 항체, 단클론 항체 또는 항체 단편과 같은 항체 기반 제제: 예를 들어, 세툭시맙, 파니투뮤맙, 인플릭시맙, 바실리시맙, 베바시주맙 (Avastin®), 압식시맙, 다크리주맙, 젬투주맙, 알렘투주맙, 리툭시맙 (Mabthera®), 팔리비주맙, 트라스투주맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 니모투주맙을 포함한다;
ㆍ 엘로티닙, 세툭시맙 및 게피티닙과 같은 EGFR 억제제;
ㆍ 베바시주맙 (Avastin®)과 같은 항-혈관신생제.
추가의 화학요법 약물은 다음에서 선택될 수 있다: 13-cis-Retinoic Acid, 2-Chlorodeoxyadenosine, 5-Azacitidine 5-Fluorouracil, 6-Mercaptopurine, 6-Thioguanine, Abraxane, Accutane®, Actinomycin-D Adriamycin®, Adrucil®, Afinitor®, Agrylin®, Ala-Cort®, Aldesleukin, Alemtuzumab, ALIMTA, Alitretinoin, Alkaban-AQ®, Alkeran®, All-transretinoic Acid, Alpha Interferon, Altretamine, Amethopterin, Amifostine, Aminoglutethimide, Anagrelide, Anandron®, Anastrozole, Arabinosylcytosine, Aranesp®, Aredia®, Arimidex®, Aromasin®, Arranon®, Arsenic Trioxide, Asparaginase, ATRA Avastin®, Azacitidine, BCG, BCNU, Bendamustine, Bevacizumab, Bexarotene, BEXXAR®, Bicalutamide, BiCNU, Blenoxane®, Bleomycin, Bortezomib, Busulfan, Busulfex®, Calcium Leucovorin, Campath®, Camptosar®, Camptothecin-11, Capecitabine, Carac™, Carboplatin, Carmustine, Casodex®, CC-5013, CCI-779, CCNU, CDDP, CeeNU, Cerubidine®, Cetuximab, Chlorambucil, Cisplatin, Citrovorum Factor, Cladribine, Cortisone, Cosmegen®, CPT-11, Cyclophosphamide, Cytadren®, Cytarabine Cytosar-U®, Cytoxan®, Dacogen, Dactinomycin, Darbepoetin Alfa, Dasatinib, Daunomycin, Daunorubicin, Daunorubicin Hydrochloride, Daunorubicin Liposomal, DaunoXome®, Decadron, Decitabine, Delta-Cortef®, Deltasone®, Denileukin, Diftitox, DepoCyt™, Dexamethasone, Dexamethasone Acetate, Dexamethasone Sodium Phosphate, Dexasone, Dexrazoxane, DHAD, DIC, Diodex, Docetaxel, Doxil®, Doxorubicin, Doxorubicin Liposomal, Droxia™, DTIC, DTIC-Dome®, Duralone®, Eligard™, Ellence™, Eloxatin™, Elspar®, Emcyt®, Epirubicin, Epoetin Alfa, Erbitux, Erlotinib, Erwinia L-asparaginase, Estramustine, Ethyol Etopophos®, Etoposide, Etoposide Phosphate, Eulexin®, Everolimus, Evista®, Exemestane, Faslodex®, Femara®, Filgrastim, Floxuridine, Fludara®, Fludarabine, Fluoroplex®, Fluorouracil, Fluoxymesterone, Flutamide, Folinic Acid, FUDR®, Fulvestrant, Gefitinib, Gemcitabine, Gemtuzumab ozogamicin, Gleevec™, Gliadel® Wafer, Goserelin, Granulocyte - Colony Stimulating Factor, Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor, Herceptin ®, Hexadrol, Hexalen®, Hexamethylmelamine, HMM, Hycamtin®, Hydrea®, Hydrocort Acetate®, Hydrocortisone, Hydrocortisone Sodium Phosphate, Hydrocortisone Sodium Succinate, Hydrocortone Phosphate, Hydroxyurea, Ibritumomab, Ibritumomab Tiuxetan, Idamycin®, Idarubicin, Ifex®, IFN-alpha, Ifosfamide, IL-11, IL-2, Imatinib mesylate, Imidazole Carboxamide, Interferon alfa, Interferon Alfa-2b (PEG Conjugate), Interleukin - 2, Interleukin-11, Intron A® (interferon alfa-2b), Iressa®, Irinotecan, Isotretinoin, Ixabepilone, Ixempra™, Kidrolase, Lanacort®, Lapatinib, L-asparaginase, LCR, Lenalidomide, Letrozole, Leucovorin, Leukeran, Leukine™, Leuprolide, Leurocristine, Leustatin™, Liposomal Ara-C, Liquid Pred®, Lomustine, L-PAM, L-Sarcolysin, Lupron®, Lupron Depot®, Matulane®, Maxidex, Mechlorethamine, Mechlorethamine Hydrochloride, Medralone®, Medrol®, Megace®, Megestrol, Megestrol Acetate, Melphalan, Mercaptopurine, Mesna, Mesnex™, Methotrexate, Methotrexate Sodium, Methylprednisolone, Meticorten®, Mitomycin, Mitomycin-C, Mitoxantrone, M-Prednisol®, MTC, MTX, Mustargen®, Mustine, Mutamycin®, Myleran®, Mylocel™, Mylotarg®, Navelbine®, Nelarabine, Neosar®, Neulasta™, Neumega®, Neupogen®, Nexavar®, Nilandron®, Nilutamide, Nipent®, Nitrogen Mustard, Novaldex®, Novantrone®, Octreotide, Octreotide acetate, Oncospar®, Oncovin®, Ontak®, Onxal™, Oprevelkin, Orapred®, Orasone®, Oxaliplatin, Paclitaxel, Paclitaxel Protein-bound, Pamidronate, Panitumumab, Panretin®, Paraplatin®, Pediapred®, PEG Interferon, Pegaspargase, Pegfilgrastim, PEG-INTRON™, PEG-L-asparaginase, PEMETREXED, Pentostatin, Phenylalanine Mustard, Platinol®, Platinol-AQ®, Prednisolone, Prednisone, Prelone®, Procarbazine, PROCRIT®, Proleukin®, Prolifeprospan 20 with Carmustine Implant Purinethol®, Raloxifene, Revlimid®, Rheumatrex®, Rituxan®, Rituximab, Roferon-A® (Interferon Alfa-2a), Rubex®, Rubidomycin hydrochloride, Sandostatin® Sandostatin LAR®, Sargramostim, Solu-Cortef®, Solu-Medrol®, Sorafenib, SPRYCEL™, STI-571, Streptozocin, SU11248, Sunitinib, Sutent®, Tamoxifen, Tarceva®, Targretin®, Taxol®, Taxotere®, Temodar®, Temozolomide, Temsirolimus, Teniposide, TESPA, Thalidomide, Thalomid®, TheraCys®, Thioguanine, Thioguanine Tabloid®, Thiophosphoamide, Thioplex®, Thiotepa, TICE®, Toposar®, Topotecan, Toremifene, Torisel®, Tositumomab, Trastuzumab, Treanda®, Tretinoin, Trexall™, Trisenox®, TSPA, TYKERB®, VCR, Vectibix™, Velban®, Velcade®, VePesid®, Vesanoid®, Viadur™, Vidaza®, Vinblastine, Vinblastine Sulfate, Vincasar Pfs®, Vincristine, Vinorelbine, Vinorelbine tartrate, VLB, VM-26, Vorinostat, VP-16, Vumon®, Xeloda®, Zanosar®, Zevalin™, Zinecard®, Zoladex®, Zoledronic acid, Zolinza, Zometa®.
투여 경로
본 발명의 관점에 따른 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩타이드 및 기타 치료제, 약제 및 약학적 조성물은 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내 및 경구를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩타이드 및 다른 치료제는 액체 또는 고체 형태로 제형화될 수 있다. 액상제는 인간 또는 동물 신체의 선택된 부위로의 주사에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
바람직한 양태에서, 항체는 전신 투여된다. 정맥 내 투여가 특히 고려된다.
일부의 경우, 항체는 암세포와 먼 위치에 있거나, 또는 암세포의 알려진 위치와 멀리 떨어져있는 위치에 적용된다. 그러한 경우, 항체는 종양으로 이동하는 것과 같이 체내에서 암세포로 이동할 수 있다.
일 양태에서, 항체는 종양에 직접 적용되거나, 또는 종양 절제 부위에 적용되는 것과 같은 암세포의 위치에서 투여된다. 투여는 절제 수술 중 발생할 수 있거나, 또는 절제 수술 후에 발생할 수 있다. 종양은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
투여는 종양 절제 부위에서 종양의 재성장을 예방하기 위한 의도로 수행되거나, 또는 절제된 종양 이외의 위치에서 암세포가 형성되는 것을 예방하기 위한 의도로 수행될 수 있다.
용법
항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드의 다회 투여 용량이 제공될 수 있다. 하나 이상 또는 각각의 투여는 다른 치료제의 동시 또는 순차적 투여를 수반할 수 있다.
다회 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 중 어느 하나의 미리 결정된 시간 간격에 의해 분리될 수 있다. 예를 들면, 7, 14, 21 또는 28 일 (± 3, 2 또는 1일)에 한 번씩 투여될 수 있다.
키트
본 발명의 일부 측면에서, 부품 키트가 제공된다. 일부 실시 양태에서, 키트는 미리 결정된 양의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 포함하는 적어도 하나 이상의 용기를 가질 수 있다. 상기 키트는 약물 또는 약학적 조성물의 형태로 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 제공할 수 있으며, 특정 질병 또는 상태를 치료하기 위해서 환자에게 투여하기 위한 지시와 함께 제공될 수 있다. 상기 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드는 종양 또는 혈액으로의 주사 또는 주입에 적합하도록 제형화 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 키트는 미리 결정된 양의 다른 치료제 (예를 들어, 항감염제 또는 화학요법제)를 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 키트는 또한 제 2 약물 또는 약학적 조성물을 포함할 수 있고, 두 가지 약물 또는 약학적 조성물은 동시에 또는 개별적으로 투여될 수 있으며, 특정 질병 또는 상태에 대한 병행 치료를 제공할 수 있다. 치료제는 또한 종양 또는 혈액으로의 주사 또는 주입에 적합하도록 제형화 될 수 있다.
대상
처리 대상은 동물 또는 인간일 수 있다. 대상은 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이며, 비인간 포유동물 일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있으며, 환자일 수 있다. 대상은 치료가 필요한 질병이나 상태로 진단 받았거나, 그러한 질병이나 상태를 가진 것으로 의심되었을 수 있다.
대상 또는 환자 선택
일부 측면에서, 인간화된 항-PRL3 항체 또는 항체 단편으로 처리하기 위해 환자를 선택하였다. 일부의 경우 PRL3를 발현하는 암을 갖는 환자로 결정되었으며, 일부의 경우 상기 암은 PRL3 과발현 암일 수 있다. 어떤 경우에는, 예를 들어 정상적인 백혈구 수를 갖는 환자와 같이 기능적 또는 활성 면역계를 갖는 환자로 결정된다. 일부 방법에서는 면역계가 손상되지 않은 환자로 결정되었다. 특히, 정상 범위 내의 백혈구 수를 갖는 환자로 결정될 수 있다. 백혈구 감소증(leukopenia)이 없는 환자로 결정될 수 있다. 상기 환자는 정상 범위 내의 호중구, 림프구, 단핵구, 적혈구 또는 혈소판 수치를 갖는 것으로 결정될 수 있다. 상기 환자는 면역계가 손상되지 않은 개체의 수치나 정상적인 값으로 설정된 것과 같이, 대조군과 유의한 차이가 없는 백혈구 수, 호중구, 림프구, 단핵구, 적혈구 또는 혈소판 수를 가질 수 있다. 예를 들어, 환자는 혈액 약 1 마이크로리터 당 약 4,500 내지 약 10,000개의 백혈구를 갖는 것으로 결정될 수 있다.
일부 화학요법제는 백혈구 수 감소와 관련이 있기 때문에 일부 경우에는, 과거에 화학요법이나 특정 화학요법제를 받지 않은 경우에만 처리를 위한 환자로 선택한다. 일부의 경우, 환자는 과거에 암에 대한 화학요법 치료를 받지 못했다. 일부의 경우, 환자는 대사길항물질(antimetabolite) 화학 요법을 받지 못했다. 어떤 경우에는 환자가 thymidylate synthase 억제제 치료를 받지 못했다. 어떤 경우에는 환자가 5-FU 치료를 받지 못했다.
본 명세서에 제시된 데이터는 종양 또는 암 세포 내에서 발견된 PRL3이 환자의 소변 내 검출이 가능한 적절한 수준으로 존재할 수 있음을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 PRL3가 암 발병의 매우 초기 단계에 소변에서 검출될 수 있는 것을 발견했다. 따라서, 일부의 경우, 소변, 타액, 혈액 또는 혈장 또는 모유를 포함한 다른 체액 샘플과 같이 환자로부터 수득된 체액 샘플에서 PRL3의 검출 또는 정량화에 기초하여 처리를 위한 환자를 선택한다. 바람직하게는, 상기 체액은 소변이다. 종양단백질(oncoprotein)의 존재 또는 부재는 ELISA 또는 웨스턴블랏 기반 방법과 같은 면역분석법과 관련될 수 있다. 일부의 경우, PRL3는 샘플의 엑소좀에서 검출된다.
본 명세서에 개시된 방법에 의해 검출 가능한 암은 위암, 방광암, 폐암, 유방암, 위암, 비인두암, 전립선암 (예컨대 전립선 선암 또는 전립선 비대증, 특히 양성 전립선 비대증)을 포함한다. 상기 암은 샘플 출처와 구별될 수 있다. 상기 암은 샘플 또는 생검에 접근하기가 어렵거나 침습적일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 일 양태에서, 환자로부터 수득된 체액 샘플에서 PRL3의 검출을 통해 환자가 암을 가진 것으로 진단될 수 있으며, 인간화된 항-PRL3 항체로 처리하는 것으로 선택될 수 있다. 암은 고형암일 수 있다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, PRL3은 광범위한 암과 관련되어 있다.
여기에 설명된 바와 같이, 세포 표면 PRL3의 증가를 통해 개체가 암을 가지거나, 세포에 암이 있음을 보여줄 수 있는 점에서 검출은 PRL3의 세포 위치 결정을 포함할 수 있다.
PRL3의 세포 위치 결정을 측정하는 방법은 당업자에게 용이하게 이해될 것이다. 일부의 경우, 면역분석법을 사용하여 개체로부터 얻은 샘플에서 타겟(예를 들면, PRL3)을 검출한다. 면역분석법은 검출 가능한 분자와 함께 타겟 분자에 대한 특이적 친화성을 갖는 항체를 사용한다. 일부의 경우, 항체는 검출 가능한 분자에 접합된다. 검출 가능한 분자는 표지라고 할 수 있다. 검출 가능한 분자는 항체가 타겟 분자에 결합될 때 검출 가능한 신호를 생성한다. 검출 가능한 신호는 정량화 가능한 신호일 수 있다. 어떤 경우에는, 항체 대신 또는 항체와 함께 앱타머가 사용된다. 적합한 방법은 in situ hybridization, FACS (fluorescence activated cell sorting) 또는 flow cytometry와 같은 면역조직화학을 포함한다. PRL3zumab과 같이 PRL3에 결합하는 항체 또는 앱타머와 같은 결합제를 이용할 수 있다. 상기 방법은 샘플을 결합제에 노출시키고, 세포 표면 PRL3가 결합제에 의해 결합되어 결합제의 검출을 허용하는 단계를 포함 할 수 있다.
단백질 발현
세포에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생산하기에 적합한 분자 생물학 기술은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 제시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
상기 폴리펩타이드는 뉴클레오타이드 서열로부터 발현될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 세포 내에 존재하는 벡터에 포함될 수 있고, 세포의 유전체(genome)에 혼입될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 외인성 유전 물질을 세포 내로 전달하기 위한 운반체로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드 분자 (DNA 또는 RNA)를 의미한다. 상기 벡터는 세포 내 유전 물질의 발현을 위한 발현 벡터 일 수 있다. 벡터는 발현될 유전자 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동되도록 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여 벡터로부터 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드, 이중 벡터, 바이러스 벡터 및 인공 염색체 (예를 들어, 효모 인공 염색체)를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "작동되도록 연결된"이란 뉴클레오타이드 서열의 발현에 조절 서열이 영향을 미치거나 조절할 수 있도록 위치하는 방식으로, 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 조절 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)이 공유 결합으로 연결되는 것을 포함한다 (이에 의해 발현 카세트를 형성). 따라서, 조절 서열이 뉴클레오타이드 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있다면, 조절 서열은 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동되도록 연결된 것이다. 가능한 경우, 생성된 전사물은 목적하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드를 생산하는데 폴리펩타이드의 발현에 적합한 임의의 세포가 사용될 수 있다. 상기 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 적절한 원핵세포는 대장균을 포함한다. 진핵세포의 예로는 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포를 포함한다. 어떤 경우에 상기 세포는 원핵세포가 아니다. 일부 원핵세포는 진핵세포와 같이 번역 후 변형(post-translational modification)을 허용하지 않기 때문이다. 또한, 진핵생물에서 매우 높은 발현 수준이 가능하며, 적절한 태그를 사용하여 진핵생물에서 단백질의 정제가 더 쉬울 수 있다. 배지로의 단백질 분비를 향상시키는데 특정 플라스미드가 이용될 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 폴리펩타이드를 발현하도록 변형된 세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 적절한 영양 공급원, 공기/산소 및/또는 성장 인자가 제공된 바이오리액터에서 배양 또는 발효를 수행할 수 있다. 세포로부터 배양 배지/발효액을 분리하고, 단백질을 추출하며, 분비된 폴리펩타이드를 분리하기 위해 개별 단백질을 분리함으로써 분비된 단백질을 수집할 수 있다. 배양, 발효 및 분리 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
바이오리액터는 세포가 배양될 수 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 바이오리액터에서의 배양은 반응물의 리액터로의 연속적인 흐름 및 리액터로부터의 배양된 세포의 연속적인 흐름과 함께 연속적으로 일어날 수 있다. 대안으로는, batches에서 배양될 수 있다. 바이오리액터는 배양되는 세포에 최적 조건이 제공되도록 pH, 산소, 유속 및 용기 내에서의 교반과 같은 환경 조건을 모니터링하고 제어한다.
목적하는 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 배양 후, 상기 폴리펩타이드는 분리될 수 있다. 당업계에 공지된 세포 배양물로부터 폴리펩타이드/단백질을 분리하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드/단백질을 배양물로부터 분리하기 위해, 폴리펩타이드/단백질을 포함하는 배지로부터 배양된 세포를 먼저 분리할 필요가 있다. 상기 폴리펩타이드/단백질이 세포로부터 분비되면, 세포는 원심분리에 의해 분비된 폴리펩타이드/단백질을 포함하는 배양 배지로부터 분리 될 수 있다. 상기 폴리펩타이드/단백질이 세포 내에서 수집되면, 원심분리 전에 sonification, 급속 동결-해동 또는 삼투성 용해를 이용하여 세포를 파쇄할 필요가 있다. 원심분리로 배양된 세포 또는 배양된 세포의 세포 파편을 포함하는 펠렛과 배양 배지 및 목적하는 폴리펩타이드/단백질을 포함하는 상층액이 생성된다.
그 다음, 다른 단백질 및 비단백질 성분을 포함할 수 있는 상층액 또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드/단백질을 분리하는 것이 바람직하다. 상층액 또는 배양 배지에서 폴리펩타이드/단백질 성분을 분리하는 일반적인 방식은 침전에 의한 것이다. 상이한 용해도를 갖는 폴리펩타이드/단백질은 황산 암모늄과 같은 침전제의 상이한 농도에 침전된다. 예를 들면, 침전제의 농도가 낮으면 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 침전제의 농도를 증가시키면서 첨가함으로써, 상이한 용해도의 단백질을 구별할 수 있다. 그 후, 분리된 단백질에서 황산 암모늄을 제거하기 위해 투석을 사용할 수 있다.
상이한 폴리펩타이드/단백질을 구별하기 위한 다른 방법으로는, 예를 들어 이온교환 크로마토그래피 및 사이즈 크로마토그래피가 당업계에 공지되어 있다. 이들은 침전의 대안으로 사용되거나, 침전에 이어 수행될 수 있다.
일단 목적하는 폴리펩타이드/단백질이 배양물로부터 분리되면, 단백질을 농축하는 것이 필요할 수 있다. 한외여과(ultrafiltration) 또는 동결건조(lyophilisation)와 같은 목적 단백질을 농축하는 방법이 당업계에 다수 공지되어 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약물 및 약학 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 경막 내, 구강 및 비강을 포함하는 다수의 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 약물 및 조성물은 주사제로 제형화될 수 있다.
바람직하게는 "치료적으로 유효한 양”으로 투여되며, 이는 개인에게 유효성을 나타내는데 충분한 것을 의미한다. 실제 투여량, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 질병의 본질 및 심각한 정도에 따라 다를 수 있다. 치료를 위한 처방, 예를 들어, 복용량 결정 등은 일반 의사 및 기타 의사의 책임하에 있으며, 일반적으로 치료할 장애, 개별 환자의 상태, 투여 경로, 투여 방법 및 의사에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 상기 기재된 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 찾을 수 있다.
서열 동정
아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, ClustalW 1.82. T-coffee or Megalign (DNASTAR) software와 같은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 소프트웨어를 사용할 때, 예를 들면 갭 페널티 및 익스텐션 페널티를 위해 바람직하게는 기본 매개변수가 사용된다. ClustalW 1.82의 기본 매개변수는 다음과 같다: Protein Gap Open Penalty = 10.0, Protein Gap Extension Penalty = 0.2, Protein matrix = Gonnet, Protein/DNA ENDGAP = -1, Protein/DNA GAPDIST = 4.
본 발명은 그러한 조합이 명확하게 허용되지 않거나 명시적으로 회피되는 경우를 제외하고, 설명된 양태 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 부분 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 양태 및 실시예들은 첨부된 도면을 참조하여 예로서 설명된다. 그 이상의 앙태 및 실시예들은 당업자에게 자명할 것이다. 언급된 모든 문서는 참조로 포함된다.
후술하는 청구항을 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 완전체, 완전체의 단계 또는 그룹을 포함하지만, 어떠한 다른 완전체, 완전체의 단계 또는 그룹을 배제하지 않는다는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 범위는 "약" 하나의 특정 값에서 및/또는 "약" 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 그러한 범위로 표현될 때, 다른 실시예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 이와 유사하게, 값이 근사값으로 표현될 때, 선행하는 "약"의 사용에 의해, 특정 값은 다른 실시예를 형성한다.
대조군
일 예에서, 이 방법은 개체의 샘플에서 암 단백질의 세포 위치를 하나 이상의 대조군 샘플과 비교하는 것을 포함한다.
상기 비교는 대조군 샘플의 분석이 개체의 시료 분석과 동시에 또는 순차적으로 수행될 것을 요구하지 않을 수 있다. 대신 데이터베이스에 저장된 결과와 같이 대조군 샘플에서 이전에 얻은 결과로 비교를 수행할 수 있다.
대조군 샘플은 암 발병 전에, 또는 암과 관련된 증상의 관찰 이전에, 또는 항암 치료제의 투여 전에 개체로부터 수득된 샘플일 수 있다.
대조군 샘플은 암이 없는 사람과 같은 다른 개체로부터 얻은 샘플일 수 있다. 개체는 성별, 나이, 병력, 민족성, 체중 또는 특정 마커의 발현과 같은 하나 이상의 특성에 따라 개체와 매치될 수 있다. 대조군 샘플은 신체 위치로부터 얻어질 수 있거나, 또는 개체로부터 수득된 샘플과 동일한 조직 또는 샘플 유형일 수 있다.
대조군 샘플은 다수의 상이한 개체 또는 조직의 대표값을 제공하는 샘플 모음일 수 있다.
일부 경우에, 대조군은 기준 샘플 또는 기준 데이터 세트일 수 있다. 상기 기준은 특정 치료를 위한 공지된 정도의 적합성을 가진 피험자로부터 이전에 수득 된 샘플일 수 있다. 기준은 기준 샘플을 분석하여 얻은 데이터 세트일 수 있다.
대조군은 표적 분자가 존재하거나 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려진 양성 대조군일 수 있으며, 또는 표적 분자가 결핍되거나 낮은 수준으로 발현되는 것으로 알려진 음성 대조군일 수 있다.
대조군은 치료 효과가 있는 것으로 알려진 피험자의 조직 샘플일 수 있다. 조직은 검사할 샘플과 동일한 유형일 수 있다. 예를 들어, 피험자로부터의 종양 조직 샘플은 이전에 치료에 반응한 피험자와 같이, 치료에 적합한 것으로 알려진 피험자로부터의 종양 조직의 대조군 샘플과 비교될 수 있다.
일부 경우에, 대조군은 시험 샘플과 동일한 개체로부터 수득된 샘플일 수 있지만, 피험자가 암이 없는 것으로 알려진 시간과 같이 건강하다고 알려진 시간부터이다. 따라서, 피험자로부터의 암 조직 샘플은 암이 아닌 조직 샘플과 비교될 수 있다.
일 예에서, 대조군은 세포 배양 샘플이다.
[ 실시예 ]
실시예 1: PRL3 - zumab의 생성
PRL3-zumab 구조(construct)는 이전에 특성화된 murine 항-PRL-3 항체 클론으로부터 조작(engineered)되었다. Queen 등에 의해 설명된 방법의 독점적인 수정을 사용하여 인간화(humanise) 또는 클론(clone)하는 것을 미국에서 두 개의 독립적인 임상시험수탁기관(CRO)과 협약하였다(60).
간략하게, 마우스 항체의 중쇄(IgG1) 및 경(카파)쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)은 CDR을 제외한 가변 영역의 단편으로 정의되는 프레임워크인 "수용체(acceptor)" 인간 서열 프레임 워크로 접목되었다. 인간 수용체 프레임 워크의 선택은 각 프레임 (일반적으로 65-70% 서열 동일성)에 가장 가까운 인간 상동체(homology)를 찾기 위해 인간 프레임 워크 서열의 데이터베이스와 마우스 프레임 워크 서열을 정렬함으로써 이루어졌다.
마우스 서열로부터의 CDR을 이식하는 것 이외에, 마우스 서열 (CDR 이외에)로부터의 약 3개의 아미노산 위치가 또한 인간 수용체 서열에 이식되었다. 이것은 마우스 및 인간 PRL-3 사이에서 보존된 C 말단 영역 내의 에피토프를 특이적으로 인식하지만, PRL-1 또는 PRL-2는 인식하지 않는 원래의 murine 항-PRL-3 항체의 CDR을 보존하였다.
본 발명자들은 PRL-3 항원에 대한 PRL3-zumab의 친화성 결합을 시험하기 위하여 Sapidyne Instruments Inc. (700 W Diamond St Boise, Idaho 83705)에 의뢰하였다. 역학배제분석(kinetic exclusion assay: KinExA) (Drake et al., 2004)을 이용한 결합 친화력 분석은 정제된 PRL3-zumab을 정제된 인간 PRL-3에 6.29pM의 Kd, 온 레이트 (Kon) 및 오프 레이트 (Koff)는 각각 약 1 x 107 M-1s-1 및 7 x 10-5 s-1를 갖는 단단한 결합제로 특정하였다 (표 1).
Figure 112019004194439-pct00004
실시예 2: 위암 치료를 위한 PRL - zumab의 사용
재료 및 방법
조직 및 세포 용해물의 제조
다수의 정상 마우스 기관은 FVB/야생형 마우스로부터 수확하고, 유방암과 전이성 폐 종양은 이식된 유방 특이적 폴리오마 바이러스 중간 T 암유전자의 과발현에 의해 유도된 전이성 유방암의 확립된 자연발생 모델인 동종의 FVB/MMTV-PyMT 마우스 균주에서 절개하였다(28). 조직의 경우, 절개된 샘플 (5 ㎣)을 프로테아제-포스파타제 억제제(protease-phosphatase inhibitor cocktail) (Pierce)가 포함된 RIPA 용해 완충액(lysis buffer) (Sigma)에 현탁하고 조직분쇄기(tissue homogenizer) (Polytron)로 완전히 파쇄 하였다. 용해물을 13,000 × g, 4 ℃에서 40 분간 원심 분리하여 정화(clarified)시켰다. 세포주의 경우는, 5 × 106 세포를 프로테아제-포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 용해 완충액에서 용해시키고 상기 설명한 바와 같이 정제하였다. 단백질 농도는 bicinchoninic assay kit (Pierce)를 사용하여 측정하였다. 2 × Lamelli 완충액을 첨가한 후, 샘플을 끓여서 곧바로 웨스턴 블로팅에 사용하거나 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다.
웨스턴 블로팅
200μg의 용해물을 12 % SDS-폴리아크릴아미드 겔의 분리된 웰에서 분리하고 블로킹 전에 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 1 : 1,000 비율로 희석한 지시된 일차 항체로 4 ℃에서 하룻밤 동안 프로빙 하였다. TBS-T 완충액 (20 mM Tris pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.2 % Tween-20)으로 철저히 세척한 후, 멤브레인을 1 : 5,000 비율로 희석한 HRP 결합 2차 항체로 1시간 동안 각각 인큐베이션하고, TBS-T로 세척하여, 화학 발광 기질 (Pierce)을 사용하여 가시화하였다.
세포배양
연구 대상 22 개의 인간 GC 세포주는 다음의 출처들로부터 얻은 것이다: MKN7, MKN74, NUGC-3, OCUM-1 (건강 과학 연구 자원 은행(Health Science Research Resources Bank)); YCC-1, YCC-3, YCC-7, YCC-17 세포 (연세 암 센터(Yonsei Cancer Centre)); AGS, CRL-5822, KATO-III, SNU-1, SNU-5 (American Type Culture Collection, ATCC); HGC27, NUGC-4, OE19 (Sigma-Aldrich); MKN28, MKN45 (리켄 바이오 자원 센터(RIKEN BioResource Center)); IM-95, SCH (일본 연구 생물 자원 은행 세포 은행(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)); SNU-484, SNU-719 (한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)). CHO 세포는 ATCC로부터 구입하였다. GFP-표지된 PRL-1, PRL-2 또는 PRL-3 융합 단백질을 안정하게 발현하는 CHO 세포의 생성은 이전에 기술되어 있다(23). 루시퍼라아제(luciferase)를 발현하는 HCT116- luc2 인간 선암 세포 (Caliper Life Sciences)는 인간 유비퀴틴 C 프로모터 (pGL4 luc2)의 조절 하에 루시퍼라아제 2 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 부모 HCT116 세포 (ATCC)로 안전하게 형질도입함으로써 확립되었다. 세포주를 10 % 열-불활성화한 태아소혈청 (Hyclone) 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신 (Life Technologies)이 첨가된 RMPI-1640 배지 (Gibco)에서 배양하고 5 % CO2가 공급되는 37 ℃ 배양기에서 유지시켰다.
PRL-3 mRNA 발현 분석
본 발명자들은 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Genechip 어레이에서 프로파일링 된 200개의 원발성 위암 표본으로 구성된 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 공개적으로 사용 가능한 GC 마이크로 어레이 데이터 세트 (GSE15459)를 분석하였다. 데이터 사전 처리는 ‘affyPLM'R 패키지 (v2.15)를 사용하여 수행하였다. 특이치(Outliers)를 제외하고 총 185 종의 종양 샘플을 다운스트림 분석에 사용할 수 있었다 (SGset1, 환자 특성은 도 17에 제공됨). 결과 메트릭스로서 전체 생존율을 갖는 생존 분석을 수행하여 각각의 유전자의 “저”,“중” 및 “고”발현을 갖는 종양 (n=183 개; 2개의 샘플은 생존 데이터가 결여됨), 즉 “저”및“고”발현 군은 33.3 백분위 수 발현 수준보다 낮고 66.7 백분위 수 발현 수준보다 높은 샘플에 해당하는 반면 중간 백분위 수 발현 수준은“중”으로 분류하였다.
재조합 GST-태그된 단백질의 제조
재조합 GST-PRL-1, GST-PRL-2 및 GST-PRL-3 융합 단백질의 제조는 이전에 기술되어 있다(53).
효소면역분석법(ELISA)
효소면역분석(ELISA)은 이전에 기술 된 바와 같이 수행하였다(53). 간단히, GST-PRL-1 (20 ng), GST-PRL-2 (20 ng) 또는 GST-PRL-3 (1 ng, 20 ng)으로 밤새 코팅한 96-웰 플레이트를 3 % 소 혈청 알부민 PBS-0.05 % Tween-20이 함유된 PBS에 3 % 소 혈청 알부민을 첨가하여 블로킹하고, 200 ng PRL3-zumab으로 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 광범위한 세척 후, HRP-접합 항-마우스 항체 (Pierce)를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. Turbo-TMB 기질 (Pierce)을 사용하여 비색계 발색을 수행하고 2M H2SO4로 산성화함으로써 중지시켰다. 흡광도는 플레이트 판독기 (Dynatech)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
동물 모델들 및 처리(treatments)
본 연구에서의 모든 동물 모델들은 생물 자원 센터 (A*STAR, Singapore)에서 얻은 8 주령 수컷 Balb/C 누드 마우스를 사용하였다. 2.5 % 아베르틴 (avertin, 100 ㎕/10 g 체중)을 동소 위암(Orthotopic gastric cancer) 모델에 복강 주사(i.p.)하여 마우스들을 마취하였다: 마취 된 쥐의 복부는 흉골 검상돌기 아래 0.5 cm에서 시작하여 1 cm 중간선 절개에 의해 층들이 열렸다. 수술용 겸자로 복부 절개를 통해 위를 꺼내고, 암세포를 장막하 층(subserosa layer)으로 주입한 후, 위를 제자리에 돌려놓고 복부를 층으로 다시 봉합하였다. 각 세포주에 대한 동소 위 종양(Orthotopic gastric tumor)을 유도하기 위해 필요한 세포수 및 실험 기간은 예비 실험 후에 확인하였다: SNU-484 종양의 경우 3 × 106 세포 또는 IM-95, NUGC-4 및 MKN-45 종양의 경우 5 × 106 세포가 필요함. 암세포를 장막하 층(subserosa layer)으로 주입한 후 2 일째에 치료 요법(treatment regime)을 시작하였다. 마우스들은 주당 두 번 100㎕ PBS에 100 ㎍의 PRL3-zumab (Wuxi Pharmatech)를 섞어 정맥 주사(i.v.)하여 총 8 회 (SNU-484 및 NUGC-4 종양) 또는 총 10 회 (IM-95 및 MKN45 종양) 수행하였다. PBS를 대조군인 “처리하지 않은” 마우스에 사용하였다. 개별 종양의 성장 속도가 다르기 때문에 실험 기간은 SNU-484 및 NUGC-4 종양의 경우 4 주, MKN-45 종양의 경우 8 주, IM-95 종양의 경우 12 주가 걸렸다. 종양 체적은 다음 공식을 사용하여 계산하였다 : 부피 = 0.4 × 종양 길이 × 종양 폭 × 종양 폭. 이종이식 종양 모델 : 150 ㎕의 PBS에 희석된 3 × 106 SNU-484 세포를 마취 된 쥐의 양 옆구리에 주사하였다. 3 주 후, 상기의 결과로 생긴 종양 (5 내지 10 mm)을 마취 하에서 외과적으로 제거하고 종양 제거 후에 PRL3-zumab (PBS 100 ㎕, i.v.) 또는 PBS (100 ㎕)를 주당 2회씩 정맥 투여 받도록 마우스를 2 군으로 나누었다. 종양 재발은 치료 후 7 주까지 처리하지 않은 군과 PRL3-zumab을 처리한 군 모두에서 매주 분석되었다. 종양 성장은 두 군 모두에서 주의하여 관찰되었다. 이차 위암 전이 모델 : 앞서 기술하였듯이, 3 × 106 HCT116-luc2 세포를 마취 된 마우스의 위 장막에 직접 이식하였다. 마우스를 처리한 (PRL3-zumab, 100 ㎕ PBS 100 ㎍) 또는 처리하지 않은 (100 ㎕ PBS) 군으로 나누고, 이식 후 1, 2 및 3 주에 150 mg/kg 루시페린(luciferin, Caliper Life Sciences)을 복강 내 주사하고 15분 후, 2 % 이소플루오란 마취 하에서 생체 내 종양 성장을 IVIS 이미징으로 관찰하였다.
마우스 혈액 샘플의 분석
마우스 혈액 도말의 WBC 염색 : 유리 슬라이드에 신선한 마우스 혈액 한 방울을 얇은 층으로 도포하여 37 ℃에서 1 시간 동안 구운 후, modified Wright Giemsa stain (Sigma)로 흥건하게 염색한 다음, 탈이온수로 3 분 동안 세척하였다. 건조시킨 후, WBCs stained blue를 사용하여 염색된 슬라이드를 현미경으로 관찰하였다. 총 WBC의 추정은 광학 현미경 (Olympus) 하에서 각 슬라이드의 10 개 시야(visual field) 부분에 있는 세포를 세고, 방정식 ‘WBCs/㎕ = (총 WBC 수 / 필드 수) × 2000’을 사용하여 계산함으로써 수행하였다. 전혈 수 : 마우스 샘플의 혈액학적 분석은 Quest Laboratories (Singapore)에서 수행하였다.
항체
HSP70 (cat# EXOAB-Hsp70A) 항체는 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences, Inc.)에서 구입하였다. 칼넥신 (Calnexin) (cat# 2679) 항체는 셀 시그널링 (Cell Signaling)에서 구입하였다. CD63 (cat # sc-15363) 항체는 산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnoloy)로부터 구입하였다. GAPDH (클론 MAB374) 항체는 밀리포어(Millipore)로부터 구입하였다. B 세포 마커 (CD45 / CD220, 클론 RA3-6B2) 및 NK 세포 마커 (CD335 / Nkp46, 클론 29A1.4)는 비디 파밍젠(BD Pharmingen)에서 구입하였다.
면역형광 이미징
세포 슬라이드의 준비 : 세포를 유리 덮개(coverslips)에 직접 시딩(seeding)하고 48 시간 동안 성장시켰다. PBSCM (PBS pH 7.0, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2)로 2 회 세척 한 후, 세포를 실온 (RT)에서 20 분 동안 3 % 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 세척하고 PBS-0.1 % 사포닌 (시그마, Sigma)으로 15분 동안 투과화 하였다. 조직 절편 슬라이드의 준비 : SNU-484 및 MKN45 동소 위 종양(orthotopic gastric tumors)의 신선한 동결 표본을 -18 ℃에서 저온 유지 장치 (cryostat, Leica)를 사용하여 10 ㎛ 슬라이스로 절단하였다. 슬라이드를 4 % 파라포름알데히드로 20 분간 고정하고, PBS-0.05 % Tween-20으로 세척한 후 PBS-FDB (PBS pH 7.0, 2 % BSA, 5 % 염소 혈청, 5 % 소 태아 혈청)로 실온(RT)에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 이어서, 슬라이드를 1 : 200 희석하여 표시된 1 차 항체와 함께 4 시간 동안 처리하고, 세척하고, 대응하는 형광 색-결합 된 2 차 항체 (Life Technologies)로 2 시간 동안 처리하였다. 세척 된 슬라이드는 DAPI-함유 항-퇴색 마운팅 시약(anti-fade mounting reagent) (Vector Laboratories)으로 고정한 후, 매니큐어로 밀봉하였다. 공초점 이미징은 LSM 510 공초점 현미경 (Zeiss AG)으로 수행하였다.
PRL3-zumab 면역조직화학염색
10 ㎛ 두께의 동결절단(cryosection) 슬라이드를 4 % 포르말린으로 20 분간 고정하고 어두운 곳에서 1 % H2O2-PBS와 함께 5 분간 배양하였다. 세척 된 슬라이드를 10 % 염소 혈청 및 1 % BSA (Sigma)를 함유하는 PBS로 RT에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS-0.05 % Tween-20에서 4 회 부드럽게 흔들면서 세척하고, 염소 항-인간 표지 된 중합체-HRP (Dako)로 2 시간 동안 배양 한 후 광범위하게 세척하고 어두운 곳에서 기질-발색체 용액(substrate-chromogen solution) (Dako)으로 20분 동안 처리하였다. 마운트로 고정된 슬라이드를 명시야 현미경 (Olympus)을 사용하여 검사하고 대표 이미지를 촬영하였다.
통계분석
인간 연구의 경우, 로그순위 검정(logrank test)을 사용하여 PRL-3 mRNA 발현 군을 기반으로 전체 GC 환자의 생존율에 대한 Kaplan-Meier 분석의 중요성을 평가하였다. 단변량분석과 다변량분석은 Cox 비례위험 회귀(Cox proportional hazards regression)를 사용하여 수행하였다. 마우스 연구의 경우, 로그순위 검정(logrank test)을 사용하여 ‘처리하지 않은’ 마우스 군과 ‘처리한’ 마우스 군 간의 전체 생존에 대한 Kaplan-Meier 분석의 유의미한 차이를 평가하였다. 동소 종양(orthotopic tumor) 체적에서의 통계적 유의 차를 계산하기 위해 Student 's t-test를 사용하였다. 통계 계산을 위해서는 SPSS 소프트웨어 v19.0 (IBM)을 사용하였다. 모든 경우에서, p 값 <0.05는 유의한 것으로 간주하였다.
결과
PRL-3는 종양-특이적 표적이다
항암 표적 치료의 개발에서의 적절한 도전은 종양에서만 발현되고, 정상 조직에서는 발현되지 않아, 바람직하지 않은 비-표적(off-target) 효과를 피할 수 있는 ‘종양 특이적 항원’의 동정이다. 우리는 내인성 PRL-3에 대한 웨스턴 블라팅으로 모든 주요 기관의 정상적인 쥐 조직을 처음으로 선별하였다. 이들 전체 블랏들에서, PRL-3의 예상 분자량에 해당하는 약 ~ 20 kDa 내생 단백질이 검출되었다 (도 1A). PRL-3 항체가 다른 분자와 교차 반응하지 않는다는 것을 확인하는 비특이적 밴드는 관찰되지 않았다(27). PRL-3 단백질이 정상 대장에서 약하게 검출되었으나 (도 1A, 2열), 유방 및 폐 조직 (도 1A, 14열-15열)을 포함하여 검사한 14 개의 다른 주요 정상 쥐 조직에서는 검출되지 않았다 (도 1A, 1열, 3열 내지 15열). 대조적으로, MMTV-PyMT 마우스에서 자발적으로 발달된 유방 및 폐 종양 (도 1A, 16열-17열)에서는 PRL-3가 풍부하게 발현되었다(28). 중요하게, PRL-3 단백질은 면역조직화학검사로 검사한 15 개의 주요 정상적인 인간 장기에서도 검출되지 않았다 (도 S1A). 또한, 환자와 일치하는 조직 샘플에서, PRL-3는 비암성(noncancerous) 위 조직에서는 검출되지 않았으나 (도 11B, 패널 a), 위암 부분에서는 높게 발현되어 (도 11B, 패널 b), 종양 특이적 상향 조절을 다시 한번 보여주었다. 암에서의 PRL-3 과발현의 빈도에 관해 발표된 문헌(29)과 PRL-3 조건부 녹아웃 마우스가 극도로 정상적이라는 최근 관찰(30)을 종합해 보면, 정상 조직이 아닌, 암이 있는 조직에서의 PRL-3의 특이적 발현은 적절한 종양-특이적 표적으로서 PRL-3의 유효성을 입증한다.
PRL-3 종양 단백질은 조사된 위 종양의 85%에서 과발현 된다
지난 10년 동안, 많은 연구들은 증가된 PRL-3 발현이 위암의 부정적인 예후인자임을 밝혀냈다(14, 31, 32). 본 발명자들은 185 명의 GC 환자의 독립적인 코호트에서 상승된 PRL-3 mRNA 수준에 대한 임상적 중요성을 추가적으로 연구하였다(임상 특성은 도 17에 주어짐). Kaplan-Meier 생존 분석 결과들은 종양에서의 상승된 PRL-3 mRNA 수준이 전체 생존 기간이 더 짧은 것과 관련이 있다는 것을 보여 주었다 (p = 0.002, 도 1B). 다변량 콕스 분석에서, 높은 PRL-3 mRNA 발현도 높은 종양 등급과 유의한 관련이 있었다 (도 18). 다음으로, 본 발명자들은 싱가포르 국립 대학교 병원에 입원한 GC 환자의 20 개의 일치되는 신선하게 얼린 생검 조직 샘플 쌍들(종양 대 인접한 정상 조직)을 사용하여 PRL-3 단백질의 수준을 조사하였다. 웨스턴 블라팅 결과, 과발현된 내인성 PRL-3는 위 종양 샘플 (T; 도 1C) 20개 가운데 17개(85 %)에서 명백하게 관찰되었으나, 일치하는 정상 위 조직 샘플 (n; 도 1C)에서는 관찰되지 않아, PRL-3의 종양-특이적 발현을 입증하였다. 특히, PRL-3 단백질은 이들 블롯에서 20 내지 25 kDa 사이의 넓은 밴드로 나타나, 아직 정의되지 않은 인간 종양 샘플에서 PRL-3 (~ 20 kDa)의 잠재적인 번역 후 변형을 시사한다. 종합적으로, 본 발명자들의 임상 데이터는 질병의 발병과 관련이 있는 인간 GC의 일반적인 현상으로, PRL-3 종양 단백질 과발현을 특징짓고, 표적 치료의 후보로서의 적합성을 재확인하였다.
새로운 PRL-3 표적 인간화 항체인 PRL3-zumab의 제조(생성)
본 발명자들은 이전에 누드 및 야생형 C57BL/6 마우스 모두에서 세포 내 PRL-3을 발현하는 종양에 대한 마우스 및 키메라 PRL-3 항체의 높은 효능을 입증하였다(24, 27). 이들 연구에서, PRL-3 단클론 항체를 투여받은 마우스는 계속적으로 체중이 늘었고 정상적인 활동을 보였으며, 이는 최소한의 비-표적 효과(off-target effect) 부작용을 시사하는 것이다. 이러한 초기 발견을 인간의 임상에 적용하기 위하여 본 발명자들은 ‘PRL3-zumab’ 인간화 단일 클론 항-PRL-3 항체를 생성하였다. 이전의 항체와 같이, 조작 된 PRL-3-zumab은 PRL-3를 특이적으로 인식하였고, 웨스턴 블라팅, ELISA 및 면역형광분석에서 PRL-3와 상동인 PRL-1 또는 PRL-2와 교차 반응하지 않았다 (도 12A-C). 이 후, 본 발명자들은 본 명세서에 기술한 모든 추가적인 실험들을 위하여 PRL3-zumab을 사용하였다.
PRL3 - zumab은 PRL -3-음성 ( PRL -3-) 동소 위 종양에서와 달리, 특이하게PRL -3-양성 (PRL-3 +) 동소 위 종양의 성장을 방해한다
마우스 종양 모델에서 자연적인(정상적인) 위치에서 성장하는 인간 암세포는 높은 충실도를 가지고 인간 질병을 복제한다. 더 중요한 것은 치료법에 대한 종양 반응들이 암세포가 피하의 위치에 이식된 것인지, 정상적인(orthotopic) 위치에 이식된 것인지 여부에 따라 극적으로 변화하는 것으로 나타났으며, 이것은 항암제의 치료 효능을 평가하기 위한 올바른 모델을 선택해야한다는 요구 사항을 강조하는 것이다. 위 종양에 대한 PRL3-zumab의 유효성을 검사하기 위한 관련 전임상 동소(orthotopic) 마우스 모델을 확립하기 위하여, 본 발명자들은 PRL-3 단백질 발현 상태에 대한 22 개의 인간 GC 세포주 패널을 먼저 스크리닝 한 후, 마우스 위의 장막하 층(subserosa layer) 내에서 세포주들의 종양 형성 능력을 시험하였다. PRL-3 단백질은 분석한 22 개의 인간 GC 세포주 중 13 개 (59 %)에서 검출되었다 (도 2A). 그러나, GC 세포주의 일부분만이 배양에서 잘 자랐으며, 관리 가능한 시간(<2 개월) 내에 동소(orthotopic) 종양을 형성하였다. 이 기준에 근거하여, PRL3-zumab의 항-종양 효능을 평가하기 위한 동소(orthotopic) GC 모델을 개발하기 위하여 3 개의 PRL-3 양성(+) 세포주 (SNU-484, NUGC-4 및 IM-95)와 하나의 PRL-3 음성(-) 세포주 (MKN45)를 선별하였다. 이들 세포주로부터의 세포들을 위의 장막하 층(subserosa layer)에 접종하고, 이어서 도 2B의 프로토콜 개요에 따라 처리하였다. 실험이 끝나는 시점에, 마우스로부터 위를 수확하고 위 종양 무게를 분석하였다.
본 발명자들은 먼저 PRL-3 단백질의 높은 발현, 배양 시 빠른 성장, 및 3-4주 이내에 재현성 있는 위 종양 형성으로 인해 우수한 PRL-3 양성(+) 동소(orthotopic) 위 종양 모델로 사용되는 SNU-484 GC 세포주에서 PRL3-zumab의 치료 효과를 연구하였다 (도 2A, 1열), 실험 과정 동안, PRL3-zumab를 처리하지 않은 마우스는 뚜렷한 복부 팽만을 나타냈고 (도 2C, 패널 a, 화살표), 신체 활동 및 음식 섭취가 감소되는 것이 관찰된 반면, PRL3-zumab를 처리한 마우스는 극도로 정상적이며, 규칙적인 음식 섭취 패턴으로 정상적인 신체 활동을 유지하는 것으로 관찰되었다 (도 2C, 패널 b). 해부학적으로, 동소(orthotopic) 종양 형성은 PRL3-zumab를 처리한 군에서 PRL3-zumab를 처리하지 않은 군과 비교하여 현저하게 감소하였다 (도 2C, 패널 c-d).
종양 체적의 측정은 PRL3-zumab를 처리한 군 (0.23 ± 0.25 ㎤)에서 PRL3-zumab를 처리하지 않은 군(4.08 ± 1.52 ㎤, p = 0.01; 도 2D)과 비교하여 종양의 양이 20배 감소한 것으로 나타났다. 감소 된 종양의 양과 일치하여, Kaplan-Meier 생존 분석은 PRL3-zumab를 처리한 마우스의 생존 기간 중앙값이 7 주로 4.5 주인 PRL3-zumab를 처리하지 않은 마우스와 비교하여 유의하게 더 긴 생존 시간을 나타내었다 (p = 0.006; 도 2E). 이 결과는 PRL-3 양성(+) SNU-484 위 종양을 가진 마우스가 PRL3-zumab 항암 치료에 효과적으로 반응한다는 것을 확인한 것이다. 이 발견을 입증하기 위하여, 2 개의 PRL-3 양성(+) GC 세포주, IM-95와 NUGC-4를 추가로 사용하여 동소(orthotopic) GC 마우스 모델을 만들었다 (도 2A, 각각 2열과 22열). SNU-484 동소(orthotropic) 종양과 유사하게, PRL3-zumab 처리는 PRL-3 양성(+) IM-95 세포 (p = 0.008; 도 S13A) 또는 PRL-3 양성(+) NUGC-4 세포 (p = 0.03, 도 S13B)에 의해 형성된 위 종양의 성장을 유의하게 억제하였다.
극명하게 대조적으로, PRL-3 음성(-) GC 세포주인, MKN45 (도 2A, 4열)에 의해 형성된 위 종양은 PRL3-zumab 처리에 반응을 나타내지 않았으며, PRL3-zumab를 처리한 군과 처리하지 않은 군의 마우스에서 뚜렷한 복부 팽만 (도 3A, 패널 a-b) 및 동소(orthotopic) 종양 형성 (도 3A, 패널 c-d)이 존재하였다. PRL3-zumab를 처리한 군(0.17 ± 0.20 ㎤)과 처리하지 않은 군(0.13 ± 0.19 ㎤) 간의 동소(orthotopic) 종양 부피 평균값 차이가 나타나지 않았다 (p = 0.4; 도 3B). Kaplan-Meier 생존 분석 결과, PRL3-zumab를 처리하지 않은 군의 생존 중앙값이 9.25 주이고, PRL3-zumab를 처리한 군의 생존 중앙값이 10 주로 나타난 바 (p = 0.3, 도 3C), PRL3-zumab를 처리한 군과 처리하지 않은 군 사이의 전체 생존 기간에서 뚜렷한 차이가 없었다. 이들 4 종류의 세포주 (도 3D에 요약 됨)에서 유래 된 동소(orthotopic) 종양에 대한 PRL3-zumab 처리 결과는 본 발명자들이 PRL3-항체 치료에 관하여 오직 PRL-3 양성(+) 종양이 PRL3-zumab에 반응하며, 반면에 PRL-3 종양단백질(oncoprotein) 발현이 없는 종양은 PRL3-zumab에 반응하지 않는다는 이전에 제안한 기본 원리(24)를 강화시킨다.
PRL3 - zumab 단독 요법이 PRL3 - zumab 및 5- 플루오로우라실 ( 5FU ) 의 병용 요법 또는 5-FU 단독 요법보다 더 효과적이다
5-FU는 위암의 1 차 치료제로 사용되는 화학 요법 약물이므로 (17), 본 발명자들은 PRL3-zumab의 동소(orthotopic) 종양의 성장 억제 효과가 5-FU와의 병용 요법으로 개선되는지 여부를 확인하였다. 본 발명자들은 PBS 대조군 (1 군), PRL3-zumab 단독 요법 군 (2 군), PRL3-zumab + 5-FU 병용 요법 군 (3 군), 또는 5-FU 단일 요법 군 (4 군)의 4 가지 처리 프로토콜을 시험 하였다. 처리 프로토콜에 따라 동소(orthotopic) PRL-3 양성(+) SNU-484 위 종양을 가진 누드 마우스 군으로 PRL3-zumab (100 μg / dose) 또는 5-FU (30 mg / kg / dose)의 격주 투여량을 개별적으로 또는 병용 투여하였다. 실험 과정에서, 본 발명자들은 5-FU 처리 마우스 (3군과 4군)에서 전체 동물 활성이 감소하는 것을 관찰하였다. 종양의 부피를 분석 한 결과, PRL3-zumab 단일 요법 (2 군)이 0.67 ± 0.59 ㎤의 가장 낮은 평균 종양 부피 값으로 가장 높은 치료 효과를 나타내었고, 다음으로 PRL3-zumab + 5-FU 병용 요법 (3 군; 1.49 ± 0.27 ㎤), 5-FU 단일 요법 (4 군; 1.76 ± 0.52 ㎤), 마지막으로 PBS 대조군 (1 군; 3.98 ± 0.60 ㎤; 도 4A) 순서로 치료 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 화학 요법제 5-FU 없이 PRL3-zumab가 사용되었을 때 위 종양을 감소시키는데 보다 효과적임을 시사한다.
이전에 본 발명자들은 PRL-3 항체 요법에서 숙주 면역계의 중요한 역할을 강조한 바 있다 (24). 본 발명자들은 백혈구(WBC) 수의 비특이적 감소를 유발하는 5-FU 치료의 부작용에 비추어서, 관찰된 치료 효능의 감소가 이 현상에 의한 것인지 여부를 조사하였다. 전체 혈액 도말 검사에서 대조군 (1 군) 또는 PRL3-zumab 단독 요법 (2 군; 도 4B)과 비교하여 5-FU 치료 (3 군 및 4 군) 후 말초혈액의 WBC 수가 5 배 감소한 것을 확인하였다. 이 결과를 검증하기 위하여, 본 발명자들은 실험 종료 시점 (28 일)에 마우스 샘플의 전체 혈액 검사를 수행하여 다른 치료 요법의 혈액학적 효과를 분석하였다. PRL3-zumab을 투여한 마우스에서는 BALB/c 누드 주의 정상 범위 내에서 일반적인 혈액학적 특성이 관찰되었으나 (35), 5-FU를 PRL3- zumab과 병용 투여 또는 5-FU를 단독 투여한 마우스들에서는 감소된 호중구, 림프구, 및 단핵구 수와 함께 적혈구 및 혈소판 수의 현저한 감소가 관찰되었다 (도 4C). 종합하면, 5-FU 치료의 결과로 나타난 면역 기능의 감소는 5-FU와 병용 투여된 PRL3-zumab의 효능 감소를 설명할 수 있으며, PRL-3 항체 요법은 강한 면역 체계를 필요로 한다는 본 발명자들의 이전의 주장을 뒷받침하는 것이다.
수술 후 PRL3-zumab 치료는 PRL-3 양성(+) 종양의 재발을 억제한다
수술은 GC 치료의 초석이나, 거의 80 %의 환자가 국소 재발 및/또는 낮은 정도의 먼 전이(a lower extent, distant metastasis)로 인해 단기간 내에 사망한다(36). PRL3-zumab이 생체 내에서 PRL-3 양성(+) GC 성장을 억제하는 능력에 비추어, 본 발명자들은 PRL3-zumab의 종양 재발 억제를 위한 수술 후 보조 요법으로의 효능을 확인하였다. 본 발명자들은 우선, PRL-3 양성(+) SNU-484 GC 세포를 사용하여 3주에 걸쳐 누드 마우스의 양쪽 옆구리에 이종 이식 종양 (5-10㎜ 폭 사이)을 확립하였다 (도 19, 패널 a). 그 결과 얻어진 고형 종양들은 신중하게 수술 (도 19, 패널 b)하여 완전히 제거하고, 대조군 항체 (처리하지 않은) 또는 PRL3-zumab (처리한)를 1주에 2회씩 주사하기 위하여 2 군으로 나누었다. 국소 종양 재발은 매주 모니터링 하였다. 수술 후 7 주까지, 처리하지 않은 군의 절제 부위에서는 큰 국소 종양이 생성되었다 (도 19, 패널 c). 이와 반대로, 같은 기간 동안, PRL3-zumab를 처리한 마우스 군의 절제 부위에서는 종양의 성장이 관찰되지 않았다 (도 19, 패널 d). 이것은 해부를 통해 확인하였고, 큰 고형 종양은 처리하지 않은 군에서 채취할 수 있었으나 (도 19, 패널 e), PRL3-zumab를 처리한 군에서는 절제 부위에서 고형 종양이 발견되지 않았다 (도 19, 패널 f). 종합하면, 이러한 결과들은 PRL3-zumab이 수술 후 국소 종양 재발을 억제하는데 효능이 있다는 것을 보여 주는 것이며, 이는 보조 요법으로서의 PRL3-zumab의 임상 적용에 대한 가능한 방안을 제시한 것이다.
PRL3-zumab은 위의 2 차 PRL-3 양성(+) 종양 전이의 성장을 억제한다
위로 전이되는 것은 드문 현상 (37-39)으로 거의 언제나 나쁜 예후와 관련이 있다 (40,41). PRL3-zumab이 전이성 종양 형성을 차단할 수 있는지 알아보기 위하여 본 발명자들은 PRL-3 양성(+) HCT116-luc2 대장암 세포를 마우스의 위의 장막하층에 외과적으로 주입하여 위 전이 대장암 실험 모델을 개발하였다. 본 발명자들은 두 가지 주요 이유로 HCT116-luc2 세포를 사용하였다 : 1) 대장암으로 인한 위암 전이가 인간에서 기술됨 (38, 39, 42), 2) HCT116-Luc2는 반딧불이 루시퍼라제를 지속적으로 발현하여 생체 내 영상 시스템 (IVIS)을 이용하여 종양의 성장을 모니터링 할 수 있음. 2번의 별도의 반복된 실험에서, PRL3-zumab를 처리하지 않은 마우스들에서는 PRL-3 양성(+) HCT116-luc2 종양이 빠르게 자라는 반면, PRL3-zumab를 처리한 마우스들에서는 동일한 기간에 PRL-3 양성(+) HCT116-luc2 종양의 성장이 상당히 감소되었다 (도 14A). 해부에서, 무거운 종양 무게가 PRL3-zumab를 처리하지 않은 마우스들의 위장에서 관찰되었다 (도 14B, 패널 a, a '). 반대로, PRL3-zumab를 처리한 마우스들의 위에서는 훨씬 낮은 종양 무게가 관찰되었다 (도 14B, 패널 b, b '). 또한, PRL3-zumab를 처리하지 않은 생쥐 (도 14B, 패널 c, c ')에서 관찰된 복벽에 대한 광범위한 전이성 파종(metastatic dissemination)이 PRL3-zumab를 처리한 마우스에서는 크게 감소된 것으로 관찰되었다 (도 14B, 패널 d, d'). 종합적으로, 이러한 결과는 PRL3-zumab이 위 오목(gastric niche) 안과 주변의 PRL-3 양성(+) HCT116-luc2 대장암 종양의 성장과 전이를 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
세포 내 PRL -3 종양 단백질은 분비 될 수 있으며 암 소변의 62 %에서 존재하나, 정상 소변에서는 존재하지 않는다
다양한 암 모델들에서 PRL3-zumab의 항종양 효능을 입증한 후, 본 발명자들은 PRL-3 양성(+) zumab 요법를 위한 PRL-3 양성(+) 암 환자를 확인하는 간단한 방법을 동정하였다. 본 발명자들은 이전에 항 PRL-3 항체가 체외에서 PRL-3 양성(+) 종양 세포에 의해 내재화 될 수 있다고 보고하였다 (23). 그러나 "세포 내" PRL-3 항원의 항체 인식이 어떻게 그리고 어디에서 발생했는지는 분명하지 않았다. 여기에서, 본 발명자들은 시험관 내에서, PRL-3 단백질이 PRL-3 음성(-) 암 세포주에서는 검출되지 않으나, PRL-3 양성(+) 암세포주의 농축 배양 배지에서는 분비 및 검출 될 수 있다는 이전에 인식되지 않은 자연 현상을 보고하였다 (도 5A, 1열-4열). 죽은 세포 또는 세포 파편에 의한 비특이적인 오염을 배제하기 위해서, 본 발명자들은 ER-국한화 단백질인 칼넥신(calnexin, CANX)을 대조군으로 사용하였으며, 이는 오직 용출액에서만 검출되었고(도 5A, 5열-8열), 조건부 배지에서는 검출되지 않았다(도 5A, 1열-4열).
마이크로어레이 및 조직학적 연구(7)에 근거하여 PRL-3는 유망한 암 바이오 마커 포텐셜을 가지고 있기 때문에 본 발명자들은 건강한 사람과 암 환자의 소변을 분석하여 “분비된” PRL-3가 바이오마커로서 임상적으로 관련이 있는지를 조사하였다. 건강한 사람의 소변 샘플 15 개와 암 환자의 소변 샘플 199 개를 웨스턴 블랏으로 분석하여 PRL-3 단백질을 검출하였다. 고무적으로, PRL-3는 다른 종류의 암을 가진 환자의 소변 샘플 (도 5B)의 평균 62 % (199 개 중 123 개)에서 쉽게 검출되었으나, 정상 소변 샘플에서는 전혀 발견되지 않았다 (도 5C, 1열-7열). 특히, 위암 환자의 14/16 (88 %)에서 (도 5C, 8열-23열), 비인두 암 환자의 12/17 (70 %)에서 (도 5D), 방광암 환자의 30/67 (45 %)에서 (도 5E), 폐암 환자의 56/85 (66 %)에서 (도 5F), 유방암 환자의 8/10 (80 %)에서(데이터는 표시하지 않음) 및 전립선암 환자의 3/4 (75 %)에서 (데이터는 표시하지 않음) 요로 PRL-3 단백질이 검출되었다. 이 214 개의 소변 표본의 결과는 PRL-3을 일반적인 암 특이성 요단백임을 확인시켜 주는 것이다.
PRL-3 단백질은 ER/Golgi 경로를 통한 고전 분비를 위한 서열 펩타이드를 갖지 않기 때문에, 본 발명자들은 PRL-3 단백질이 비-고전적 엑소좀(exosome) 분비를 통한 분비 여부를 고려하였다. 엑소좀은 많은 생물학적 체액 및 세포 배양 배지에 존재하는 50 ~ 150 ㎚ 사이의 세포막 및/또는 엔도좀 파생 소포이다(43). 본 발명자들은 테트라스파닌(tetraspanin) CD63을 대조 엑소좀 내 마커 (control exosomal marker)로 사용하여 여러 종류의 암 환자로부터 얻은 소변 샘플의 엑소좀 분별(exosome fractionation)을 수행하였다(44). 놀랍게도 엑소좀 내 PRL-3는 방광암 환자 (도 16)의 소변을 제외한 나머지 다른 유형의 암에서는 검출되지 않았다 (데이터는 표시하지 않음). 따라서, 요로 PRL-3는 적어도 두 가지 형태, 즉 용해성, '자유' 형태 (다중 암 환자의 소변) 및 엑소좀-관련 형태 (방광암 환자의 소변만 포함)로 구성된 암 특이성 마커로 존재한다.
요로 PRL - 3는 PRL3 - zumab 요법의 치료 반응 모니터링을 위한 잠재적 대리 바이오 마커 일 수 있다
암 환자의 소변 샘플에서 PRL-3가 자주 검출되므로, 본 발명자들은 요로 PRL-3가 생체 내의 진정한 PRL-3 양성(+) 종양의 존재를 반영하는지 여부를 조사하였다. 이 관계를 확인하기 위한 임상의 일치된 종양-소변 샘플을 얻는 데 어려움이 있었기 때문에, 본 발명자들은 PRL-3 양성(+) SNU-484 및 PRL-3 음성(-) MKN45 동소 위 마우스 모델을 사용하여 일치된 종양-소변 쌍에서 PRL-3 발현을 비교하였다. 또한, 각 동소 모델을 PRL3-zumab 요법과 요로 PRL-3 발현 사이의 관계를 밝히기 위하여 PRL3-zumab를 처리하지 않은, 또는 처리한 2 군으로 세분하였다. PRL3-zumab를 처리하지 않은 PRL-3 양성(+) SNU-484 종양 보유 마우스의 소변 샘플에서 매우 많은 PRL-3 단백질이 검출되었다 (도 6A, 홀수 열 1-9). 그러나, PRL-3의 종양 내 발현 감소와 일치하여, PRL3-zumab 처리 후 모든 마우스에서 요로 PRL-3은 더 이상 검출되지 않았다 (도 6A, 짝수 열 2-10). 중요하게, PRL3-zumab 처리 마우스의 요로 PRL-3 신호 손실은 각 경우에 위 종양 수축과 일치하였으며 (도 6A, 상부 패널), 이는 요로 PRL-3가 PRL3-zumab 치료 효능에 대한 대리 바이오 마커로 유용 할 수 있음을 보여주는 것이다. 대조적으로, 우리는 PRL3-zumab 요법 여부와 상관없이 PRL-3 음성(-) MKN45 동소 종양이 있는 마우스에서 요로 PRL-3을 검출하지 못하였다 (도 6A, 11열-12열). 따라서, 요로 PRL-3는 PRL-3 음성(-) 암에서는 검출되지 않으나, PRL-3 양성(+)을 보유한 마우스에서 특이적으로 검출되며, 감소 된 종양 무게와 병행하여 PRL-zumab으로 처리하면 요로 PRL-3는 감소한다.
PRL3-zumab 치료 후 PRL-3 양성(+) 종양에서의 B 및 NK 세포 침윤 증가
임상 항체 개발에서 중요한 고려 사항은 생체 내에서 종양과 정상 (또는 비-항원 발현) 조직 사이의 항체의 생체 분포이다(46). 이러한 이유로 본 발명자들은 본 발명의 동소 모델의 종양 부위에서 PRL3-zumab의 분포를 분석하였다. PRL3-zumab 처리 후, PRL3-zumab의 농축이 PRL-3 양성(+) SNU484 종양 (도 6B, 패널 b-c)에서 검출되었으나, PRL-3 음성(-) MKN45 종양에서는 검출되지 않았다 (도 6B, 패널 f). 대조군으로서, PRL3-zumab를 처리하지 않은 마우스 (도 6B, 패널 a) 또는 5-FU 단독 처리 마우스에서는 신호가 관찰되지 않았다 (도 6B, 패널 d). 이러한 결과는 PRL-3 발현 종양의 미세 환경에서 PRL3-zumab의 특이적 축적을 나타내는 것이다. 면역 효과 세포에 의한 항체 인식은 항체의 Fc 부분에 결합하는 면역 글로불린 수용체 (FcRs)를 통해 이루어지며, 이들 이펙터 세포의 동원(recruitment)과 활성화를 가져온다 (47). 종양 조직에 PRL3-zumab의 축적이 면역 세포의 침윤을 일으키는지 여부를 확인하기 위해, 세포 내 항체 치료(26)의 효능에 대한 중요한 두 FcR-보유 면역 세포인, B 세포와 NK 세포에 대한 특이적 항체를 사용하여 PRL-3 양성(+) SNU-484 위 종양 절편에서의 면역 형광을 수행하였다. PRL-3 양성(+) SNU-484 동소 종양 절편에서, PRL3-zumab를 처리하지 않은 종양 절편 (도 6B, 패널 g 및 m)과 비교하여, 침윤 B 세포 및 NK 세포의 수는 PRL3-zumab를 처리한 종양에서 현저하게 높았다 (도 6B, 패널 h 및 n). 특히, 본 발명자들은 PRL3-zumab 및 5-FU 병용 요법을 받은 마우스 (도 6B, 패널 i 및 o) 및 5-FU 처리 마우스 (도 6B, 패널 j 및 p)에서 5-FU 투여 시 림프구 집단의 감소로 인한 것으로 예측되는 (도 4C), B 또는 NK 세포 침윤의 결핍을 일관되게 관찰하였다. PRL-3 음성(-) MKN45 종양 절편에서, PRL3-zumab 치료와 상관없이 B 세포 또는 NK 세포 침윤은 관찰되지 않았다 (도 6B, 패널 k-1 및 q-r). 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 PRL3-zumab과 PRL-3 항원이 상호 작용하여 생체 내에서 치료 효과를 유도 할 수 있는 새로운 기작을 제안하였다 (도 6C): 1) 비전형적인 분비 (엑소좀 내 PRL-3) 또는 괴사 또는 apoptotic PRL-3 양성(+) 종양 세포들 (자유 PRL-3)로부터의 자발적 누출을 통해 외재화 된 PRL-3 항원은 2) 종양의 오목(niches) 안에 PRL3-zumab 결합 및 면역 복합체 축적을 위한 미끼 역할을 하여 3) 결과적으로 항-종양 효과를 위한 효과기 NK 및 B 세포의 모집 및 활성화를 초래한다.
PRL-3 양성(+) 종양에 대한 PRL3-zumab 억제 작용의 가능한 기전
자가 면역 병리학에 관한 연구들에 따르면 자가 항체들이 특정 세포 내 항원들에 결합하여 항원-발현 세포의 세포질 및 핵 구획 내에 축적될 수 있다(47). 마찬가지로, 본 발명자들은 항-PRL-3 항체가 시험관 내 에서 PRL-3 양성(+) 종양 세포들에 의해 내재화 될 수 있다는 것을 관찰하였다(4). 그러나, 항체 수용(uptake) 방식은 잘 정의되어 있지 않다. 여기에서, 본 발명자들은 세포 내 PRL-3 항원이 특이적 결합 및 종양 억제를 위해 항체와 결합(관련) 될 수 있는 두 가지 새로운 발견을 하였다. 1) 세포 내 PRL -3 종양 단백질은 분비 될 수 있다. 종양 세포에서 여러 고전적인 "세포 내" 단백질이 분비 및/또는 세포 표면 재배치화를 통해 외재화 되어 항체를 이용한 치료적 개입에 접근 할 수 있다고 보고되어 왔다 (48,49). 본 발명자들은 3 개의 PRL-3 양성(+) 세포주: SNU-484, NUGC-4, IM-95 및 하나의 PRL-3 음성(-) 세포주 MKN45에서 세포 내 PRL-3 및 세포 외 PRL-3 발현을 비교하여 PRL-3가 PRL3-zumab 결합을 위한 표적 항원으로 유사하게 외재화 될 수 있는지 조사하였다. PRL-3 발현은 대조군으로서 비-분비되는, ER-앵커(anchored) 단백질인 칼네신 (calnexin)과 비교하였다. PRL-3 단백질은 PRL-3 양성(+) GC 세포의 세포 내 단백질 분획물들 (세포 용해물)뿐만 아니라 (도 6A, 1열-3열), PRL-3 양성(+) GC 세포의 세포 외 단백질 풀 (농축된 조건 배지) (도 6A, 5열-7열)에서 검출되었으나, PRL-3 음성(-) GC 세포주 에서는 검출되지 않았다 (도 6A, 4열, 8열). 대조적으로, 칼네신(calnexin)은 PRL-3 양성(+) 및 PRL-3 음성(-) PRL GC 세포 (도 6A, 1열-4열)의 세포 내 풀(pools)에만 존재하고, 세포 외 풀(pools)에는 존재하지 않았다 (도 6A, 5열-8열). 이 관찰은 죽은 세포 또는 세포 파편에 의한 비특이적인 오염을 배제하였고, PRL-3를 새로운 분비 단백질로 특징 지었다. 2) 외재화 된 PRL-3는 PRL3 - zumab 결합을 위한 미끼의 역할을 할 수 있다. 본 발명자들은 PRL3-zumab을 처리한 동소(orthotopic) GC 마우스로부터 얻은 종양 절편을 조사하고 종양 오목(niche) 내의 PRL3-zumab의 분포를 분석하였다. 대조군인 미처리 마우스에서는 신호가 관찰되지 않았다 (그림 6B, 가장 왼쪽 패널). 치료 후, PRL3-zumab은 PRL-3 양성(+) SNU-484 종양의 미세 환경 내에서 농축되었으나, 5-FU 단일 요법 또는 PRL-3 음성(-) MKN45 종양의 경우는 이러한 현상이 관찰되지 않았다 (도 6B). 이러한 결과는 PRL-3 양성(+) 종양의 미세 환경에서는 PRL3-zumab의 특이적 축적을 나타내지만 PRL-3 음성(-) 종양의 미세환경에서는 그렇지 않다는 것을 시사한다.
토론
이 연구는 최소한의 부작용으로 암을 표적으로 하는 면역 요법의 실행 가능한 분자 표적으로서 이전에 인식되지 않았던 암세포 특이적 세포 내 종양 단백질의 잠재력을 입증하였다. 본 발명의 결과들은 우수한 종양-특이적 oncotarget으로 PRL-3를 특징지었고, 동소 종양 모델들을 생성하기 위해 인간의 위암 세포주를 사용하여, 임상 관련 설정에서 PRL3-zumab의 특정 항종양 효능을 증명하였다. PRL3-zumab은 동소의 PRL-3 양성(+) 위 종양의 성장을 특이적으로 억제하여 (그러나 PRL-3 음성(-)은 아님), PRL-3 양성(+) 위암의 치료에 PRL3-zumab의 적합성을 입증하였다. 또한, 분비된 요로 PRL-3는 진단 및 치료 반응 모니터링을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있다.
인간 GC 세포주를 사용하여 임상 관련 동소(orthotopic) GC 모델을 만들기 위하여, 본 발명자들은 면역 결핍 누드 마우스를 사용하였으나, NOD/SCID, BALB/c-RAG2null 또는 그 파생물과 같은 심각한 면역 저하 마우스 계통은 사용하지 않았다(48). 이 후자의 계통은 내인성 면역 체계가 거의 없거나 전혀 없기 때문에 연구 결과를 면역 능력이 있는 인간 환자에게 적용할 때 차이가 생긴다. 좀 더 임상적으로 관련이 있는 마우스 모델의 사용은 체내의 복합적인 상호 작용을 요약할 수 없고 생체 내 독성을 예측하기 어려운 배양 접시에서의 시험관 내 약물 스크리닝의 한계를 극복한다(49). 실제로, 항 PRL-3 항체는 면역 저하 된 SCID 마우스(24)에서 또는 시험관 내 에서, PRL-3 양성(+) 암세포에 직접 첨가되었을 때(27) 항암 효능이 결핍되어 있는 것으로 밝혀졌으며, 이것은 성공적인 치료를 위한 치료제와 면역 효과기들(immune effectors)의 상호 작용에 대한 중요성을 나타내는 것이다. 본 발명에서 PRL3-zumab이 원발성 및 전이성 위암 성장을 저해하는 치료 효능과 암 재발을 예방하기 위한 수술 후 보조 요법의 가치가 입증되었다. 또한, 본 발명자들은 PRL3-zumab의 축적 및 PRL3-zumab 치료 시 PRL-3 양성(+) 종양 오목들(niches)에 B 및 NK 세포의 침윤을 증가함을 입증함으로써 PRL3-zumab의 항종양 활성에 주요 면역 효과기들(immune effectors)의 관련성을 강화시켰다. PRL-3는 최근 NKG2D 리간드인 ULBP2의 분비를 촉진하여 NK 세포에 의한 종양 인식 및 세포 용해를 감소시키는 것으로 나타났다(50). 이 연구 결과는 PRL3- zumab 처리 마우스에서 관찰 된 PRL-3 양성(+) 종양 오목들(niches)로의 NK 세포 침윤 증가가 상승적으로 NK 세포 용해 활성을 증가시킴으로써 PRL-3 양성(+) 종양의 보다 효과적인 면역 표적화를 유도할 수 있음을 시사한다.
분비 된 형태의 PRL-3의 발견은 PRL-3 양성(+) 종양 부위에 대한 면역 세포 모집 및 PRL3-zumab의 항종양 효능에 필요한 특정 항체-항원 상호 작용에 무게를 부여한다. 흥미롭게도 수용성 PRL-3가 여러 암 환자의 소변에서 검출되었지만, 방광암 환자의 소변에서만 엑소좀 관련 PRL-3가 검출되었고, 다른 악성 종양 환자로부터의 소변에서는 검출되지 않았다. 이것에 대한 가능한 설명은 혈장에서 70 kDa 미만의 단백질이 보우만 캡슐로 들어가서 오줌 배설이 가능하다는(45) 신장성 사구체 여과에 의해 부과된 신체적 배제 한계이다. 본 발명의 결과는 PRL-3가 생체 내에서 적어도 두 가지 형태로 종양 세포에서 분비 될 수 있음을 간접적으로 나타낸다. 1) 첫째, 여러 종류의 암 소변에 존재하는 용해성, 여과 가능한 형태이다. 이러한 'free PRL-3'은 종양 괴사, 세포 사멸 또는 종양 세포 용해 과정에서 체액으로 누출 될 수 있으며 20-25 kDa의 낮은 분자량을 가지고 사구체를 통과하여 소변으로 배출 될 수 있다. 2) 둘째, '엑소좀 PRL-3'으로서, 방광암 환자의 소변에서만 발견되는데, 이유는 방광 비뇨기 계통에 방해받지 않는 방광암 세포가 소변 풀에 직접 PRL-3 함유 엑소좀을 흘릴 수 있기 때문이다. 그러나 다른 암 조직 (위, 간, 폐)에서 순환하는 엑소좀은 사구체 여과를 통과할 수 없지만, PRL-3 양성(+) 암세포의 출아 된 엑소좀은 생체 내에서 PRL3-zumab 인식을 위한 종양 부위 내의 앵커 지점으로 작용하여 캐스케이드 면역 반응을 일으킬 수 있다 (도 6C).
최근 많은 수의 FDA 승인 된 항암제가 표적 선택성이 떨어지는 것으로 나타났다(51). 본 발명에서, 종양 조직 및/또는 암 소변에서 mRNA 수준 또는 단백질 수준의 PRL-3 발현에 대해 400 개 이상의 임상 암 샘플을 조사하였다. 평균적으로, PRL-3 종양 단백질은 여러 종류의 암 (위, 간, 폐, 비인두, 신장, 유방, 결장, 방광)의 62 %에서 과발현 되었다. 이러한 높은 PRL-3 종양 양성으로, 종양 특이적 PRL-3에 대한 PRL3-zumab-표적 치료의 개발은 개인화 된 의학을 향한 흥미 진진한 단계이다. PRL3-zumab은 off-target 부작용 (PRL-3은 대부분의 정상 성인 조직에서 검출 가능한 수준으로 발현되지 않음)을 최소화하면서 치료 효과를 극대화함으로써, 임상 적 유효성 확인 및 정밀 항암제로서의 개발을 정당화한다.
본 발명자들은 PRL3-zumab 암 치료에 관한 다섯 가지 핵심 연구 결과를 다음과 같이 요약한다. 1) PRL3 - zumab은 PRL -3 종양 특이 항원을 특이적으로 인식한다. PRL3-zumab은 매우 특이적이다- PRL-3 zumab은 PRL-3와 75 % 이상의 아미노산 서열을 공유하는 2 개의 상동체 (PRL-1 또는 PRL-2)와 교차 반응하지 않는다. 또한, PRL3-zumab은 종양 조직에서 PRL-3 항원을 특이적으로 인식하지만, 정상 조직에서는 그렇지 않으며, 이것은 PRL3-zumab이 낮은 독성 및 최소의 타겟 외(off-target) 부작용을 나타냄을 시사한다. 2) PRL3 - zumab은 PRL -3 양성(+) 동소( orthotopic ) 위 종양의 성장을 억제하고 수술 후 PRL -3 양성(+) 종양 재발을 예방한다. 종양 내 PRL-3 단백질 발현은 치료 반응에 대한 절대 요구 조건이며 종양 억제를 위한 항원 항체 인식의 필요성을 시사한다. 3) PRL3 - zumab은 화학 요법과 병용하는 것보다 단일 요법으로 더 효과적이다. 종합적으로, 본 발명의 결과들은 화학 요법 유도 면역 억제 (34)가 PRL3-zumab의 치료 효능을 감소시킴에 따라 PRL3-zumab의 치료 결과가 숙주 면역계에 의존한다는 것을 나타낸다. 4) PRL3 - zumab은 여러 개의 PRL -3 양성 암에서 광범위하게 사용되어야 한다. 본 발명의 결과들이 PRL3-zumab 효능에 대한 사례 연구로서 다중 GC 모델에 초점을 맞추었지만, PRL-3는 다중 암 유형의 종양 전이 및 불량 예후와 광범위하게 관련이 있으며 PRL-3 발현의 증가가 전반적인 생존 기간 단축과 관련되어 있다(7). PRL3-zumab이 PRL-3 항원을 인식할 때에만 효과를 발휘한다는 원칙에 근거하여, 면역학적으로 손상되지 않은 환자에서 PRL-3 양성인 암의 대부분을 표적으로 하는 효능이 있는 것으로 생각되어지며, 이것은 일반암 치료에서 새로운 치료법을 제시한 것이다. 5) 요로 PRL - 3는 암 진단 및 치료 반응 모니터링을 위한 잠재적인 새로운 바이오 마커가 될 수 있다. 본 발명에서 여러 사람의 암 환자의 평균 62 %에서 요로 PRL-3를 검출하였다. 마우스 모델에서 관찰 된 종양과 요로 PRL-3 발현 사이의 밀접한 상관 관계는 소변의 PRL-3 발현이 다양한 인간 악성 종양에서 PRL-3 표적 암 치료법 (PRL-zumab 포함)에 대한 유망한 진단 바이오 마커로서 유용할 수 있음을 나타내었다. 또한, 본 발명의 데이터는 소변 PRL-3가 임상적으로 PRL3-zumab 치료 효능을 추정할 수있는 빠르고 간단한 정성적인 방법을 제공함으로써 대리 바이오 마커로 기능 할 수 있음을 시사한다. 요로 PRL-3의 바이오 마커 가치가 추가 검증을 필요로 할지라도, PRL3-zumab에 대한 그러한 '동반 진단 (companion diagnostic)'의 개발 가능성은 조기 임상 시험에서 강력한 가설 테스트를 허용함으로써 그것의 약물 개발 프로세스를 가속화 할 것이다(52).
여기에서 본 발명자들은 PRL-3 양성(+) 인간 암을 차단하기 위한 세포 내 종양표적(oncotarget)에 대한 최초의 인간화 항체로서 PRL3-zumab을 입증하였다. 종합적으로, 본 발명의 결과는 여기와 다른 곳에서(23, 24, 27) 세포 내 암항원들(oncoantigens)은 항암 효과를 위해 치료용 항체가 접근할 수 없다는 정설에 이의를 제기한다. 본 발명자들은 다른 세포 내 종양 단백질이 표적 면역 요법으로 작용할 엄청난 잠재력을 가질 수 있다고 제안한다. 수많은 종양 특이적 세포 내 암항원(oncoantigens) 후보들은 미래의 임상 시험을 위한 실행 가능한 분자 표적으로서 그들의 잠재성에 대해 재검토되어야 한다.
실시예 3: PRL3 - zumab 작용기전(MOA)의 조사
이 연구에서, 본 발명자들은 PRL-3 항체가 '종자 및 토양' 간 동소(orthotopic) 종양 모델을 사용하여 세포 내 PRL-3 항원에 어떻게 결합 할 수 있는지를 다루는 분자 작용 기전 (MOA)에 주로 초점을 맞춘다. 본 발명자들은 실제로 ‘세포 내 종양단백질’ 이 ‘세포 외 종양단백질’ 로서 세포 표면에 재배치되기(relocalized) 위하여 시험관 내에서 보다 생체 내에서 더 높은 비율로 존재하고, 따라서 세포 외 종양표적(Oncotargets)에 대해서 항체 기존(conventional) 경로를 통한 종양 제거에 대한 합리적인 근거를 따른다는 중요한 결론에 도달하기 위하여 여러 측면에서 조사하였다. 일관되게, 우리는 PRL3-zuamb이 요구되는 PRL-3 '세포 내 항원을 발현하는 종양을 차단한다는 것을 역학적으로 발견하였다 : 1. FcγII / III 모두의 차단제로, 숙주 FcγII / III 수용체 상호작용 치료 효능을 상실시킨다. 2. 전체 항체 활성, Fc 조각 (CH1 및 Ch2 도메인)이 없는 미니 바디는 치료 효능을 무시한다. 3. M1 (M2는 아님) 대식세포들, B 림프구들, 자연 살해 세포들을 증가시켜 숙주 면역을 향상시킨다. 이 결과들은 ‘세포내 종양단백질’을 표적하는 항체의 작용 기작이 고전적인 항체 의존 세포 독성 (ADCC) 또는 식세포 (ADCP) 경로를 통한 '세포 외 종양단백질' 을 표적하는 유사한 원리를 실제로 따른다는 것을 시사한다. 마지막으로 110 개의 귀중한 신선 동결 인간 종양 또는 일치하는 정상 조직을 사용하여, 본 발명자들은 PRL-3이 간암, 폐, 결장, 유방, 위, 방광, 전립선, AML 및 신장 환자의 종양 샘플 등 9 종의 다른 인간 암종에서 평균 78 % 이상에서 광범위하게 과발현되나, 상기 종양 샘플과 일치하는 정상 조직에서는 그렇지 않은, 우수한 종양 특이적 종양표적(oncotarget)임을 보여 주었다. 이런 발견들은 대부분의 ‘치료하기 힘든’ 암에 대한 표적 면역 요법의 차세대 시장 개척자로서 PRL3-zumab 임상 실험을 보증한다.
재료 및 방법
세포주
인간 HCC 세포주 Hep3B2.1, HepG2, Huh-7, PLC, SNU449는 American Type Cell Culture (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 쥐의 HCC 세포주 Hep53.4는 CLS Cell Lines Service GmbH (Eppelheim, Germany)로부터 구입 하였다. 모든 세포주는 권장 배지에서 배양하였다. MHCC-LM3 인간 간암 세포주는 Dr Kam-Man Hui 연구실 (National Cancer Center, Singapore)에서 일상적으로 유지 관리되었다.
웨스턴 블로팅
환자 조직의 경우, 5 ㎣ 조각을 프로테아제-포스파타제 억제제(protease-phosphatase inhibitor cocktail) (Pierce)가 포함된 RIPA 용해 완충액(RIPA lysis buffer) (Sigma)에 현탁하고 조직 분쇄기(tissue homogenizer) (Polytron)로 완전히 파쇄하였다. 용해물을 13,000 × g, 4 ℃에서 40 분간 원심 분리하여 정화(clarified)시켰다. 세포주의 경우는, 5 × 106 세포를 프로테아제-포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 용해 완충액에서 용해시키고 상기 설명한 바와 같이 정제하였다. 조직 용해물 (40μg) 또는 세포 용해물 (200μg)을 12 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 블로킹 전에 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 쥐 항-PRL-3 34 또는 항-GAPDH (클론 MAB347, Milipore) 항체로 4 ℃에서 하룻밤 동안 프로빙 하였다. TBS-T 완충액 (20 mM Tris pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.2 % Tween-20)으로 철저히 세척한 후, 멤브레인을 1 : 5,000 비율로 희석한 HRP 결합 2차 항체로 1 시간 동안 각각 인큐베이션하고, TBS-T로 세척하여, 화학 발광 기질 (Pierce)을 사용하여 가시화하였다.
동물 모델들 및 처리(treatments)
본 연구에서의 모든 동물 모델들은 생물 자원 센터 (A*STAR, Singapore)에서 얻은 8 주령 수컷 Balb/C 누드 마우스를 사용하였다. 마우스들은 2.5 % 아베르틴 (avertin, 100 ㎕/10 g 체중)으로 마취하였다.
마취 된 쥐의 복부는 흉골 검상돌기 아래 바로 아래에서 시작하여 1 cm 중간 선 절개에 의해 층들이 열렸다. 복부 절개를 통해 간엽의 좌측 엽을 꺼내고, 3 x 106 개의 MHCC-LM3 간암 세포를 피막하층에 접종하였다. 간은 복강으로 되돌려졌고 복부는 다시 층으로 봉합되었다. 치료 요법(treatment regime)은 암세포 접종 후 5 일째에 시작하였다. 종양 성장/부피 실험을 위해, 처리 된 마우스에 5주 동안, 매주 2회, PRL3-zumab, 인간 IgG 이소 타입 대조군 (카탈로그 BE0092, Bio X Cell) 또는 PRL3-minibody를 각 100 ㎍ 씩 i.v. 투여하였다. 표시된 경우, 100㎍의 항-CD16/32 항체 (클론 2.4G2; Bio X Cell)의 동시-투여에 의해 동시-처리를 수행하였다. 모든 항체들은 주사를 위하여, 100 ㎕(최종) 되도록 PBS에 희석하였다. 종양 체적은 다음 공식을 사용하여 계산하였다 : 부피 = 0.4 × 종양 길이 × 종양 폭 × 종양 폭. 생존 연구를 위하여, 처리 된 마우스를 100 ㎕ PBS로 희석 된 100 ㎍의 PRL3-zumab을 1 주일에 2 회, 총 10 회, i.v. 투여하였다. 미처리 마우스를 대조군으로, 동등한 용량의 위약 (완충제 단독)을 대조군으로 i.v. 투여하였다. 마우스가 감소된 신체 활동을 나타내고 병이 났을 때, 그들은 생존 분석에서 안락사 시키고 "사망" 사건으로 기록하였다.
세포 분리
종양 세포. 동소(orthopopic) MHCC-LM3 간 종양들을 수확하고 MACS 조직 해리 키트 (130-095-929, Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 부드럽게 분리시켰다. 이 키트는 중요한 세포 표면 에피토프를 보존하면서 종양 세포의 높은 수율을 위해 최적화되어 있다. 분리 된 종양 세포를 연속적으로 세고, RPMI에 재현탁한 후, 분석할 때까지 얼음에 보관하였다. 배양된 세포. 완전 RPMI 배지 (10 % FBS 및 1 % 항생제가 첨가 된 RPMI 배지)가 담긴 T-75 플라스크에서 80 % 컨플루언스로 기하 급수적으로 성장한 MHCC-LM3 PRL-3 양성(+) 간암 세포를 PBS로 한번 세척하고 비-효소 세포 분리 완충액 (C5914; Sigma)을 5 분 동안 가하여 부착 세포를 현탁액으로 떼어냈다. 세포를 PBS로 1 회 세척하고, 계수하고, 완전 RPMI 배지에서 재현탁하고, 분석 할 때까지 얼음에 보관하였다.
세포 표면 라벨링 및 유동 세포 계측법 분석
cetuximab (항-EGFR, 키메라 Ab), 허셉틴 (항-HER2, 인간화 된 Ab), 또는 PRL3-zumab (항-PRL-3, 인간화 된 Ab) 2 μg를 총 부피 100㎕ 되도록 한 후, 4 x 105 개의 세포와 함께 4 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 추가된 1 차 항체가 없는 별도의 튜브가 음성 대조군으로 사용되었다. 인큐베이션 후, 1 ㎖ PBS를 각 샘플에 첨가하고, 원심 분리하고, 1.5 ㎕ 항-인간 FITC 항체를 함유하는 100 ㎕ PBS에 세포 펠렛을 재현탁 시켰다. 4 ℃에서 15 분 배양 후, 세포는 이전과 같이 PBS로 씻고 마지막으로 200 ㎕ PBS에 재부유 하였다. 세포를 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 세포 여과기를 통과시키고, FACS Diva 소프트웨어를 사용하는 2 개의 레이저 (488 ㎚ 및 633 ㎚)가 장착 된 BD FACSCanto II 유동 세포 계측기에서 즉시 측정하였다. 데이터는 FCS3 파일로 저장되고 Flowing Software 버전 2.5.1을 사용하여 분석하였다. 살아있는 세포는 FSC와 SSC를 기반으로 게이팅 하였다. 단일 세포는 FSC 및 SSC 폭을 사용하여 게이팅 하였다. 단일 항체 염색 세포 (2 차 단독) 및 염색되지 않은 대조 세포를 보정을 위해 사용하였다.
재조합 GST-태그 단백질 제조 및 ELISA
재조합 GST-PRL-1, GST-PRL-2 및 GST-PRL-3 융합 단백질 제조 및 ELISA 분석은 이전에 기술되어 있다(59). 간략히, 표시된 항원 양으로 코팅 된 96-웰 ELISA 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 0.5 ng 또는 1 ng의 PRL-3 미니 바디와 함께 반응하기 전에 3 % 소 혈청 알부민으로 차단시켰다. 광범위한 세척 및 2 차 항체 배양 후, Turbo-TMB 기질 (피어스 (Pierce))을 사용하여 비색계 발색을 수행하고 2M H2SO4로 산성화함으로써 중지시켰다. 흡광도는 플레이트 판독기 (Dynatech)를 사용하여 450 ㎚에서 측정하였다.
면역 형광 이미징
MHCC 동소(orthotopic) 간 종양의 신선한 동결 표본은 -16 ℃에서 저온 유지 장치 (cryostat, Leica)를 사용하여 10 ㎛ 슬라이스로 절단하였다. 슬라이드를 4 % 파라포름알데히드로 20 분간 고정하고, PBS-0.05 % Tween-20으로 세척 한 후 PBS-FDB (PBS pH 7.0, 2 % BSA, 5 % 염소 혈청, 5 % 소 태아 혈청)로 실온(RT)에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 이어서, 슬라이드를 1 : 200 희석하여 표시된 1 차 항체와 함께 4 시간 동안 처리하고, 세척하고, 대응하는 형광 색-결합 된 2 차 항체 (Life Technologies)로 2 시간 동안 처리하였다. 세척 된 슬라이드는 DAPI-함유 항-퇴색 마운팅 시약(anti-fade mounting reagent) (Vector Laboratories)으로 고정된 후, 매니큐어로 밀봉하였다. 공초점 이미징은 LSM 800 공초점 현미경 (Zeiss AG)으로 수행하였다. 종양 캡슐 (정상 및 종양 조직의 교차점)에 인접한 종양 영역의 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocytes, TILs)의 대표 이미지 (n=3)를 취했다. 면역 세포 (녹색)와 DAPI 양성 세포 (파란색)의 총 수는 Image J 소프트웨어로 분석하였으며 TIL의 비율은 면역 세포와 DAPI의 비율을 측정하여 결정하였다. 3 개 이미지들의 결과를 평균하는 것은 1 개의 샘플의 데이터를 나타낸다.
결과
PRL -3 '세포 내 종양 단백질'은 in vivo 에서 '세포 외 종양 단백질'로 확인 될 수 있다
PRL-3 항체는 PRL-3 발현 이종 이식 종양, 전이성 폐종양 및 동소(orthotopic) 위암에 대한 효능을 나타냈다. 세포 내 종양 단백질에 대한 이러한 비전형적 항체 요법을 이해하기 위하여, PRL3-항체가 면역 세포에서 FcγR과 세포 내 PRL-3을 어떻게 연결시킬 수 있을까? 가능한 가설은 다른 세포 표면 (세포 외) 항원과 같이, PRL-3 자체의 일부가 뒤집혀 생체 내 에서 세포 표면에 노출되어 사이클링 효과를 유발하여 직접 PRL3-zumab 결합을 허용한다는 것이다. 이를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 부드러운 효소 해리를 사용하여 고체 간 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 유동 세포 계측법 (도 20a)을 사용하여 시험관 내 배양 세포 대 이러한 탈체(ex vivo) 종양 세포의 세포 표면 발현을 비교하였다. 이러한 비투과성 세포 풀(pools)의 세포 계측 분석은 이들 사이의 주요 항원 특이성 차이를 나타냈다. 항-상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 키메라 항체인 세툭시맙(Cetuximab)은 인위적으로 많은 양의 성장 인자가 첨가되어 배양 된 세포와 비교하여 탈체(ex vivo) 종양에서 EGFR의 표면 발현을 현저히 낮추는 반면, PRL-3의 경우는 그 반대였다 (도 20b의 대표적인 흐름 히스토그램). 정량은 배양 된 세포 (CC;도 20c, 열 3 대 4)에 비하여 탈체(ex vivo) 종양 세포 (T)에서의 표면 EGFR 염색에서 3 배 감소를 나타내었다. 이와 대조적으로, PRL3-zumab 염색법으로 분석한 PRL-3 발현은 배양세포 조건과 비교하여 세포 내 PRL-3 단백질의 외재화를 위한 암세포의 능력을 향상시키는 조건들인 저산소 스트레스 및 혈청 결핍 하에서 생체 내(in vivo)에서 암세포들이 있는 탈체(ex vivo) 종양 세포에서 약 7배 증가하였다 (CC;도 20c, 컬럼 5 대 6). 유동 세포 계측법에서 보여준 이러한 변화가 이러한 항원들의 전체 세포 수준의 변화로 인한 것인지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 용해물의 웨스턴 블로팅을 병행하여 수행했다. 앞선 세포 계측 관찰과 일치하여, 배양 된 세포와 비교하여, EGFR의 전체 수준은 생체 외 종양 세포에서 현저히 하향 조절되었다 (도 20d). 대조적으로, PRL-3 발현은 원래의 세포와 비교하여 종양에서 명백하게 증가 하였다 (도 20d). 그러나, 총 PRL-3 수준의 증가가 PRL-3 표면 수준의 증가에 비해 훨씬 작기 때문에, 후자의 관찰은 주로 세포 내 PRL-3의 재-위치화에 기인한 것으로 판단된다. 이를 확인하기 위해, 배양 된 MHCC 세포 및 MHCC 종양의 투과 전자 현미경 (TEM)을 수행하여, MHCC 세포에 비해 MHCC 종양의 세포막의 세포 외 리플렛(leaflet)에 대한 항-PRL-3 면역금염색(immunogold staining)의 현저한 증가가 관찰되었고, 세포막의 세포 내 리플렛(leaflet)에서는 유의 한 차이는 없었다.
PRL3 - zumab은 마우스의 '종자 및 토양' 동소( orthotopic ) 간 종양 모델에서 Fc 의존성 방식으로 치료 효능을 나타낸다
생체 내에서 '세포 외' PRL-3 항원의 이러한 높은 수준은 PRL-3 항체에 의해 인식되어 면역 세포를 모집하고 전통적인 세포 외 종양 단백질에 대한 항체 치료제의 고전 ADCC 및 ADCP를 따른다. 인간 암세포 ("종자")가 그들의 자연적 위치 ("토양")에서 자랄 수 있는 동소(orthotopic) 종양 모델은 인간 질병을 높은 충실도로 복제한다. 본 발명자들은 최근 PRL3-zumab이 인간의 위암 세포에 의해 형성된 PRL-3 발현의 동소(orthotopic) 위 종양을 억제 할 수 있다고 보고하였다(8). 또한 본 발명자들은 PRL3-zumab이 절제 후 PRL-3 발현 종양 재발을 차단할 수 있음을 보여주었다.
본 발명에서 임상적으로 관련된 치료적 HCC 치료 반응 16을 보다 잘 재현하기 위해, PRL3-zumab이 자연 오목(niche)에서 간 종양을 억제하는 능력을 테스트하기 위해 동소(orthotopic) HCC 모델을 확립하였다 (도 21a). PRL-3 단백질 발현 상태 (도 21b)에 대해 스크리닝 된 6 개의 인간 (마우스 1 ?) 간암 세포주의 패널에서, PRL-3 양성(+) MHCC-LM3 세포만 합리적인 시간(6 주) 내에 간 종양을 강하게 형성하였고, 후속 처리 실험을 위해 선택되었다. 동소(orthotopic) 위 종양 6과 유사하게, 동소(orthotopic) 간 종양 형성은 PRL3-zumab을 처리하지 않은 마우스에 비해 PRL3-zumab을 처리한 마우스에서 눈에 띄게 감소하였다 (도 21c). 종양 체적의 측정 결과, PRL3-zumab을 처리하지 않은 마우스에 비해 PRL3-zumab을 처리한 마우스의 평균 종양 무게가 7 배 감소된 것으로 나타났다 (도 21d; 0.30 ± 0.36 대 2.41 ± 1.20 ㎤, P = 0.0001). PRL3-zumab 처리가 생쥐 생존에 장기적인 영향을 미치는지를 연구하기 위해 본 발명자들은 PRL3-zumab을 4 주 동안 처리 한 후, 치료를 중단하고, 병적 특성 ("사망"사건)이 나타날 때까지 걸린 시간을 모니터링 하였다. 이 치료 계획에 따라, 처리한 마우스는 처리하지 않은 마우스에 비해 유의하게 더 긴 총 생존율을 보였으며, 중앙 생존 기간은 12 주 대 8 주였다 (도 21e; Kaplan-Meier 생존 분석, P = 0.002). 종합적으로, 본 발명의 발견은 PRL3-zumab이 현저한 종양 무게 감소 및 더 긴 생존과 함께 이 임상적으로 관련된 HCC 모델에서 치료 효능을 유지한다는 것을 확증했다.
관련 분자 기작을 이해하기 위하여, 먼저 PRL3-zumab이 PRL-3 양성(+) 암 세포를 직접 저해 할 수 있는지 분석하기 위한 시험관 내 분석을 수행하였다. 생체 내 PRL-3 양성(+) 종양의 완전한 억제에도 불구하고, PRL3-zumab 처리는 50 ㎎/㎖의 고용량에서도 시험관 내에서 PRL-3 양성(+) 또는 PRL-3 음성(-) 암 세포 성장을 억제하지 못했다 (도 24). 대조적으로, 시스플라틴 처리는 PRL-3 양성(+) 및 PRL-3 음성(-) 세포 모두에서 용량 의존적이며 비특이적인 세포 살상을 초래하였다 (도 24). 이 발견은 다른 치료 항체와 마찬가지로 PRL3-zumab이 항종양 효과를 위한 특정 숙주 인자를 필요로 한다는 것을 재확인한 것이다. 기존 항체 치료에서 면역 세포상의 Fc 수용체 (FcR)는 항원-항체 복합체의 상수 (Fc) 영역에 결합하고, 항체-의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) 또는 식균 작용 (ADCP) 17을 통한 표적 항원/세포 제거(clearance)를 위한 작동기 경로(effector pathway)의 모집 및 활성화를 유도한다. PRL3-zumab의 작용 메카니즘에 숙주 FcRs이 관여 하는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 2개의 보완적인 실험을 설계하였다 (도 20f). 즉, 1) PRL3-zumab 및 FcγII 및 FcγIII 수용체의 결합 위치를 차단함으로써 IgG FcR-매개 면역 제거(clearance)의 강력한 억제제인 항-CD16/32 항체 (2.4G2 mAb)를 PRL-3 양성(+) 동소 간 종양을 접종한 마우스에 병용 처리 18 및 2) 온전한(손상되지 않은) PRL3-zumab를 CH1 및 CH2 도메인이 없도록 조작되었으나, Fc 수용체에 결합하는데 필수적인 것으로 나타난 19, 20 (scFv-CH3) 2 PRL3-미니바디(minibody)로 대체. 2.4G2 mAb를 사용하여 FcγII / III 수용체가 차단되면 PRL3-zumab 치료 효능이 완전히 상실되어, 처리하지 않은, 2.4G2 mAb 또는 이소 타입-매치 대조 (IgG) 처리한 마우스들과 평군 종양 부피에서 의미있는 차이가 없는 결과가 나타났다 (도 20g). 마찬가지로, (scFv-CH3) 2 PRL3 미니 바디로 처리한 간 종양도 치료 반응이 없었다 (도 20g). 특히, (scFv-CH3) 2 PRL3-미니바디(minibody)의 치료 효능의 유사한 결핍은 동소(orthotopic) PRL-3 양성(+) SNU-484 위암 (도 25)에 대해 명백하였고, 이는 조직 특이적인 결함이 아님을 보여준다. 또한, PRL3-zumab의 CH1 및 CH2 도메인의 결실은 웨스턴 블라팅, ELISA 및 면역 형광법 (데이터는 나타내지 않음)에 의해 입증 된 바와 같이, 생성된 미니 바디가 PRL-3에 결합하는 것에 영향을 주지 않았으며, 이는 치료 효과의 손실이 항체 소형화로부터 기인한 잠재적인 항원 결합의 결함때문은 아니라는 것을 의미한다. 종합하면, 본 발명의 결과들은 PRL3-zumab의 Fc 도메인과 호스트 FcγII / III 수용체 사이의 상호 작용이 PRL3-zumab의 항종양 효과에 필수적임을 입증한다.
PRL3 - zumab은 B 림프구, 자연 살해 세포 및 M1 대식세포를 PRL -3 발현 종양 위치(niche)로 모집하여 생체 내에서 암세포를 죽인다
Fc-FcR 상호 작용은 ADCC 및 ADCP를 통한 종양 세포 제거에 중요하다. NK 세포가 ADCC의 주요 반응기(effector)인 반면, 대식세포는 ADCP의 반응기이며, 후자가 암 치료를 위해 승인된 대부분의 항체의 주요 작용 기작으로 점차 인식되고 있다 21. 종양 관련 대식세포 (TAM, tumor- associated macrophages)는 면역-자극 활성과 종양 살상 활성(M1 대식세포)과 면역 억제 및 전(pro)-전이 활성(M2 대식세포) 사이를 변화하며 종양 형성 과정에서 역동적이고 상반되는 역할을 할 수 있는 종양 스토마(tumor stoma)의 주요 요소이다 22. PRL3-zumab이 종양 위치 내에서 대식세포와 다른 면역 세포의 침윤 및 축적을 촉진시키는지 확인하기 위하여, 상이한 대식세포 아형에 특이적인 다음과 같은 항체를 이용하여 PRL-3 MHCC 간 종양 절편에서 면역 형광을 수행하였다: M1 대식세포 (CD86), Pan-Macrophage (F4/80),; M2 대식세포 (CD206), B 세포 (CD45/B220), 및 NK 세포 (CD335). 흥미롭게도, F4/80 대식세포와 CD206 M2 대식세포의 축적에 대한 집단 평균 간의 유의한 차이는 관찰되지 않은 반면 (도 2a, b), CD86 M1 대식세포의 유의한 증가가 명백하게 나타났다 (도 21c; F (5,12) = 7.127, p <0.0053). 마찬가지로, 모든 처리군에서 B 세포 (도 21d; F (5,12) = 40.14, P <0.001) 및 NK 세포 (도 21e; F (5,12) = 7.386, P <0.0046)의 현저한 축적이 관찰되었다. 놀랍게도, PRL3-zumab 및 2.4G2 mAb의 병용 요법은 이러한 PRL3-zumab의 유도 축적을 역전시켜 (도 2c-e), PRL3-zumab이 FcR-의존적 방식으로 이들 세포의 특이적 축적을 촉진한다는 것을 입증하였다. 종합하면, 우리의 결과는 PRL3-zumab의 Fc 도메인과 FcγII/III 수용체 사이의 상호 작용이 종양 파괴성의 M1 대식세포, B 세포 및 NK 세포의 모집에 필수적이며, 이들이 생체 내 항 종양 효능과 밀접한 상관관계가 있음을 입증한다 (도 21f).
새로운 종양표적(oncotarget)인 PRL-3은 여러 사람의 암에서 빈번하게 과발현된다; PRL3-zumab은 이러한 다중 PRL-3 양성 인간 암을 치료하기 위한 긴급하고 충족되지 않은 의료적 니즈에 적합하다.
본 발명자들은 앞서 PRL-3 발현이 85%의 신선한 동결 위암 조직에서 검출되었지만, 환자와 매치된 정상 위암 조직에서는 검출되지 않아, PRL-3가 새로운 위암 종양표적(oncotarget)임을 입증하였다 6. 상승된 PRL-3 전사체 발현이 많은 다른 종양 유형에서 확인된 바 있기 때문에 2, 본 발명자들은 9가지 다른 암 유형으로부터 수득하기 힘든 110개의 신선한 동결 환자 종양 샘플, 특히 충족되지 않은 의학적 니즈를 갖는 공격적인 악성 종양에서 PRL-3 단백질 발현을 광범위하게 특성화하려고 시도하였다. 임상 협력자들로부터 무작위로 할당된 신선한 동결 샘플 중, 16/20의 간 종양 (80 %;도 23a), 9/10의 폐 종양 (90 %;도 23b), 7/10의 결장 종양 (70 %;도 23c), 9/10의 유방 종양 (90 %;도 23d), 13/18의 신장 종양 (72 %; 도 23e, f), 19/28의 방광 종양 (68 %, 도 23g), 6/12의 AML 샘플 (50 %; 도 23h), 5/6의 위 종양 (83 %;도 23i) 및 4/4의 전립선 종양 (100 %;도 23j)에서 본 발명자들은 강력한 PRL-3 발현을 검출하였다. 간, 폐, 결장, 유방 및 신장 종양의 경우, 본 발명자들은 같은 기관에서 신선하게 동결된 동일 환자의 비-암성 조직을 얻을 수 있었고, 이로 인해 PRL-3 발현의 특이성(specificity)에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있었다. 놀랍게도, PRL-3는 상응하는 종양에서의 높은 발현에도 불구하고, 이와 매치되는 정상 조직에서는 검출되지 않았다 (도 4a-e). 요약하면, 이러한 결과는 PRL-3이 다양한 9개의 종양 유형(표 1)에서 평균 ≥78%에서 발현되는 광범위하고 종양-연관된 종양표적(oncotarget)임을 입증하고, 특히 긴급하고, 충족되지 않은 의학적 니즈를 갖는 이들에게 PRL-3가 여러 종류의 암 유형에서 우수한 종양표적(oncotarget)임을 강조한다. PRL3-zumab은 신규한 암 치료의 시급한 니즈에 적용될 수 있을 것이다.
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검토
본 발명은 본 발명자들의 이전 연구를 토대로, 어떻게 항체가 “세포내 종양 단백질”을 표적화하는지 분석할 수 있는 작용 분자에 대한 결정적 증거와 다양한 PRL-3-양성 인간 암 유형에 대한 PRL3-zumab의 미래의 치료적 가치를 제공한다. PRL-3가 110 개의 무작위로 분석된 신선한 동결 인간 암 샘플에서 > 78 %의 빈도로 존재하는 종양-연관 종양표적(oncotarget)이라는 발견과, 동소(orthotopic) 위암 모델에 대한 본 발명과 이전의 연구에서 동소(orthotopic) 간과 폐 종양에서 PRL3-zumab의 우수한 치료 효과를 입증하였으며(ref), 본 발명자들은 PRL3-zumab을 일반적인 다른 암 뿐만 아니라, PRL-3가 긴박하고 충족되지 않은 의학적 니즈를 갖는 급성 악성 종약의 획기적인 면역 요법 후보임을 다시 입증하였다.
근원적인 기능적 간 부전을 포함하는 간세포 암의 병리학적 복잡성으로 인해 간세포 암의 의학적 치료는 매우 난해하다. 또한, 이식 후 간세포 암의 재발은 임상적인 관련 문제로 남아있다. 간세포 암의 진행에 관련된 특정 분자의 변화를 규명하기 위한 이전의 노력들은 특히 간세포 암의 90% 이상이, 알코올 중독, B형 간염 또는 C형 간염의 감염 또는 간의 지방 축적과 같은 다양한 요인에 의해 발병하는 간병변에서 발전하는 것과 같이 다양한 병인학 때문에 실질적 성과를 거의 얻지 못했다. 간세포 암종의 이질성에 대한 증거로, 진행 간암에 대항하는 새로운 분자 표적 약물의 적어도 5 가지 주요 3 상 임상 시험이 지난 6 년 동안 실패하였다32. Sorafenib은 2.8달이라는 연장된 평균 생존 기간을 갖는, 진행 간세포암의 사망률을 개선한 최초의 치료법이다 12. 그러나, 진행 간세포암과 간 기능 장애(Child-Pugh B)를 갖는 환자에서 sorafenib을 이용한 치료는 생존 결과가 더 나쁘게 나타났다 33. 따라서 간세포암 환자에게 높은 치료 효능과 낮은 독성을 지닌 새로운 분자적 표적 약물의 발견이 시급한 실정이다. 본 발명에서는, PRL-3 과발현이 무작위로 분석된 간암 환자 샘플의 80 %에서 확인된 바, PRL-3 단백질이 상기 병적 질환의 일반 지표가 될 수 있다는 최초의 임상 증거를 제공한다. 흥미롭게도, 대부분의 인간 주요 기관에서는 PRL-3 단백질 발현이 결여되어 있어 6, PRL3-zumab은 36mg/kg(비공개 관찰값)의 높은 no-observed-adverse-event-level (NOAEL) 값을 나타내어, 비인간 영장류 독성 연구에서 내성이 좋은 것이 입증되었다. 본 발명의 동소 마우스 모델에서 PRL3-zumab의 항종양 효능은 안전하고 효과적인 치료방법으로써, PRL-3 양성(+) 간 세포암 환자에 대한 조기 임상 시험을 시작할 수 있는 강한 근거가 된다.
항체가 세포 내 종양 단백질을 인식하는 방법을 다루기 위해, 우리는 이전에 항체가 암 세포에 의해 흡수될 수 있는 것을 포함하여 작용기작 (MOA)에 대한 3가지 가능한 모델을 제공하였다 (CBT, 2008). 본 발명에서는 ‘세포 내 종양 단백질’을 ‘세포외 종양 단백질’로 표면화할 수 있는 증거를 제공함으로써 MOA를 통합하였고, 따라서 정상 조직이 아닌 종양 조직에서 특이적이고 지속적인 PRL-3의 상향 조절에 의해 뒷받침되는, PRL3-zumab의 항-종양 효과에 대한 기전적 설명과 함께 암 세포 살상 효과의 고전적인 경로를 따를 수 있었다. 실제로, 종양-연관 세포내 항원의 세포-표면 재배치(relocalization)는 치료적 개입을 위한 새로운 기회를 제공한다. 생체 내 염증(inflamentry), 종양 괴사, 종양 세포 사멸 용해물, 세포사멸(apoptosis)은 세포 내 단백질을 종양 미세환경으로 누출시키고 면역 반응을 촉발하는데 기여할 수 있다. PRL-3 이외에, heat-shock 단백질 70 (HSP70), heat-shock 단백질 90 (HSP90), glucose-regulated protein 78 (GRP78), 액틴(actin), 사이토케라틴(cytokeratins), 비멘틴(vimentin), 뉴클레오린(nucleolin), 뉴클레오좀(nucleosomes), 에스트로겐 수용체-알파 변이체((estrogen receptor-alpha variant 36, ER-α36), 및 feto-acinar pancreatic protein (FAPP)와 같이 다른 세포 내 단백질의 종양 연관된 세포-표면 재배치에 대해 기술된 바 있다(5). 암에서의 항체-기초요법에 적합한 새로운 항원 표적을 확인하는데 상당한 노력이 투여된 바, 여기서의 본 발명의 결과는, 악성으로 진행되는 동안의 고전적인 “세포 내에 있던” 세포질 및 핵 단백질의 세포-표면으로의 재배치가 더 주목할 만한 가치가 있는 일반적인 종양-특이적 현상일 수 있으며, 이는 암의 질병율과 사망률을 줄이기 위한 더 혁신적이고 합리적인 약물 디자인을 위한 토대가 될 수 있다.
본 발명자들은 세포 유형과 10% FBS 배양 배지의 인공적 조건으로 제한되어 생체 내 복잡성을 모방하는 것이 불가능한 세포 배양 시스템에서 생체 내 종양 세포 사멸 현상을 재현하는 것이 매우 도전적인 과제라는 것을 이해한다. 우리는 실험용 디쉬에서 암 세포를 사멸하는 약물은 그 자체의 독성 때문이라는 것을 깨달았다. 시험관 내에서 PRL-3 양성(+) 암세포에 PRL3-zumab 처리하여도 세포 성장을 억제하지 못하였음에도 불구하고, 이들 세포로부터 유래된 종양은 생체 내에서 PRL3-zumab에 의해 강력히 억제될 수 있다. 본 발명의 연구 결과는 이러한 현상에 대한 두 가지 설명을 제공한다. 첫째, 시험관 내에서 ADCC를 수행하는 배양 시스템에서 ‘세포외 PRL-3’의 양은 중요하지 않으나, 종양 세포에서는 PRL3-zumab-매개된 암 세포 사멸 효과를 촉발할 수 있을 만큼 충분히 그 수치가 상향 조절될 수 있다. 둘째로, 생체 내 시스템과 달리, 시험관 내 시스템은 PRL3-zumab에 의해 면역-매개 종양 세포 사멸을 유도하기 위해 필수적인 복잡한 숙주 요인을 재현하지 못한다.
이러한 결과는 생체 내 환경이 표적 단백질과 그 치료 반응의 약효에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 한다는 확실한 증거를 제공하며, 단순화된 배양 조건에 기초한 분석에서 간과 될 수 있는 현상이다. 이 맥락에서, 본 발명자들은 Fc-숙주 FcγR 상호 작용이 PRL3-zumab의 항-종양 효과에 필수적이며, 숙주 세포에서의 FcγR의 차단은 ADCC 및 ADCP에 참여하는 중요한 B 세포, NK 세포 및 M1 대식세포의 침윤 감소와 함께, PRL3-zumab 항종양 효과의 완전한 손실을 초래함을 알 수 있었다. 대식세포는 종양에 침투하는 면역 세포의 주요 집단 중 하나이며, 일반적으로 종양의 성장과 전이에 유리하게 작용한다. 이것은 주로, 진행 암에서 관찰되는 바와 같이, 종양이 진행되는 동안의 대식세포-분극화 현상이 M1에서 M2 표현형으로 분화를 유도하여 종양 탈출(tumor escape)을 촉진하기 때문이다. M1 세포는 높은 항균 활성, 면역-자극 기능 및 종양세포 독성을 갖는다. 최근의 메타 분석 연구에 따르면, 폐암 증례23와 위암 증례24 환자에서, 증가된 종양파괴성 M1의 침투와 유리한 생존율 사이에는 유의한 상관관계가 있음이 밝혀졌다. 중요한 것은, PRL3-zumab 치료는 M1의 특이적 증가를 가져 왔지만, M2 대식세포 축적은 없었다는 것이다. 이것이 항종양 표현형에 대한 M1/M2 양극성의 역전을 반영하는 것인지, M1 대식세포 모집의 특이적 촉진을 반영하는 것인지는 추가 연구가 필요하다. 흥미롭게도, PRL3-zumab에 의한 M1 종양파괴성 활성의 증진은 M1 TAM 편향화를 촉진하기 위한 사이토카인(예를 들어, GM-CSF, IFN-g, IL-12)에 의한 치료 뿐만 아니라, NF-kB 및 STAT1 경로를 표적으로 하는 것과 같은 다른 칼날의 TAM-표적 항-종양 전략과 함께 나란히 랭크된다 25. M1 대식세포 외에, PRL3-zumab 또한 NK 세포 및 B 세포의 침윤 및 항종양 효과를 FcγR-의존적 방식으로 촉진시켰다. NK 세포가 ADCC의 주요 작용자로 잘 알려져 있는 반면, 항-종양 반응에서 B 세포의 기능적 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 종래 본 발명자들은 B 세포의 성숙과 활성화가 결여된 유전자 변형 마우스 (muMT 마우스)에서 항 PRL-3 mAb가 PRL-3 종양을 억제하지 못한다는 것을 발견하고, B 세포의 항종양 역할을 예견한 바 있다. 여러 연구들은 종양 관련 B세포가 암 면역 감시에 기여하고 전이를 억제할 수 있음을 보여주었다. 원발성 인간 유방 및 난소 종양에서 B 세포의 높은 침투는 좋은 예후와 상관관계가 있는 것으로 알려졌다. 화학요법은 항-종양 B 세포 활성과 세포 내 축적을 촉진하여 더 나은 항-종양 반응과 상관관계가 있는 것으로 알려졌다. 반대로, B 세포 결핍은 T-세포 의존성 항-종양 세포독성 반응에 손상을 주고, 종양 성장을 촉진시킨다. 흥미롭게도, 고용량 화학 요법을 받고 자가 이식을 받은 림프종 환자의 회고분석에서, 고용량 화합요법 과정에서의 B 세포 고갈이 유의하게 높은 고형 종양 발생을 유도하였다. 종합하면, 본 발명자들은 일반적인 항암 치료의 기전적 효과에서 B 세포가 매우 중요한 역할을 담당하나 그 역할이 과소평가되어 있다는 가설을 세웠다.
본 발명에서 주요 면역세포 모집과 함께 항체 및 Fc 수용체의 Fc 기능에 대한 중요한 증거로부터, 본 발명자들은 PRL3-zumab의 작용 기전이 주로 세포 표면 PRL-3와의 결합을 포함하고, trastuzumab과 rituximab과 같은 다른 수용체 표적 항체와 유사하게, 고전적인 ADCC 또는 ADCP를 통해 항-종양 제거(anti-tumor clearance) 하는 것으로 제안한다. 본 발명의 독창적인 항체 표적인 ‘세포내 종양단백질’은, ‘세포-내 및 세포-외 종양 단백질’ 모두가 ADCC 및/또는 ADCP를 통한 면역-매개된 종양 세포 사멸을 따르기 때문에, 항체 치료와 함께 잠재적인 암-특이적 치료 표적의 커다란 세포 내 보배로써 추가 연구를 보장해준다. 본 발명의 선구자적인 새로운 암 치료법은 조만간 도래할 암 환자에게 이로운 암 면역요법의 새로운 시대를 기다리고 있다.
실시예 2에 대한 참고문헌
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90 95 Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 115 120 125 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Ser Lys Leu Gly 145 150 <210> 35 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 318 heavy chain variable region <400> 35 Glu Phe Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile 1 5 10 15 Ala Gly Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Ala Arg Pro His Leu Gln Thr Asn Pro Pro 85 90 95 Ala Gln Pro Thr Cys Ser Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Leu Arg Ser 100 105 110 Ile Ser Val Gln Val Arg Arg Glu Leu Pro Leu Val Cys Leu Leu Gly 115 120 125 Pro Arg Asp Ser Gly His Cys Leu Cys Ser Gln Asn Asp Thr Pro Ile 130 135 140 Arg Leu Ser Pro Gly Pro Trp Lys Leu Gly 145 150 <210> 36 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 318 light chain variable region <400> 36 Leu Val Asp Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 20 25 30 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala 35 40 45 Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln 50 55 60 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn 65 70 75 80 Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro 115 120 125 Ser Trp Lys 130 <210> 37 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PRL3 sequence <400> 37 Met Ala Arg Met Asn Arg Pro Ala Pro Val Glu Val Ser Tyr Lys His 1 5 10 15 Met Arg Phe Leu Ile Thr His Asn Pro Thr Asn Ala Thr Leu Ser Thr 20 25 30 Phe Ile Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Gly Ala Thr Thr Val Val Arg Val 35 40 45 Cys Glu Val Thr Tyr Asp Lys Thr Pro Leu Glu Lys Asp Gly Ile Thr 50 55 60 Val Val Asp Trp Pro Phe Asp Asp Gly Ala Pro Pro Pro Gly Lys Val 65 70 75 80 Val Glu Asp Trp Leu Ser Leu Val Lys Ala Lys Phe Cys Glu Ala Pro 85 90 95 Gly Ser Cys Val Ala Val His Cys Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Pro 100 105 110 Val Leu Val Ala Leu Ala Leu Ile Glu Ser Gly Met Lys Tyr Glu Asp 115 120 125 Ala Ile Gln Phe Ile Arg Gln Lys Arg Arg Gly Ala Ile Asn Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Thr Tyr Leu Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Gln Arg Leu Arg Phe 145 150 155 160 Lys Asp Pro His Thr His Lys Thr Arg Cys Cys Val Met 165 170 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binding sequence <400> 38 Lys Ala Lys Phe Tyr Asn 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binding sequence <400> 39 His Thr His Lys Thr Arg 1 5

Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 PRL3에 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 1의 HC-CDR1; 서열번호 2의 HC-CDR2; 및 서열번호 3의 HC-CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4의 경쇄 LC-CDR1; 서열번호 5의 LC-CDR2; 및 서열번호 6의 LC-CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    여기서, 상기 인간화 항체는 생체 내(in vivo)에서 PRL3에 결합할 수 있는 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CH1 및 CH2 도메인을 함유하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 KAKFYN 및/또는 HTHKTR를 포함하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 따른 PRL3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 선택적으로 분리된 인비트로 (in vitro) 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 16 내지 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7 내지 서열번호 15로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 따른 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 위암 또는 위암의 전이인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정맥 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료할 암으로부터 떨어져 있는 위치에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 위암 환자에 투여되는 인간화 항-PRL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 상기 환자는 이전에 위암에 대한 항대사 (antimetabolite) 치료를 받지 않았거나, 또는 이전에 항대사 (antimetabolite) 치료를 받지 않은 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항대사 (antimetabolite) 치료는 5-FU인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 환자는 손상된 면역체계를 갖지 않는 것으로 결정되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 세포에서 PRL3의 세포내 위치를 결정하는 단계를 포함하는 인비트로 (in vitro) 방법으로, 상기 방법은 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용한 면역분석법이고, 세포 표면에서 PRL3의 발현은 상기 세포가 암성인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포 표면에서 PRL3의 발현은 대조군 세포와 비교하여 2배 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
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