CN109476759A - Prl3抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合肝再生磷酸酶‑3(PRL3)的人源化抗体和所述抗体治疗癌症的应用。还请求保护测定PRL3在细胞中定位的体外方法，其中PRL3在细胞表面表达表明该细胞是癌性的。

Description

PRL3抗体
发明领域
本发明涉及结合PRL3的人源化抗体。
背景技术
癌症从根本上讲是一种基因表达紊乱的疾病，导致多步骤进展为转移(1)，这是癌症相关死亡的主要原因(2)。越来越多的证据表明蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)在驱动转移性进展中发挥重要作用(3)。我们在1998年鉴定了肝再生磷酸酶-3(PRL-3；也称为PTP4A3)，作为PRL家族双特异性PTP的成员(4)，其由三个成员组成：PRL-1、PRL-2、和PRL-3。2001年，弗格斯汀小组将PRL-3表征为转移相关磷酸酶，特异性地在转移性结直肠癌样本中高度上调，但不是原发性癌症和正常结直肠上皮细胞(5)。在最近的独立全球基因表达研究中，PRL-3也被确定为葡萄膜黑色素瘤患者转移复发的最重要预测因子(6)。临床上，PRL-3 mRNA表达水平升高与多种癌症类型的高转移潜能和预后不良有关，包括结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌(7)。
PRL通过其异戊烯化的C-末端定位于质膜和内体的细胞质面(8)。越来越多的证据表明，PRL-3促进恶性转化的多个阶段，包括细胞增殖、上皮-间质转化(EMT)、侵染、运动、血管生成和存活(9)。分子学上，PRL-3已被证明通过下调PTEN可间接激活PI3K/Akt通路(10)，并通过多种上游受体酪氨酸激酶的组成型激活激活致癌ERK和SRC信号(11-13)。
PRL-3在2004年首次与GC进展相关联，当时发现较高的PRL-3水平与GC侵袭性和转移增加相关(14)。从那时起，据报道PRL-3在多达70％的原发性胃癌中过度表达，在GC患者的所有肿瘤阶段，PRL-3表达水平越高，术后生存期越短(15,16)。PRL-3的这种预后潜力尤其重要，因为GC在全球范围内成为癌症死亡率的第三大原因，每年有超过700,000例与胃癌相关的死亡(2)，很大程度上是由于检测延迟和早期疾病的无症状性，加上治疗后的高复发率(17)。尽管失败率很高，但根治性手术仍然是GC的标准治疗形式，辅助化疗通常被认为是切除前和/或切除后(18,19)。尽管如此，化疗的总体存活率仍然很差，并且由于非特异性靶向其他活跃分裂的非癌细胞而伴有不良副作用(17)。为此，使用肿瘤特异性生物制剂的靶向治疗已成为抗癌药物开发的焦点，因为它们有可能选择性地抑制参与癌细胞生长和存活的特定分子，同时保留正常细胞。目前的抗体疗法仅针对细胞外(细胞表面或分泌的)蛋白质，因为通常认为抗体太大而不能进入细胞，留下大量的细胞内治疗靶点，例如磷酸酶、激酶和转录因子，未被抗体疗法所利用。例如，在GC中，HER2/neu受体拮抗剂曲妥珠单抗(赫赛汀)已被批准用于靶向表达细胞表面HER2/neu受体的13-20％的GCs，特别是转移性胃或胃食管连接腺癌(20,21)。然而，尽管反应温和，但患者常常对曲妥珠单抗产生耐药性(22)，从而阻碍其疗效。因此迫切需要并且正在积极地寻求用于GC的替代靶向疗法。
2008年，我们报道了抗体治疗的新方法，靶向细胞内PRL-1和PRL-3抗癌药(23)。在该报告中，我们发现抗PRL-3抗体抑制表达PRL-3(但不是PRL-1)的癌细胞的实验性转移，而抗PRL-1抗体抑制表达PRL-1(但不是PRL-3)的癌细胞，因此，当靶向这种细胞内癌蛋白时，对于治疗功效的特异性抗体-抗原识别建立了严格的要求。在此之后，2011年，我们验证了这一新概念的可行性和有效性，在野生型C57BL/6和转基因自发性乳腺肿瘤MMTV-PyMT小鼠中通过抗体治疗或疫苗接种靶向其他内源性和外源性细胞内“肿瘤特异性抗原”(24)。我们和Ferrone提出了三种可能的细胞内肿瘤抗原(TA)特异性抗体的抗肿瘤活性机制，包括抗体渗透到细胞中、抗体与外化抗原结合和/或MHC结合抗原衍生肽的抗体识别(25,26)。
在小鼠和最近的嵌合(27)抗PRL-3抗体靶向表达PRL-3的肿瘤成功之后，我们在此将我们的方法转化为一个更具临床相关性的四个关键方面：1)使用PRL-3人源化抗体(PRL3-珠单抗(PRL3-zumab))代替小鼠或嵌合抗体；2)靶向人癌细胞系而不是小鼠癌细胞系；3)开发更多临床相关的原位胃肿瘤模型而不是小鼠尾静脉转移模型；4)鉴定用于监测PRL3-珠单抗治疗功效的潜在替代生物标志物。我们展示了一类新的人源化抗体阻断胃肿瘤发生的第一个例子。我们的研究结果揭示了抗体治疗靶向细胞内癌蛋白的潜力，开创了癌症治疗的新时代。
发明概述
脱靶效应是癌症治疗的主要临床问题。我们生产了一种针对肿瘤特异性细胞内PRL-3的一流人源化抗体(PRL3-珠单抗)，这是一种在多种人类癌症中上调的致癌磷酸酶。我们专注于胃癌(GC)，提供独立证据表明PRL-3 mRNA水平升高与GC患者的总体生存期缩短显著相关。PRL-3蛋白在85％的新鲜冷冻的GC肿瘤中过表达，但在检查的患者匹配的正常胃组织中没有。使用人类GC细胞系，我们建立了临床相关的原位胃肿瘤模型，并证明PRL3-珠单抗特异性阻断PRL-3阳性(PRL-3+)的生长，但不抑制PRL-3阴性(PRL-3)肿瘤的生长。PRL-3-珠单抗作为单一疗法具有比单独使用5-氟尿嘧啶(5-FU)或5-FU更好的治疗效果。PRL3-珠单抗特异性地富集在PRL-3+肿瘤组织中并促进免疫细胞募集至PRL-3+肿瘤微环境。出乎意料的是，我们在62％的多种人类癌症尿液和100％来自PRL-3+的癌症尿液中发现了分泌的PRL-3癌蛋白，而不是PRL-3荷瘤小鼠。此外，用PRL3-珠单抗有效治疗后，尿PRL-3水平显著降低。尿PRL-3可被认为是未来多种癌症类型中PRL3-珠单抗治疗的治疗反应监测的潜在诊断和替代生物标志物。
我们还研究了作用机制(MOA)以解决PRL-3抗体如何可能与其细胞内PRL-3抗原结合，并得出结论，“细胞内癌蛋白”确实可以作为癌症中的“细胞外癌蛋白”重新定位到细胞表面，因此，通过针对细胞外癌靶标的抗体常规途径，遵循肿瘤消除的合理基础。
一致地，我们发现PRL3-珠单抗阻断表达PRL-3‘细胞内’抗原的肿瘤，需要宿主FcγII/III受体相互作用，完全抗体活性，并且增加M1(但不是M2)巨噬细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞以增强宿主免疫。这些结果表明，靶向“细胞内癌蛋白”的抗体的MOA确实遵循通过经典抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或吞噬(ADCP)途径靶向“细胞外癌蛋白”以消除肿瘤的类似原理。
最后，使用110个珍贵的新鲜冷冻人类肿瘤或其匹配的正常组织，我们进一步证明了PRL-3是一种优良的肿瘤特异性癌靶点，平均≥78％来自9种不同的人类癌症类型中广泛过表达：肝、肺、结肠、乳腺、胃、膀胱、前列腺、AML和肾病患者肿瘤样本，但不在匹配的正常组织中表达。因此，PRL-3可能是癌症的有用生物标志物，并且是癌症治疗的极为普遍的靶标。因此，PRL-3可以为实体癌提供有用的生物标志物。
本发明涉及与PRL3结合的抗体或抗原结合片段。还公开了重链和轻链多肽。抗体、抗原结合片段和多肽可以以分离和/或纯化的形式提供，并且可以配制成适合用于研究、治疗和诊断的组合物。特别地，本发明涉及结合PRL3的人源化抗体，特别是PRL3拮抗剂抗体。
在一些情况下，本发明的抗体抑制PRL3的功能。在一些情况下，抗体抑制PRL3的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)功能。在一些情况下，抗体诱导ADCC和/或ADCP。在一些情况下，抗体能够结合Fc受体，例如FcRII和/或FcRIII。在一些情况下，抗体与细胞的结合导致免疫细胞，例如B细胞、NK细胞或巨噬细胞，优选M1巨噬细胞募集到细胞。
在本发明的一个方面，提供了抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi)：
i)KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
ii)AASNLES(SEQ ID NO：5)
iii)QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
iv)GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
v)WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
vi)EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
或其变体，其中序列(i)至(vi)中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
抗体或抗原结合片段可包含至少一个含有以下CDR的轻链可变区：
LC-CDR1：KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
抗体或抗原结合片段可以包含至少一个含有以下CDR的重链可变区：
HC-CDR1：GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
所述抗体可以包含至少一个含有图7所示CDR的轻链可变区。所述抗体可以包含至少一个含有图7所示CDR的重链可变区。
所述抗体可以包含至少一个包含图7中所示的氨基酸序列之一的轻链可变区(VL)，或与图7中所示的VL链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的氨基酸序列。所述抗体可具有与图7中所示的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性V的L链氨基酸序列，并包含以下CDR序列：
LC-CDR1：KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
所述抗体可以包含至少一个包含图7中所示的氨基酸序列之一的重链可变区(VH)，或与图7中所示的VH链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的氨基酸序列。所述抗体可具有与图7中所示的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的VH链氨基酸序列，并包含以下CDR序列：
HC-CDR1：GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
所述抗体可包含至少一个包含图7中所示的氨基酸序列之一的轻链可变区(或与图7中所示的VL链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的氨基酸序列)和至少一个包含图7中所示的氨基酸序列之一的重链可变区(或与图7中所示的VH链氨基酸序列的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的氨基酸序列)。
所述抗体可以结合至PRL3。所述抗体可以任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgM或IgM，优选IgG。在一个实施方案中，提供了任选分离的体外复合物，该复合物包含与PRL3结合的本文所述的抗体或抗原结合片段。
在本发明的一个方面，提供了分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包含以下CDR：
HC-CDR1：GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
在本发明的一个方面，提供抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链包含分别与HC-CDR1序列(SEQ ID NO：1)、HC-CDR2序列(SEQ ID NO：2)、HC-CDR3序列(SEQ ID NO：3)具有至少85％的总体序列相同性的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3，轻链包含分别与LC-CDR1序列(SEQ ID NO：4)、LC-CDR2序列(SEQ ID NO：5)、LC-CDR3序列(SEQID NO：6)具有至少85％的总体序列相同性的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3。
在一些实施方案中，序列相同性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
在本发明的另一方面，提供了任选分离的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
重链序列与图7中所示的重链序列具有至少85％的序列相同性，和
轻链序列与图7中所示的轻链序列具有至少85％的序列相同性。
在一些实施方案中，序列相同性程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多肽还根据HCFR1：HC-CDR1：HCFR2：HC-CDR2：HCFR3：HC-CDR3：HCFR4的排列在CDR之间包含可变区重链框架序列。所述框架序列可以源自人共有框架序列。
在一些情况下，抗体、抗原结合片段或多肽包含选自以下的重链序列：
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV(SEQ ID NO：29)；
WIYPGNVNTYYNEKFR(SEQ ID NO：30)；
ASTAYMELSSLRSE(SEQ ID NO：31)；和/或
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT(SEQ ID NO：32)。
在本发明的一个方面，提供了分离的轻链可变区多肽，任选地与如本文所述的重链可变区多肽组合，该轻链可变区多肽包含以下CDR：
LC-CDR1：KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多肽还根据LCFR1：LC-CDR1：LCFR2：LC-CDR2：LCFR3：LC-CDR3：LCFR4的排列在CDR之间包含可变区轻链框架序列。所述框架序列可以源自人共有框架序列。
在一些情况下，抗体、抗原结合片段或多肽包含选自以下的轻链序列：
QSPSSLSASVGDRVT(SEQ ID NO：26)；
KASQSVEDDGENYMNWYQQK(SEQ ID NO：27)；和/或
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT(SEQ ID NO：28)。
在一些情况下，抗体、抗原结合片段或多肽包含2、3、4、5、6或所有选自以下的氨基酸序列：
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV；
WIYPGNVNTYYNEKFR；
ASTAYMELSSLRSE；
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT；
QSPSSLSASVGDRVT；
KASQSVEDDGENYMNWYQQK；和/或
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT。
所述抗体可包含至少一个轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，其包含图7中所示的氨基酸序列之一或与图7中所示的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，并包含以下CDR序列：
LC-CDR1：KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
HC-CDR1：GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
并包含以下至少一个序列：
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV；
WIYPGNVNTYYNEKFR；
ASTAYMELSSLRSE；
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT；
QSPSSLSASVGDRVT；
KASQSVEDDGENYMNWYQQK；和/或
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT。
所述抗体可包含至少一个轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，其包含图7中所示的氨基酸序列之一或与图7中所示的氨基酸序列之一具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
所述抗体可包含至少一个选自以下的轻链可变区(VH)：SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25、或与氨基酸序列SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：NO：24或SEQ ID NO：25具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
优选地，所述抗体包含选自以下的轻链可变区(VH)：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22，或与氨基酸序列SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21或SEQ ID NO：22具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
所述抗体可包含至少一个选自以下的轻链可变区(VL)：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15，或与氨基酸序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
优选地，所述抗体包含选自以下的轻链可变区(VL)：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12，或与氨基酸序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
抗体可包含以下CDR序列：
LC-CDR1：KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
HC-CDR1：GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
并包含以下至少一个序列：
VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWV；
WIYPGNVNTYYNEKFR；
ASTAYMELSSLRSE；
ASEEKNYPWFAYWGQGTLVT；
QSPSSLSASVGDRVT；
KASQSVEDDGENYMNWYQQK；和/或
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFT；
并且能够结合PRL3，并拮抗PRL3的生物学功能。
在一些实施方案中，抗体或抗体结合片段可进一步包含人恒定区。例如选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4之一。
在一些实施方案中，抗体或抗体结合片段可进一步包含鼠恒定区。例如选自IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3之一。
抗体优选为完整抗体，或包含Fc结构域的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可包括CH1和CH2结构域中的一个或两个。优选地，抗体包括CH2结构域。抗体可含有CH1和CH2结构域。优选地，抗体不是Fab’、F(ab)’2片段，和/或不是scFv和/或不是微抗体。优选地，抗体是IgG免疫球蛋白。
在一些方面，待治疗的个体是免疫活性的。个体可能已被确定具有免疫活性。个体可能已被确定产生NK细胞和/或B细胞。个体可以被治疗以刺激NK细胞和/或B细胞的产生和/或活化，例如通过施用细胞因子，或通过停止施用已知能减少NK细胞和/或B细胞的产生和/或活化的试剂。
在本发明的另一方面，提供了一种组合物，例如药物组合物或药物。所述组合物可以包含本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽和至少一种药学上可接受的载体，赋形剂，佐剂或稀释剂。
在本发明的另一方面，提供了编码本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽的分离的核酸。所述核酸编码图7所示的序列，或是由于遗传密码子简并后的编码序列，或者可以具有与其至少70％，任选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的核苷酸序列。
抗体可以与PRL3结合。抗体可以与包含氨基酸序列KAKFYN和/或HTHKTR的表位结合。抗体可能能够结合两种序列。
在本发明的一个方面，提供了包含本文所述核酸的载体。在本发明的另一方面，提供了包含所述载体的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是真核生物，或哺乳动物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)，或人的细胞或可以是原核细胞，例如大肠杆菌。在本发明的一个方面，提供了一种制备本文所述的抗体或抗原结合片段或多肽的方法，所述方法包括在适于表达编码所述抗体或抗原结合片段或多肽的载体的条件下培养本文所述的宿主细胞，并回收所述抗体或抗原结合片段或多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗或用于医学治疗方法的抗体、抗原结合片段或多肽。在本发明的另一方面，提供用于治疗T细胞功能障碍的本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽。在本发明的另一方面，提供了本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽在制备用于治疗T细胞功能障碍的药物或药物组合物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了一种方法，该方法包括使含有或怀疑含有PRL3的样品与如本文所述的抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体或抗原结合片段和PRL3的复合物的形成。
在本发明的另一方面，提供了一种诊断受试者的疾病或病症的方法，该方法包括在体外使来自受试者的样品与抗体或抗原结合片段接触，如本文所述，并检测抗体或抗原结合片段和PRL3的复合物的形成。
在本发明的另一方面，提供了如本文所述的抗体或抗原结合片段在体外用于检测PRL3的用途。在本发明的另一个方面，提供了如本文所述的抗体或抗原结合片段作为体外诊断剂的用途。
在本发明的方法中，抗体、抗原结合片段或多肽可以作为如本文所述的组合物提供。
在本发明的任何方面，抗体优选特异性结合PRL3而不是其他PRL磷酸酶，例如PRL1或PRL2。
抗体可以是IgG。它可具有约140至160kDa的分子量，优选约150kDa。
在一些实施方案中，抗体可以是PRL3-珠单抗。
本文还公开了如本文公开的人源化抗体或抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在其他方面，提供了用于治疗癌症的方法的人源化抗体或抗体结合片段。该抗体可用于抑制肿瘤形成和/或抑制肿瘤转移。抗体可用于减小肿瘤的大小。例如，与未治疗的个体相比，或与治疗前相同的个体相比，治疗的个体可能显示特定肿瘤的肿瘤大小减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，或肿瘤数量减少，或两者兼有。
还提供了治疗癌症的方法，包括施用本文公开的人源化抗体或抗体结合片段。
癌症可以是表达或过表达PRL3的癌症。癌症可以是胃癌。
人源化抗体或抗体结合片段可以静脉内施用。它可以在远离待治疗的癌症的部位施用。
在一些方法中，患者先前未接受过化学疗法，特别是抗代谢疗法，例如5-FU。在一些情况下，患者之前没有接受过这种治疗，或者没有接受过这种以治疗他们的癌症，例如胃癌。在一些情况下，抗体不与另一种药剂共同施用(即抗体单一疗法)。在一些情况下，抗体不与5-FU共同施用。
在一些方法中，已经确定患者没有免疫系统受损。具体地，患者的白细胞计数可能已经确定在正常范围内。具体地，可能已经确定患者没有白细胞减少症。可能已经确定患者的嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞或血小板计数在正常范围内。患者的白细胞计数、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞或血小板计数与对照组，例如来自已知未患免疫系统受损的个体的计数，或与已建立的正常值无显著差异。例如，可以确定患者每微升血液具有约4,500至约10,000个白细胞。
在一些方面，本发明提供了为用人源化抗PRL3抗体或抗体片段治疗选择患者的方法，该方法包括在来自患者的尿液样品中测定PRL3的存在。在一些情况下，该方法涉及确定来自患者的尿液样品中PRL3的水平。在一些情况下，患者可能患有胃癌、鼻咽癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌或前列腺癌。
在某些情况下，个体有PRL3过表达癌症的家族史，或已被确定有可能产生过表达PRL3的癌症。在某些情况下，个体患有过表达PRL3的癌症，并且被认为具有该癌症转移的风险。
另一方面，本文提供了涉及确定PRL3的细胞定位的方法。细胞表面上细胞PRL3的比例增加可能表明个体患有癌症。本文提供了一种方法，包括确定细胞中PRL3的细胞定位，其中PRL3在细胞表面的表达表明细胞是癌性的。
方法包括用于诊断癌症的方法，其中细胞表面上PRL3的存在或增加可以指表明个体患有癌症。在某些情况下，细胞中PRL3的量与非癌性对照样品相同，但是与非癌性对照相比，PRL3的定位可以改变。
其他方法包括用于确定细胞是否癌变的方法，该方法包括确定细胞表面的PRL3的存在。与对照细胞相比，PRL3的水平或比例的增加可以表明个体已经或将要变成(具有)癌症。
方法可以包括基于样品中PRL3的细胞定位来选择抗癌疗法的个体。在一些情况下，该方法涉及对这样选择的个体施用抗癌疗法。
在一些情况下，该方法可以包括在两个或更多个时间点测定来自患者的两个或更多个样品中PRL3的细胞定位。细胞表面上PRL3的量的变化可以指示个体中癌症的增加或减少。细胞表面PRL3随时间的增加可能表明个体已经患上癌症，或者癌症已经恶化。细胞表面PRL3随时间的减少可能表明癌症已经减少，或者治疗已经导致癌症的治疗。细胞表面PRL3水平的增加或不变可能表明需要额外的或替代的抗癌疗法。因此，细胞表面的PRL3水平可用于为进一步或替代的抗癌疗法选择个体。
细胞表面PRL3增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍可能表明个体有癌症，和/或细胞是癌性的，或者应该选择该个体进行治疗。可以将细胞表面的PRL3水平与对照进行比较。
样品可以是血液样品或血清样品。样品可以是尿液样品。癌症可以是肿瘤或肿瘤周围组织的样品。该方法可以包括获得样品，或者该方法可以对先前从个体获得的样品进行。
诊断和检测方法可以在体外或离体进行，在一些情况下不涉及从个体获得样品的步骤。
描述
抗体
本发明的抗体优选结合PRL3(抗原)，任选地Kd为5pM至8pM，优选6-7pm，优选约6.3pM。在某些情况下，抗体的解离率约为7×10-5s-1。例如，在大约1×10-5s-1和1×10-6s-1之间。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合PRL3，但不结合PRL1或PRL2。
本发明的抗体可以以分离的形式提供。
就“抗体”而言，我们包括其片段或衍生物，或合成抗体或合成抗体片段。
鉴于目前关于单克隆抗体技术的技术，可以制备出针对大多数抗原的抗体。抗原结合部分可以是抗体的一部分(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如单链Fv片段[ScFv])。针对所选抗原的合适单克隆抗体可以通过已知技术制备，例如在“单克隆抗体：技术手册”，H Zola(CRC出版社,1988)和“单克隆杂交瘤抗体：技术和应用”，J G R Hurrell(CRC出版社,1982)。Neuberger等(1988,第八届国际生物技术论坛(8th InternationalBiotechnology Symposium)部分2,792-799)讨论了嵌合抗体。
单克隆抗体(mAb)可用于本发明的方法，并且是特异性靶向抗原上单个表位的抗体的均质群体。因此，结合PRL3的mAb可用于治疗癌症。
抗体的抗原结合片段，例如Fab和Fab2片段也可以与遗传工程改造的抗体和抗体片段一样提供。抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)结构域参与抗原识别，这一事实首先通过早期蛋白酶消化实验识别。通过啮齿动物抗体的“人源化”进一步确认。啮齿动物来源的可变结构域可以融合到人源的恒定结构域，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 81,6851-6855)。
本发明的抗体和抗体结合片段已经人源化。人源化抗体是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已经被修饰以增加它们与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”过程通常应用于开发用于人类施用的单克隆抗体。当开发特异性抗体的过程涉及在非人免疫系统，例如小鼠，中产生时，“人源化”过程可能是必要的，因为这样的抗体在施用于人类患者时可能是免疫原性的。人源化可涉及取代分子的Fab部分中的选择性氨基酸。或者，人源化可涉及将合适的CDR编码区段插入人抗体支架中。
抗原特异性由可变结构域赋予且独立于恒定结构域，这是从涉及抗体片段的细菌表达的实验中得知的，所述抗体片段全部含有一个或多个可变结构域。这些分子包括Fab样分子(Better等(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science 240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配对结构域通过柔性寡肽连接(Bird等(1988)Science 242,423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 85,5879)和包含分离的V结构域的单结构域抗体(dAbs)(Ward等(1989)Nature 341,544)。参与合成保留其特异性结合位点的抗体片段的技术的一般综述可在Winter和Milstein(1991)Nature 349,293-299中找到。
“ScFv分子”是指VH和VL配对结构域共价连接(例如通过柔性寡肽)的分子。
Fab，Fv，ScFv和dAb抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，从而允许容易地产生大量的所述片段。
全抗体和F(ab')2片段是“二价”的。“二价”是指所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab，Fv，ScFv和dAb片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。与PRL3结合的合成抗体也可以使用本领域熟知的噬菌体展示技术来制备。
抗体可以通过亲和力成熟的过程产生，其中产生与未修饰的亲本抗体相比，抗体对抗原的亲和力有改善的修饰抗体。亲和力成熟抗体可以通过本领域已知的方法生产，例如Marks等,Rio/Technology 10:779-783(1992)；Barbas等Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等Gene 169:147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):331 0-15 9(1995)；和Hawkins等J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
本发明的抗体优选表现出与PRL3的特异性结合。特异性结合靶分子的抗体优选以更高的亲和力结合靶标，和/或以比结合其他靶标更长的持续时间结合靶标。在一个实施方案中，抗体与不相关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合的约10％，例如通过放射免疫测定法(RIA)测定。
本发明的抗体的解离常数(Kd)优选≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤100pM之一。通常依据其解离常数(Kd)来描述抗体对其靶标的结合亲和力。结合亲和力可以通过本领域已知的方法，例如通过用抗体的Fab版本和抗原分子进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量。
本发明的抗体可以是“拮抗剂”抗体，其抑制或降低与其结合的抗原的生物活性。阻断PRL3可以抑制或降低PRL3的磷酸酶活性。在一些情况下，抗体结合但不一定影响PRL3的活性。
在某些方法中，抗体是PRL3-珠单抗，或PRL3-珠单抗的变体。PRL3-珠单抗包含以下CDR序列：
轻链：
LC-CDR1:(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：(SEQ ID NO：6)
重链：
HC-CDR1:(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：(SEQ ID NO：3)
CDR序列由Kabat定义确定。
具有如本文所述的CDR抗体分子的结构通常是抗体分子的重链或轻链序列或其实质部分，其中CDR位于对应于重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以参考Kabat,E.A.等，免疫学蛋白质序列.第4版.美国卫生与公众服务部,1987年及其更新。有许多学术和商业在线资源可用于查询此数据库。例如，参见Martin，A.C.R.通过计算机访问Kabat抗体序列数据库蛋白质：结构，功能和遗传学，25(1996)，130-133以及相关的在线资源，目前在万维网地址bioinf.org.uk/abs/simkab.html。
本发明的抗体可以包含PRL3-珠单抗的CDR，或SEQ ID NOs 1-6之一的CDR。在本发明的抗体中，六个CDR序列中的一个或两个或三个或四个可以变化。变体可以在六个CDR序列中的一个或两个中具有一个或两个氨基酸取代。
抗PRL3-珠单抗克隆的VH和VL链的氨基酸序列示于图7。
轻链和重链CDR也可以尤其用于与许多不同框架区结合使用。因此，具有LC-CDR1-3或HC-CDR1-3的轻链和/或重链可以具有替代的框架区。合适的框架区在本领域中是众所周知的，并且例如在M.Lefranc和G.Le:franc(2001)"The Immunoglobulin FactsBook",学术出版社中被描述，其通过引用并入本文。
在本说明书中，抗体可以具有VH和/或VL链，其包含与图7的一个或多个VH和/或VL氨基酸序列具有高百分比序列相同性的氨基酸序列。
例如，本发明的抗体包括结合PRL3并具有VH链的抗体，所述VH链具有与图7所示的氨基酸序列的一个或多个具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
本发明的抗体可以被可检测地标记或至少能够检测。例如，抗体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或可以以任何其它方式容易被检测的分子进行标记。合适的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物和放射性标记。结合部分可以用可检测标记直接标记，或者可以间接标记。例如，结合部分可以是未标记的抗体，其可以被自身进行了标记的另一抗体检测。或者，第二抗体可能具有与其结合的生物素，并且将标记的链霉亲和素与所述生物素结合用于间接标记第一抗体。
尽管本文描述了多种抗体片段，但抗体优选为完整抗体，其含有抗体结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)。抗体可以由两条重链和两条轻链组成。它包含提供抗体的抗原特异性的可变片段(Fv)和恒定结构域。
本发明的抗体片段优选包括CH2结构域。抗体的CH2结构域在介导效应子功能和保持抗体稳定性中起重要作用。因此，本发明的抗体片段优选不是Fab'、F(ab)’2、scFv或微抗体。
本发明的抗体和片段优选能够与Fcγ(Fc-γ)受体，优选FcγII(CD32)和FcγIII(CD16)受体相互作用。
检测方法
本文所述的抗体或抗原结合片段可用于涉及将所述抗体或抗原结合片段与PRL3结合的方法。这样的方法可能涉及检测抗体或抗原结合片段和PRL3的结合复合物。因此，在一个实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括将含有或怀疑含有PRL3的样品与本文所述的抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体或抗原结合片段和PRL3的复合物的形成。
合适的方法模式在本领域中是众所周知的，包括免疫测定，例如夹心测定法如ELISA。该方法可以包括将抗体或抗原结合片段或PRL3或两者用可检测标记(例如荧光、发光或放射性标记)进行标记。
这种方法可以提供需要PRL3检测和定量的疾病或病症的诊断方法的基础。这样的方法可以在体外在患者样品上进行，或者在患者样品的加工之后进行。一旦收集到样品，就不需要患者在实施用于诊断的体外方法时在场，因此该方法可以是不在人体或动物体上实施的方法。
这样的方法可以涉及测定患者样品中存在的PRL3的量。该方法还可以包括将测定的量与标准或参考值进行比较，作为达到诊断的过程的一部分。其他诊断测试可与本文所述的相结合，以增强诊断或预后的准确性，或确认通过使用本文所述测试获得的结果。
在PRL3样品中的检测可以用于诊断患者的癌性病症的目的，诊断为癌性病症的倾向或提供癌性病症的预后(预测)。诊断或预后可能涉及可能是良性或恶性的现有(先前诊断的)癌性病症，可能涉及疑似的癌性病症，或可能涉及患者(可能以前未被诊断的)癌性病症的筛查。
样品可以从任何组织或体液中取出。样品可以包括或可以来源于：一定量的血液；来自个体血液的一定量的血清，其可能包含除去纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的流体部分；组织样本或活检；或从所述个体分离的细胞。
本发明的方法优选在体外进行。术语“体外”旨在包括用培养物中的细胞的实验，而术语“体内”旨在包括用完整的多细胞生物体的实验。
治疗应用
本发明的抗体、抗原结合片段和多肽以及包含此类试剂的组合物可提供用于医学治疗方法中。可以向需要治疗的患有疾病或病症的受试者提供治疗。该疾病或病症可能是癌症，包括转移性癌症。
抗体，抗原结合片段或多肽的施用优选为“治疗有效量”，这足以对个体显示益处。施用的实际量、施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗方案，例如关于剂量等的决定，由全科医生和其他医生负责，并且通常考虑到待治疗的疾病、个体患者的状况、递送部位、给药方法和从业者已知的其他因素。上面提到的技术和方案的例子可以在雷明顿药学大全,第20版,2000年出版.Lippincott,Williams&Wilkins.中找到。
与未接受治疗的患者相比，本文所述的方法和组合物适当地能够改善应用治疗的个体的可测定标准。
为此目的，可以指定许多反映癌症的进展或患者的健康的标准。有用的标准可包括肿瘤大小、肿瘤尺寸、肿瘤最大尺寸、肿瘤数量、肿瘤标志物(如甲胎蛋白)的存在、转移的程度或数量等。
因此，作为例子，通过适当的测定或测试测量，经治疗的个体可显示肿瘤大小或数量的减少。与未接受治疗的个体相比，治疗的个体可以显示例如，特定肿瘤的肿瘤大小减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，或肿瘤数量减少，或两者兼具。术语增殖性疾病在本文中以广义使用，包括需要控制细胞周期的任何疾病。具体地，增殖性疾病包括恶性和肿瘤前疾病。这里描述的方法和组合物在治疗或诊断腺癌方面特别有用，例如：小细胞肺癌、肾癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌。例如，可治疗的恶性肿瘤包括急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管内皮细胞瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、绒毛膜癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌精原细胞瘤、胚胎癌、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、松果体瘤、10血管母细胞瘤、声学神经瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、黑色素瘤、中性母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
就本说明书而言，术语“癌症”可包括以下任何一种或多种：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、女性生殖系统癌、男性生殖系统癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌和直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、下咽癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性胸腺瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经系统癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿系统癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。
治疗可以导致癌症症状的缓解，或者可以导致癌症的完全治疗。治疗可以减缓癌症的进展，或者可以防止癌症症状的恶化。
制备药学上有用的组合物和药物
本发明的抗体、抗原结合片段和多肽可以配制成用于临床应用的药物组合物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
根据本发明，还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，这种生产方法可以包括选自下组的一个或多个步骤：分离本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽；和/或将分离的本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗T细胞功能障碍性疾病的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。
癌症
癌症可以是任何不想要的细胞增殖(或任何通过不想要的细胞增殖表现的疾病)、赘生物或肿瘤，或不想要的细胞增殖、赘生物或肿瘤的风险或倾向增加。癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性的(转移性)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。
待治疗的肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢或外周神经系统，例如神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例如黑素瘤、间皮瘤，淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌，前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤。
在特别优选的方面，癌症是表达PRL3的癌症。在某些情况下，癌症是过表达PRL3的癌症。也就是说，癌症与PRL3的过表达相关或由其引起。PRL3不需要在癌症中起作用，而是可以是癌细胞的标记或现象。在特别优选的方面，癌症是胃癌、鼻咽癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌或前列腺癌。癌症可能是急性髓性白血病、结肠癌或卵巢癌。在某些情况下，癌症是转移性癌症。
同时或依次施用
取决于待治疗的病症，组合物可以单独或与其它治疗组合施用，或者同时或依次给予。
在本说明书中，本发明的抗体、抗原结合片段或多肽和抗感染剂或化学治疗剂(治疗剂)可以同时或依次施用。
在一些实施方案中，使用本发明的抗体、抗原结合片段或多肽进行治疗可伴随着化学疗法。
同时施用是指将抗体、抗原结合片段或多肽和治疗剂一起施用，例如作为含有两种试剂的药物组合物(组合制剂)，或者彼此紧密衔接，并且任选地经由相同的施用途径，例如施用到同一动脉、静脉或其他血管。
依次施用是指施用抗体、抗原结合片段或多肽或治疗剂之一随后在给定的时间间隔之后，分开施用其它药剂。不要求两个试剂通过相同的途径施用，尽管在一些实施方案中是这种情况。时间间隔可以是任何时间间隔。
化疗
化疗是指用药物或电离辐射治疗癌症(例如使用X射线或γ射线的放射治疗)。在优选的实施方案中，化疗是指用药物治疗。所述药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、核酸或肽适体、核酸(例如DNA，RNA)、肽、多肽、或蛋白质。所述药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂，赋形剂或载体。
治疗可能涉及一种以上药物的施用。所述药物可以单独施用或与其他治疗组合施用，或者同时或依次，取决于待治疗的病症。例如，化疗可以是涉及施用两种药物的联合治疗，其中一种或多种可以用于治疗癌症。
化疗可以通过一种或多种给药途径施用，例如肠外、静脉注射、口服或肿瘤内。
化疗可以根据治疗方案执行。治疗方案可以是可由内科医师或医师准备的预定时间表、计划、方案或化疗方案，并且可以被定制以适合需要治疗的患者。
治疗方案可以指示一种或多种：施用于患者的化学疗法的类型；每种药物或辐射的剂量；施用(给药)之间的时间间隔；每次治疗的长度；任何治疗间歇(如果有的话)的数量和性质等。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，其指示每种药物如何施用。
化疗药物可以选自：
·烷化剂如顺铂、卡铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；
·嘌呤或嘧啶抗代谢物如咪唑硫唑嘌呤或巯嘌呤；
·生物碱和萜类化合物，如长春花生物碱(如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛)、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉烷如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇；
·拓扑异构酶抑制剂，如I型拓扑异构酶抑制剂喜树碱伊立替康和托扑替康，或II型拓扑异构酶抑制剂安吖啶(amsacrine)、依托泊苷、磷酸依托泊甙、替尼泊苷；
·抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素)如更生霉素，多柔比星(阿霉素TM)，表柔比星、博来霉素、雷帕霉素；
·基于抗体的药剂，例如抗-TIM-3抗体、抗-VEGF、抗-TNFα、抗-IL-2、抗-GpIIb/IIIa、抗-CD-52、抗-CD20、抗-RSV、抗-HER2/neu(erbB2)、抗-TNF受体、抗-EGFR抗体、多克隆抗体或抗体片段、示例包括：西妥昔单抗、帕尼单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗阿昔单抗、达利珠单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗帕利珠单抗、曲妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、尼妥珠单抗；
·EGFR抑制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗和吉非替尼；
·抗血管生成剂如贝伐珠单抗
其他化学治疗药物可以选自：13-顺-视黄酸、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞嘧啶核苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、放线菌素-D 阿地白介素、阿仑单抗、爱宁达((ALIMTA))、阿利维甲酸、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、 三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、比卡鲁胺、BiCNU、 博来霉素、硼替佐米、白消安、甲酰四氢叶酸钙、开普拓-11,卡培他滨、氟尿嘧啶(CaracTM),卡铂、卡莫司汀、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、亚叶酸因子、克拉屈滨、可的松、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷达克金(Dacogen)、放线菌素、达依泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、地塞米松、地西他滨、 地尼白介素(Denileukin)、白喉毒素(Diftitox)，阿糖胞苷TM、地塞米松、醋酸地塞美松、地塞米松磷酸钠、地塞米松磷酸钠(Dexasone)、右雷佐生、DHAD、DIC、Diodex、多西他赛、阿霉素、阿霉素脂质体、羟基脲胶囊(DroxiaTM)、DTIC、 EligardTM、EllenceTM、EloxatinTM、表阿霉素、阿法依泊汀、爱必妥、埃罗替尼、欧文氏菌左旋天冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol 依托泊苷、磷酸依托泊甙、依维莫司、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟脲嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、GleevecTM、Wafer、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、地塞米松(Hexadrol)、六甲嘧胺、HMM、Hydrocort 氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松磷酸(Hydrocortone Phosphate)、羟基脲、替伊莫单抗、替伊莫单抗提希坦(Tiuxetan)、伊达比星、α干扰素、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺、α-干扰素、α-干扰素-2b(PEG偶联)、白细胞介素-2、白细胞介素-11、Intron (α-干扰素-2b)、伊立替康、异维甲酸、伊沙匹隆、IxempraTM、天冬酰胺酶、拉帕替尼、左旋天冬酰胺酶、LCR、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、苯丁酸氮芥、LeukineTM、亮丙瑞林、长春新碱、LeustatinTM、脂质体Ara-C、液体环己亚硝脲、L-PAM、L-沙可来新、Lupron地塞米松、氮芥、盐酸氮芥、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、MesnexTM、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲基强的松龙、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、MTC、MTX、盐酸氮芥、MylocelTM、奈拉滨、NeulastaTM、尼鲁米特、氮芥、奥曲肽、醋酸奥曲肽、OnxalTM、奥普瑞白介素(Oprevelkin)、 奥沙利铂、紫杉醇、蛋白结合的紫杉醇、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、聚乙二醇化干扰素、培门冬酶、乙二醇化非格司亭、PEG-INTRONTM、PEG-L-天冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥、强的松、强的松、甲基苄肼、具有卡莫司汀植入剂的普利司盘(Prolifeprospan)20、雷洛昔芬、利妥昔单抗、(干扰素α-2a)、柔红霉素盐酸盐、善宁沙格司亭、索拉非尼、SPRYCELTM、STI-571、链脲佐菌素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、 替莫唑胺、西罗莫司脂化物、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤硫磷酰胺、噻替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、TrexallTM、TSPA、VCR、维克替比(Vectibix)TM、 ViadurTM、长春花碱、硫酸长春碱、Vincasar 长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VM-26、伏立诺他、VP-16、ZevalinTM、唑来膦酸、伏立诺他胶囊(Zolinza)、
施用途径
本发明的诸方面的抗体、抗原结合片段、多肽和其它治疗剂、药物和药物组合物可以配制成通过多种途径施用，包括但不限于胃肠外、静脉内、动脉内、肌肉内、肿瘤内和口服。抗体、抗原结合片段，多肽和其它治疗剂可以以配制成流体或固体形式。可以将流体制剂配制成通过注射给人或动物体的选定区域来施用。
在优选的方面，抗体施用于全身。特别考虑静脉内给药。
在一些情况下，抗体应用于远离癌细胞的部位，或远离已知的癌细胞部位。在这种情况下，抗体可在体内迁移至癌细胞，例如迁移至肿瘤。
在一些方面，抗体在癌细胞的部位施用，例如直接施用于肿瘤，或施用于肿瘤切除部位。在切除手术期间可以进行给药，或者可以在切除手术后进行给药。肿瘤可以是原发性癌症或转移性癌症。
可以进行给药以防止肿瘤在肿瘤切除部位再生，或者可以在预防在切除的肿瘤以外的部位形成癌细胞的情况下进行给药。
剂量方案
可以提供抗体、抗原结合片段或多肽的多个剂量。剂量中的一种或多种或每种可伴随着同时或依次施用另一种治疗剂。
多个剂量可以分开预定的时间间隔，其可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天、或1、2、3、4、5或6个月中之一。例如，可以每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予剂量一次。
试剂盒
在本发明的一些方面，提供了诸零件形成的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以具有至少一个具有预定量的抗体、抗原结合片段或多肽的容器。所述试剂盒可以以药物或药物组合物的形式提供抗体、抗原结合片段或多肽，并且可以与用于施用于患者以治疗特定疾病或病症的说明书一起提供。所述抗体、抗原结合片段或多肽可以配制以便适于注射或输注到肿瘤或血液。
在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含至少一个具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化疗剂)的容器。在这样的实施方案中，所述试剂盒还可以包含第二药物或药物组合物，使得两种药物或药物组合物可以同时或分开施用，使得它们为特定疾病或病症提供组合治疗。所述治疗剂也可以配制以便适于注射或输注到肿瘤或血液中。
受试者
待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选哺乳动物，更优选人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。受试者可能被诊断为患有需要治疗的疾病或病症，或被怀疑患有这种疾病或病症。
受试者或患者选择
在一些方面，选择患者以供人源化抗PRL3抗体或抗体片段进行治疗。在一些情况下，已经确定患者患有表达PRL3的癌症。在某些情况下，癌症是过表达PRL3的癌症。在一些情况下，确定患者具有功能性或活跃免疫系统，例如，如具有正常白细胞计数的患者所指示的。在一些方法中，已经确定患者的免疫系统没有受损。具体地，可能已经确定患者的白细胞计数在正常范围内。具体地，可能已经确定患者没有白细胞减少症。可能已经确定患者的嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞或血小板计数在正常范围内。患者的白细胞计数、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞或血小板计数与对照组，例如来自已知未患免疫系统受损的个体的计数，或建立的正常值无显著差异。例如，可以确定患者每微升血液具有约4,500至约10,000个白细胞。
一些化学治疗剂与白细胞计数的减少有关，因此在某些情况下，仅在患者过去未接受过化学疗法或特定的化学治疗剂时才选择患者进行治疗。在某些情况下，患者过去未接受过针对其癌症的化学治疗。在某些情况下，患者未接受抗代谢药化疗。在某些情况下，患者未接受胸苷酸合成酶抑制剂治疗。在某些情况下，患者未接受5-FU治疗。
本文提供的数据显示，在肿瘤细胞或癌症细胞内发现的PRL3可以在患者尿液中以足够的水平存在，以便能够进行检测。此外，本发明人发现可以在癌症产生的非常早期阶段在尿液中检测到PRL3。因此，在一些情况下，基于从患者获得的体液样品中PRL3的检测或定量来选择患者进行治疗，例如尿液、唾液、血液或血浆样品，或任何其他体液，包括母乳。优选地，体液是尿液。癌蛋白的存在或不存在可涉及免疫测定，例如基于ELISA或蛋白质印迹的方法。在一些情况下，在样品中的外泌体中检测到PRL3。
可通过本文公开的方法检测的癌症包括胃癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌(例如前列腺腺癌或前列腺增生，特别是前列腺增生)。癌症可能远离样品来源。癌症可以是难以接近和/或侵入性的癌症，例如进入样品或活组织检查。因此，在本文公开的一个方面，通过检测从患者获得的体液样品中的PRL3，可以诊断患者患有癌症，然后选择用人源化抗PRL3抗体治疗。癌症可能是一种实体癌症。如本文所证明的，PRL3与多种癌症相关。
如本文所解释的，检测可涉及确定PRL3的细胞定位，其中细胞表面PRL3的增加可指示个体患有癌症，或细胞是癌性的。
本领域技术人员将容易理解用于确定PRL3的细胞定位的方法。在一些情况下，免疫测定用于检测来自个体的样品中的靶标(例如PRL3)。免疫测定使用对靶分子具有特异性亲和力的抗体与可检测分子结合。在一些情况下，抗体与可检测分子缀合。可检测分子可称为标记。当抗体与靶分子结合时，可检测分子产生可检测信号。可检测信号可以是可量化信号。在一些情况下，使用适体代替抗体或与抗体一起使用。合适的方法包括免疫组织化学，例如原位杂交、荧光激活细胞分选(FACS)或流式细胞术。方法可以使用结合剂，例如结合PRL3的抗体或适体，例如PRL3珠单抗。该方法可包括将样品暴露于结合剂，使细胞表面PRL3被结合剂结合，从而可以检测结合剂。
蛋白表达
适用于在细胞中生产本发明多肽的分子生物学技术是本领域公知的，例如Sambrook等,分子克隆:实验手册,纽约:冷泉港实验室出版社,1989((Molecular Cloning：A Laboratory Manual))中所记载的那些。
多肽可以从核苷酸序列表达。所述核苷酸序列可以包含在存在于细胞中的载体中，或可以整合入细胞的基因组中。
本文所用的“载体”是用作将外源遗传物质转移入细胞的载体的寡核苷酸分子(DNA或RNA)。所述载体可以是用于在细胞中表达所述遗传物质的表达载体。这样的载体可以包括可操作地连接到编码待表达的基因序列的核苷酸序列的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从根据本发明的载体表达多肽。合适的载体包括质粒、二元载体、病毒载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这种情形，其中所选择的核苷酸序列和调节核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以这样的方式共价连接以将核苷酸序列的表达置于调控序列的影响或控制下(从而形成表达盒)。因此，如果调控序列能够影响核苷酸序列的转录，则调控序列可操作地连接到所选择的核苷酸序列。在合适的情况下，所得到的转录物然后可以翻译成所需的蛋白质或多肽。
适于多肽表达的任何细胞可用于制备本发明的肽。所述细胞可以是原核生物或真核生物。合适的原核细胞包括大肠杆菌。真核细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在某些情况下，细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许进行与真核生物相同的翻译后修饰。此外，非常高的表达水平在真核生物中是可能的并且蛋白质可以更容易使用适当的标签从真核生物纯化。还可以使用特异性质粒，其增强蛋白质分泌到培养基中。
产生感兴趣多肽的方法可以涉及经修饰以表达多肽的细胞的培养或发酵。所述培养或发酵可以在生物反应器中进行，所述生物反应器具有适当的营养物质，空气/氧气和/或生长因子供应。可以通过分离细胞与培养基/发酵液，提取蛋白质内容物，并分离各个蛋白质以分离分泌的多肽来收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的。
生物反应器包括其中可以培养细胞的一个或多个容器。生物反应器中的培养物可以连续发生，反应物连续流入反应器，并从中连续流出培养的细胞。或者，培养物可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如pH、氧气、进入和离开的流速，以及容器内的搅动，以便为被培养的细胞提供最佳条件。
在培养表达感兴趣的多肽的细胞后，优选分离该多肽。可以使用本领域已知用于从细胞培养物分离多肽/蛋白质的任何合适的方法。为了从培养物中分离感兴趣的多肽/蛋白质，可能有必要首先将培养的细胞从含有感兴趣的多肽/蛋白质的培养基中分离出来。如果感兴趣的多肽/蛋白是从细胞分泌的，则可以通过离心从含有分泌的多肽/蛋白质的培养基中分离细胞。如果感兴趣的多肽/蛋白质在细胞内收集，则有必要在离心之前破坏细胞，例如使用超声处理、快速冻融或渗透裂解。离心将产生含有培养细胞或培养细胞的细胞碎片的沉淀物，以及含有培养基和上述感兴趣的多肽/蛋白质的上清液。
然后可能需要从可能含有其它蛋白质和非蛋白质组分的上清液或培养基中分离感兴趣的多肽/蛋白质。从上清液或培养基中分离多肽/蛋白质组分的常见方法是通过沉淀。不同溶解度的多肽/蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵中沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂中，提取水溶性蛋白质。因此，通过添加增加浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可以使用透析从分离的蛋白质中除去硫酸铵。
用于区分不同多肽/蛋白质的其它方法是本领域已知的，例如离子交换色谱和尺寸色谱。这些可以用作沉淀的替代物，或者可以在沉淀后进行。
一旦已经从培养物中分离出感兴趣的多肽/蛋白质，则可能需要浓缩所述蛋白质。用于浓缩感兴趣的蛋白质的许多方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。
本发明方面的药物和药物组合物可以配制用于通过多种途径给药，包括但不限于肠胃外、静脉内、动脉内、肌肉内、肿瘤内、口腔和鼻腔。可以配制药物和组合物用于注射。
给药优选为“治疗有效量”，这足以为个体带来益处。施用的实际量、施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗方案，例如关于剂量等的决定，由全科医生和其他医生负责，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送的部位、给药方法和从业者已知的其他因素。上面提到的技术和方案的例子可以在雷明顿药学大全,第20版,2000年出版.Lippincott,Williams&Wilkins.中找到。
序列相同性
用于确定百分比氨基酸或核苷酸序列相同性的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如使用公知的计算机软件，例如ClustalW 1.82.T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件。当使用这样的软件时，优选使用默认参数，例如，对于空位罚分和延伸罚分。ClustalW 1.82的默认参数为：蛋白空位开放罚分＝10.0，蛋白空位延伸罚分＝0.2，蛋白矩阵＝Gonnet，蛋白/DNA端隙＝-1，蛋白/DNA隙距＝4。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除了这种组合是明显不允许的或明确避免的。
本文使用的部分标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图，通过示例的方式来说明本发明的诸方面和实施例。其他方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
在整个说明书中，包括以下权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括”和“包含”之类的变体将被理解为意指包含所述整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
必须指出的是，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。范围可以在本文中表示为“约”一个特定值，和/或“约”另一特定值。当表示这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一特定值。类似地，当值被表示为近似值时，通过使用先行词“约”，可以理解为所述特定值形成另一个实施例。
对照
在一些情况下，该方法涉及来自个体的样品中的癌蛋白的细胞定位与一个或多个对照样品比较。
该比较可能不需要对照样品的分析是与分析来自个体的样品同时或顺序地进行。相反，可以与先前从对照样本获得的结果进行比较，例如存储在数据库中的结果。
对照样品可以是在癌症发作之前，或在观察与癌症相关的症状之前，或在施用抗癌疗法之前从个体获得的样品。
对照样品可以是从另一个体获得的样品，例如没有患癌症的个体。个体可以根据一个或多个特征与个体匹配，例如，性别、年龄、病史、种族、体重或特定标记的表达。对照样品可以从身体部位获得，或者与从个体获得的样品具有相同的组织或样品类型。
对照样品可以是样品的集合，从而在许多不同的个体或组织中提供代表性的值。
在一些情况下，对照可以是参考样本或参考数据集。参考可以是先前从具有特定治疗的已知适合度的受试者获得的样品。参考可以是从分析参考样本获得的数据集。
对照可以是已知靶分子存在或以高水平表达的阳性对照，或已知靶分子不存在或以低水平表达的阴性对照。
对照可以是来自已知受益于治疗的受试者的组织样品。组织可以与被测样品的类型相同。例如，可以将来自受试者的肿瘤组织样品与来自已知适合于治疗的受试者的肿瘤组织的对照样品进行比较，例如先前已对治疗做出反应的受试者。
在某些情况下，对照可以是从与测试样品相同的个体获得的样品，但是从已知受试者健康的时间开始，例如，已知受试者没有患癌症的时间。因此，可以将来自受试者的癌组织样品与非癌组织样品进行比较。
在某些情况下，对照是细胞培养样品。
附图简要说明
现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施例和实验，其中：
图1.PRL-3是一种在胃肿瘤中高表达的新型肿瘤靶标。(A)PRV-3在FVB/野生型小鼠的各种正常组织(泳道1至15)和来自FVB/MMTV-PyMT小鼠的自发性乳腺和转移性肺肿瘤(泳道16和17)中的蛋白质印迹。用PRL3-珠单抗抗体探测印迹。HSP70，加样对照。(B)SGSet1GC患者群组中PRL-3mRNA表达的Kaplan-Meier存活分析。n＝183；p＝0.002，对数秩检验。(C)来自GC患者的20对人原发性胃肿瘤(T)中的PRL-3与患者匹配的正常组织(n)的完整蛋白质印迹分析。Mr，相对分子量(kDa)。
图2.PRL3-珠单抗特异性阻断PRL-3+原位胃肿瘤。(A)22种人GC细胞系中内源性PRL-3的蛋白质印迹。选择用于随后动物模型的致瘤PRL-3+和PRL-3-细胞系用红色标有星号(*)。Mr，相对分子量(kDa)。(B)Balb/C裸鼠中的实验原位GC模型的略图。(C)PRL3-珠单抗治疗抑制PRL-3+SNU-484原位胃肿瘤生长。图a-b，在实验结束时小鼠的外表(第28天)。箭头突出了未治疗小鼠的腹胀。图c-d，切除胃，肿瘤区域用黑线框出。条，10mm。(D)第28天未治疗组和PRL3-珠单抗治疗组的平均胃肿瘤体积。N＝每组8；p＝0.01，t检验；数据代表平均值±S.D。(E)未处理(红线)和PRL3-珠单抗处理(黑线)组小鼠的Kaplan Meier存活分析。N＝4每组；p＝0.006，对数秩检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。
图3.PRL3-珠单抗对PRL-3-原位胃肿瘤没有治疗作用。(A)PRL3-珠单抗治疗不能阻断PRL-3-MKN45原位胃肿瘤生长。图a-b，在实验结束时小鼠的外表(第56天)。图c-d，切除胃，肿瘤区域用黑线框出。条，10mm。(B)在第56天，未治疗组和PRL3-珠单抗治疗组的平均胃肿瘤体积。n＝每组5；p＝0.4，t检验；数据代表平均值±S.D。(C)未处理(红线)和PRL3-珠单抗处理(黑线)组小鼠的Kaplan Meier存活分析。N＝4每组；p＝0.3，对数秩检验。(D)4种人GC细胞系的原位模型中PRL3-珠单抗治疗结果的总结。p值<0.05被认为具有统计学意义。(E)来自MKN45-PRL3原位胃肿瘤生长的第28天的平均胃肿瘤体积。N＝4(未处理)或5(处理)'p＝0.00002，t-检验'数据表示平均值±SEM。
图4.PRL3-珠单抗作为单一疗法更有效，而不是单独使用5-氟尿嘧啶(5-FU)或5-FU的联合疗法。四个治疗组用于治疗PRL-3+SNU-484原位肿瘤：PBS对照(组1)、PRL3-珠单抗单一疗法(组2)、PRL3-珠单抗+5-FU组合疗法(组3)或5-FU单一疗法(组4)。(A)在第28天从每个治疗组切除的小鼠胃，其中原位肿瘤区域用黑线框出。条，10mm。右图，第28天各组的平均胃肿瘤体积。n＝5每组；当与组1比较时，每组的p值，t-检验；数据代表平均值±S.D。(B)在治疗开始前(第0天)和实验结束时(第28天)，来自治疗小鼠组的吉姆萨染色的血涂片的代表性图像。白细胞(WBC)染成蓝色。条，40μm。右图，表示第28天来自每只小鼠的血涂片的平均WBC计数。n＝每组5；当与组1比较时，每组的p值，t-检验；数据代表平均值±S.D。p值<0.05被认为具有统计学意义。(C)各种治疗方案结束时小鼠组的血液学特征(第28天)。以红色突出显示的值表示BALB/c裸鼠的正常参考范围的异常值(35)。
图5.细胞内PRL-3癌蛋白可以分泌到细胞培养基中，并且存在于62％的癌症尿液中，但不存在于正常尿液中。(A)PRL-3在所示GC细胞系的匹配裂解物和条件培养基中的蛋白质印迹。CANX，钙连蛋白。(B)所有癌症患者和正常个体的尿样中％PRL-3阳性的总结研究。(C-F)在(C)正常个体和GC患者、(D)鼻咽癌患者、(E)膀胱癌患者和(F)肺癌患者的尿液中PRL-3的代表性蛋白质印迹。Mr，相对分子量(kDa)。
图6.有效的PRL3-珠单抗治疗导致尿PRL-3的损失，在机理上涉及肿瘤内积累和免疫效应物的募集。(A)在匹配的尿液和来自未处理或PRL3-珠单抗处理的小鼠的肿瘤样品中的PRL-3蛋白的蛋白质印迹，所述小鼠携带PRL-3+SNU484或PRL-3-MKN45原位胃肿瘤。上图，第28天(SNU-484)或第56天(MKN45)切除胃。(B)对来自经受各种处理的小鼠的原位SNU-484和MKN45肿瘤组织冷冻切片通过免疫组织化学分析PRL3-珠单抗(图a-f；条，20μm)，或B细胞的免疫荧光(图e-1)和NK细胞标记物(图m-r；条，50μm)。分别为绿色，CD45R/B220和CD335/Nkp46染色的B和NK细胞标记物；蓝色，DAPI核染色。(C)描述PRL3-珠单抗对PRL-3+癌细胞的作用机制的模型：1)PRL-3抗原，通过非常规分泌物外化(外泌体PRL-3)，或从坏死PRL-3+肿瘤细胞(游离PRL-3)自发渗漏，作为2)PRL3-珠单抗结合和免疫复合物在肿瘤生态位内积聚的诱饵，随后导致3)效应NK细胞和B细胞的募集和活化，用于抗肿瘤作用。
图7.显示CDR位置的人源化抗体序列。(A)重链序列(B)轻链序列。
图8.鼠抗体克隆的序列(A)克隆#223和(B)克隆#318
图9.人PRL3序列
图10.PRL-3珠单抗序列分析。(A)识别CDR区(灰色框)和识别重要域序列(透明框)的人源化序列的轻链序列比对。(B)鉴定CDR区(灰色框)和鉴定重要结构域序列(透明框)的人源化序列的重链序列比对。
图11.PRL-3不在正常成人组织中表达，但在人胃肿瘤中强烈表达。(A)(a)来自各种器官的多个正常人组织和(b)来自GC患者的匹配的胃肿瘤和正常胃组织的PRL-3表达的免疫组织化学。条50μm。
图12.PRL3-珠单抗特异性结合PRL-3，但不与PRL-1或PRL-2密切相关。(A-C)PRL-1、PRL-2和PRL-3蛋白的人同种型用于分析PRL3-珠单抗特异性。(a)用PRL3-珠单抗或抗GST抗体探测重组GST-PRL1、GST-PRL2和GST-PRL3的蛋白质印迹。(b)使用重组GST-PRL1、GST-PRL-2和GST-PRL-3蛋白质对PRL3-珠单抗进行ELISA。(c)用PRL3-珠单抗过表达GFP-PRL1，GFP-PRL2或GFP-PRL3细胞的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的免疫荧光染色。条，40μm。
图13.PRL3-珠单抗抑制小鼠中PRL-3+原位胃肿瘤的肿瘤生长。将8周龄雄性BALB/C裸鼠植入PRL-3阳性NUGC-4或IM-95细胞系以诱导原位胃肿瘤。在实验结束时，测量可见肿瘤(黑色轮廓)并比较体积。(a)未治疗和PRL3-珠单抗治疗的小鼠的有IM-95肿瘤的胃。最右边的图显示了未处理和PRL3-珠单抗处理的小鼠中IM-95肿瘤的平均肿瘤体积的图表。p＝0.008，t-检验n＝6，数据代表平均值±S.D.条，10mm。(b)未治疗和PRL3-珠单抗治疗的小鼠的具有NUGC-4肿瘤的胃。最右边的图显示了未处理和PRL3-珠单抗处理的小鼠中NUGC-4肿瘤的肿瘤体积。P＝0.003，t检验；n＝4，数据表示平均值±S.D。条，10mm。(C)PRL3-珠单抗，但不是人IgG同种型对照，抑制体内PRL3阳性胃肿瘤生长。在未处理的，人IgG处理的(hIgG)和PRL3-珠单抗处理的小鼠中，将8周龄雄性BALB/C裸鼠植入PRL3阳性SNU-484肿瘤。P<0.001，单因素方差分析；n＝每组4，数据代表平均值±SEM。***p<0.001，Tukey的事后检验(未治疗组与治疗组)。
图14.术后PRL3-珠单抗治疗抑制PRL-3+肿瘤的复发。(A)由PRL-3+SNU-484细胞形成的异种移植肿瘤在肿瘤切除前生长3周。随后将小鼠分成安慰剂(未治疗的)或PRL3-珠单抗(治疗的)组，每两周一次治疗7周以监测肿瘤再生长。图a，在3周结束时携带肿瘤的小鼠外表。图b，手术切除肿瘤后小鼠外表，下图显示解剖肿瘤。图c-d，在切除和治疗后7周小鼠外表。图e，解剖切除部位复发的肿瘤。图f，治疗小鼠无肿瘤复发。条，10mm。(B)未治疗(n＝10)和治疗(n＝8)组小鼠的Kaplan Meier无复发存活分析。P<0.001，对数秩检验。
图15.PRL3-珠单抗抑制由植入胃内的PRL-3+HCT116结肠直肠癌细胞形成的局部和转移性腹部肿瘤。将HCT116-luc2细胞植入小鼠胃的胃浆膜下层以模拟继发性结肠直肠癌向胃龛的转移。PRL3-珠单抗治疗减少了胃龛中HCT116-luc2肿瘤的生长。(A)接种后3周内全身体内肿瘤生长的IVIS成像。(B)分析来自(A)的小鼠的全动物IVIS强度随时间的变化。每组n＝4；p<0.001，双因素方差分析。(C)第3周末切除的胃中的肿瘤负荷。(D)分析来自(C)的胃的IVIS强度差异。每组n＝4；p＝0.01，t检验；数据代表平均值±SEM。(E)第3周末腹壁内的转移性肿瘤负荷。(F)分析来自(E)的胃的IVIS强度差异。n＝每组4；p＝0.0003，t检验；数据代表平均值±SEM。
图16.外泌体相关的PRL-3存在于膀胱癌患者的尿液中。用针对PRL3CD63外泌体标记物的抗体分析来自膀胱癌患者尿液样品的纯化的外泌体级分。
图17.SGSet1患者队列的临床特征。
图18.SGSet1患者队列中PRL-3表达的单变量和多变量Cox回归分析。
图19.PRL3癌蛋白可以从癌细胞中分泌出来并作为PRL3-珠单抗的诱饵。(A)在无血清培养基中培养胃癌(GC)细胞48小时后，细胞内蛋白质库(细胞裂解物)和细胞外蛋白质库(浓缩条件培养基)中PRL3蛋白质表达的分析。对于细胞外蛋白质分析，首先清除来自五个GC细胞培养皿的条件培养基(50mL)的死细胞和细胞碎片，然后离心浓缩(终体积～0.2mL)。(B)使用抗人IgG抗体，通过免疫组织化学分析来自经受各种处理的小鼠的原位SNU-484和MKN45肿瘤组织冷冻切片的PRL3-珠单抗。条20μ<μM。
图20.体内肿瘤细胞表面PRL-3高度上调，但体外培养的癌细胞未高度上调。(a)体外培养细胞和离体肿瘤细胞的细胞表面谱的细胞计数分析的实验大纲。(b)用对照(透明)、PRL3-珠单抗(粉红色)或西妥昔单抗(CTX；灰色)抗体进行细胞表面染色的代表性直方图。在减去从对照染色推断的背景信号之后确定正栅(％pos)。(c)如(b)中所测试的不同抗体的细胞表面阳性群体％。数据表示平均值±SEM。(d)EGFR和PRL-3的蛋白质印迹显示了培养细胞中的蛋白质水平与肿瘤相比有所改变。GAPDH，加样对照。
图21.原位肝肿瘤的PRL3-珠单抗抑制需要宿主FcγII/III受体结合。(a)原位肝肿瘤模型的概况。(b)六种人癌细胞系中PRL-3表达的蛋白质印迹。GAPDH，加样对照。(c)与安慰剂(未治疗)相比，携带原位PRL-3+MHCC-LM3肝肿瘤的小鼠在每两周施用100μg/剂量PRL3-珠单抗(治疗)5周后肿瘤负荷降低。条，10mm。(d)第35天未治疗组和治疗组的平均肝肿瘤体积。P＝0.0001，t-检验；数据代表平均值±SEM。(e)未处理(红线)和处理(黑线)组小鼠的Kaplan Meier存活分析。P＝0.002，对数秩检验。(f)草图描绘了PRL3-珠单抗与PRL3-微抗体的结构域结构，以及它们使Fc受体(FcR)与宿主免疫细胞结合的能力。2.42G2单克隆抗体(mAb)充当FcR阻断剂，阻止完整IgG结合FcR。
图22：与宿主FcγII/III受体的相互作用对于PRL3-珠单抗诱导的NK细胞、B细胞和M1巨噬细胞募集到肿瘤生态位中是必需的。通过针对(a)F4/80(泛巨噬细胞)、(b)CD206(M2巨噬细胞)、(c)CD86(M1巨噬细胞)、(d)CD45/B220(B细胞)，或(e)CD335(NK细胞)的抗体的免疫荧光分析来自经受各种处理的小鼠的原位MHCC-LM3肝肿瘤组织冷冻切片。如材料和方法中所述计算肿瘤浸润评分。*p<0.05，单因素方差分析；数据代表平均值±SEM。(g)拍摄在第35天用安慰剂(未处理)，单独PRL3-珠单抗，2.4G2mAb，PRL3-珠单抗+2.4G2mAb组合疗法，人IgG或PRL3-微抗体治疗的小鼠的切除的肝脏并测量肿瘤体积。直肠肿瘤区域用黑线框出。条，10mm。在第35天每组的平均肝肿瘤体积p＝0.003，单因素方差分析；数据代表平均值±SEM。
图23：PRL-3是在多种人肿瘤中经常过表达的一般性肿瘤靶标。(a-e)肿瘤(T)中PRL-3与患者匹配的正常组织(n)对(a)肝肿瘤、(b)肺肿瘤、(c)结肠肿瘤、(d)乳腺肿瘤、和(e)肾肿瘤中的完整蛋白质印迹分析。(f-j)在没有匹配的正常组织的其他患者样品中的(f)肾肿瘤、(g)膀胱肿瘤、(h)急性髓性白血病(AML)、(i)胃肿瘤和(j)前列腺肿瘤的完整蛋白质印迹分析。GAPDH，加样对照。相对分子质量(以kDa表示)显示在每个结果集的右侧。
图24：分析PRL3-珠单抗是否可直接抑制PRL-3+癌细胞的体外试验。
图25：(scFv-CH3)2PRL3-微抗体对原位PRL-3+SNU-484胃肿瘤的影响。
实施例
实施例1 PRL3-珠单抗的产生
PRL3-珠单抗构建体由先前表征的鼠抗PRL-3抗体克隆改造而成。我们聘请了两个来自美国的独立合同研究组织(CRO)进行人源化或克隆，使用Queen等人(60)描述的方法的专有改进方法。
简而言之，将小鼠抗体的重链(IgG1)和轻链(κ)的互补决定区(CDR)移植到“受体”人序列框架上，其中框架被定义为除CDR之外的可变区段。通过将小鼠框架序列与人框架序列的数据库比对以找到每条链的最接近的人同源物(通常65-70％序列相同性)来进行人受体框架的选择。
除了从小鼠序列移植CDR之外，还将来自小鼠序列(除CDR之外)的约三个氨基酸位置移植到人受体序列中。这保留了原始的鼠抗PRL-3抗体的CDR，其特异性识别小鼠和人PRL-3之间保守的C末端区域内的表位，但不识别PRL-1或PRL-2。
我们邀请Sapidyne Instruments Inc.(700戴梦得西街博伊西，爱达荷州83705)测试PRL3-珠单抗结合PRL-3抗原的亲和力。结合亲和力分析，使用动力学排除试验(Drake等，2004)，将纯化的PRL3-珠单抗表征为纯化的人PRL-3的紧密结合物，Kd为6.29pM，结合率(Kon)和解离率(Koff)分别约为1×107M-1s-1和7×10-5s-1(表1)。
表1：KinExA PRL3-珠单抗结合亲和力分析的总结。
实施例2：PRL-珠单抗用于治疗胃癌的用途
材料与方法
组织和细胞裂解物的制备
从FVB/野生型小鼠获得多个正常小鼠器官，而乳腺癌和转移性肺肿瘤则从同基因FVB/MMTV-PyMT小鼠中解剖出来-这是一种由乳腺特异性多瘤病毒中T癌基因转基因过表达驱动的成熟的转移性乳腺癌自发模型(28)。对于组织，将切下的样品(5mm3)悬浮在含有蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合物(Pierce)的RIPA裂解缓冲液(Sigma)中，并用组织匀浆器(Polytron)完全破碎。通过在4℃以13,000×g离心40分钟澄清裂解物。对于细胞系，在含有蛋白酶-磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解5×106个细胞，并如上所述澄清。使用二辛可宁试验试剂盒(Pierce)评估蛋白质浓度。加入2×Lamelli缓冲液后，将样品煮沸并立即用于蛋白质印迹或在-20℃下储存直至使用。
蛋白质印迹
在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的不同孔中分离200μg裂解物并转移至硝酸纤维素膜，然后用1：1,000稀释度的所示一抗在4℃进行过夜封闭和探测。用TBS-T缓冲液(20mMTris pH 7.6,140mM NaCl，0.2％Tween-20)彻底洗涤后，将膜与相应的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗以1：5,000稀释度孵育1小时，用TBS-T洗涤，并使用化学发光底物(Pierce)显色。
细胞培养
研究的22种人GC细胞系来自以下来源：MKN7、MKN74、NUGC-3、OCUM-1(健康科学研究资源库)；YCC-1、YCC-3、YCC-7、YCC-17细胞(延世癌症中心)；AGS、CRL-5822、KATO-III、SNU-1、SNU-5(美国典型培养物保藏中心，ATCC)；HGC27、NUGC-4、OE19(西格玛奥德里奇)；MKN28、MKN45(日本理化研究所)；IM-95，SCH(日本研究生物资源细胞库)；SNU-484、SNU-719(韩国细胞系库)。CHO细胞购自ATCC。先前已经描述了稳定表达GFP标记的PRL-1、PRL-2或PRL-3融合蛋白的CHO细胞的产生(23)。通过在人泛素C启动子(pGL4luc2)的控制下将含有荧光素酶2基因的慢病毒稳定转导到亲本HCT116细胞(ATCC)中来建立表达荧光素酶的HCT116-luc2人腺癌细胞(Caliper Life Sciences)。将细胞系在补充有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的RMPI-1640培养基(Gibco)中培养，并保存在补充有5％CO2的37℃培养箱中。
PRL-3 mRNA表达分析
我们分析了来自Gene Expression Omnibus(GEO)数据库的公开可用的GC微阵列数据集(GSE15459)，该数据库由在Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Genechip阵列上分析的200个原发性胃癌样本组成。使用'affyPLM'R包(v2.15)进行数据预处理。排除异常值，得到总共185个肿瘤样本可用于下游分析(SGset1；患者特征在图17中提供)。以整体存活率作为结果指标进行存活分析，以比较各基因的“低”、“中”和“高”表达的肿瘤(n＝183；2个缺失存活数据的样本)，即，“低”和“高”表达组分别对应于低于33.3百分位数且高于66.7百分位数表达水平的样品，而中间百分位数被分类为“中等”。
重组GST标记蛋白的制备
先前已经描述了重组GST-PRL-1、GST-PRL-2和GST-PRL-3融合蛋白的制备(53)。
ELISA
如前所述进行ELISA测定(53)。简而言之，将用GST-PRL-1(20ng)、GST-PRL-2(20ng)或GST-PRL-3(1ng，20ng)包被过夜的96孔板用PBS-0.05％Tween-20中的3％牛血清白蛋白封闭，然后与200ng PRL3-珠单抗一起在37℃温育2小时。在充分洗涤后，在37℃下加入HRP缀合的抗小鼠抗体(Pierce)1小时。使用Turbo-TMB底物(Pierce)进行比色显色，并通过用2M H2SO4酸化终止。使用读板器(Dynatech)在450nm下测量吸光度。
动物模型和治疗
从生物资源中心(A*STAR，新加坡)获得的8周龄雄性Balb/C裸鼠用于该研究中的所有动物模型。用2.5％阿佛丁(100μl/10g体重)麻醉小鼠腹腔注射。原位胃癌模型：通过从剑突下方0.5cm开始的1cm中线切口分层打开麻醉小鼠的腹部。用手术钳通过腹部切口取出胃，并将癌细胞注射到浆膜下层。随后，将胃放回并将腹部分层缝合。在初步实验后确认了诱导每个细胞系的正交各向异性胃肿瘤所需的细胞数量和实验持续时间：SNU-484肿瘤为3×106个细胞，IM-95、NUGC-4和MKN-45肿瘤为5×106个细胞。治疗方案在接种胃浆膜下层中的癌细胞后第2天开始。将小鼠静脉内(iv)与100μgPRL3-珠单抗(Wuxi Pharmatech)一起在100uL PBS中每周两次施用，总共八次(SNU-484和NUGC-4肿瘤)或十次(IM-95和MKN45肿瘤)。PBS用作“未处理的”小鼠中的对照。由于个体肿瘤的生长速度不同，实验持续时间如下：SNU-484和NUGC-4肿瘤为4周，MKN-45肿瘤为8周，IM-95肿瘤为12周。使用下式计算肿瘤体积：体积＝0.4×肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度。Xenograph肿瘤模型：将150μl PBS中的3×106个SNU-484细胞注射到麻醉小鼠的两侧。3周后，在麻醉下手术取出所得肿瘤(5-10mm)，将小鼠分成2组，肿瘤切除后每两周接受PRL3-珠单抗(100μL，100μLPBS，i.v.)或PBS(100μL)。在未治疗组和治疗组中每周分析肿瘤复发直至切除后7周。在两组中仔细监测肿瘤生长。继发胃转移模型：如所述，将3×106HCT116-luc2细胞直接植入麻醉小鼠的胃浆膜中。将小鼠分成经处理的(PRL3-珠单抗，100uL PBS中100ug)或未处理的(100uL PBS)组，在腹膜内注射150mg/kg荧光素(Caliper Life Sciences)后15分钟，在2％异氟烷麻醉下通过IVIS成像监测植入后第1、2和3周的体内肿瘤生长。
分析小鼠血液样本
小鼠血涂片的WBC染色：在载玻片上取一滴新鲜小鼠血液中涂抹薄层后，将载玻片在37℃下烘烤1小时，然后用改良的Wright Giemsa染色剂(Sigma)浸渍1分钟，然后用去离子水洗涤3分钟。干燥后，在显微镜下观察染色的载玻片，WBC染成蓝色。通过在每个载玻片中的十个视野中计数，用等式WBCs/μl＝(计数的WBC总数/视野数)×2000计算，在光学显微镜(Olympus)下估计总WBC。全血计数：由Quest Laboratories(新加坡)进行小鼠样品的血液学分析。
抗体
HSP70(目录号EXOAB-Hsp70A)抗体购自System Biosciences，Inc.Calnexin(目录号2679)抗体购自Cell Signaling。CD63(目录号sc-15363)抗体购自Santa CruzBiotechnoloy。GAPDH(克隆MAB374)抗体购自Millipore。B细胞标记物(CD45/CD220，克隆RA3-6B2)和NK细胞标记物(CD335/Nkp46，克隆29A1.4)购自BD Pharmingen。
免疫荧光成像
细胞载玻片的制备：将细胞直接接种到玻璃盖玻片上并生长48小时。用PBSCM(PBSpH 7.0,1mM MgCl2,1mM CaCl2)洗涤两次后，将细胞在室温(RT)下在3％多聚甲醛中固定20分钟，用PBS-0.1％皂苷(Sigma)洗涤并透化15分钟。组织切片载玻片的制备：使用低温恒温器(Leica)在-18℃下将SNU-484和MKN45原位胃肿瘤的新鲜冷冻样品切成10μm切片。将载玻片用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS-0.05％Tween-20洗涤，并在室温下在PBS-FDB(PBS pH7.0，2％BSA，5％山羊血清，5％胎牛血清)中封闭1小时。随后将载玻片与指定的一抗在室温下以1：200稀释温育4小时，洗涤，并与相应的荧光染料偶联的二抗(Life Technologies)一起温育2小时。将洗过的载玻片用含DAPI的抗褪色安装试剂(Vector Laboratories)固定并用指甲油密封。用LSM 510共聚焦显微镜(Zeiss AG)进行共聚焦成像。
PRL3-珠单抗的免疫组织化学
将10μm厚的冷冻切片用4％福尔马林固定20分钟，并在1℃下用1％H2O2-PBS孵育5分钟。然后将洗过的载玻片在含有10％山羊血清和1％BSA(Sigma)的PBS中在室温下封闭1小时。随后，将载玻片在PBS-0.05％Tween-20中洗涤四次，同时轻轻摇动，并与山羊抗人标记的聚合物-HRP(Dako)一起温育2小时，然后充分洗涤，与底物-色原溶液(Dako)一起避光孵育10-20分钟。使用明场显微镜(Olympus)检查已安装的载玻片并捕获代表性图像。
统计分析
对于人类研究，基于PRL-3 mRNA表达分组，使用对数秩检验来评估Kaplan-Meier分析整体GC患者存活的显著性。使用Cox比例风险回归进行单变量和多变量分析。对于小鼠研究，使用对数秩检验来评估“未治疗”和“治疗”小鼠组之间总体存活的Kaplan-Meier分析的显著差异。Student's t检验用于计算原位肿瘤体积的统计学显著差异。使用SPSS软件v19.0(IBM)进行统计计算。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果
PRL-3是肿瘤特异性靶标
在抗癌靶向治疗的开发中的相关挑战是鉴定仅在肿瘤中但不在正常组织中表达的“肿瘤特异性抗原”，以避免不期望的脱靶效应。我们首先通过蛋白质印迹筛选来自所有主要器官的正常小鼠组织的内源性PRL-3。在这些完整印迹中，检测到对应于PRL-3预测分子量的单个～20kDa内源蛋白质(图1A)。我们没有观察到任何非特异性条带，证实PRL-3抗体不与其他分子交叉反应(27)。尽管在正常结肠中可以检测微弱PRL-3蛋白(图1A，泳道2)，但在检查的14个其他主要正常小鼠组织中检测不到(图1A，泳道1,3-15)，包括乳腺和肺组织(图1A，泳道14-15)。相反，PRL-3在来自MMTV-PyMT小鼠的自发产生的乳腺和肺肿瘤(图1A，泳道16-17)中大量表达(28)。重要的是，在通过免疫组织化学检查的15个主要正常人体器官中也检测不到PRL-3蛋白(图S1A)。此外，在患者匹配的组织样本中，在非癌胃组织中检测不到PRL-3(图11B，图a)，但在胃肿瘤切片中高表达(图11B，图b)，再次显示肿瘤特异性上调。结合关于癌症中PRL-3过表达高频率的已发表文献(29)，以及最近观察到PRL-3条件性敲除小鼠显示正常(30)，PRL-3在癌组织中的特异性表达，但在正常组织中没有表达，证实PRL-3是适当的肿瘤特异性靶标。
PRL-3癌蛋白在85％的胃肿瘤中过表达
在过去十年中，许多研究表明PRL-3表达升高是胃癌的负面预后因素(14,31,32)。我们进一步研究了185名GC患者的独立队列中PRL-3 mRNA水平升高的临床显著性(图17中给出的临床特征)。Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤中PRL-3 mRNA水平升高与总生存期较短有关(p＝0.002；图1B)。在多变量Cox分析中，高PRL-3 mRNA表达也与较高肿瘤等级显著相关(图18)。接下来，我们使用来自新加坡国立大学医院的GC患者的20个匹配的新鲜冷冻活检组织样本对(肿瘤与邻近正常组织)检查了PRL-3蛋白的水平。蛋白质印迹清楚地显示内源性PRL-3在17/20(85％)胃肿瘤中过表达(T；图1C)，但在任何匹配的正常胃组织中均未过表达(n；图1C)，证实PRL-3的肿瘤特异性表达。值得注意的是，PRL-3蛋白在这些印迹中显示为20至25kDa的条带，表明在尚未确定的人肿瘤样品中PRL-3(～20kDa)的潜在翻译后修饰。总的来说，我们的临床数据表明PRL-3癌蛋白过表达是人类GC中与疾病严重程度相关的常见现象，再次确认其适合作为靶向治疗的候选者。
产生新的靶向PRL-3的人源化抗体PRL3-珠单抗
我们以前证明了鼠和嵌合PRL-3抗体对裸鼠和野生型C57BL/6小鼠中表达胞内PRL-3的肿瘤的高效率(24,27)。在这些研究中，接受PRL-3单克隆抗体的小鼠体重不断增加并显示出活动正常，表明脱靶副作用最小。为了将这些早期发现转化为人类的临床应用，我们生产了称为'PRL3-珠单抗'的人源化单克隆抗PRL-3抗体。与其前身类似，工程化PRL-3-珠单抗特异性识别PRL-3，并且通过蛋白质印迹、ELISA和免疫荧光分析证明不与PRL-3同源物PRL-1或PRL-2交叉反应(图12A-C)。随后，我们将PRL3-珠单抗用于本报告中描述的所有进一步实验。
PRL3-珠单抗特异性阻断PRL-3阳性(PRL-3+)而非PRL-3阴性(PRL-3-)原位胃肿瘤的生长
在小鼠肿瘤模型中在其天然(原位)位置生长的人癌细胞以高保真度复制人类疾病。更重要的是，肿瘤对治疗的反应已经显示出根据癌细胞植入皮下还是原位位置而有显著不同，(33)，从而突显了选择正确模型来检测抗肿瘤药物治疗功效的要求。为了建立相关的临床前原位小鼠模型以检查PRL3-珠单抗对胃肿瘤的功效，我们首先筛选了一组22个人GC细胞系的PRL-3蛋白表达状态，随后测试了它们在小鼠胃的浆膜层内的致瘤能力。在分析的22个(59％)人GC细胞系中有13个检测到PRL-3蛋白(图2A)。然而，只有一部分GC细胞系在培养中生长良好，并在可控制的时间范围内(<2个月)形成原位肿瘤。基于这些标准，选择三种PRL-3+细胞系(SNU-484，NUGC-4和IM-95)和一种PRL-3-细胞系(MKN45)用于开发原位GC模型以评估PRL3-珠单抗的抗肿瘤功效。将来自这些细胞系的细胞接种到胃的浆膜下层，随后按照图2B中概述的方案进行处理。在实验结束时，从小鼠中取出胃并分析胃肿瘤负荷。
我们首先研究了PRL3-珠单抗治疗对SNU-484GC细胞系的影响，该细胞系由于PRL-3蛋白的高表达、培养物快速生长、3-4周内可重复形成胃肿瘤而成为优良的PRL-3+原位胃肿瘤模型(图2A，泳道1)。在实验过程中，未经治疗的小鼠出现明显的腹胀(图2C，图a，箭头)并显示出身体活动和食物摄入减少，而PRL3-珠单抗治疗的小鼠看起来非常正常(图2C，图b)并且通过常规的食物摄入模式维持正常的身体活动。解剖后，与未治疗组相比，PRL3-珠单抗治疗组的原位肿瘤形成明显减少(图2C，图c-d)。肿瘤体积的测量显示，与未治疗组相比，PRL3-珠单抗治疗组(0.23±0.25cm3)的肿瘤负荷显著降低20倍(4.08±1.52cm3；p＝0.01；图2D)。与肿瘤负荷减少一致，Kaplan-Meier分析显示PRL3-珠单抗治疗小鼠的生存时间显著长于未治疗小鼠，中位生存时间分别为7周和4.5周(p＝0.006；图2E)，证实携带PRL-3+SNU-484胃肿瘤的小鼠对PRL3-珠单抗抗肿瘤疗法有效应答。为了验证该发现，使用另外两种PRL-3+GC细胞系IM-95和NUGC-4产生原位GC小鼠模型(图2A，分别为泳道2和22)。与SNU-484正交各向异性肿瘤相似，PRL3-珠单抗治疗显著抑制由PRL-3+IM-95细胞(p＝0.008；图S13A)或PRL-3+NUGC-4细胞(p＝0.03；图S13B)形成的胃肿瘤的生长。
与之形成鲜明对比的是，由PRL-3GC细胞系MKN45形成的胃肿瘤(图2A，泳道4)显示对PRL3-珠单抗治疗没有反应，在治疗组和未治疗组的小鼠中都存在明显的腹胀(图3A，图a-b)和原位肿瘤形成(图3A，图c-d)。在治疗组(0.17±0.20cm3)和未治疗组(0.13±0.19cm3)之间未发现平均原位肿瘤体积的差异(p＝0.4；图3B)。Kaplan-Meier生存分析显示未治疗组和治疗组之间的总生存率没有显著差异，未治疗组的中位生存期为9.25周，而PRL3-珠单抗治疗组为10周(p＝0.3；图3C)。来自这四种细胞系的PRL3-珠单抗治疗原位肿瘤的结果(总结在图3D中)巩固了我们之前提出的关于PRL-3抗体治疗的基本原理(24)-只有PRL-3+肿瘤对PRL3-珠单抗治疗有反应，而缺乏PRL-3癌蛋白表达的肿瘤则没有。
PRL3-珠单抗作为单一疗法比单独使用5-氟尿嘧啶(5FU)或5-FU的联合疗法更有效
由于5-FU是一种用作胃癌一线治疗的化疗药物(17)，我们研究了PRL3-珠单抗在抑制原位肿瘤生长方面是否可能更有效地与5-FU联合使用。我们测试了四种治疗方案：PBS对照(组1)、PRL3-珠单抗单一疗法(组2)、PRL3-珠单抗+5-FU组合疗法(组3)或5-FU单一疗法(组4)。根据治疗方案，将每两周一次剂量的PRL3-珠单抗(100μg/剂量)或5-FU(30mg/kg/剂量)单独或组合静脉内施用于携带原位PRL-3+SNU-484胃的裸鼠组中肿瘤。在实验过程中，我们观察到5-FU处理的小鼠(第3组和第4组)的总体动物活性降低。肿瘤体积分析表明，PRL3-珠单抗单药治疗(第2组)治疗效果最高，平均肿瘤体积最低为0.67±0.59cm3，其次是PRL3-珠单抗+5-FU联合治疗(第3组；1.49±0.27cm3)，5-FU单一疗法(第4组；1.76±0.52cm3)，最后是PBS对照(第1组；3.98±0.60cm3；图4A)。这些结果表明，当不使用化学治疗剂5-FU时，PRL3-珠单抗在减少胃肿瘤方面更有效。
以前，我们强调了宿主免疫系统在PRL-3抗体治疗功效中的关键作用(24)。鉴于5-FU治疗引起白细胞数量(WBC)非特异性减少的已知副作用(34)，我们研究了观察到的治疗效果的降低是否可能是由于这种现象。在全血涂片中，我们发现与对照(组1)或PRL3-珠单抗单一疗法(组2；图4B)相比，5-FU治疗(组3和4)后外周WBC计数减少5倍。为了验证这些结果，我们进行了小鼠样品的全血计数，以分析实验结束时(第28天)不同治疗方案的血液学影响。而接受PRL3-珠单抗的小鼠在BALB/c裸菌株的正常范围内具有一般的血液学特征(35)，那些接受5-FU联合PRL3-珠单抗或单独使用5-FU的患者显示中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数减少，红细胞和血小板计数显著减少(图4C)。总之，我们的结果表明，5-FU治疗导致的免疫功能降低可能是PRL3-珠单抗与5-FU联合使用时效果降低的原因，并支持我们之前的PRL-3抗体治疗需要更强的免疫系统这一发现。
术后PRL3-珠单抗治疗可抑制PRL-3+肿瘤的复发
尽管手术是治疗GC的基石，但近80％的患者在短时间内死亡主要是由于局部复发和/或较低程度的远端转移(36)。鉴于PRL3-珠单抗在体内抑制PRL-3+GC生长的能力，我们研究了PRL3-珠单抗是否也具有抑制肿瘤复发的术后辅助治疗的功效。使用PRL-3+SNU-484GC细胞，我们首先在3周的时间内在裸鼠的两侧腹部建立异种移植肿瘤(5-10mm宽)(图19，小图a)。然后通过仔细手术完全除去所得的实体瘤(图19，小图b)，并将小鼠分成2组，每周两次注射对照抗体(未治疗)或PRL3-珠单抗(治疗)。然后每周监测局部肿瘤复发。在手术后7周，未治疗组在切除部位出现大的局部肿瘤(图19，小图c)。相反，在同一时期，在接受PRL3-珠单抗治疗的小鼠的切除部位未观察到可见的肿瘤生长(图19，小图d)。解剖后证实了这一点-而大型实体肿瘤可以从未治疗组中获得(图19，小图e)，PRL3-珠单抗治疗组在切除部位未发现实体肿瘤(图19，小图f)。总的来说，这些结果表明PRL3-珠单抗具有抑制术后局部肿瘤复发的功效，表明该药物作为辅助治疗的临床转化的可能途径。
PRL3-珠单抗抑制胃中继发性PRL-3+肿瘤转移的生长
胃中存在转移是一种罕见的情况(37-39)，几乎总是与预后不良有关(40,41)。为了解决PRL3-珠单抗是否可以阻断转移性肿瘤形成，我们使用手术注射到小鼠胃浆膜层的PRL-3+HCT116-luc2结肠直肠癌细胞开发了结肠直肠癌转移到胃的实验模型。我们使用HCT116-luc2细胞有两个主要原因：1)已经在人类中描述了来自结肠癌的胃转移(38,39,42)，和2)HCT116-Luc2组成型表达萤火虫荧光素酶，允许使用体内成像系统(IVIS)监测肿瘤生长。在2个单独的实验重复中，PRL-3+HCT116-luc2肿瘤在未治疗的小鼠中快速生长，PRL3-珠单抗治疗的小鼠在相同时期内PRL-3+HCT116-luc2肿瘤生长大大降低(图14A)。解剖后，在未处理小鼠的胃中观察到重肿瘤负荷(图14B，小图a，a')。相反，PRL3-珠单抗治疗的小鼠具有低得多的胃肿瘤负荷(图14B，小图b，b')。此外，在未治疗的小鼠中观察到对腹壁的广泛转移性弥散(图14B，小图c，c')在治疗的小鼠中也大大减少(图14B，小图d，d')。总之，这些结果表明PRL3-珠单抗可以减少胃龛内和周围的PRL-3+HCT116-luc2结肠直肠癌肿瘤的生长和转移。
细胞内PRL-3癌蛋白可被分泌出来并在62％的癌症尿液中存在，但不存在于正常尿液中
已经证明了PRL3-珠单抗在各种癌症模型中的抗肿瘤功效，我们接下来寻求一种简单的方法来鉴定PRL3+癌症患者以供PRL3-珠单抗治疗。之前我们报道了抗PRL-3抗体可以在体外被PRL-3+肿瘤细胞内化(23)。然而，尚不清楚“细胞内”PRL-3抗原的抗体识别是如何以及在何处发生的。在这里，我们报告了一种以前未被认识到的自然现象，PRL-3蛋白可以在体外在相应的PRL-3+而非PRL-3-癌细胞系浓缩培养基中分泌和检测(图5A，泳道1-4)。为了排除死细胞或细胞碎片的非特异性污染，我们检测到ER定位蛋白钙联接蛋白(CANX)作为对照，仅在裂解物中(图5A，泳道5-8)，但在条件培养基中没有(图5A，泳道1-4)。
由于基于微阵列和组织学研究，PRL-3具有有希望的癌症生物标志物潜力(7)，我们通过分析来自健康个体和癌症患者的尿液样品，开始研究“分泌的”PRL-3是否可能具有临床相关性作为生物标志物。通过蛋白质印迹分析来自健康个体的总共15个尿样和来自癌症患者的199个尿样以检测PRL-3蛋白。令人鼓舞的是，PRL-3很容易在不同类型癌症患者的尿液样本中检出，平均62％(199个中的123个)(图5B)，但在正常尿液样本中完全不存在(图5C，泳道1-7)。具体地，在多达14/16(88％)的胃癌患者、12/17(70％)的鼻咽癌患者(图5D)、30/67(45％)的膀胱癌患者(图5E)、56/85(66％)的肺癌患者(图5F)、8/10(80％)的乳腺癌患者和3/4(75％)的前列腺癌患者(数据未显示)中检测到尿PRL-3蛋白(图5C，泳道8-23)。我们从这214份尿样中得到的结果表明PRL-3是一种常见的癌症特异性尿蛋白。
由于PRL-3蛋白不具有通过ER/高尔基体途径进行经典分泌的序列肽，因此我们考虑是否可能通过非经典外泌体分泌来分泌。外泌体是存在于许多生物体液和细胞培养基中的50-150nm的细胞膜和/或内体衍生的囊泡(43)。我们使用跨膜四蛋白CD63作为对照外泌体标记物，对来自不同类型癌症患者的尿样进行外泌体分级(44)。令人惊讶的是，我们仅从膀胱癌患者的尿液中检测到外泌体PRL-3(图16)，但未从其他类型的癌症检测到(数据未显示)。因此，尿PRL-3作为癌症特异性标志物存在，其包含至少两种形式-可溶的，“游离”形式(来自多个癌症患者的尿液)和外泌体相关形式(仅来自膀胱癌患者的尿液)。
尿PRL-3可能是PRL3-珠单抗治疗的治疗反应监测的潜在替代生物标志物
由于PRL-3可能经常在癌症患者的尿液样本中检测到，我们质疑尿PRL-3是否反映了体内真正的PRL-3+肿瘤的存在。由于难以获得临床匹配的肿瘤-尿液样本来验证这种关系，我们改为使用PRL-3+SNU-484和PRL-3-MKN45原位胃小鼠模型来比较PRL-3在匹配的肿瘤-尿液配对中的表达。此外，每个原位模型被细分为2组-未治疗或PRL3-珠单抗(治疗)-以阐明PRL3-珠单抗治疗与尿PRL-3表达之间的关系。在未治疗的PRL-3+SNU-484荷瘤小鼠中，PRL-3蛋白在尿液样品中高度丰富(图6A，奇数泳道1-9)。然而，在PRL3-珠单抗治疗后，在所有小鼠中不再检测到尿PRL-3，这与PRL-3的肿瘤内表达降低一致(图6A，偶数泳道2-10)。重要的是，PRL3-珠单抗治疗的小鼠尿PRL-3信号的丢失与每种情况下的胃肿瘤缩小相对应(图6A，上面小图)，表明尿PRL-3可用作PRL3-珠单抗治疗功效的替代生物标志物。相反，我们没有检测携带PRL-3MKN45原位肿瘤的小鼠尿PRL-3，无论PRL3-珠单抗治疗与否(图6A，泳道11-12)。因此，在携带PRL-3+但不携带PRL-3-癌症的小鼠中特异性地检测到尿PRL-3，并且在用PRL3-珠单抗治疗时减少肿瘤负荷并减少尿PRL-3。
PRL3-珠单抗治疗后PRL-3+肿瘤中B细胞和NK细胞浸润增加
临床抗体开发中的一个重要考虑因素是体内肿瘤与正常(或非抗原表达)组织之间抗体的生物分布(46)。鉴于此，我们在我们的原位模型中探索了PRL3-珠单抗在肿瘤部位的分布。在PRL3-珠单抗治疗后，我们检测到PRL-3+SNU484肿瘤内PRL3-珠单抗的富集(图6B，小图b-c)，但PRL-3-MKN45肿瘤中没有(图6B，小图f)。作为对照，在未治疗的小鼠(图6B，小图a)或单独的5-FU中没有观察到信号(图6B，小图d)。这些结果表明PRL3-珠单抗在表达PRL-3的肿瘤的微环境中的特异性积累。免疫效应细胞通过免疫球蛋白受体(FcR)识别抗体，其结合抗体的Fc部分，导致这些效应细胞的募集和活化(47)。为了确定PRL3-珠单抗在肿瘤组织中的积累是否导致免疫细胞的浸润，使用针对B细胞和NK细胞的特异性抗体对PRL-3+NU-484胃肿瘤切片进行免疫荧光，两种携带FcR的免疫细胞类型被认为对细胞内抗体治疗的功效至关重要(26)。在PRL-3+SNU-484原位肿瘤切片中，与未治疗的肿瘤切片相比(图6B，小图g和m)，PRL3-珠单抗治疗的肿瘤中浸润性B细胞和NK细胞的数量明显更高(图6B，小图h和n)。引人注目的是，我们一直观察到在用PRL3-珠单抗和5-FU联合治疗的小鼠(图6B，图i和o)和5-FU治疗的小鼠(图6B，图j和p)中缺乏B或NK细胞浸润，可能是由于5-FU给药后淋巴细胞群减少(图4C)。在PRL-3-MKN45肿瘤切片中，无论PRL3-珠单抗治疗如何，均未观察到B细胞或NK细胞浸润的差异(图6B，小图k-1和q-r)。基于这些发现，我们提出了PRL3-珠单抗和PRL-3抗原如何相互作用以在体内引发治疗效果的新机制(图6C)：1)PRL-3抗原，通过非常规分泌外泌(外泌体PRL-3)，或从坏死或凋亡的PRL-3+肿瘤细胞(游离PRL-3)自发渗漏，作为2)PRL3-珠单抗结合和免疫复合物在肿瘤生态位内积累的诱饵，随后导致3)效应NK细胞和B细胞的募集和活化，用于抗肿瘤作用。
PRL3-珠单抗抑制PRL-3+肿瘤的可能作用机制
对自身免疫病理学的研究表明，自身抗体可以结合特定的细胞内抗原，并在抗原表达细胞的细胞质和核区室内积聚(47)。同样，我们观察到抗PRL-3抗体可以在体外被PRL-3+肿瘤细胞内化(4)。然而，抗体摄取的方式仍然没有明确确定。在这里，我们发现了细胞内PRL-3抗原可能参与特异性结合和肿瘤抑制的抗体的两个新发现：1)细胞内PRL-3癌蛋白可以被分泌出来。在肿瘤细胞中，已经报道了几种经典的“细胞内”蛋白质通过分泌和/或细胞表面重新定位而外化，从而使得它们可以使用抗体进行治疗干预(48,49)。我们通过比较三种PRL-3+细胞系SNU-484、NUGC-4、IM-95和一种PRL-3-细胞系MKN45中PRL-3细胞内和细胞外PRL-3的表达来研究PRL-3是否同样可以外化为PRL3-珠单抗结合的靶抗原。将PRL-3表达与非分泌的ER锚定蛋白钙联接蛋白作为对照进行比较。在PRL-3+GC细胞的细胞内蛋白质级分(细胞裂解物)中检测到PRL-3蛋白质(图6A，泳道1-3)，以及PRL-3+GC细胞的细胞外蛋白质库(浓缩的条件培养基)(图6A，泳道5-7)，但没有PRL-3-GC细胞系(图6A，泳道4,8)。相反，钙联接蛋白仅存在于PRL-3+和PRL-3-PRL GC细胞的细胞内库中(图6A，泳道1-4)，但不存在于细胞外库中(图6A，泳道5-8)。该观察结果排除了死细胞或细胞碎片的非特异性污染，并将PRL-3表征为新的分泌蛋白。2)外化的PRL-3可以作为PRL3-珠单抗结合的诱饵。我们接下来研究了来自经治疗的原位GC小鼠的肿瘤切片，并分析了肿瘤生态位内中PRL3-珠单抗的分布。作为对照，在未治疗的小鼠中未观察到信号(图6B，最左边的图)。在治疗后，PRL3-珠单抗在PRL-3+SNU-484肿瘤的微环境中富集，但不是接受5-FU单一疗法或PRL-3-MKN45肿瘤的那些(图6B)。这些结果表明PRL3-珠单抗在PRL-3+肿瘤的微环境中的特异性积累，但不在PRL-3-肿瘤中积累。
讨论
该研究进一步证明了先前未被认识到的肿瘤特异性细胞内癌蛋白作为癌症靶向免疫疗法的可行分子靶标的潜力，具有最小的副作用。使用人胃癌细胞系生产原位肿瘤模型，我们的结果将PRL-3表征为优异的肿瘤特异性靶点，并证明了PRL3-珠单抗在临床相关环境中的特异性抗肿瘤功效。PRL3-珠单抗特异性抑制原位PRL-3+(但不是PRL-3-)胃肿瘤的生长，确定PRL3-珠单抗治疗PRL-3+胃癌的适合性。此外，分泌的尿PRL-3可用作诊断和治疗反应监测的生物标志物。
为了使用人GC细胞系创建临床相关的原位GC模型，我们使用免疫缺陷的裸鼠但不是严重免疫受损的小鼠品系，例如NOD/SCID，BALB/c-RAG2null或它们的衍生物(48)。后面这些品系很少或没有完整的内源性免疫系统，从而在将研究结果转化为免疫功能正常的人类患者方面造成了空白。使用更临床相关的小鼠模型也克服了培养皿中体外药物筛选的局限性，它们无法概括体内复杂的相互作用，并且对体内毒性的预测很差(49)。事实上，抗PRL-3抗体已被证明在免疫功能低下的SCID小鼠中(24)，或在体外直接加入PRL-3+癌细胞时(27)缺乏抗癌功效，表明治疗剂与免疫效应物相互作用对于成功治疗的重要性。在这里，我们证明了PRL3-珠单抗在抑制原发性和转移性胃肿瘤生长中的治疗功效，以及它对于预防癌症复发的术后辅助治疗的价值。此外，我们通过证实PRL3-珠单抗的积累以及PRL3-珠单抗治疗后PRL-3+肿瘤细胞中B和NK细胞的浸润增加来扩展这些发现，从而加强这些关键免疫效应物参与PRL3-珠单抗的抗肿瘤活性。最近显示PRL-3促进ULBP2(NKG2D配体)的分泌，导致NK细胞的肿瘤识别和细胞溶解减少(50)。该发现表明，在PRL3-珠单抗处理的小鼠中观察到的增加的NK细胞浸润到PRL-3+肿瘤生态位中可能协同伴随着NK细胞溶胞活性的增加，从而导致PRL-3+肿瘤的免疫靶向更有效。
分泌形式的PRL-3的发现增加了免疫细胞募集到PRL-3+肿瘤部位所需的特异性抗体-抗原相互作用和PRL3-珠单抗的抗肿瘤功效。有趣的是，尽管在多个癌症患者的尿液中检测到可溶性PRL-3，但我们仅在膀胱癌患者的尿液中检测到外泌体相关的PRL-3，而在其他恶性肿瘤患者的尿液中检测不到。对此可能的解释是肾小球滤过所施加的物理排除限制，只允许小于70kDa的蛋白质从血浆进入Bowman胶囊进行尿液排泄(45)。我们的结果间接表明PRL-3可以从体内至少两种形式的肿瘤细胞中分泌：1)首先，作为存在于多种类型的癌尿中的可溶性，可过滤的形式。这种“游离PRL-3”可能在肿瘤坏死、细胞凋亡或肿瘤细胞裂解过程中泄漏到体液中，其低分子量为20-25kDa，可能通过肾小球并在尿液中排出体外。2)其次，作为'外泌体PRL-3'，仅在膀胱癌患者的尿液中发现，因为膀胱癌细胞不受阻碍地进入膀胱泌尿系统可以将这种含有PRL-3的外泌体直接排入尿池。然而，来自其他癌组织(如胃、肝、肺)的循环外泌体不能通过肾小球滤过，而来自PRL-3+癌细胞的出芽外泌体可以作为肿瘤区域内的锚定点用于体内PRL3-珠单抗识别以启动级联免疫应答(图6C)。
最近，大量FDA批准的抗癌药物被证明具有较差的目标选择性(51)。在我们的研究中，研究了超过400个临床癌症样品，用于在肿瘤组织和/或癌尿中的mRNA水平或蛋白质水平表达PRL-3。平均而言，PRL-3癌蛋白在所检查的多种类型的癌症(胃、肝、肺、鼻咽、肾、乳腺、结肠、膀胱)中的62％中过表达。具有如此高的PRL-3肿瘤阳性，针对肿瘤特异性PRL-3的PRL3-珠单抗靶向疗法的开发是朝向个性化医疗的令人兴奋的步骤。通过最大程度提高治疗效果，同时最大限度减少脱靶副作用(PRL-3在大多数正常成人组织中不以可检测水平表达)，PRL3-珠单抗证明临床验证和开发是一种精确的抗癌药物。
我们在此总结了关于PRL3-珠单抗癌症治疗的五个主要发现：1)PRL3-珠单抗特异性识别PRL-3肿瘤特异性抗原。PRL3-珠单抗具有高度特异性-它不与其两个同源物(PRL-1或PRL-2)交叉反应，这些同源物具有>75％的氨基酸序列相同性。此外，PRL3-珠单抗特异性识别肿瘤组织中的PRL-3抗原，但不识别正常组织中的PRL-3抗原，表明毒性低和脱靶副作用最小。2)PRL3-珠单抗特异性抑制PRL-3+原位胃肿瘤的生长，并防止术后PRL-3+肿瘤复发。肿瘤内PRL-3蛋白表达是治疗反应的绝对必要条件，表明需要特异性抗原-抗体识别肿瘤抑制。3)PRL3-珠单抗作为单一疗法比与化疗相结合更有效。总的来说，我们的结果表明PRL3-珠单抗治疗结果取决于宿主免疫系统，因为化疗诱导的免疫抑制(34)降低了PRL3-珠单抗的治疗功效。4)PRL3-珠单抗应该在多种PRL-3阳性癌症中具有广泛的用途。虽然我们的研究结果集中在多个GC模型作为PRL3-珠单抗疗效的案例研究，但PRL-3也与多种癌症类型的肿瘤转移和预后不良有广泛联系，PRL-3表达较高与总生存期较短有关(7)。基于PRL3-珠单抗仅在识别PRL-3抗原时发挥其作用的原理，设想在免疫未受损的患者中靶向大多数(即便不是全部)PRL-3阳性癌症有效，从而在一般癌症治疗中开辟了新的治疗途径。5)尿PRL-3可能是癌症诊断和治疗反应监测的潜在新型生物标志物。我们在多个人类癌症患者中平均检测到尿PRL-3的比例为62％。小鼠模型中观察到的肿瘤与尿PRL-3表达之间的密切相关性表明，尿PRL-3表达可用作PRL-3靶向癌症治疗(包括PRL3-珠单抗)在各种人类恶性肿瘤中的前瞻性诊断生物标志物。此外，我们的数据表明尿PRL-3可能作为替代生物标志物，为临床医生提供快速和简单的定性方法来推断PRL3-珠单抗治疗效果。虽然尿PRL-3的生物标志物值需要进一步验证，通过在早期临床试验中进行稳健的假设检验，开发PRL3-珠单抗的这种“伴随诊断”的潜力将加速其药物开发过程(52)。
在本文中，我们证明PRL3-珠单抗是第一种抗细胞内肿瘤靶标以阻断PRL-3+人类癌症的人源化抗体。总的来说，我们在这里和其他地方的结果(23,24,27)挑战了治疗性抗体无法获得抗癌作用的细胞内抗癌药物的教条。我们建议其他细胞内癌蛋白也可能具有作为靶向免疫疗法的巨大潜力。现在应该重新考虑无数的候选肿瘤特异性细胞内抗癌药物作为未来临床试验的可行分子靶标的潜力。
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实施例3：PRL3珠单抗作用机制的研究
在这项研究中，我们主要使用‘种子和土壤’肝原位肿瘤模型，关注分子作用机制(MOA)，以解决PRL-3抗体如何与其细胞内PRL-3抗原结合。我们从不同方面进行研究，得出一个重要的结论，即确实“细胞内癌蛋白”在体内的比例高于体外，以“细胞外癌蛋白”的形式重新定位到细胞表面，因此，通过针对细胞外肿瘤靶标的抗体常规途径，遵循肿瘤消除的合理基础。一致地，我们在机理上发现PRL3-珠单抗阻断表达PRL-3‘细胞内’抗原的肿瘤需要：1.宿主FcγII/III受体相互作用，因为两种FcγII/III阻断剂均消除了治疗功效。2.完全抗体活性，缺乏Fc片段的小体(CH1和Ch2结构域)消除治疗功效，3.增加M1(但不是M2)巨噬细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞以增强宿主免疫力。这些结果表明，针对“细胞内癌蛋白”的抗体的MOA确实遵循通过经典抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或吞噬(ADCP)途径靶向“细胞外癌蛋白”以消除肿瘤的类似原理。最后，使用110个珍贵的新鲜冷冻人类肿瘤或其匹配的正常组织，我们进一步表明PRL-3是一种优良的肿瘤特异性靶标，在9种不同的人类癌症类型中平均≥78％广泛过表达：肝、肺、结肠、乳腺、胃、膀胱、前列腺、AML和肾病患者肿瘤样本，但不匹配正常组织。这些发现使得PRL3-珠单抗临床试验成为大多数“难以治疗”癌症的靶向免疫治疗的下一个前沿。
材料和方法
细胞系。人HCC细胞系Hep3B2.1、HepG2、Huh-7、PLC、SNU449购自American TypeCell Culture(马纳萨斯，维吉尼亚州，美国)。鼠HCC细胞系Hep53.4购自CLS Cell LinesService GmbH(埃佩尔海姆，德国)。所有细胞系均在其推荐培养基中培养。MHCC-LM3人HCC癌细胞系常规保存在Kam-Man Hui博士实验室(新加坡国立癌症中心)。
蛋白质印迹。对于患者组织，将3片5mm的组织悬浮在含有蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合物(Pierce)的RIPA裂解缓冲液(Sigma)中，并用组织匀浆器(Polytron)完全破碎。通过在4℃以13,000×g离心40分钟澄清裂解物。对于细胞系，在含有蛋白酶-磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解5×106个细胞，并如上所述澄清。将组织裂解液(40μg)或细胞裂解液(200μg)在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，转移至硝酸纤维素膜，然后在4℃下用鼠抗PRL-3 34或抗GAPDH抗体(克隆MAB374，Milipore)封闭和探测。用TBS-T缓冲液(20mM TrispH 7.6,140mM NaCl，0.2％Tween-20)彻底洗涤后，将膜与相应的辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的第二抗体以1：5,000稀释度孵育1小时，用TBS-T缓冲液洗涤，并使用化学发光底物(Pierce)显现。
动物模型和治疗。从生物资源中心(A*STAR，新加坡)获得的8周龄雄性BALB/c裸鼠用于该研究中的所有动物模型。用2.5％阿佛丁(每10g体重100μl)麻醉小鼠。通过从剑突下方开始的1cm中线切口分层打开麻醉小鼠的腹部。通过腹部切口取出肝左叶，并将3×106个MHCC-LM3肝癌细胞接种到包膜下层。将肝脏放回腹腔并将腹壁分层缝合。治疗方案在接种癌细胞后第5天开始。对于肿瘤生长/体积实验，静脉内给予100μg的PRL3-珠单抗、人IgG同种型对照(目录BE0092；Bio X Cell)或PRL3-微抗体的每种来治疗小鼠，每两周一次，持续5周。如有说明，通过共同施用100μg抗CD16/32抗体(克隆2.4G2；Bio X Cell)进行共处理。将所有抗体稀释到100μL(最终)PBS中用于注射。使用下式计算最终肿瘤体积：体积＝0.4×肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度。对于存活研究，静脉内给予治疗的小鼠100μlPBS稀释的100μg PRL3-珠单抗，每周两次，共10次。静脉内给予未治疗的小鼠等量安慰剂(仅缓冲液)作为对照。当小鼠体力活动减少并且出现生病时，将其安乐死并记录为生存分析中的“死亡”事件。
细胞分离。肿瘤细胞。收获原位MHCC-LM3肝肿瘤，并根据制造商的说明使用MACS组织解离试剂盒(130-095-929；Miltenyi Biotec)轻轻解离。该试剂盒针对高产量的肿瘤细胞进行了优化，同时保留了重要的细胞表面表位。随后对分离的肿瘤细胞进行计数，重悬浮于RPMI中，放置在冰上直至分析。培养细胞。MHCC-LM3PRL-3+肝癌细胞在T-75烧瓶中的完全RPMI培养基(RPMI补充10％FBS和1％抗生素)中以80％汇合指数生长，用PBS洗涤一次，并与非酶促细胞解离缓冲液(C5914；Sigma)一起温育5分钟，以将贴壁细胞移入悬浮液中。用PBS洗涤细胞一次，计数，重悬浮于完全RPMI培养基中，并放置在冰上直至分析。
细胞表面标记和流式细胞术分析。将4×105个细胞与2μg西妥昔单抗(抗EGFR，嵌合抗体)，赫赛汀(抗HER2，人源化抗体)，PRL3-珠单抗(抗PRL-3，人源化抗体)一起孵育，总体积为100μl在4℃下保持30分钟。没有添加任何一抗的单独管用作阴性对照。孵育后，向每个样品中加入1mL PBS，离心，并将细胞沉淀重悬于含有1.5μL抗人FITC抗体的100μLPBS中。在4℃温育15分钟后，如前所述用PBS洗涤细胞，最后重悬于200μLPBS中。使细胞通过细胞过滤器以获得单细胞悬浮液，并使用FACS Diva软件立即在配备有2个激光(488nm和633nm)的BD FACSCanto II流式细胞仪上获得(数据)。数据存储为FCS3文件，并使用FlowingSoftware版本2.5.1进行分析。基于FSC和SSC对活细胞进行门控。使用FSC和SSC宽度门控单个细胞。单抗体染色的细胞(仅二抗)和未染色的对照细胞用于补偿。
重组GST标记蛋白的制备和ELISA。先前已经描述了重组GST-PRL-1、GST-PRL-2和GST-PRL-3融合蛋白的制备和ELISA测定(59)。简而言之，用3％牛血清白蛋白封闭涂有指定抗原量的96孔ELISA板，然后在37℃下与0.5ng或1ng PRL-3微抗体一起温育2小时。在充分洗涤和二抗孵育后，使用Turbo-TMB底物(Pierce)进行比色显色，并通过用2M H2SO4酸化终止。使用读板器(Dynatech)在450nm下测量吸光度。
免疫荧光成像。使用低温恒温器(Leica)在16℃下将新鲜冷冻的MHCC原位肝肿瘤标本切成10μm切片。将载玻片用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS-0.05％Tween-20洗涤，并在室温下在PBS-FDB(PBS pH 7.0，2％BSA，5％山羊血清，5％胎牛血清)中封闭1h。随后将载玻片与指定的一抗在4℃以1：200稀释度温育过夜、洗涤，并与相应的荧光染料偶联的二抗(Life Technologies)一起温育2小时。将洗过的载玻片用含DAPI的抗褪色安装试剂(Vector Laboratories)固定并用指甲油密封。用LSM 800共聚焦显微镜(Zeiss AG)进行共聚焦成像。拍摄肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在肿瘤囊附近(正常和肿瘤组织的交界处)的肿瘤区域中的代表性图像(n＝3)。通过Image J软件分析免疫细胞(绿色)和DAPI阳性细胞(蓝色)的总数，并通过免疫细胞与DAPI的比率来确定TIL的百分比。平均3个图像的结果表示1个样本的数据。
结果
PRL-3‘细胞内癌蛋白’可在体内被鉴定为“细胞外癌蛋白”。
PRL-3抗体已显示出对表达PRL-3的异种移植肿瘤、转移性肺肿瘤和原位胃肿瘤的功效。为了解这些针对细胞内癌蛋白的非常规抗体治疗，PRL3抗体如何在免疫细胞上桥接细胞内PRL-3与FcγR？一种可能的假设是PRL-3本身的某些部分可能被翻转以在体内暴露于细胞表面以触发循环效应，从而允许直接PRL3-珠单抗结合，如同其他细胞表面(细胞外)抗原一样。为了测试这一点，我们使用温和的酶解法从固体肝肿瘤制备单细胞悬浮液，并使用流式细胞术方法比较这些离体肿瘤细胞与体外培养细胞的细胞表面表达(图20a)。这些未透化处理的细胞库的细胞计数分析揭示了它们之间的主要抗原特异性差异。西妥昔单抗是一种抗表皮生长因子受体(EGFR)嵌合抗体，与人工添加大量生长因子的培养细胞相比，体外肿瘤中EGFR表面表达显著降低，而PRL-3则相反(图20b中的代表性流动直方图)。定量测定显示离体肿瘤细胞(T)中表面EGFR染色相对于培养细胞减少3倍(CC；图20c，第3列与第4列)。相反，如PRL3-珠单抗染色分析的，PRL-3表达在离体肿瘤细胞中增加约7倍，其中体内，癌细胞处于低氧应激和血清剥夺，与培养细胞相比，可能增强癌细胞外化细胞内PRL-3蛋白的能力的条件(CC；图20c，第5列与第6列)。为了验证在流式细胞术中看到的这些变化是否可能是由于这些抗原的总细胞水平的变化，我们平行进行了裂解物的蛋白质印迹分析。与早期的细胞计数观察一致，与培养的细胞相比，EGFR的总水平在离体肿瘤细胞中显著下调(图20d)。相反，相对于原始细胞，PRL-3的表达在肿瘤中明显增加(图20d)。然而，由于PRL-3总水平的增加远小于PRL-3表面水平的增加，我们认为后一种观察可能主要归因于细胞内PRL-3的重新定位。为了验证这一点，进行了培养的MHCC细胞和MHCC肿瘤的透射电子显微镜(TEM)，其中观察到MHCC肿瘤中细胞膜的细胞外小叶上的抗PRL-3免疫金染色与MHCC细胞相比显著增加，而细胞膜的细胞内小叶没有显著差异。
PRL3-珠单抗在小鼠‘种子和土壤’原位肝肿瘤模型中以Fc依赖性方式显示出治疗功效
然后可以通过PRL-3抗体识别体内这些更高水平的“细胞外”PRL-3抗原以募集免疫细胞，并遵循针对传统细胞外癌蛋白的抗体治疗剂的经典ADCC和ADCP。原位肿瘤模型，其中允许人癌细胞(“种子”)在其天然位置(“土壤”)生长，以高保真度复制人类疾病。我们最近报道PRL3-珠单抗可以抑制由人胃癌细胞形成的PRL-3表达的原位胃肿瘤(8)。此外，我们发现PRL3-珠单抗还可以阻断切除后表达PRL-3的肿瘤复发。
在本研究中，为了更好地概括临床相关的治疗性HCC治疗反应16，我们建立了原位HCC模型，以测试PRL3-珠单抗在其天然生态位内抑制肝肿瘤的能力(图21a)。在筛选出PRL-3蛋白表达状态的6个人(1只小鼠？)肝癌细胞系的小组中(图21b)，只有PRL-3+MHCC-LM3细胞在合理的时间范围内(6周)稳健地形成肝肿瘤，并被选择用于后续的治疗实验。与原位胃肿瘤6类似，与未治疗的小鼠相比，PRL3-珠单抗治疗的小鼠中原位肝肿瘤形成明显减少(图21c)。与未治疗的小鼠相比，肿瘤体积的测量显示治疗小鼠的平均肿瘤负荷显著降低7倍(图21d；0.30±0.36对2.41±1.20cm3，P＝0.0001)。为了研究治疗是否会对小鼠存活具有长期影响，我们用PRL3-珠单抗治疗小鼠四周，停止治疗，并监测直到出现病态特征所需的时间(“死亡”事件)。按照这种治疗方案，与未治疗的小鼠相比，治疗小鼠的总生存期显著延长，中位生存时间分别为12周和8周(图21e；Kaplan-Meier生存分析，P＝0.002)。总的来说，我们的研究结果表明PRL3-珠单抗在这种临床相关的HCC模型中保留了治疗功效，显著降低了肿瘤负荷并延长了存活期。
为了解所涉及的分子机制，我们首先进行了体外试验，以分析PRL3-珠单抗是否可以直接抑制PRL-3+癌细胞。尽管PRL-3+肿瘤在体内受到显著抑制，但PRL3-珠单抗治疗在体外不抑制PRL-3+和PRL-3癌细胞生长，即使在50mg/mL的高剂量下也是如此(图24)。相反，顺铂治疗导致PRL-3+和PRL-3-细胞的剂量依赖性，非特异性细胞杀伤(图24)。这一发现再次证实PRL3-珠单抗与其他治疗性抗体一样，需要特异性宿主因子才能产生抗肿瘤作用15。在常规抗体疗法中，免疫细胞上的Fc受体(FcR)与抗原-抗体复合物的恒定(Fc)区域结合，导致它们通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)17募集和激活靶抗原/细胞清除的效应途径17。为了研究宿主FcR参与PRL3-珠单抗的作用机制，我们设计了2个互补实验(图20f)，即1)用PRL3-珠单抗和抗CD16/32抗体(2.4G2mAb)共同处理用PRL-3原位肝肿瘤接种的小鼠，通过阻断FcγII和FcγIII受体的结合位点，有效的IgG FcR介导的免疫清除抑制剂18，2)用缺乏CH1和CH2结构域的工程化(scFv-CH3)2PRL3-微抗体取代完整的PRL3-珠单抗，显示对结合Fc受体必不可少19,20。同样，用(scFv-CH3)2PRL3-微抗体治疗的肝肿瘤也没有治疗反应(图20g)。值得注意的是，对于原位PRL-3SNU-484胃肿瘤，(scFv-CH3)2PRL3-微抗体的治疗效果类似缺乏也是明显的(图25)，说明这不是组织特异性缺陷。此外，PRL3-珠单抗的CH1和CH2结构域的缺失不影响由此产生的微抗体与PRL-3的结合，如蛋白质印迹、ELISA和免疫荧光证实(数据未显示)，表明治疗效果的丧失不是由抗体小型化引起的潜在抗原结合缺陷引起的。总之，我们的结果证实PRL3-珠单抗的Fc结构域与宿主FcγII/III受体之间的相互作用对于PRL3-珠单抗的抗肿瘤作用是必需的。
PRL3-珠单抗将B淋巴细胞、自然杀伤细胞和M1巨噬细胞募集到表达PRL-3的肿瘤生态位中，用于体内癌细胞的杀伤
Fc-FcR相互作用在通过ADCC和ADCP清除肿瘤细胞中是重要的。尽管NK细胞是ADCC的主要效应物，但巨噬细胞是ADCP的效应物，后者越来越被认为是大多数批准用于治疗癌症的抗体背后的主要作用机制21。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤造口的重要元素，可以发挥动态，肿瘤发生过程中的相反作用，免疫刺激和杀肿瘤活性(M1巨噬细胞)与免疫抑制和促转移活性(M2巨噬细胞)之间的差异22。为了确定PRL3-珠单抗是否促进肿瘤生态位内中巨噬细胞和其他免疫细胞的浸润和积累，使用对不同巨噬细胞亚型特异的各种抗体对PRL-3+MHCC肝肿瘤切片进行免疫荧光检测：M1巨噬细胞(CD86)、泛巨噬细胞(F4/80)；M2巨噬细胞(CD206)、B细胞(CD45/B220)和NK细胞(CD335)。有趣的是，CD86+M1巨噬细胞的显著增加是明显的(图21c；F(5,12)＝7.127，p<0.0053)，而在用于积累F4/80+巨噬细胞和CD206+M2巨噬细胞的组平均值之间没有观察到显著差异(图2a，b)。类似地，还观察到所有治疗组中B细胞(图21d；F(5,12)＝40.14，P<0.001)和NK细胞(图21e；F(5,12)＝7.386，P<0.0046)的显著积累。值得注意的是，PRL3-珠单抗和2.4G2mAb的联合治疗导致PRL3-珠单抗诱导的积累逆转(图2c-e)，证实PRL3-珠单抗以FcR依赖性方式促进这些细胞的特异性积累。总之，我们的结果证实PRL3-珠单抗的Fc结构域和FcγII/III受体之间的相互作用对于肿瘤杀伤M1巨噬细胞、B细胞和NK细胞的募集是必需的，并且这些与体内抗肿瘤功效密切相关(图21f)。
PRL-3是一种新型肿瘤靶标，在多种人类癌症中频繁过度表达；PRL3-珠单抗将用于治疗这些多种PRL-3阳性人类癌症的紧急未满足的医疗需求
我们之前已经证明了PRL-3作为一种新型胃癌靶点的价值，其中在85％的新鲜冷冻胃肿瘤组织中检测到PRL-3表达，但在患者匹配的正常胃组织中未检测到PRL-3表达6。由于PRL-3转录物表达升高已在许多其他肿瘤类型2中描述，我们试图在难以获得的来自9种不同癌症类型的110个新鲜冷冻患者肿瘤样本中广泛表征PRL-3蛋白表达，特别是医疗需求未满足的侵略性恶性肿瘤。在这些来自我们临床合作者随机分配的新鲜冷冻样本中，我们在16/20肝脏肿瘤(80％；图23a)、9/10肺肿瘤(90％；图23b)、7/10结肠肿瘤(70％；图23c)、9/10乳腺肿瘤(90％；图23d)、13/18肾肿瘤(72％；图23e，f)、19/28膀胱肿瘤(68％；图23g)、6/12AML样品(50％；图23h)、5/6胃肿瘤(83％；图23i)和4/4前列腺肿瘤(100％；图23j)中检测到强烈的PRL-3表达。对于肝、肺、结肠、乳腺和肾脏肿瘤，我们设法从相同的器官获得新鲜冷冻的、患者匹配的非癌组织，这使得珍贵地了解PRL-3表达的特异性。值得注意的是，尽管在相应的匹配肿瘤中高表达，但在任何匹配的正常组织中均未检测到PRL-3(图4a-e)。总之，这些结果表明PRL-3是一种广泛的、与肿瘤相关的广泛靶点，在9种肿瘤类型中平均表达≥78％(表1)，并且突显PRL-3是多种癌症类型的优良靶点，特别是那些有紧急、未满足的医疗需求的人。
表1：不同肿瘤类型的PRL3表达的总结
讨论
本研究以我们之前的工作为基础，提供关于进一步剖析可能的抗体如何靶向“细胞内癌蛋白”的作用分子的确凿证据以及PRL3-珠单抗对多种PRL-3阳性人类癌症类型的未来治疗价值。我们对PRL-3的发现是肿瘤相关的靶标，在110个随机分析的新鲜冷冻人类癌症样本中以>78％的频率存在，并在本次和先前研究(参考文献)中利用原位胃肿瘤模型证实了PRL3-珠单抗在原位肝和肺肿瘤中具有显著的治疗益处，我们再次证明PRL3-珠单抗是这些急性恶性肿瘤的突破性免疫治疗候选药物，除了其他癌症之外，还有其他急需的医疗需求。
HCC的病理生理复杂性包括潜在的功能性肝功能不全，使HCC的医疗具有挑战性。移植后HCC的复发也是临床相关的问题。先前确定HCC进展中涉及的特定分子变化的努力产生的实际命中很少，特别是由于HCC的病因不同：超过90％的HCC是由肝硬化引起的，而肝硬化又是由多种因素引起的，包括酒精中毒、乙型肝炎或丙型肝炎感染，或肝脏中脂肪的积聚。关于HCC异质性的证据，过去六年来至少五项针对晚期肝癌的新型分子靶向药物的III期主要试验已经失败32。索拉非尼是最初的疗法，表明晚期HCC的死亡率有所改善，中位生存期延长2.8个月12。然而，在晚期HCC和肝功能障碍患者(Child-Pugh B患者)中治疗索拉非尼导致更差的生存结果33。因此，迫切需要发现对HCC患者具有高治疗功效和低毒性的新型分子靶向药物。在这里，80％的随机分析的肝癌患者样本中检测到PRL-3过表达，提供了PRL-3蛋白可能是这种病态疾病的常见标志物的第一个临床证据。值得注意的是，由于大多数主要人体器官缺乏PRL-3蛋白表达6，已经证实PRL3-珠单抗在非人灵长类动物毒理学研究中具有良好的耐受性，其中未观察到的不良事件水平(NOAEL)剂量高达36mg/kg(未发表的观察结果)。PRL3-珠单抗在这里报道的原位小鼠模型中的抗肿瘤功效为PRL3-HCC患者开始PRL3-珠单抗的早期试验提供了强有力的支持，作为一种安全、有效的治疗方式。
为了解决抗体如何识别细胞内癌蛋白，我们之前提供了三种可能的作用机制模型(MOA)，包括抗体可被癌细胞摄取..(CBT，2008)。在这项研究中，我们通过提供关于如何将‘细胞内癌蛋白’外化为‘细胞外癌蛋白’的证据来巩固MOA，因此，遵循癌细胞杀伤效应的经典途径，PRL3-珠单抗安全有效的抗肿瘤作用的机制解释，以PRL-3在肿瘤而非正常组织中的特异性和一致性上调为基础。实际上，肿瘤相关细胞内抗原的细胞表面重新定位为治疗干预提供了新的机会。褪黑、肿瘤坏死、肿瘤细胞杀伤裂解物、细胞凋亡，也可能促使细胞内蛋白质泄漏到肿瘤微环境中并引发体内免疫应答。除了PRL-3，实际上，肿瘤相关的其他细胞内蛋白的细胞表面重新定位也见诸描述，热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌动蛋白、细胞角蛋白、波形蛋白、核仁蛋白、核小体、雌激素受体-α变体36(ER-α36)和胎儿-腺泡胰蛋白(FAPP)(5)。由于已经投入大量精力来鉴定适合癌症中基于抗体的疗法的新抗原靶标，我们的结果在此重申，在恶性进展过程中经典“细胞内”胞质和核蛋白的细胞表面重定位可能是一种值得更多关注的常见肿瘤特异性现象，并且为越来越多的创新和合理的药物设计降低癌症发病率和死亡率奠定了基础。
我们理解在10％FBS培养基中人工条件限制细胞类型的细胞培养系统中反映体内肿瘤细胞杀伤事件的挑战，不可能模拟体内复杂性。我们认识到杀死培养皿中癌细胞的药物可能是因为药物自身的毒性。然而，我们表明，尽管体外PRL3-珠单抗处理PRL-3+癌细胞不会导致细胞生长的任何抑制，但是来自这些细胞的肿瘤可以在体内被PRL3-珠单抗有效抑制。
我们的研究结果为这一现象提供了两种解释。首先，‘细胞外PRL-3’的量在培养体系中是不显著的，从而不足以在体外进行ADCC，但在肿瘤细胞中高度上调到足以触发PRL3-珠单抗介导的癌细胞杀伤作用的水平。其次，与体内系统不同，体外系统未能涵盖PRL3-珠单抗诱导免疫介导的肿瘤细胞杀伤所必需的复杂宿主因子。
这些结果提供了可靠的证据，证明体内环境在影响目标蛋白的可药性及其治疗反应中起着重要作用，这种现象在基于简化培养条件的试验中可能被忽略。在这种情况下，我们发现Fc-宿主FcγR相互作用对于PRL3-珠单抗的抗肿瘤作用是必需的，宿主细胞中FcγR的阻断导致PRL3-珠单抗抗肿瘤作用的完全丧失，同时伴随B细胞、NK细胞和M1巨噬细胞的浸润减少，这对参与ADCC和ADCP很重要。巨噬细胞是肿瘤浸润性免疫细胞的主要群体之一，并且通常有利于肿瘤生长和转移。这主要是因为在晚期癌症中观察到，肿瘤进展期间的巨噬细胞极化事件通过诱导从M1到M2表型的分化促进肿瘤逃逸。M1细胞具有高杀微生物活性、免疫刺激功能和肿瘤细胞毒性。最近的荟萃分析研究已经确定了在肺23和胃24癌症患者中增加的杀肿瘤M1浸润与有利存活之间存在显著相关性。重要的是，PRL3-珠单抗治疗导致M1而非M2的特异性增加，巨噬细胞的累积。这是否反映了M1/M2极化向抗肿瘤表型的逆转，或M1巨噬细胞募集的特异性促进，需要进一步研究。有趣的是，PRL3-珠单抗导致的M1杀肿瘤活性的这种增强将其与其他尖端的TAM靶向抗肿瘤策略(如靶向NF-kB和STAT1途径)，以及用细胞因子(例如GM-CSF、IFN-g、IL-12)治疗以促进M1TAM极化25相并列。除了M1巨噬细胞外，PRL3-珠单抗还以FcγR依赖性方式促进NK细胞和B细胞的浸润以及抗肿瘤作用。尽管NK细胞是众所周知的ADCC的主要效应物，但对B细胞在抗肿瘤反应中的功能作用知之甚少。以前，当我们发现抗PRL-3单克隆抗体不能抑制B细胞成熟和活化缺陷的基因工程小鼠品系(muMT小鼠)中的PRL-3+肿瘤时，我们暗示B细胞具有抗肿瘤作用。研究表明肿瘤相关B细胞可以促进癌症免疫监视并抑制转移。已经发现B细胞向原发性人乳腺和卵巢肿瘤的更高浸润与更好的预后相关。已经显示化学疗法以与更好的抗肿瘤反应相关的方式促进抗肿瘤B细胞活化和瘤内积累。相反，B细胞耗竭损害T细胞依赖性抗肿瘤细胞毒性反应并促进肿瘤生长。有趣的是，在接受高剂量化疗并随后进行自体移植的淋巴瘤患者的回顾性分析中，注意到在高剂量化疗方案期间B细胞的耗尽导致实体瘤的发生率显著增加。总之，我们假设B细胞在一般抗肿瘤治疗的机械功效中发挥重要但未被充分认识的作用。
本研究中抗体和Fc受体Fc功能的重要证据，以及关键的免疫细胞募集，我们提出PRL3-珠单抗的作用机制主要涉及结合细胞表面PRL-3，然后通过经典ADCC或ADCP进行抗肿瘤清除，类似于其他受体靶向抗体如曲妥珠单抗和利妥昔单抗。我们的非常规抗体靶标‘细胞内癌蛋白’确保对抗体疗法的潜在癌症特异性治疗靶标的胞内大宝藏作进一步研究，因为“细胞内和细胞外癌蛋白”都通过ADCC和/或ADCP跟踪免疫介导的肿瘤细胞杀伤。我们的先驱新型癌症治疗将等待癌症免疫疗法的新时代，以便尽快使癌症患者受益。
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序列表
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<120> PRL3抗体
<130> FJS/FP7283633
<150> SG10201604834P
<151> 2016-06-14
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<400> 11
Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp Gly
20 25 30
Glu Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化轻链蛋白 HZD_K6
<400> 12
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp Gly
20 25 30
Glu Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化轻链蛋白 K
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp
20 25 30
Gly Glu Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化轻链蛋白 L1
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp
20 25 30
Gly Glu Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105 110
Thr
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化轻链蛋白 L2
<400> 15
Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp
20 25 30
Gly Glu Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105 110
Thr
<210> 16
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H1
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Leu Glu Trp Met Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ser
115
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H2
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ser
115
<210> 18
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H3
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ser
115
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H4
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H5
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ser
115
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H6
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ser
115
<210> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 HZD_H7
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Ser
115
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 H1
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 H2
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化重链蛋白 H3
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要轻链结构域序列
<400> 26
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要轻链结构域序列
<400> 27
Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp Gly Glu Asn Tyr Met Asn Trp
1 5 10 15
Tyr Gln Gln Lys
20
<210> 28
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要轻链结构域序列
<400> 28
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
1 5 10 15
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp
20 25 30
Pro Phe Thr
35
<210> 29
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要重链结构域序列
<400> 29
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
1 5 10 15
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His Trp
20 25 30
Val
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要重链结构域序列
<400> 30
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要重链结构域序列
<400> 31
Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
1 5 10
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重要重链结构域序列
<400> 32
Ala Ser Glu Glu Lys Asn Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
1 5 10 15
Thr Leu Val Thr
20
<210> 33
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 单克隆抗体223重链可变区
<400> 33
Glu Phe Met Glu Trp Ser Trp Val Ile Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ala Gly Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Glu
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Arg Asn Tyr Pro Trp Phe Ala
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr
130 135 140
Pro Pro Pro Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Ser Leu Gly
145 150 155
<210> 34
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 单克隆抗体223轻链可变区
<400> 34
Trp Glu Phe Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
20 25 30
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Val Glu Asp Asp Gly Glu Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn
65 70 75 80
Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Ser Lys Leu Gly
145 150
<210> 35
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 单克隆抗体318重链可变区
<400> 35
Glu Phe Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ala Gly Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Ala Arg Pro His Leu Gln Thr Asn Pro Pro
85 90 95
Ala Gln Pro Thr Cys Ser Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Leu Arg Ser
100 105 110
Ile Ser Val Gln Val Arg Arg Glu Leu Pro Leu Val Cys Leu Leu Gly
115 120 125
Pro Arg Asp Ser Gly His Cys Leu Cys Ser Gln Asn Asp Thr Pro Ile
130 135 140
Arg Leu Ser Pro Gly Pro Trp Lys Leu Gly
145 150
<210> 36
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 单克隆抗体318轻链可变区
<400> 36
Leu Val Asp Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
20 25 30
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala
35 40 45
Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn
65 70 75 80
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Trp Lys
130
<210> 37
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人PRL3序列
<400> 37
Met Ala Arg Met Asn Arg Pro Ala Pro Val Glu Val Ser Tyr Lys His
1 5 10 15
Met Arg Phe Leu Ile Thr His Asn Pro Thr Asn Ala Thr Leu Ser Thr
20 25 30
Phe Ile Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Gly Ala Thr Thr Val Val Arg Val
35 40 45
Cys Glu Val Thr Tyr Asp Lys Thr Pro Leu Glu Lys Asp Gly Ile Thr
50 55 60
Val Val Asp Trp Pro Phe Asp Asp Gly Ala Pro Pro Pro Gly Lys Val
65 70 75 80
Val Glu Asp Trp Leu Ser Leu Val Lys Ala Lys Phe Cys Glu Ala Pro
85 90 95
Gly Ser Cys Val Ala Val His Cys Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Pro
100 105 110
Val Leu Val Ala Leu Ala Leu Ile Glu Ser Gly Met Lys Tyr Glu Asp
115 120 125
Ala Ile Gln Phe Ile Arg Gln Lys Arg Arg Gly Ala Ile Asn Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Thr Tyr Leu Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Gln Arg Leu Arg Phe
145 150 155 160
Lys Asp Pro His Thr His Lys Thr Arg Cys Cys Val Met
165 170
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 结合序列
<400> 38
Lys Ala Lys Phe Tyr Asn
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 结合序列
<400> 39
His Thr His Lys Thr Arg
1 5

Claims (20)

1.一种结合PRL3的人源化抗体或抗体结合片段。
2.如权利要求1所述的人源化抗体或抗体结合片段，其中所述抗体或抗体结合片段含有CH1和CH2结构域。
3.如权利要求1所述的人源化抗体或抗体结合片段，其与包含氨基酸序列KAKFYN和/或HTHKTR的表位结合。
4.如前述权利要求中任一项所述的人源化抗体或抗体结合片段，其具有氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选氨基酸序列i)至vi)；
i)KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
ii)AASNLES(SEQ ID NO：5)
iii)QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
iv)GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
v)WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
或其变体，其中i)至vi)中的一个或多个序列中的一个、两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
5.如前述权利要求中任一项所述的人源化抗体或抗原结合片段，其具有至少一个包含以下CDR的轻链可变区：
LC-CDR1：KASQSVEDDGENYMN(SEQ ID NO：4)
LC-CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：5)
LC-CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO：6)
6.如前述权利要求中任一项所述的人源化抗体或抗原结合片段，其具有至少一个含有以下CDR的重链可变区：
HC-CDR1：GYTFTNYYMH(SEQ ID NO：1)
HC-CDR2：WIYPGNVNTYYNEKFRG(SEQ ID NO：2)
HC-CDR3：EEKNYPWFAY(SEQ ID NO：3)
7.一种体外复合物，任选分离的，包含与PRL3结合的前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
8.一种抗体或抗原结合片段，其包含如图7所示的重链和轻链可变区序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的人源化抗体、抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
10.如前述权利要求中任一项所述的人源化抗体或抗体结合片段，其用于治疗癌症的方法中。
11.一种方法，包括向患者施用如权利要求1所述的人源化抗体或抗体结合片段以治疗癌症。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是胃癌或胃癌转移。
13.如权利要求11所述的方法，其中人源化抗体或抗体结合片段是静脉内施用的。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述人源化抗体在远离待治疗的癌症的位置施用。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述方法包括向患有胃癌的患者施用所述人源化抗PRL3抗体，其中所述患者先前未接受过针对胃癌的抗代谢物疗剂，或者之前未接受过抗代谢物疗剂。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述抗代谢物疗剂是5-FU。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述患者已被确定为免疫系统没有受损。
18.一种体外方法，包括测定细胞中PRL3的细胞定位，其中PRL3在细胞表面的表达表明该细胞是癌性的。
19.如权利要求18所述的方法，其中与对照细胞相比，PRL3在细胞表面的表达增加2倍。
20.如权利要求18所述的方法，其中如果PRL3在细胞表面表达，则确定所述个体患有癌症，或选择所述个体以便用于抗癌治疗。
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