CN109661406A - 靶向肿瘤相关巨噬细胞的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的抗体及其用途。本发明人研究了暴露在巨噬细胞相关肿瘤表面的特异性标志物，以检测和靶向TAM。他们表明，肿瘤相关巨噬细胞表达在正常巨噬细胞中不存在的sideroflexin 3。本发明人进一步证明，使用针对sideroflexin 3的抗体，它们消耗了从LCC患者获得的PBMC样品中的TAM并强烈减少了白血病B细胞数量。

Description

靶向肿瘤相关巨噬细胞的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的抗体及其用途。

背景技术

在过去的十年中，人们越来越认识到肿瘤微环境在促进癌症发生和肿瘤生长中的重要性(H.Korkaya JCI,121,(10),3804–3809,2011；E.Lonardo,J.Frias-Aldeguer,CellCycle,11(7),1282–1290,2012；J.W.Pollard,Nature Reviews Immunology,9(4),259–270,2009)。

肿瘤微环境的特征在于慢性炎症，它不抑制肿瘤生长，而是通过刺激细胞增殖、激活癌症干细胞(CSC)和促进转移而有利于肿瘤形成(V.Plaks,Cell Stem Cell,16(3),225–238,2015；S.M.Cabarcas,L.A.International Journal of Cancer,129(10),2315–2327,2011)。引导肿瘤炎症反应的是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(R.Noy Immunity,41(1),49–61,2014)。几十年来，人们观察到大量TAM与疾病快速进展和患者预后不良之间存在相关性(L.Bingle,Journal of Pathology,196(3),254–265,2002；B.-Z.Qian Cell,141(1),39–51,2010)。然而，直到最近才解释了这种矛盾的表型。现在可以理解，这种相关性是由于TAM介导的旁分泌信号传导，其中巨噬细胞衍生因子激活CSC区室并促进CSC的干性特征，加剧肿瘤进展、转移，甚至CSC的化学抗性。

趋化因子(例如CCL2、CCL5和CXCL12)、CSF-1和补体级联组分介导单核细胞向肿瘤的浸润(E.Bonavita,Advances in Cancer Research,128,141–171,2015；E.Bonavita,Cell,160(4),700–714,2015)。一旦它们在肿瘤内，肿瘤环境迅速促进它们分化成肿瘤调节的巨噬细胞。最初认为TAM偏离M1表型，表达M2促肿瘤(protumor)标志物(BiswasSK.Nature Immunology,11(10),889–896,2010)。

为了更具体地鉴定M2样TAM和亚组，已经使用血红蛋白清道夫受体CD163(Heusinkveld M.The Journal of Immunology,187(3),1157–1165,2011；Martinez FO.,Annual Review of Immunology,27,451–483,2009)、巨噬细胞清道夫受体1CD204(BiswasSK.Nature Immunology,11(10),889–896,2010,Laoui,D.International Journal ofDevelopmental Biology,55(7–9),861–867,2011)、甘露糖受体CD206(Mantovani,A.Trends in Immunology,23(11),549–555,2002)、巨噬细胞受体CD68(Tang X,CancerLetter 2013,Takeuchi H,Oncol Lett 2016；Hu H,tumour biol 2016；Kim KJ,PlosOne2015)和最近的T-细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的蛋白-3(Tim-3)(Yan W.,Gut,64(10),1593–1604,2015)并取得了巨大成功。

由于认识到肿瘤微环境在促进癌症发生和肿瘤生长中的重要作用，特别是TAM的作用，TAM抑制和/或消耗代表了一种有吸引力的抗癌免疫治疗方法(Noy,R.,and Pollard,J.W.2014.Tumor-associated macrophages:from mechanisms to therapy.Immunity 41:49-61)。然而，开发的药物非常少，临床阶段的“抗TAM”疗法主要包括靶向CD115(TAM的功能标志物)(Cassier,P.A.,Italiano,A.,Gomez-Roca,C.A.,Le Tourneau,C.,Toulmonde,M.,Cannarile,M.A.,Ries,C.,Brillouet,A.,Muller,C.,Jegg,A.M.等2015.CSF1Rinhibition with emactuzumab in locally advanced diffuse-type tenosynovialgiant cell tumours of the soft tissue:a dose-escalation and dose-expansionphase 1study.Lancet Oncol 16:949-956)。

因此，需要一种新药物靶向肿瘤中存在的TAM。具体地，非常期望靶向TAM特异性生物标志物的药物。

发明简述

本发明涉及靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的抗体及其用途。具体地，本发明由权利要求所限定。

发明详述

发明人表明在肿瘤相关巨噬细胞(在白血病中TAM也称为护士样细胞(NLC))中存在sideroflexin 3，这在现有技术中从未提及。

更具体地，发明人提出证据表明，肿瘤相关巨噬细胞表达在正常巨噬细胞中不存在的sideroflexin 3。这是暴露在巨噬细胞相关肿瘤表面的第一个特异性标志物，因此为检测和靶向TAM提供了独特的机会(用于治疗癌症)。发明人进一步提出证据表明，使用针对sideroflexin 3的抗体，它们消耗了从LCC患者获得的PBMC样品中的TAM并强烈减少了白血病B细胞数量。

在本文中，发明人研究了暴露在巨噬细胞相关肿瘤表面上的特异性标志物，以检测和靶向TAM。通过用从LCC患者获得的TAM免疫小鼠，他们在200个级分之间回收了能够特异性识别TAM的四个抗体级分(四个杂交瘤，包括一个亚型：6-16、6-25、6-66-49和6-66-74)。出乎意料地，测序实验显示3个杂交瘤具有相同的VH和VL序列。他们惊奇地发现：1)级分中的抗体能够识别在巨噬细胞相关肿瘤表面特异性表达的sideroflexin 3蛋白；2)抗体对TAM具有特异性，并且不识别来自患者或健康供体的其他PBMC(如淋巴细胞B和T)或肿瘤细胞；3)在从LCC患者获得的PBMC样品中使用sideroflexin 3抗体消耗了TAM并减少了肿瘤细胞数量；和4)sideroflexin 3抗体还能够检测乳腺肿瘤样品中存在的TAM。因此，这些结果表明，靶向在TAM上表达的sideroflexin 3允许恢复在癌症中有益的抗肿瘤免疫力。

本发明的抗体

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

(a)重链，其中可变结构域包含：

-与SEQ ID NO：1所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR1；

-与SEQ ID NO：2所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR2；和

-与SEQ ID NO：3所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR3；

(b)轻链，其中可变结构域包含：

-与SEQ ID NO：4所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR1；

-与SEQ ID NO：5所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR2；和

-与SEQ ID NO：6所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR3；

(c)其以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

(a)重链，其中可变结构域包含：

-序列如SEQ ID NO：1所示的H-CDR1；和

-序列如SEQ ID NO：2所示的H-CDR2；和

-序列如SEQ ID NO：3所示的H-CDR3；

(b)轻链，其中可变结构域包含：

-序列如SEQ ID NO：4所示的L-CDR1；和

-序列如SEQ ID NO：5所示的L-CDR2；和

-序列如SEQ ID NO：6所示的L-CDR3。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

-重链，其中可变结构域与SEQ ID NO:7所示序列具有至少70％同一性；

-轻链，其中可变结构域与SEQ ID NO:8所示序列具有至少70％同一性；

并且其以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

-重链，其中可变结构域与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％同一性；

-轻链，其中可变结构域与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％同一性；

并且其以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

-重链，其中可变结构域与SEQ ID NO:7所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；

-轻链，其中可变结构域与SEQ ID NO:8所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；

并且其以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

-重链，其中可变结构域的序列如SEQ ID NO:7所示；

-轻链，其中可变结构域的序列如SEQ ID NO:8所示。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗体能够消耗肿瘤相关巨噬细胞。

评估TAM消耗的测试是本领域已知的。例如，以下测试用抗-CSF-1R评估NLC消耗：Avery Polk,Ye Lu,Tianjiao Wang,Erlene Seymour,Nathanael G.Bailey,JackW.Singer,Philip S.Boonstra,Megan S.Lim,Sami Malek,and RyanA.Wilcox.2016.Colony-stimulating Factor-1Receptor is Required for Nurse-likeCell Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia.Clin.Cancer Res.Jun 22.pii:clincanres.3099.2015。

本申请中的目标序列如下表1所示：

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同的含义，并且将在本发明中同等地使用。本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅包括完整抗体分子，还包括抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，lambda(1)和kappa(k)。有五种主要的重链类型(或同种型)决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域结构并因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点通常包括六个CDR，其包含来自每一个重链和轻链V区的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。在本发明的上下文中，本发明抗体的氨基酸残基根据IMGT编号系统编号。已经定义了IMGT独特编号以比较可变结构域，无论抗原受体、链类型或物种如何(Lefranc M.-P.,"Unique databasenumbering system for immunogenetic analysis"Immunology Today,18,509(1997)；Lefranc M.-P.,"The IMGT unique numbering for Immunoglobulins,T cell receptorsand Ig-like domains"The Immunologist,7,132-136(1999).；Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.andLefranc,G.,"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains"Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。在IMGT独特编号中，保守氨基酸总是具有相同的位置，例如半胱氨酸23、色氨酸41、疏水氨基酸89、半胱氨酸104、苯丙氨酸或色氨酸118。IMGT独特编号提供框架区(FR1-IMGT：1至26位、FR2-IMGT：39至55、FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的标准化划界。如果CDR3-IMGT长度小于13个氨基酸，则按以下顺序从环的顶部产生空位：111、112、110、113、109。如果CDR3-IMGT长度超过13个氨基酸，则按以下顺序在CDR3-IMGT环顶部的111位和112位之间产生另外的位置：112.1、111.1、112.2、111.2、112.3、111.3等(http:// www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html)。

如本文所用，术语“特异性”是指抗体可检测地结合抗原上存在的表位(例如sideroflexin-3)，同时与非sideroflexin-3蛋白或结构(例如在TAM或其他细胞类型上表达的其他蛋白质)具有相对较少的可检测反应性的能力。特异性可以通过结合或竞争性结合测定来相对确定，使用例如Biacore仪器，如本文其他地方所述。特异性可以表现为例如在与特异性抗原的结合相对于与其他不相关分子的非特异性结合中亲和力/亲合力为约10：1、约20：1、约50：1、约100：1、10,000：1或更高比例(在特异性抗原是sideroflexin-3的情况下)。

如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力表示为解离常数Kd，其定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka定义为1/Kd。确定mAb亲和力的优选方法可参见Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan等,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience,N.Y.,(1992,1993),和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，其通过引用整体并入本文。本领域熟知的用于测定mAb亲和力的一种优选的标准方法是使用Biacore仪器。

可以通过本领域已知的任何方法测定本发明抗体的特异性结合。对于表位结合可使用许多不同的竞争性结合测定形式。可以使用的免疫测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素测定、凝胶扩散沉淀素测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定和补体固定测定等技术的竞争测定系统。此类测定是常规的并且是本领域熟知的(参见例如Ausubel等,eds,1994CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&sons,Inc.,New York)。例如，(GE Healthcare，Piscaataway，NJ)是多种表面等离子体共振测定形式之一，其常规用于单克隆抗体的表位区组(epitope bin panel)。另外，可以进行常规的交叉阻断测定，例如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow和David Lane，1988中描述的那些。

本文所用的术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组合物”、“mAb”等是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，考虑到空位(其需要引入以便最佳对齐两个序列)的数量和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数#/位置总数#×100)。如下所述，可以使用数学算法完成序列比较并确定两个序列之间的同一性百分比。

两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入ALIGN程序的E.Myers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.4：11-17,1988)算法来测定。另外，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443-453,1970)算法测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已经结合到GCG软件包的GAP程序中。测定同一性百分比的另一个程序是CLUSTAL(M.Larkin等，Bioinformatics 23：2947-2948,2007；首先由D.Higgins和P.Sharp描述，Gene 73：237-244,1988)，其可作为独立程序或通过Web服务器获得(参见http://www.clustal.org/)。

两个核苷酸氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用例如算法，例如用于核酸序列的BLASTN程序，使用默认值，字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并对两条链进行比较来测定。

如本文所用，术语“sideroflexin 3”或“SFXN3”，也称为“SFX3；”或“BA108L7.2”是Sideroflexin蛋白的一个成员，并且是指在人中由SFXN3基因[基因ID：81855]编码的蛋白质。Sideroflexin通常被称为参与线粒体中铁转运的蛋白质。此外，还报道了人Sideroflexin在胰腺β细胞分化中起重要作用(Yoshikumi Y,J Cell Biochem.,95,1157-1168(2005))。野生型sideroflexin 3人氨基酸序列的一个实例在NCBI网站上提供，参考序列：NP_112233。编码野生型sideroflexin 3氨基酸序列的核苷酸序列的一个实例在NCBI网站上提供，参考序列：NM_030971。

术语“肿瘤相关巨噬细胞”或“TAM”具有其在本领域中的一般含义，并且旨在描述属于巨噬细胞谱系的一类细胞。它们在肿瘤块附近或肿瘤块内发现(Shih,J-Y.,Journalof Cancer Molecules 2(3):101-106 2006)。TAM来自循环的单核细胞或常驻组织巨噬细胞，其形成在许多肿瘤类型的基质内发现的主要白细胞浸润物。越来越多的证据表明它们参与促肿瘤(例如通过肿瘤血管生成促进生长和转移)过程(Birbrair,A.AmericanJournal of Physiology.Cell Physiology 307(1):C25–C38.2014；Thoreau,M；Oncotarget 6(29)27832-27832 2015)。TAM与肿瘤微环境中的多种生长因子、细胞因子和趋化因子(其被认为教化TAM并确定它们的特定表型并因此确定不同类型肿瘤之间随着微环境变化它们的功能作用)相互作用。因此，已经证明TAM取决于它们相关的肿瘤类型而作用不同(Lewis,CE；Cancer Research66(2):605–612.(2006))。在许多肿瘤类型中，已显示TAM浸润水平具有显著的预后价值。TAM与乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤和淋巴瘤类型的预后不良有关；与结肠癌和胃癌的预后较好有关，以及与肺癌和前列腺癌的预后不良和预后较好有关(Allavena,P.Critical Reviews in Oncology/Hematology 66:1.(2008))。在白血病中，TAM也称为护士样细胞(NLC)。

可以通过本领域已知的任何合适的方法确定并证明TAM细胞的调控/抑制功能(Qian BZ和Pollard JW，Cell，2010，vol 141,1：39-41)。具体地，这些测试的例子在实施例部分列出。特别地，实施例中体现的测试被认为是用于评估TAM功能的标准体外测试。

在一些实施方案中，根据本发明的肿瘤相关巨噬细胞是哺乳动物肿瘤相关巨噬细胞，更具体地人肿瘤相关巨噬细胞。

在一个实施方案中，本发明的抗体根据Kabat系统定义。

抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等人设计的系统编号。该系统如Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department ofHealth and Human Services，NIH，USA(以下称“Kabat等”)所述。Kabat残基命名并不总是直接对应于SEQ ID序列中氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸序列可含有比严格Kabat编号中更少或更多的氨基酸，这对应于基本可变结构域结构的结构组分(构架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号的序列比对，可以确定给定抗体的正确Kabat残基编号。根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35B(H-CDR1)、残基50-65(H-CDR2)和残基95-102(H-CDR3)。根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(L-CDR1)、残基50-56(L-CDR2)和残基89-97(L-CDR3)。

根据Kabat系统，本发明抗体的六个CDR是：

-H-CDR1:SEQ ID NO:11:GFSLTGY；

-H-CDR2:SEQ ID NO:12:WGDGS；

-H-CDR3:SEQ ID NO:13:DLKFAY；

-L-CDR1:SEQ ID NO:14:KASQHVTTAVA；

-L-CDR2:SEQ ID NO:15:SASFRYT；

-L-CDR3:SEQ ID NO:16:QQHYTTPWT。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

(a)重链，其中可变结构域包含：

-与SEQ ID NO：11所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR1；

-与SEQ ID NO：12所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR2；和

-与SEQ ID NO：13所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR3；

(b)轻链，其中可变结构域包含：

-与SEQ ID NO：14所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR1；

-与SEQ ID NO：15所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR2；和

-与SEQ ID NO：16所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR3；

(c)其以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含：

(a)重链，其中可变结构域包含：

-序列如SEQ ID NO：11所示的H-CDR1；和

-序列如SEQ ID NO：12所示的H-CDR2；和

-序列如SEQ ID NO：13所示的H-CDR3；

(b)轻链，其中可变结构域包含：

-序列如SEQ ID NO：14所示的L-CDR1；和

-序列如SEQ ID NO：15所示的L-CDR2；和

-序列如SEQ ID NO：16所示的L-CDR3。

通过本领域已知的任何技术产生本发明的抗体，例如但不限于单独或组合的任何化学、生物学、遗传学或酶学技术。通常，已知所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以容易地通过产生多肽的标准技术产生所述抗体。例如，可以使用熟知的固相方法，优选使用市售的肽合成装置(例如Applied Biosystems，Foster City，California制造)并根据制造商的说明合成它们。或者，可以通过本领域熟知的重组DNA技术合成本发明的抗体。例如，在将编码抗体的DNA序列整合入表达载体并将这些载体引入合适的将表达所需抗体的真核或原核宿主中后，可以获得作为DNA表达产物的抗体，之后可以使用已知技术从宿主中分离它们。

在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体是嵌合抗体，尤其是嵌合小鼠/人抗体。

根据本发明，术语“嵌合抗体”是指包含非人抗体的VH结构域和VL结构域以及人抗体的CH结构域和CL结构域的抗体。

在一些实施方案中，本发明的人嵌合抗体可以通过以下来制备：获得编码如前所述的VL和VH结构域的核酸序列，通过将它们插入用于动物细胞的表达载体来构建人嵌合抗体表达载体，所述动物细胞具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因，和通过将表达载体引入动物细胞来表达编码序列。作为人嵌合抗体的CH结构域，其可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，但IgG类的那些是合适的，并且也可以使用属于IgG类的任何一个亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。同样，人嵌合抗体的CL可以是属于Ig的任何区域，也可以使用κ类或λ类的区域。产生嵌合抗体的方法涉及本领域熟知的常规重组DNA和基因转染技术(参见Morrison SL.等(1984)和专利文件US5,202,238；和US5,204,244)。

在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体是人源化抗体。具体地，在所述人源化抗体中，可变结构域包含人受体框架区和任选的人恒定结构域(如果存在)和非人供体CDR，例如小鼠CDR。

在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体基于人源化的相同方法是犬源化或灵长类化的。

根据本发明，术语“人源化抗体”是指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区，但保留之前非人抗体的CDR的抗体。

本发明的人源化抗体可以通过以下来制备：如前所述获得编码CDR结构域的核酸序列，通过将它们插入用于动物细胞的表达载体来构建人源化抗体表达载体，所述动物细胞具有编码(i)与人抗体相同的重链恒定区和(ii)与人抗体相同的轻链恒定区的基因，和通过将表达载体引入动物细胞来表达基因。人源化抗体表达载体可以是以下任一类型：编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于不同的载体上，或两个基因存在于相同载体上(串联型)。就构建人源化抗体表达载体的容易性、引入动物细胞的容易性和动物细胞中抗体H链和L链的表达水平之间的平衡而言，优选串联型的人源化抗体表达载体。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18等。基于常规重组DNA和基因转染技术产生人源化抗体的方法是本领域熟知的(参见例如，Riechmann L.等1988；Neuberger MS.等1985)。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包括例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan EA(1991)；Studnicka GM等(1994)；Roguska MA等(1994))和链替换(美国专利号5,565,332)。用于制备此类抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。

本发明的抗体片段

在一个实施方案中，本发明的抗体是选自下组的抗原结合片段：Fab、F(ab)'2、单结构域抗体、ScFv、Sc(Fv)2、双抗体、三抗体、四抗体、单抗体(unibody)、微抗体、巨抗体、小型模块化免疫药物(SMIP)、作为分离的互补决定区(CDR)的由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元，和包含以下或由以下组成的片段：与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL链或VH链以及氨基酸序列。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指完整抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合给定抗原(例如sideroflexin-3)的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段进行。术语抗体的抗原结合片段涵盖的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；Fab'片段，由VL、VH、CL、CH1结构域和铰链区组成的单价片段；F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab'片段的二价片段；由抗体单臂的VH结构域组成的Fd片段；单结构域抗体(sdAb)片段(Ward等，1989Nature 341：544-546)，其由VH结构域或VL结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过人工肽接头将它们连接，所述接头使得它们能够作为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链制备(称为单链Fv(ScFv)；参见例如Bird等，1989Science 242：423-426；和Huston等，1988proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合自发形成，或可以通过肽接头偶联单价scFv产生，例如二价sc(Fv)2。此类单链抗体包括一个或多个抗原结合部分或抗体片段。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。单抗体是另一种缺乏IgG4抗体铰链区的抗体片段。铰链区的缺失导致分子基本上是传统IgG4抗体的一半大小并且具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。抗原结合片段可以整合入单结构域抗体、SMIP、巨抗体、微抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体和四抗体中(参见，例如，Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23,9,1126-1136)。术语“双抗体”、“三抗体”或“四抗体”是指具有多价抗原结合位点(2、3或4)的小抗体片段，该片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。抗原结合片段可以整合入包含一对串联的Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，所述串联的Fv区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,1995Protein Eng.8(10)；1057-1062和美国专利号5,641,870))。

本发明的Fab可以通过用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理与sideroflexin-3特异性反应的抗体而获得。此外，可以通过以下来生产Fab：将编码抗体Fab的DNA插入用于原核表达系统或用于真核表达系统的载体，并将载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达Fab。

本发明的F(ab')2可以通过用蛋白酶(胃蛋白酶)处理与sideroflexin-3特异性反应的抗体而获得。此外，F(ab')2可以通过用硫醚键或二硫键结合下述Fab'来制备。

本发明的Fab'可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理与sideroflexin-3特异性反应的F(ab')2而获得。此外，可以通过以下来生产Fab'：将编码抗体的Fab'片段的DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体中，并将载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以进行表达。

可以通过以下来生产本发明的scFv：获得如前所述编码VH和VL结构域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体，然后将表达载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达scFv。为制备人源化scFv片段，可以使用称为CDR移植的公知技术，其涉及从供体scFv片段选择互补决定区(CDR)，并将它们移植到已知三维结构的人scFv片段框架上(参见例如，WO98/45322、WO87/02671、US5,859,205、US5,585,089、US4,816,567、EP0173494)。

结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元-分子量约为13kDa-且对应于抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体及其制备方法的更多细节可发现于US 6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197和6,696,245；US 2004/0110941；EP 1433846,0368684和0616640；WO 2005/035572、2004/101790、2004/081026、2004/058821、2004/003019和2003/002609，其每一个的全文通过引用并入本文。

单抗体是另一种基于去除IgG4抗体的铰链区的抗体片段技术。铰链区的缺失导致分子基本上是传统IgG4抗体的一半大小并且具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。此外，由于单抗体较小，它们在较大实体瘤中显示更好的分布，具有潜在有利的功效。可以参考其全文通过引用并入本文的WO 2007/059782获得单抗体的更过细节。

核酸分子、载体和宿主细胞

本发明的进一步目的涉及编码本发明抗体的核酸分子。更具体地，核酸分子编码本发明抗体的重链或轻链。

在一个具体的实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％同一性的核酸序列。

更具体地，核酸分子包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80％同一性的核酸序列。

更具体地，核酸分子包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少90％同一性的核酸序列。

更具体地，核酸分子包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少91、92、93、94、95、96、97、9或99％同一性的核酸序列。

可变结构域重链：核酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4：SEQ ID NO：9

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGATCTCAAATCCAGACTGAGCATCACCGAGGACAACTCCAAGCGCCAAGTTTTCTTAAAAATGGACAGTCTGAAACTGAAGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGATCTTAAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

可变结构域轻链：核酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4:SEQ ID NO:10

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCTCATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAACATGTGACTACTGCTGTTGCCTGGTTTCAACAGAAACCAGGACAATTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包含于任何合适的载体，例如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。如本文所用，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的介质。因此，本发明的另一个目的涉及包含本发明核酸的载体。此类载体可包含调控元件，例如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者时引起或指导所述抗体的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T等1987)、Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等1985)和增强子(Gillies SD等1983)等。合适载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等1990)、pAGE103(Mizukami T等1987)、pHSG274(Brady G等1984)、pKCR(O'Hare K等1981)、pSG1βd2-4(Miyaji H等1990)等。质粒的其他实例包括含有复制起点的复制质粒，或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类重组病毒可通过本领域已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒进行瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中找到。

本发明的进一步方面涉及通过根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将“外源”(即外部或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需的物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞被“转化”。

本发明的核酸可用于在合适的表达系统中生产本发明的抗体。术语“表达系统”是指在合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如，其用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母或酵母菌、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)有缺陷的CHO细胞(Urlaub G等；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，以下称为“YB2/0细胞”)等。本发明还涉及用于生产表达根据本发明的抗体的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将如上所述的重组核酸或载体体外或离体引入感受态宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这些重组宿主细胞可用于生产本发明的抗体。通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析适当地从培养基分离本发明的抗体。

功能性变体和竞争性抗体

本发明提供包含6-25抗体的VL区、VH区、或一个或多个CDR的功能性变体的抗体。在本发明单克隆抗体的上下文中，所用的VL、VH或CDR的功能性变体仍然允许抗体保留亲本抗体(即6-25抗体)的至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的亲和力/亲合力和/或特异性/选择性，并且在某些情况下，本发明的这种单克隆抗体可能具有比亲本Ab更高的亲和力、选择性和/或特异性。这种变体可以通过多种亲和力成熟方案获得，包括突变CDR(Yang等,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链替换(Marks等,Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌的突变菌株(Low等,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等(以上)讨论了这种亲和力成熟的方法。这种功能性变体通常保留显著的与亲本Ab的序列同一性。CDR变体的序列可能通过大多数保守性替换与亲本抗体序列的CDR序列不同，例如变体中至少约35％、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多(例如，约65％-95％，例如约92％、93％或94％)的替换是保守性氨基酸残基替代。CDR变体的序列可能通过大多数保守性替换与亲本抗体序列的CDR序列不同，例如变体中至少10个，例如至少9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个替换是保守性氨基酸残基替代。在本发明上下文中，保守性替换可以定义为如下所反映的氨基酸类别内的替换：

脂族残基I、L、V和M。

环烯基相关残基F、H、W和Y。

疏水性残基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y。

带负电荷的残基D和E。

极性残基C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T。

带正电荷的残基H、K和R。

小残基A、C、D、G、N、P、S、T和V。

非常小的残基A、G和S。

涉及转角的残基A、C、D、E、G、H、K、N，Q、R、S、P和涉及形成的残基T。

柔性残基Q、T、K、S、G、P、D、E和R。

更多的保守性替换分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。与6-25抗体的CDR相比，变体CDR基本上保留了在亲水(hydropathic)/亲水性质和残基重量/大小方面的保守性。本领域通常理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性。已经接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这又限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。根据它们的疏水性和电荷特征，为每种氨基酸指定了亲水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。类似残基的保留也可以或替代地通过相似性得分来测量，如使用BLAST程序来测定(例如，可通过NCBI获得的BLAST 2.2.8，使用标准设置BLOSUM62，Open Gap＝11和ExtendedGap＝1)。合适的变体通常表现出与亲本肽至少约70％的同一性。根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少70％同一性是指第一序列与第二氨基酸序列具有70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％同一性。根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少90％同一性是指第一序列与第二氨基酸序列具有90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％同一性。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有重链的抗体，所述重链包含i)与本发明抗体的H-CDR1具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的H-CDR1，ii)与本发明抗体的H-CDR2具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的H-CDR2，和iii)与本发明抗体的H-CDR3具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的H-CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有轻链的抗体，所述轻链包含i)与本发明抗体的L-CDR1具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的L-CDR1，ii)与本发明抗体的L-CDR2具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的L-CDR2，和iii)与本发明抗体的L-CDR3具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的L-CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有重链和轻链的抗体，所述重链包含i)与本发明抗体的H-CDR1具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的H-CDR1，ii)与本发明抗体的H-CDR2具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的H-CDR2，和iii)与本发明抗体的H-CDR3具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的H-CDR3，所述轻链包含i)与本发明抗体的L-CDR1具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的L-CDR1，ii)与本发明抗体的L-CDR2具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的L-CDR2，和iii)与本发明抗体的L-CDR3具有至少90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性的L-CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有重链的抗体，所述重链包含i)本发明抗体的H-CDR1，ii)本发明抗体的H-CDR2，和iii)本发明抗体的H-CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有轻链的抗体，所述轻链包含i)本发明抗体的L-CDR1，ii)本发明抗体的L-CDR2，和iii)本发明抗体的L-CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有重链和轻链的抗体，所述重链包含i)本发明抗体的H-CDR1，ii)本发明抗体的H-CDR2，和iii)本发明抗体的H-CDR3，所述轻链包含i)本发明抗体的L-CDR1，ii)本发明抗体的L-CDR2，和iii)本发明抗体的L-CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有重链的抗体，所述重链与SEQ ID NO：7具有至少70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有轻链的抗体，所述轻链与SEQ ID NO：8具有至少70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有重链和轻链的抗体，所述重链与SEQ IDNO：7具有至少70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性，所述轻链与SEQ ID NO：8具有至少70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％同一性。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有与SEQ ID NO：7相同的重链的抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有与SEQ ID NO：8相同的轻链的抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体是具有与SEQ ID NO：7相同的重链和与SEQ IDNO：8相同的轻链的抗体。

在另一个方面，本发明提供与本发明抗体竞争结合sideroflexin-3的抗体。

如本文所用，在抗体结合预定抗原或表位的上下文中，术语“结合”通常是指当例如在BIAcore 3000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术，使用可溶形式的抗原作为配体并且抗体作为分析物进行测定时，结合的亲和力对应于约10-7M或更低、例如约10-8M或更低、例如约10-9M或更低、约10-10M或更低，或约10-11M或甚至更低的KD。(GE Healthcare，Piscaataway，NJ)是多种表面等离子体共振测定形式之一，其常规用于单克隆抗体的表位区组。通常，抗体结合预定抗原的亲和力的KD比结合与预定抗原不相同也不紧密相关的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD低至少十倍、例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍。当抗体的KD非常低(即，抗体具有高亲和力)时，其结合抗原的KD通常比非特异性抗原的KD低至少10,000倍。如果这种结合是不可检测的(例如，在BIAcore 3000仪器中使用等离子体共振(SPR)技术，使用可溶形式的抗原作为配体并且抗体作为分析物)，或这种结合比检测到的该抗体和具有不同化学结构或氨基酸序列的抗原或表位的结合低100倍、500倍、1000倍或1000倍以上，则称该抗体基本上不结合抗原或表位。

抗体工程化

本发明的工程化抗体包括其中对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，以例如改善抗体性质的抗体。通常，进行这样的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”到相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定这些残基。为了使框架区序列恢复其种系构型，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”至种系序列。这种“回复突变”抗体也涵盖在本发明中。另一种类型的框架修饰涉及突变框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等的美国专利公开号20030153043中进一步详细描述。

在一些实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以改变糖基化以在增加抗体对抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。该方法在Carr等的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。

在一些实施方案中，对位于第一CDR(CDR1)内及其附近的聚集“热点”中的氨基酸进行一些突变以降低抗体对聚集的易感性(参见Joseph M.Perchiacca et al.,Proteins2011；79:2637–2647)。

本发明的抗体可以是任何同种型。同种型的选择通常由期望的效应子功能来指导。IgG1和IgG3是介导例如ADCC或CDC的效应子功能的同种型，而IgG2和IgG4不介导或以较低的方式介导。可以使用轻链恒定区中的任一个，κ或λ。如果需要，可以通过已知方法转换本发明的单克隆抗体的类别。通常，类别转换技术可用于将一个IgG亚类转换成另一个，例如从IgG1转变为IgG2。因此，为各种治疗用途，本发明单克隆抗体的效应子功能可以通过同种型转换为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体来改变。

在一些实施方案中，本发明的抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG3抗体。

在一些实施方案中，修饰CH1的铰链区从而改变(例如，增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基的数量。该方法在Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述。例如，改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基的数量以促进轻链和重链的组装，或提高或降低抗体的稳定性。

在一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，从而改变抗体的效应子功能。例如，可用将一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，使得抗体对效应子配体具有不同的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变其亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或其补体。该方法在Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。

在一些实施方案中，可以将选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等的美国专利号6,194,551中进一步详细描述。

在一些实施方案中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸增加抗体对Fc受体的亲和力。该方法在Presta的PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，已经定位了IgG1上对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改进结合的变体(参见R.L.等,2001J.Biol.Chen.276:6591-6604,WO2010106180)。

术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域熟知的术语，是指细胞介导的以下反应：表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞裂解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞激活。

另外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基或不具有岩藻糖基残基的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体，或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如Hang等的EP1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化或缺乏岩藻糖基残基。因此，在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体可以通过在表现出低岩藻糖基化或非岩藻糖基化模式的细胞系(例如，编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因表达缺陷的哺乳动物细胞系)中重组表达来产生。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系(Lecl3细胞)，其将岩藻糖连接至与Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields,R.L.等,2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在该工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等,1999Nat.Biotech.17：176-180)。Eureka Therapeutics进一步描述了基因工程化CHO哺乳动物细胞，其能够产生不含岩藻糖残基的具有改变的哺乳动物糖基化模式的抗体(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。或者，本发明的单克隆抗体可以在工程化用于哺乳动物样糖基化模式且能够产生缺乏岩藻糖作为糖基化模式的抗体的酵母或丝状真菌中产生(参见例如EP1297172B1)。

半衰期

在一些实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375中所述，可以引入一种或多种下列突变：T252L、T254S、T256F。或者，为了增加生物半衰期，如Presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022所述，可以改变抗体的CH1或CL区，以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。US2005/0014934A1(Hinton等)描述了具有增加的半衰期和改进的与新生儿Fc受体(FcRn，负责将母体IgG转移至胎儿)的结合的抗体(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.immunol.24:249(1994))。那些抗体包含具有一个或多个替换的Fc区，所述替换改进Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基处具有替换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的替换(美国专利号7,371,826)。

本发明预期的本发明抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常在其中一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖用于衍生其他蛋白质的PEG的任何形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等的EP0154316和Ishikawa等的EP0401384。

本发明预期的抗体的另一种修饰是将至少本发明抗体的抗原结合区与血清蛋白(例如人血清白蛋白)或其片段偶联或蛋白融合，以增加所得分子的半衰期。例如Balance等的EP0322094描述了这种方法。另一种可能性是将至少本发明抗体的抗原结合区与能够结合血清蛋白(例如人血清白蛋白)的蛋白质融合，以增加所得分子的半衰期。如Nygren等的EP0486525描述了这种方法。

聚唾液酸化是另一种技术，它使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长治疗性肽和蛋白质的活性寿命并提高稳定性。PSA是唾液酸(糖)的聚合物。当用于递送蛋白质和治疗性肽药物时，聚唾液酸在偶联时提供保护性微环境。这增加了治疗性蛋白质在循环中的活性寿命，并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。它被某些细菌所采用，这些细菌已经进化了数百万年以用它来涂覆它们的细胞壁。然后，这些天然的聚唾液酸化细菌凭借分子模拟能够阻止身体的防御系统。PSA，大自然的终极秘密技术，可以很容易地从这些细菌中大量生产并具有预定的物理特性。即使与蛋白质偶联，细菌PSA也是完全无免疫原性的，因为它在化学上与人体中的PSA相同。

另一种技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是一种来自蜡质玉米淀粉的改性天然聚合物，可以通过机体的酶代谢。通常施用HES溶液以替代不足的血液体积并改进血液的流变学特性。抗体的羟乙基化能够通过增加分子的稳定性以及通过降低肾清除率来延长循环半衰期，从而导致生物活性增加。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制多种HES抗体偶联物。

在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域的SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该方法在Ward等的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。

其他修饰

在本发明的某些实施方案中，已经将抗体工程化以增加pI并改进其药物样特性。蛋白质的pI是分子整体生物物理特性的关键决定因素。已知具有低pI的抗体溶解性较差、稳定性较差且易于聚集。此外，纯化具有低pI的抗体是具有挑战性的，并且尤其在用于临床使用的放大期间可能是有问题的。增加本发明抗体或其片段的pI改进它们的溶解度，使得抗体能够以更高的浓度(>100mg/ml)配制。高浓度(例如>100mg/ml)的抗体的配制提供了能够通过玻璃体内注射向患者的眼睛施用更高剂量的抗体的优点，这反过来可以减少给药频率，这是治疗慢性病包括心血管疾病的重要优点。更高的pI还可以增加IgG形式抗体的FcRn介导的再循环，从而使药物在体内持续更长的持续时间，需要更少的注射。最后，由于更高的pI导致更长的保质期和体内生物活性，抗体的总体稳定性显著提高。优选地，pI大于或等于8.2。

包含本发明抗体的抗原结合结构域的CAR-T细胞

本发明还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含本发明抗体的抗原结合结构域。通常，所述嵌合抗原受体包含本发明抗体的至少一个VH和/或VL序列。本发明的嵌合抗原受体还包含细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”具有其在本领域中的一般含义，是指人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的抗体(例如，scFv)的抗原结合结构域。CAR的特征包括利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重新定向到选定靶标的能力。非MHC限制性抗原识别为表达CAR的T细胞提供不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。

在一些实施方案中，本发明提供了包含抗原结合结构域的CAR，所述抗原结合结构域包含本发明抗体的单链可变片段(scFv)，或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含接头肽。接头肽可位于轻链可变区和重链可变区之间。

在一些实施方案中，CAR包含细胞外铰链结构域、跨膜结构域和选自CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内结构域的细胞内T细胞信号传导结构域。CD28是T细胞共刺激中重要的T细胞标志物。4-1BB向T细胞传递有效的共刺激信号，促进T淋巴细胞的分化并增强其长期存活。CD3ζ与TCR结合产生信号，并含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体可以是糖基化的、酰胺化的、羧化的、磷酸化的、酯化的、N-酰化的、通过例如二硫桥环化的，或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合。

本发明还提供编码本发明的嵌合抗原受体的核酸。在一些实施方案中，如上所述将核酸整合入载体。

本发明还提供了宿主细胞，其包含编码本发明的嵌合抗原受体的核酸。宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段。在一个实施方案中，宿主细胞是例如从外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)中分离的T细胞。在一些实施方案中，T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，T细胞可以从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或液体。也可以富集或纯化T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以是任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞例如Th2细胞、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。

根据已知技术或基于本公开内容对本领域技术人员显而易见的其变体，如上所述制备的那些T细胞群可用于的过继性免疫疗法的方法和组合物。参见例如，Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；还参见Rosenberg的美国专利号4,690,915。癌症的过继性免疫疗法是指其中向携带肿瘤的宿主施用具有抗肿瘤反应性的免疫细胞的治疗方法，目的是细胞直接或间接介导已形成的肿瘤的消退。淋巴细胞，特别是T淋巴细胞的输注属于这一类。目前，大多数过继性免疫疗法基于使用患者自身免疫细胞进行治疗的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。这些疗法涉及处理患者自身的淋巴细胞，以增强免疫细胞介导的反应或识别机体内的特定抗原或外来物质，包括癌细胞。通过移除患者的淋巴细胞并将这些细胞体外暴露于生物制剂和药物以激活细胞的免疫功能来完成治疗。一旦自体细胞被激活，将这些离体的活化细胞重新输入患者体内以增强免疫系统，从而治疗癌症。在一些实施方案中，通过首先从其培养基中收获细胞，然后将细胞洗涤并以治疗有效量浓缩在适于施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中来配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐。输注介质可以补充有人血清白蛋白。组合物中细胞的治疗有效量取决于具有所需特异性的T细胞的相对代表性、接受者的年龄和体重、靶向病症的严重程度和靶向Ag的免疫原性。这些细胞量可低至约103/kg，优选5×10 3/kg；高达107/kg，优选108/kg。细胞数量将取决于组合物的最终用途，其中包含的细胞类型也是如此。例如，如果需要对特定Ag具有特异性的细胞，那么该群体将含有大于70％，通常大于80％、85％和90-95％的此类细胞。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更小，可以是500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。临床相关数量的免疫细胞可以分摊到累积等于或超过所需细胞总量的多次输注中。

具体地，本发明的细胞特别适用于治疗癌症。因此，本发明的另一个目的涉及治疗有需要的受试者中的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的细胞群。

多特异性抗体

在一些实施方案中，本发明提供多特异性抗体，其包含来自上文所述的本发明分子的抗体的第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点用于募集杀伤机制，例如通过结合人效应子细胞上的抗原作为BiTE(双特异性T细胞接合者)抗体(其是针对靶抗原的双特异性scFv2)和US7235641中描述的T细胞上的CD3，或通过结合细胞毒剂或第二治疗剂。如本文所用，术语“效应子细胞”是指免疫细胞，其参与免疫应答的效应子阶段(与免疫应答的认知和激活阶段相反)。示例性免疫细胞包括髓样或淋巴来源细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括细胞溶解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞和粒细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应子细胞表达特异性Fc受体(FcR)并执行特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应子细胞能够诱导ADCC，例如天然杀伤细胞。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并将抗原呈递给免疫系统的其他组分。在一些实施方案中，效应子细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。效应子细胞上特定FcR的表达可以通过体液因子如细胞因子来调节。效应子细胞可以吞噬靶抗原或吞噬或裂解靶细胞。合适的细胞毒剂和第二治疗剂在下面举例说明，包括毒素(如放射性标记的肽)、化疗剂和前药。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点结合肿瘤相关巨噬细胞上的抗原，例如CD163、CD204、CD206、CD68和Tim-3。

如本文所用，术语“CD68”(分化簇68)也称为“GP110”；“LAMP4”和“SCARD1”，其具有在本领域中的一般含义，是指人中由CD68基因[基因ID：968]编码的蛋白质。该基因编码由人单核细胞和组织巨噬细胞高度表达的110-kD的跨膜糖蛋白。它是溶酶体/内体相关膜糖蛋白(LAMP)家族的成员。该蛋白质主要定位于溶酶体和内体，其中较小的部分循环至细胞表面。它是I型完整膜蛋白，具有高度糖基化的细胞外结构域，并与组织和器官特异性的凝集素或选择蛋白结合。该蛋白质也是清道夫受体家族的成员。清道夫受体通常起到清除细胞碎片、促进吞噬作用和介导巨噬细胞的募集和激活的作用。

如本文所用，术语“CD163”(分化簇163)也称为“M130”；“MM130”；“SCARI1”，其具有在本领域中的一般含义，并且是指人中由CD163基因[基因ID：9332]编码的蛋白质。CD163仅在单核细胞和巨噬细胞中表达。它起急性相调节受体的作用，参与巨噬细胞对血红蛋白/触珠蛋白复合物的清除和内吞作用，从而可以保护组织免受游离血红蛋白介导的氧化损伤。该蛋白质还可以作为细菌的固有免疫传感器和局部炎症的诱导物。分子大小为130kDa。该受体属于清道夫受体富含半胱氨酸的B型家族，由具有多个剪接变体的1048个氨基酸残基的细胞外结构域、单个跨膜区段和细胞质尾部组成。

如本文所用，术语“CD204”(分化簇204)也称为“巨噬细胞清道夫受体1”(MSR1)，其具有在本领域中的一般含义，是指人中由MSR1基因(NCBI参考：mRNA序列：NM_138716)编码的蛋白质。CD204的Uniprot参考是P21757，NCBI参考蛋白序列是NP_002436。

如本文所用，术语“CD206”(分化簇206)也称为“甘露糖受体”，其具有在本领域中的一般含义，是指主要存在于巨噬细胞和未成熟树突细胞表面上，但是也在皮肤细胞(例如人真皮成纤维细胞和角质形成细胞)表面表达的C型凝集素。CD206的uniprot参考是P22897。

如本文所用，术语“Tim-3”也称为“甲肝病毒细胞受体2”(HAVCR2)，其具有在本领域的一般含义，是指人中由HAVCR2基因(NCBI参考：mRNA序列：NM_032782)编码的T-细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域-3。Tim-3的Uniprot参考是Q8TDQ0，NCBI参考蛋白序列是NP_116171。

本发明的多特异性抗体分子的示例性形式包括但不限于(i)通过化学异源偶联交联的两种抗体，一种对sideroflexin-3具有特异性，另一种对第二抗原具有特异性；(ii)包含两个不同抗原结合区的单个抗体；(iii)单链抗体，其包含两个不同的抗原结合区，例如通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链包含通过短肽键串联的两个可变结构域(Wu等,Generation and Characterizationof a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig^TM)Molecule,In:AntibodyEngineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，其是两个单链双抗体的融合物，产生对于每种靶抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vii)flexibody，它是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(viii)一种所谓的“对接和锁定”分子，基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”，当应用于Fab时，其可以产生由与不同Fab片段连接的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(x)双抗体。双特异性抗体的另一种示例性形式是具有互补CH3结构域以强制异二聚化的IgG样分子。这些分子可以使用已知技术制备，例如称为Triomab/Quadroma(Trion Pharma/FreseniusBiotech)、Knob-into-Hole(Genentech)、CrossMAb(Roche)和静电匹配(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程域体(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)的技术。

在一些实施方案中，通过受控的Fab臂交换获得或可获得双特异性抗体，通常使用DuoBody技术。WO2008119353和WO2011111717(都是Genmab A/S)已经描述了通过受控的Fab臂交换产生双特异性抗体的体外方法。在WO 2008119353中描述的一种示例性方法中，在还原条件下孵育时，通过两种均包含IgG4样CH3区域的单特异性抗体之间的“Fab-臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)形成双特异性抗体。所得产物是具有两个Fab臂的双特异性抗体，所述Fab臂可包含不同的序列。在WO 2011131746中描述的另一个示例性方法中，通过包括以下步骤的方法制备本发明的双特异性抗体，其中第一和第二抗体中的至少一种是本发明的抗体：a)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区；b)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二抗体，所述Fc区包含第二CH3区；其中所述第一和第二CH3区的序列不同，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的每个同源二聚体相互作用；c)在还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起孵育；和d)获得所述双特异性抗体，其中所述第一抗体是本发明的抗体，所述第二抗体具有不同的结合特异性，反之亦然。还原条件可以例如通过添加例如选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂来提供。步骤d)可以进一步包括将条件恢复为非还原或较少还原，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。优选地，第一和第二CH3区的序列不同，仅包含少数相当保守的不对称突变，使得所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的每个同源二聚体相互作用。关于这些相互作用及其如何实现它们的更多细节在WO 2011131746中提供，其通过引用整体并入本文。以下是这种不对称突变的组合的示例性实施方案，任选地其中一个或两个Fc区是IgG1同种型。

免疫偶联物

可检测标记

可以将本发明的抗体与可检测标记偶联以形成免疫偶联物。合适的可检测标记包括，例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这种可检测标记的免疫偶联物的方法是本领域普通技术人员所熟知的，并在下面更详细地描述。可检测标记可以是通过放射自显影检测的放射性同位素。对本发明目的特别有用的同位素是3H、125I、131I、35S和14C。

可以用荧光化合物标记免疫偶联物。通过将免疫偶联物暴露于适当波长的光并检测所得荧光来确定荧光标记的抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

或者，可以通过将抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记免疫偶联物。通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的免疫偶联物的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

类似地，可以使用生物发光化合物来标记本发明的免疫偶联物。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化蛋白质提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

或者，可以通过将本发明的抗体与酶连接来可检测地标记免疫偶联物。当在合适的底物存在下孵育抗体-酶偶联物时，酶部分与底物反应产生化学部分，其可以例如通过分光光度、荧光或视觉方法检测。可用于可检测地标记多特异性免疫偶联物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。

本领域技术人员将知道可以根据本发明使用的其他合适的标记。标志物部分与抗体的结合可以使用本领域已知的标准技术完成。这方面的典型方法描述于Kennedy等,Clin.Chim.Acta 70:1,1976；Schurs等,Clin.Chim.Acta 81:1,1977；Shih等,Int'lJ.Cancer 46:1101,1990；Stein等,Cancer Res.50:1330,1990和Coligan。

此外，通过使用与抗生物素蛋白、链霉亲和生物素偶联的抗体，可以增强免疫化学检测的便利性和多样性(参见例如Wilchek等(eds.),“Avidin-Biotin Technology,”Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press 1990)；Bayer等,“ImmunochemicalApplications of Avidin-Biotin Technology,”in Methods In Molecular Biology(Vol.10)149-162(Manson,ed.,The Humana Press,Inc.1992))。

进行免疫测定的方法是公认的(参见例如Cook and Self,“MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays,”in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman,eds.,Cambridge University Press 1995)；Perry,“The Role of Monoclonal Antibodies inthe Advancement of Immunoassay Technology,”in Monoclonal Antibodies:Principles and Applications 107-120(Birch and Lennox,eds.,Wiley-Liss,Inc.1995)；Diamandis,Immunoassay(Academic Press,Inc.1996))。

抗体-药物偶联物(ADC)

在一些实施方案中，本发明的抗体与治疗部分即药物偶联。治疗部分可以是例如细胞毒素、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。此类偶联物在本文中称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”。

在一些实施方案中，抗体与细胞毒性部分偶联。细胞毒性部分可以例如选自以下：紫杉醇；细胞松弛素B；短杆菌肽D；溴化乙锭；吐根碱；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；柔红霉素；二羟基蒽二酮；微管蛋白抑制剂如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂如单甲基奥瑞他汀E或F或其类似物或衍生物；海兔毒素10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光辉霉素；放线菌素D；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢物，如甲氨喋呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷化剂，如二氯甲基二乙胺、硫代嘌呤、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴嗪、丝裂霉素C；铂类衍生物，如顺铂或卡铂；多卡霉素A、多卡霉素SA、雷切霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，如放线菌素、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、光霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普力霉素、安定霉素(AMC)；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(PDB)；白喉毒素及相关分子如白喉A链及其活性片段和杂合分子、蓖麻毒素如蓖麻毒素A或去糖基化蓖麻毒素A链毒素、霍乱毒素、志贺样毒素如SLTI、SLTII、SLTIIV、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、阿罗林、皂草素、蒴莲根毒素、胶凝蛋白、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白如PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素；核糖核酸酶(RNase)；DNase I、葡萄球菌内毒素A；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素和假单胞菌内毒素。

在一些实施方案中，抗体与核酸或核酸相关分子偶联。在一个这种实施方案中，偶联的核酸是细胞毒性核糖核酸酶(RNase)或脱氧核糖核酸酶(例如DNase I)、反义核酸、抑制性RNA分子(例如siRNA分子)或免疫刺激性核酸(例如含免疫刺激性CpG基序的DNA分子)。在一些实施方案中，抗体与适体或核酶偶联。

在一些实施方案中，抗体例如作为融合蛋白与裂解肽(例如CLIP、马加宁2、蜂毒肽、天蚕素和P18)偶联。

在一些实施方案中，抗体与细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNa、IFN3、IFNy、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子、安西司亭和TNFa)偶联。

在一些实施方案中，抗体与放射性同位素或含放射性同位素的螯合物偶联。例如，抗体可以与允许抗体与放射性同位素络合的螯合剂接头(例如DOTA、DTPA或噻西坦)偶联。抗体还可以或可选地包含一个或多个放射性标记的氨基酸或其他放射性标记的分子或与之偶联。放射性同位素的非限制性实例包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、125I、131I、186Re、213Bi、225Ac和227Th。为了治疗目的，可以使用发射β或α颗粒辐射的放射性同位素，例如131I、90Y、211At、212Bi、67Cu、186Re、188Re和212Pb。

在某些实施方案中，抗体-药物偶联物包含抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括，例如紫杉烷(例如(紫杉醇)、(多西他赛))、T67(Tularik)、长春花类烷(例如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)和多拉司他汀(例如奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白剂包括，例如浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如埃博霉素A和B)、诺可达唑、秋水仙碱和colcimid、雌莫司汀、隐藻菌素、头孢噻吩、美登木素生物碱、考布他汀、圆皮海绵内酯和软珊瑚醇。在一些实施方案中，细胞毒剂是美登木素生物碱，另一组抗微管蛋白剂。例如，在具体的实施方案中，美登木素生物碱是美登素或DM-1(ImmunoGen,Inc.；还参见Chari等,Cancer Res.52:127-131,1992)。

在其他实施方案中，细胞毒剂是抗代谢物。抗代谢物可以是，例如嘌呤拮抗剂(例如硫唑嘌呤或霉酚酸酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤)、阿昔洛韦、更昔韦洛、齐多夫定、阿糖腺苷、利巴韦林、叠氮胸苷、胞苷阿拉伯糖苷、金刚烷胺、双脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或三氟胸苷。

在其他实施方案中，本发明的抗体与前药转化酶偶联。可以使用已知方法将前药转化酶与抗体重组融合或与其化学偶联。示例性的前药转化酶是羧肽酶G2、β-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。

诊断用途

如实施例部分所述，本发明的抗体允许检测肿瘤相关巨噬细胞，从而检测癌症中涉及的肿瘤微环境。

本发明的一个方面涉及本发明的抗体用于检测肿瘤相关巨噬细胞的用途。

因此，本发明的一个方面涉及检测生物样品中的肿瘤相关巨噬细胞和/或评估其含量的方法，其中所述方法包括将所述样品与本发明的抗体接触。在一个实施方案中，该方法用于诊断癌症。

本发明的进一步方面涉及本发明的抗体用于诊断癌症疾病和其中sideroflexin-3水平被改变(升高或降低)的其他疾病。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体可以用可检测的分子或物质标记，例如荧光分子、放射性分子或如上所述的本领域已知的任何其他标记。例如，可以通过本领域已知的任何方法用放射性分子标记本发明的抗体。例如，放射性分子包括但不限于用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如I123、I124、In111、Re186、Re188。本发明的抗体还可以用用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物标记，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。施用抗体后，检测患者体内抗体的分布。用于检测任何特定标记的分布的方法是本领域技术人员已知的，并且可以使用任何适当的方法。一些非限制性实例包括计算机断层扫描(CT)、位置发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)、荧光、化学发光和超声波检查。

本发明的抗体可用于诊断和分期与肿瘤相关巨噬细胞相关的癌症疾病。

通常，所述诊断方法涉及使用从患者获得的生物样品。如本文所用，术语“生物样品”包括从受试者获得的多种样品类型，并且可用于诊断或监测测定。生物样品包括但不限于血液和生物来源的其他液体样品、固体组织样品如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞，及其后代。例如，生物样品包括从怀疑患有与肿瘤相关巨噬细胞相关的癌症疾病的个体收集的组织样品中获得的细胞。

生物样品包括临床样品、培养细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物液体和组织样品。

治疗目的

如实施例部分所述，本发明的抗体靶向参与癌症中的肿瘤微环境的肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤微环境被认为在促进癌症发生和肿瘤生长中起非常重要的作用。

本发明的抗体、片段或免疫偶联物可用于治疗与肿瘤相关巨噬细胞相关的任何疾病，优选癌症。本发明的抗体可以单独使用，或与任何合适的试剂组合使用。

在本文所述的治疗方法的每一个实施方案中，以与寻求治疗的疾病或病症的管理相关的常规方法一致的方式递送本发明的抗体或本发明的抗体-药物偶联物。根据本文的公开内容，在足以预防或治疗疾病或病症的条件下，向需要这种治疗的患者施用有效量的抗体或抗体-药物偶联物一段时间。

如本文所用，术语“治疗”是指预防或预防性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括治疗处于患病风险或怀疑患有该疾病的受试者以及生病或被诊断为患有疾病或医学病症的受试者，包括抑制临床复发。可以向患有医学病症或最终可能患有病症的受试者施用治疗，以预防、治愈、延迟病症或复发病症的一种或多种症状的发作、降低病症或复发病症的一种或多种症状的严重程度或缓解病症或复发病症的一种或多种症状，或者为了延长受试者的存活期超过在没有这种治疗的情况下预期的存活期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的一般目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以采用(部分或全部)“加载方案”，其可以包括施用比医生在维持方案期间使用的更大剂量的药物，比医生在维持方案期间更频繁地施用药物，或两者。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在治疗疾病期间维持受试者，例如使受试者长期(数月或数年)保持缓解的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以采用连续治疗(例如以规律的间隔(例如每周、每月、每年等)施用药物)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇治疗、复发治疗或实现特定的预定标准[例如疾病表现等]时的治疗)。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量的本发明抗体可根据诸如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明的抗体在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。本发明抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。具有本领域普通技术的医生可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始在药物组合物中使用的本发明抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本发明组合物的合适剂量将是这样：化合物的量是根据特定剂量方案有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。例如，用于治疗用途的治疗有效量可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。通常，化合物抑制癌症的能力可以例如在预测人肿瘤功效的动物模型系统中评估。或者，组合物的这种性质可以通过熟练医生已知的体外测定法检查化合物诱导细胞毒性的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或减轻受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如以下因素来测定这样的量：受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或施用途径。本发明抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是约0.1-100mg/kg、例如约0.1-50mg/kg、例如约0.1-20mg/kg、例如约0.1-10mg/kg、例如约0.5、约0.3、约1、约3mg/kg、约5mg/kg或约8mg/kg。本发明抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0.02-100mg/kg、例如约0.02-30mg/kg、例如约0.05-10mg/kg或0.1-3mg/kg，例如约0.5-2mg/kg。可以例如静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，例如在靶标位点附近施用。调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。在一些实施方案中，在治疗期间，例如在预定义的时间点监测治疗功效。在一些实施方案中，可通过疾病区域的可视化或通过本文进一步描述的其他诊断方法监测功效，例如，通过使用例诸如本发明的标记抗体、衍生自本发明抗体的片段或小抗体进行一次或多次PET-CT扫描。如果需要，药物组合物的有效每日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量(任选地，以单位剂型)，在一天中以适当的间隔分开施用。在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体通过长时间，例如超过24小时的缓慢连续输注施用，以使任何不希望的副作用最小化。还可以使用每周、每两周或每三周一次的给药期来施用有效剂量的本发明抗体。给药期可以限制在例如8周、12周或直到建立临床进展。作为非限制性实例，在治疗开始后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天的至少一天，或在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周的至少一周，或其任意组合，每24、12、8、6、4或2小时使用单次或分次剂量，或其任何组合，可以用每日剂量为以下含量的本发明抗体提供根据本发明的治疗：每天约0.1-100mg/kg，例如0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg。

因此，本发明的一个目的涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体。

在另一个方面，本发明涉及如本文任何方面或实施方案所定义的本发明的抗体，其用作药物。

在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体用于治疗癌症的用途。

在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物与第二试剂组合用于治疗疾病或病症。当用于治疗癌症时，本发明的抗体或本发明的抗体-药物偶联物可以与常规癌症疗法(例如手术、放疗、化疗或其组合)组合使用。

术语“癌症”、“恶性肿瘤”和“肿瘤”是指或描述哺乳动物中通常特征在于不受调节的细胞生长的病理病症。更确切地，在本发明的用途中，疾病(即癌症)与肿瘤相关巨噬细胞TAM相关，其已被证明与肿瘤细胞共生相关。此外，发明人显示，本发明的拮抗剂(如针对sidoreflexin 3的抗体)杀死肿瘤相关巨噬细胞(TAM)并减少肿瘤细胞生长：肿瘤细胞募集TAM，其在肿瘤微环境中提供存活和血管生成因子(参见综述Dirkx A.E.M.Journal ofLeukocyte Biology vol.80no.6 1183-1196 December 2006)。

具体地，癌症可能与实体瘤或未分化的骨髓细胞的不受调节的生长有关(即白血病、淋巴瘤)。

可以使用本发明的方法和组合物治疗的多种癌症和其他增殖性疾病包括但不限于以下：

-癌，包括膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、头颈癌和皮肤癌，包括鳞状细胞癌，

-间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；

-其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；

-中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；

-间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；

-其他肿瘤，包括黑色素瘤、色素性干皮病、角化癌、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌；

-淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于阴道多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤；

-白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，如成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞、红白细胞白血病细胞白血病和骨髓增生异常综合征，慢性白血病，如但不限于慢性粒细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病。

在一个实施方案中，所述癌症是白血病，其选自所有急性和慢性白血病：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、慢性粒单核细胞白血病(LMMC)、急性早幼粒细胞白血病(APL)。

在一个优选的实施方案中，所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

在一个实施方案中，所述癌症是选自以下的淋巴瘤：所有霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)。

在一个实施方案中，所述癌症是选自以下的实体瘤：脑、头颈部、肾上腺、结肠、小肠、胃、心脏、肝脏、皮肤、肾脏、肺、胰腺、睾丸、卵巢、前列腺、子宫、甲状腺、膀胱、乳腺、子宫内膜肿瘤、多发性骨髓瘤和肉瘤。

在上文中以及随后提及肿瘤、肿瘤疾病、癌或癌症的情况下，可替代地或另外地隐含地表示原始器官或组织和/或任何其他位置的转移，无论肿瘤的位置和/或转移如何。

组合

本发明还提供治疗应用，其中本发明的抗体与至少一种其他治疗剂组合使用，例如用于治疗癌症。这种施用可以是同时、分开或依次的。对于同时施用，试剂可以视情况作为一种组合物或作为单独的组合物施用。另外的治疗剂通常与待治疗的病症有关。示例性治疗剂包括其他抗癌抗体、细胞毒剂、化疗剂、抗血管生成剂、抗癌免疫原、细胞周期控制/凋亡调节剂、激素调节剂和下述其他试剂。

在一些实施方案中，本发明的抗体与化疗剂组合使用。术语“化疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的化合物。化疗剂的实例包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番茄枝内酯类(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁；倍癌霉素(duocarmycin，包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素；氮芥，诸如氯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、磷雌氮芥、异磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、三芥环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(如加利车霉素，尤其是加利车霉素11和加利车霉素211，参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186，1994)；蒽环类抗生素，包括达内霉素A(dynemicin A)；埃斯波霉素；以及新抑癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素类、放线菌素、氨茴霉素、氮丝氨酸、博来霉素类、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉阿霉素、氰吗啉阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培来霉素、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、曲麦克特；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，诸如卡鲁睾酮、羟甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特、曼托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶；氨苯吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞(eifornithine)；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；环氧甘醚；硝酸镓；羟脲；蘑菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，诸如美登素和美坦西醇类；丙米腙；米托蒽醌；莫匹达谋；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；丙亚胺；根霉素；西作非兰；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(尤其是T-2毒素、粘液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替哌；类紫杉醇，如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他塞(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊本膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、那洛昔芬、LY117018、奥那斯酮、和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，如氟他米特、尼鲁米特、比卡米特、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方案中，本发明的抗体与靶向癌症疗法组合使用。靶向癌症疗法是通过干扰参与癌症的生长、进展和扩散的特定分子(“分子靶标”)来阻断癌症的生长和扩散的药物或其他物质。靶向癌症疗法有时称为“分子靶向药”、“分子靶向疗法”、“精准医疗”或类似的名称。在一些实施方案中，靶向疗法是向受试者施用酪氨酸激酶抑制剂。术语“酪氨酸激酶抑制剂”是指作为受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂的任何一种治疗剂或药物。酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物是本领域已知的，且描述于其全文通过引用并入本文的美国专利公开2007/0254295。本领域技术人员将理解，与酪氨酸激酶抑制剂相关的化合物将概括酪氨酸激酶抑制剂的作用，例如，相关化合物将作用于酪氨酸激酶信号传导通路的不同成员，以产生与那个酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂相同的作用。适用于本发明实施方案的方法的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物的实例包括但不限于：达沙替尼(BMS-354825)、PP2、BEZ235、塞卡替尼、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(Sutent；SU11248)、厄洛替尼(特罗凯；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡奈替尼(CI1033)、塞玛昔布(semaxinib，SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、伊马替尼(Gleevec；STI571)、来氟米特(SU101)、凡德他尼(Zactima；ZD6474)、MK-2206(8-[4-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-1,2,4-三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮盐酸盐)衍生物、其类似物，及其组合。适用于本发明的另外的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物描述于例如，美国专利公开2007/0254295、美国专利号5,618,829、5,639,757、5,728,868、5,804,396、6,100,254、6,127,374、6,245,759、6,306,874、6,313,138、6,316,444、6,329,380、6,344,459、6,420,382、6,479,512、6,498,165、6,544,988、6,562,818、6,586,423、6,586,424、6,740,665、6,794,393、6,875,767、6,927,293和6,958,340，所有这些的全文都通过引用并入本文。在一些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是已经口服施用的小分子激酶抑制剂，并且已经是至少一个I期临床试验，更优选至少一个II期临床试验，甚至更优选至少一个III期临床试验的主题，最优选由FDA批准用于至少一种血液或肿瘤适应症。此类抑制剂的实例包括但不限于：吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、BMS-599626(AC-480)、来那替尼、KRN-633、CEP-11981、伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、AZM-475271、CP-724714、TAK-165、舒尼替尼、瓦他拉尼、CP-547632、凡德他尼、伯舒替尼、来他替尼、坦度替尼、米哚妥林、恩扎妥林、AEE-788、帕唑帕尼、阿西替尼、Motasenib、OSI-930、西地尼布、KRN-951、多韦替尼、Seliciclib、SNS-032、PD-0332991、MKC-1(Ro-317453；R-440)、索拉非尼、ABT-869、布立尼布(BMS-582664)、SU-14813、替拉替尼、SU-6668、(TSU-68)、L-21649、MLN-8054、AEW-541和PD-0325901。

在一些实施方案中，本发明的抗体与免疫治疗剂组合使用。如本文所用，术语“免疫治疗剂”是指间接或直接增强、刺激或增加机体对癌细胞的免疫应答和/或降低其他抗癌疗法的副作用的化合物、组合物或治疗。因此，免疫疗法是直接或间接刺激或增强免疫系统对癌细胞的应答和/或减轻可能已经由其他抗癌剂引起的副作用的疗法。免疫疗法在本领域中也称为免疫性疗法、生物性疗法、生物反应调节剂疗法和生物疗法。本领域已知的常见免疫治疗剂的实例包括但不限于：细胞因子、癌症疫苗、单克隆抗体和非细胞因子佐剂。或者，免疫治疗性治疗可以包括向受试者施用一定量的免疫细胞(T细胞、NK细胞、树突细胞、B细胞......)。免疫治疗剂可以是非特异性的，即通常增强免疫系统以使人体更有效地对抗癌细胞的生长和/或扩散，或者它们可以是特异性的，即靶向癌细胞本身。免疫治疗方案可以结合使用非特异性和特异性的免疫治疗剂。非特异性免疫治疗剂是刺激或间接改善免疫系统的物质。非特异性免疫治疗剂已被单独用作治疗癌症的主要疗法，以及在主要疗法之外使用，在这种情况下，非特异性免疫治疗剂作为佐剂发挥作用以增强其他疗法(例如癌症疫苗)的有效性。在后一种情况下，非特异性免疫治疗剂也可以发挥作用以减少其他疗法的副作用，例如由某些化疗剂诱导的骨髓抑制。非特异性免疫治疗剂可作用于关键免疫系统细胞并引起次级反应，例如增加细胞因子和免疫球蛋白的产生。或者，试剂本身可包含细胞因子。非特异性免疫治疗剂通常分类为细胞因子或非细胞因子佐剂。已经在癌症治疗中发现许多细胞因子的应用，作为设计为增强免疫系统的一般非特异性免疫疗法，或作为与其他疗法一起提供的佐剂。合适的细胞因子包括但不限于干扰素、白细胞介素和集落刺激因子。本发明预期的干扰素(IFN)包括常见类型的IFN，IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN可以直接作用于癌细胞，例如，通过减缓它们的生长，促进它们发育成具有更正常行为的细胞和/或增加它们的抗原产生，从而使癌细胞更容易被免疫系统识别并破坏。IFN还可以间接作用于癌细胞，例如，通过减慢血管生成、增强免疫系统和/或刺激自然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞。重组IFN-α可作为罗扰素(Roche Pharmaceuticals)和甘乐能(ScheringCorporation)商购获得。本发明预期的白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-11和IL-12。市售重组白细胞介素的实例包括(IL-2；Chiron Corporation)和(IL-12；Wyeth Pharmaceuticals)。Zymogenetics，Inc(Seattle，Wash.)目前正在测试重组形式的IL-21，其也预期用于与本发明组合使用。本发明预期的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF或非格司亭)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭)和促红细胞生成素(阿法依伯汀、达比波廷)。用一种或多种生长因子治疗可以帮助刺激经历传统化疗的受试者中新血细胞的产生。因此，用CSF治疗可有助于减少与化疗相关的副作用，并且可允许使用更高剂量的化疗剂。各种重组集落刺激因子可商购获得，例如(G-CSF；Amgen)、Neulasta(培非格司亭；Amgen)、Leukine(GM-CSF；Berlex)、Procrit(促红细胞生成素；Ortho Biotech)、Epogen(促红细胞生成素；Amgen)、Arnesp(促红细胞生成素)。本发明的组合的组合物和组合的施用方法还可以包括“全细胞”和“过继性”免疫治疗方法。例如，此类方法可包括输注或重新输注免疫系统细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，例如CC2+和/或CD8+ T细胞(例如用肿瘤特异性抗原和/或遗传增强扩增的T细胞)、表达抗体的B细胞或其他产生抗体或呈递抗体的细胞、树突细胞(例如，用DC-扩增剂如GM-CSF和/或Flt3-L培养的树突细胞，和/或肿瘤相关的抗原负载的树突细胞)、抗肿瘤NK细胞、所谓的杂交细胞或其组合。细胞裂解物也可用于这些方法和组合物中。临床试验中可用于这些方面的细胞“疫苗”包括CanvaxinTM、APC-8015(Dendreon)、HSPPC-96(Antigenics)和细胞裂解物。从癌细胞脱落的抗原及其混合物(参见例如Bystryn等，Clinical Cancer Research Vol.7,1882-1887，2001年7月)，任选地与佐剂如明矾混合，也可以是这些方法和组合的组合物中的组分。

在一些实施方案中，本发明的抗体与放射疗法组合使用。放射疗法可以包括辐射或向患者施用相关的放射性药物。辐射源对于待治疗患者而言可以是外部的或内部的(放射治疗可以是例如外部束放射治疗(EBRT)或近距离放射治疗(BT)的形式)。可用于实施此类方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。

在一些实施方案中，本发明的抗体与对共刺激分子具有特异性的抗体组合使用。对共刺激分子具有特异性的抗体的实例包括但不限于抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗TIMP3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体或抗B7H6抗体。

本发明的另一个目的涉及治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用对癌细胞抗原具有选择性的第一抗体，并向受试者施用本发明的抗体。

许多抗体目前在临床上用于治疗癌症，而其他抗体处于临床开发的不同阶段。本发明方法的目标抗体通过ADCC起作用，并且通常对肿瘤细胞具有选择性，尽管本领域技术人员将认识到一些临床上有用的抗体确实作用于非肿瘤细胞，例如CD20。有许多抗原和相应的单克隆抗体用于治疗B细胞恶性肿瘤。一种流行的靶抗原是CD20，其存在于B细胞恶性肿瘤中。利妥昔单抗是针对CD20抗原的嵌合非偶联单克隆抗体。CD20在B细胞活化、增殖和分化中具有重要的功能作用。单克隆抗体阿仑单抗靶向CD52抗原，其用于治疗慢性淋巴细胞白血病。许多抗体靶向CD22，并且最近证明了其与毒素的组合在抗化疗的毛细胞白血病中的功效。靶向CD20的单克隆抗体还包括托西莫单抗和替伊莫单抗。可用于本发明方法的单克隆抗体已用于实体瘤，包括但不限于依决洛单抗和曲妥珠单抗(赫赛汀)。依决洛单抗靶向结肠癌和直肠癌中见到的17-1A抗原，并已被批准在欧洲用于这些适应症。其抗肿瘤作用通过ADCC、CDC和诱导抗个体基因型网络介导。曲妥珠单抗靶向HER-2/neu抗原。这种抗原见于25％至35％的乳腺癌。曲妥珠单抗被认为以多种方式起作用：下调HER-2受体的表达、抑制过表达HER-2蛋白的人肿瘤细胞的增殖、增强免疫募集和针对过表达HER-2蛋白的肿瘤细胞的ADCC，以及下调血管生成因子。阿仑单抗(Campath)用于治疗慢性淋巴细胞白血病；结肠癌和肺癌；吉姆单抗(Mylotarg)可用于治疗急性髓性白血病；替伊莫单抗(Zevalin)可用于治疗非霍奇金淋巴瘤；帕尼单抗(Vectibix)可用于治疗结肠癌。西妥昔单抗(Erbitux)也适用于本发明的方法。该抗体与EGF受体(EGFR)结合，并已用于治疗实体瘤，包括结肠癌和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。

药物组合物

本发明的一个方面涉及包含本发明抗体的药物组合物。

通常，本发明的抗体以药物组合物的形式向受试者施用，所述药物组合物包含药学上可接受的载体。可用于这些组合物的药学上可接受的载体包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙烯乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。为了用于向患者施用，将组合物配制成用于向患者施用。本发明的组合物可以通过以下施用：口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道或通过植入型药盒。本文使用的包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制这些悬浮液。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇溶液。可以使用的可接受载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。与天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式一样，脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇类稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其他常用的表面活性剂，例如Tween、Span和其他乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。本发明的组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括例如乳糖。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。或者，本发明的组合物可以用于直肠施用的栓剂的形式施用。这些可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。这种材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。本发明的组合物也可局部施用，特别是当治疗靶标包括局部施用易于接近的区域或器官时，包括眼、皮肤或下肠道疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。对于局部应用，组合物可以配制成合适的软膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将组合物配制成合适的洗剂或霜剂，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。用于下肠道的局部应用可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠制剂实现。也可以使用贴剂。本发明的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入施用。这种组合物根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规的增溶剂或分散剂制备为盐水溶液。例如，存在于本发明药物组合物中的抗体可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用小瓶中以10mg/mL的浓度提供。该产品配制为用于静脉内施用：9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌注射用水。将pH调节至6.5。本发明药物组合物中抗体的示例性合适剂量范围可为约1mg/m2至500mg/m2。然而，应当理解，这些明细是示例性的，并且考虑到必须在临床试验中测定的药物组合物中特定抗体的亲和力和耐受性，可以调整最佳明细和方案。可以制备用于注射(例如，肌肉内静脉注射)的本发明的药物组合物以含有无菌缓冲水(例如对于肌肉内，1ml)和约1ng至约100mg，例如约50ng至约30mg或更优选约5mg至约25mg的本发明的抗肌球蛋白18A抗体。

在某些实施方案中，考虑使用脂质体和/或纳米颗粒将抗体引入宿主细胞中。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用是本领域技术人员已知的。

纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式包封化合物。为了避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，通常使用能够在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒预期用于本发明，并且可以容易地制备这些颗粒。

脂质体由磷脂形成，所述磷脂分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm至4μm。超声处理MLV导致形成直径为的小单层囊泡(SUV)，其在核心中含有水溶液。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。

试剂盒

最后，本发明还提供包含至少一种本发明抗体的试剂盒。含有本发明抗体的试剂盒可用于检测sideroflexin-3的表达(增加或减少)，或用于治疗或诊断测定。本发明的试剂盒可含有与固体支持物(例如组织培养板或珠子(例如琼脂糖珠))偶联的抗体。可以提供包含用于体外(例如在ELISA或Western印迹或流式细胞术中)检测和定量sideroflexin-3的抗体。可以为这种用于检测的抗体提供标记，例如荧光标记或放射性标记。

通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1.四种抗NLC抗体对NLC的高染色。A.用四种抗NLC抗体染色来自CLL患者的B-CLL和NLC以及来自健康供体的血液样品的单核细胞、T细胞和B细胞(实线：同种型对照；虚线：抗体)。B.6-25抗体在门控CD163+ NLC上的阳性染色和在其他细胞上的阴性染色。C.与同种型对照相比，在NLC门控上染色的四种抗体的荧光强度的平均值。

图2.与4种抗体一起培养时，NLC消耗和白血病细胞死亡。通过显微镜观察来自CLL患者的PBMC培养物在每种抗NLC抗体下存在6天后，与同种型条件相比的NLC(包围)的消耗。在每种抗体的条件下，这些培养物中NLC的绝对数量接近于零。

图3：培养10天后，用6-25抗体或同种型对照和FACS分析对2名CLL患者的PBMC染色。(MFI：平均荧光强度)。

图4：用6-25抗体或同种型对照和FACS分析对来自健康供体的PBMC染色。(MFI：平均荧光强度)。

图5：由两种商购抗SFXN3抗体和6-25抗体或同种型显示的重组sideroflexin 3的蛋白质印迹。

图6：来自CLL患者的PBMC在有或没有6-25抗体或同种型对照的情况下培养10天的显微镜检查和B CLL活力分析。FACS：框中死B CCL的百分比。

图7：CLL患者的PBMC在有或没有6-25抗体或同种型对照的情况下培养10天后的NLC数。

具体实施方式

实施例1：靶向肿瘤相关巨噬细胞的sideroflexin

材料&方法

使用Ficoll从患者分离PBMC，并在RPMI 10％FBS中以10×10⁶个细胞/ml培养10天。然后除去上清液，用PBS洗涤贴壁细胞(NLC)两次。使用细胞刮刀分离NLC、计数并将干燥的颗粒冷冻。也将非贴壁细胞的干燥颗粒冷冻。合并来自几个患者的NLC，并使用“Proteo-extract native membrane protein extraction kit”(Calbiochem)提取膜蛋白。

在室温下将Pierce^TM高容量链霉亲和素琼脂糖珠(thermo Fisher Scientific)与山羊抗小鼠IgG-生物素(Sigma Aldrich，B7401)一起孵育20分钟，洗涤三次，然后在4℃下用杂交瘤的上清液培养基或对照培养基孵育2小时。在PBS洗涤三次后，在4℃下将包被的珠子与来自NLC或非贴壁细胞的500μg膜蛋白一起孵育过夜。用Laemmli溶液洗涤并洗脱珠子。将这些溶液加入丙烯酰胺凝胶中，并在迁移后用速溶蓝(euromedex)着色。切下凝胶条并提取肽。简言之，用乙腈和碳酸氢铵洗涤条带，用DTT和碘乙酰胺还原和烷基化，用胰蛋白酶消化，然后用乙腈和甲酸提取肽。然后通过质谱法鉴定肽。比较每种条件下鉴定的肽(没有杂交瘤的上清液，没有蛋白质，用来自非贴壁细胞和来自NLC的蛋白质)。

结果

为了确定特异性识别NLC的四种抗体的靶标，我们通过免疫沉淀测试了四种杂交瘤培养物上清液。因此，我们通过质谱法鉴定了与每种杂交瘤相关的肽。

我们发现了这些肽：

6-16：sideroflexin 3和GRP78

6-25：sideroflexin 3

6-66-49：GRP78

6-66-74：内质蛋白(endoplasmine)和GRP78

实施例2：靶向肿瘤相关巨噬细胞

材料&方法

制备针对NLC的抗体

从RPMI 10％FBS中的10×10⁶个细胞/ml的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的血液样品中分离的PBMC培养物制备NLC。在37℃和5％CO₂气氛中培养14天后，除去B白血病细胞并收集贴壁细胞(NLC)。每15天向小鼠腹膜内注射来自不同供体的3百万至1千5百万的NLC4次。然后从脾脏中分离脾细胞，并与α63s2鼠骨髓瘤细胞系融合产生200个杂交瘤。在4℃下将这些杂交瘤培养物的200个条件培养基与NLC或白血病细胞一起孵育30分钟，然后与荧光二级抗小鼠抗体一起孵育。然后通过流式细胞术分析这些细胞。

流式细胞术分析

在4℃下将50μl每种杂交瘤培养物上清液与20万个细胞(来自CLL患者或健康供体的NLC、B白血病细胞或PBMC)一起孵育30分钟。用PBS洗涤后，在4℃下将细胞与偶联荧光染料的山羊抗小鼠抗体一起孵育30分钟。洗涤后，在4℃下将细胞与偶联不同荧光染料的抗人CD163、抗人CD3、抗人CD19和抗人CD14一起孵育15分钟。洗涤后，用流式细胞术分析细胞。

用抗体培养

用或不用来自杂交瘤培养物上清液的5μl/ml纯化抗体或用5μg/ml同种型对照培养从CLL患者分离的PBMC 6天。然后通过在显微镜下计数来评估NLC的数量，并且通过使用碘化丙锭的细胞计数器来评估活的白血病细胞的活力。

免疫组织化学

在4μm厚的常规处理的福尔马林固定的石蜡包埋的具有邻近正常组织的肿瘤标本切片上进行IHC。在柠檬酸盐缓冲液(pH6)中进行热诱导的表位修复技术。将每种抗体孵育30分钟，并根据制造商的方案使用EnVision G|2System/AP(Dako)酶-偶联的聚合物主链显示，并通过试剂盒中包含的Permanent Red Chromogen(Fas Red)观察。用苏木精和曙红(H&E)染色μm厚的切片。使用Autostainer plus(Dako)载玻片处理器处理IHC。

结果

NLC的4种特异性抗体的流式细胞术分析

NLC描述为CLL的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。

为了靶向NLC，我们决定制备针对NLC的特异性抗体。因此，我们用来自LLC患者的纯化NLC免疫小鼠。通过体外培养来自患者的外周血单核细胞(PBMC)产生NLC。14天后，分离NLC，然后注射给小鼠。获得约200个杂交瘤，并且在流式细胞术中测试它们的上清液识别来自患者的NLC的能力。在这200个上清液中，4个(6-16、6-25、6-66-49、6-66-74)识别并固定了NLC，但没有白血病细胞和来自LLC患者的极少数单核细胞。图1A显示与黄色同种型相比，每种上清液呈蓝色染色。这些上清液没有固定来自健康供体的T(CD3⁺)或B(CD19⁺)淋巴细胞(图1A)。图1B显示具有CD163(TAM/NLC的特异性抗体)和6-25抗体的NLC的双重染色，而这两种抗体没有识别其他PBMC。因此，这些上清液含有针对NLC的特异性抗体，该同种型被确定为IgG1。图1C示出了与同种型相比，4种抗体的平均荧光强度。

抗体功能

为了测试抗体功能，我们将CLL患者的PBMC与4种抗体中的每种一起培养，显示在培养6天时，与不用抗体或用同种型对照培养相比，NLC的数量强烈减少(周围的大细胞)，且存活的B白血病细胞的数量减少。

检测乳腺肿瘤中的TAM

为了测试4种抗体是否能够在CLL中识别除NLC之外的其他TAM，我们用4种抗体在乳腺肿瘤中进行IHC染色。我们发现，在pH6条件下，这些抗体中的2种，6-25和6-66-49，在巨噬细胞上产生特异性褐色染色，尤其是在肿瘤边缘(炎症区域的特征)和肿瘤内部。然而，在远离肿瘤处(即，在“健康”组织中)检测到非常低的染色。此外，癌细胞或其他免疫细胞未被染成棕色。

实施例3

材料&方法

通过流式细胞术分析用6-25抗体染色NLC和CLL细胞

将从2名CLL患者的血液样品中分离的PBMC培养10天。然后在4℃下用6-25抗体或适当的同种型对照将PBMC染色30分钟。用PBS洗涤后，在4℃下将细胞与偶联荧光染料的山羊抗小鼠抗体一起孵育30分钟。洗涤后，在4℃下将细胞与偶联不同荧光染料的抗人CD163、抗人CD68、抗人CD5和抗人CD19一起孵育15分钟。洗涤后，通过流式细胞术分析细胞。通过CD163/CD68的阳性染色选择NLC，并通过CD19/CD5的阳性染色选择CLL细胞。

通过流式细胞术分析用6-25抗体染色来自健康供体的PBMC

在4℃下用6-25抗体或适当的同种型对照将从健康供体的血沉棕黄层中分离的PBMC染色30分钟。用PBS洗涤后，在4℃下将细胞与偶联荧光染料的山羊抗小鼠抗体一起孵育30分钟。洗涤后，在4℃下将细胞与偶联不同荧光染料的抗人CD3、抗人CD4、抗人CD8、抗人CD14和抗人CD19一起孵育15分钟。洗涤后，通过流式细胞术分析细胞。通过其特异性标志物选择每个群体(对于CD4 T细胞为CD3+/CD4+、对于CD8 T细胞为CD3+/CD8+、对于B淋巴细胞为CD3-/CD19+、对于单核细胞为CD3-/CD14+)。

用6-25抗体培养后B CLL细胞和NLC的活力

用或不用5μg/ml纯化的6-25抗体或用5μg/ml同种型对照(鼠IgG1)培养从CLL患者的血液样品分离的PBMC 6天。在消耗B CLL之前和之后，在相差显微镜(x20)上获得照片。在Malassez薄片上计数NLC。通过用7AAD和膜联蛋白V染色然后进行FACS分析来评估活的白血病细胞。

蛋白质印迹

将5、10、50或100ng重组sideroflexin 3进行蛋白质印迹，并在4℃下用10μg/ml抗体溶液和以下抗体探测过夜：兔多克隆抗SFXN3或小鼠单克隆抗SFXN3或6-25抗体或小鼠IgG1同种型。洗涤后，在室温下将膜与第二抗体溶液(1/10000，HRP)一起孵育1小时。然后用ECL进行显色。

结果

用6-25抗体将来自两名CLL患者的PBMC培养10天产生的NLC(CD68+CD163+细胞)进行染色，并与同种型对照相比较。然而，来自相同培养物的门控的CLL细胞(CD5+CD19+)未被6-25抗体染色，用6-25和用同种型对照获得的CLL细胞的平均荧光强度相似(图3)。

将来自健康供体的PBMC与6-25抗体或同种型对照一起孵育，并且6-25抗体没有将CD4 T细胞、CD8 T细胞、B淋巴细胞和单核细胞染色。对于每个门控的群体，用6-25获得的平均荧光强度与用同种型对照获得的相似(图4)。

通过6-25抗体在蛋白质印迹中识别人重组sideroflexin 3，其具有对应于22kDa大小的条带。用两种商购抗体(兔多克隆抗体和小鼠单克隆抗体)通过蛋白质印迹检查该人重组sideroflexin 3的识别。用这两种抗体获得两条条带，其中一条对应于sideroflexin3的大小(22kDa)(图5)。

为了分析6-25抗体的功能，我们在有或没有6-25或同种型对照的情况下培养了CLL患者的PBMC 6天。6天后，在6-25的培养物中显示NLC消耗。消除B CCL后，消耗更明显。在用同种型对照或不用抗体的培养物中，NLC发育不受影响。与6-25抗体相比，在这些培养物中确实观察到圆形的贴壁细胞。然后，通过用膜联蛋白V和7-AAD染色并进行FACS分析来分析这三种培养物中的B CLL细胞的活力。在有或没有同种型对照的情况下培养6天后，B CLL的活力高，仅有6.4％的死细胞。然而，在6-25抗体存在下培养6天后，81.5％的B CLL死亡(图6)。

还在有或没有6-25或同种型对照的情况下计数两名CLL患者的PBMC培养物中的NLC。与有或没有同种型对照的培养物相比，6-25的培养物中NLC数接近于零(图7)。

参考文献

在整个申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开。

Claims (15)

1.一种抗体，其中所述抗体包含：

(a)重链，其中可变结构域包含：

-与SEQ ID NO：1所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR1；

-与SEQ ID NO：2所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR2；和

-与SEQ ID NO：3所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的H-CDR3；

(b)轻链，其中可变结构域包含：

-与SEQ ID NO：4所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR1；

-与SEQ ID NO：5所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR2；和

-与SEQ ID NO：6所示序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的L-CDR3；

(c)其以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

2.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：

(a)重链，其中可变结构域包含：

-序列如SEQ ID NO：1所示的H-CDR1；和

-序列如SEQ ID NO：2所示的H-CDR2；和

-序列如SEQ ID NO：3所示的H-CDR3；

(b)轻链，其中可变结构域包含：

-序列如SEQ ID NO：4所示的L-CDR1；和

-序列如SEQ ID NO：5所示的L-CDR2；和

-序列如SEQ ID NO：6所示的L-CDR3。

3.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：

-重链，其中可变结构域与SEQ ID NO:7所示序列具有至少70％或80％或90％同一性；

-轻链，其中可变结构域与SEQ ID NO:8所示序列具有至少70％或80％或90％同一性；

并且以与具有抗体6-25的可变轻链结构域(VL)和/或可变重链结构域(VH)的抗体基本上相同的亲和力结合sideroflexin-3。

4.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：

-重链，其中可变结构域的序列如SEQ ID NO:7所示；

-轻链，其中可变结构域的序列如SEQ ID NO:8所示。

5.前述权利要求任一项所述的抗体，其中所述抗体能够消耗肿瘤相关巨噬细胞。

6.前述权利要求任一项所述的抗体，其是嵌合抗体或人源化抗体。

7.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的抗体。

8.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的抗体重链或轻链。

9.权利要求1所述的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％或80％或90％同一性的核酸序列。

10.一种载体，其包含权利要求7-9所述的核酸分子。

11.一种宿主细胞，其已经通过权利要求7-9所述的核酸和/或权利要求10所述的载体转染、感染或转化。

12.权利要求1所述的抗体用作药物。

13.用于检测生物样品中的肿瘤相关巨噬细胞和/或评估其含量的方法，其中所述方法包括将所述样品与权利要求1所述的抗体接触。

14.权利要求1所述的抗体用于治疗癌症。

15.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体。