CN104854132A - Rspo3结合剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明关于RSPO结合剂，特别是RSPO3结合剂及使用该结合剂以治疗疾病(诸如癌症)的方法。本发明提供与人RSPO3蛋白特异性结合且调节β-连环蛋白活性的抗体。本发明另提供使用能调节RSPO3蛋白的活性且抑制肿瘤生长的试剂的方法。本发明也描述治疗癌症的方法，该方法包含对患有肿瘤或癌症的患者施用治疗有效量的本发明的试剂或抗体。

Description

RSPO3结合剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请案主张于2012年7月13日提出申请的美国临时专利申请案第61/671,421号、2013年1月16日提出申请的美国临时申请案第61/753,184号、2013年3月15日提出申请的美国临时申请案第61/789,156号及2013年5月23日提出申请的美国临时申请案第61/826,747号的优先权，各案以参照方式整体纳入本文。
技术领域
本发明的领域大抵关于与R-脊椎蛋白(RSPO)、特别是人R-脊椎蛋白RSPO3结合的抗体及其它试剂，以及使用该抗体或其它试剂以治疗疾病诸如癌的方法。
背景技术
R-脊椎蛋白(RSPO)家族的蛋白在脊椎动物之间具保守性，包含四个成员RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4。这些蛋白有许多不同的名称，包括顶板特异性脊椎蛋白(roof plate-specific spondin)、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin 1-4及Futrin1-4。RSPO为小型分泌蛋白，所有RSPO共享大约40至60％的序列同源性及结构域组织。所有RSPO蛋白包含在N端的两个类似弗林蛋白酶(furin)的多半胱氨酸区、其后为血小板反应素结构域及碱性带电C端尾部(Kim等，2006,Cell Cycle,5:23-26)。
研究显示，RSPO蛋白在脊椎动物发育期间(Kamata等，2004,Biochim.Biophys Acta,1676:51-62)与爪蟾(Xenopus)的肌肉发育(Kazanskaya等，2004,Dev.Cell,7:525-534)方面具有功能。研究也显示RSPO1为胃肠上皮细胞的强效有丝分裂原(Kim等，2005,Science,309:1256-1259)。报告指出RSPO3主要表达于爪蟾及小鼠的内皮细胞及内皮前驱细胞中或附近。另外，研究指出RSPO3可能在胚胎发生时作为血管生成因子(Kazanskaya等，2008,Development,135:3655-3664)。已知RSPO蛋白活化类似Wnt信号传导的β-连环蛋白信号传导，然而RSPO蛋白与Wnt信号传导之间的关系仍在研究当中。报告指出RSPO蛋白对Wnt配体具有阳性调节活性(Nam等，2006,JBC281:13247-57)。此研究也指出RSPO蛋白可作为Frizzled8及LRP6受体配体及诱导β-连环蛋白信号传导(Nam等，2006,JBC 281:13247-57)。最近研究已发现RSPO蛋白与LGR(富含亮氨酸重复的G蛋白偶合受体)蛋白(如LGR5)之间有相互作用(美国专利公开号2009/0074782及2009/0191205)，这些资料提出活化β-连环蛋白信号传导的替代途径。
Wnt信号传导途径已被认为是有效的癌治疗靶标。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、后胚胎组织维持及干细胞生物学的重要调节因子之一。更特别地，Wnt信号传导在细胞极性的产生和细胞命运决定包括干细胞族群自我更新中起重要作用。未受调节的Wnt途径活化与许多人癌症有关，一般相信该活化可改变细胞的发育命运。活化Wnt途径可能使肿瘤细胞维持在未分化状态和/或导致不受控制的增生。因此癌的发生可通过超越控制正常发育及组织修复的恒定机制进行(于Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50；Beachy等，2004,Nature,432:324-31中综述)。
Wnt信号传导途径首先在果蝇发育突变无翅(wg)以及小鼠原致癌基因int-1(现称Wnt1)中阐述(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；Van Ooyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabrera等，1987,Cell,50:659-63；Rijsewijk等，1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因编码分泌型脂肪修饰糖蛋白，其中19种已在哺乳动物中识别。这些分泌型配体活化由卷曲(FZD)受体家族成员及低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRP5/6)组成的受体复合体。该FZD受体为G蛋白偶合受体(GPCR)超家族的七个跨膜结构域蛋白，且包含具有10个保守性半胱氨酸的大型胞外N端配体结合结构域，称为多半胱氨酸区(CRD)或Fri结构域。有十种人FZD受体，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。不同的FZD CRD对特定Wnt蛋白有不同的结合亲和性(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，FZD受体已被分成活化典型β-连环蛋白途径者及活化非典型途径者(Miller等，1999,Oncogene,18:7860-72)。
Wnt信号传导于癌症的角色，首先是因为识别Wnt1(原名int1)为通过邻近插入小鼠病毒而转化的乳腺肿瘤的致癌基因而被发现(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。其它Wnt信号传导在乳腺癌角色的证据自此开始累积。举例来说，转基因β-连环蛋白于乳腺中的过表达导致增生及腺癌(Imbert等，2001,J.Cell Biol.,153:555-68；Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，然而丧失Wnt信号传导扰乱正常乳腺发育(Tepera等，2003,J.Cell Sci.,116:1137-49；Hatsell等，2003,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳腺癌中，β-连环蛋白累积表示超过50％的癌中有经活化的Wnt信号传导，虽然特定突变尚未被识别，但已观察到卷曲受体表达上调(Brennan&Brown,2004,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,9:119-31；Malovanovic等，2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。
Wnt途径的活化也和结直肠癌有关。大约5至10％的所有结直肠癌为遗传性，其中一种主要形式为家族性腺瘤息肉症(FAP)，这是一种常染色体显性疾病，其中大约80％的患者包含大肠腺瘤息肉(APC)基因的种系突变。另外也在其它Wnt途径成分包括Axin及β-连环蛋白发现突变。个别腺瘤为包含第二失活等位基因的上皮细胞的种系过度生长，大量FAP腺瘤无可避免地导致腺癌经由致癌基因和/或抑瘤基因的额外突变发生。另外，Wnt信号传导途径的活化，包括APC的功能丧失突变及β-连环蛋白的稳定突变，可诱导小鼠模型中的增生发育及肿瘤生长(Oshima等，1997,CancerRes.,57:1644-9；Harada等，1999,EMBO J.,18:5931-42)。
黑色素瘤和乳腺癌及结肠癌类似，通常具有Wnt途径的组成性活化，如β-连环蛋白的细胞核累积所示。一些黑色素瘤及细胞系中的Wnt/β-连环蛋白途径活化是因为途径成分的修饰所致，如APC、ICAT、LEF1及β-连环蛋白(见例如Larue等，2006,Frontiers Biosci.,11:733-742)。然而，文献中关于Wnt/β-连环蛋白信号传导在黑色素瘤中的确切作用有所矛盾。举例来说，一项研究发现细胞核β-连环蛋白浓度上升和黑色素瘤存活改善有关，而经活化的Wnt/β-连环蛋白信号传导却与细胞增生减少有关(Chien等，2009,PNAS,106:1193-1198)。
癌药物研究的焦点现正转移至以人癌症相关性基因、蛋白及途径为目标的靶向治疗。需要能为癌患者提供治疗益处的靶向信号传导途径的新药剂及靶向多重途径的新的药剂组合。因此，干扰β-连环蛋白信号传导的生物分子(例如抗RSPO3抗体)是癌及其它β-连环蛋白相关疾病的新治疗药剂的潜在来源。
发明内容
本发明提供与RSPO3蛋白结合的结合剂(诸如抗体)以及包含该结合剂的组合物(诸如药物组合物)。本发明也提供与RSPO3及至少一种其它抗原或靶标结合的结合剂以及该结合剂的药物组合物。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是新颖多肽，如抗体、抗体片段及与该抗体相关的其它多肽。本发明另提供通过将该RSPO3结合剂施用至患有肿瘤的受试对象以抑制肿瘤生长的方法。本发明另提供通过将该RSPO3结合剂施用至需要该结合剂的受试对象以治疗癌的方法。在一些实施方式中，治疗癌或抑制肿瘤生长的方法包含利用该RSPO3结合剂以靶向癌干细胞。在一些实施方式中，该方法包含扰乱β-连环蛋白信号传导。在一些实施方式中，该方法包含调节(例如抑制)血管生成。在某些实施方式中，该方法包含减少肿瘤中癌干细胞的频率、减少肿瘤中癌干细胞的数量、减少肿瘤的致瘤性和/或通过减少肿瘤中癌干细胞的数量或频率以减少肿瘤的致瘤性。
在一方面，本发明提供与人RSPO3特异性结合的结合剂，如抗体。人RSPO3的序列为该领域已知，其作为SEQ ID NO:3包含于本文中。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂结合至人RSPO3的氨基酸22至272以内。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂结合至人RSPO3的氨基酸22至207以内。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂结合至人RSPO3的氨基酸35至135以内。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂结合至人RSPO3的氨基酸35至86以内。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂结合至人RSPO3的氨基酸92至135以内。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂(如抗体)与选自RSPO1、RSPO2或RSPO4的至少一种其它人RSPO特异性结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体调节β-连环蛋白活性、为β-连环蛋白信号传导的拮抗剂、抑制β-连环蛋白信号传导和/或抑制β-连环蛋白活化。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂抑制RSPO3信号传导。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂抑制、干扰和/或扰乱RSPO3与一种或多种LGR蛋白(如LGR4、LGR5和/或LGR6)的结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂抑制RSPO3与LGR5的结合。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与人RSPO3结合的抗体。在一些实施方式中，该抗体与人RSPO3及小鼠RSPO3结合。在某些实施方式中，该抗体包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在一些实施方式中，该抗体另包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)。在一些实施方式中，该抗体包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该抗体包含：包含DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQID NO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该抗体包含：包含DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ IDNO:80)的重链CDR3，和/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ IDNO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该抗体包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ IDNO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含下列的抗体：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)、DYSIH(SEQ IDNO:78)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的重链CDR1；(b)包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)、YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的重链CDR2；(c)包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)、TYFANNFD(SEQ ID NO:80)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的重链CDR3；(d)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)、KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的轻链CDR1；(e)包含AAS(SEQ ID NO:13)、AASNLES(SEQ ID NO:82)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的轻链CDR2；及(f)包含QQSNEDPLT(SEQ IDNO:14)、QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的轻链CDR3。在一些实施方式中，该氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，该取代被当作种系人源化过程的一部份。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含下列的抗体：(a)与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少80％序列一致性的重链可变区，和/或(b)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少80％序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含下列的抗体：(a)与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少90％序列一致性的重链可变区，和/或(b)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少90％序列一致性的轻链可变区。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，该单克隆抗体是IgG1抗体。在一些实施方式中，该单克隆抗体系IgG2抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是单克隆抗体131R002或单克隆抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是单克隆抗体131R002或单克隆抗体131R003的亲和性成熟变异体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂为包含源自抗体131R002或抗体131R003的抗原结合位点的嵌合抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002或抗体131R003的人源化形式。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011。
在另一方面，本发明提供与本发明的抗体竞争与人RSPO3特异性结合的结合剂(例如抗体)。在一些实施方式中，该结合剂(例如抗体)与包含重链可变区及轻链可变区的抗体竞争与人RSPO3的特异性结合，该重链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:62，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86。在一些实施方式中，与该RSPO3结合剂竞争的抗体是抗体131R002或抗体131R003。在一些实施方式中，与该RSPO3结合剂竞争的抗体是抗体131R002或抗体131R003的人源化形式。在一些实施方式中，与该RSPO3结合剂竞争的抗体是抗体h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011。在一些实施方式中，该结合剂在体外竞争性结合测定中与本发明的抗体竞争与RSPO3的特异性结合。
在某些实施方式中，该结合剂是与本发明的抗体(例如131R002、131R003或其人源化形式/变异体)所结合的RSPO3上的相同表位或实质上相同的表位结合的抗体。在某些实施方式中，该结合剂是与抗体h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011所结合的RSPO3上的相同表位或实质上相同的表位结合的抗体。
在另一方面，该结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与本发明的抗体(例如131R002、131R003或其人源化形式/变异体)所结合的RSPO3上的表位重叠。在一些实施方式中，该结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与抗体h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011所结合的RSPO3上的表位重叠。
在前述各方面或实施方式的特定实施方式以及本说明书中其他部分所述的其它方面和/或实施方式中，该结合剂是双特异性抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体与人RSPO3及第二靶标特异性结合。在一些实施方式中，该双特异性抗体与人RSPO3及人RSPO1特异性结合。在一些实施方式中，该双特异性抗体与人RSPO3及人RSPO2特异性结合。在一些实施方式中，该双特异性抗体与人RSPO3及人RSPO4特异性结合。在一些实施方式中，该双特异性抗体调节β-连环蛋白活性。在某些实施方式中，该双特异性抗体抑制β-连环蛋白活性。在某些实施方式中，该双特异性抗体抑制β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，该双特异性抗体抑制β-连环蛋白的活化。在一些实施方式中，该双特异性抗体减少癌干细胞的数量或频率。在某些实施方式中，该双特异性抗体包含两个完全相同的轻链。在某些实施方式中，该双特异性抗体是IgG抗体。在某些实施方式中，该双特异性抗体是IgG1抗体。在某些实施方式中，该双特异性抗体是IgG2抗体。
在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在一些实施方式中，该第一抗原结合位点包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ IDNO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)。在一些实施方式中，该双特异性抗体还包含与人RSPO1特异性结合的第二抗原结合位点。在一些实施方式中，该双特异性抗体还包含与人RSPO2特异性结合的第二抗原结合位点。抗RSPO1抗体或抗RSPO2抗体的非限制性实例已于例如国际专利申请案公开号WO 2013/012747描述。在一些实施方式中，该第一及第二结合位点包含共同(例如相同)轻链。
在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：a)与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，及b)与人RSPO1特异性结合的第二抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ IDNO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：a)与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，及b)与人RSPO2特异性结合的第二抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ IDNO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在一些实施方式中，该第一抗原结合位点包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ IDNO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)。
在一些实施方式中，该双特异性抗体与人RSPO3特异性结合，且包含与SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少90％的序列一致性的重链可变区。在一些实施方式中，该双特异性抗体与人RSPO3特异性结合，且包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少95％的序列一致性的重链可变区。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含第一及第二结合位点，其中该第一及第二结合位点包含共同(例如相同)轻链。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少95％序列一致性的轻链可变区。
在前述各方面的某些实施方式以及本说明书中其他部分所述的其它方面和/或实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体经分离。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体是实质上纯的。
在另一方面，本发明提供多肽。在一些实施方式中，该多肽包含选自下列的序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87及SEQ IDNO:88。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:36和/或SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQID NO:37和/或SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:44和/或SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:45和/或SEQ IDNO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:44和/或SEQ ID NO:72。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:45和/或SEQ ID NO:72。在一些实施方式中，该多肽包含SEQID NO:62和/或SEQ ID NO:72。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:44和/或SEQ ID NO:86。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:45和/或SEQ IDNO:86。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:86。
在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:22和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ IDNO:41和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:46和/或SEQID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:47和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:73。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:47和/或SEQ ID NO:73。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:63和/或SEQ IDNO:73。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:73。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:87。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:47和/或SEQ ID NO:87。在一些实施方式中，该多肽包含SEQID NO:63和/或SEQ ID NO:87。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:87。
在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:27和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:39和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ IDNO:42和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:48和/或SEQID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:64和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:48和/或SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:64和/或SEQ IDNO:74。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:48和/或SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该多肽包含SEQID NO:64和/或SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:88。
在一些实施方式中，该多肽经分离。在某些实施方式中，该多肽是实质上纯的。在某些实施方式中，该多肽是抗体或任何抗体的部分，诸如抗体片段。
在另一方面，本发明提供经分离的多核苷酸分子，该经分离的多核苷酸分子包含编码前述各方面以及本说明书中的其它方面和/或实施方式中的抗体和/或多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，该多核苷酸包含选自下列的序列：SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94及SEQ IDNO:95。在一些实施方式中，该多核苷酸包含编码选自下列的多肽的多核苷酸：SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88。
本发明另提供包含该多核苷酸的表达载体，以及包含该表达载体和/或该多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，该细胞是杂交瘤细胞系。在一些实施方式中，该细胞是单克隆细胞系。在一些实施方式中，该细胞是原核细胞。在一些实施方式中，该细胞是真核细胞。
在其它方面，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，该方法包含使该肿瘤与有效量的RSPO3结合剂或抗体(包括本文所述的各种)接触。
在另一方面，本发明提供抑制受试对象中的肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂或抗体(包括本文所述的各种)。
在另一方面，本发明提供抑制细胞中β-连环蛋白信号传导的方法，该方法包含使该细胞与有效量的RSPO3结合剂或抗体(包括本文所述的各种)接触。在一些实施方式中，该细胞是肿瘤细胞。在一些实施方式中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是胰脏肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是肺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是乳腺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤表达升高水平的至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，该肿瘤表达升高水平的RSPO1。在一些实施方式中，该肿瘤表达升高水平的RSPO2。在一些实施方式中，该肿瘤表达升高水平的RSPO3。在一些实施方式中，该肿瘤表达高水平的至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，该肿瘤表达高水平的RSPO1。在一些实施方式中，该肿瘤表达高水平的RSPO2。在一些实施方式中，该肿瘤表达高水平的RSPO3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂举例来说通过减少肿瘤中癌干细胞的数量和/或频率以抑制该肿瘤生长。在一些实施方式中，该肿瘤包含RSPO基因融合。在一些实施方式中，该肿瘤包含RSPO2基因融合。在一些实施方式中，该肿瘤包含RSPO3基因融合。
在另一方面，本发明提供治疗受试对象的癌的方法。在一些实施方式中，该方法包含对受试对象施用治疗有效量的如上述的RSPO3结合剂或抗体以及本文其他部分所述者的任一者。在一些实施方式中，该癌是胰腺癌。在一些实施方式中，该癌是结直肠癌。在一些实施方式中，该结直肠癌包含大肠腺瘤息肉(APC)基因中的失活突变。在一些实施方式中，该结直肠癌不包含APC基因中的失活突变。在一些实施方式中，该结直肠癌包含野生型APC基因。在一些实施方式中，该结直肠癌包含RSPO基因融合。在一些实施方式中，该结直肠癌包含RSPO2基因融合。在一些实施方式中，该结直肠癌包含RSPO3基因融合。在一些实施方式中，该癌是卵巢癌。在一些实施方式中，该癌是肺癌。在一些实施方式中，该癌是乳腺癌。在一些实施方式中，该癌表达升高水平的至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，该癌是表达升高水平的RSPO3的卵巢癌。在一些实施方式中，该癌是表达升高水平的RSPO3的肺癌。在一些实施方式中，该癌是表达升高水平的RSPO3的乳腺癌。在一些实施方式中，该癌是表达升高水平的RSPO3的胰腺癌。
在另一方面，本发明提供治疗受试对象的疾病的方法，其中该疾病是与β-连环蛋白活化、β-连环蛋白信号传导增加和/或β-连环蛋白信号传导异常有关，其中该方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂或抗体，包括本文所述的各者。
在前述各方面的某些实施方式以及本文其他部分所述的其它方面和/或实施方式中，该治疗方法另包含测定至少一种RSPO蛋白于肿瘤或癌中的表达水平的步骤。
在另一方面，本发明提供识别或选择适用于以RSPO3结合剂或抗体(包括但不限于本文所述的各种)治疗的人受试对象的方法。在一些实施方式中，该方法包含测定该受试对象是否具有其中特定RSPO(如RSPO3)蛋白表达水平相较于相同RSPO蛋白在正常组织中的表达或该相同RSPO蛋白的预定水平上升的肿瘤。在一些实施方式中，该方法包含识别适合治疗的受试对象或选择适合治疗的受试对象，若该肿瘤具有升高水平的RSPO表达。在一些实施方式中，该方法包含测定该受试对象是否具有包含APC基因失活突变的肿瘤。在一些实施方式中，该方法包含识别适合治疗的受试对象或选择适合治疗的受试对象，若该肿瘤包含APC基因失活突变。在一些实施方式中，该方法包含测定该受试对象是否具有包含RSPO基因融合(例如RSPO3基因融合)的肿瘤。在一些实施方式中，该方法包含识别适合治疗的受试对象或选择适合治疗的受试对象，若该肿瘤包含RSPO基因融合(如RSPO3基因融合)。
在前述各方面的某些实施方式以及本文其他部分所述的其它方面和/或实施方式中，该治疗方法包含对该受试对象施用该RSPO3结合剂及至少一种其它治疗剂。
本发明另提供包含本文所述的RSPO3结合剂或抗体及药学上可接受的载剂的药物组合物，及产生该RSPO3结合剂的细胞系。本发明也提供治疗受试对象(例如人)的癌和/或抑制肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试对象施用有效量的包含该RSPO3结合剂的药物组合物。
本发明的方面或实施方式是以马库什群组或其它选择性形式的群组描述，本发明不仅涵盖被标示为整体的整个群组，也涵盖该群组的个别成员及该主要群组中所有可能的子群组，并且还涵盖不含其中一个或多个群组成员的主要群组。本发明也设想明确排除所要求的发明中任何群组成员之一或多者。
附图说明
图1：RSPO于肿瘤及正常组织中的表达。图中显示来自正常、良性及恶性组织人样本的微阵列数据概述。各打勾记号显示RSPO mRNA的表达水平。(A)RSPO1(B)RSPO2(C)RSPO3
图2：RSPO蛋白与LGR5的结合试验。表达LGR5的HEK-293细胞的FACS分析。HEK-293细胞经编码FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表达载体瞬时转染，然后与可溶性RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc或RSPO4-Fc融合蛋白混合。抗FLAG抗体被用来做为阳性对照，可溶性FZD8-Fc被用来作为阴性对照。特异性结合是由各FACS图的黑色线框内有信号存在所表示。
图3：抗RSPO3抗体抑制由RSPO3及WNT3A诱导的β-连环蛋白信号传导。TOPflash荧光素酶报告基因试验被用来测量在暴露于WNT3a(5ng/ml)与RSPO3(10ng/ml)的组合后且在渐增浓度的抗RSPO3抗体(131R002或131R003)存在下HEK-293细胞中的β-连环蛋白信号传导。使用经4倍连续稀释20μg/ml至0.02μg/ml的抗体。对照组包括在无抗体存在下暴露于对照培养基(无WNT3a且无RSPO)、仅WNT3a或WNT3a与RSPO3的组合。
图4：亲和性成熟131R003抗体变异体抑制由RSPO3及WNT3A诱导的β-连环蛋白信号传导。TOPflash荧光素酶报告基因试验被用来测量在暴露于WNT3a与RSPO3的组合后且在渐增浓度的抗RSPO3抗体(131R003(-▲-)、131R003CDR1变异体(-■-)或131R003CDR3变异体(-●-))存在下HEK-293细胞中的β-连环蛋白信号传导。使用经5倍连续稀释20μg/ml至0.006μg/ml的抗体。对照组包括在无抗体存在下暴露于对照培养基(无WNT3a且无RSPO)/仅细胞(-Δ-)、对照抗体(-▼-)、仅WNT3a(-◆-)或WNT3a与RSPO3的组合(-□-)。
图5：抗RSPO抗体抑制肿瘤生长。OV38卵巢肿瘤细胞经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO1抗体89M5与抗RSPO3抗体131R003的组合(-●-)；紫杉醇(taxol)(-▲-)；抗RSPO1抗体89M5、抗RSPO3抗体131R003与紫杉醇的组合(-▼-)；或对照抗体(-■-)治疗。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。
图6：抗RSPO抗体抑制肿瘤生长。OV38卵巢肿瘤细胞经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO1抗体89M5与抗RSPO3抗体131R002的组合(-▲-)；抗RSPO1抗体89M5与紫杉醇的组合(-○-)；抗RSPO3抗体131R002与紫杉醇的组合(-□-)；抗RSPO1抗体89M5、抗RSPO3抗体131R002与紫杉醇的组合(-Δ-)；仅紫杉醇(-▼-)或对照抗体(-■-)治疗。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。
图7：抗RSPO3抗体抑制肿瘤生长。(A)LU45肺肿瘤细胞经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗体131R002(-○-)或对照抗体(-■-)治疗。(B)LU25肺肿瘤细胞经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗体131R002(-○-)或对照抗体(-■-)治疗。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。
图8：亲和性成熟抗体变异体抑制由RSPO3及WNT3A诱导的β-连环蛋白信号传导。TOPflash荧光素酶报告基因试验被用来测量在暴露于WNT3a与人RSPO3的组合后且在渐增浓度的抗RSPO3抗体131R002(-▲-)、131R006(-●-)或131R007(-■-))存在下HEK-293T细胞中的β-连环蛋白信号传导。使用经5倍连续稀释20μg/ml至0.0064μg/ml的抗体。对照组包括在无抗体存在下暴露于对照培养基(无WNT3a且无RSPO/细胞(-○-))、仅WNT3a(-▼-)或WNT3a与人RSPO3的组合(-◆-)。
图9：抗RSPO3抗体抑制RSPO3与LGR5的相互作用。表达LGR5的HEK-293T细胞的FACS分析。HEK-293T细胞系经编码人LGR5的胞外域(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)的cDNA表达载体瞬时转染，然后与RSPO3-生物素融合蛋白及抗RSPO3抗体131R006或131R007混合。结合利用PE共轭的链霉抗生物素蛋白检测。相对RSPO3-生物素结合显示于y轴，FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表达显示于x轴。阳性结合由各FACS图的黑色线框内有信号存在所表示。
图10：抗RSPO抗体抑制肿瘤生长。NCI-H2030细胞系经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗体131R002(-●-)、仅卡铂(-Δ-)、抗RSPO3抗体131R002与卡铂的组合(-○-)或对照抗体(-■-)处理。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。
图11：抗RSPO抗体抑制肿瘤生长。LU102肺肿瘤细胞系经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗体131R002(-●-)、仅卡铂(-Δ-)、抗RSPO3抗体131R002与卡铂的组合(-○-)或对照抗体(-■-)处理。(A)数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。(B)基因组富集分析结果。
图12：抗RSPO抗体抑制肿瘤生长。PN35胰腺肿瘤细胞系经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗体131R002(-●-)、吉西他滨与白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)的组合(-Δ-)、抗RSPO3抗体131R002与吉西他滨与白蛋白结合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)(ABRAXANE)的组合(-○-)或对照抗体(-■-)处理。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。(A)所有四个治疗组；(B)吉西他滨与白蛋白结合型太平洋紫杉醇治疗组，以及抗RSPO3抗体、吉西他滨与白蛋白结合型太平洋紫杉醇治疗组的放大图。
图13：抑制由RSPO3及WNT3A诱导的β-连环蛋白信号传导。TOPflash荧光素酶报告基因试验被用来测量在暴露于WNT3a与人RSPO3的组合后且在渐增浓度的抗RSPO3抗体131R007(-□-)或131R010(-●-)存在下HEK-293T细胞中的β-连环蛋白信号传导。使用经5倍连续稀释20μg/ml至0.0064μg/ml的抗体。对照组包括在无抗体存在下暴露于对照培养基(无WNT3a且无RSPO/细胞(-▲-))、仅WNT3a(-▼-)或WNT3a与人RSPO3的组合(-◆-)。
图14：抗RSPO抗体抑制肿瘤生长。LU25NSCLC肺肿瘤细胞系经皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗体131R008(-▲-)、仅太平洋紫杉醇(-○-)、抗RSPO3抗体131R008与太平洋紫杉醇的组合(-●-)或对照抗体(-■-)处理。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。
具体实施方式
本发明提供新颖的试剂，包括但不限于与RSPO蛋白(特别是人RSPO3)结合的多肽，如抗体。该RSPO3结合剂包括但不限于β-连环蛋白信号传导的拮抗剂。该RSPO3结合剂包括但不限于RSPO3与LGR蛋白相互作用的抑制剂。本发明也提供相关的多肽及多核苷酸、包含该RSPO3结合剂的组合物，及制备该RSPO3结合剂的方法。本发明另提供使用该新颖的RSPO3结合剂的方法，诸如抑制肿瘤生长的方法、治疗癌的方法、调节血管生成的方法、减少肿瘤中癌干细胞的频率的方法、抑制β-连环蛋白信号传导的方法，和/或识别和/或选择适合治疗的受试对象的方法。
人RSPO3特异性结合的单克隆抗体已被鉴定出，即单克隆抗体131R002及131R003(实施例3)。抗RSPO3抗体131R002及131R003与人RSPO3的结合亲和性小于10nM(实施例3)。抗RSPO3抗体131R002及131R003抑制RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导(实施例4，图3)。131R003的亲和性成熟变异体抑制RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导且具有比母体131R003更高的活性(实施例5，图4)。抗RSPO3抗体当以单一试剂作用、与抗RSPO1抗体组合以及与一种或多种化学治疗剂组合时，皆抑制肿瘤生长(实施例6、7、11、12及14；图5至7、10至12及14)。人源化抗RSPO3抗体h131R006及h131R007是比抗体131R002更强的β-连环蛋白活性抑制剂(实施例8，图8)。抗RSPO3抗体h131R006及h131R007阻断RSPO3与LGR5的结合(实施例9，图9)。人源化抗RSPO3抗体h131R010同型IgG1抑制β-连环蛋白活性，与IgG2同型抗体h131R007类似(实施例13，图13)。
I.定义
为了促进对本发明的了解，以下定义一些术语及短语。
本文所使用的术语“拮抗剂”及“拮抗性”是指部分或完全阻断、抑制、减少或中和靶标的生物活性和/或信号传导途径(例如β-连环蛋白信号传导)的任何分子。本文所使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制、减少或中和蛋白(例如RSPO蛋白)的活性的任何分子。适当的拮抗剂分子特别包括但不限于拮抗抗体或抗体片段。
本文所使用的术语“调节”是指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激或抑制活性。调节可为增加或减少活性(例如减少RSPO信号传导、减少β-连环蛋白信号传导)、改变结合特性，或与蛋白质、途径或其它生物性关注点的活性有关的生物性、功能性或免疫特性的任何其它改变。
本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子通过其可变区内的至少一个抗原结合位置辨识靶标且与的特异性结合，像是蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述组合的靶标。本文所使用的该术语包含完整多株抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体诸如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白质，及任何其它包含抗原辨认区(即抗原结合位点)的经修饰的免疫球蛋白分子只要该抗体展现所需的生物活性。抗体可为下列五种主要免疫球蛋白类型中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其亚型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，根据其分别被称为α、δ、ε、γ及μ的重链恒定结构域的形式。不同类型的免疫球蛋白具有不同且广为周知的次单位结构及三维构型。抗体可为未经修饰(naked)或与其它分子共轭，该其它分子包括但不限于毒素及放射性同位素。
术语“抗体片段”是指完整抗体的部分且是指完整抗体的抗原性决定可变区。抗原片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、线性抗体、单链抗体及自抗体片段形成的多特异性抗体。本文所使用的“抗体片段”包含抗原结合位点或表位结合位点。
抗体的“可变区”用语是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区(不论单独或组合指称)。重链及轻链的可变区各由四个架构区(FR)及连接该四个架构区的三个互补决定区(CDR)组成，该三个CDR又名“超变异区”。各链中的CDR被架构区拉近，并与来自其它链中的CDR一起形成该抗体的抗原结合位点。至少有两种技术用于测定CDR：(1)基于跨种序列变异性的方法(即Kabat等，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Edition,National Institutes of Health,Bethesda,MD)；及(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-Lazikani等，1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，有时该领域使用这两种技术的组合以测定CDR。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指同源性抗体群，其高度特异性辨认及结合单一抗原性决定簇或表位。此与多株抗体相反，多株抗体通常包括多种以不同抗原决定簇为目标的不同抗体的混合。术语“单克隆抗体”包含完整及全长单克隆抗体，也包含抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)抗体、双特异性抗体、包含抗体部分的融合蛋白质、及任何其它包含抗原辨认区(抗原结合位点)的经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指由多种技术包括但不限于杂交瘤产生、噬菌体选择、重组表达及转基因动物制备的该抗体。
本文所使用的术语“人源化抗体”是指非人(例如小鼠)抗体的形式，该形式是包含最少非人序列的特定免疫球蛋白链、嵌合性免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗体是其中CDR的残基经非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR残基取代的人免疫球蛋白，其具有所需的特异性、亲和性和/或结合能力(Jones等，1986,Nature,321:522-525；Riechmann等，1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等，1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv架构区残基是由具有所需特异性、亲和性、结构和/或结合能力的非人物种的抗体的对应残基取代。该人源化抗体可进一步通过取代Fv架构区和/或该经取代的非人残基内的额外残基加以修饰，以精进优化抗体特异性、亲和性、结构和/或结合能力。通常，该人源化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两或三个对应该非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或实质上所有的架构区是具有人免疫球蛋白共同序列的架构区。该人源化抗体也可包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于例如美国专利第5,225,539号。
本文所使用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有对应由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体可利用任何该领域已知的技术制备。此人抗体的定义特别排除包含非人CDR的人源化抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体”是指其中该免疫球蛋白分子的氨基酸序列是源自两个或多个物种的抗体。通常，轻链及重链的可变区皆对应源自一哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的抗体的可变区，然而该恒定区对应源自另一物种(通常是人)的抗体中的序列。
本文所使用的短语“亲和性成熟抗体”是指在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，该改变导致该抗体对抗原的亲和性增加，相较于不具有该改变的母体抗体。该定义也包括与CDR残基改变一起发生的非CDR残基的改变。较佳的亲和性成熟抗体将具有奈莫耳或甚至皮莫耳程度的对靶标抗原的亲和性。亲和性成熟抗体通过该领域已知的方法产生。举例来说，Marks等，1992,Bio/Technology 10:779-783描述通过VH及VL结构域替换产生的亲和性成熟。CDR和/或架构残基的随机突变形成由Barbas等，1994,PNAS,91:3809-3813；Schier等，1995,Gene,169:147-155；Yelton等，1995,J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等，1995,J.Immunol.,154:3310-9及Hawkins等，1992,J.Mol.Biol.,226:889-896描述。定点突变形成也可被用来获得亲和性成熟抗体。
术语“表位”及“抗原决定簇”在本文可交换使用，是指可被特定抗体辨识且特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可自连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。自连续氨基酸形成的表位(又称为线性表位)通常在蛋白质变性时仍被保留，然而通过三级折叠形成的表位(又称为构形表位)通常在蛋白质变性时丧失。表位通常包括至少3个及更常地至少5或8至10个呈独特空间构形的氨基酸。
术语“异多聚分子”或“异多聚体”或“异多聚复合物”或“异多聚多肽”在本文可被交换使用，是指包含至少第一多肽及第二多肽的分子，其中该第二多肽与第一多肽的氨基酸序列有至少一个氨基酸残基不同。该异多聚分子可包含由第一及第二多肽形成的“异二聚体”，或可形成其中存在额外多肽的更高阶的三级结构。
术语“选择性结合”或“特异性结合”是指结合剂或抗体以更频繁、更快速、更长时间、更高亲和性或上述条件的某些组合与表位、蛋白质或靶标分子反应或结合，相较于可供选择的物质包括非相关蛋白质。在某些实施方式中，“特异性结合”是指例如抗体以大约0.1mM或更低，但通常低于大约1μM的KD与蛋白质结合。在某些实施方式中，“特异性结合”是指抗体有时以至少约0.1μM或更低，有时以至少约0.01μM或更低，且有时以至少约1nM或更低的KD与靶标结合。由于不同物种之间的同源性蛋白质具有序列一致性，因此特异性结合可包括辨识超过一个物种的蛋白质的抗体(例如人RSPO3及小鼠RSPO3)。同样地，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内具有同源性，因此特异性结合可包括辨识超过一种蛋白(例如人RSPO3及RSPO1)的抗体(或其它多肽或结合剂)。应了解的是，在某些实施方式中，与第一靶标特异性结合的抗体或结合基团可能或可能不与第二靶标特异性结合。因此，“特异性结合”不一定表示(虽然可包括)排他性结合(即与单一靶标结合)。因此，在某些实施方式中，抗体与一种以上的靶标特异性结合。在某些实施方式中，多重靶标可能由抗体上的相同的抗原结合位点结合。举例来说，在某些情况下，抗体可能包含两个完全相同的抗原结合位点，该两个抗原结合位点各自与两个或多个蛋白(例如RSPO3及RSPO1)上的相同表位特异性结合。在某些可供选择的实施方式中，抗体可能为多特异性且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合位点。以非限制性实例而言，双特异性抗体可包含一个辨识第一蛋白(例如人RSPO3)上的表位的抗原结合位点，另包含第二个辨识第二蛋白(例如人RSPO2)上的不同表位的不同抗原结合位点。一般来说(但不必然)，所谓的结合是指特异性结合。
术语“多肽”和“肽”以及“蛋白”在本文可交换使用，这些用语是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为线性或分支，其可能包含经修饰的氨基酸，且其可能被非氨基酸中断。该用语也包含经天然或人为干预修饰的氨基酸聚合物；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，诸如与标记成份共轭。该定义也包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)以及该领域习知的其它修饰的多肽。应了解的是，由于本发明的多肽可能以抗体为主，因此在某些实施方式中，该多肽可能为单链或相连的多个链。
术语“多核苷酸”及“核酸”在本文可交换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶被纳入聚合物中的底物。
“高度严谨度的条件”可识别为下列条件：(1)采用低离子张力及高温清洗，例如于50℃的15mM NaCl/1.5mM柠檬酸钠/0.1％十二基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如42℃的具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液的于pH 6.5的5x SSC(0.75M NaCl，75mM柠檬酸钠)中的50％(体积/体积)甲酰胺；或(3)于杂交期间采用42℃于5x SSC中的50％甲酰胺、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、经超音波化的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，于42℃以0.2x SSC及50％甲酰胺清洗，之后于55℃以含有EDTA的0.1x SSC进行高严谨度清洗。
在提及两个或多个核酸或多肽时，术语“一致”或百分比“一致性”是指当两个或多个序列或子序列经比较及排比(需要时导入间格)以达最高对应性且不把任何保守性氨基酸取代当作序列一致性的部分时，该两个或多个序列或子序列是相同或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。该百分比一致性可利用序列比较软件或算法测量，或通过目视检查测量。多种可被用于取得氨基酸或核苷酸序列排比的算法及软件是该领域所广为周知。该算法及软件包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin软件包及其变化性产品。在一些实施方式中，本发明的两个核酸或多肽是实质上一致表示当其经比较或排比以达最高对应性时，利用序列比较算法或目视检查得知其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％且在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基一致性。在一些实施方式中，一致性存在于至少约10、至少约20、至少约40至60残基、至少约60至80残基长度或介于其间的任何整数长度的序列区域。在一些实施方式中，一致性存在于60至80残基以上的更长区域，诸如至少约80至100残基，且在一些实施方式中该序列是与经比较的全长序列诸如核苷酸序列的编码区域实质上一致。
“保守性氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基取代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基群系于该领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例来说，以苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。较佳地，本发明的多肽及抗体的序列中的保守性取代不废除含有该氨基酸序列的多肽或抗体与该多肽或抗体原本所结合的抗原(即该一种或多种RSPO蛋白)的结合。识别不消除抗原结合性的核苷酸及氨基酸保守性取代的方法是该领域所广为周知。
本文所使用的术语“载体”是指构建体，该构建体能在宿主细胞中递送及通常表达一种或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒载体、粘质体载体、噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体，及包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体。
经“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈现未见于天然中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些经纯化至一定程度而使其不再以见于天然中的形式存在者。在一些实施方式中，经纯化的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是实质上纯的。
本文所使用的术语“实质上纯的”是指其为至少50％纯的(即不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的的物质。
本文所使用的术语“癌”及“癌性”是指称或描述哺乳动物的生理状况，其中细胞群具有未受调节的细胞生长的特征。癌的实例包括但不限于癌(carcinoma)、胚细胞瘤、肉瘤及血液性癌诸如淋巴瘤及白血病。
本文所使用的术语“肿瘤”及“赘生物(neoplasm)”是指任何由过度细胞生长或增生所导致的组织团块，不论是良性(非癌性)或包括癌前性病灶的恶性(癌性)。
本文所使用的术语“转移”是指癌藉以自原发部位扩散或转移至身体其它区域且在新位置发展类似癌性病灶的过程。“转移”或“转移性”细胞是指与邻近细胞丧失粘着接触且经由血流或淋巴自疾病的原发部位移动以入侵邻近身体结构的细胞。
术语“癌干细胞”、“CSC”、“肿瘤干细胞”及“肿瘤起始细胞”在本文可交换使用，是指源自癌或肿瘤且具有下列特性的细胞：(1)具有广泛增生能力，(2)能进行不对称细胞分裂以产生一种或多种类型的经分化的细胞后代，其中该经分化的细胞具有减少的增生或发育能力，及(3)能进行对称细胞分裂以自我更新或自我维持。这些特性授予癌干细胞在连续移植至免疫不全的宿主(例如小鼠)时能形成或建立肿瘤或癌的能力，相对于大部分无法形成肿瘤的肿瘤细胞。癌干细胞以混乱的方式进行自我更新及分化以形成具有异常且可在将来突变发生时改变的细胞类型的肿瘤。
术语“癌细胞”及“肿瘤细胞”是指源自癌或肿瘤或癌前病灶的细胞的整体族群，包括非致瘤性细胞(其包含大部分的癌细胞族群)及致瘤性干细胞(癌干细胞)。本文所使用的术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”当仅用于指称那些缺乏更新及分化能力的细胞时将由术语“非致瘤性”修饰，以区别那些肿瘤细胞与癌干细胞。
本文所使用的术语“致瘤性”是指癌干细胞的功能特性，包括自我更新(导致额外的致瘤性癌干细胞)及增生以产生所有其它肿瘤细胞(导致经分化及因此非致瘤性肿瘤细胞)的特性。
本文所使用的术语“致瘤性”是指源自肿瘤的随机细胞样本在连续移植至免疫不全宿主(例如小鼠)时形成明显肿瘤的能力。此定义也包括当连续移植至免疫不全宿主(例如小鼠)时形成明显肿瘤的经富集和/或经分离的癌干细胞族群。
术语“受试对象”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长动物、犬、猫、囓齿动物及该类似动物，该动物将成为特定治疗的接受者。通常，关于人受试对象的术语“受试对象”及“患者”在本文可交换使用。
术语“医药上可接受”是指经美国联邦政府的管理机关或州政府核准(或可核准)或经明列于美国药典或其它普遍公认的药典中以用于动物(包括人)的产品或化合物。
术语“医药上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的医药载剂”是指可与本发明的至少一种结合剂(例如抗体)一起施用至受试对象的赋形剂、载剂或佐剂，且该赋形剂、载剂或佐剂不破坏该结合剂的活性。该赋形剂、载剂或佐剂当与足以达到治疗效应的剂量的结合剂一起施用时应不具毒性。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效应”是指有效“治疗”受试对象或哺乳动物的疾病或疾患的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、小型有机分子或其它药物的量。以癌为例，药物(例如抗体)的治疗有效量具有治疗效应且因此可减少癌细胞的数量；降低致瘤性、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力；减少癌干细胞的数量或频率；减少肿瘤大小；减少癌细胞群；抑制和/或停止癌细胞浸润至外围器官包括例如癌扩散至软组织及骨；抑制和/或停止肿瘤或癌细胞转移；抑制和/或停止肿瘤或癌细胞生长；缓解一种或多种与癌相关的症状的严重程度；减少发病率及死亡率；促进生活质量；或该效应的组合。以该试剂举例来说抗体预防现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的方面而言，其可被称为细胞静止性和/或细胞毒性。
术语“治疗”或“缓和”是指：1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状和/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展及2)预防性或防范性措施，该措施预防或减缓靶标病理状况或疾患的发展。因此那些需要治疗者包括那些已罹患该疾患者、那些易于罹患该疾患者，以及那些欲预防该疾患者。在一些实施方式中，受试对象是经本发明的方法成功“治疗”，若该患者显示下列一或多项：癌细胞的数量减少或完全消失；肿瘤大小减少；抑制或缺乏癌细胞浸润至外围器官包括癌细胞扩散至软组织及骨；抑制或缺乏肿瘤或癌细胞转移；抑制或缺乏癌生长；缓解一种或多种与该特定癌相关的症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；减少致瘤性；减少癌干细胞的数量或频率；或一些效应的组合。
如本揭示内容及权利要求中所使用者，单数形式的“一”(a,an)及“该”(the)包含复数形式除非上下文另外清楚地说明。
应了解的是，只要本文的实施方式是以术语“包含”描述，其也提供其它以“由...组成”和/或“实质上由...组成”的用语所描述的类似实施方式。也应了解的是，只要本文的实施方式是以术语“实质上由...组成”描述，其也提供其它以“由...组成”的用语所描述的类似实施方式。
当使用于本文诸如“A和/或B”的词组中，术语“和/或”意图包括A及B两者、A或B、A(单独)及B(单独)。同样地，使用于词组诸如“A、B和/或C”中的术语“和/或”意图包含下列实施方式中的各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(单独)；B(单独)；及C(单独)。
II.RSPO结合剂
本发明提供与人RSPO蛋白特异性结合的剂。该试剂在本文被称为“RSPO结合剂”。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是多肽。在某些实施方式中，该RSPO结合剂与RSPO3结合(“RSPO3结合剂”)。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与至少一种其它人RSPO特异性结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂所结合的至少一种其它人RSPO选自RSPO1、RSPO2或RSPO4。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO1、RSPO2和/或RSPO4上的相同表位结合的抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的第一表位结合且与RSPO1、RSPO2和/或RSPO4上的第二不同表位结合的双特异性抗体。人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4的全长氨基酸(aa)序列是该领域已知，在本文以SEQ ID NO:1(RSPO1)、SEQ ID NO:2(RSPO2)、SEQ ID NO:3(RSPO3)及SEQ IDNO:4(RSPO4)表示。
在某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的抗原结合位点能结合一、二、三或四个RSPO。在某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的抗原结合位点能结合RSPO3以及一、二或三个其它RSPO。举例来说，在某些实施方式中，RSPO3结合剂的抗原结合位点能与RSPO3以及选自RSPO1、RSPO2或RSPO4的至少一种其它RSPO特异性结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3及RSPO1特异性结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3及RSPO2特异性结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3及RSPO4特异性结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3、RSPO1及RSPO2特异性结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3、RSPO1及RSPO4特异性结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3、RSPO2及RSPO4特异性结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂与人RSPO3特异性结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂(例如抗体)与人RSPO3及小鼠RSPO3特异性结合。
在某些实施方式中，该抗原结合剂是在人RSPO3的氨基酸22至272内特异性结合的抗体。在某些实施方式中，该抗原结合剂是在人RSPO3的氨基酸22至207内特异性结合的抗体。在某些实施方式中，该抗原结合剂是在人RSPO3的氨基酸35至135内特异性结合的抗体。在某些实施方式中，该抗原结合剂是在人RSPO3的氨基酸35至86内特异性结合的抗体。在某些实施方式中，该抗原结合剂是在人RSPO3的氨基酸92至135内特异性结合的抗体。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂在SEQ ID NO:5内结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体与RSPO3的弗林蛋白酶样的多半胱氨酸区结合。在一些实施方式中，该试剂或抗体与RSPO3的弗林蛋白酶样的多半胱氨酸区内的至少一个氨基酸结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7内结合。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体在序列SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7内结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3的血小板反应素结构域结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体与RSPO3的血小板反应素结构域内的至少一个氨基酸结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体在SEQ ID NO:8内结合。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂或抗体以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(KD)与至少一种RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，RSPO结合剂或抗体以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(KD)与RSPO3结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约20nM或更低的KD与RSPO3结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约10nM或更低的KD与RSPO3结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约1nM或更低的KD与RSPO3结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约0.5nM或更低的KD与RSPO3结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约0.1nM或更低的KD与RSPO3结合。在某些实施方式中，本文所述的RSPO3结合剂或抗体与至少一种其它RSPO结合。在某些实施方式中，本文所述的与至少一种其它RSPO结合的RSPO3结合剂或抗体以大约100nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的KD与至少一种其它RSPO结合。举例来说，在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体也以大约10nM或更低的KD与RSPO1、RSPO2和/或RSPO4结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂以大约10nM或更低的KD与人RSPO及小鼠RSPO结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂以大约1nM或更低的KD与人RSPO3及小鼠RSPO3结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂以大约0.1nM或更低的KD与人RSPO3及小鼠RSPO3结合。在一些实施方式中，该结合剂(例如抗体)与RSPO3蛋白的解离常数是利用RSPO3融合蛋白测得的解离常数，该RSPO3融合蛋白包含至少部分的固定于Biacore芯片上的RSPO3蛋白。在一些实施方式中，该结合剂(例如抗体)与RSPO3蛋白的解离常数是利用被Biacore芯片上的抗人IgG抗体所捕捉的结合剂及RSPO3蛋白所测定的解离常数。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点及与第二靶标特异性结合的第二抗原结合位点。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约100nM或更低的KD与RSPO3及该第二靶标结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约50nM或更低的KD与RSPO3及该第二靶标结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约20nM或更低的KD与RSPO3及该第二靶标结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约10nM或更低的KD与RSPO3及该第二靶标结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体以大约1nM或更低的KD与RSPO3及该第二靶标结合。在一些实施方式中，该抗原结合位点之一的亲和性可能低于另一抗原结合位点的亲和性。举例来说，一个抗原结合位点的KD可能为大约1nM，第二抗原结合位点的KD可能为大约10nM。在一些实施方式中，该两个抗原结合位点之间的亲和性差异可能为大约2倍或2倍以上、大约3倍或3倍以上、大约5倍或5倍以上、大约8倍或8倍以上、大约10倍或10倍以上、大约15倍或15倍以上、大约20倍或20倍以上、大约30倍或30倍以上、大约50倍或50倍以上、或大约100倍或100倍以上。调整两个抗原结合位点的亲和性可能影响该双特异性抗体的生物活性。举例来说，降低该抗原结合位点对RSPO3或该第二靶标的亲和性可能具有所需效应，例如降低该结合剂的毒性和/或增加治疗指数。
以非限制性实例说明，该双特异性抗体可能包含(a)以约0.1nM至约10nM的KD与人RSPO3结合的第一抗原结合位点，及(b)以约0.1nM至约20nM、约0.5nM至约20nM或约1.0nM至10nM的KD与第二靶标(例如人RSPO2)特异性结合的第二抗原结合位点。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC50)与至少一种人RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC50)与人RSPO3结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)也以大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的EC50与人RSPO1、RSPO2和/或RSPO4结合。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该抗体是重组抗体。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，该抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，该抗体是人抗体。在一些实施方式中，该抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在某些实施方式中，该抗体是IgG1抗体。在某些实施方式中，该抗体是IgG2抗体。在某些实施方式中，该抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。在一些实施方式中，该抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体是单价抗体。在一些实施方式中，该抗体是单特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体是双价抗体。在一些实施方式中，该抗体与细胞毒性部分共轭。在一些实施方式中，该抗体经分离。在一些实施方式中，该抗体是实质上纯的。
本发明的RSPO3结合剂(例如抗体)的特异性结合可使用该领域已知的任何方法检测。可使用的免疫检测包括但不限于竞争性及非竞争性检测系统，该系统利用诸如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白印迹分析、放射性免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀分析、沉淀反应、胶体扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集测定、补体固定测定、免疫放射分析、荧光免疫分析及蛋白质A免疫分析的技术。该检测是例行性检测且为该领域中广为周知(见例如Ausubel等，Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。
举例来说，抗体与人RSPO3的特异性结合可利用ELISA测定。ELISA测定包含准备抗原，以抗原包覆96孔微量板的孔槽，添加与可检测的化合物诸如酶受质(例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)共轭的RSPO3结合抗体或其它RSPO3结合剂至孔槽，培养一段时间后，检测与该抗原结合的抗体的存在。在一些实施方式中，该RSPO3结合抗体或结合剂不与可检测的化合物共轭，而是将辨识该RSPO3结合剂或抗体且与可检测的化合物共轭的第二共轭抗体(例如抗Fc抗体)加入孔槽中。在一些实施方式中，不以抗原包覆孔槽，反而是以RSPO3结合剂或抗体包覆孔槽，并于添加抗原至该经包覆的孔槽后加入与可检测的化合物共轭的第二抗体。本领域技术人员将了解可经修改以增加经检测的信号的参数以及该领域所知的ELISA的其它变量。
在另一实例中，抗体与人RSPO3的特异性结合可利用FACS测定。FACS筛选测定可包含产生cDNA构建体以表达抗原为融合蛋白(例如RSPO3-Fc或RSPO3-CD4TM)，将该构建体转染至细胞中，使该抗原表达在细胞表面，使该RSPO3结合剂与该经转染的细胞混合，并培养一段时间。被RSPO3结合剂结合的细胞可利用与可检测的化合物共轭的二级抗体(例如与PE共轭的抗Fc抗体)及流式细胞分析识别。本领域技术人员将了解可经修改以优化经检测的信号的参数以及其它可增进筛选(例如筛选阻断抗体)的FACS变数。
抗体或其它结合剂与抗原(例如RSPO3)的结合亲和性及抗体－抗原交互反应的解离速率可通过竞争性结合测定决定。竞争性结合测定的一实例是放射性免疫测定，其包含在渐增量的未经标记的抗原存在下，培养经标记的抗原(例如3H或125I)或其片段或变异体与感兴趣的抗体，之后检测与该经标记的抗原结合的抗体。该抗体与抗原的亲和性及结合解离速率可由斯卡查德(Scatchard)图分析的数据测定。在一些实施方式中，Biacore动力学分析用于测定与抗原(例如RSPO3)结合的抗体或剂的结合及解离速率。在一些实施方式中，Biacore动力学分析包含分析抗体与芯片表面上经固定的抗原(例如RSPO3)的结合及解离。在一些实施方式中，Biacore动力学分析包含分析抗原(例如RSPO3)与芯片表面上经固定的抗体(例如抗RSPO3抗体)的结合及解离。
在某些实施方式中，本发明提供与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂(例如抗体)包含抗体131R002、抗体131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的1、2、3、4、5和/或6个CDR(见表1)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含131R002、131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的一个或多个CDR；131R002、131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的两个或多个CDR；131R002、131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的三或多个CDR；131R002、131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的四或多个CDR；131R002、131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的五或多个CDR；或131R002、131R003或其人源化变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011的所有六个CDR。
表1
在某些实施方式中，本发明提供与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂另包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ IDNO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ IDNO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ IDNO:83)。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ IDNO:9)的重链CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)的重链CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)的轻链CDR1，包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)的重链CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1，包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)的重链CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1，包含AAS(SEQID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQID NO:35)的重链CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1，包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1，包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，及(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQID NO:81)的轻链CDR1，包含AASNLES(SEQ ID NO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1，包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，及(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1，包含AASNLES(SEQID NO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。
在某些实施方式中，本发明提供与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体或双特异性抗体)，其中该RSPO3结合剂包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ IDNO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)、DYSIH(SEQ ID NO:78)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的重链CDR1；(b)包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)、YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的重链CDR2；(c)包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ IDNO:35)、TYFANNFD(SEQ ID NO:80)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的重链CDR3；(d)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)、KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的轻链CDR1；(e)包含AAS(SEQ ID NO:13)、AASNLES(SEQ ID NO:82)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的轻链CDR2；及(f)包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)、QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)或其包含1、2、3或4个氨基酸取代的变异体的轻链CDR3。在某些实施方式中，该氨基酸取代是保守性取代。在一些实施方式中，该取代被当作种系人源化过程的一部份。
在某些实施方式中，本发明提供与RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区与SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少约80％的序列一致性，该轻链可变区与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少80％的序列一致性。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:15具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:16具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:36具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:37具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ IDNO:44具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:45具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:17具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:72具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:86具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少约95％序列一致性的重链可变区，和/或与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ IDNO:86具有至少约95％序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:62，且该轻链可变区包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45或SEQ ID NO:62，且该轻链可变区包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62组成，且该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:62组成，且该轻链可变区由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86组成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:44，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:45，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:62，该轻链可变区包含SEQ IDNO:17。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:44组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:17组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:45组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:17组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:62组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:17组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:44组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:17组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:45组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:17组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:62组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:17组成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:44，该轻链可变区包含SEQ ID NO:72。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:45，该轻链可变区包含SEQ ID NO:72。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:62，该轻链可变区包含SEQ IDNO:72。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:44组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:72组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:45组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:72组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:62组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:72组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:44组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:72组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:45组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:72组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:62组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:72组成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:44，该轻链可变区包含SEQ ID NO:86。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:45，该轻链可变区包含SEQ ID NO:86。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:62，该轻链可变区包含SEQ IDNO:86。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:44组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:86组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:45组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:86组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区实质上由SEQ ID NO:62组成，该轻链可变区实质上由SEQ ID NO:86组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:44组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:86组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:45组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:86组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:62组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:86组成。
在某些实施方式中，本发明提供与RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69具有至少90％序列一致性的重链，和/或(b)与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ IDNO:88具有至少90％序列一致性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69具有至少95％序列一致性的重链，和/或(b)与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88具有至少95％序列一致性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQID NO:27且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:28且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:39且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:42且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ IDNO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQID NO:49且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:64且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:69且该轻链含有SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:49且该轻链含有SEQ IDNO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQID NO:64且该轻链含有SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:69且该轻链含有SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链实质上由SEQ ID NO:29组成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链由SEQ ID NO:29组成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链由SEQ ID NO:88组成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:27且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:28且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:39且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:42且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:49且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:64且该轻链含有SEQID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:69且该轻链含有SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:49且该轻链含有SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:64且该轻链含有SEQ ID NO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链和/或轻链，该重链含有SEQ ID NO:69且该轻链含有SEQ IDNO:88。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链实质上由SEQ ID NO:74组成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链由SEQ ID NO:74组成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链实质上由SEQ ID NO:88组成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69组成，且该轻链由SEQ ID NO:88组成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ ID NO:29。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:49，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:64，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:69，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:48组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:49组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ IDNO:64组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:69组成，该轻链实质上由SEQID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQID NO:48组成，该轻链由SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:49组成，该轻链由SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:64组成，该轻链由SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:69组成，该轻链由SEQ ID NO:29组成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ ID NO:74。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:49，该轻链可变区包含SEQ ID NO:74。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:64，该轻链可变区包含SEQ ID NO:74。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:69，该轻链可变区包含SEQ ID NO:74。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:48组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:49组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ IDNO:64组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:69组成，该轻链实质上由SEQID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQID NO:48组成，该轻链由SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:49组成，该轻链由SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:64组成，该轻链由SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:69组成，该轻链由SEQ ID NO:74组成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链含有SEQ ID NO:48且该轻链含有SEQ ID NO:88。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:49，该轻链可变区包含SEQ ID NO:88。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:64，该轻链可变区包含SEQ ID NO:88。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链可变区，该重链包含SEQ ID NO:69，该轻链可变区包含SEQ ID NO:88。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:48组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:49组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ IDNO:64组成，该轻链实质上由SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链实质上由SEQ ID NO:69组成，该轻链实质上由SEQID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQID NO:48组成，该轻链由SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:49组成，该轻链由SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:64组成，该轻链由SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含重链及轻链，该重链由SEQ ID NO:69组成，该轻链由SEQ ID NO:88组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含131R002抗体的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含(有或无前导序列的)131R002抗体的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R002抗体。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈嵌合抗体形式的131R002抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R002抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R002抗体的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方式中，该人源化版本的131R002是IgG1抗体。在一些实施方式中，该人源化版本的131R002是IgG2抗体。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R002、实质上由抗体131R002组成或由抗体131R002组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含131R003抗体的重链可变区及轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含131R003抗体的重链可变区，其中该源自131R003的重链可变区已经亲和性成熟。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含131R003抗体的重链可变区，其中该重链可变区相较于该亲代131R003抗体包含至少一个经修饰或改变的CDR。在一些实施方式中，该RSPO结合剂包含131R003抗体的重链可变区，其中该重链可变区相较于该亲代131R003抗体包含经修饰的CDR1。在一些实施方式中，该RSPO结合剂包含131R003抗体的重链可变区，其中该重链可变区相较于该亲代131R003抗体包含经修饰的CDR2。在一些实施方式中，该RSPO结合剂包含131R003抗体的重链可变区，其中该重链可变区相较于该亲代131R003抗体包含经修饰的CDR3。在一些实施方式中，该RSPO结合剂包含131R003抗体的重链可变区，其中该重链可变区相较于该亲代131R003抗体包含经修饰的CDR1及CDR3。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含(有或无前导序列的)131R003抗体的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R003抗体。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R003抗体的变异体，其相较于该亲代131R003抗体包含不同的重链CDR1。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R003抗体的变异体，其相较于该亲代131R003抗体包含不同的重链CDR3。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R003抗体的变异体，其相较于该亲代131R003抗体包含不同的重链CDR1及不同的重链CDR3。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈嵌合抗体形式的131R003抗体或131R003的任何变异体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R003抗体或131R003的任何变异体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R003抗体或131R003的任何变异体的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方式中，该人源化版本的131R003或131R003的变异体是IgG1抗体。在一些实施方式中，该人源化版本的131R003或131R003的变异体是IgG2抗体。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R003、实质上由抗体131R003组成或由抗体131R003组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R003的变异体、实质上由抗体131R003的变异体组成或由抗体131R003的变异体组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含131R006B抗体的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含(有或无前导序列的)131R006B抗体的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R006B抗体。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈嵌合抗体形式的131R006B抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R006B抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R006B抗体的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方式中，该人源化版本的131R006B是IgG1抗体。在一些实施方式中，该人源化版本的131R006B是IgG2抗体。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R006B、实质上由抗体131R006B组成或由抗体131R006B组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R006B的变异体、实质上由抗体131R006B的变异体组成或由抗体131R006B的变异体组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含131R005/131R007抗体的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含(有或无前导序列的)131R005/131R007抗体的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是131R005/131R007抗体。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈嵌合抗体形式的131R005/131R007抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R005/131R007抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈人源化抗体形式的131R005/131R007抗体的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方式中，该人源化版本的131R005/131R007是IgG1抗体。在一些实施方式中，该人源化版本的131R005/131R007是IgG2抗体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是131R008。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R005/131R007、实质上由抗体131R005/131R007组成或由抗体131R005/131R007组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R005/131R007的变异体、实质上由抗体131R005/131R007的变异体组成或由抗体131R005/131R007的变异体组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R008、实质上由抗体131R008组成或由抗体131R008组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R008的变异体、实质上由抗体131R008的变异体组成或由抗体131R008的变异体组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含h131R010或h131R011抗体的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含(有或无前导序列的)h131R010或131R011抗体的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是h131R010抗体。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是h131R011抗体。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈嵌合抗体形式的h131R010或h131R011抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含h131R010或h131R011抗体的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是h131R011。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由寄存于美国菌种保存中心(ATCC)的质粒PTA-120420所编码的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由寄存于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由寄存于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链可变区，及由寄存于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由寄存于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由寄存于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由寄存于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链，及由寄存于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体h131R010、实质上由抗体h131R010组成或由抗体h131R010组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体h131R010的变异体、实质上由抗体h131R010的变异体组成或由抗体h131R010的变异体组成。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体h131R011、实质上由抗体h131R011组成或由抗体h131R011组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体h131R011的变异体、实质上由抗体h131R011的变异体组成或由抗体h131R011的变异体组成。
在某些实施方式中，本发明提供其作为双特异性抗体的RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点及与第二靶标结合的第二抗原结合位点。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含：与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ IDNO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQID NO:80)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)且该重链CDR3包含ATYFANNFDY(SEQ IDNO:35)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)，该重链CDR3包含ATYFANNFDY(SEQ IDNO:35)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)，该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ IDNO:11)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO:80)，该重链CDR2包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)且该重链CDR3包含TYFANNFD(SEQID NO:80)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO:80)或KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)且该重链CDR3包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2，及包含ATYFANYFDY(SEQID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，及第二抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点及该第二抗原结合位点包含共同(相同)轻链。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少约80％的序列一致性的第一重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的第一重链可变区。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:72或SEQ ID NO:86具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:44。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:45。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:62。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一轻链可变区的双特异性抗体，该第一轻链可变区包含SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一轻链可变区的双特异性抗体，该第一轻链可变区包含SEQ ID NO:72。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一轻链可变区的双特异性抗体，该第一轻链可变区包含SEQ ID NO:86。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区及第一重链恒定区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62，且该第一重链恒定区包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区及第一重链恒定区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:44，且该第一重链恒定区包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区及第一重链恒定区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:45，且该第一重链恒定区包含SEQ IDNO:60或SEQ ID NO:61。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是包含第一重链可变区及第一重链恒定区的双特异性抗体，该第一重链可变区包含SEQ ID NO:62，且该第一重链恒定区包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与人RSPO3及第二靶标特异性结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与人RSPO3及第二人RSPO特异性结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与人RSPO3及选自RSPO1、RSPO2或RSPO4的第二人RSPO特异性结合的双特异性抗体。抗人RSPO的抗体的非限制性实例已于例如国际专利公开号WO 2013/012747描述。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与人RSPO3及人RSPO1特异性结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：a)与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，及b)与人RSPO1特异性结合的第二抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)，且其中该第一及第二抗原结合位点皆包含共同轻链。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与人RSPO3及人RSPO2特异性结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：a)与人RSPO3特异性结合的第一抗原结合位点，及b)与人RSPO2特异性结合的第二抗原结合位点，其中该第一抗原结合位点包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)，且其中该第一及第二抗原结合位点皆包含共同轻链。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含源自抗RSPO3抗体131R003的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含源自抗RSPO3抗体131R003的变异体的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含源自抗RSPO3抗体131R006B的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含源自抗RSPO3抗体h131R005/131R007的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含源自抗RSPO3抗体h131R010或h131R011的重链可变区。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含第一CH3结构域及第二CH3结构域，该第一CH3结构域及第二CH3结构域各自经修饰以促进异多聚体的形成。在一些实施方式中，该第一及第二CH3结构域是利用突点对应孔洞技术加以修饰。在一些实施方式中，该第一及第二CH3结构域包含氨基酸的改变，该氨基酸的改变导致不同的静电相互作用。在一些实施方式中，该第一及第二CH3结构域包含氨基酸的改变，该氨基酸的改变导致不同的疏水性/亲水性相互作用。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含选自下列的重链恒定区：(a)第一人IgG1恒定区，其中对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置253及292的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代，及第二人IgG1恒定区，其中对应IgG1(SEQ IDNO:56)的位置240及282的氨基酸经赖氨酸取代；(b)第一人IgG2恒定区，其中对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置249及288的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代，及第二人IgG2恒定区，其中对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置236及278的氨基酸经赖氨酸取代；(c)第一人IgG3恒定区，其中对应IgG3(SEQ ID NO:58)的位置300及339的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代，及第二人IgG3恒定区，其中对应IgG3(SEQ ID NO:58)的位置287及329的氨基酸经赖氨酸取代；及(d)第一人IgG4恒定区，其中对应IgG4(SEQ ID NO:59)的位置250及289的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代，及第二IgG4恒定区，其中对应IgG4(SEQ ID NO:59)的位置237及279的氨基酸经赖氨酸取代。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG1(SEQID NO:56)的位置253及292的位置具有氨基酸取代的第一人IgG1恒定区(其中对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置253及292的位置的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代)，及在对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置240及282的位置具有氨基酸取代的第二人IgG1恒定区(其中对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置240及282的位置的氨基酸经赖氨酸取代)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置249及288的位置具有氨基酸取代的第一人IgG2恒定区(其中对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置249及288的位置的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代)，及在对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置236及278的位置具有氨基酸取代的第二人IgG2恒定区(其中对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置236及278的位置的氨基酸经赖氨酸取代)。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG3(SEQ ID NO:58)的位置300及339的位置具有氨基酸取代的第一人IgG3恒定区(其中对应IgG3(SEQ ID NO:58)的位置300及339的位置的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代)，及在对应IgG3(SEQ ID NO:58)的位置287及329的位置具有氨基酸取代的第二人IgG3恒定区(其中对应IgG3(SEQ ID NO:58)的位置287及329的位置的氨基酸经赖氨酸取代)。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG4(SEQ ID NO:59)的位置250及289的位置具有氨基酸取代的第一人IgG4恒定区(其中对应IgG4(SEQ ID NO:59)的位置250及289的位置的氨基酸经谷氨酸或天冬氨酸取代)，及在对应IgG4(SEQ ID NO:59)的位置237及279的位置具有氨基酸取代的第二人IgG4恒定区(其中对应IgG4(SEQ ID NO:59)的位置237及279的位置的氨基酸经赖氨酸取代)。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG1(SEQID NO:56)的位置253及292的位置具有氨基酸取代的第一人IgG1恒定区(其中该氨基酸经谷氨酸取代)，及在对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置240及282的位置具有氨基酸取代的第二人IgG1恒定区(其中该氨基酸经赖氨酸取代)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置253及292的位置具有氨基酸取代的第一人IgG1恒定区(其中该氨基酸经天冬氨酸取代)，及在对应IgG1(SEQ ID NO:56)的位置240及282的位置具有氨基酸取代的第二人IgG1恒定区(其中该氨基酸经赖氨酸取代)。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG2(SEQID NO:57)的位置249及288的位置具有氨基酸取代的第一人IgG2恒定区(其中该氨基酸经谷氨酸取代)，及在对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置236及278的位置具有氨基酸取代的第二人IgG2恒定区(其中该氨基酸经赖氨酸取代)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含在对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置249及288的位置具有氨基酸取代的第一人IgG2恒定区(其中该氨基酸经天冬氨酸取代)，及在对应IgG2(SEQ ID NO:57)的位置236及278的位置具有氨基酸取代的第二人IgG2恒定区(其中该氨基酸经赖氨酸取代)。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:60的重链恒定区。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是双特异性抗体，其包含SEQ IDNO:61的重链恒定区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:60的第一重链恒定区及SEQ ID NO:61的第二重链恒定区。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其以约50nM或更低、约25nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低、或约0.1nM或更低的KD与RSPO3结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其以约50nM或更低、约25nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低、或约0.1nM或更低的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其以约50nM或更低的KD与RSPO3结合，且以约50nM或更低的KD与第二靶标(如RSPO2结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其以约25nM或更低的KD与RSPO3结合，且以约25nM或更低的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其以约10nM或更低的KD与RSPO3结合，且以约10nM或更低的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其以约1nM或更低的KD与RSPO3结合，且以约1nM或更低的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是双特异性抗体，其包含一个结合亲和性相较于第二抗原结合位点的结合亲和性为弱的抗原结合位点。举例来说，在一些实施方式中，该双特异性抗体可能以约0.1nM至1nM的KD与RSPO3结合，且可能以约1nM至10nM的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。或者，该双特异性抗体可能以约1nM至10nM的KD与RSPO3结合，且可能以约0.1nM至1nM的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。在一些实施方式中，该双特异性抗体可能以约0.1nM至1nM的KD与RSPO3结合，且可能以约1nM至10nM的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。或者，该双特异性抗体可能以约1nM至10nM的KD与RSPO3结合，且可能以约0.1nM至1nM的KD与第二靶标(如RSPO2)结合。在一些实施方式中，该两个抗原结合位点之间的亲和性差异可能为大约2倍或2倍以上、大约3倍或3倍以上、大约5倍或5倍以上、大约8倍或8倍以上、大约10倍或10倍以上、大约15倍或15倍以上、大约30倍或30倍以上、大约50倍或50倍以上或大约100倍或100倍以上。在一些实施方式中，该RSPO3抗原结合位点的至少一个CDR中的至少一个氨基酸残基经不同的氨基酸取代，以使该RSPO3结合位点的亲和性改变。在一些实施方式中，该RSPO3结合位点的亲和性增加。在一些实施方式中，该RSPO3结合位点的亲和性减少。在一些实施方式中，该第二靶标(如RSPO2)的抗原结合位点的至少一个CDR中的至少一个氨基酸残基经不同的氨基酸取代，以使该第二抗原结合位点的亲和性改变。在一些实施方式中，该第二抗原结合位点的亲和性增加。在一些实施方式中，该第二抗原结合位点的亲和性减少。在一些实施方式中，该RSPO3及该第二抗原结合位点的亲和性皆经改变。
本发明提供与人RSPO蛋白特异性结合的多肽，包括但不限于抗体。在一些实施方式中，该多肽与人RSPO3结合。在一些实施方式中，该多肽与人RSPO3及选自RSPO1、RSPO2或RSPO4的至少一种其它人RSPO结合。
在某些实施方式中，该多肽包含抗体131R002、131R003或131R003的变异体包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R010及h131R011的一、二、三、四、五和/或六个CDR(见本文表1)。在一些实施方式中，该多肽包含每个CDR最多有四个(即0、1、2、3或4个)氨基酸取代的CDR。在某些实施方式中，该重链CDR被包含于重链可变区内。在某些实施方式中，该轻链CDR被包含于轻链可变区内。
在一些实施方式中，本发明提供与人RSPO3特异性结合的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQID NO:86具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:62具有至少约95％的序列一致性的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:72或SEQ ID NO:86具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供与人RSPO3特异性结合的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:68具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:87具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:63或SEQ ID NO:68具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:87具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:68具有至少约95％的序列一致性的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:87具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:63或SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:63或SEQ ID NO:68，和/或SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:87组成。
在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ IDNO:69的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69组成的氨基酸序列，和/或实质上由SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:48组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ IDNO:29组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:49组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ ID NO:29组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:64组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ IDNO:29组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:69组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ ID NO:29组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:48组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ IDNO:74组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:49组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ ID NO:74组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:64组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ IDNO:74组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:69组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ ID NO:74组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:48组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ IDNO:88组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:49组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ ID NO:88组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:64组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ IDNO:88组成的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含实质上由SEQ ID NO:69组成的氨基酸序列和/或实质上由SEQ ID NO:88组成的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供与人RSPO3特异性结合的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:69具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69具有至少约95％的序列一致性的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:64或SEQ ID NO:69的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:27和/或SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ IDNO:28和/或SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:48和/或SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:29组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:64和/或SEQID NO:29组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:69和/或SEQ IDNO:29组成。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和/或包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:27和/或SEQID NO:74组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:28和/或SEQ IDNO:74组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:48和/或SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:64和/或SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:74组成。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQID NO:64的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:48和/或SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:49和/或SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:64和/或SEQ ID NO:88组成。在某些实施方式中，该多肽实质上由SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:88组成。
在一些实施方式中，RSPO3结合剂包含多肽，该多肽包含选自下列的序列：SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88。
许多蛋白(包括抗体)包含引导该蛋白运输至各处的信号序列。信号序列(又称信号肽或前导序列)位于新生多肽的N端。它们引导该多肽至内质网且该蛋白被分类至其应该去的地方，例如胞器的内部空间、细胞内部的膜、细胞的外膜或经分泌至细胞外部。大部分信号序列在蛋白被运送至内质网后，通过信号肽酶与该蛋白切割。自该多肽切割该信号序列通常发生于氨基酸序列的特定位点，且取决于该信号序列内的氨基酸残基。虽然通常有一个特定的切割位点，但信号肽酶可能识别和/或使用一个以上的切割位点，导致该多肽不相同的N端。举例来说，使用信号序列内的不同的切割位点可导致具有不同N端氨基酸的多肽的表达。因此，在一些实施方式中，本文所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些实施方式中，该N端的长度相差1、2、3、4、5个氨基酸。在一些实施方式中，该多肽为实质上相同，即该多肽具有相同的N端。在一些实施方式中，该多肽的信号序列相较于“天然”或“亲代”信号序列包含一个或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)氨基酸取代和/或删除。在一些实施方式中，该多肽的信号序列包含让一个切割位点变成主要切割位点的氨基酸取代和/或删除，由此导致具有一种N端的实质上相同的多肽。在一些实施方式中，该多肽的信号序列影响该多肽的表达程度，例如增加表达或减少表达。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62的重链可变区，及包含SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ IDNO:44的重链可变区，及包含SEQ ID NO:17的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:45的重链可变区，及包含SEQ ID NO:17的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:62的重链可变区，及包含SEQ ID NO:17的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:44的重链可变区，及包含SEQ ID NO:72的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:45的重链可变区，及包含SEQ ID NO:72的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:62的重链可变区，及包含SEQ ID NO:72的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:44的重链可变区，及包含SEQ ID NO:86的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:45的重链可变区，及包含SEQ ID NO:86的轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:62的重链可变区，及包含SEQ ID NO:86的轻链可变区。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69的重链，及包含SEQID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:48的重链及包含SEQ ID NO:29的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:49的重链及包含SEQ ID NO:29的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:64的重链及包含SEQ IDNO:29的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:69的重链及包含SEQ ID NO:29的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:48的重链及包含SEQ ID NO:74的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:49的重链及包含SEQ ID NO:74的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQID NO:64的重链及包含SEQ ID NO:74的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:69的重链及包含SEQ ID NO:74的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:48的重链及包含SEQID NO:88的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:49的重链及包含SEQ ID NO:88的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:64的重链及包含SEQ ID NO:88的轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与抗体竞争与RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:69的重链及包含SEQ ID NO:88的轻链。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体131R002或抗体131R003竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体131R003的变异体竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体131R003的人源化版本竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体h131R005/131R007竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体h131R008竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体h131R006A或抗体h131R006B竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体h131R010竞争与人RSPO3的特异性结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂与抗体h131R011竞争与人RSPO3的特异性结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂或抗体于体外竞争性结合测定中竞争与RSPO3的特异性结合。在一些实施方式中，该RSPO3是人RSPO3。在一些实施方式中，该RSPO3是小鼠RSPO3。
在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由本发明的抗体所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体131R002或抗体131R003所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体131R003的变异体所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体131R003的人源化版本所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体h131R006A或抗体h131R006B所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体h131R005/131R007所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体h131R008所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体h131R010所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在某些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)与RSPO3上由抗体h131R011所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。
在另一实施方式中，RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由本发明的抗体所结合的RSPO3上的表位重叠。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体131R002或抗体131R003所结合的RSPO3上的表位重叠。在另一实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体131R003的变异体所结合的RSPO3上的表位重叠。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体131R003的人源化版本所结合的RSPO3上的表位重叠。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体h131R006A或抗体h131R006B所结合的RSPO3上的表位重叠。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体h131R005/131R007所结合的RSPO3上的表位重叠。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体h131R008所结合的RSPO3上的表位重叠。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体h131R010所结合的RSPO3上的表位重叠。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该表位与由抗体h131R011所结合的RSPO3上的表位重叠。
在某些实施方式中，本文所描述的RSPO结合剂(例如抗体)与至少一种人RSPO蛋白结合且调节RSPO活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO拮抗剂且降低RSPO活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO拮抗剂且降低β-连环蛋白活性。
在某些实施方式中，本文所描述的RSPO3结合剂(例如抗体)与人RSPO3结合且调节RSPO3活性。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是RSPO3拮抗剂且降低RSPO3活性。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是RSPO3拮抗剂且降低β-连环蛋白活性。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)是至少一种人RSPO蛋白的拮抗剂。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是至少一种RSPO的拮抗剂且抑制RSPO活性。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的RSPO活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制一、二、三或四种RSPO蛋白的活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂抑制RSPO3活性。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在某些实施方式中，抑制人RSPO3活性的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)是至少一种人RSPO蛋白的拮抗剂。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的RSPO信号传导。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制一、二、三或四种RSPO蛋白的信号传导。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的信号传导。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂抑制人RSPO3信号传导。在某些实施方式中，抑制RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制人RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在某些实施方式中，抑制人RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在某些实施方式中，抑制人RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在某些实施方式中，抑制人RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在某些实施方式中，抑制人RSPO3信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)是β-连环蛋白信号传导的拮抗剂。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的β-连环蛋白信号传导。在一些实施方式中，该抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂抑制β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)抑制至少一种RSPO蛋白与受体的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制人RSPO蛋白与其一种或多种受体的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制RSPO蛋白与至少一种LGR蛋白的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制RSPO蛋白与LGR4、LGR5和/或LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂抑制RSPO3与LGR4的结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂抑制RSPO3与LGR5的结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂抑制RSPO3与LGR6的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂与至少一种LGR蛋白的结合经抑制至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，抑制至少一种RSPO与至少一种LGR蛋白结合的RSPO结合剂另抑制β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在某些实施方式中，抑制人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)阻断至少一种RSPO与受体的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂阻断人RSPO蛋白与其一种或多种受体的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂阻断RSPO与至少一种LGR蛋白的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂阻断至少一种RSPO蛋白与LGR4、LGR5和/或LGR6的结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂阻断RSPO3与LGR4的结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂阻断RSPO3与LGR5的结合。在一些实施方式中，RSPO3结合剂阻断RSPO3与LGR6的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂与至少一种LGR蛋白的结合经阻断至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，阻断至少一种RSPO蛋白与至少一种LGR蛋白结合的RSPO结合剂另抑制β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在某些实施方式中，阻断人RSPO3与至少一种LGR蛋白结合的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)抑制β-连环蛋白信号传导。应了解的是，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO结合剂在某些实施方式中可能抑制β-连环蛋白信号传导途径中通过一种或多种受体的信号传导，但不一定抑制通过所有受体的信号传导。在某些选择性实施方式中，通过所有人受体的β-连环蛋白信号传导可能皆被抑制。在某些实施方式中，通过选自LGR4、LGR5及LGR6的一种或多种受体的β-连环蛋白信号传导经抑制。在某些实施方式中，该RSPO结合剂对β-连环蛋白信号传导的抑制是指减少β-连环蛋白信号传导量至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体)抑制β-连环蛋白的活化。应了解的是，抑制β-连环蛋白的活化的RSPO结合剂在某些实施方式中可能抑制通过一种或多种受体的β-连环蛋白的活化，但不一定抑制通过所有受体的β-连环蛋白的活化。在某些选择性实施方式中，通过所有人受体的β-连环蛋白活化可能皆被抑制。在某些实施方式中，通过选自LGR4、LGR5及LGR6的一种或多种受体的β-连环蛋白活化经抑制。在某些实施方式中，该RSPO结合剂对β-连环蛋白活化的抑制是指减少β-连环蛋白活化量至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或131R003的变异体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的RSPO3结合剂是抗体h131R011。
用于测定RSPO结合剂(或候选RSPO结合剂)是否抑制β-连环蛋白信号传导的体内及体外测定是该领域所知。举例来说，可使用以细胞为基底的荧光素酶报告试验测量体外的β-连环蛋白信号传导水平，其利用含有多份TCF结合结构域与下游萤火虫荧光素酶报告基因的TCF/Luc报告载体(Gazit等，1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在一种或多种Wnt(例如由转染细胞表达或由Wnt条件培养基提供的Wnt)存在且有或没有RSPO蛋白或RSPO条件培养基下，RSPO结合剂存在时的β-连环蛋白信号传导水平是与无RSPO结合剂存在时的信号传导水平比较。除了TCF/Luc报告子测定的外，RSPO结合剂(或候选剂)对β-连环蛋白信号传导的影响可于体外或活体内通过测量该试剂对β-连环蛋白调节基因表达水平的影响加以测定，如c-myc(He等，1998,Science,281:1509-12)、细胞周期素D1(Tetsu等，1999,Nature,398:422-6)和/或纤维粘连蛋白(Gradl等，1999,Mol.Cell Biol.,19:5576-87)。在某些实施方式中，RSPO结合剂对β-连环蛋白信号传导的影响也可能通过测量该试剂对Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-连环蛋白的磷酸化状态的影响检测。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂具有一种或多种下列影响：抑制肿瘤细胞增生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性、通过减少肿瘤中癌干细胞的频率减少肿瘤的致瘤性、抑制肿瘤生长、刺激肿瘤细胞的细胞死亡、诱导肿瘤中的细胞分化、使致癌细胞分化成非致癌状态、诱导肿瘤细胞分化标记物的表达、防止肿瘤细胞转移、减少肿瘤细胞的存活或调节血管生成。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂可抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂可抑制活体内(例如异种移植小鼠模型和/或于罹患癌的人体内)的肿瘤生长。在某些实施方式中，相较于未经治疗的肿瘤，肿瘤生长经抑制至少约二倍、约三倍、约五倍、约十倍、约50倍、约100倍、或约1000倍。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂可减少肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体可于动物模型诸如小鼠异种移植模型中减少包含癌干细胞的肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体可通过减少肿瘤中癌干细胞的数量或频率以减少肿瘤的致瘤性。在某些实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少至少约二倍、约三倍、约五倍、约十倍、约50倍、约100倍、或约1000倍。在某些实施方式中，癌干细胞的数量或频率减少是通过使用动物模型的限制稀释试验测定。有关使用限制稀释试验以测定肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少的其它实例及指南可见例如国际公开号WO 2008/042236、美国专利公开号2008/0064049及美国专利公开号2008/0178305。
在某些实施方式中，本文描述的RSPO3结合剂于小鼠、长尾猕猴(cynomolgusmonkey)或人体内具有至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂系于小鼠、长尾猕猴或人体内具有至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期的IgG(例如IgG1或IgG2)抗体。增加(或减少)剂诸如多肽及抗体的半衰期的方法是该领域所知。举例来说，增加IgG抗体循环半衰期的已知方法包括导入突变至Fc区，此增加pH 6.0时抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合(见例如美国专利公开号2005/0276799、2007/0148164及2007/0122403)。增加缺乏Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括像是PEG化的技术。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是多株抗体。多株抗体可利用任何已知的方法制备。在一些实施方式中，多株抗体是通过以感兴趣的抗原(例如经纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白)通过多重皮下或腹腔内注射的方式免疫动物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驴)产生。该抗原可任意选择地与载剂共轭，诸如钥孔状帽贝血蓝素(KLH)或血清白蛋白。该抗原(不论有无载剂蛋白质)经无菌盐水稀释，且通常与佐剂(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐剂)组合以形成稳定乳液。在经过足够时间后，自经免疫的动物(通常是血液或腹水中)回收多株抗体。该多株抗体可根据该领域的标准方法自血清或腹水纯化，该方法包括但不限于亲和性层析、离子交换层析、胶体电泳及透析。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是单克隆抗体。单克隆抗体可利用本领域技术人员已知的杂交瘤方法制备(见例如Kohler and Milstein,1975,Nature,256:495-497)。在一些实施方式中，使用杂交瘤方法将小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物经上述方法免疫，以诱发产生与该免疫抗原特异性结合的抗体的淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞可于体外免疫。在一些实施方式中，该免疫抗原可为人蛋白质或其部分。在一些实施方式中，该免疫抗原可为小鼠蛋白质或其部分。
在免疫后，淋巴细胞经分离，然后利用例如聚乙二醇与适当的骨髓瘤细胞系融合。该杂交瘤细胞系利用该领域已知的特殊培养基筛选，未融合的淋巴细胞及骨髓瘤细胞在筛选后不会存活。产生特异性拮抗选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤可利用多种方法识别，该方法包括但不限于免疫沉淀、免疫转渍及体外结合试验(例如流式细胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫测定)。该杂交瘤可利用标准方法于体外增殖(J.W.Goding,1996,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,3rd Edition,Academic Press,SanDiego,CA)，或于动物活体内以腹水肿瘤方式增殖。该单克隆抗体可根据该领域的标准方法自培养基或腹水液体纯化，该方法包括但不限于亲和性层析、离子交换层析、胶体电泳及透析。
在某些实施方式中，单克隆抗体可利用本领域技术人员已知的重组DNA技术制备。编码单克隆抗体的多核苷酸自成熟B细胞或杂交瘤细胞分离，像是通过RT-PCR使用寡核苷酸引子以特异性扩增编码该抗体的重链及轻链的基因，该多核苷酸的序列利用标准技术测定。该经分离的编码重链及轻链的多核苷酸接着被选殖至适当表达载体，该载体在转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞后产生单克隆抗体。
在某些其它实施方式中，重组单克隆抗体或其片段可自表达所需物种的可变结构域或CDR的噬菌体展示库分离(见例如McCafferty等，1990,Nature,348:552-554、Clackson等，1991,Nature,352:624-628及Marks等，1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
编码单克隆抗体的多核苷酸可通过例如使用重组DNA技术修饰以产生可供选择的抗体。在一些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链及重链的恒定结构域可被例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或以非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施方式中，该恒定区是经截短或移除以产生所需的单克隆抗体的抗体片段。可变区的定点或高密度突变形成可被用于最佳化单克隆抗体的特异性、亲和性等。
在一些实施方式中，拮抗人RSPO3的单克隆抗体是人源化抗体。通常，人源化抗体是其中源自CDR的残基经源自具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的CDR的残基取代的人免疫球蛋白，该取代是利用本领域技术人员已知的方法进行。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv架构区残基是由具有所需特异性、亲和性及/或结合能力的非人物种的抗体的对应残基取代。在一些实施方式中，人源化抗体可进一步通过取代Fv架构区和/或该经取代的非人残基内的额外残基加以修饰，以精进优化抗体特异性、亲和性和/或能力。通常，人源化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两或三个可变结构域，该可变结构域包含所有或实质上所有的对应该非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或实质上所有的架构区是具有人免疫球蛋白共同序列的架构区。在一些实施方式中，人源化抗体也可包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该部分。在某些实施方式中，该人源化抗体用于治疗用途，因为当施用至人受试对象时它们可能减少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗体)反应。本领域技术人员将能遵循已知技术获得具有减少免疫原性的功能性人源化抗体(见例如美国专利第5,225,539、5,585,089、5,693,761及5,693,762号)。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是人抗体。人抗体可利用该领域已知的多种技术直接制备。在一些实施方式中，人抗体可自体外免疫的永生化人B淋巴细胞产生或自经免疫的个体分离的淋巴细胞产生。不论何种情况，产生直接拮抗靶标抗原的抗体的细胞可被制造及分离(见例如Cole等，1985,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77；Boemer等，1991,J.Immunol.,147:86-95；及美国专利第5,750,373、5,567,610及5,229,275号)。在一些实施方式中，该人抗体可选自噬菌体分子库，其中该噬菌体分子库表达人抗体(Vaughan等，1996,NatureBiotechnology,14:309-314；Sheets等，1998,PNAS,95:6157-6162；Hoogenboom andWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等，1991,J.Mol.Biol.,222:581)。或者，噬菌体展示技术可被用来自未经免疫接种的供体的免疫球蛋白可变区结构域基因库体外产生人抗体及抗体片段。产生及使用抗体噬菌体库的技术也描述于美国专利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484及7,264,963号，及Rothe等，2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200。一旦抗体经识别，该领域已知的亲和性成熟策略包括但不限于链改组(chain shuffling)(Marks等，1992,Bio/Technology,10:779-783)及定点突变形成可被用于产生高亲和性人抗体。
在一些实施方式中，人抗体可于包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备。经免疫后，这些小鼠可产生整套人抗体而不产生内源性免疫球蛋白。此方法于美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016号中描述。
本发明也包含特异性识别至少一种人RSPO蛋白的双特异性抗体。双特异性抗体可特异性辨识及结合至少两种不同抗原或表位。该不同的表位可位于相同分子内(例如两个表位位于人RSPO3上)或位于不同分子上(例如一表位位于RSPO3上，一表位位于RSPO2上)。在一些实施方式中，双特异性抗体相较于个别抗体或超过一种抗体的组合具有增强的效力。在一些实施方式中，双特异性抗体相较于个别抗体或超过一种抗体的组合具有减少的毒性。本领域技术人员已知的是任何结合剂(例如抗体)可能具有独特的药物动力学(PK)(例如循环半衰期)。在一些实施方式中，双特异性抗体具有同步两种活性结合剂的PK的能力，其中该两种个别结合剂具有不同PK特性。在一些实施方式中，双特异性抗体具有集中两种结合剂(例如抗体)的作用于相同区域(例如肿瘤和/或肿瘤微环境)的能力。在一些实施方式中，双特异性抗体具有集中两种结合剂(例如抗体)的作用于相同靶标(例如肿瘤和/或肿瘤细胞)的能力。在一些实施方式中，双特异性抗体具有使两种结合剂(例如抗体)的作用以超过一种生物途径或功能为靶标的能力。
在某些实施方式中，该双特异性抗体与RSPO3及第二靶标特异性结合。在某些实施方式中，该双特异性抗体与RSPO3及第二人RSPO(例如RSPO1、RSPO2或RSPO4)特异性结合。在某些实施方式中，该双特异性抗体与RSPO3及RSPO2特异性结合。在一些实施方式中，该双特异性抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体是人抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体是IgG1抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体是IgG2抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体具有减少的毒性和/或不良反应。在一些实施方式中，该双特异性抗体相较于两种个别抗体的混合物或作为单一试剂的抗体具有减少的毒性和/或不良反应。在一些实施方式中，该双特异性抗体具有增加的治疗指数。在一些实施方式中，该双特异性抗体相较于两种个别抗体的混合物或作为单一试剂的抗体具有增加的治疗指数。
在一些实施方式中，该抗体可特异性辨识及结合第一抗原靶标(例如RSPO3)及第二抗原靶标，像是在淋巴细胞上的效应分子(例如CD2、CD3、CD28、CTLA-4、CD80或CD86)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)以使细胞性防御机制集中于表达和/或产生第一抗原靶标的细胞。在一些实施方式中，该抗体可被用于引导细胞毒性剂至表达特定靶标抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂及与细胞毒性剂或放射性核种螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA结合的臂。
用于制备双特异性抗体的技术是本领域技术人员所知，见例如Millstein等，1983,Nature,305:537-539；Brennan等，1985,Science,229:81；Suresh等，1986,Methods inEnzymol.,121:120；Traunecker等，1991,EMBO J.,10:3655-3659；Shalaby等，1992,J.Exp.Med.,175:217-225；Kostelny等，1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruber等，1994,J.Immunol.,152:5368；美国专利第5,731,168号；国际公开号WO 2009/089004及美国专利公开号2011/0123532。在一些实施方式中，该双特异性抗体包含在两个重链之间的接口部分具有氨基酸修饰的重链恒定区。在一些实施方式中，该双特异性抗体可利用“突点对应孔洞”策略产生(见例如美国专利第5,731,168号；Ridgway等，1996,Prot.Engin.,9:617-621)。有时候，“突点”及“孔洞”的用语是以“隆突”及“空腔”取代。在一些实施方式中，该双特异性抗体可能包含无法在重链之间形成双硫键接的变异绞链区(见例如WO 2006/028936)。在一些实施方式中，该修饰可能包含氨基酸的改变，该氨基酸的改变导致不同的静电相互作用。在一些实施方式中，该修饰可能包含氨基酸的改变，该氨基酸的改变导致不同的疏水性/亲水性相互作用。
双特异性抗体可为完整抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。本发明也考虑超过两价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等，1991,J.Immunol.,147:60)。因此，在某些实施方式中，拮抗RSPO3的抗体是多特异性。
在某些实施方式中，本文描述的抗体(或其它多肽)可为单特异性。在某些实施方式中，抗体所包含的一个或多个抗原结合位点的各者是能结合RSPO蛋白上的同源性表位。在某些实施方式中，本文所述的单特异性抗体的抗原结合位点能结合例如RSPO3及RSPO2(即在RSPO3及RSPO2蛋白上皆能发现的相同表位)。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力，例如抗体片段可具有增加的肿瘤穿透。已知用于产生抗体片段的各种技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。在一些实施方式中，抗体片段包括由胃蛋白酶消化抗体分子所产生的F(ab')2片段。在一些实施方式中，抗体片段包括通过减少F(ab')2片段的双硫键所产生的Fab片段。在其它实施方式中，抗体片段包括通过以木瓜酶及还原剂处理抗体分子所产生的Fab片段。在某些实施方式中，抗体片段经重组产生。在一些实施方式中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗体片段可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达及分泌，允许大量产生这些片段。在一些实施方式中，抗体片段自如本文讨论的抗体噬菌体库分离。举例来说，可利用方法建构Fab表达库(Huse等，1989,Science,246:1275-1281)以允许快速有效地识别对RSPO蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单株Fab片段。在一些实施方式中，抗体片段是线性抗体片段。在某些实施方式中，抗体片段是单特异性或双特异性。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是scFv。各种技术可被用于产生对一种或多种人RSPO具有特异性的单链抗体(见例如美国专利第4,946,778号)。
另外，尤其以抗体片段来说所需的是，修饰抗体以改变(例如增加或减少)其血清半衰期。此可通过例如使抗体片段中的适当区域发生突变以纳入救援受体结合表位至抗体片段中达成，或通过将该表位纳入肽标签中然后使该肽标签与抗体片段的末端或中间融合(例如通过DNA或肽合成)达成。
异源共轭抗体也属于本发明的范围内。异源共轭抗体是由两个共价连接的抗体组成。该抗体被计划用于例如使免疫细胞以非所需的细胞为靶标(见例如美国专利第4,676,980号)。也考虑到该异源共轭抗体可利用已知的合成蛋白质化学方法于体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。举例来说，免疫毒素可利用双硫交换反应或通过形成硫醚键加以建构。为达此目的的适当试剂实例包括亚胺基硫醇盐及甲基-4-巯基丁亚氨酸酯。
就本发明的目的而言，应了解的是经修饰的抗体可包含任何类型的提供该抗体与靶标(即人RSPO3)连接的可变区。在这方面，该可变区可包含或衍生自任何种类的可被诱导以启动体液性反应及产生拮抗该所需抗原的免疫球蛋白的哺乳动物。因此，该经修饰的抗体的可变区可为例如人、小鼠、非人灵长动物(例如长尾猕猴(cynomolgusmonkey)、猕猴等)或兔来源。在一些实施方式中，该经修饰的免疫球蛋白的可变区及恒定区皆为人来源。在其它实施方式中，兼容性抗体的可变区(通常源自非人来源)可经工程化或特别修饰以促进该分子的结合特性或减少免疫原性。在这方面，可用于本发明的可变区可经人源化或通过纳入输入氨基酸序列以另行改变。
在某些实施方式中，重链及轻链的可变结构域是通过至少部分取代一个或多个CDR及(若需要的话)部分取代架构区及序列修饰和/或改变加以改变。虽然CDR可能源自与架构区来源的抗体相同类型或甚至相同亚型的抗体，一般设想CDR可能源自不同类型的抗体且通常源自不同物种的抗体。要转移一可变结构域的抗原结合能力至另一可变结构域不一定需要将所有CDR取代成供体可变区的所有CDR。相反地，可能只需要转移那些维持抗原结合位点的活性所需的残基即可。
尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将了解，本发明的经修饰的抗体将包含其中至少部分的一个或多个恒定结构域已被删除或以其它方式改变的抗体(例如全长抗体或其免疫反应性片段)以提供所需的生化特征，像是相较于包含原始或未经改变的恒定区的大约相同免疫原性的抗体具有增加的肿瘤定位或增加的血清半衰期。在一些实施方式中，该经修饰的抗体的恒定区将包含人恒定区。与本发明兼容的恒定区修饰包含添加、删除或取代一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸。本文所揭示的经修饰的抗体可能包含对三个重链恒定结构域的一或多者(CH1、CH2或CH3)和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施方式中，一个或多个结构域自该经修饰的抗体的恒定区部分或全部删除。在一些实施方式中，该经修饰的抗体将包含其中整个CH2结构域被移除的结构域删除构建体或变异体(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，所缺少的恒定区结构域由短氨基酸间隔子(例如10个氨基酸残基)取代，以提供通常由该缺少恒定区授予的一些分子柔韧性。
在一些实施方式中，该经修饰的抗体经工程化以直接融合CH3结构域与该抗体的绞链区。在其它实施方式中，肽间隔子被插入绞链区与经修饰的CH2和/或CH3结构域之间。举例来说，其中CH2结构域被删除且剩余的CH3结构域(经修饰或未经修饰)是以5至20个氨基酸间隔子与绞链区连接的构建体可被表达。该间隔子可被添加以确保恒定区的调节组件维持自由及可接近，或该绞链区维持可弯折。然而，应注意氨基酸间隔子在一些情况中可能证实具有免疫原性，且诱发拮抗该构建体的非所需免疫反应。因此，在某些实施方式中，任何添加至构建体的间隔子将为相对非免疫原性，以维持该经修饰的抗体的所需生物性质。
在一些实施方式中，该经修饰的抗体可能仅具有部分构建体结构域删除或取代少数或甚至单一个氨基酸。举例来说，在CH2结构域的选择区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上减少Fc结合，因此增加癌细胞定位和/或肿瘤穿透。类似地，可能可行的是单纯删除该一个或多个恒定区结构域中控制所需调节的特定效应功能(例如补体C1q结合)的部分。该恒定区的部分删除可增进该抗体的选择特性(血清半衰期)，同时保留其它与该主题恒定区结构域完整有关的所需功能。另外，如上所述，所公开的抗体的恒定区可经由一个或多个氨基酸的突变或取代修饰以增进该形成构建体的特性。在这方面可能扰乱由保守性结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，然而实质上维持该经修饰的抗体的构造及免疫原性特性。在某些实施方式中，该经修饰的抗体包含添加一个或多个氨基酸至恒定区以增进所需特征诸如减少或增加效应功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物连接位点。
该领域已知的是恒定区媒介数种效应功能。举例来说，补体的C1成分与(结合至抗原的)IgG或IgM抗体的Fc区结合活化该补体系统。补体活化于细胞病原体的调理作用及溶解中至为重要。补体活化也刺激炎性反应，且也与自体免疫超敏性有关。此外，抗体的Fc区可与表达Fc受体(FcR)的细胞结合。有一些Fc受体对不同类型的抗体具有特异性，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体结合引发多种重要且多变的生物反应，包括吞噬及破坏抗体包覆颗粒、清空免疫复合物、通过杀手细胞溶解经抗体包覆的靶标细胞(称为抗体依赖性细胞细胞毒性或ADCC)、释放炎性介导物、胚胎转移及控制免疫球蛋白的产生。
在某些实施方式中，该经修饰的抗体具有经改变的效应功能，该经改变的效应功能因此影响该施用抗体的生物特性。举例来说，在一些实施方式中，删除或不活化(经由点突变或其它方法)恒定区结构域可能减少循环中经修饰的抗体与Fc受体结合，因此增加癌细胞定位和/或肿瘤穿透。在其它实施方式中，恒定区修饰增加抗体的血清半衰期。在其它实施方式中，恒定区修饰减少抗体的血清半衰期。在一些实施方式中，恒定区是经修饰以消除双硫键或寡糖基团。根据本发明的恒定区修饰可利用广为周知的生化或分子工程技术轻易进行。
在某些实施方式中，属于抗体的RSPO3结合剂不具有一种或多种效应功能。例如在一些实施方式中，该抗体不具ADCC活性及/或不具补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方式中，该抗体不与Fc受体和/或补体因子结合。在某些实施方式中，该抗体不具效应功能。
本发明另包含实质上与本文前述的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其抗体片段同源的变异体及相等物。这些可包含例如保守性取代突变，即以类似氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守性取代是指以同一大类的氨基酸取代另一氨基酸，像是例如以一酸性氨基酸取代另一酸性氨基酸、以一碱性氨基酸取代另一碱性氨基酸或以一中性氨基酸取代另一中性氨基酸。保守性氨基酸取代的目的是该领域广为周知并于本文描述。
因此，本发明提供产生与RSPO3结合的抗体的方法，包括与RSPO3及第二靶标(如人RSPO)特异性结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，用于产生与RSPO3结合的抗体的方法包含利用杂交瘤技术。在一些实施方式中，提供用于产生与人RSPO3结合的抗体的方法。在一些实施方式中，该方法包含使用人RSPO3的氨基酸22至272。在一些实施方式中，该方法包含使用SEQ ID NO:3的氨基酸22至272。在一些实施方式中，用于产生与RSPO3结合的抗体的方法包含筛选人噬菌体库。本发明另提供识别与RSPO3结合的抗体的方法。在一些实施方式中，该抗体是通过FACS筛选与RSPO3或其部分的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过FACS筛选与RSPO3及第二RSPO或其部分的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过FACS筛选与RSPO3及RSPO2或其部分的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过利用ELISA筛选与RSPO3的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过利用ELISA筛选与RSPO3及第二RSPO的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过利用ELISA筛选与RSPO3及RSPO2结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过FACS筛选RSPO3与人LGR蛋白结合的阻断加以识别。在一些实施方式中，该抗体是通过筛选对β-连环蛋白信号传导的抑制或阻断加以识别。
在一些实施方式中，产生抗人RSPO3蛋白的抗体的方法包含以包含人RSPO3的氨基酸22至272的多肽免疫哺乳动物。在一些实施方式中，产生抗人RSPO3蛋白的抗体的方法包含以包含至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272的多肽免疫哺乳动物。在一些实施方式中，该方法另包含自该哺乳动物分离抗体或抗体产生细胞。在一些实施方式中，产生与RSPO3蛋白结合的单克隆抗体的方法包含：(a)以包含至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272的多肽免疫哺乳动物；(b)自该免疫哺乳动物分离抗体产生细胞；(c)融合该抗体产生细胞与骨髓瘤细胞系的细胞以形成杂交瘤细胞。在一些实施方式中，该方法另包含(d)筛选表达与RSPO3蛋白结合的抗体的杂交瘤细胞。在一些实施方式中，该至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272选自SEQ ID NO:5至8。在一些实施方式中，该至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272是SEQ ID NO:5。在一些实施方式中，该至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。在一些实施方式中，该至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272是SEQID NO:6及SEQ ID NO:7。在某些实施方式中，该哺乳动物是小鼠。在一些实施方式中，该抗体是利用包含至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272的多肽筛选。在某些实施方式中，包含至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272的用于筛选的多肽选自SEQ ID NO:5至8。在一些实施方式中，该抗体与RSPO3及至少一种其它RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，该至少一种其它RSPO蛋白选自RSPO1、RSPO2及RSPO4。在某些实施方式中，该抗体与RSPO3及RSPO1结合。在某些实施方式中，该抗体与RSPO3及RSPO2结合。在某些实施方式中，该抗体与RSPO3及RSPO4结合。在某些实施方式中，该抗体与RSPO3、RSPO1及RSPO2结合。在某些实施方式中，该抗体与RSPO3、RSPO1及RSPO4结合。在某些实施方式中，该抗体与RSPO3、RSPO2及RSPO4结合。在一些实施方式中，该抗体与人RSPO3及小鼠RSPO3两者结合。
在一些实施方式中，由本文所述的方法产生的抗体是RSPO拮抗剂，特别是RSPO3拮抗剂。在一些实施方式中，由本文所述的方法产生的抗体抑制β-连环蛋白信号传导。
在一些实施方式中，产生抗至少一种人RSPO蛋白的抗体的方法包含利用包含单一抗原结合位点的膜结合性异二聚体分子识别抗体。在一些非限制性实施方式中，该抗体是利用国际专利公开号WO 2011/100566所述的方法及多肽识别。
在一些实施方式中，产生抗至少一种人RSPO蛋白的抗体的方法包含在抗体表达库中筛选与人RSPO蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，该抗体表达库是噬菌体库。在一些实施方式中，该筛选包含筛选(panning)。在一些实施方式中，该抗体表达库是噬菌体库。在一些实施方式中，该抗体表达库是哺乳动物细胞库。在一些实施方式中，该抗体表达库是利用至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272筛选。在一些实施方式中，在第一次筛选中被识别的抗体，再次利用不同的RSPO蛋白筛选，藉以识别与RSPO3及第二RSPO蛋白结合的抗体。在某些实施方式中，包含至少部分的人RSPO3的氨基酸22至272的用于筛选的多肽选自SEQ ID NO:5至8。在一些实施方式中，在筛选中识别的抗体与RSPO3及至少一种其它RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，该至少一种其它RSPO蛋白选自RSPO1、RSPO2及RSPO4。在某些实施方式中，在筛选中识别的抗体与RSPO3及RSPO1结合。在某些实施方式中，在筛选中识别的抗体与RSPO3及RSPO2结合。在某些实施方式中，在筛选中识别的抗体与RSPO3及RSPO4结合。在一些实施方式中，在筛选中识别的抗体与人RSPO3及小鼠RSPO3两者结合。在一些实施方式中，在筛选中被识别的抗体是RSPO3拮抗剂。在一些实施方式中，在筛选中被识别的抗体抑制由RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。
在某些实施方式中，本文所述的抗体经分离。在某些实施方式中，本文所述的抗体是实质上纯的。
在本发明的一些实施方式中，该RSPO3结合剂是多肽。该多肽可为包含与RSPO3结合的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。该领域将同意本发明的一些氨基酸序列可变化而不会对该蛋白质的结构或功能造成显著影响。因此，本发明另包括多肽的变异体，该变异体显示拮抗人RSPO3的抗体或其片段的实质活性或包括该抗体或其片段的区域。在一些实施方式中，RSPO结合多肽的氨基酸序列变异体包括删除、插入、倒位、重复和/或其它类型的取代。
在某些实施方式中，本文所述的多肽经分离。在某些实施方式中，本文所述的多肽是实质上纯的。
该多肽、类似物及其变异体可另经修饰以包含正常非该多肽的部分的额外化学基团。该衍生化基团可增进或以其它方式调节该多肽的溶解性、生物半衰期和/或吸收。该基团也可减少或消除该多肽及变异体的非所需的不良反应。有关化学基团的介绍可见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22st Edition,2012,PharmaceuticalPress,London。
本文所述的多肽可通过该领域已知的任何适当方法产生。该方法从直接蛋白质合成方法至建构编码多肽序列的DNA序列及在适当宿主中表达该序列皆可。在一些实施方式中，DNA序列利用重组技术建构，其通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列。可任意选择地，该序列可通过定点突变形成突变以提供其功能性类似物。见例如Zoeller等，1984,PNAS,81:5662-5066及美国专利第4,588,585号。
在一些实施方式中，编码感兴趣的多肽的DNA序列可通过化学合成利用寡核苷酸合成器建构。寡核苷酸可根据该所需多肽的氨基酸序列设计，并选择那些将产生感兴趣重组多肽的宿主细胞所偏好的密码子。标准方法可被用于合成编码经分离的感兴趣多肽的多核苷酸序列。举例来说，完全氨基酸序列可被用于建构反转译基因。另外，可合成包含编码经分离的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，多个编码该所需多肽的部分的小型寡核苷酸可被合成然后连接。个别寡核苷酸通常包含5'或3'悬端以用于互补组装。
一经组装(通过合成、定点突变形成或其它方法)，该编码感兴趣的特定多肽的多核苷酸序列可被插入表达载体并可操作性连接适合该蛋白质于所需宿主内表达的表达控制序列。适当组装可通过核苷酸测序、限制酶定位和/或于适当宿主内表达生物活性多肽证实。如该领域所广为周知，为了在宿主内获得高表达水平的经转染的基因，该基因必须可操作性连接在选定的表达宿主内具功能性的转录及转译表达控制序列。
在某些实施方式中，重组表达载体被用于扩增及表达拮抗人RSPO3的DNA编码抗体或其片段。举例来说，重组表达载体可为可复制的DNA构建体，其具有与适当转录和/或转译调节组件可操作性连接的编码RSPO结合剂(诸如抗RSPO抗体或其片段)的多肽链的合成性或cDNA衍生性DNA片段，该调节组件源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。转录单位通常包含下列的组合：(1)于基因表达中具有调节作用的基因组件，例如转录启动子或增强子，(2)经转录成mRNA然后转译成蛋白质的结构或编码序列，及(3)适当的转录及转译启动及终止序列。调节组件可包括操作子序列以控制转录。通常由复制起点授予的于宿主内复制的能力及有利转化物辨识的选择基因可被额外纳入。DNA区系“可操作性连接”当它们彼此之间功能性相关。举例来说，信号肽的DNA(分泌前导序列)是可操作性连接多肽的DNA，若其被表达为参与该多肽分泌的前体；启动子是可操作性连接编码序列，若其控制该序列的转录；或核糖体结合位点是可操作性连接编码序列，若其位置是为了允许转译。在一些实施方式中，适用于酵母菌表达系统的结构组件包括使宿主细胞得以胞外分泌经转译的蛋白质的前导序列。在其它实施方式中，当重组蛋白质是于无前导或转运序列存在时表达的情况中，其可包括N端甲硫氨酸残基。此残基之后可任意选择地从经表达的重组蛋白质切下以提供最终产物。
表达控制序列及表达载体的选择取决于宿主选择。多样化的表达宿主/载体组合可被采用。可用于真核宿主的表达载体包括例如包含源自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，像是源自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)，及广泛宿主范围质粒像是M13及其它丝状单链DNA噬菌体。
本发明的RSPO结合剂(例如多肽或抗体)可由一个或多个载体表达。例如在一些实施方式中，一个重链多肽由一个载体表达，第二重链多肽由第二载体表达，且轻链多肽由第三载体表达。在一些实施方式中，第一重链多肽及轻链多肽由一个载体表达，且第二重链多肽由第二载体表达。在一些实施方式中，二条重链多肽由一个载体表达，且轻链多肽由第二载体表达。在一些实施方式中，三条多肽由一个载体表达。因此，在一些实施方式中，第一重链多肽、第二重链多肽及轻链多肽由单一载体表达。
用于表达RSPO3结合多肽或抗体(或用来作为抗原的RSPO蛋白)的适当宿主细胞包括原核生物、酵母菌细胞、昆虫细胞或在适当启动子控制下的高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(Bacillus)。高级真核细胞包括如下所述的哺乳动物来源的株化细胞系。不含细胞的转译系统也可被采用。用于细菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳动物细胞性宿主的适当克隆及表达载体描述于Pouwels等，1985,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,NY。有关蛋白质产生(包括抗体产生)方法的额外信息可见于例如美国专利公开号2008/0187954；美国专利第6,413,746、6,660,501号；及国际专利公开号WO 04/009823。
多种哺乳动物细胞培养系统可被用于表达重组多肽。可能理想的是于哺乳动物细胞中表达重组蛋白质，因为这些蛋白质通常经过正确折叠、适当修饰且具生物功能性。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7(猴肾来源)、L-929(小鼠纤维母细胞来源)、C127(小鼠乳腺肿瘤来源)、3T3(小鼠纤维母细胞来源)、CHO(中国仓鼠卵巢来源)、HeLa(人子宫颈癌来源)、BHK(仓鼠肾纤维母细胞来源)、HEK-293(人胚胎肾来源)细胞系及其变异株。哺乳动物表达载体可包含非转录组件(诸如复制起点、与所需表达的基因相连的适当启动子及增强子，及其它5'或3'侧翼非转录序列)及5'或3'非转译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体位点及受体位点，及转录终止序列)。
于昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白质也提供产生正确折叠及具生物功能的蛋白质的有效方法。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白质的杆状病毒系统是本领域技术人员所广为周知(见例如Luckow和Summers,1988,Bio/Technology,6:47)。
因此，本发明提供包含本文所述的RSPO3结合剂的细胞。在一些实施方式中，该细胞产生本文所述的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该细胞产生抗体。在一些实施方式中，该细胞产生与人RSPO3结合的抗体。在某些实施方式中，该细胞产生抗体131R002。在某些实施方式中，该细胞产生抗体131R003。在某些实施方式中，该细胞产生抗体131R003的变异体。在某些实施方式中，该细胞产生人源化版本的抗体131R002、抗体131R003或抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该细胞产生嵌合版本的抗体131R002、抗体131R003或抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该细胞产生抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该细胞产生抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该细胞产生抗体h131R008。在一些实施方式中，该细胞产生抗体h131R010。在一些实施方式中，该细胞产生抗体h131R011。在一些实施方式中，该细胞产生与RSPO3结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该细胞产生与RSPO3及RSPO2结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该细胞是杂交瘤细胞。在一些实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，该细胞是原核细胞。在一些实施方式中，该细胞是真核细胞。
由经转化的宿主产生的蛋白质可根据任何适当方法纯化。标准方法包括层析(例如离子交换、亲和性及尺寸柱层析)、离心、差别溶解或通过任何其它用于蛋白质纯化的标准技术。亲和性标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外套序列及麸胱甘肽-S-转移酶可被连接至该蛋白质以允许通过通过适当亲和性管柱的轻易纯化。用于纯化免疫球蛋白的亲和性层析可包括蛋白质A、蛋白质G及蛋白质L层析。经分离的蛋白质可经物理特征化，使用像是蛋白水解、尺寸排阻层析(SEC)、质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)、等电点沉淀(IEF)、高效液相层析(HPLC)及x光结晶的技术。经分离的蛋白质的纯度可利用本领域技术人员已知的技术测定，该技术包括但不限于SDS-PAGE、SEC、毛细管胶体电泳、IEF及毛细管等电点沉淀(cIEF)。
在一些实施方式中，源自分泌重组蛋白质至培养基的表达系统的上清液可利用商用蛋白质浓缩过滤器先行浓缩，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超过滤单位浓缩。在浓缩步骤之后，该浓缩液可被加至适当纯化基材。在一些实施方式中，可采用阴离子交换树脂，例如具有二乙基胺基乙基(DEAE)悬挂基团的基材或基质。该基材可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它常用于蛋白质纯化的基材。在一些实施方式中，可采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换基材包括包含磺丙基或羧甲基的各种不可溶基材。在一些实施方式中，可采用羟磷灰石基质，包括但不限于陶瓷羟磷灰石(CHT)。在某些实施方式中，一种或多种应用疏水性反相HPLC基质(例如具有悬挂甲基或其它脂肪族基团的硅胶)的逆相HPLC步骤可被采用以进一步纯化重组蛋白质(例如RSPO3结合剂)。上述的一些或所有纯化步骤的各种组合可被应用以提供均质性重组蛋白质。
在一些实施方式中，异二聚体蛋白质诸如双特异性抗体根据本文所述的任何方法纯化。在一些实施方式中，抗RSPO双特异性抗体利用至少一种层析步骤分离和/或纯化。在一些实施方式中，该至少一种层析步骤包含亲和性层析。在一些实施方式中，该至少一种层析步骤另包含阴离子交换层析。在一些实施方式中，该经分离和/或纯化的抗体产物包含至少90％的异二聚抗体。在一些实施方式中，该经分离和/或纯化的抗体产物包含至少95％、96％、97％、98％或99％的异二聚抗体。在一些实施方式中，该经分离和/或纯化的抗体产物包含大约100％的异二聚抗体。
在一些实施方式中，于细菌培养中生产的重组蛋白质可被分离，例如通过自细胞团块初步萃取，接着进行一或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻层析步骤。HPLC可被使用于最终纯化步骤。用于表达重组蛋白质的微生物细胞可通过任何方便方法破碎，包括冷冻解冻循环、超音波震荡、机械破碎或使用细胞溶解剂。
本领域已知的用于纯化抗体及其它蛋白质的方法也包括例如那些于美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048及2009/0187005所述。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂是非抗体的多肽。用于识别及产生以高亲和性与蛋白质靶标结合的非抗体多肽的各种方法是该领域所知。见例如Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等，2006,Protein Science,15:14-27；Gill等，2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76；及Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83。在某些实施方式中，噬菌体或哺乳动物细胞展示技术可被用于生产和/或识别RSPO3结合多肽。在某些实施方式中，该多肽包含选自蛋白A、蛋白G、脂质运载蛋白(lipocalin)、纤维粘连蛋白结构域、锚蛋白(ankyrin)共同重复结构域或硫氧还蛋白类型的蛋白质支架。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂或抗体可以数种共轭(即免疫共轭物或放射共轭物)或非共轭形式的任一者被使用。在某些实施方式中，该抗体可以非共轭形式被使用以驾驭个体的天然防御机制，包括补体依赖性细胞毒性及抗体依赖性细胞毒性，以消灭恶性或癌细胞。
在一些实施方式中，该RSPO3结合剂(例如抗体或多肽)与细胞毒性剂共轭。在一些实施方式中，该细胞毒性剂是化学治疗剂，包括但不限于甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土霉素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、霉法兰(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定霉素(daunorubicin)或其它插入剂。在一些实施方式中，该细胞毒性剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-次黄嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂胶素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些实施方式中，该细胞毒性剂是放射性同位素以产生放射共轭物或经放射共轭的抗体。多种放射性核种可用于产生经放射共轭的抗体，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re及212Bi。本发明也可使用抗体与一种或多种小分子毒素的共轭物，该毒素诸如卡利奇霉素(calicheamicins)、类美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothenes)、CC1065及具有毒素活性的那些毒素的衍生物。抗体与细胞毒性剂的共轭物可利用各种双官能性蛋白偶合剂制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亚胺环硫丁烷(IT)、亚氨酸酯的双官能基衍生物(诸如己二亚胺二甲酯HCl)、活性酯的双官能基衍生物(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛的双官能基衍生物(诸如戊二醛)、双迭氮化合物(诸如双(对-迭氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲苯酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
III.多核苷酸
在某些实施方式中，本发明包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码与RSPO3特异性结合的多肽(或多肽的片段)的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”包含仅包括该多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。举例来说，在一些实施方式中，本发明提供包含编码抗人RSPO3的抗体或编码该种抗体的片段(例如包含该抗原结合位点的片段)的多核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为RNA的形式或DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA及合成性DNA；可为双链或单链，若单链可为编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方式中，该多核苷酸包含编码包含选自下列的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88。在某些实施方式中，该多核苷酸包含选自下列的多核苷酸序列：SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQID NO:94及SEQ ID NO:95。
在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:18的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:19的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:20的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:24的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:25的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:26的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:30的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQID NO:31的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:32的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:40的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:43的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:50的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:51的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:52的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:53的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:54的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQID NO:55的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:65的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:66的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:67的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:70的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:71的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:75的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:76的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:77的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQID NO:84的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:85的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:89的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:90的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:91的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:92的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:93的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:94的多核苷酸。在一些实施方式中，该质粒包含含有SEQ ID NO:95的多核苷酸。
在某些实施方式中，该多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与包含选自下列序列的多核苷酸具有至少约80％一致性、至少约85％一致性、至少约90％一致性、至少约95％一致性，且在一些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQID NO:93、SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95。本发明也提供包含与下列序列杂交的多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:990、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95。本发明也提供包含与下列序列的互补序列杂交的多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94及SEQ ID NO:95。在某些实施方式中，该杂交于高度严谨度条件下发生。
在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:20的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体是由包含SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:20的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:20的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:20的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:75的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:75的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:75的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:75的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:75的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:95及SEQ ID NO:89的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:89的多核苷酸编码。
在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:53及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:70及SEQ ID NO:26的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:53及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:70及SEQ ID NO:76的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:90的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:93及SEQ ID NO:90的多核苷酸编码。
在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:32的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:32的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:32的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:32的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:32的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:77的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:77的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:77的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:77的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:77的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:77的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:85及SEQ ID NO:91的多核苷酸编码。在一些实施方式中，该抗体由包含SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:91的多核苷酸编码。
在某些实施方式中，该多核苷酸包含融合至多核苷酸的相同阅读框的成熟多肽的编码序列，该编码序列有助于例如多肽自宿主细胞的表达及分泌(例如作为分泌序列以控制源自细胞的多肽的运输的前导序列)。具有前导序列的多肽是前体蛋白，该前导序列可由宿主细胞切割以形成成熟形式的多肽。该多核苷酸也可编码蛋白原，蛋白原是成熟蛋白质加上额外的5'氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白质是蛋白原，其是不活化形式的蛋白质。一旦原序列被切割后，剩下即为活性成熟蛋白质。
在某些实施方式中，该多核苷酸包含融合至标志序列的相同阅读框的成熟多肽的编码序列，以允许例如用于纯化该经编码的多肽。举例来说，该标志序列可为由pQE-9载体供应的六组氨酸标签以提供在细菌宿主的例中用于纯化与该标记融合的成熟多肽，或当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时该标志序列可为源自流感血球凝集素蛋白质的血球凝集素(HA)标签。在一些实施方式中，该标志序列是FLAG卷标，即可与其它亲和性标签搭配使用的序列DYKDDDDK的肽(SEQ ID NO:33)。
本发明还涉及上述多核苷酸编码片段、类似物和/或衍生物的变异体。
在某些实施方式中，本发明提供多核苷酸，该多核苷酸包含具有与编码包含本文所述的RSPO3结合剂(例如抗体)或其片段的多肽的多核苷酸至少约80％一致性、至少约85％一致性、至少约90％一致性、至少约95％一致性，及在一些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列的多核苷酸。
如本文所使用的用语，具有与参考核苷酸序列至少例如95％“一致性”的核苷酸序列的多核苷酸是意图表示该多核苷酸的核苷酸序列与该参考序列相同，除了该多核苷酸序列可在该参考核苷酸序列的每100个核苷酸中包括最多五个点突变。换言的，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致性的核苷酸序列的多核苷酸，在参考序列中最多5％的核苷酸可被删除或以另一核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸数量的最多5％的核苷酸可被插入该参考序列中。这些参考序列的突变可发生在该参考核苷酸序列的5'或3'端位置或那些末端位置之间的任何位置，这些位置各自分散在参考序列的核苷酸之中或在参考序列内以一个或多个连续族群存在。
多核苷酸变异体可包含编码区、非编码区或两区中的改变。在一些实施方式中，多核苷酸变异体包含产生沉默取代、添加或删除的改变，但不改变该经编码的多肽的性质或活性。在一些实施方式中，多核苷酸变异体包含导致该多肽的氨基酸序列无改变的沉默取代(由于基因密码的简并)。在一些实施方式中，核苷酸变异体包含在转录层级导致表达差异(例如增加或减少表达)的核苷酸序列。多核苷酸变异体可为了多种原因产生，例如为了最佳化密码子于特定宿主的表达(例如将人mRNA中的密码子改变成那些细菌宿主诸如大肠杆菌所偏好的密码子)。在一些实施方式中，多核苷酸变异体在序列的非编码或编码区包含至少一个沉默突变。
在一些实施方式中，多核苷酸变异体是经产生以调节或改变该经编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方式中，多核苷酸变异体是经产生以增加该经编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体是经产生以减少该经编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体相较于亲代多核苷酸序列增加该经编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体相较于亲代多核苷酸序列减少该经编码的多肽的表达。
在一些实施方式中，至少一种多核苷酸变异体是经产生(不改变该经编码的多肽的氨基酸序列)以增加异多聚分子的产生。在一些实施方式中，至少一种多核苷酸变异体是经产生(不改变该经编码的多肽的氨基酸序列)以增加双特异性抗体的产生。
在某些实施方式中，多核苷酸经分离。在某些实施方式中，多核苷酸是实质上纯的。
本发明也提供本文所述的包含该多核苷酸的载体。本发明也提供本文所述的包含该多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含该多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸分子。
IV.使用方法及药物组合物
本发明的RSPO3结合剂(包括多肽及抗体)可用于各种应用，包括但不限于治疗性处理方法诸如癌的治疗。在某些实施方式中，该试剂可用于抑制β-连环蛋白信号传导、抑制肿瘤生长、调节血管生成、抑制血管生成、诱导分化、减少肿瘤体积、减少肿瘤中癌干细胞的频率和/或减少肿瘤的致瘤性。使用方法可为体外、离体或体内方法。在某些实施方式中，RSPO3结合剂或多肽或抗体是人RSPO3的拮抗剂。
在某些实施方式中，该RSPO3结合剂用于治疗与β-连环蛋白活化、β-连环蛋白信号传导增加和/或β-连环蛋白信号传导异常有关的疾病。在某些实施方式中，该疾病是依赖β-连环蛋白信号传导的疾病。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂用于治疗特征为血管生成增加的疾病。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂用于治疗特征为干细胞和/或祖细胞的量增加的疾病。在一些实施方式中，该方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂(例如抗体)。在一些实施方式中，该受试对象是人。
本发明提供利用本文所述的RSPO3结合剂或抗体抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法包含于体外使细胞与RSPO3结合剂(例如抗体)接触。举例来说，永生化细胞系或癌细胞系于培养基中培养，其中添加抗RSPO3抗体或其它剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方式中，肿瘤细胞系自患者样本诸如像是组织活体检查、胸膜渗液或血液样本分离，并于其中添加RSPO3结合剂以抑制肿瘤生长的培养基中培养。
在一些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法包含于体内使肿瘤或肿瘤细胞与RSPO3结合剂(例如抗体)接触。在某些实施方式中，使肿瘤或肿瘤细胞接触RSPO3结合剂于动物模型中进行。举例来说，RSPO3结合剂可被施用至具有异种移植的免疫不全小鼠(例如NOD/SCID小鼠)。在一些实施方式中，癌细胞或癌干细胞自患者样本诸如像是组织活体检查、胸膜渗液或血液样本分离，并注射至免疫不全小鼠，该小鼠接着被施用RSPO3结合剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方式中，RSPO3结合剂经施用至该动物。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂于导入肿瘤发生细胞至动物的同时或短时间内施用以预防肿瘤生长(“预防模型”)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂于肿瘤生长至特定大小后施用以作为治疗的用(“治疗模型”)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂，其中该RSPO3结合剂包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ IDNO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在该方法的一些实施方式中，该RSPO3结合剂另包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ IDNO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ IDNO:83)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ IDNO:9)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ IDNO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ IDNO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。
在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该受试对象是人。在某些实施方式中，该受试对象具有肿瘤或肿瘤已被移除。在一些实施方式中，该受试对象具有至少一种RSPO蛋白(如RSPO1、RSPO2、RSPO3或RSPO4)的表达水平上升的肿瘤。在一些实施方式中，该受试对象具有至少一种RSPO蛋白(如RSPO1、RSPO2、RSPO3或RSPO4)的表达水平高的肿瘤。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R01。
在某些实施方式中，该肿瘤是其中β-连环蛋白信号传导活跃的肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤系其中β-连环蛋白信号传导异常的肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤包含APC抑瘤基因的不活化突变(例如截短突变)。在某些实施方式中，该肿瘤不包含APC抑瘤基因的不活化突变。在一些实施方式中，该肿瘤包含野生型APC基因。在一些实施方式中，该肿瘤不包含β-连环蛋白基因的活化突变。在某些实施方式中，接受治疗的受试对象的癌涉及该肿瘤。
在一些实施方式中，该肿瘤包含RSPO基因融合。在一些实施方式中，该肿瘤包含RSPO2基因融合。在一些实施方式中，该肿瘤包含RSPO3基因融合。
在某些实施方式中，该肿瘤表达被RSPO3结合剂或抗体结合的RSPO3。在某些实施方式中，该肿瘤具有上升表达水平的RSPO1或过表达RSPO1。在某些实施方式中，该肿瘤具有上升表达水平的RSPO2或过表达RSPO2。在某些实施方式中，该肿瘤具有上升表达水平的RSPO3或过表达RSPO3。术语“肿瘤具有上升表达水平”是指蛋白的表达水平或核酸的表达水平。一般来说，术语“肿瘤具有上升表达水平”的蛋白或基因(或类似用语)是指肿瘤中的蛋白或基因的表达水平相较于参考样本中的该相同蛋白或相同基因的表达水平或预定的表达水平。在一些实施方式中，该参考样本是相同组织类型的正常组织。在一些实施方式中，该参考样本是一群组织类型的正常组织。在一些实施方式中，该参考样本是相同组织类型的肿瘤或肿瘤群。在一些实施方式中，该参考样本是不同组织类型的肿瘤或肿瘤群。因此在一些实施方式中，肿瘤中的蛋白或基因的表达水平相较于一群组织类型内的该蛋白或基因的平均表达水平为“上升”或“高”。在一些实施方式中，肿瘤中的蛋白或基因的表达水平相较于该相同组织类型或不同组织类型的其它肿瘤中的该蛋白或基因的表达水平为“上升”或“高”。在一些实施方式中，该肿瘤相较于该相同组织类型的正常组织中所表达的RSPO量表达“上升”或“高”量的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些实施方式中，该肿瘤相较于预定的量表达“上升”或“高”量的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。
此外，本发明提供抑制受试对象体内肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该肿瘤包含癌干细胞。在某些实施方式中，该肿瘤中癌干细胞的频率通过施用RSPO3结合剂而减少。本发明也提供减少肿瘤中癌干细胞的频率的方法，该方法包含使该肿瘤接触有效量的RSPO3结合剂(例如抗RSPO3抗体)。在一些实施方式中，提供减少受试对象的肿瘤中癌干细胞的频率的方法，该方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂(例如抗RSPO3抗体)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
在一些实施方式中，该肿瘤是实质肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤是选自结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤或头颈肿瘤的肿瘤。本文所使用的“肺癌”包括但不限于小细胞肺癌及非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤是胰腺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是包含APC基因中的失活突变的结直肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是不包含APC基因中的失活突变的结直肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是包含RSPO基因融合的结直肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是包含RSPO2基因融合的结直肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是包含RSPO3基因融合的结直肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO1的卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO2的胰脏肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO2的结肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO2的肺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO3的肺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO3的卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO3的乳腺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是具有上升表达水平的RSPO3的结直肠肿瘤。
本发明另提供治疗癌的方法，该方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该癌的特征为表达上升量的至少一种RSPO蛋白的细胞，相较于参考样本中的该相同RSPO蛋白的表达水平。本文所使用的“参考样本”包括但不限于正常组织、该相同组织类型的非癌性组织、该相同组织类型的肿瘤组织及不同组织类型的肿瘤组织。在某些实施方式中，该癌的特征为表达上升量的至少一种RSPO蛋白的细胞，相较于预定的该相同RSPO蛋白的量。在一些实施方式中，决定至少一种RSPO的表达水平于治疗前进行。在一些实施方式中，决定至少一种RSPO的表达水平由免疫组织化学进行。因此在某些实施方式中，该癌的特征为表达上升量的至少一种RSPO蛋白的细胞，相较于正常组织中的该相同RSPO蛋白的表达水平。在某些实施方式中，该癌的特征为过表达RSPO1的细胞。在某些实施方式中，该癌的特征为过表达RSPO2的细胞。在某些实施方式中，该癌的特征为过表达RSPO3的细胞。在某些实施方式中，该癌过表达至少一种选自RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的RSPO蛋白。在某些实施方式中，该癌的特征为表达β-连环蛋白的细胞，其中该RSPO3结合剂(例如抗体)干扰RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导和/或活化。
在一些实施方式中，该RSPO结合剂与RSPO3结合且抑制或减少癌的生长。在一些实施方式中，该RSPO结合剂与RSPO3结合、干扰RSPO3/LGR相互作用且抑制或减少癌的生长。在一些实施方式中，该RSPO结合剂与RSPO3结合、抑制β-连环蛋白活化且抑制或减少癌的生长。在一些实施方式中，该RSPO结合剂与RSPO3结合且减少癌中癌干细胞的频率。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO抗体是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
本发明提供治疗癌的方法，该方法包含对受试对象(例如需要治疗的受试对象)施用治疗有效量的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该治疗癌的方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂，其中该RSPO3结合剂包含重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)，该重链CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)，且该重链CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)。在该方法的一些实施方式中，该RSPO3结合剂另包含轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)，该轻链CDR2包含AAS(SEQ IDNO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)，且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ IDNO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ IDNO:10)的重链CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ IDNO:35)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ IDNO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ IDNO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ IDNO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ IDNO:82)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该受试对象是人。在某些实施方式中，该受试对象罹患癌性肿瘤。在某些实施方式中，该受试对象罹患的肿瘤已经移除。在一些实施方式中，治疗癌的方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂，其中该受试对象具有相较于参考样本或预定的量升高表达至少一种RSPO蛋白的肿瘤。在一些实施方式中，该受试对象具有升高表达RSPO3的肺肿瘤且经施用抗RSPO3抗体。
本发明也提供用于治疗癌的方法中的RSPO3结合剂，其中该RSPO3结合剂是本文所述的抗体。本发明也提供本文所述的RSPO3结合剂(例如抗体)于制造用于治疗癌的药物的用途。
在某些实施方式中，该癌选自结直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤或头颈癌的癌。在某些实施方式中，该癌是胰腺癌。在某些实施方式中，该癌是卵巢癌。在某些实施方式中，该癌是结直肠癌。在某些实施方式中，该癌是乳腺癌。在某些实施方式中，该癌是前列腺癌。在某些实施方式中，该癌是肺癌。
此外，本发明提供减少受试对象体内肿瘤的致瘤性的方法，该方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该肿瘤包含癌干细胞。在一些实施方式中，该肿瘤的致瘤性通过减少肿瘤中癌干细胞的频率降低。在一些实施方式中，该方法包含使用本文所述的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该肿瘤中癌干细胞的频率通过施用RSPO3结合剂而减少。
在某些实施方式中，该方法另包含测定肿瘤或癌中至少一种RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平的步骤。在一些实施方式中，该测定肿瘤或癌中RSPO的表达水平的步骤包含测定RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平。在一些实施方式中，肿瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平是与参考样本中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平比较。在一些实施方式中，肿瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平是与正常组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平比较。在一些实施方式中，肿瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平是与预先测定的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平比较。在一些实施方式中，肿瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平是与正常组织中预先测定的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平比较。在一些实施方式中，该肿瘤具有高表达水平的RSPO1。在一些实施方式中，该肿瘤具有高表达水平的RSPO3。通常，RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平是与该相同组织类型的正常组织中的RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平比较。然而在一些实施方式中，RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平是与一群组织类型内的RSPO(即蛋白或核酸)的平均表达水平比较。在一些实施方式中，肿瘤中RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平是与该相同组织类型或不同组织类型的其它肿瘤中的RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平比较。
在一些实施方式中，测定RSPO的表达水平于治疗前进行。在一些实施方式中，若该肿瘤或癌相较于参考样本(例如正常组织)中相同RSPO的表达水平或预定的量具有升高表达水平的RSPO，则对该受试对象施用本文所述的RSPO3结合剂或抗体。举例来说，在一些实施方式中，若该肿瘤或癌相较于正常或对照组织中RSPO3的表达水平具有升高表达水平的RSPO3(即蛋白或核酸)，则对该受试对象施用RSPO3结合剂(例如抗RSPO3抗体)。
在某些实施方式中，该方法另包含测定肿瘤或癌是否具有APC基因的失活突变的步骤。在一些实施方式中，该方法另包含测定肿瘤或癌是否具有β-连环蛋白基因的活化突变的步骤。在一些实施方式中，该方法另包含测定肿瘤或癌是否具有RSPO基因融合的步骤。
此外，本发明提供调节血管生成的方法，该方法包含对受试对象施用治疗有效量的RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该血管生成调节包含抑制血管生成。在一些实施方式中，该方法包含使用本文所述的RSPO3结合剂。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3结合且抑制或减少血管生成。在某些实施方式中，抑制和/或减少血管生成抑制或减少肿瘤或癌的生长。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3结合且促进异常血管生成。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂与RSPO3结合且促进非生产性血管生成。在某些实施方式中，该异常血管生成或非生产性血管生成抑制或减少肿瘤或癌的生长。
此外，本发明提供识别适用于以RSPO结合剂治疗人受试对象的方法，该方法包含测定该受试对象是否具有相较于正常组织、参考样本的该相同RSPO(即蛋白或核酸)的表达或预定的该RSPO蛋白的量为上升的RSPO(即蛋白或核酸)表达水平的肿瘤。在一些实施方式中，识别适用于以RSPO3结合剂治疗的人受试对象的方法包含：测定该受试对象是否具有相较于参考样本或预定的RSPO3的量为上升的RSPO3表达水平的肿瘤。在一些实施方式中，识别适用于以RSPO3结合剂治疗的人受试对象的方法包含：自该受试对象获得肿瘤样本并测定该肿瘤是否具有相较于参考样本或预定的RSPO3的量为上升的RSPO3表达水平。在一些实施方式中，若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象为适用于以与RSPO3特异性结合的抗体治疗。在一些实施方式中，若经选择为适合治疗，则对该受试对象施用本文所述的RSPO3结合剂或抗体。在一些实施方式中，若该肿瘤具有上升表达水平的超过一种RSPO(即蛋白或核酸)，则对该受试对象施用与最高表达水平的RSPO结合的RSPO结合剂。在某些实施方式中，该受试对象罹患的肿瘤已经移除。举例来说，在一些实施方式中，测定肿瘤中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平，若该肿瘤相较于正常组织中RSPO3的量具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象为适用于以与RSPO3特异性结合的抗体治疗。若经选择为适合治疗，则对该受试对象施用如本文所述的抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的人源化形式。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体的人源化形式。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R011。
本发明提供选择适用于以RSPO结合剂治疗的人受试对象的方法，该方法包含测定该受试对象是否具有相较于正常组织中该相同RSPO的表达或相较于预定的量为上升的至少一种RSPO(即蛋白或核酸)表达水平的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的至少一种RSPO表达水平，则选择该受试对象为适用于以该与上升表达水平的RSPO特异性结合的抗体治疗。在一些实施方式中，若经选择为适合治疗，则对该受试对象施用本文所述的RSPO结合剂或抗体。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：测定该受试对象是否具有相较于参考样本或预定的RSPO3的量为上升的RSPO3表达水平的肿瘤。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：自该受试对象获得肿瘤样本并测定该肿瘤是否具有相较于参考样本或预定的RSPO3的量为上升的RSPO3表达水平。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：测定该受试对象是否具有相较于参考样本或预定的RSPO3的量为上升的RSPO3表达水平的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象为适用于以该抗体治疗。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：自该受试对象获得肿瘤样本，及测定该肿瘤是否具有相较于参考样本或预定的RSPO3的量为上升的RSPO3表达水平，其中若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象为适用于以该抗体治疗。在某些实施方式中，该受试对象的肿瘤已移除。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
本发明也提供治疗人受试对象的癌的方法，该方法包含：(a)选择适合治疗的受试对象，该选择是根据(至少部分根据)该受试对象具有上升量的RSPO的癌，及(b)对该受试对象施用如本文所述的治疗有效量的RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
用于测定细胞、肿瘤或癌中的RSPO表达水平的方法是本领域技术人员所知。以核酸表达而言，该方法包括但不限于PCR类试验、微阵列分析及核苷酸测序(例如NextGen测序)。以蛋白表达而言，该方法包括但不限于蛋白印迹分析、蛋白数组、ELISA、免疫组织化学(IHC)试验及FACS。
本发明提供识别适用于以RSPO3结合剂治疗的人受试对象的方法，该方法包含自该受试对象获得肿瘤样本，及测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合。在一些实施方式中，识别适用于以RSPO3结合剂治疗的人受试对象的方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO基因融合的肿瘤，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象为适用于以该抗体治疗。在一些实施方式中，识别适用于以RSPO3结合剂治疗的人受试对象的方法包含：(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及(b)测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象为适用于以该抗体治疗。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含测定该受试对象是否具有RSPO基因融合的肿瘤。
本发明也提供选择适用于以RSPO结合剂治疗的人受试对象的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO基因融合的肿瘤，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象为适用于以该与RSPO蛋白特异性结合的抗体治疗。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含测定该受试对象是否具有RSPO基因融合的肿瘤。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：自该受试对象获得肿瘤样本，及测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO基因融合的肿瘤，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象为适用于以该抗体治疗。在一些实施方式中，选择适用于以RSPO3特异性结合性抗体治疗的人受试对象的方法包含：自该受试对象获得肿瘤样本，及测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象为适用于以该抗体治疗。在一些实施方式中，该RSPO基因融合是RSPO2基因融合。在一些实施方式中，该RSPO基因融合是RSPO3基因融合。在一些实施方式中，若经选择为适合治疗，则对该受试对象施用本文所述的RSPO结合剂或抗体。在某些实施方式中，该受试对象罹患的肿瘤已经移除。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
本发明也提供治疗人受试对象的癌的方法，该方法包含：(a)选择适合治疗的受试对象，该选择是根据(至少部分根据)该受试对象具有RSPO基因融合的癌，及(b)对该受试对象施用如本文所述的治疗有效量的RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R006A或h131R006B。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R008。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R010。在一些实施方式中，该抗RSPO3抗体是抗体h131R011。
用于测定肿瘤是否具有RSPO基因融合的方法是本领域技术人员所知。该方法可能包括但不限于PCR类试验、微阵列分析及核苷酸测序(例如NextGen测序、全基因组测序(WGS))。
测定肿瘤或癌是否具有上升的RSPO表达水平或具有RSPO基因融合的方法可使用各种样本。在一些实施方式中，该样本是取自具有肿瘤或癌的受试对象。在一些实施方式中，该样本是新鲜肿瘤/癌样本。在一些实施方式中，该样本是冷冻肿瘤/癌样本。在一些实施方式中，该样本是经福尔马林固定的石蜡包埋样本。在一些实施方式中，该样本是处理成细胞溶解物。在一些实施方式中，该样本是处理成DNA或RNA。
本发明另提供治疗受试对象的疾病或病状的方法，其中该疾病或病状与β-连环蛋白信号传导异常(例如增加量)有关。本发明另提供治疗受试对象的疾病或病状的方法，其中该疾病或病状的特征为干细胞和/或祖细胞的量增加。在一些实施方式中，该治疗方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO结合剂、多肽或抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R011。
本发明也提供抑制细胞中β-连环蛋白信号传导的方法，该方法包含使该细胞与有效量的RSPO结合剂接触。在某些实施方式中，该细胞是肿瘤细胞。在某些实施方式中，该方法是活体内方法，其中使该细胞与该RSPO3结合剂接触的步骤包含对该受试对象施用治疗有效量的该RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该方法是体外方法或离体(ex vivo)方法。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制β-连环蛋白信号传导。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制β-连环蛋白的活化。在某些实施方式中，该RSPO结合剂干扰RSPO/LGR相互作用。在某些实施方式中，该LGR是LGR4、LGR5和/或LGR6。在某些实施方式中，该LGR是LGR4。在某些实施方式中，该LGR是LGR5。在某些实施方式中，该LGR是LGR6。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R011。
本发明也提供如本文所述的RSPO结合剂、多肽或抗体于诱导细胞分化的用途，该细胞包括但不限于肿瘤细胞。在一些实施方式中，诱导细胞分化的方法包含使该细胞与有效量的如本文所述的RSPO结合剂(例如抗RSPO抗体)接触。在某些实施方式中，诱导受试对象体内的肿瘤中的细胞分化的方法包含对该受试对象施用治疗有效量的RSPO结合剂、多肽或抗体。在一些实施方式中，诱导肿瘤细胞的分化标记物的方法包含施用治疗有效量的RSPO结合剂、多肽或抗体。在一些实施方式中，该肿瘤是实质肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤选自结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤或头颈肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在某些其它实施方式中，该肿瘤是结肠肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方式中，该方法是体内方法。在某些实施方式中，该方法是体外方法。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R011。
本发明另提供使肿瘤发生细胞分化成非肿瘤发生细胞的方法，该方法包含使该肿瘤发生细胞与RSPO结合剂接触。在一些实施方式中，该方法包含对受试对象施用该RSPO结合剂，该受试对象具有包含肿瘤发生细胞的肿瘤或该包含肿瘤发生细胞的肿瘤已被移除。在某些实施方式中，该肿瘤发生细胞是卵巢肿瘤细胞。在某些实施方式中，该肿瘤发生细胞是结肠肿瘤细胞。在一些实施方式中，该肿瘤发生细胞是肺肿瘤细胞。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R002。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是人源化版本的抗体131R003。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体131R003的变异体的人源化版本。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R006A或抗体h131R006B。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R005/131R007。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R008。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R010。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是抗体h131R011。
在某些实施方式中，由本文所述的RSPO3结合剂治疗的疾病不是癌。举例来说，该疾病可能是代谢性疾病如肥胖或糖尿病(例如第二型糖尿病)(Jin T.,2008,Diabetologia,51:1771-80)。或者，该疾病可能是骨骼疾病如骨质疏松症、骨关节炎或类风湿性关节炎(Corr M.,2008,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.,4:550-6；Day等，2008,BoneJoint Surg.Am.,90Suppl 1:19-24)。该疾病也可能是肾病如多囊性肾病(Harris等，2009,Ann.Rev.Med.,60:321-337；Schmidt-Ott等，2008,Kidney Int.,74:1004-8；Benzing等，2007,J.Am.Soc.Nephrol.,18:1389-98)。或者，可治疗眼睛疾病包括但不限于黄斑变性及家族性渗出性玻璃体视网膜病(Lad等，2009,Stem Cells Dev.,18:7-16)。也可治疗心血管疾病，包括心肌梗塞、动脉粥样硬化及瓣膜疾病(Al-Aly Z.,2008,Transl.Res.,151:233-9；Kobayashi等，2009,Nat.Cell Biol.,11:46-55；van Gijn等，2002,Cardiovasc.Res.,55:16-24；Christman等，2008,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.,294:H2864-70)。在一些实施方式中，该疾病是肺疾病如自发性肺动脉性高血压或肺纤维化(Laumanns等，2008,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2009,40:683-691；等，2008,PLoS ONE,3:e2142)。在一些实施方式中，以RSPO3结合剂治疗的疾病是肝病，如肝硬化或肝纤维化(Cheng等，2008,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,294:G39-49)。
本发明另提供包含本文所述的RSPO3结合剂的药物组合物。在某些实施方式中，该药物组合物另包含医药上可接受的载具。在一些实施方式中，该药物组合物于受试对象(例如人患者)中具有抑制肿瘤生长及治疗癌的用途。
在某些实施方式中，供储存及使用的调制剂是通过组合本发明的经纯化的抗体或剂与医药上可接受的载具(例如载剂或赋形剂)加以制备。适当的医药上可接受的载具包括但不限于非毒性缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯酚、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚；低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物诸如单醣、双醣、葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属复合物(例如锌蛋白质复合物)；及非离子性界面活性剂诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London)。
本发明的药物组合物可以任何数量的方式经局部或系统施用。施用可为通过表皮贴片、经皮贴片、软膏、乳液、乳膏、胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液体剂及粉剂的局部施用；通过吸入或喷入粉剂或气雾剂的经肺施用，包括通过喷雾器、气管内或鼻内施用；经口；或非经肠施用包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如注射或输注)或颅内(例如脊椎鞘内或心室内)施用。
该治疗调制剂可呈单位剂量形式。该调制剂包括锭剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、水或非水性介质的溶液或悬浮液、或栓剂。在固态组合物诸如锭剂中，该主要活性成分与医药载剂混合。习用的制锭成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、及稀释剂(例如水)。这些可被用来形成含有本发明的化合物或其无毒性、医药上可接受的盐的均质混合物的固体预调制组合物。该固体预调制组合物接着被分成上述种类的单位剂量形式。锭剂、丸剂等调制剂或组合物可经包覆或经其它方式复合以提供提供具有长效优点的剂型。举例来说，锭剂或丸剂可包含由外部成份包覆的内部组合物。另外，该两种成份可以肠溶层分开，该肠溶层用来抵抗崩解，以使该内部成份完整通过胃或被延迟释放。多种物质可被用于该肠溶层或包覆层，该物质包括多种聚合酸及聚合酸与诸如虫胶、鲸腊醇及醋酸纤维素的物质的混合物。
本文所述的RSPO3结合剂或抗体也可被包封于微胶囊中。该微胶囊通过例如凝聚技术或通过界面聚合化制备，例如分别于于胶体药物递送系统中(例如脂质粒、白蛋白微球、微乳化液、纳米微粒及纳米微囊)或于巨乳化液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(异丁烯酸甲酯)微胶囊，如The Science and Practice of Pharmacy,22stEdition,2012,Pharmaceutical Press,London所述。
在某些实施方式中，医药调制剂包括与脂质体复合的本发明的RSPO3结合剂(例如抗体)。产生脂质体的方法是本领域技术人员所知。举例来说，有些脂质体可利通过逆相蒸发含有磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物加以产生。脂质体可被挤压通过定义孔径大小的滤网以产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方式中，持续释放的制剂可被产生。持续释放制剂的适当实例包括含有RSPO3结合剂(例如抗体)的固相疏水性聚合物的半透性基体，其中该基体是呈形状对象的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基体的实例包括聚酯、水凝胶(诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮脯利特(leuprolide acetate)所组成的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
在某些实施方式中，除了施用RSPO3结合剂(例如抗体)的外，该方法或治疗另包含施用至少一种额外的治疗剂。额外的治疗剂可于施用该RSPO3结合剂之前、的同时及/或之后施用。本发明也提供包含RSPO3结合剂与该额外治疗剂的药物组合物。在一些实施方式中，该至少一种额外治疗剂包含1、2、3或更多种额外的治疗剂。
含有两种或两种以上治疗剂的组合疗法通常使用具有不同作用机制的剂，虽然并非必要。使用不同作用机制的剂的组合疗法可能导致加成或协同效应。组合疗法可能允许相较于单一疗法使用较低剂量的各剂，藉以减少该(等)剂的毒性不良反应和/或增加治疗指数。组合疗法可能减少抗药性癌细胞发生的可能性。在一些实施方式中，组合疗法包含影响(例如抑制或杀灭)非致瘤性细胞的治疗剂及影响(例如抑制或杀灭)致瘤性CSC的治疗剂。
在一些实施方式中，RSPO3结合剂与至少一种额外治疗剂的组合导致加成或协同效果。在一些实施方式中，该组合疗法导致该RSPO3结合剂的治疗指数增加。在一些实施方式中，该组合疗法导致该额外剂的治疗指数增加。在一些实施方式中，该组合疗法导致该RSPO3结合剂的毒性和/或不良反应减少。在一些实施方式中，该组合疗法导致该额外剂的毒性和/或不良反应减少。
有用类别的治疗剂包括例如抗微管蛋白剂、耳抑素、DNA次要凹槽结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如铂复合物诸如顺铂(cisplatin)、单(铂)、二(铂)及三核铂复合物及卡铂(carboplatin))、蒽环类(anthracycline)、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法致敏剂、双联霉素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、离子载体、莱克西托素(lexitropsin)、亚硝基尿素、普拉汀诺(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、放射线致敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱或该类似物。在某些实施方式中，第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。在一些实施方式中，第二治疗剂是铂复合物诸如卡铂或顺铂。在一些实施方式中，该额外的治疗剂是铂复合物与紫杉烷的组合。
可与RSPO3结合剂组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方式中，该方法或治疗牵涉施用本发明的RSPO3结合剂或抗体与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒组合的组合。RSPO3结合剂(例如抗体)的治疗可发生于施用化学治疗之前、的同时或之后。组合施用可包括于单一医药调制剂中共投或利用分开的调制剂共投，或以任何顺序连续施用但通常在一段期间内以使所有活性剂可同步展现其生物活性。该化学治疗剂的准备及施用计划可根据制造商的说明使用或由经验丰富的医生凭经验决定。该化学治疗的准备及施用计划也描述于The Chemotherapy SourceBook,4th Edition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
可用于本发明的化学治疗剂包括但不限于：烷化剂诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸盐诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶诸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基优瑞多巴(meturedopa)及优瑞多巴(uredopa)；伸乙亚胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylmelamines)包括阿草特胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)及三羟甲基三聚氰胺(trimethylolmelamime)；氮芥子气诸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯膦酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酸胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、霉法兰(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosourea)诸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、罗氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷诺氮芥(ranimustine)；抗生素诸如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(anthramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、达克霉素(dactinomycin)、正定霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-羰基-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、鸟苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂诸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤类似物诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素诸如卡鲁睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酮(testolactone)；抗肾上腺剂诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatrexate)；度弗胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗密素(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺(2,2',2″-trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；类紫杉醇(taxoids)例如太平洋紫杉醇(TAXOL)及多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；铂类似物诸如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；温诺平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)(XELODA)及上述任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂也包括用来调节或抑制荷尔蒙对肿瘤的作用的抗荷尔蒙剂，诸如抗雌激素剂包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；及抗雄性素剂诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、柳普林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂是顺铂。在某些实施方式中，该额外治疗剂是卡铂。在某些实施方式中，该额外治疗剂是太平洋紫杉醇(紫杉醇(taxol))。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、131R006A、131R006B、131R005/131R007或131R008与顺铂的组合。
在某些实施方式中，该化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的活性的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星(doxorubicin HCl)、柠檬酸正定霉素(daunorubicin citrate)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone HCl)、放线菌素D、依托泊苷(etoposide)、盐酸拓扑替康(topotecan HCl)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)，以及这些任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，该额外治疗剂是伊立替康。因此，在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与拓扑异构酶抑制剂的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与伊立替康的组合。
在某些实施方式中，该化学治疗剂是抗代谢剂。抗代谢剂是一种化学物质，其结构类似正常生化反应所需的代谢物，但仍有足够的不同处以干扰一种或多种细胞正常功能，诸如细胞分裂。抗代谢剂包括但不限于吉西他滨(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、甲胺喋呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)及克拉屈滨(cladribine)，以及这些任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂是吉西他滨。因此，在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与抗代谢剂的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与吉西他滨的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与培美曲塞的组合。
在某些实施方式中，该化学治疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于与微管蛋白结合的剂。在一些实施方式中，该试剂是紫杉烷。在某些实施方式中，该试剂是太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该试剂是太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白结合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel；ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代性实施方式中，该抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，诸如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)或长春地辛(vindesine)或其医药上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，该抗有丝分裂剂是驱动蛋白(kinesin)Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶诸如Aurora A或Plk1的抑制剂。在某些实施方式中，当该与RSPO结合剂组合施用的化学治疗剂是抗有丝分裂剂时，该经治疗的癌或肿瘤是乳腺癌或乳腺肿瘤。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与太平洋紫杉醇的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与吉西他滨及白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)的组合。
在一些实施方式中，额外治疗剂包含诸如小分子的剂。举例来说，治疗可涉及组合施用本发明的RSPO3结合剂(例如抗体)与作为其它肿瘤相关性蛋白质的抑制剂的小分子，其它肿瘤相关性抗原包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF。在某些实施方式中，该额外治疗剂是抑制癌干细胞途径的小分子。在一些实施方式中，该额外治疗剂是缺口途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是Wnt途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是BMP途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是抑制β-连环蛋白信号传导的分子。
在一些实施方式中，额外治疗剂包含生物性分子像是抗体。举例来说，治疗可涉及组合施用本发明的RSPO3结合剂(例如抗体)与拮抗其它肿瘤相关性抗原的其它抗体，包括但不限于与EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF结合的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是与第二RSPO(例如RSPO1、RSPO2和/或RSPO4)结合的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是抗RSPO2抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是抗RSPO1抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂是抗癌干细胞标记的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是与缺口途径的成份结合的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是与Wnt途径的成份结合的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂是抑制癌干细胞途径的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是缺口途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是Wnt途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是BMP途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是抑制β-连环蛋白信号传导的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂是血管生成抑制剂的抗体(例如抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方式中，该额外治疗剂是贝伐珠单抗(bevacizumab)(AVASTIN)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)或西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)。
在一些实施方式中，本文所述的该方法包含施用治疗有效量的RSPO3结合剂与Wnt途径抑制剂的组合。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂为卷曲(FZD)蛋白结合剂(FZD结合剂)。FZD结合剂的非限制性实例可见于美国专利第7,982,013号，其以参照方式整体纳入本文。FZD结合剂可包括但不限于抗FZD抗体。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO结合剂与抗FZD抗体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO结合剂与抗FZD抗体18R5的组合。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂为Wnt蛋白结合剂(Wnt结合剂)。Wnt结合剂的非限制性实例可见于美国专利第7,723,477及7,947,277号、国际专利公开号WO 2011/088127及WO2011/088123，其以参照方式整体纳入本文。Wnt结合剂可包括但不限于抗Wnt抗体及FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与FZD-Fc可溶性受体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与FZD8-Fc可溶性受体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与抗FZD抗体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与抗FZD抗体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与抗FZD抗体18R5的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与FZD-Fc可溶性受体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与FZD8-Fc可溶性受体的组合。
在一些实施方式中，本文所述的该方法包含施用治疗有效量的RSPO结合剂与一种以上的额外治疗剂的组合。因此，在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO结合剂与化学治疗剂及Wnt途径抑制剂的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与化学治疗剂及Wnt途径抑制剂的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与化学治疗剂及抗FZD抗体18R5的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与化学治疗剂及FZD8-Fc可溶性受体的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用RSPO3结合剂与吉西他滨及Wnt途径抑制剂的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与吉西他滨及抗FZD抗体18R5的组合。在一些实施方式中，该方法包含施用抗RSPO3抗体131R002、131R003、131R003的变异体、人源化版本的131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011与吉西他滨及FZD8-Fc可溶性受体的组合。
另外，以本文所述的RSPO3结合剂治疗可包括与其它生物分子组合治疗，像是一种或多种细胞介素(例如淋巴介质、介白素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)，或可伴随手术移除肿瘤、癌细胞或任何其它医师认为必要的治疗。
在某些实施方式中，该治疗涉及施用本发明的RSPO3结合剂(例如抗体)与放射治疗的组合。RSPO3结合剂的治疗可发生于施用放射治疗之前、的同时或之后。该放射治疗的施用计划可由经验丰富的医生决定。
组合施用可包括于单一医药调制剂中共投或利用分开的调制剂共投，或以任何顺序连续施用但通常在一段期间内以使所有活性剂可同步展现其生物活性。
将了解的是，RSPO3结合剂与至少一种额外治疗剂的组合可以任何顺序施用或同时施用。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂将被施用至已先接受第二治疗剂治疗的患者。在某些其它实施方式中，该RSPO3结合剂与第二治疗剂将被实质上同步或同时施用。举例来说，受试对象可能在接受第二治疗剂(例如化学治疗)的疗程时被给予RSPO3结合剂(例如抗体)。在某些实施方式中，RSPO3结合剂将于接受第二治疗剂治疗的一年内被施用。在某些替代性实施方式中，RSPO3结合剂将于接受第二治疗剂的任何治疗的10、8、6、4或2个月内被施用。在某些其它实施方式中，RSPO3结合剂将于接受第二治疗剂的任何治疗的4、3、2或1周内被施用。在一些实施方式中，RSPO3结合剂将于接受第二治疗剂的任何治疗的5、4、3、2或1天内被施用。将另外了解的是，该二(或多)种剂或治疗可在数小时或数分钟内(即实质上同步)被施用至受试对象。
以疾病的治疗而言，本发明的RSPO3结合剂(例如抗体)的适当剂量取决于所需治疗的疾病类型、该疾病的严重性及病程、该疾病的反应性、该RSPO3结合剂或抗体经施用以达治疗或预防目的、先前治疗、该患者的临床病史等，所有皆由主治医师斟酌。该RSPO3结合剂或抗体可经施用一次或在数天至数月期间的治疗系列施用，或直到达成疗效或达到减少的疾病状态(例如肿瘤大小减少)。理想投药计划可自药物累积于患者体内的测量值加以计算，且将视个别抗体或剂的相对强度而异。主治医师可轻易地决定理想剂量、投药方法及重复频率。在某些实施方式中，剂量是0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重、或10mg至50mg/kg体重。在某些实施方式中，该抗体或其它RSPO3结合剂的剂量是约0.1mg至约20mg/kg体重。在某些实施方式中，剂量可于每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在某些实施方式中，该抗体或其它RSPO3结合剂每周给予一次、每二周给予一次或每三周给予一次。
在一些实施方式中，RSPO3结合剂(例如抗体)可以一开始较高的“起始”剂量施用，之后施用一或多次较低剂量。在一些实施方式中，施用的频率也可能改变。在一些实施方式中，投药计划可能包含施用初始剂量，然后每周、每二周、每三周或每月施用一次额外剂量(或“维持”剂量)。举例来说，投药计划可能包含施用起始剂量，然后施用例如一半起始剂量的每周维持剂量。或投药计划可能包含施用起始剂量，然后每隔一周施用例如一半起始剂量的维持剂量。或投药计划可能包含三周施用三次起始剂量，然后每隔一周施用例如相同量的维持剂量。
如本领域技术人员所知，施用任何治疗剂可能导致不良反应和/或毒性。在一些情况中，不良反应和/或毒性非常严重以至于无法施用治疗有效剂量的特定剂。在一些情况中，药物治疗必须中断，并尝试其它剂。然而，许多相同治疗类别的剂通常展现类似的不良反应和/或毒性，表示患者必须停止治疗，或可能的话忍受与该治疗剂有关的不适不良反应。
因此，本发明提供治疗受试对象的癌的方法，该方法包含利用间歇性投药计划施用一或多剂，如此可能减少与施用RSPO3结合剂、化学治疗剂等有关的不良反应和/或毒性。在一些实施方式中，治疗人受试对象的癌的方法包含对该受试对象施用治疗有效剂量的RSPO3结合剂与治疗有效剂量的化学治疗剂的组合，其中所述一种或两种试剂根据间歇性投药计划施用。在一些实施方式中，该间歇性投药计划包含对该受试对象施用初始剂量的RSPO3结合剂，接着大约每2周施用一次RSPO3结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药计划包含对该受试对象施用初始剂量的RSPO3结合剂，接着大约每3周施用一次RSPO3结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药计划包含对该受试对象施用初始剂量的RSPO3结合剂，接着大约每4周施用一次RSPO3结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂利用间歇性投药计划施用，且该化学治疗剂每周施用。
V.包含RSPO结合剂的套组
本发明提供包含本文所述的RSPO3结合剂(例如抗体)的套组，其可被用于实施本文所述的方法。在某些实施方式中，套组包含于一个或多个容器中的至少一种经纯化的抗至少一种人RSPO蛋白的抗体。在一些实施方式中，该套组包含所有实施检测试验所必需和/或足以实施检测试验的成份，包括所有对照物、使用说明及任何必要软件以供结果分析及表达。本领域技术人员将显而易见的是，本发明所揭示的RSPO3结合剂可被轻易纳入该领域所广为周知的已建立的套组格式之一。
本发明另提供包含RSPO3结合剂(例如抗RSPO3抗体)以及至少一种额外治疗剂的套组。在某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂是化学治疗剂。在某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂是Wnt途径抑制剂。在某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂是血管生成抑制剂。
本发明的实施方式可通过参考下列非限制性实施例进一步定义，以下实施例描述本发明的某些抗体的详细制备及使用本发明的抗体的方法。本领域技术人员将显而易见的是，许多在材料及方法上的调整可加以实施而不背离本发明的范围。
实施例1
RSPO及LGR在人肿瘤中的表达
来自大量人患者的正常组织、良性肿瘤及恶性肿瘤样本的mRNA通过微阵列技术(Genelogic BioExpress Datasuite)分析。此数据显示在多种肿瘤类型包括肾、子宫内膜及卵巢的恶性组织中，RSPO1的表达水平相较于正常组织上升。注意到RSPO1经常过表达于卵巢癌(图1A)。此外，此数据显示在多种肿瘤类型包括卵巢、胰脏及肺脏的恶性组织中，RSPO3的表达水平相较于正常组织上升(图1C)。此外发现，相较于正常组织，LGR5及LGR6过表达于恶性乳腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤及卵巢肿瘤，然而LGR4过表达于肺肿瘤。相较于其它乳腺肿瘤亚型，LGR5及LGR6的过表达似乎局限于三阴性(ERnegPRnegHER2neg)乳腺肿瘤。
RNA分离自生长于鼠异种移植的一系列人肿瘤。该RNA样本利用已建立的用于产生标记cRNA的Affymetrix程序制备及处理。该经处理的RNA与AffymetrixHG-U133plus 2.0微阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)杂交，如制造商技术手册所述。在杂交后，该微阵列经清洗、扫描及分析。经扫描的数组背景调整及信号强度正常化利用GCRMA算法(Bioconductor,www.bioconductor.org)进行。
特定人RSPO及人LGR经评估：RSPO1(241450_at)、RSPO2(1554012_at)、RSPO3(228186_s_at)、RSPO4(237423_at)、LGR4(218326_s_at)、LGR5(210393_at)及LGR6(227819_at)。微阵列分析显示，虽然LGR4及LGR6广泛表达于几乎所有肿瘤，发现许多肿瘤大幅过表达仅特定RSPO家族成员及LGR5(表2)，虽然这些表达水平并未与正常组织中的表达水平比较。通常在给定肿瘤中只有单一RSPO家族成员高度表达，显示在该RSPO家族内可能有功能性重复。
表2
实施例2
RSPO蛋白与LGR5的结合
细胞表面LGR5蛋白通过连接人LGR5的氨基酸22至564与N端FLAG标签，再连接CD4的跨膜结构域与C端GFP蛋白标签(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)，使用标准重组DNA技术产生。RSPO-Fc构建体利用标准重组DNA技术产生。特别地，全长人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4符合读框地连接至人Fc区，该重组RSPO-Fc蛋白利用杆状病毒(baculovirus)于昆虫细胞表达。该融合蛋白利用蛋白A层析自该昆虫培养基纯化。
HEK-293细胞利用该FLAG-LGR5-CD4TM-GFP构建体瞬时转染。经48小时后，将转染细胞悬浮于包含2％FBS及肝素的冰冷PBS中，并于10μg/ml RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc、RSPO4-Fc或FZD8-Fc融合蛋白存在下培养15分钟。以100μlPE共轭的抗人Fc二级抗体进行二次培养以检测与Fc融合蛋白结合的细胞。与抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)培养的细胞作为阳性对照，与抗PE抗体培养者作为阴性对照。该细胞于FACSCalibur设备(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析，数据利用FlowJo软件处理。
如图2所示，RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4皆与表达在HEK-293细胞表面上的LGR5结合，然而FZD8(阴性对照)不与LGR5结合。
RSPO蛋白与LGR5之间的结合亲和性通过表面电浆共振分析。可溶性LGR5-Fc构建体利用标准重组DNA技术产生。特别地，人LGR5的氨基酸1至564符合读框地连接至人Fc，该重组LGR5-Fc融合蛋白利用杆状病毒于昆虫细胞表达。该LGR5-Fc融合蛋白利用蛋白A层析自该昆虫培养基纯化。切割该LGR5信号序列产生了包含LGR5的氨基酸22至564的成熟LGR5-Fc融合蛋白。重组RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc及RSPO4-Fc融合蛋白利用标准胺类化学(NHS/EDC)固定于CM5芯片。将二倍稀释的可溶性LGR5-Fc注射至芯片表面(100nM至0.78nM)。利用Biacore LifeSciences(GE Healthcare)的Biacore 2000系统收集不同时间的动力学数据，并利用同步整体拟合方程式拟合数据，以产生各RSPO蛋白的亲和常数(KD值)(表3)。
表3
LGR5(nM)
RSPO1 110
RSPO2 14
RSPO3 ＜1.0
RSPO4 73
人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4皆与LGR5结合，显示RSPO蛋白可能是LGR蛋白的配体。
实施例3
识别抗RSPO3抗体
筛选哺乳动物细胞抗体库，识别两种抗RSPO3抗体131R002及131R003。后续的序列数据显示，抗体131R002及131R003具有相同的轻链序列但不同的重链序列。
抗体131R002及131R003的KD利用Biacore LifeSciences(GE Healthcare)的Biacore 2000系统测定。重组人RSPO3蛋白经生物素基化，并以400至700ru包覆密度被俘获于链霉抗生物素蛋白包覆芯片(GE Healthcare)上。该抗体以HBS-P(0.01MHEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005％v/v表面活性剂P20)自100nM连续2倍稀释至0.78nM，并注射于芯片表面。收集一段时间的动力学数据并将该动力学数据利用同步整体拟合方程式拟合以产生各抗体的亲和性常数(KD值)。
抗体131R002对人RSPO3的亲和常数(KD)为8.2nM，抗体131R003对人RSPO3的KD为7.3nM。
实施例4
抗RSPO3抗体抑制β-连环蛋白活性的体外测试
HEK-293细胞经6倍TCF-荧光素酶报告载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染。经24至48小时后，经转染的HEK-293细胞在抗RSPO3抗体131R002及131R003存在下，与WNT3a(5ng/ml)及人RSPO3(10ng/ml,R&D BioSystems,Minneapolis,MN)的组合一起培养。在细胞中添加经四倍连续稀释20μg/ml至0.02μg/ml的抗体131R002及131R003。在对照方面，细胞与WNT3a及RSPO3的组合、仅WNT3a、仅RSPO3或无添加下一起培养。该细胞经培养16小时后，利用荧光素酶检测系统(Promega,Madison,WI)如制造商说明所述测量荧光素酶活性。
如图3所示，抗RSPO3抗体131R002及131R003各自以剂量依赖形式减少RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。这些结果证实，抗体131R002及131R003为RSPO3的特异性抑制剂，且能减少和/或阻断RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。
实施例5
RSPO3抗体的亲和性成熟及人源化
抗RSPO3抗体131R003经亲和性成熟处理，并鉴定出多种变异体。一种131R003变异体相较于亲代131R003抗体，具有经改变的重链CDR1(SEQ ID NO:34)。第二种变异体相较于亲代131R003，具有经改变的重链CDR3(SEQ ID NO:35)。所产生的另一种变异体相较于亲代131R003包含经改变的重链CDR1及CDR3。
HEK-293细胞经6倍TCF-荧光素酶报告载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染。在24至48小时后，该经转染的HEK-293细胞在抗RSPO3抗体131R003、131R003CDR1变异体及131R003CDR3变异体存在下与WNT3a及人RSPO3的组合一起培养。在细胞中添加经5倍连续稀释20μg/ml至0.006μg/ml的131R003、131R003CDR1变异体及131R003CDR3变异体。在对照方面，细胞与WNT3a及RSPO3的组合、仅WNT3a、仅RSPO3、对照抗体或无添加下一起培养。该细胞经培养16小时后，利用荧光素酶检测系统(Promega,Madison,WI)如制造商说明所述测量荧光素酶活性。
如图4所示，抗RSPO3抗体131R003CDR1变异体及131R003CDR3变异体各自以剂量依赖形式且比亲代131R003更低的浓度减少RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。这些结果证实，131R003变异体保留亲代131R003的特征，即它们是RSPO3的特异性抑制剂且能减少和/或阻断RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。此外，这些结果证实131R003变异体比亲代131R003具有更佳的活性。
131R003变异体的人源化形式利用标准技术产生。人源化抗体h131R005、h131R007、h131R008、h131R010、h131R011包含相较于亲代131R003抗体经改变的重链CDR3。人源化131R006B包含相较于亲代131R003抗体经改变的重链CDR3。抗体h131R005/131R007、h131R010及h131R011相较于抗体131R006B包含架构区3中的多个氨基酸取代。抗体h131R005/131R007、h131R006及h131R011为IgG2抗体。抗体h131R008及h131R010为IgG1抗体。抗体h131R005/131R007、h131R010及h131R011包含相同的重链可变区。抗体h131R010及h131R011包含相同的轻链可变区，其与h131R005/131R007的轻链可变区不同。
编码131R010抗体的重链的质粒依照布达佩斯条约的规定，于2013年6月18日以ATCC编号PTA-120420寄存于美国菌种保存中心(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)。编码131R010抗体的轻链的质粒依照布达佩斯条约的规定，于2013年6月18日以ATCC编号PTA-120421寄存于美国菌种保存中心(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)。
实施例6
通过抗RSPO抗体抑制体内卵巢肿瘤生长
游离OMP-OV38卵巢肿瘤细胞(细胞数1×105)经注射至6至8周龄的NOD/SCID小鼠。让肿瘤生长39天直到达到平均体积150mm3。小鼠经随机分组(每组n＝8)，并接受抗RSPO1抗体89M5与抗RSPO3抗体131R003的组合；抗RSPO1抗体89M5、抗RSPO3抗体131R003与紫杉醇的组合；紫杉醇作为单一试剂；或对照抗体的治疗。抗体剂量为20mg/kg每周一次，紫杉醇的剂量为15mg/ml每周一次。抗体与紫杉醇的施用经由腹腔注射实施。监测肿瘤生长，于所示时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±SEM表示。
如图5所示，抗RSPO1与抗RSPO3抗体的组合抑制OMP-OV38卵巢肿瘤生长。意外的是，抗RSPO1抗体89M5、抗RSPO3抗体131R002与紫杉醇的组合抑制肿瘤生长的程度，显著高于单独使用紫杉醇或单独使用抗体组合。
游离OMP-OV38卵巢肿瘤细胞(细胞数1×105)经注射至6至8周龄的NOD/SCID小鼠。让肿瘤生长35天直到达到平均体积140mm3。小鼠经随机分组(每组n＝10)，并经抗RSPO3抗体131R002；抗RSPO1抗体89M5；紫杉醇；89M5与紫杉醇的组合；131R002与紫杉醇的组合；89M5与131R002的组合；89M5、131R002与紫杉醇的组合；或对照抗体治疗。抗体剂量为20mg/kg每周一次，紫杉醇的剂量为15mg/ml每周一次施用至第46天，随后施用剂量为7.5mg/kg。抗体与紫杉醇的施用经由腹腔注射实施。监测肿瘤生长，于所示时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±SEM表示。
如图6所示，相较于对照抗体，抗RSPO1抗体89M5与抗RSPO3抗体131R002的组合抑制OMP-OV38卵巢肿瘤生长。抗RSPO1抗体89M5与紫杉醇的组合或抗RSPO3抗体131R002与紫杉醇的组合相较于单独使用紫杉醇无差别。然而，意外的是，抗RSPO189M5、抗RSPO3抗体131R002与紫杉醇的组合显示高于单独使用紫杉醇的活性。
实施例7
通过抗RSPO3抗体抑制体内肺肿瘤生长
在OMP-LU45非小细胞肺肿瘤中，已观察到CD201+细胞比起CD201-细胞更具致瘤性。另外，发现RSPO3高度表达于CD201+细胞族群。游离且经分选的OMP-LU45CD44+CD201+肺肿瘤细胞(细胞数5×104)经注射至6至8周龄的NOD/SCID小鼠。让肿瘤生长38天直到达到平均体积140mm3。小鼠经随机分组(每组n＝10)，并以抗RSPO3抗体131R002或对照抗体治疗。抗体剂量为25mg/kg每周一次，抗体施用经由注射至腹腔内实施。监测肿瘤生长，于所示时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±SEM表示。
在具有第二肺肿瘤的试验中，游离OMP-LU25肺肿瘤细胞(细胞数5×104)经注射至6至8周龄的NOD/SCID小鼠。让肿瘤生长48天直到达到平均体积110mm3。小鼠经随机分组(每组n＝9)，并以抗RSPO3抗体131R002或对照抗体治疗。抗体剂量为25mg/kg每周一次，抗体施用经由注射至腹腔内实施。监测肿瘤生长，于所示时间点以电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±SEM表示。
如图7A及7B所示，相较于对照抗体，抗RSPO抗体131R002抑制两种肺肿瘤OMP-LU45及OMP-LU25的生长。
实施例8
抗RSPO3抗体抑制β-连环蛋白活性
HEK-293细胞经6倍TCF-荧光素酶报告载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染。经24至48小时后，该经转染的HEK-293细胞在抗RSPO3抗体131R002、131R006B或131R007存在下，与WNT3a条件培养基(5ng/ml)及人RSPO3(10ng/ml,R&D BioSystems)的组合一起培养。在细胞中添加经5倍连续稀释20μg/ml至0.0064μg/ml的抗体131R002、131R006或131R007。在对照方面，细胞与单独的WNT3a条件培养基、WNT3a条件培养基与人RSPO3的组合一起培养或无添加仅细胞培养。该细胞经培养16小时后，利用荧光素酶检测系统(Promega,Madison,WI)如制造商说明所述测量荧光素酶活性。
如图8所示，所有三种抗RSPO3抗体皆以剂量依赖形式减少WNT3a/RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。人源化抗体131R006B及131R007似乎比抗体131R002具有更高的抑制β-连环蛋白活性的能力。这些结果证实，人源化抗体131R006B及131R007比起131R002为更强的RSPO3抑制剂，且能减少和/或阻断WNT3a/RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导。
实施例9
抑制RSPO3与LGR5的结合
HEK-293T细胞经编码人LGR5的胞外域(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)的cDNA表达载体转染。转染细胞与重组RSPO3－生物素融合蛋白在抗RSPO3抗体131R006B或131R007存在下一起培养。不与抗体一起培养的细胞为对照组。用PBS清洗细胞，RSPO3与表达LGR5的转染细胞的结合通过添加PE共轭链霉抗生物素蛋白并以流式细胞分析测定。
如图9所示，抗RSPO3抗体131R006B及131R007高度有效地阻断RSPO3与LGR5表达细胞的结合。
实施例10
RSPO3抗体的结合亲和性
RSPO3抗体131R002、131R003、131R003CDR3变异体、h131R007、h131R008及h131R011的KD利用Biacore LifeSciences(GE Healthcare)的Biacore 2000系统测定。所使用的方法与实施例3所述的方法不同。山羊抗人IgG抗体利用标准胺类化学(NHS/EDC)与羧甲基-葡聚糖(CM5)SPR芯片偶合，并以乙醇胺封闭。抗体(经纯化的抗体或培养上清液)以HBS-P-BSA(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005％v/v聚山梨醇酯20，100ug/ml BSA)稀释至浓度10μg/ml，经由该抗人IgG抗体捕捉至芯片上。人RSPO3(R&D Systems)以HBS-P-BSA稀释，自300nM 2倍连续稀释至37.5nM，并依次注射在经捕捉的抗RSPO3抗体上方。测量各浓度的RSPO3结合及解离。在每次抗原注射后，注射5μl的100mM H3P04以移除抗原－抗体复合物，然后再进行下一次注射。收集一段时间的动力学数据并将该动力学数据利用同步整体拟合方程式拟合以产生各抗体的亲和性常数(KD值)(表4)。
表4
RSPO3抗体 KD
131R002(IgG2) 1.3nM
131R003(IgG2) 1.9nM
131R003 CDR3变异体(IgG2) 1.7nM
h131R007(IgG2) 654pM
h131R008(IgG1) 876pM
h131R010(IgG1) ND
h131R011(IgG2) 686pM
在其它试验中，抗体h131R008对人RSPO3具有低至448pM的KD，对人RSPO1或RSPO2不具可检测的结合，对人RSPO4具有微弱结合。抗体h131R008对鼠RSPO3具有248pM的KD，对鼠RSPO1或RSPO2不具可检测的结合，对鼠RSPO4具有微弱结合。
实施例11
抗RSPO3抗体抑制体内肺肿瘤生长
根据微阵列数据中的高水平RSPO3表达，选择用来测试的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞是NCI-H2030。将NCI-H2030细胞(1×106)注射至NOD-SCID小鼠。让肿瘤生长大约60天直到达到平均体积100mm3。荷瘤小鼠被随机分成4组(每组n＝7至9)。荷瘤小鼠利用抗RSPO3抗体131R002、卡铂、抗RSPO3抗体131R002与卡铂的组合或对照抗体治疗。抗体剂量为25mg/kg每周一次。卡铂剂量为50mg/kg每周一次。监测肿瘤生长，于所示的治疗后天数以电子卡尺测量肿瘤体积。
如图10所示，抗RSPO3抗体与卡铂组合的治疗比起单独使用卡铂或单独使用抗体，更佳地抑制NCI-H2030肿瘤生长。
OMP-LU102是源自患者的非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植，其根据微阵列数据中的高量RSPO3表达被选择用来测试。将OMP-LU102肺肿瘤细胞(1×105)注射至NOD-SCID小鼠。让肿瘤生长22天直到达到平均体积90mm3。荷瘤小鼠被随机分成4组(每组n＝10)。荷瘤小鼠利用抗RSPO3抗体131R002、卡铂、抗RSPO3抗体131R002与卡铂的组合或对照抗体治疗。抗体剂量为25mg/kg每周一次。卡铂剂量为50mg/kg每周一次。监测肿瘤生长，于所示的治疗后天数以电子卡尺测量肿瘤体积。
如图11A所示，抗RSPO3抗体的单一试剂治疗抑制OMP-LU102肺肿瘤生长，但与卡铂组合治疗时的效应远高于单一试剂治疗。
在治疗后，自四个试验组的各肿瘤制备RNA。基因表达以微阵列分析特征化。如图11B的基因组富集分析显示，抗RSPO3抗体治疗(不论是单一试剂或与卡铂组合)抑制正常干细胞或癌干细胞的多种特征基因组的表达。仅用卡铂治疗没有这种对基因表达的影响。
实施例12
抗RSPO3抗体抑制体内胰肿瘤生长
OMP-PN35是源自患者的胰管腺癌(PDAC)异种移植，其根据微阵列数据中的高量RSPO3表达被选择用来测试。将OMP-PN35(1×105)肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠。让肿瘤生长30天直到达到平均体积90mm3。荷瘤小鼠被随机分成4组(每组n＝10)。荷瘤小鼠经抗RSPO3抗体131R002、吉西他滨加白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、抗RSPO3抗体与吉西他滨加白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)治疗。抗体剂量为25mg/kg每周一次。吉西他滨剂量为20mg/kg每周一次，白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)的剂量为30mg/kg每周一次。监测肿瘤生长，于所示的治疗后天数以电子卡尺测量肿瘤体积。
图12A显示所有四个治疗组的结果，图12B仅显示组合治疗的放大图。图12A及12B显示，相较于单独使用吉西他滨及白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)，抗RSPO3抗体与吉西他滨加白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)的组合抑制OMP-PN35胰腺肿瘤生长的效果更好。
实施例13
抗RSPO3抗体抑制β-连环蛋白活性
HEK-293细胞经6倍TCF-荧光素酶报告载体(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)转染。经24至48小时后，该经转染的HEK-293细胞在抗RSPO3抗体h131R007或h131R010存在下，与WNT3a条件培养基(5ng/ml)及人RSPO3(2ng/ml,R&DBioSystems)的组合一起培养。在细胞中添加经5倍连续稀释20μg/ml至0.0064μg/ml的抗体h131R007或h131R010。在对照方面，细胞与单独的WNT3a条件培养基、WNT3a条件培养基与人RSPO3的组合一起培养或无添加仅细胞培养。该细胞经培养16小时后，利用荧光素酶检测系统(Promega,Madison,WI)如制造商说明所述测量荧光素酶活性。
如图13所示，抗体h131R010以剂量依赖形式减少WNT3a/RSPO3诱导的β-连环蛋白信号传导且与h131R007的抑制程度类似。由于h131R010抑制β-连环蛋白信号传导的程度与h131R007类似，因此显而易见，抗RSPO3抗体的活性不受转换成IgG1同型的影响。
实施例14
抗RSPO3抗体抑制体内肺肿瘤生长
OMP-LU25是源自患者的非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植，其根据微阵列数据中的高量RSPO3表达被选择用来测试。将OMP-LU25肿瘤细胞(5×104)注射至NOD-SCID小鼠。让肿瘤生长33天直到达到平均体积120mm3。荷瘤小鼠被随机分成4组(每组n＝9)。荷瘤小鼠经对照抗体、抗RSPO3抗体131R008、太平洋紫杉醇(paclitaxel)或抗RSPO3抗体131R008与太平洋紫杉醇的组合治疗。抗体剂量为每周20mg/kg。太平洋紫杉醇剂量为每周15mg/kg。监测肿瘤生长，于所示的治疗后天数以电子卡尺测量肿瘤体积。
如图14所示，当以单一试剂使用及与化学疗法组合使用时，抗RSPO3抗体131R008抑制OMP-LU25肿瘤生长。另外，抗RSPO3抗体131R008与太平洋紫杉醇的组合导致肿瘤消退。
应了解本文所描述的实施例及实施方式仅供说明示范的目的，各种对于其修饰或改变将由本领域技术人员建议且将被纳入本申请案的精神与范围内。
所有本文所提及的公开数据、专利、专利申请案、网站及编号/数据库序列包括多核苷酸及多肽序列在此以参照方式整体纳入本文以符合所有目的，和特别且独立指出个别公开资料、专利、专利申请案、网站或编号/数据库序列各自以参照方式被纳入的范围相同。
本说明书中公开的序列如下：
含信号序列的人RSPO1蛋白序列(SEQ ID NO:1)
MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA
含信号序列的人RSPO2蛋白序列(SEQ ID NO:2)
MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
含信号序列的人RSPO3蛋白序列(SEQ ID NO:3)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
含信号序列的人RSPO4蛋白序列(SEQ ID NO:4)
MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP
不含预测信号序列的人RSPO3蛋白序列(SEQ ID NO:5)
QNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
人RSPO3弗林蛋白酶样结构域1(SEQ ID NO:6)
PNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYG
人RSPO3弗林蛋白酶样结构域2(SEQ ID NO:7)
INKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEA
人RSPO3血小板反应素结构域(SEQ ID NO:8)
HCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQ
131R002/131R003重链CDR1(SEQ ID NO:9)
KASGYTFTDYS
131R002/131R003重链CDR2(SEQ ID NO:10)
IYPSNGDS
131R002/131R003重链CDR3(SEQ ID NO:11)
ATYFANYFDY
131R002/131R003轻链CDR1(SEQ ID NO:12)
QSVDYDGDSYM
131R002/131R003轻链CDR2(SEQ ID NO:13)
AAS
131R002/131R003轻链CDR3(SEQ ID NO:14)
QQSNEDPLT
131R002重链可变区(SEQ ID NO:15)
QVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSSSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANYFDYWGQGTTLTVSSAST
131R003重链可变区(SEQ ID NO:16)
QVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSYSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANYFDYWGQGTTLTVSSAST
131R002/131R003轻链可变区(SEQ ID NO:17)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
131R002重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:18)
CAGGTACAATTGCAAGAATCCGGACCCGAACTTGTGAAGCCCGGAGCGTCAGTCAAGATCTCGTGTAAGGCCAGCGGGTACACCTTTACGGATTATTCGATCCATTGGGTAAAACAGAATCACGGGAAGTCGCTCGACTGGATTGGTTATATCTACCCGTCCAACGGTGATTCGGGATACAACCAGAAGTTCAAAAATCGGGCCACACTTACAGTGGACACATCGTCGTCAACTGCATATCTCGAGGTCCGCAGACTGACGTTTGAGGACTCAGCTGTCTACTATTGCGCGACTTATTTCGCCAACTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGGACGACACTGACGGTCAGCTCCGCGAGCACC
131R003重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:19)
CAGGTGCAACTTAAACAGTCGGGGCCTGAGTTGGTCAAACCAGGAGCCTCAGTAAAGATTAGCTGCAAAGCATCAGGTTATACCTTTACGGATTACTCGATCCACTGGGTGAAGCAGAACCACGGAAAGTCACTGGATTGGATCGGGTACATCTACCCCTCGAATGGAGATTCGGGGTATAACCAAAAGTTCAAAAACCGGGCCACGCTGACTGTGGACACGTCGTATTCCACCGCATATTTGGAAGTCCGCAGACTCACGTTCGAGGACTCCGCGGTATACTATTGTGCCACATACTTTGCGAATTACTTTGACTACTGGGGTCAGGGCACAACGCTTACTGTCTCCAGCGCGTCAACA
131R002/131R003轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:20)
GACATCGTGCTCACACAGAGCCCTGCATCGCTCGCAGTATCGCTTGGTCAGCGAGCGACCATTTCATGCAAAGCGTCACAATCGGTAGATTACGACGGAGACTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCCCCGAAGTTGCTCATCTACGCCGCGTCCAATCTGGAGTCAGGCATTCCCGCCAGATTCAGCGGGAGCGGGTCAGGAACGGATTTTACCCTCAATATCCATCCGGTAGAGGAGGAAGATGCGGCGACTTACTATTGTCAGCAGTCGAATGAGGACCCACTCACGTTCGGGGCTGGAACAAAACTGGAACTTAAACGG
含下划线所示的预测信号序列的131R002重链氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSSSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含下划线所示的预测信号序列的131R003重链氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSYSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含下划线所示的预测信号序列的131R002/131R003轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
含预测信号序列的131R002重链核苷酸序列(SEQ ID NO:24)
ATGAAACACTTGTGGTTCTTTCTTTTGCTGGTGGCAGCGCCTAGGTGGGTGCTCAGCCAGGTACAATTGCAAGAATCCGGACCCGAACTTGTGAAGCCCGGAGCGTCAGTCAAGATCTCGTGTAAGGCCAGCGGGTACACCTTTACGGATTATTCGATCCATTGGGTAAAACAGAATCACGGGAAGTCGCTCGACTGGATTGGTTATATCTACCCGTCCAACGGTGATTCGGGATACAACCAGAAGTTCAAAAATCGGGCCACACTTACAGTGGACACATCGTCGTCAACTGCATATCTCGAGGTCCGCAGACTGACGTTTGAGGACTCAGCTGTCTACTATTGCGCGACTTATTTCGCCAACTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGGACGACACTGACGGTCAGCTCCGCGAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
含预测信号序列的131R003重链核苷酸序列(SEQ ID NO:25)
ATGAAGCATCTTTGGTTCTTCCTGCTCTTGGTGGCTGCGCCGAGGTGGGTGCTCAGCCAGGTGCAACTTAAACAGTCGGGGCCTGAGTTGGTCAAACCAGGAGCCTCAGTAAAGATTAGCTGCAAAGCATCAGGTTATACCTTTACGGATTACTCGATCCACTGGGTGAAGCAGAACCACGGAAAGTCACTGGATTGGATCGGGTACATCTACCCCTCGAATGGAGATTCGGGGTATAACCAAAAGTTCAAAAACCGGGCCACGCTGACTGTGGACACGTCGTATTCCACCGCATATTTGGAAGTCCGCAGACTCACGTTCGAGGACTCCGCGGTATACTATTGTGCCACATACTTTGCGAATTACTTTGACTACTGGGGTCAGGGCACAACGCTTACTGTCTCCAGCGCGTCAACAAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
含预测信号序列的131R002/131R003轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:26)
ATGAAGCACCTCTGGTTCTTTCTTCTTCTGGTCGCAGCGCCGAGATGGGTACTTAGCGACATCGTGCTCACACAGAGCCCTGCATCGCTCGCAGTATCGCTTGGTCAGCGAGCGACCATTTCATGCAAAGCGTCACAATCGGTAGATTACGACGGAGACTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCCCCGAAGTTGCTCATCTACGCCGCGTCCAATCTGGAGTCAGGCATTCCCGCCAGATTCAGCGGGAGCGGGTCAGGAACGGATTTTACCCTCAATATCCATCCGGTAGAGGAGGAAGATGCGGCGACTTACTATTGTCAGCAGTCGAATGAGGACCCACTCACGTTCGGGGCTGGAACAAAACTGGAACTTAAACGGACTGTGGCGGCTCCCTCAGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAACAATTGAAGTCGGGTACTGCCTCCGTCGTCTGTTTGTTGAACAACTTTTATCCGAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAATGCGCTGCAGAGCGGTAACTCGCAAGAGTCAGTCACAGAGCAAGACTCGAAGGATTCGACGTATTCGCTCAGCAGCACATTGACGCTGTCGAAGGCAGATTACGAGAAACACAAGGTGTACGCGTGCGAGGTCACCCATCAGGGATTGTCGTCACCCGTGACGAAATCCTTTAACCGCGGAGAATGCTGA
不含预测信号序列的131R002重链氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
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不含预测信号序列的131R003重链氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
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不含预测信号序列的131R002/131R003轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不含预测信号序列的131R002重链氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
CAGGTACAATTGCAAGAATCCGGACCCGAACTTGTGAAGCCCGGAGCGTCAGTCAAGATCTCGTGTAAGGCCAGCGGGTACACCTTTACGGATTATTCGATCCATTGGGTAAAACAGAATCACGGGAAGTCGCTCGACTGGATTGGTTATATCTACCCGTCCAACGGTGATTCGGGATACAACCAGAAGTTCAAAAATCGGGCCACACTTACAGTGGACACATCGTCGTCAACTGCATATCTCGAGGTCCGCAGACTGACGTTTGAGGACTCAGCTGTCTACTATTGCGCGACTTATTTCGCCAACTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGGACGACACTGACGGTCAGCTCCGCGAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
不含预测信号序列的131R003重链氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
CAGGTGCAACTTAAACAGTCGGGGCCTGAGTTGGTCAAACCAGGAGCCTCAGTAAAGATTAGCTGCAAAGCATCAGGTTATACCTTTACGGATTACTCGATCCACTGGGTGAAGCAGAACCACGGAAAGTCACTGGATTGGATCGGGTACATCTACCCCTCGAATGGAGATTCGGGGTATAACCAAAAGTTCAAAAACCGGGCCACGCTGACTGTGGACACGTCGTATTCCACCGCATATTTGGAAGTCCGCAGACTCACGTTCGAGGACTCCGCGGTATACTATTGTGCCACATACTTTGCGAATTACTTTGACTACTGGGGTCAGGGCACAACGCTTACTGTCTCCAGCGCGTCAACAAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
不含预测信号序列的131R002/131R003轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:32)
GACATCGTGCTCACACAGAGCCCTGCATCGCTCGCAGTATCGCTTGGTCAGCGAGCGACCATTTCATGCAAAGCGTCACAATCGGTAGATTACGACGGAGACTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCCCCGAAGTTGCTCATCTACGCCGCGTCCAATCTGGAGTCAGGCATTCCCGCCAGATTCAGCGGGAGCGGGTCAGGAACGGATTTTACCCTCAATATCCATCCGGTAGAGGAGGAAGATGCGGCGACTTACTATTGTCAGCAGTCGAATGAGGACCCACTCACGTTCGGGGCTGGAACAAAACTGGAACTTAAACGGACTGTGGCGGCTCCCTCAGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAACAATTGAAGTCGGGTACTGCCTCCGTCGTCTGTTTGTTGAACAACTTTTATCCGAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAATGCGCTGCAGAGCGGTAACTCGCAAGAGTCAGTCACAGAGCAAGACTCGAAGGATTCGACGTATTCGCTCAGCAGCACATTGACGCTGTCGAAGGCAGATTACGAGAAACACAAGGTGTACGCGTGCGAGGTCACCCATCAGGGATTGTCGTCACCCGTGACGAAATCCTTTAACCGCGGAGAATGCTGA
FLAG标签(SEQ ID NO:33)
DYKDDDDK
131R003重链CDR1变异体(SEQ ID NO:34)
KASGYTFTSYTF
131R003重链CDR3变异体(SEQ ID NO:35)
ATYFANNFDY
131R003重链可变区-变异体1(SEQ ID NO:36)
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131R003重链可变区-变异体2(SEQ ID NO:37)
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含下划线所示的预测信号序列的131R003重链变异体1(SEQ ID NO:38)
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不含预测信号序列的131R003重链变异体1(SEQ ID NO:39)
QVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSYSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含预测信号序列的131R003重链变异体1核酸(SEQ ID NO:40)
ATGAAGCATCTTTGGTTCTTCCTGCTCTTGGTGGCTGCGCCGAGGTGGGTGCTCAGCCAGGTGCAACTTAAACAGTCGGGGCCTGAGTTGGTCAAACCAGGAGCCTCAGTAAAGATTAGCTGCAAAGCATCAGGTTATACCTTTACGGATTACTCGATCCACTGGGTGAAGCAGAACCACGGAAAGTCACTGGATTGGATCGGGTACATCTACCCCTCGAATGGAGATTCGGGGTATAACCAAAAGTTCAAAAACCGGGCCACGCTGACTGTGGACACGTCGTATTCCACCGCATATTTGGAAGTCCGCAGACTCACGTTCGAGGACTCCGCGGTATACTATTGTGCCACATACTTTGCGAATAACTTTGACTACTGGGGTCAGGGCACAACGCTTACTGTCTCCAGCGCGTCAACAAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
含下划线所示的预测信号序列的131R003重链变异体2(SEQ ID NO:41)
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不含预测信号序列的131R003重链变异体2(SEQ ID NO:42)
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含预测信号序列的131R003重链变异体2核酸(SEQ ID NO:43)
ATGAAGCATCTTTGGTTCTTCCTGCTCTTGGTGGCTGCGCCGAGGTGGGTGCTCAGCCAGGTGCAACTTAAACAGTCGGGGCCTGAGTTGGTCAAACCAGGAGCCTCAGTAAAGATTAGCTGCAAAGCATCAGGATACACCTTCACTAGCTATACATTCCACTGGGTGAAGCAGAACCACGGAAAGTCACTGGATTGGATCGGGTACATCTACCCCTCGAATGGAGATTCGGGGTATAACCAAAAGTTCAAAAACCGGGCCACGCTGACTGTGGACACGTCGTATTCCACCGCATATTTGGAAGTCCGCAGACTCACGTTCGAGGACTCCGCGGTATACTATTGTGCCACATACTTTGCGAATAACTTTGACTACTGGGGTCAGGGCACAACGCTTACTGTCTCCAGCGCGTCAACAAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
人源化131R003抗体
人源化131R005/131R007/131R008/131R010/131R011重链可变区(SEQ ID NO:44)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
人源化131R006A重链可变区(SEQ ID NO:45)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTFHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
含下划线所示的预测信号序列的人源化131R005/131R007/131R011重链(IgG2)(SEQ ID NO:46)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含下划线所示的预测信号序列的人源化131R006A重链
(SEQ ID NO:47)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTFHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测信号序列的人源化131R005/131R007/131R011重链(IgG2)
(SEQ ID NO:48)
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不含预测信号序列的人源化131R006A重链
(SEQ ID NO:49)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTFHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人源化131R005/131R007重链可变区核酸
(SEQ ID NO:50)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCA
人源化131R006A重链可变区核酸(SEQ ID NO:51)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATACATTCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCA
含预测信号序列的人源化131R005/131R007重链核酸(SEQ ID NO:52)
ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTCCTCCTTGTCGCCGCTCCACGCTGGGTGCTTTCCCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
含预测信号序列的人源化131R006A重链核酸(SEQ ID NO:53)
ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTCCTCCTTGTCGCCGCTCCACGCTGGGTGCTTTCCCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATACATTCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
不含预测信号序列的人源化131R005/131R007重链核酸(SEQ ID NO:54)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
不含预测信号序列的人源化131R006A重链核酸(SEQ ID NO:55)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATACATTCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:56)
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人IgG2重链恒定区(SEQ ID NO:57)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3重链恒定区(SEQ ID NO:58)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:59)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人IgG2重链恒定区(13A链变异体)(SEQ ID NO:60)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2重链恒定区(13B链变异体)(SEQ ID NO:61)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人源化131R006B重链可变区(SEQ ID NO:62)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTVDTSYSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
含下划线所示的预测信号序列的人源化131R006B重链(SEQ ID NO:63)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTVDTSYSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测信号序列的人源化131R006B重链(SEQ ID NO:64)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTVDTSYSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人源化131R006B重链可变区核酸(SEQ ID NO:65)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCGTGGATACCTCATACTCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCA
含序列信号的人源化131R006B重链核酸(SEQ ID NO:66)
ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTCCTCCTTGTCGCCGCTCCACGCTGGGTGCTTTCCCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCGTGGATACCTCATACTCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
不含预期序列信号的人源化131R006B重链核酸(SEQ ID NO:67)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCGTGGATACCTCATACTCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA
含下划线所示的预测信号序列的人源化131R008/131R010重链(IgG1)(SEQ ID NO:68)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测信号序列的人源化131R008/131R010重链(IgG1)(SEQ ID NO:69)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含信号序列核酸的人源化131R008重链(IgG1)(SEQ ID NO:70)
ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTCCTCCTTGTCGCCGCTCCACGCTGGGTGCTTTCCCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGA
不含预测信号序列核酸的人源化131R008重链(IgG1)(SEQ ID NO:71)
CAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGAGCTTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTATTCAATCCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAGTGGATTGGATACATCTACCCCTCAAATGGGGACTCTGGCTACAACCAAAAGTTCAAGAACCGGGTGACTATGACCAGAGATACCTCAACATCTACTGCCTACATGGAACTCAGCAGGCTGCGCTCAGAGGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCACCTACTTCGCTAATAACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACCACCCTGACTGTCAGCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGA
人源化131R005/131R007/131R008轻链可变区(SEQ ID NO:72)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDVATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
含下划线所示的预测信号序列的人源化131R005/131R007/131R008轻链(SEQ ID NO:73)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSDIVLTQSPASLAVSLGQRATITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDVATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不含下划线所示的预测信号序列的人源化131R005/131R007/131R008轻链(SEQ ID NO:74)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDVATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人源化131R005/131R007/131R008轻链可变区核酸(SEQ ID NO:75)
GATATCGTCCTGACCCAAAGCCCTGCTTCACTTGCTGTGAGCCTGGGGCAACGCGCCACCATCACTTGCAAGGCATCTCAGAGCGTGGACTATGATGGAGACTCTTACATGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGTCAACCTCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCATCTAATCTTGAAAGCGGCATCCCGGCTCGGTTCTCTGGTTCTGGATCAGGAACCGACTTCACCCTCACCATTAACCCAGTGGAGGCCGAGGACGTGGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCAAACGAGGACCCCCTGACTTTCGGAGCCGGGACCAAGCTGGAGCTTAAGCGT
含信号序列核酸的人源化131R005/131R007/131R008轻链(SEQ ID NO:76)
ATGAAACATCTTTGGTTCTTCCTTCTGCTGGTCGCTGCTCCTCGGTGGGTGCTTAGCGATATCGTCCTGACCCAAAGCCCTGCTTCACTTGCTGTGAGCCTGGGGCAACGCGCCACCATCACTTGCAAGGCATCTCAGAGCGTGGACTATGATGGAGACTCTTACATGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGTCAACCTCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCATCTAATCTTGAAAGCGGCATCCCGGCTCGGTTCTCTGGTTCTGGATCAGGAACCGACTTCACCCTCACCATTAACCCAGTGGAGGCCGAGGACGTGGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCAAACGAGGACCCCCTGACTTTCGGAGCCGGGACCAAGCTGGAGCTTAAGCGTACGGTGGCCGCACCGTCAGTCTTTATCTTTCCACCCTCCGACGAACAGCTTAAGTCAGGCACTGCCTCAGTCGTGTGTCTCCTCAATAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTCCAGTCCGGGAACTCTCAAGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACTCACTGTCAAGCACTCTCACCCTCTCAAAGGCCGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGTCTGTCCTCTCCTGTCACCAAGTCCTTCAATAGAGGAGAATGTTGA
不含预测信号序列核酸的人源化131R005/131R007/131R008轻链(SEQ ID NO:77)
GATATCGTCCTGACCCAAAGCCCTGCTTCACTTGCTGTGAGCCTGGGGCAACGCGCCACCATCACTTGCAAGGCATCTCAGAGCGTGGACTATGATGGAGACTCTTACATGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGTCAACCTCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCATCTAATCTTGAAAGCGGCATCCCGGCTCGGTTCTCTGGTTCTGGATCAGGAACCGACTTCACCCTCACCATTAACCCAGTGGAGGCCGAGGACGTGGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCAAACGAGGACCCCCTGACTTTCGGAGCCGGGACCAAGCTGGAGCTTAAGCGTACGGTGGCCGCACCGTCAGTCTTTATCTTTCCACCCTCCGACGAACAGCTTAAGTCAGGCACTGCCTCAGTCGTGTGTCTCCTCAATAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTCCAGTCCGGGAACTCTCAAGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACTCACTGTCAAGCACTCTCACCCTCTCAAAGGCCGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGTCTGTCCTCTCCTGTCACCAAGTCCTTCAATAGAGGAGAATGTTGA
变异体重链CDR1(SEQ ID NO:78)
DYSIH
变异体重链CDR2(SEQ ID NO:79)
YIYPSNGDSGYNQKFK
变异体重链CDR3(SEQ ID NO:80)
TYFANNFD
变异体轻链CDR1(SEQ ID NO:81)
KASQSVDYDGDSYMN
变异体轻链CDR2(SEQ ID NO:82)
AASNLES
变异体轻链CDR3(SEQ ID NO:83)
QQSNEDPLTF
含信号序列核酸的人源化131R010重链(IgG1)(SEQ ID NO:84)
ATGAAACACTTGTGGTTCTTTCTGCTCCTTGTCGCAGCACCACGGTGGGTGCTGTCGCAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTCAGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGATAA
不含信号序列核酸的人源化131R010重链(IgG1)(SEQ ID NO:85)
CAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTCAGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGATAA
人源化131R010/131R011轻链可变区(SEQ ID NO:86)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
含下划线所示的预测信号序列的人源化131R010/131R011轻链(SEQ ID NO:87)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不含预测信号序列的人源化131R010/131R011轻链(SEQ ID NO:88)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人源化131R010/131R011轻链可变区核酸(SEQ ID NO:89)
GATATCCAGATGACTCAGTCGCCCTCATCGTTGAGCGCCTCGGTCGGGGATCGCGTGACTATTACTTGTAAAGCGTCCCAGAGCGTGGACTACGACGGAGATTCCTACATGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGGAAAGGCTCCTAAACTTCTCATCTACGCAGCCTCGAATCTGGAATCAGGAGTCCCGAGCCGGTTCAGCGGATCAGGCTCCGGTACTGATTTTACCCTCACGATCTCGCCAGTGCAAGCCGAGGACTTCGCGACCTACTACTGCCAACAGTCCAACGAGGACCCGCTGACCTTCGGCGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAGCGT
含信号序列核酸的人源化131R010/131R011轻链(SEQ ID NO:90)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCGATATCCAGATGACTCAGTCGCCCTCATCGTTGAGCGCCTCGGTCGGGGATCGCGTGACTATTACTTGTAAAGCGTCCCAGAGCGTGGACTACGACGGAGATTCCTACATGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGGAAAGGCTCCTAAACTTCTCATCTACGCAGCCTCGAATCTGGAATCAGGAGTCCCGAGCCGGTTCAGCGGATCAGGCTCCGGTACTGATTTTACCCTCACGATCTCGCCAGTGCAAGCCGAGGACTTCGCGACCTACTACTGCCAACAGTCCAACGAGGACCCGCTGACCTTCGGCGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTGGCCGCTCCATCCGTGTTTATCTTTCCGCCGTCCGATGAGCAGCTCAAGTCGGGCACTGCCAGCGTGGTCTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCTAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCGCTCCAATCCGGTAACTCGCAAGAGAGCGTGACCGAACAGGACTCAAAGGACTCGACGTACAGCCTGTCATCGACCTTGACTCTCTCAAAGGCCGACTACGAAAAGCACAAGGTCTACGCGTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGTCCTCGCCTGTGACCAAGAGCTTCAATCGCGGAGAGTGCTGA
不含信号序列核酸的人源化131R010/131R011轻链(SEQ ID NO:91)
GATATCCAGATGACTCAGTCGCCCTCATCGTTGAGCGCCTCGGTCGGGGATCGCGTGACTATTACTTGTAAAGCGTCCCAGAGCGTGGACTACGACGGAGATTCCTACATGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGGAAAGGCTCCTAAACTTCTCATCTACGCAGCCTCGAATCTGGAATCAGGAGTCCCGAGCCGGTTCAGCGGATCAGGCTCCGGTACTGATTTTACCCTCACGATCTCGCCAGTGCAAGCCGAGGACTTCGCGACCTACTACTGCCAACAGTCCAACGAGGACCCGCTGACCTTCGGCGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTGGCCGCTCCATCCGTGTTTATCTTTCCGCCGTCCGATGAGCAGCTCAAGTCGGGCACTGCCAGCGTGGTCTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCTAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCGCTCCAATCCGGTAACTCGCAAGAGAGCGTGACCGAACAGGACTCAAAGGACTCGACGTACAGCCTGTCATCGACCTTGACTCTCTCAAAGGCCGACTACGAAAAGCACAAGGTCTACGCGTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGTCCTCGCCTGTGACCAAGAGCTTCAATCGCGGAGAGTGCTGA
人源化131R011重链可变区核酸(SEQ ID NO:92)
CAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTCA
含信号序列核酸的人源化131R011重链(IgG2)(SEQ ID NO:93)
ATGAAACACTTGTGGTTCTTTCTGCTCCTTGTCGCAGCACCACGGTGGGTGCTGTCGCAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTCAGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGATAA
不含信号序列核酸的人源化131R011重链(IgG2)(SEQ ID NO:94)
CAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTCAGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGATAA
人源化131R010重链可变区(SEQ ID NO:95)
CAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTC
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种与人R-脊椎蛋白3(RSPO3)特异性结合的经分离的抗体，其包含：
(a)包含DYSIH(SEQ ID NO:78)、KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQID NO:79)或IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2以及包含TYFANNFD(SEQ IDNO:80)、ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，和
(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)或QSVDYDGDSYM(SEQ IDNO:12)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:82)或AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2以及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其包含：
(a)包含DYSIH(SEQ ID NO:78)或KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2和包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3；以及包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:82)的轻链CDR2和包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3；
(b)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2和包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3；以及包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2和包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3；或
(c)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2和包含TYFANNFD(SEQ IDNO:80)的重链CDR3；以及包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)的轻链CDR2和包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其包含：
(a)与SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少90％序列一致性的重链可变区，和
(b)与SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72具有至少90％序列一致性的轻链可变区。
4.如权利要求3所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:44的重链可变区和包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:15的重链可变区和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:16的重链可变区和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:36的重链可变区和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:37的重链可变区和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:45的重链可变区和包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区；或
(g)包含SEQ ID NO:62的重链可变区和包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区。
5.一种与权利要求1至4中任一项所述的抗体竞争与RSPO3特异性结合的经分离的抗体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、人抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。
7.一种抗体，其包含由以PTA-120420保藏于ATCC的质粒编码的重链可变区和由以PTA-120421保藏于ATCC的质粒编码的轻链可变区。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体，其抑制RSPO3与至少一种富含亮氨酸重复的G蛋白偶合受体(LGR)的结合。
9.如权利要求8所述的抗体，其中该LGR选自由LGR5、LGR4及LGR6组成的组。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体，其
(a)抑制RSPO3信号传导；
(b)抑制β-连环蛋白的活化；
(c)抑制β-连环蛋白信号传导；
(d)抑制肿瘤生长；
(e)诱导肿瘤中的分化标记物的表达；
(f)诱导肿瘤中的细胞分化；或
(g)减少肿瘤中的癌干细胞的频率。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1至7中任一项所述的抗体及药学上可接受的载剂。
12.一种经分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的多核苷酸。
13.一种细胞，其包含：
(a)权利要求1至7中任一项所述的抗体；或
(b)权利要求12所述的多核苷酸。
14.权利要求1至7中任一项所述的抗体在抑制肿瘤生长中的用途。
15.权利要求1至7中任一项所述的抗体在诱导肿瘤细胞分化中的用途。
16.权利要求1至7中任一项所述的抗体在减少肿瘤中的癌干细胞的频率中的用途。
17.权利要求1至7中任一项所述的抗体在抑制细胞中的β-连环蛋白信号传导中的用途。
18.如权利要求17所述的抗体用途，其中所述细胞是肿瘤细胞。
19.如权利要求14至16或18中任一项所述的抗体用途，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤、肺肿瘤、结直肠肿瘤或卵巢肿瘤。
20.权利要求1至7中任一项所述的抗体在治疗癌中的用途。
21.如权利要求20所述的抗体用途，其中所述癌是结直肠癌、胰腺癌、肺癌或卵巢癌。
22.如权利要求14至16或18至21中任一项所述的抗体用途，其中所述肿瘤或癌具有RSPO基因融合。
23.如权利要求14至16或18至21中任一项所述的抗体用途，其还包含测定所述肿瘤或癌是否具有RSPO基因融合的步骤。
24.如权利要求22或23所述的抗体用途，其中所述RSPO基因融合为RSPO2基因融合或RSPO3基因融合。
25.权利要求1至7中任一项所述的抗体在治疗与β-连环蛋白的活化有关的疾病中的用途。
26.如权利要求14至16或18至25中任一项所述的抗体用途，其包含施用至少一种额外的治疗剂。
27.如权利要求26所述的抗体用途，其中所述额外的治疗剂为化学治疗剂、血管生成抑制剂或额外的抗体。
28.一种识别肿瘤用于以权利要求1至7中任一项所述的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述所述RSPO基因融合为RSPO2基因融合或RSPO3基因融合。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述RSPO基因融合由PCR类试验、微阵列分析或核苷酸测序测定。

Claims (113)

1.一种与人R-脊椎蛋白3(RSPO3)特异性结合的经分离的抗体，其包含：
(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2以及包含ATYFANYFDY(SEQID NO:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)或TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或
(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ IDNO:81)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ ID NO:13)或AASNLES(SEQ ID NO:82)的轻链CDR2以及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其包含：
(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO:34)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2以及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO:11)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO:35)的重链CDR3，和/或
(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ IDNO:13)的轻链CDR2以及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其包含：
(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:79)的重链CDR2以及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:80)的重链CDR3，和/或
(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:81)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:82)的轻链CDR2以及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:83)的轻链CDR3。
4.如权利要求1所述的抗体，其包含：
(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO:9)或DYSIH(SEQ ID NO:78)的重链CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO:10)的重链CDR2以及包含TYFANNFD(SEQ IDNO:80)的重链CDR3，和/或
(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO:12)的轻链CDR1、包含AAS(SEQ IDNO:13)的轻链CDR2以及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:14)的轻链CDR3。
5.一种与人RSPO3特异性结合的经分离的抗体，其包含：
(a)与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少90％序列一致性的重链可变区，和/或
(b)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少90％序列一致性的轻链可变区。
6.如权利要求1至5中任一所述的抗体，其包含：
(a)与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少95％序列一致性的重链可变区，和/或
(b)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86具有至少95％序列一致性的轻链可变区。
7.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:15的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区。
8.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:16的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区。
9.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:36的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区。
10.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:37的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:72的轻链可变区。
11.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:44的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区。
12.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:45的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区。
13.如权利要求6所述的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:62的重链可变区，及
(b)包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86的轻链可变区。
14.一种与权利要求1至13中任一项所述的抗体竞争与RSPO3特异性结合的经分离的抗体。
15.一种与RSPO3上的表位结合的经分离的抗体，该表位与权利要求1至13中任一项所述的抗体所结合的RSPO3上的表位相同。
16.一种与RSPO3上的表位结合的经分离的抗体，该表位与如权利要求1至13中任一项所述的抗体所结合的RSPO3上的表位重叠。
17.如权利要求1至16中任一项所述的抗体，其是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
18.如权利要求1至17中任一项所述的抗体，其是人源化抗体。
19.如权利要求1至17中任一项所述的抗体，其是人抗体。
20.如权利要求1至19中任一项所述的抗体，其是IgG1抗体。
21.如权利要求1至19中任一项所述的抗体，其是IgG2抗体。
22.如权利要求1至19中任一项所述的抗体，其是包含抗原结合位点的抗体片段。
23.一种抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69的重链序列，及
(b)SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:88的轻链序列。
24.如权利要求23所述的抗体，其包含SEQ ID NO:48的重链序列及SEQ IDNO:74或SEQ ID NO:88的轻链序列。
25.如权利要求23所述的抗体，其包含SEQ ID NO:64的重链序列及SEQ IDNO:74或SEQ ID NO:88的轻链序列。
26.如权利要求23所述的抗体，其包含SEQ ID NO:69的重链序列及SEQ IDNO:74或SEQ ID NO:88的轻链序列。
27.一种抗体，其包含选自由以下组成的组的抗体的重链可变区及轻链可变区：131R102、131R103、131R103的变异体、人源化版本的131R103、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010及h131R011。
28.一种抗体，其选自由以下组成的组：131R102、131R103、131R103的变异体、人源化版本的131R103、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010及h131R011。
29.一种抗体，其包含由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的重链可变区。
30.一种抗体，其包含由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的重链。
31.一种抗体，其包含由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的轻链可变区。
32.一种抗体，其包含由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的轻链。
33.一种抗体，其包含由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的重链可变区和由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的轻链可变区。
34.一种抗体，其包含由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的重链和由以PTA-____保藏于ATCC的质粒编码的轻链。
35.如权利要求1至34中任一项所述的抗体，其抑制RSPO3与至少一种富含亮氨酸重复的G蛋白偶合受体(LGR)的结合。
36.如权利要求35所述的抗体，其中该LGR选自由LGR4、LGR5及LGR6组成的组。
37.如权利要求36所述的抗体，其中该LGR是LGR5。
38.如权利要求1至37中任一项所述的抗体，其抑制RSPO3信号传导。
39.如权利要求1至38中任一项所述的抗体，其抑制β-连环蛋白的活化。
40.如权利要求1至39中任一项所述的抗体，其抑制β-连环蛋白信号传导。
41.如权利要求1至40中任一项所述的抗体，其抑制肿瘤生长。
42.如权利要求1至41中任一项所述的抗体，其诱导肿瘤中的分化标记物的表达。
43.如权利要求1至42中任一项所述的抗体，其诱导肿瘤中的细胞分化。
44.如权利要求1至41中任一项所述的抗体，其减少肿瘤中的癌干细胞的频率。
45.一种多肽，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88。
46.如权利要求45所述的多肽，其是抗体。
47.一种细胞，其包含或产生权利要求1至46中任一项所述的抗体或多肽。
48.一种经分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求1至46中任一项所述的抗体或多肽的多核苷酸。
49.一种经分离的多核苷酸分子，其包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95。
50.一种载体，其包含权利要求48或49所述的多核苷酸。
51.一种细胞，其包含权利要求48或49所述的多核苷酸或如权利要求50所述的载体。
52.一种药物组合物，其包含权利要求1至46中任一项所述的抗体或多肽及药学上可接受的载剂。
53.一种抑制肿瘤生长的方法，其中该方法包含使该肿瘤接触有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
54.一种抑制受试对象中的肿瘤生长的方法，其中该方法包含对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
55.一种诱导受试对象中的肿瘤细胞分化的方法，该方法包含对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
56.一种减少受试对象的肿瘤中的癌干细胞的频率的方法，该方法包含对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
57.一种抑制细胞中β-连环蛋白信号传导的方法，该方法包含使该细胞接触有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
59.如权利要求53至56或58所述的方法，其中所述肿瘤选自由结直肠肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤或头颈肿瘤组成的组。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤是肺肿瘤。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤是结直肠肿瘤。
63.如权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
64.一种治疗受试对象中的癌的方法，其中该方法包含对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述癌选自由结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠道癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤或头颈癌组成的组。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述癌是结直肠癌。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述癌是胰腺癌。
68.如权利要求65所述的方法，其中所述癌是肺癌。
69.如权利要求65所述的方法，其中所述癌是卵巢癌。
70.如权利要求53至56或58至69项中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌所表达的RSPO3水平相较于参考样本中的RSPO3水平或预定的RSPO3水平上升。
71.如权利要求53至56或58至70项中任一项所述的方法，其还包含测定所述肿瘤或癌中的RSPO3的表达水平的步骤。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述测定RSPO3的表达水平的步骤于用所述抗体进行治疗或接触之前进行。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中若所述肿瘤或癌具有上升的RSPO3表达水平，则所述抗体：
(a)被施用至所述受试对象，或
(b)与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。
74.如权利要求53至56或58至69项中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌具有RSPO基因融合。
75.如权利要求53至56或58至69项中任一项所述的方法，其还包含测定所述肿瘤或癌是否具有RSPO基因融合的步骤。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述RSPO基因融合为RSPO2基因融合。
77.如权利要求74或75所述的方法，其中所述RSPO基因融合为RSPO3基因融合。
78.如权利要求53至56或58至77中任一项所述的方法，其中所述受试对象曾将肿瘤或癌移除。
79.一种治疗受试对象中的疾病的方法，其中所述疾病与β-连环蛋白的活化有关，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1至44中任一项所述的抗体。
80.如权利要求53至56或58至79中任一项所述的方法，其中所述方法还包含施用至少一种额外的治疗剂。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述额外的治疗剂为化学治疗剂。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述额外的治疗剂为血管生成抑制剂。
83.如权利要求80所述的方法，其中所述额外的治疗剂为抗体。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述抗体是抗RSPO1抗体。
85.如权利要求83所述的方法，其中所述抗体是抗RSPO2抗体。
86.如权利要求53至56或58至85中任一项所述的方法，其中所述受试对象是人。
87.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO3表达水平相较于参考样本或预定的RSPO3水平上升的肿瘤。
88.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤相较于参考样本或预定的RSPO3水平是否具有上升的RSPO3表达水平。
89.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO3表达水平相较于参考样本或预定的RSPO3水平上升的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象以该抗体治疗。
90.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤相较于参考样本或预定的RSPO3水平是否具有上升的RSPO3表达水平，
其中若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象以该抗体进行治疗。
91.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO3表达水平相较于参考样本或预定的RSPO3水平上升的的肿瘤。
92.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤相较于参考样本或预定的RSPO3水平是否具有上升的RSPO3表达水平。
93.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有RSPO3表达水平相较于参考样本或预定的RSPO3水平上升的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象以该抗体治疗。
94.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤相较于参考样本或预定的RSPO3水平是否具有上升的RSPO3表达水平，
其中若该肿瘤具有上升的RSPO3表达水平，则选择该受试对象以该抗体治疗。
95.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有含有RSPO基因融合的肿瘤。
96.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合。
97.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有含有RSPO基因融合的肿瘤，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象以该抗体治疗。
98.一种识别人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合，
其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象以该抗体治疗。
99.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有含有RSPO基因融合的肿瘤。
100.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合。
101.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：测定该受试对象是否具有含有RSPO基因融合的肿瘤，其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象以该抗体治疗。
102.一种选择人受试对象用于以与RSPO3特异性结合的抗体的治疗的方法，该方法包含：
(a)自该受试对象获得肿瘤样本，及
(b)测定该肿瘤是否具有RSPO基因融合，
其中若该肿瘤具有RSPO基因融合，则选择该受试对象以该抗体治疗。
103.如权利要求95至102中任一项所述的方法，其中所述RSPO基因融合为RSPO2基因融合。
104.如权利要求95至102中任一项所述的方法，其中所述RSPO基因融合为RSPO3基因融合。
105.如权利要求87至104中任一项所述的方法，其中所述抗体为权利要求1至44中任一项所述的抗体。
106.如权利要求87至105中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由结直肠肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤或头颈肿瘤组成的组。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述肿瘤是肺肿瘤。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
109.如权利要求106所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
110.如权利要求87至94或105至109中任一项所述的方法，其中所述RSPO3表达水平由PCR类试验、微阵列分析或免疫组织化学测定。
111.如权利要求95至109中任一项所述的方法，其中所述RSPO基因融合由PCR类试验、微阵列分析或核苷酸测序测定。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述核苷酸测序为NextGen测序或全基因组测序。
113.如权利要求88、90、92、94、96、98、100或102至109中任一项所述的方法，其中所述样本为新鲜肿瘤样本、冷冻肿瘤样本或福尔马林固定的石蜡包埋样本。
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