KR20200096275A - 항-rspo3 항체 - Google Patents

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텅-위안 창
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Abstract

서열번호 2, 6, 10 및 14로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열의 중쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및 서열번호 4, 8, 12 및 16으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 서열의 경쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하며, 여기서 항체는 RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체.

Description

항-RSPO3 항체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 7일에 제출된 미국 가출원 제62/595,845호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.
R-스폰딘(R-spondins, RSPOs)은 4개의 별개의 분비된 단백질(RSPO1, 2, 3, 및 4)의 그룹이며, 트롬보스폰딘 타입 1 반복(TSR-1)-함유 단배질의 슈퍼 패밀리에 속한다. 예를 들어, Jin 및 Yoon(2012). 생화학 및 세포 생물학의 국제 저널(44): 2278-2287을 참조한다. 모든 인간 RSPO는 40%-60% 아미노산(a.a.) 서열 유사성을 공유하고, 그리고 이들 단백질은 다음 요소를 포함하여 234 내지 272개의 아미노산을 함유한다: (i)RSPO의 분비를 촉진하는 N-말단 소수성 신호 펩티드; (ii) 2개의 푸린-유사 시스테인-풍부 도메인(furin-like cysteine-rich domains, FU-CRD); (iii) TSR-1 도메인; 및 (iv) 양으로 하전된 잔기를 갖는 염기성 아미노산-풍부 도메인의 C-말단 꼬리. 2개의 FU-CRD는 RSPO의 생물학적 기능에 대한 Wnt/β-카테닌-의존적 신호 전달을 촉진하는데 필요하고 충분한 것으로 나타났다. 예를 들어, de Lau 외. (2012). 게놈 생물학 (13): 242; 및 Kim 외. (2008). 세포의 분자 생물학 (19): 2588-2596를 참조한다. 대조적으로, TSR-1 도메인은 프리즐(Frizzled, Fz)/평면 세포 극성(planar cell polarity, PCP) 신호 전달의 조절에서 기계론 역할(mechanistic role)을 한다.
RSPO는 척추 동물 발달 및 줄기 세포 성장에서 다면발현성(pleiotropic)의 기능을 갖는다. 몇몇 연구는 RSPO가 2개의 가능한 모델에 의해 설명될 수 있는 바와 같이 WNT 리간드로 β-테닌의 활성화를 초래하도록 Wnt 경로 신호 전달을 강하게 향상시킬 수 있다고 제안하였다. 예를 들어, Jin 및 Yoon (2012); de Lau 외. (2014). 유전자&발달 (28): 305-316; 및 Kontermann, R. E. (2012). 생화학 및 생물 물리학의 기록(526): 194-205을 참조한다. 한 모델은 RSPO가 암에서 Wnt/b-카테닌 신호 전달을 활성화시키기 위해 WNT 및 FZD를 갖는 수용체의 클러스터상에서 활성화 리간드로서 LRP5/6 및 LGR4/5/6 수용체에 직접 결합할 것을 제안하였다. 예를 들어, Wang 외. (2013). 유전자 및 발달 (27): 1339-1344을 참조한다. 대안적으로, RSPO는 또한 DKK1-매개 LRP6 및 크레멘 군집(Kremen association)을 방해함으로써 DKK1-매개 엔도사이토시스(endocytosis)를 길항으로 작용(antagonize)할 수 있다. RSPO는 또 다른 모델에서 세포 표면의 FZD 및 LRP6 수용체 전환(turnover)을 가속화하기 위해 음성 피드백 조절제로서 ZNFR3 및 그의 상동체인 RNF43에 결합한다. 예를 들어, Jin 및 Yoon (2012)을 참조한다.
WNT 신호 전달은 세포 증식, 분화, 이동 및 생존의 조절에 관여한다. 예를 들어, Niehrs (2012). 네이처 리뷰. 분자 세포 생물학(13): 767-779를 참조한다. 따라서, Wnt 신호 전달 경로는 암 치료법의 잠재적인 표적으로서 조사되어 왔다. 예를 들어 Madan 및 Virshup (2015). 분자 암 치료학(14): 1087-1094을 참조한다. 인간 유전학 연구 및 유전자 타겟팅 접근법은 RSPO가 정규 및 비정규 WNT 조절자가 될 수 있는 능력을 가짐을 보여주었다. MacDonald 외. (2009). 발달 세포(17): 9-26. RSPO3 유전자 융합의 기능 획득(gain of function)은 FZD 및 LRP5/6 세포 표면 풍부도를 강화시키고, 그리고 이어서 활성화된 Wnt 신호 전달을 강화시켰다. Madan 외. (2015). 종양 유전자 (35): 2197-2207. 치료하기 어려운 암 환자의 서브세트는 RSPO-융합 유전자를 보유(carrying)하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Madan 외. (2015)를 참조한다. 예를 들어, 결장암의 5-10%에서 단백질 티로신 포스파타제 수용체 타입 K는 RSPO3와 융합하여 (PTPRK)-RSPO3 융합을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, Seshagiri 외. (2012). 네이처(488): 660-664를 참조한다. 활성화된 Wnt 신호 전달은 10%의 APC야생형 결장암 및 1-11%의 난소암, 식도암, 폐암 및 두경부암에서 발견되었다. 예를 들어, Seshagiri 외. (2012)를 참조한다. 324 NSCLC 코호트(cohort)의 대략 1~2%가 EIF3E(e1)-RSPO2(e1), PTPRK(e1)-RSPO3(e2) 및 PTPRK(e7)-RSPO3(e2)로 진단되었다. 예를 들어, Browning 외. (2001). 생화학 과학의 동향(26): 284; 및 Parker 및 Zhang (2013). 중국 암 저널(32): 594-603을 참조한다. 2개의 최근 연구는 항-RSPO3 항체가 RSPO3-융합 유전자 또는 RSPO3-자극 베타-카테닌 신호 전달을 갖는 종양에 대해 길항적인 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, Storm 외. (2016). 네이처 (529): 97-100; 및 Chartier 외. (2016). 암 연구 (76): 713-723를 참조한다. 따라서, 강화된 RSPO-Wnt 신호 전달에 의해 구동되는 암의 서브세트가 있는 것으로 보인다. 항-RSPO3 항체는 결장암, 폐암 및 난소 암을 포함한 다양한 암에서 항암 치료법에 유의하게 영향을 줄 가능성이 있다.
일 견지에서, 본 명세서에서는 분리된 항체를 설명한다. 분리된 항체는 서열번호 2, 6, 10 및 14로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열의 중쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및 서열번호 4, 8, 12 및 16으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 서열의 경쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하며, 여기서 항체는 RSPO3 단백질에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 2로부터 유래된 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 4로부터 유래된 것이다.
일부 구현예에서, 항체는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 서열과 적어도 80%가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 6으로부터 유래된 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 8로부터 유래된 것이다. 항체는 서열번호 6의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 10으로부터 유래된 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 12로부터 유래된 것이다. 항체는 서열번호 10의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 12의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 14로부터 유래된 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 16으로부터 유래된 것이다. 항체는 서열번호 14의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 명세서에서 설명된 항체는 RSPO3 단백질에서 입체형태적으로 결정된(conformationally-determined) 또는 선형 에피토프(linear epitope)에 결합될 수 있다. 이는 IgG 항체이며, Fc 영역, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단쇄 항체(single-chain antibody), scFV 멀티머(multimer), 1가 항체(monovalent antibody), 다가 항체(multivalent antibody), 또는 키메릭 항체(chimeric antibody)를 함유하는 항체일 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 인간화(humanized)될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 또 다른 분자(예를 들어, 작은 분자 약물, 세포-타겟팅 모이어티, 세포 독성제(cytotoxic agent), 면역조절제(immunomodulator), 폴리펩티드, 핵산 분자, 검출 가능한 라벨(detectable label), 또는 폴리머)와 접합하여 면역접합(immunoconjugate)을 생성한다.
또한 본 명세서는 본 명세서에서 설명된 임의의 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 설명한다.
또 다른 견지에서, 본 명세서는 분리된 핵산을 포함하는 호스트 세포를 제공한다.
일 견지에서, 본 명세서에서 설명된 항체를 포함하는 조성물을 설명한다. 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 또 다른 치료제(예를 들어, 또 다른 암 약물, 세포 독성제, 또는 면역조절제)를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 설명된 임의의 항체는 항체의 유효량과 세포를 접촉시킴으로써 세포에서의 RSPO3 또는 Wnt 신호 전달을 억제하는데 사용될 수 있다.
항체는 또한 항체의 유효량과 세포를 접촉시킴으로써 암 세포 성장 또는 암 세포 전이를 억제하는데 사용될 수 있다.
또 다른 견지에서, 본 명세서는 본 명세서에서 설명된 임의의 항체의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법을 설명한다.
일부 구현예에서, 암은 RSPO3 양성 암(RSPO3 positive cancer), RSPO3-융합 양성 암(RSPO3-fusion positive cancer), 선종성 용종 대장(adenomatous polyposis coli, APC) 돌연변이를 갖는 암, β-카테닌 돌연변이를 갖는 암, 또는 과활성화된 Wnt 신호 전달을 갖는 암이다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에 항체를 투여하기 전에 대상의 암이 상기 돌연변이 또는 일탈 중 하나를 가지는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 암은 결장암(colon cancer), 백혈병(leukemia), 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 유방암(breast cancer), 신장암(kidney cancer), 전립선암(prostate cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 흑색종(melanoma), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암(bladder cancer), 교모세포종(glioblastoma), 또는 두경부암(head and neck cancer)일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에게 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 본 명세서는 샘플에서 RSPO3 단백질 또는 이의 단편을 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 본 명세서에서 설명된 임의의 항체를 샘플과 접촉시키는 단계 및 항체와 RSPO3 단백질 또는 이의 단편 사이의 특이적인 결합을 분석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, RSPO3 단백질은 인간 RSPO3 단백질이다.
RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 변이체를 확인하는 방법을 본 명세서에서 설명한다. 방법은 본 명세서에서 설명된 항체의 하나 이상의 상보적 결정 영역에 하나 이상의 변형을 도입하여 항체 변이체를 생성하는 단계; 및 RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 변이체를 확인하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 구현예들의 세부 사항들은 첨부된 도면 및 이하의 설명에서 설명된다. 구현예의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 단일 세포주를 스크리닝하기 위한 모델로서 RSPO3 하이브리도마 B1(RSPO3 Hybridoma B1)의 사용을 보여주는 개략도 및 이미지 세트이다. (A) 개략도는 단일 콜로니 선택 절차를 보여준다; (B) 단일 클론은 제한 희석 및 팽창에 의해 확인하였다; (C) 클론을 옮기고 Ab 발현에 대해 평가하였다; 그리고 (D) 높은 Ab 발현 수준을 나타내는 세포를 T25-cm2 조직 배양 플라스크에서 팽창시켰다.
도 2는 항-RSPO3 하이브리도마 항체 반응성을 나타내는 웨스턴 블롯 세트이다. 이들 하이브리도마 항체를 RSPO1-4 항원 면역 블롯으로 반응시켰다. 마커의 M.W.를 표시하였다. (A) A1, A2, A4, A5, A6 및 A9 클론; 및 (B) B1, B3, B4, B8 및 B9 클론.
도 3은 ELISA에 의해 측정된 항-RSPO3 하이브리도마 항체 반응성을 보여주는 그래프 세트이다. 이 하이브리도마 항체는 RSPO3 항원과 함께 반영되는 RSPO1-4 항원 면역 블롯으로 반응시켰다. (A) A1, A2, A4, A5, A6 및 A9 클론; 및 (B) B1, B3, B4, B8 및 B9 클론.
도 4는 정규 Wnt 신호 전달을 타겟팅하는 RSPO3 Ab 및 β-카테닌 활성의 억제에 대한 시험관 내(in vitro) 테스트를 보여주는 그래프 세트이다. (A) A1, A2, A4, A5, A6 및 A9 클론; (B) B1, B3, B4, B8 및 B9 클론; 및 (C) RSPO-Wnt 신호 전달에서 상승된 A4 및 A6 클론의 복용-반응 효과. MDA-MB436 TCF/LEF-Luc 세포를 20㎍/mL 항-RSPO3 항체 클론 A1, A2, A4, A5, A6, A9 또는 131R002의 존재 하에 Wnt3a(20ng/mL) 및 RSPO3(50ng/mL)의 조합과 함께 인큐베이팅하였다. 컨트롤로서, Wnt3a 및 RSPO3의 조합, Wnt3a 단독, RSPO3 단독 또는 첨가하지 않은 상태로 세포를 인큐베이팅하였다. 세포를 16시간 동안 인큐베이팅하고 원-글로 루시퍼라제 어세이 시스템(One-Glo Luciferase Assay System)을 사용하여 루시퍼라제 활성 어세이를 수행하였다.
도 5는 hRSPO3 및 mRSPO3의 아미노산 서열의 정렬이다.
도 6은 항-RSPO3 Ab가 Wnt3a 및 RSPO3의 조합에 의해 자극된 WNT 리포터 활성을 억제함을 나타내는 그래프 세트이다. (A) hB1 또는 131R010에 의해, Wnt3a+인간 RSPO3(h) 또는 쥐과(murine) RSPO3(m)에 의해 자극된 RSPO-Wnt 신호 전달의 복용-반응 억제; 및 (B) MDA-MB436 TCF/LEF-Luc 세포를 20㎍/mL 항-RSPO3 항체의 클론 hB1 또는 131R010의 존재 하에 Wnt3a(20ng/mL) 및 hRSPO3(50ng/mL)의 조합과 함께 인큐베이팅하였다. 세포를 16시간 동안 인큐베이팅하였다. 원-글로 루시퍼라제 어세이 시스템을 사용하여 루시퍼라제 활성 어세이를 수행하였다.
도 7은α-RSPO3 Ab-항원 상호 작용의 결합 키네틱을 측정하기 위해 비아코어(Biacore)의 사용을 나타내는 그래프이다. Biacore T200을 사용하여 결합 센서그램을 생성한 후 간단한 1:1 상호 작용 모델에 맞췄다. 일련의 hB1 농도(0.39-6.25nM)는 주사 사이에 표면을 재생성하지 않으면서 단일-사이클로 주사하였다. 군집을 2분 동안 모니터링하고, 최종 해리 시간은 15분이었다. hRSPO3를 27.5RU에서 CM5 칩 상에 고정시켰다.
도 8은 Pep-세트에 의한 RSPO3 단백질 상의 α-RSPO3 Ab 에피토프의 맵핑을 나타내는 그래프 세트이다. 이들 히스토그램은 도면에 표시된 바와 같이 RSPO3 Ab 131R010(A), 131R002(B) 및 하이브리도마 A6(C)에 결합하는 각각의 10-mer 올리고펩티드의 능력을 나타낸다. QNASRGRRQR (서열번호 74); ASRGRRQRRM (서열번호 75); RGRRQRRMHP (서열번호 76); RRQRRMHPNV (서열번호 77); CLSCKPRLFF (서열번호 78); SCKPRLFFAL (서열번호 79); ERGKKGRERK (서열번호 80); GKKGRERKRK (서열번호 81); KGRERKRKKP (서열번호 82); RERKRKKPNK (서열번호 83); RENKQQQKKR (서열번호 84).
도 9는 여러 α-RSPO3 항체의 에피토프 연구를 보여주는 일련의 개략도 및 그래프이다. (A) 다양한 절단된(truncated) RSPO3 단편을 ELISA 플레이트에 코팅 한 후, α-RSPO3 항체인 비오티닐화된 hB1(biotinylated hB1)을 각 웰에 첨가하였다. 이어서 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)를 첨가하여 결합된 비오티닐화된 항체를 검출하였다. (B) 1㎍/ml의 비오티닐화된 시클릭 펩티드 및 100ng/ml의 비오티닐화된 재조합 인간 RSPO3를 NeutrAvidin 사전-코팅된 플레이트에 적용하였다. 상이한 시클릭 펩티드와 hB1 사이의 결합을 조사하기 위해, 이어서, 2㎍/ml의 hB1을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 결합된 항-RSPO3 항체를 검출하기 위해, 이어서 염소 항-인간 IgG-Fc-HPR(Chemicon)을 플레이트에 적용하였다.
도 10은 상이한 α-RSPO3 항체에 의한 RSPO3와 LGR5 또는 RNF43의 경쟁적인 결합을 보여주는 그래프 세트이다. 상이한 α-RSPO3 항체가 LGR5 또는 RNF43에 대한 RSPO3의 결합과 경쟁할 수 있는지를 시험하기 위해, 재조합 hRSPO3을 플레이트 상에 코팅하였다. (A) 재조합 LGR5(22-560)-Fc를 비오틴과 접합시켜 검출을 용이하게 하였다. 이어서, 비오티닐화된 LGR5를 다양한 농도의 α-RSPO3 항체 또는 이소 타입 컨트롤 Ab 중 하나와 각각 혼합하고 RSPO3-코팅된 웰에 적용하였다. 이어서 스트렙타비딘-HRP를 첨가하여 결합된 비오티닐화된 LGR5를 검출하였으며; 그리고 (B) 재조합 His-태그된 RNF43 및 상이한 α-RSPO3 항체의 혼합물을 각각 RSPO3-코팅된 웰에 적용하였다. 이어서, 결합된 RNF43의 검출을 위해 마우스 항-His 태그 항체-HRP를 첨가하였다. 플레이트를 1XPBST로 세척하여 추가 검출 항체를 제거한 후, TMB 기질 용액을 10분 동안 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 비색(colorimetric) 반응을 2N HCL에 의해 중단시키고, 각 웰의 450nm에서의 광학 밀도를 즉시 측정하였다.
도 11은 DLD-1 세포 모델에서 상처 치유에 대한 상이한 α-RSPO3 항체의 효과를 보여주는 그래프이다. 상처 봉합의 백분율을 계산하고 막대 그래프에 나타내었다.
도 12는 특정 항-RSPO3 단일 클론성 항체를 사용하여 생체 내(in vivo) 결장직장암 PDX 모델 CR3150 종양 성장의 억제를 나타내는 그래프이다. 마우스를 4.5주 동안 매주 2회 hB1, 131R010 또는 컨트롤(비히클(PBS))로 처리하였다. 처리 5일에, 비히클 및 hB1 그룹 각각으로부터 3마리 마우스를 2차 복용 후 24시간에 종양 수집을 위해 희생시켰다. 그 후 5일부터 58일까지 컨트롤, hB1 또는 131R010 그룹에서 각각 5, 3, 및 3 마리의 마우스가 남았다. 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 비히클 그룹에서 하나의 마우스 및 미처리 그룹에서 하나의 마우스를 인도적 종점(humane endpoint)에 도달하는 종양 부피로 인해, 각각 39일 및 46일에 안락사시키고, 종양 부피의 마지막 값은 연구가 끝날 때까지 진행되었다.
도 13은 CR3150 PDX 모델에서 hB1의 분자 반응의 평가를 보여주는 그래프 세트이다. 장내 줄기 세포 마커(Axin2 및 LGR5), 다운스트림 마커(TCF7), 암 줄기 세포 마커(CD133 및 CD44) 및 분화 마커(CEACAM7 및 KRT20)의 발현은 2회 복용 후 2일 이내 또는 마지막 복용 후 29일 이내에 Q-PCR을 사용하여 수행하였다.
도 14는 RSPOhigh NCI-H2030 폐암 CDX 모델에서 hB1의 효능을 보여주는 그래프이다. 4주 동안 일주일에 한 번 마우스를 25mg/kg에서 hB1 또는 131R010으로 처리하거나, 컨트롤(비히클)로 처리하였다. 처리 28일에, 각각의 비히클, 131R010 및 hB1 그룹으로부터 7마리 마우스를 5차 복용 후 24시간에 종양 수집을 위해 희생시켰다. 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 처리 51일에, 카보플라틴(Carboplatin), hB1, 131R010 및 조합 그룹의 카보플라틴 각각으로부터의 7마리 마우스를 종양 수집을 위해 희생시켰다. 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다.
도 15는 PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체(transcript)를 보유하는 인간 SNU-1411 결장 이종이식 종양에서의 항-종양 효능을 나타내는 그래프 세트이다. 종양 세포를 마우스에 주사하고 종양이 200mm3에 도달할 때 처리를 개시하였다. 격주 마다 1회 25mg/kg으로 항체를(Q2W), 매주 1회 20mg/kg으로 파클리탁셀로 항체를(Q1W) 제공하였다. 항체 및 카보플라틴 둘 다 정맥 주사에 의해 투여하였다. 파클리탁셀은 1일 내지 32일, 그리고 조합 그룹은 1일 내지 46일로 제공하였다. 항체 및 파클리탁셀 둘 다 정맥 주사에 의해 투여하였다. 각각의 처리주기에 대해, 항체는 1일 째 그리고 파클리탁셀은 3일 째 제공하였다. 표시된 날에 종양 및 체중 측정을 수행하였다. 평균±SEM. *: p<0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 컨트롤에 이어서 투키의 테스트 후 비교함(Tukey's post-test comparison).
도 16은 췌장암 조직에서 RSPO3의 발현을 나타내는 그래프이다. 80명의 환자 샘플로 구성된 췌장암 조직 마이크로어레이를 항-RSPO3 mAb hB1로 염색하였다. 전체 섹션의 이미지는 3DHISTECH의 디지털 슬라이드 스캐너로 스캔하였다. 그래프는 암 조직 어레이 및 정상 조직 어레이에서 RSPO3을 발현하는 경우의 백분율을 나타낸다.
도 17은 폐암 조직에서 RSPO3의 발현을 나타내는 그래프이다. 50명의 환자 샘플로 구성된 폐암 조직 마이크로어레이를 항-RSPO3 mAb hB1로 염색하였다. 전체 섹션의 이미지는 3DHISTECH의 디지털 슬라이드 스캐너로 스캔하였다. 그래프는 암 조직 어레이 및 정상 조직 어레이에서 RSPO3을 발현하는 경우의 백분율을 나타낸다.
도 18은 유방암 조직에서 RSPO3의 발현을 나타내는 그래프이다. 75명의 환자 샘플로 구성된 유방암 조직 마이크로어레이를 항-RSPO3 mAb hB1로 염색하였다. 전체 섹션의 이미지는 3DHISTECH의 디지털 슬라이드 스캐너로 스캔하였다. 그래프는 유방 침습성 도관 암종(breast invasive ductal carcinoma) 조직 어레이에서 RSPO3을 발현하는 경우의 백분율을 나타낸다.
도 19는 결장암 조직에서 RSPO3의 발현을 나타내는 그래프이다. 64명의 환자 샘플로 구성된 결장암 조직 마이크로어레이를 항-RSPO3 mAb hB1로 염색하였다. 전체 섹션의 이미지는 3DHISTECH의 디지털 슬라이드 스캐너로 스캔하였다. 그래프는 결장직장 암종(colorectal carcinoma) 조직 어레이에서 RSPO3을 발현하는 경우의 백분율을 나타낸다.
본 명세서에는 신규한 항-RSPO3 항체가 설명된다. 특히, 인간화된 항체 hB1은 RSPO3-융합 유전자 또는 RSPO3 과발현을 갖는 암에서 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 항암 효능을 입증하였다. 하기 기재된 데이터는 다음을 입증한다: (1) RSPO3에 대한 hB1의 결합 친화도는 pM 범위에 있음; (2) β-카테닌 TCF/LEF-Luc 리포터 시스템에서, hB1 및 로스만투주맙(rosmantuzumab)은 동일한 효력(potency)을 나타냄; (3) hB1 및 로스만투주맙은 CR3150 결장직장암 PDX 모델에서 동일한 항암 효능을 나타냄; (4) hB1은 NCI-H2030 및 SNU-1411 암 이종이식 모델에서 항암 효능을 나타냄; (5) hB1은 샘플에서 RSPO3 수준을 결정하는데 사용될 수 있음; 그리고 (6) hB1 및 로스만투주맙은 상이한 에피토프에 결합함.
항체 A4, A6, B1 및 hB1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 하기 표에 나타냈다. 4가지 상이한 방법(IMGT, Chothia, KABAT 및 Honegger)에 의해 예측된 상보적 결정 영역(CDR) 또한 표에 나타냈다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본 명세서에서 설명된 항-RSPO3 항체는 서열번호 2, 6, 10 및 14로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열로부터의 중쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및 서열번호 4, 8, 12 및 16으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 서열로부터의 경쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 각 영역의 3개의 CDR은 상기에 나타낸다. 당업자는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 CDR을 확인할 수 있을 것이다.
항체는 RSPO3에 특이적으로 결합 할 수 있으며, 즉 다른 비-RSPO3 단백질보다 높은 친화도로 RSPO3에 결합할 수 있으며, RSPO3와 그의 리간드 사이의 상호 작용을 방해할 수 있다. 항체가 결합 할 수 있는 RSPO3 단백질은 인간 RSPO3(예를 들어, GenBank 접근번호 NP_116173), 마우스 RSPO3, 또는 다른 포유 동물 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 A4, A6, B1 또는 hB1과 동일한 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 단일 클론성 항체, 다클론성 항체, 전장 항체(full-length antibodies) 또는 이의 단편, Fc 영역, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편을 함유하는 항체, 단일쇄 항체, scFV 다량체, 1가 항체, 다가 항체, 인간화 항체 및 키메릭 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항원-결합 활성을 갖는 다양한 항체 구조를 포함한다.
본 명세서에 개시된 항체 서열 및 이의 CDR에 기초하여, 당업자는 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 재조합 방법을 사용하여 다양한 형태의 항-RSPO3 항체를 생산할 수 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 항-RSPO3 항체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 구성을 포함하는 분리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)도 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 핵산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16, 또는 이들 서열로부터 하나 이상의 CDR을 함유하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 핵산 분자를 함유하는 호스트 세포가 또한 본 명세서에 제공된다. 핵산 분자 및 호스트 세포는 항-RSPO3 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 설명된 임의의 항체는 RSPO3와 이의 리간드 사이의 결합을 억제하고, RSPO3 기능을 억제하고, 샘플에서 RSPO3 단백질 또는 이의 단편을 검출하고(예를 들어, 면역 어세이에서), RSPO3를 발현하는 조직 또는 세포에 결합하며(예를 들어, 세포를 확인하거나 RSPO3-발현 세포를 분리하기 위해), 암 세포의 성장 또는 전이를 억제하거나, 대상에서 암을 치료하거나, 항-RSPO3 항체 변이체를 생성하는데 사용할 수 있다.
용어 "샘플"은 임의의 생물학적 샘플, 예를 들어 체액 샘플, 혈액 샘플, 세포 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 또는 조직 샘플을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 항-RSPO3 항체는 다양한 투여 경로, 예를 들어 정맥 내, 관절 내(intraarticular), 결막 내(conjunctival), 두개 내(intracranial), 복강 내(intraperitoneal), 흉막 내(intrapleural), 근육 내, 척수강 내(intrathecal) 또는 피하(subcutaneous) 투여 경로에 적합한 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 수용액 또는 동결 건조 제제(lyophilized formulation)일 수 있다. 이는 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 버퍼, 부형제, 안정제 또는 보존제를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 항-RSPO3 항체와 함께 작용하는 다른 활성 성분, 예를 들어 또 다른 치료제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 대상에서 암 또는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
항-RSPO3 항체는 또한 또 다른 분자 또는 모이어티, 예를 들어 단백질 또는 펩티드, 약물(예를 들어, 세포 독성 약물), 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지), 또는 고체 지지체(예를 들어, 비드 또는 플레이트)와 접합할 수 있다. 이러한 항체 접합체는 암을 치료하거나 샘플에서 RSPO3를 검출하는 것과 같은 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
임의의 항-RSPO3 항체로 치료될 수 있는 암 또는 종양은 결장암, 백혈병, 결장직장암, 난소암, 췌장암, 폐암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종 및 두경부암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치료는 단독으로 또는 다른 약물 또는 치료법과 함께 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 또는 종양은 컨트롤(예를 들어, 또 다른 암, 정상 조직 또는 정상 세포)과 비교하여 더 높은 RSPO3의 발현 수준을 갖거나 RSPO-융합 유전자 또는 RSPO3 전좌를 보유한다. 일부 구현예에서, 암 또는 종양은 선종성 용종 대장(APC) 돌연변이, β-카테닌 돌연변이, 또는 과활성화된 Wnt 신호 전달을 갖는다. 선택적으로, 항-RSPO3 항체를 대상에게 투여하기 전에, 대상의 암 또는 종양이 더 높은 RSPO3의 발현 수준을 나타내는 지, 또는 RSPO-융합 유전자를 갖는지 또는 RSPO3 전좌, APC 돌연변이, β-카테닌 돌연변이 또는 과활성화된 Wnt 신호 전달이 있는 지, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
"대상"은 인간 또는 인간이 아닌 동물을 지칭한다. "처리하는(treating)" 또는 "처리(treatment)"는 장애의 증상을 치료(cure), 완화(alleviate), 안도(relieve), 구제(remedy), 개시의 지연 또는 장애를 개선, 장애에 이차적인 질병 상태, 또는 장애에 대한 소인(predisposition)을 시키기 위한 목적으로 장애를 갖는 대상에게 화합물 또는 조성물의 투여를 지칭한다. "유효량"은 처리 대상에서 의학적으로 바람직한 결과를 생성 할 수 있는 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다.
본 명세서에 설명된 항-RSPO3 항체는 원하는 특성, 예를 들어 개선된 안정성, 결합 특이성 또는 생체 내(in vivo) 효능을 갖는 항-RSPO3 항체를 생성하도록 변형 될 수 있다. 항체 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 변형은 하나 이상의 CDR 또는 CDR 외부의 사이트에 도입될 수 있다. 변형은 예를 들어 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함 할 수 있다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 항체 변이체를 생성 할 수 있다. 변형은 무작위로 또는 사이트-특이적으로 도입될 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 기술(alanine scanning mutagenesis technique)은 항체의 항원 결합 활성 및 특이성을 제거하지 않고 변형될 수 있는 잔기를 확인하는데 사용될 수 있다.
이하의 특정예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 개시의 나머지를 제한하지 않는다. 추가의 정교화 없이, 당업자는, 본 명세서의 설명에 기초하여, 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 생각된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.
실시예 1: 재료 및 방법
1. 세포주
써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)에서 획득한 ExpiCHO-S 세포를 제외하고 ATCC로부터 세포주를 구입하였다. DLD-1 및 NCI-H2030 세포주는 10% FBS가 보충된 RPMI에서, 10% FBS가 있는 DMEM에서 293T 세포주, 그리고 ExpiCHO?? 발현 배지 배지(ExpiCHO?? Expression Medium Medium, Thermo)에서 ExpiCHO-S로 성장시켰다. 인간 SNU-1411 결장 종양 세포를 한국 세포주 은행으로부터 획득하고 10% FBS(v/v) 및 페니실린(100U/ml)/스트렙토마이신(100㎍/ml)이 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 배양물을 5% CO2/95% 공기에서 37℃의 가습 인큐베이터에서 유지시켰다.
2. 리포터 분석
Wnt 신호 전달은 β-카테닌/TCF 의존적 전사 반응을 유발한다. Kelvin Kun-Chih Tsai 박사의 선물인 MDA-MB436-TCF/LEF-Luc 세포를 사용하여 Wnt 신호 전달 경로의 활성을 모니터링하였다. 예를 들어, Wang 외. (2013). 위장병학 (145): 1110-1120를 참조한다. 간략하게, MDA-MB436-TCF/LEF-Luc 세포를 10% FBS가 보충 된 RSPO 배지에서 검은 평평한 바닥 96웰 배양 플레이트(Costar)에 시딩(seeding)하고 37℃ 5% CO2에서 밤새 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 24시간 후, 세포를 항-RSPO3 ab, 20ng/ml WNT3a(R&D 시스템) 및 RSPO 리간드(Peprotech Systems)로 처리하고 16시간 동안 추가로 인큐베이팅하였다. 루시퍼라제 활성은 브라이트-글로 루시퍼라제 어세이 시스템(Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega)을 사용하여 측정하였다.
3. 하이브리도마 생성 및 RSPO3 항체 정제
RSPO3에 대한 마우스 단일 클론성 항체는 LTK BioLaboratories(Taiwan)에 의해 생성하였다. 간략하게, 대략 0.5-1.5mg의 RSPO3를 마우스에서 면역화에 사용하였다. 이어서, 면역 비장 세포를 골수종 세포(myeloma cell)와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성하고, 11개의 하이브리도마 클론을 분리하였다. 하이브리도마를 IMDM(GIBCO) 및 불활성화된 20% FBS으로 96-웰 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 이어서, 세포 상청액(supernatants)을 표준 ELISA 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 RSPO3에 대한 결합 능력에 대해 스크리닝하여 하기 설명된 바와 같이 양성 클론을 선택하였다. 양성 클론으로부터의 세포를 96-웰 플레이트에 서브 클로닝하고, 단일 클론을 회수하고, 불활성화된 20% FBS가 보충된 무혈청 배지(SFM, HyClone)에서의 성장에 점진적으로 적응시켰다. 도 1을 참조한다. 이들 마우스에 하이브리도마 세포를 복강 내로 주사하여 복수(ascites) 종양 형성 및 복수액(ascitic fluid) 생성을 유도하였다. 표준 프로토콜에 따라 복수액을 단백질 A-세파로오스(protein A-Sepharose)에 로딩하였다. 정제된 RSPO3 Ab를 아지드 비함유(azide free) PBS 버퍼에 대해 투석시켰다.
4. 하이브리도마로부터 RSPO3 항체의 서열 분석 및 클로닝
하이브리도마에서 IgG 중쇄 및 경쇄의 cDNA 서열을 결정하기 위해, 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 분리하고 랜덤 헥사머에 의한 역전사 효소로 cDNA를 제조하였다. 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, 69831-3) 및 Ig-프라이머 믹스(표 1에 나타냄)를 가변 도메인 결정을 위한 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 생성물을 DNA 서열 분석을 위한 pJET1.2/블런트 클로닝 벡터(CloneJET PCR cloning Kit, Thermo)에 클로닝하였다. RSPO3 항체에 대응하는 유전자 코드 및 코딩된 아미노산 서열은 상기에 개시하였다.
RSPO3 Ab 가변 영역을 클로닝하기 위한 프라이머 세트
프라이머 VL-for
VL-for k1 GACAWTGTTCTCACCCAGTC (서열번호 17)
VL-for k2 GACATCCAGATGACACAGWC (서열번호 18)
VL-for k3 GATRTTGTGATGACCCAGWC (서열번호 19)
VL-for k4 GACATTSTGMTGACCCAGTC (서열번호 20)
VL-for k5 GATGTTGTGVTGACCCAAAC (서열번호 21)
VL-for k6 GACACAACTGTG ACCCAGTC (서열번호 22)
VL-for k7 GAYATTKTGCTCACTCAGTC (서열번호 23)
VL-for k8 GATATTGTGATRACCCAGGM (서열번호 24)
VL-for k9 GACATTGTAATGACCCAATC (서열번호 25)
VL-for k10 GACATTGTGATGWCACAGTC (서열번호 26)
VL-for k11 GATRTCCAGATGAMCCAGTC (서열번호 27)
VL-for k12 GATGGAGAAACAACACAGGC (서열번호 28)
VL-for λ1 GACGCTGTTGTGACTCAGGA (서열번호 29)
VL-for λ2 GACCYTGTGCTCACTCAGTC (서열번호 30)
프라이머 VL-rev
VL-rev 1 GCGTTTBATTTCCAGCTTGG (서열번호 31)
VL-rev 2 GCGTTTTATTTCCAATTTTG (서열번호 32)
VL-rev λ GCCTAGGACAGTCAMCYTG (서열번호 33)
프라이머 VH-for
VH-for 1 GAGGTTCDSCTGCAACAGTY (서열번호 34)
VH-for 2 CAGGTGCAAMTGMAGSAGTC (서열번호 35)
VH-for 3 GAVGTGMWGCTGGTGGAGTC (서열번호 36)
VH-for 4 CAGGTTAYTCTGAAAGAGTC (서열번호 37)
VH-for 5 GAKGTGCAGCTTCAGSAGTC (서열번호 38)
VH-for 6 CAGATCCAGTTSGYGCAGTC (서열번호 39)
VH-for 7 CAGRTCCAACTGCAGCAGYC (서열번호 40)
VH-for 8 GAGGTGMAGCTASTTGAGWC (서열번호 41)
VH-for 9 GAAGTGAAGMTTGAGGAGTC (서열번호 42)
VH-for 10 GATGTGAACCTGGAAGTGTC (서열번호 43)
VH-for 11 CAGATKCAGCTTMAGGAGTC (서열번호 44)
VH-for 12 CAGGCTTATCTGCAGCAGTC (서열번호 45)
VH-for 13 CAGGTTCACCTACAACAGTC (서열번호 46)
VH-for 14 CAGGTGCAGCTTGTAGAGAC (서열번호 47)
VH-for 15 GARGTGMAGCTGKTGGAGAC (서열번호 48)
프라이머 VH-rev
VH-rev 1 CGAGGAGACGGTGACMGTGG (서열번호 49)
VH-rev 2 CGCAGAGACAGTGACCAGAG (서열번호 50)
VH-rev 3 CGAGGAGACTGTGAGASTGG (서열번호 51)
R = A 또는 G; Y = C 또는 T; M = A 또는 C; K = G 또는 T; S = C 또는 G; W = A 또는 T; H = A 또는 C 또는 T;
B = C 또는 G 또는 T; V = A 또는 C 또는 G; D = A 또는 G 또는 T).
5. ExpiCHO-S 세포로부터 B1, hB1 및 기준 항체 131R010의 구축, 발현 및 정제
하이브리도마를 생성하는 항체로부터 VH 및 VL 영역의 cDNA 서열을 GeneDireX, Inc.로 합성하였다. pFUSEss-CHIg-hG1e1 및 pFUSE2ss-CLIg-hk (InvivoGen)는 각각 중쇄(CH) 및 경쇄(CL)의 불변 영역 전에 합성된 가변 영역을 도입하였다. pFUSEss-CHIg-hG1e1 클로닝의 경우, hIL2 신호 서열 하에 EcoRI 및 NheI 절단 부위에 의해 중쇄의 가변 영역을 삽입하여 아미노산 서열을 프레임으로 만들었다. 각각, 경쇄의 가변 영역을 EcoRI 및 BsiWI에 의해 pFUSE2ss-CLIg-hk에 삽입하였다. pcDNA3.4(Invitogen)를 항체 발현 벡터로 사용하기 위해, 이전에 구축된 pFUSEs 플라스미드로부터의 hIgHG-F/hIgHG-R 및 CLIg-F/CLIg-R 프라이머를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 전장 항체를 증폭시킨 후 표준 프로토콜(Thermo)로 설명된 TA TOPO 클로닝하였다.
hIgHG-F; 5'-CATGCCTAGGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3'
(서열번호 52)
hIgHG-R: 5'-GGGTTTCATATGTCATTTACCCGGAGACAGG-3'
(서열번호 53)
CLIg-F: 5'-GGAAGATATCCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3'
(서열번호 54)
CLIg-R: 5'-CCTTAATTAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'
(서열번호 55)
재조합 항체 생산을 위해, ExpiCHO-S?? 세포를 2:3의 비로 중쇄 및 경쇄(예를 들어, pcDNA3.4-hB1H 및 pcDNA3.4-hB1L)를 코딩하는 재조합 플라스미드 pcDNA3.4로 공-형질 감염(co-transfected)시켰다. ExpiCHOTM 발현 배지는 표준 프로토콜을 사용하여 8-10일 후에 수확하였다. 생성된 항체를 Mabselect SuReTM XL(GE Healthcare) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상청액으로부터 정제하였다.
6. RSPO3-결합에서 하이브리도마 항체의 반응성
항체의 RSPO-결합 능력을 평가하기 위해, 정제된 항체를 면역블롯 상에서 RSPO1, 2, 3 및 4와 반응시켰다. 항원-결합 ELISA 어세이를 수행하기 위해, 96-웰 고 결합 폴리스티렌 플레이트(Corning)를 4℃에서 밤새 인큐베이팅함으로써 캡쳐 버퍼에서 2㎍/ml의 재조합 RSPO3 조제용 물질(preparation)로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 0.05% Tween 20(PBST)이 보충된 PBS로 2회 세척하였다. 플레이트를 PBST-10% BSA로 블락하고 실온에서 1시간 동안 ELISA 표준 프로토콜로 어세이하였다.
7. 항체 이소타이핑
항체 이소타이핑의 경우, 마이크로타이터 플레이트(microtiter　plate)를 상기 설명된 바와 같이 RSPO3로 코팅한 후, 이어서 제조사의 지시에 따라 Zymed Laboratories로부터의 마우스 모노Ab ID 키트(Mouse MonoAb ID Kit, HRP)로 분석 하였다.
8. 항체 엔지니어링: Ab 인간화
인간화되고 완전한 기능을 갖는 RSPO3 항체를 생성하기 위해, 본 연구에서는 항체 인간화 기술이 사용하였고, 이 서비스는 Industrial Technology Research Institute(Hsiuchu, Taiwan)에 의해 제공하였다. 이상적인 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체를 상기에 나타냈다. 그러나, 항체 재포장 방법은 일반적으로 친화도 및 안정성에서 약간의 변화를 보여줬다. 예를 들어, Roguska 외. (1996). Protein Eng (9): 895-904; 및 Roguska 외. (1994). Proc Natl Acad Sci USA (91): 969-973을 참조한다.
9. RSPO3 Ab의 결합 스크리닝
스트렙타비딘-코팅된 센서는 ForteBio 핸드북에 설명된 바와 같이 10㎍/ml의 비오티닐화된 RSPO3로 코팅하였다. 항체 농도는 0.75 내지 93.8nM의 범위였다. 0.5% BSA를 갖는 pH-조정된 PBS로 정량적인 키네틱 결합 분석을 수행하였다. 모든 단계는 1000rpm에서 연속 쉐이킹 속도로 30℃에서 수행하였다.
10. RSPO3 Ab의 결합 분석
α-RSPO3 Ab 및 재조합 인간 RSPO3 단백질(hRSPO3) 사이의 결합 키네틱을 CM5 시리즈 S 센서 칩(GE Healthcare)이 장착된 Biacore T200 바이오센서를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 러닝 버퍼는 최종 pH 7.4를 갖는 HBS-EP 버퍼(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)이었다. hRSPO3 단백질을 약 27.5 반응 단위(RU)의 코팅 밀도로 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. α-RSPO3 Ab를 HBS-EP 중 6.25nM에서 0.39nM로 2배 연속 희석하고 각각 30㎕/분의 유속으로 120초 동안 칩 표면에 주사 한 후, 최종 900초로 해리 단계를 수행하였다. 획득된 센서그램은 기준 표면상에서 획득된 신호 및 러닝 버퍼의 신호를 이중 감산(double subtracting)하여 보정하였다. 센서그램은 1:1 결합 모델을 사용하여 BIAcore T200 평가 소프트웨어 3.0에 전체적으로 맞춰 α-RSPO3 Ab에 대한 친화도 상수(KD 값)를 산출하였다. 독립적으로 제조된 α-RSPO3 Ab 희석 시리즈 및 huRSPO3 코팅된 칩 표면을 사용하여 개별 실험에서 복제 측정을 수행하였다.
11. PepSet ELISA에서 항체 결합 에피토프 맵핑
PepSet 라이브러리용 ELISA를 사용하여 α-RSPO3 hB1 항체 및 RSPO3 결합 에피토프를 결정하였다. RSPO3의 추론된(deduced) 아미노산 서열(GenBank 접근번호 NP_116173)을 RSPO3의 성숙 도메인을 커버하는 비오티닐화된 선형 펩티드의 PepSet 라이브러리를 설계하기 위한 기준 서열로서 사용하였다. Mimotopes(빅토리아, 호주)에 의해 합성된 121개의 펩티드는 길이가 10인 아미노산이었으며, N-말단 펩티드의 경우 Biotin-SGSG-PEPTIDE-NH2 및 C-말단 펩티드의 경우 Biotin-SGSG-PEPTIDE-OH의 2가지 포맷의 잔기로 오프셋(offset)하였다. 펩티드(1-3mg)를 200 마이크로리터 80/20 DMSO/물 혼합물에 용해시키고, 작업 용액으로서 0.1% BSA 및 0.1% 소듐 아지드를 함유하는 PBS에서 1:200으로 추가로 희석하였다. 플레이트의 각 웰에 상이한 비오티닐화된 펩티드를 부착시키기 위해, NeutrAvidin으로 코팅되고 BSA(Thermo Scientific Pierce, Rockford, lL)로 블락된 플레이트를 사용하였다. 플레이트를 0.1% Tween 20을 갖는 1X PBS로 3회 세척한 다음, 100ml 비오티닐화된 펩티드 용액을 각 웰의 플레이트에 적용하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 플레이트를 1X PBST로 다시 3회 세척 하였다. 이어서, 10㎍/㎖의 α-RSPO3 항체를 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 교반하면서 인큐베이팅하였다. 펩티드에 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 다시 3회 세척하였다. 결합된 항-RSPO3 항체를 검출하기 위해, 염소 항-인간 IgG-Fc-HPR을 1시간 동안 플레이트에 적용하였다. 1XPBST로 플레이트를 세척하여 추가 검출 항체를 제거한 후, 100㎕의 테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB) 기질 용액을 20분 동안 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 비색 반응을 2N HCL에 의해 중단시키고 각각의 웰의 450nm에서의 광학 밀도를 즉시 측정하였다.
12. 사슬 내 이황화 결합을 갖는 합성 시클릭 펩티드를 사용한 항체 결합 에피토프 맵핑
플레이트 상에 상이한 비오티닐화된 펩타이드 또는 단백질을 부착시키기 위해, 1㎍/ml의 비오티닐화된 시클릭 펩티드 및 100ng/ml의 비오티닐화된 재조합 인간 RSPO3를 NeutrAvidin 사전-코팅된 플레이트(Thermo Scientific Pierce)에 적용 하였다. 시클릭 펩티드를 0.1M DTT로 먼저 처리하여 시클릭 펩티드의 환원 형태(reducing form)를 생성시켰다. hB1과 다른 시클릭 펩타이드 사이의 결합을 조사하기 위해, 2㎍/ml의 hB1을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 인큐베이팅 및 세척 후, 이어서 염소 항-인간 IgG-Fc-HPR(Chemicon)을 플레이트에 적용하였다. 1XPBST로 플레이트를 세척하여 추가(extra) 검출 항체를 제거한 후, 100㎕의 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 10 분 동안 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 비색 반응을 2N HCL에 의해 중단시키고, 각 웰의 450nm에서의 광학 밀도를 즉시 측정하였다.
13. Ab/수용체/리간드 결합의 경쟁 ELISA
RSPO3의 결합에 대해 상이한 α-RSPO3 항체가 LGR5 또는 RNF43과 경쟁하는지 여부를 시험하기 위해, 재조합 인간 RSPO3(Peprotech) 500ng/ml를 플레이트 상에 코팅하였다. 재조합 LGR5(22-560)-Fc(R&D)를 검출 목적으로 비오틴과 접합시켰다. 이어서, 30ng/ml의 비오티닐화된 LGR5를 각각 다양한 농도의 α-RSPO3 항체 또는 이소타입 컨트롤 항체와 혼합하고 RSPO3 코팅된 웰에 적용하였다. 이어서 항-스트렙타비딘-HRP 항체를 첨가하여 결합된 비오티닐화된 LGR5를 검출하였다. 500ng/ml의 재조합 인간 RSPO3(Peprotech)를 플레이트 상에 코팅하였다.
상이한 α-RSPO3 항체가 RNF43에 대한 RSPO3의 결합을 경쟁할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 각각의 200ng/ml의 재조합 Hig-태그된 RNF43(RNF43-His16108-H08H, Sino Biological)의 혼합물과 20㎍/ml의 다른 α-RSPO3 항체를, 각각의 웰에 적용하였다. 이어서, 결합된 RNF43-His의 검출을 위해 마우스 항-His 태그 항체-HRP(BioLegend)를 첨가하였다. 인큐베이팅 후, 1XPBST, 100㎕ 테트라메틸벤지딘 (TMB)으로 플레이트를 세척하여 과량의 검출 항체를 제거한 후, 기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 비색 반응을 2N HCL에 의해 중단시키고, 각 웰의 450nm에서의 광학 밀도를 즉시 측정하였다.
14. 인간 결장직장 선암종 DLD1 세포의 "상처 치유" 능력에서 α-RSPO3 Ab의 효과
DLD-1 세포를 16시간 동안 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지와 함께 Culture-Insert 2 Well(ibidi, Martinsried, 독일)에서 웰당 40000 세포로 시딩하였다. 배양 삽입물을 제거한 후, 세포를 20ng/ml Wnt3a 및 50ng/ml RSPO3의 존재 하에 저 세럼(0.5%) 배지에서 100㎍/ml 컨트롤 인간 IgG1 항체 또는 100㎍/ml 항-RSPO3 항체 중 하나로 처리하였다. 이어서, 샘플을 생세포 이미지 시간 경과 현미경 시스템(live cell image time lapse microscopy system, Leica AF6000 LX)에 적용하여 DLD-1 세포의 이동을 관찰하였다. 시작 시 10X 대물 렌즈 아래에서 각 웰의 3개의 위치를 선택하였고, 이들 위치의 상(phase) 이미지는 매 30분마다 최대 60시간 동안 Zyla 4.2 sCMOS 카메라에 의해 획득하였다.
15. CR3150 RSPOhigh PDX 모델에서 hB1의 효능 평가
전-임상(preclinical)으로 생체 내 효능을 평가하기 위해, 결장직장암 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델 CR3150을 본 연구에 사용하였고, 서비스를 Crown Bioscience Inc.(Taicang, 중국)에 의해 제공하였다. 암컷 BALB/c 누드 마우스는 종양 발달을 위해 1차 CR3150 종양(직경 2-3mm)의 단편을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 크기가 약 190mm3에 도달하면, 종양을 가지는(tumor-bearing) 마우스를 무작위로 그룹으로 할당하고, 25mg/kg의 테스트 물품 또는 비히클(PBS)을 4.5주 동안 일주일에 2회 복강 내(i.p.)로 주사하였다. 종양 부피는 매주 2회 캘리퍼(caliper)에 의해, TV = 0.5×a×b2의 공식을 사용하여 측정하였고, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이다. 인도적 종점에 도달하는 종양 크기로 인해 동물을 희생시켰으며, 그리고 종양 부피의 마지막 값은 연구가 끝날 때까지 진행되었다.
평균 및 표준 오차를 포함한 통계적 분석이 종양 부피에 대해 제공하였다. 두 처리 요법은 독립적이었으므로, 컨트롤에 대한 각각의 처리 사이의 비교를 위해, 독립적인 샘플 t-테스트를 수행하였다. 모든 데이터는 SPSS 18.0을 사용하여 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
16. CR3150 PDX 모델에서 hB1의 분자 반응 평가
RSPO3 융합 PDX 모델로부터의 종양 샘플을 Q-PCR에 의해 분석하였다. RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, #15596-018)에 의해 추출하였고, cDNA는 M-MLV RT, RNase H Minus(Promega, #M3682)에 의해 합성하였다. 쥐과(murine) 이종이식에서 성장한 항체-처리된 인간 종양의 카피수는 실시간 정량적 RT-PCR(KAPA SYBR FAST qPCR Kit, KAPABIOSYSTEMS, #KK4604)을 사용하여 결정하였다. 2㎕ cDNA를 18㎕ PCR 혼합물에 첨가하고 95℃에서 1분의 개시 단계로 반응을 시작한 후, 95℃에서 2초 및 60℃에서 30초를 포함한 40사이클의 증폭을 수행하였다. 실시간 PCR 반응 및 데이터 분석은 LightCycler 1.0 시스템(Roche)으로 수행하였다. GAPDH는 정규화를 위한 하우스키핑 유전자로 사용하였다. PCR 분석에 사용된 프라이머 세트는 표 2에 있다.
Q-PCR 분석에 사용된 프라이머 세트
GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (서열번호 56)
GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC (서열번호 57)
LGR5-F TGATGACCATTGCCTACAC (서열번호 58)
LGR5-R GTAAGGTTTATTAAAGAGGAGAAG (서열번호 59)
AXIN2-F TCCCCACCTTGAATGAAGAA (서열번호 60)
AXIN2-R TGGTGGCTGGTGCAAAGA (서열번호 61)
TCF7-F CACCCGGCCATTGTGC (서열번호 62)
TCF7-R GCTTTTCCCTCGACCGC (서열번호 63)
CD133F GCATTGGCATCTTCTATGGTT (서열번호 64)
CD133-R CGCCTTGTCCTTGGTAGTGT (서열번호 65)
CD44-F TCCAACACCTCCCAGTATGACA (서열번호 66)
CD44-R TCTTCAGGATTCGTTCTGTATT (서열번호 67)
CEACAM7-F GCCAAACAGTGCCCAGACC (서열번호 68)
CEACAM7-R CTCTCGACCGTTGTGTGCG (서열번호 69)
KRT20-F ACGCCAGAACAACGAATACC (서열번호 70)
KRT20-R ACGACCTTGCCATCCACTAC (서열번호 71)
17. RSPOhigh NCI-H2030 폐암 세포 유래 이종이식(CDX) 모델에서 hB1의 효능의 평가
전-임상으로 생체 내 효능을 평가하기 위해, RSPOhigh NCI-H2030 폐암 세포 유래 이종이식(CDX) 모델을 이 연구에 사용하였다. 암컷 누드 마우스에 종양 발생을 위해 NCI-H2030의 한 단편(5*106)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 크기가 약 250mm3에 도달할 때, 종양을 가지는 마우스를 무작위로 그룹에 할당하고 25mg/kg의 테스트 물품, 50mg/kg의 카보플라틴(carboplatin) 또는 비히클(이소 타입 IgG)을 4주 동안 매주 정맥 내(i.v.) 주사하였다. 종양 부피는 3일 마다(1일 투약 및 2일 오프) 캘리퍼에 의해, TV = 0.5×a×b2의 공식을 사용하여 측정하였고, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이다. 인도적 종점에 도달하는 종양 크기로 인해 동물을 희생시켰으며, 그리고 종양 부피의 마지막 값은 연구가 끝날 때까지 진행되었다.
평균 및 표준 오차를 포함한 통계적 분석이 종양 부피에 대해 제공하였다. 두 처리 요법은 독립적이었으므로, 컨트롤에 대한 각각의 처리 사이의 비교를 위해, 독립적인 샘플을 수행하였다. Prism에 의한 이원변량분석(2wayANOVA) 다중 비교를 사용하여 모든 데이터를 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
18. PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체를 보유하는 SNU-1411 결장 이종이식 종양의 성장에 대한 카보플라틴과 조합된 항-RSPO3 항체의 효과
SNU-1411 이종이식 종양에 대한 항체의 효과를 결정하기 위해, 종양을 가지는 동물을 무작위화하고 평균 종양 부피가 대략 150-200mm3에 도달했을 때 처리를 시작하였다. 항체는 격주로 1회(Q2W) 제공하였고 파클리탁셀은 1주일에 1회(Q1W) 투여하였다. 항체 및 파클리탁셀 둘 다 정맥 내로 투여하였다. 전자 캘리퍼로 일주일에 2회 종양 성장을 측정하였다. 종양 부피는 식(LxW2)/2로 계산하였으며, 여기서 L은 종양에서 가장 긴 축이고 W는 종양에서 가장 짧은 축이다. 동물 체중은 일주일에 1회 기록하였다. 약물-관련 부작용의 임의의 부정적인 명백한 사인에 대해 마우스를 자주 검사하였다. 연구가 끝나면 모든 마우스를 안락사 시켰다.
19. 통계학적 분석
데이터는 평균±S.E.M으로 표현하였다. 그룹 간의 평균값의 차이는 비모수 t 테스트(non-parametric t test)로 분석하였다. 다중 비교는 일원 ANOVA 테스트(one-way ANOVA test)에 이어 Tukey의 테스트 후 비교를 사용하였다. p<0.05의 차이는 유의하게 상이한 것으로 간주하였다. 통계 분석용 소프트웨어는 GraphPad Prism4(GraphPad Software Inc)에 의한 것이었다.
20. 조직 마이크로어레이(TMA)-기반 면역조직화학 방법
hB1에 의한 조직 슬라이드에서 RSPO3 단백질에 대한 IHC 표지 강도를 스코어링하고 분석하였다. 모든 조직 마이크로 어레이 슬라이드는 US Biomax로부터 획득하였다. 선암종의 35 케이스, 카르시노이드(carcinoid), 세엽세포암종(acinic cell carcinoma), 샘평편상피암종(adenosquamous carcinoma), 도세포종(islet cell tumor) 및 편평세포암종(squamous cell carcinoma)의 각 1개, 27 개의 암 인접 췌장 조직, 및 13개의 정상적인 췌장 조직, 케이스 당 단일 코어를 함유하는, 췌장 선암종(Pancreatic adenocarcinoma) 조직 마이크로어레이 슬라이드(PA807)를 hB1(1:100)에 의해 RSPO3에 대해 염색하였다. 일치하는 암 인접 폐 조직(26개의 편평 상피 세포 암종(squamous cell carcinoma), 18개의 선암종 및 1개의 샘평편상피암종)을 가지는 NSCLC의 45가지 케이스 및 5개의 정상적인 폐 조직, 케이스 당 복제 코어를 함유하는, 비소 세포성 폐암(non-small cell lung carcinoma, NSCLC) 조직 마이크로어레이 슬라이드(LC10012b)를 hB1(1:100)에 의해 RSPO3 수준에 대해 염색하였다. 75개 케이스의 유방 침습성 도관 암종(breast invasive ductal carcinoma), 케이스 당 복제 코어를 함유하는, 유방 침습성 도관 암종 조직 마이크로어레이 슬라이드(BR1505c)를 hB1(1:100)에 의해 RSPO3에 대해 염색하였다. 36가지 케이스의 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma) 및 일치하는 인접 정상 조직, 9개의 림프절 전이 암종 및 정상 림프절 조직, 플러스 10개의 정상 결장직장 조직을 함유하는, 림프절 전이 암종을 가지는 결장직장 암종 및 일치하는 인접 정상 조직 마이크로슬라이드(CO10012b)를 hB1(1:100)에 의해 RSPO3에 대해 염색하였다.
슬라이드의 신호 강도를 두 명의 보드-인증 병리학자에 의해 평가하였다. 면역염색 스코어(범위: 0, 2-8)는 이전 보고서(비율 스코어: 0=0/100, 1=1/100~1/10, 2=1/10, 3=1/3~2/3, 4=2/3~1, 및 5=100/100; 강도 스코어: 0=음성, 1=약함, 2=중간, 그리고 3=강함)에 따라 비율 스코어 + 강도 스코어로 정의하였다.
실시예 2: RSPO1-4 결합에서 α-RSPO3 하이브리도마의 반응성
항체의 RSPO-결합 능력을 평가하기 위해, 초기 배치-A 클론(A1, A2, A4, A5, A6, A9) 및 배치-B 클론 (B1, B3, B4, B8 및 B9)으로부터 유래된, 몇몇 클론성 하이브리도마의 배양 상청액으로부터의 정제된 단일 클론성 항체(mAbs)는 면역 블롯 상에서 RSPO1, 2, 3 및 4와 반응하였다. 초기 배치-A 클론으로부터의 모든 mAb는 RSPO3와 강한 반응성을 나타냈다. 도 2, (A)를 참조한다. B4 및 B9 mAb만이 RSPO3와의 반응성을 나타냈다. 도 2, (B)를 참조한다. 이어서, 모든 RSPO3-반응 mAb를 4개의 상이한 RSPO인, RSPO1-4 사이의 결합에서 그들의 선택성에 대해 평가하였다. 결과는 클론 A1, A2, A4, A6, B1 및 B8로부터 유래된 mAb만이 ELISA 어세이에서 RSPO3와 반응함을 나타냈다. 도 3을 참조한다.
항체의 RSPO3-결합 친화도를 평가하기 위해, 키네틱 어세이를 Octetsystems에 의해 수행하였다. 배치-A 클론(A1, A4, A6, A9)으로부터의 정제된 단일 클론성 항체(mAbs)를, 기준 Ab-131R002와 함께, RSPO-3와의 결합에 대해 검사하였다. 표 3을 참조한다. 배치-A 클론으로부터의 모든 이들 항-RSPO3 항체는 1.04x10-8 내지 7.8x10-8M 범위의 높은 표적 내 결합 친화도(on-target binding　affinities)를 나타냈다.
RSPO3 단백질 및 항-RSPO3 항체 사이의 결합 친화도
샘플 ID kon(1/Ms) kdis(1/s) KD (M) KD 에러 RMax
131R002 1.05E+06 2.02E-03 1.93E-09 4.78E-11 0.1485
A6 2.41E+05 2.50E-03 1.04E-08 3.57E-10 0.2151
A4 3.27E+04 8.84E-04 2.70E-08 4.82E-09 0.3588
A9 2.70E+04 1.13E-03 4.20E-08 7.12E-09 0.1496
A1 2.83E+04 2.21E-03 7.80E-08 3.80E-09 0.2876
Erbitux 2.55E+01 2.49E-02 9.76E-04 4.17E-02 9.7173
실시예 3: RSPO3-Wnt 신호 전달 경로의 억제
OncoMed Pharmaceuticals Inc.는 여러 RSPO3-결합 항체(로스만투주맙(rosmantuzumab)(131R010) 및 131R002)를 개발하였다. 본 연구에 대한 기준 컨트롤으로서의 역할을 위해, 항체 로스만투주맙 및 131R002가 간행물(US22014/0017253A1)에서 공표된 아미노산 서열에 따라 구축하고 발현하였다. 그 후, 6개의 자체 개발된(in-house developed) 쥐과 mAb(A1, A2, A4, A6, B1, B8)와 131R002 기준 mAb는 여러 가지 바이오어세이로 특성화하였다. 이러한 α-RSPO3 쥐과 mAbs는 RSPO-LGR 신호 전달 경로에 대한 실질적인 억제 활성을 나타냈다. 도 4, (A) 및 (B)를 참조한다. 클론 A4, A6 및 B1만이 RSPO3-Wnt 다운스트림 신호 전달 경로 TCF/LEF-Luc 리포터 시스템을 보유한 MDA-MB436 리포터 세포주에서 용량-의존적 방식으로 유의한 억제 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 도 4. (C)를 참조한다. 이어서 항체 이소타입을 수행하여 클래스 및 서브클래스를 식별하였다. 클론 A4, A6 및 B1은 각각 표 4에 나타낸 바와 같이, 이소타입 IgG1, IgG2a 및 IgG1인 것으로 밝혀졌다.
항체 이소타입핑
포착 항체 A4 A6 B1
IgG1 ++++ - ++++
IgG2a - ++++ -
IgG2b + - -
IgG3 - - -
IgA - - -
IgM - - -
카파 경쇄(Kappa light chain) ++ ++ ++
람다 경쇄(Lambda
light chain)		 - - -
실시예 4: α-RSPO3의 인간화
하이브리도마로부터 mAb의 mRNA 서열을 시퀀싱한 후 CHO 세포에서 cDNA 합성 및 발현하였다. A4, A6 및 B1 하이브리도마에 대응하는 재조합 IgG의 발현 및 정제 후, 이들 IgG는 RSPO3 결합 및 중화에 대해 확인하였다. 인간화를 위해 클론 B1를 선택하였다. 쥐과 mAb는 분자 모델링의 도움으로 가변 도메인 재포장 방법에 의해 인간화하였다. 예를 들어, Safdari 외. (2013). Biotechnol Genet Eng Rev(29): 175-186을 참조한다. 인간화 기술은 또한 쥐과에서 인간 IgG 골격으로의 상보적 결정 영역(CDR)의 이식 및 환자의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위한 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 피하기 위해 항체의 가변 영역 서열에서 T 세포 에피토프의 제거를 포함한다. 이어서, 인간화된 α-RSPO3 mAb를 CHO 세포에서 발현시키고 정제된 항체를 결합 친화도 및 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 검사에 대해 분석하였다. 예를 들어, Liu 외. (2008). Immunol Rev (222): 9-27를 참조한다. 다음의 섹션으로부터의 결과는 쥐과 클론 B1으로부터 유래된 인간화 α-RSPO3 항체, hB1을 생성하기 위한 항체 공학의 성공을 확인하였다.
실시예 4: hB1과 로스만투주맙은 RSPO-WNT 중화 어세이 및 항원 결합 키네틱 어세이에서 동등한 효력을 나타냈다
리드 후보인 hB1의 시험관 내 및 생체 내 항암 활성을 특성화하고 상(Phase) 1a/1b 임상 시험을 받고 있는 로스만투주맙과 비교하였다. hB1 mAb는 항원으로서 인간 RSPO3(hRSPO3)에 기초하여 생성하였다. 대부분의 전임상 생체 내 연구는 쥐에서 수행되기 때문에, hB1이 쥐과 RSPO3(mRSPO3)을 인식하고 중화할 수 있는지 여부를 아는 것이 중요했다. hRSPO3 및 mRSPO3 사이의 아미노산 서열 정렬을 도 5에 나타냈다. hB1은 hRSPO3 또는 mRSPO3 중 하나에 의해 자극된 WNT 리포터 활성을 억제할 수 있었다. 도 6, (A)를 참조한다. 최대 억제성 억제(IC50)의 50%에 필요한 hB1 및 로스만투주맙의 농도는 WNT 리포터 어세이에서 나타난 바와 같이 각각 58.0 및 58.7nM이었다. 도 6, (B)를 참조한다.
hB1의 hRSPO3에 대한 결합 특성을 측정하기 위해, 키네틱 어세이를 Biacore T200을 사용하여 수행하였다. hRSPO3 단백질을 대략 27.5 반응 단위(RU)의 코팅 밀도로 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 도 7에 보이는 바와 같이, hB1과 hRSPO3의 결합 친화도는 로스만투주맙과 hRSPO3의 결합 친화도와 유사하였다. 평형 해리 상수 KD는 모두 피코몰(pM) 수준이었다. 표 5를 참조한다.
Biacore 바이오센서를 이용한 항체-항원 상호 작용의 결합 키네틱의 특성화.
ID kon (1/Ms, *106) koff (1/s, *10-5) KD (pM)
131R010 9.4 ± 1.8 18.1 ± 0.1 20.0 ± 0.4
hB1 1.7 ± 0.8 3.4 ± 0.1 26.8 ± 1.3
실시예 5: 결합 에피토프의 맵핑
α-RSPO3 Ab의 결합 에피토프를 확인하기 위해, hRSPO3 아미노 서열로부터 유래된 중첩 펩티드 라이브러리(각 펩티드 당 10-mer, 오프셋: 2개의 아미노산 잔기, 성숙 hRSPO3를 커버하는 총 펩티드 수: 122)를 Mimotope, Inc.로부터 제조하였다. hRSPO3로부터 유래된 중첩 펩티드에 대한 α-RSPO3 mAb의 결합을 측정하였다. 가능한 결합 에피토프로 확인된 아미노산 서열을 표 6에 나타냈다. 기준 항체는 RSPO3 단편으로부터의 아미노산(a.a.) 7-11 및 a.a. 35-42과 반응한 131R002 및 로스만투주맙, 및 RSPO3 서열의 a.a. 5-11, 35-42 및 195-198과 반응한 하이브리도마 A6 α-RSPO3 mAb을 포함한다. 그러나, A4 또는 hB1 mAb는 검출 가능한 결합 신호를 나타내지 않았다. 결과는 hB1 및 로스만투주맙이 hRSPO3 상에 서로 다른 결합 에피토프를 인식함을 알려주었다. 선형 펩티드를 사용한 에피토프 맵핑 결과(도 8 및 표 6)에 따르면, hB1은 huRSPO3 상의 입체형태적으로 결정된 에피토프에 결합할 가능성이 있다고 결론내렸다. 이 관찰은 hB1과 로스만투주맙 사이의 상이한 결합 모드를 입증하기 위해 중요하다.
펩티드 스캐닝에 의해 α-RSPO3 mAb에 대한 에피토프 맵핑
Abs 신호 서열
131R002 + R7-R11; S35-F42
131R010 + R7-R11; S35-F42
하이브리도마 A6 + R5-R11; S35-F42;R195-K198
하이브리도마 A4 -
hB1 -
α-RSPO3 Ab의 추가 입체형태 에피토프 연구는 그의 타겟 서열을 좁히기 위해 재조합 RSPO3 절단된 단백질 및 시클릭 펩티드 스캐닝을 사용하여 수행하였다. 결과는 hB1이 RSPO3 단백질에서 c-말단 절단된 영역을 인식했음을 입증하였다. RSPO3에서 hB1의 결합 에피토프는 a.a. 33-86로 좁아졌다. 도 9, (A)를 참조한다. RSPO3는 푸린-유사 시스테인-풍부 영역을 함유한다. 지금까지, RSPO3의 3D 구조는 보고되지 않았다. 또한, hRSPO3로부터 유래된 시클릭 펩티드에 대한 α-RSPO3 mAb의 결합을 측정하도록 4개의 시클릭 펩티드(a.a. 40-47, 44-53, 56-75 및 79-94)를 설계하였다. 결과는 hB1이 RSPO3 FR1 영역(잔기 56-75를 포함)에서 도메인을 함유하는 선택된 에피토프를 인식한다는 것을 입증하였다. 도 9, (B)를 참조한다. hB1은 RSPO3 푸린 영역(잔기 56-75를 포함)에서 신규한 에피토프를 타겟으로 하여 RSPO-WNT 경로를 중화시킬 수 있다.
실시예 6: hB1은 LGR5와 경쟁하고 RSPO3에 결합한다
RSPO3의 결합에 대해 상이한 α-RSPO3 항체가 LGR5 또는 RNF43과 경쟁하는지 여부를 조사하기 위해, Ab/수용체/리간드 결합 경쟁 ELISA 어세이를 수행하였다. 131R010 및 5D6은 α-RSPO3 기준 항체로서 Oncomed 및 Genetech로부터 왔다. 수용체 결합 부위에서 RSPO3와 경쟁하기 위해 상이한 α-RSPO3 항체와 LGR5 표면 수용체 간의 상호 작용에 대한 ELISA-기반 분석을 제시하였다.
결과는 이들 α-RSPO3 항체가 컨트롤 Ab 그룹과 비교하여 LGR5와 경쟁하고 RSPO3에 결합함을 입증하였다. 도 10, (A)를 참조한다.
추가적으로, 그들의 수용체 결합 부위에서 공-수용체 RNF43의 결합 능력을 결정하기 위한 경쟁 수용체/리간드 경쟁 어세이를 설계하였다. 우리의 결과는 hB1 및 131R010가 RNF43 및 RSPO3 간의 결합을 방해하지 않았음을 입증하였다. 5D6은 LGR5 및 RNF43과 경쟁하여 huRSPO3에 결합하였다. 도 10, (B)를 참조한다. 우리의 결과는 hB1에 의한 RSPO3의 중화가 LGR5-의존적 경로로부터 WNT/β-카테닌 신호 전달 경로 활성화 기여를 현저하게 감소함을 입증하였다.
실시예 7: α-RSPO3 Ab는 인간 결장직장 선암종 DLD-1 세포의 세포 이동 능력을 억제하였다
RSPO3-Wnt 신호 캐스케이드(cascade)는 세포 침습뿐만 아니라 세포 이동을 조절하기 때문에, 상처 치유 어세이를 수행하여 α-RSPO3 mAb가 이동 능력에 어떻게 영향을 미치는지 시험하였다. Wnt3a 및 RSPO3 처리는 DLD 세포의 이동 활성을 향상시켰다 (선종성 용종 대장(APC) 유전자에서 결실을 지님(harboring)). Wnt3a 및 RSPO3 처리의 존재 하에서 DLD-1의 이동 활성에 대한 이소타입 컨트롤 Ab 및 hB1의 효과를 비교하였다. hB1 및 131R010 α-RSPO3 mAb 둘 다가 Wnt3a 및 RSPO3의 존재 하에서 DLD-1 세포의 상처 치유 활성을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 도 11을 참조한다.
실시 예 8: hB1은 CR3150 PDX 종양 성장을 억제하였다
CR3150 결장 종양은 35세의 아시아 여성 환자로부터 유래하였다. CR3150 종양은 PTPRK-RSPO3 융합 유전자를 지니는 적당히 분화된 관상 선암종이다. 종양을 갖는 마우스는 초기에 4개의 실험 그룹, 즉 비히클(PBS), hB1, 131R010 및 미처리 그룹으로 할당하였다. 테스트 물품 또는 비히클을 1일부터 29일까지 매주 2회 마우스에 i.p.로 주사하였다. 도 12에 보이는 바와 같이, 컨트롤 그룹의 평균 종양 부피는 처리 후 58일에 연구 종료 시 1867.6±475.7mm3에 도달하였다. 25mg/kg으로 hB1로 처리된 그룹은 871.2±227.7mm3의 말단 평균 종양 부피로 분명한 종양 성장 억제(TGI=60.8%, p=0.179)를 유도하였다. 도 12를 참조한다. 25mg/kg으로 131R010으로 처리된 그룹은 또한 말단 평균 종양 부피가 680.2±38.2mm3인 항종양 활성(TGI=71.0%, p=0.067)을 생성하였다. 도 12를 참조한다. 46일 째, 상대 종양 부피를 사용하여 처리 및 컨트롤 간의 차이를 비교했을 때, 통계학적으로 유의한 항종양 활성은 hB1 처리에 대해 TGI=68.4%, p=0.041, 및 131R010 처리에 대해 TGI=69.8%, p=0.039로 기록되었다. 따라서, hB1 및 131R010은 이 연구에서 치료적 이점을 갖는 것으로 여겨졌다. 또한, 이 연구에서 심각한 체중 감소는 없었다. 요약하면, 단일 제제로서 투여된 hB1 및 131R010은 CR3150 환자-유래 결장직장암 모델에 대해 유의한 항종양 활성을 나타냈다.
실시 예 9: α-RSPO3 Ab는 CR3150 PDX 모델에서 분자 반응을 감소시켰다
CR3150 PDX 모델에서 hB1의 분자 반응을 평가하기 위해, 장내 줄기 세포 마커(Axin2 및 LGR5), Wnt 다운스트림 마커(TCF7), 암 줄기 세포 마커(CD133 및 CD44) 및 분화 마커(CEACAM7 및 KRT20)의 발현 수준을 측정하였다. 결과는 hB1 처리 그룹에서 장내 줄기 세포 마커(Axin2 및 LGR5) 및 Wnt 다운스트림 마커(TCF7)의 발현이 초기 단계에서 컨트롤보다 유의하게 낮음을 보여주었다. 도 13을 참조한다. 자체적인(in-house) RSPO3 Ab 그룹의 마지막 투여 후 29일 이내에 분석된 암 줄기 세포 마커(CD133 및 CD44) 및 분화 마커(CEACAM7 및 KRT20)의 발현은 컨트롤 그룹과 비교하여 유의하게 감소하였다. 도 13을 참조한다.
실시예 10: α-RSPO3 Ab는 NCI-H2030 RSPOhigh CDX 모델 종양 성장을 억제하였다
NCI-H2030 폐암 세포는 폐암 환자의 림프절로부터 유래하였다. NCI-H2030 세포는 RSPO3 과발현을 가지는 것으로 나타났다. 종양을 가지는 마우스는 1)비히클, 2)hB1, 3)131R010, 4)카보플라틴+비히클, 5)카보플라틴+hB1, 및 6)카보플라틴+131R010을 받기 위해 6개의 실험 그룹으로 초기에 할당하였다. 도 14를 참조한다. 테스트 물품 또는 비히클을 1일에서 29일까지 주 1회 마우스에 정맥 내 투여하였다. 처리 후 29일 째, 컨트롤 그룹의 평균 종양 부피는 1702±298.1mm3에 도달하였다. 25mg/kg으로 hB1의 처리는 1124±471.8mm3의 말단 평균 종양 부피로 명백한 종양 성장 억제를 유도하였다. 동일한 투여량에서 131R010의 처리는 또한 말단 평균 종양 부피가 1327.4±194.3mm3인 항종양 활성을 생성하였다. hB1은 이 연구에서 치료적인 이점을 입증하였다. 또한, 이 연구에서 심각한 체중 감소는 없었다. 요약하면, 단일 제제로서 또는 카보플라틴과 조합하여 투여된 hB1은 H2030 폐암 CDX 모델에 대해 유의한 항종양 활성을 나타냈다. 또한, hB1은 NCI-H2030 암 이종이식 모델에서 로스만투주맙 보다 우수한 항암 효능을 나타냈다.
실시예 11: α-RSPO3 Ab는 PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체를 보유하는 인간 SNU-1411 결장 이종이식 종양을 억제하였다
PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체를 보유하는 인간 SNU-1411 결장 이종이식 종양에서, 항-RSPO3 항체 hB1의 활성을 기준 항-RSPO3 항체 OMP-131R10과 단독으로 그리고 파클리탁셀과 조합하여 비교하였다. 처리 개시 후 연구 과정 동안 상이한 그룹에서의 평균 종양 크기의 결과를 도 15에 나타냈다. 컨트롤 mAb 그룹의 평균 종양 크기는 18일에 1071mm3에 도달하였다. 단독으로 사용될 때, 131R10 및 hB1은 컨트롤 처리 그룹과 비교하여 SNU-1411 종양 성장에 대해 항종양 활성이 없었다 (p>0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 컨트롤 mAb 처리 그룹에 이어 두 케이스 모두 Tukey의 시험 후 비교함). 도 15의 상단을 참조한다. 평균 종양 부피는 18일에 131R10의 경우 1265mm3이고 HB1의 경우 1177mm3이었다. 파클리탁셀 단독은 18일에 컨트롤 mAb 처리 그룹에 비해 69% 종양 부피 감소를 일으켰다(p<0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 컨트롤 mAb에 이어 Tukey의 시험 후 비교함). 도 15의 상단을 참조한다. 131R10+파클리탁셀의 조합 및 hB1+파클리탁셀의 조합은 18일 째 컨트롤 mAb 처리 그룹과 비교하여 종양 부피를 각각 78% 및 86% 감소시켰다(p<0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 컨트롤 mAb 그룹에 이어 두 케이스 모두 Tukey의 시험 후 비교함). 도 15의 상단을 참조한다. 두 조합 그룹 vs. 파클리탁셀 단독 사이에 통계적 유의성은 없었다(p>0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 파클리탁셀 그룹에 이어 두 케이스 모두 Tukey의 쌍별 비교(pairwise comparison)함). 도 15의 상단을 참조한다. 표 7은 18일에 hB1, 131R10, 파클리탁셀 및 이들의 조합의 항종양 효능을 요약한다. 일반적으로, 항체 처리는 단일 제제 및 파클리탁셀과의 조합에서 잘 견딘다.
컨트롤 mAb 및 항-RSPO3 단일 제제 그룹은 18일에 마지막 투여 후 24시간에 종결하였다. 파클리탁셀 및 조합 그룹에서 동물에 대한 처리를 계속하여 처리 반응 지속 시간을 결정하였다. 파클리탁셀의 항종양 효능은 처리 3주 후 손실되었고, 32일(처리 후 31일)에 950mm3의 평균 종양 부피에 도달하였다. 도 15를 참조한다. 한편, 종양 성장 억제는 두 조합 그룹 모두에 의해 지속되었으며, 32일 째에 파클리탁셀 단독에 대해 131R10+파클리탁셀에 의해 82%, hB1+파클리탁셀에 의해 75%의 종양 부피 감소가 발생하였다(p<0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 파클리탁셀에 이어 Tukey의 쌍별 비교함). 도 15의 하단을 참조한다. 표 8은 32일(처리 후 31일)에 파클리탁셀 및 조합 그룹의 항종양 활성을 요약한다. 조합의 항종양 효능은 36일부터 감소하였다. 46일에 연구 종료 시 평균 종양 부피는 hB1+파클리탁셀의 경우 874±247mm3이고 131R10+파클리탁셀의 경우 399±138mm3이었다.
18일에 PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체를 보유하는 인간 SNU-1411 결장 이종이식 종양에서 단일 제제로서 및 파클리탁셀과 조합된 131R10 및 hB1의 항종양 효능.
처리 N 18일 때 종양 부피 종양 부피 감소, 컨트롤 mAb의 %
컨트롤 mAb 7 1071 ± 152 -
131R10 7 1264 ± 153 -18 ± 14
hB1 7 1177 ± 228 -10 ± 21
파클리탁셀 7 329 ± 59 69 ± 6*
131R10 + 파클리탁셀 7 242 ± 101 78 ± 10*
hB1 + 파클리탁셀 7 156±147 86±4*
* p<0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 컨트롤 mAb에 이어 Tukey의 시험 후 비교함
32일에 PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체를 보유하는 인간 SNU-1411 결장 이종이식 종양에서 파클리탁셀과 조합된 131R10, hB1의 항종양 효능.
처리 N 32일 때 종양 부피 종양 부피 감소, 파클리탁셀 mAb의 %
파클리탁셀 7 949 ± 105 -
131R10 + 파클리탁셀 7 176 ± 76 82 ± 8*
hB1 + 파클리탁셀 7 245 ± 88 75 ± 9*
* p<0.05 일원 ANOVA에 의한 vs. 파클리탁셀에 이어 두 케이스 모두 Tukey의 시험 후 비교함
요약하면, 본 연구는 2주 동안 hB1 또는 131R10 단독으로의 처리가 PTPRK(e13)-RSPO3(e2) 융합 전사체를 보유하는 인간 SNU1411 결장 이종이식 종양에 대해 항종양 효과는 없으나, 파클리탁셀 처리 그룹과 비교하여 유사한 항-종향 활성을 가지는 파클리탁셀과의 조합에서 효과적임을 입증하였다. 파클리탁셀-매개된 성장 억제는 처리 후 3주에 손실되는 반면, hB1 또는 131R10과 파클리탁셀의 조합은 처리 후 4주 동안 유효하게 유지된다. hB1+파클리탁셀보다 느린 속도로 131R10+파클리탁셀에서, 두 조합에 대해 처리 후 35일에 종양 성장이 재개하였다.
실시예12: α-RSPO3 항체 hB1에 의한 유방암, 결장암, 췌장암 및 폐암 조직 마이크로어레이에서 RSPO3의 면역조직화학적(Immunohistochemical) 발현
정상 및 질병 상태의 암 조직에서 RSPO3의 차등 발현을 평가하기 위해, 유방암, 결장암, 췌장암, 폐암 환자에서 병리학적 특징과의 연관성을 조직 마이크로어레이(TMA)-기반 면역조직화학(IHC)에 의해 평가하였다. 80개의 췌장 선암종 및 정상 케이스 조직 어레이에서 RSPO3의 발현은 RSPO3 항체 hB1에 의해 평가하였다. 결과는 91%(21/23)의 종양이 낮거나 강한 RSPO3 양성 염색을 나타냄을 보여주었다. 대조적으로, 8.7%(2/23)만이 췌장 관 선암종 케이스에서 음성 염색을 나타냈다. 결과는 정상 또는 암 인접 췌장 조직과 비교하여 후기 TNM 병기 췌장 관 선암종에서 더 높은 RSPO3 발현이 더 빈번하게 관찰됨을 입증하였다. 도 16을 참조한다.
50개의 폐 비소 세포 암종 및 정상 케이스 조직 어레이에서 RSPO3의 발현을 RSPO3 항체 hB1에 의해 평가하였다. 결과는 종양의 92.3%(24/26)가 낮거나 강한 RSPO3 양성 염색을 나타낸 반면, 7.7%(2/26)만이 n 편평세포암종 케이스에서 음성 염색을 나타냄을 보여주었다. 도 17을 참조한다.
RSPO3 항체 hB1에 의한 RSPO3 발현에 대해 유방 침습성 도관 암종 조직 어레이를 평가하였다. 결과는 종양 샘플의 72%(54/75)가 낮거나 강한 RSPO3 양성 염색을 나타낸 반면, 28%(21/75)만이 유방 침습성 도관 암종 케이스에서 음성 염색을 나타냄을 보여주었다. 도 18을 참조한다.
64개의 결장직장 암종 및 매칭된 인접 정상 조직 마이크로어레이에서 RSPO3의 발현을 RSPO3 항체 hB1에 의해 평가하였다. 결과는 종양의 91.7%(33/36)가 강한 RSPO3 양성 염색을 나타내는 반면, 8.3%(3/36)만이 결장직장 선암종 케이스에서 낮은 염색을 나타냄을 보여주었다. 도 19를 참조한다.
hB1에 의해 검출된 높은 RSPO3 염색은 췌장암, 폐암 또는 유방암 환자에서 먼 곳의 전이와 유의한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.
기타 구현예
본 명세서에서 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 각 특징은 동일, 동등 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특성으로 교제될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 주장하지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 일반적인 일련의 동등하거나 유사한 특징의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 설명된 구현예의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있고, 이의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 구현예의 다양한 변경 및 변형을 수행할 수 있다. 따라서, 기타 구현예들도 청구 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> National Health Research Institutes <120> Anti-RSPO3 Antibodies <130> 218384-0011PCT <150> US 62/595,845 <151> 2017-12-07 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 caggtgcaac tgcaggagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcca cactctaact tactactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attgatccta gcactggtta tagtgaatac 180 aatcaaagat tcgagggcaa ggccacattg actgcagaca agtcctccgg cacagtctac 240 atgcagctga gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaacggg 300 ccctttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcg 345 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Leu Thr Tyr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 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Glu Ala Ser Glu Trp Ser Pro Trp Ser Pro Cys Met 145 150 155 160 Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val 165 170 175 Arg Asp Ile Leu Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro 180 185 190 Thr Ser Glu Thr Arg Thr Cys Ile Val Gln Arg Lys Lys Cys Ser Lys 195 200 205 Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu Asn 210 215 220 Lys Glu Glu Arg Lys Glu Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ser Lys Gly Leu 225 230 235 240 Glu Ser Ser Ile Glu Thr Pro Asp Gln Gln Glu Asn Lys Glu Arg Gln 245 250 255 Gln Gln Gln Lys Arg Arg Ala Arg Asp Lys Gln Gln Lys Ser Val Ser 260 265 270 Val Ser Thr Val His 275 <210> 73 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(273) <223> hRSPO3 <400> 73 Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys 35 40 45 Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala 50 55 60 Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys 65 70 75 80 Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr 85 90 95 Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser 130 135 140 Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr 145 150 155 160 Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val 165 170 175 Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro 180 185 190 Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys 195 200 205 Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn 210 215 220 Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser 225 230 235 240 Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys 245 250 255 Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His 260 265 270 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 75 Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg Met 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 76 Arg Arg Gln Arg Arg Met His Pro Asn Val 1 5 10 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 77 Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe 1 5 10 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 78 Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala Leu 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 79 Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 80 Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys 1 5 10 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 81 Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 82 Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn Lys 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 83 Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys Arg 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 84 Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg Met His Pro 1 5 10

Claims (28)

  1. 서열번호 2, 6, 10 및 14로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열의 중쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
    서열번호 4, 8, 12 및 16으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 서열의 경쇄 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하며,
    여기서 항체는 RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 2로부터의 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 4로부터의 것인, 분리된 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    항체는 서열번호 2의 서열과 적어도 80%가 동일한(identical) 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 서열과 적어도 80%가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 6으로부터의 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 8로부터의 것인, 분리된 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    항체는 서열번호 6의 서열과 적어도 80%가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열과 적어도 80%가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 10으로부터의 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 12로부터의 것인, 분리된 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    항체는 서열번호 10의 서열과 적어도 80%가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 12의 서열과 적어도 80%가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 14로부터의 것이며, 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열번호 16으로부터의 것인, 분리된 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    항체는 서열번호 14의 서열과 적어도 80%가 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16의 서열과 적어도 80%가 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체는 RSPO3 단백질에서 입체형태적으로 결정된(conformationally-determined) 또는 선형 에피토프(linear epitope)에 결합되는, 분리된 항체.
  11. 제1항에 있어서,
    항체는 Fc 영역, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단쇄 항체(single-chain antibody), scFV 멀티머(multimer), 1가 항체(monovalent antibody), 다가 항체(multivalent antibody), 또는 키메릭 항체(chimeric antibody)을 함유하는 항체인, IgG 항체인, 분리된 항체.
  12. 제1항에 있어서,
    항체는 인간화(humanized)된, 분리된 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체는 또 다른 분자와 접합(conjugated)되는, 분리된 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는(encode) 핵산 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  15. 제14항의 분리된(isolate) 핵산을 포함하는, 호스트 세포.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    또 다른 치료제(therapeutic agent)를 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 유효량과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 RSPO3를 억제하는 방법.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 유효량과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 Wnt 신호 전달을 억제하는 방법.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 유효량과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포 성장 또는 암 세포 전이를 억제하는 방법.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    암은 RSPO3 양성 암(RSPO3 positive cancer), RSPO3-융합 양성 암(RSPO3-fusion positive cancer), 선종성 용종 대장(adenomatous polyposis coli, APC) 돌연변이를 갖는 암, β-카테닌 돌연변이를 갖는 암, 또는 과활성화된 Wnt 신호 전달을 갖는 암인, 대상에서 암을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    암은 결장암(colon cancer), 백혈병(leukemia), 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 유방암(breast cancer), 신장암(kidney cancer), 전립선암(prostate cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 흑색종(melanoma), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암(bladder cancer), 교모세포종(glioblastoma), 또는 두경부암(head and neck cancer)인, 대상에서 암을 치료하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에게 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법.
  26. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    항체와 RSPO3 단백질 또는 이의 단편 사이의 특이적인 결합을 어세이(assay)하는 단계를 포함하는, 샘플에서 RSPO3 단백질 또는 이의 단편을 검출하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    RSPO3 단백질은 인간 RSPO3인, 샘플에서 RSPO3 단백질 또는 이의 단편을 검출하는 방법.
  28. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 하나 이상의 상보적 결정 영역에 하나 이상의 변형을 도입하여 항체 변이체를 생성하는 단계; 및
    RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 변이체를 확인하는 단계를 포함하는, RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 변이체를 확인하는 방법.
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