TWI710575B

TWI710575B - 人類抗-fgfr4抗體

Info

Publication number: TWI710575B
Application number: TW104126103A
Authority: TW
Inventors: 雷瑪艾柏罕; 福地圭介; 坦賈朗奇; 約翰內斯班吉; 渡邊一郎; 林新子; 大塚敏明
Original assignee: 德商第一三共歐洲公司; 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2015-08-11
Publication date: 2020-11-21
Also published as: TW201619198A; JP2020183418A; ES2764418T3; EP3180356A1; WO2016023894A1; US20170226213A1; JP7011939B2; US10358498B2; JP2017526671A; PL3180356T3; EP3180356B1

Abstract

本發明關於對抗FGF受體4(FGFR4)之新穎抗體及彼等之醫療用途，尤其是用於診斷、預防或治療與FGFR表現、過度表現或過度活躍相關之疾病。

Description

人類抗-FGFR4抗體

纖維母細胞生長因子(FGF)為具有不同生物活性之生長因子一族，其成員涉及血管生成、傷口癒合、胚胎發育及各種內分泌信號傳導途徑。該人類FGF家族包含18個成員，此18個成員為結構上相關之信號傳導分子。他們藉由與其同源受體(FGFR)，酪胺酸激酶受體一族交互作用來發揮其生物活性。哺乳動物FGFR家族具有四個成員：FGFR1-4，其各由3個胞外免疫球蛋白型結構域(D1-D3)、一個單一跨膜結構域及一個胞內分裂酪胺酸激酶結構域所組成。FGF主要與D2和D3結構域交互作用。各FGFR與FGF之特定子集結合。大多數FGF可結合數種不同之FGFR亞型，而其他FGF可特異活化一種受體或受體之一種同種型。

受體-配體交互作用導致受體二聚體化及自磷酸化，與膜相關蛋白及胞質型輔助蛋白形成複合體並起始數種信號傳導級聯反應。該FGFR-FGF信號傳導系統藉由調節細胞功能和過程，諸如生長、分化、移行、形態發生和血管生成在發育和組織修復中具有重要作用。

FGFR4信號傳導可被數種FGF活化，這些FGF亦活化該FGFR家族的其他成員(Ornitz et al.,1996,J.Biol.Chem.,1996,271：15292-7)，而FGF19係特異於FGFR4(Xie et al.,1999,Cytokine,11(10)：720-35)。活化FGFR4受體導致數種類型之細胞信號傳導，包括開始接續在以FGF刺激FGFR4後之由磷酸化級聯反應介導的信號傳導途徑。當配體結合FGFR4之胞外結構域時，受體二聚體化及後續之酪胺酸激酶殘基磷酸化會藉由誘導信號傳導分子與受體結合而導致信號傳導途徑活化(Vainikka et al.,1992，EMBO，11(12)：4273-4280，及1994,J.Biol.Chem.269：18320-18326)。例如，FGFR4與PLCγl聯結，當已觀察到FGF刺激時，MAP激酶活化和DNA合成增加。與其他人類FGF生長因子受體家族之成員進一步交互作用可能擴充FGFR4之信號傳導潛力且此方法不僅用於信號多樣化，亦用於放大信號(McKeehan W.L.and Kan M.,1994,Mol.Reprod.Dev.39：69-82)。85kDa絲胺酸激酶已被發現會負調節FGFR4之酪胺酸磷酸化，但其確切功能尚未闡明(Vainikka et al.,1996,J.Biol.Chem.271：1270-1273)。FGFR4與NCAM聯結已證明可介導整合素依賴性黏附(Cavallaro et al.,2001,Nat.Cell Biol.3：650-657)，此在腫瘤轉移中可能具有決定性作用。

據報導，FGFR4具有數種細胞作用。該受體參與控制玻管中及活體內之各種細胞的分化過程的控制，諸如骨骼肌分化和再生、間葉組織分化或成骨作用、或在出生後肝臟發育期間之肺泡形成。此外，FGFR4被描述成控制膽汁酸和膽固醇體內平衡且被認為參與控制肥胖。此外，FGFR4在玻管中及活體內控制膽汁生成和膽固醇生成之間的平衡。FGFR4亦參與某些腫瘤現象，諸如肝細胞癌或結腸癌之發展，或乳腺纖維腺瘤細胞或乳癌上皮細胞增殖，諸如乳癌或結腸直腸癌細胞運動性。FGFR4亦被描述過度表現在某些胰臟癌細胞株中且與惡性星形細胞瘤有關。

FGFR4涉及各種疾病因而使得此受體成為診斷及治療應用的重要標靶。在此背景下，有效的策略為使用對抗FGFR4的抗體。尤其是，干擾由FGFR4介導之信號傳導的抗體是理想的。抗FGFR4抗體之實例描述於諸如，下列文獻中：國際申請案WO 03/063893、WO 2012/138975、WO 2013/0183319及美國申請案US 2011/0150903。Bumbaca等人(mAbs 3：4,1-11；2011)描述一種人化之抗FGFR4抗體，其以高特異性結合FGF受體4。此抗體在本文中係作為比較性實例，並稱為GT-13。然而，對新的抗FGFR4抗體仍然有需要。

本發明的基本問題係提供新穎之抗FGFR4抗體及使用彼等來診斷、預防及/或治療與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病的方法。

尤其是，對於新的對抗FGFR4之人類抗體是有需要的。重組製造之抗體經常發生的問題是：在非人類免疫系統中製造之抗體的蛋白質序列與人體中天然產生之同源抗體部分不同。因此，當投予人類患者時其可能具有致免疫性。因此，人們發現，設計用來投予人類之單株抗體較佳為經過修飾以增加其與人體自然產生之抗體變體的相似性。特別有利的為那些為完全人源之抗體，即，其不含有任何非人類來源之部分。因此，本發明的目的在於提供人類對診斷和治療用途有利之人類抗FGFR4抗體。較佳地，該所需抗體應防止FGFR4傳導信號。本文所描述之本發明滿足此需求並提供額外益處。

本發明之第一態樣為針對介於人類FGFR4之胺基酸119至248之間(較佳為介於胺基酸152至240之間(Ig樣結構域2)，更佳為介於胺基酸230至240之間)的抗原決定部位之人類抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物。

該抗體適合用於醫療中，尤其是人類醫療，更特別地，用於診斷、預防及/或治療與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病。

本發明亦提供包含如本文所描述之抗體的共軛結合物。尤其是，抗體藥物共軛結合物為本發明之主題。

本發明之另一態樣為融合蛋白，其中本發明之抗體係連接IL-2或其功能片段。

本發明之另一態樣為編碼該抗體之核酸分子，其可選擇地以可操作方式連接表現控制序列。

本發明之另一態樣為宿主，尤其是包含該核酸分子之重組細胞。該細胞可用於製備該抗體。

本發明還有另一態樣為包含該抗體、該核酸分子或宿主之醫藥組成物，並可選擇地加上醫藥上可接受之載體。

本發明還有另一態樣為用於診斷、預防及/或治療與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病的方法。

本發明關於針對FGFR4之人類抗體或其功能片段或功能衍生物。術語“抗體”特指包含至少一個免疫球蛋白重鏈及至少一個免疫球蛋白輕鏈之分子。各重鏈和輕鏈可包含一個可變結構域和一個恆定結構域。該抗原結合位點可從重鏈和輕鏈之可變結構域形成。可變區(亦稱為可變結構域)包含互補決定區(CDR)，例如CDR1、CDR2和CDR3區及鄰接該CDR之框構區(FR)。熟習本技藝之人士可輕易理解術語“互補決定區”(參見，例如Harlow and Lane(eds.),Antibodies：A Laboratory Manual,CSHL press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)且係指在抗體之可變結構域內，主要與抗原接觸並決定抗體之特異性的胺基酸之延伸。此區亦稱為高可變區。

術語“人類抗體”包含全人類抗體或人化抗體，其中全人類抗體為較佳者。人類抗體可從經基因工程改造之動物製備，例如包含異種免疫系統的動物或來自根據已知技術之抗體展示庫。人類抗體大致描述於van Dijk and van de Winkel(Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001))和Lonberg(Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。人類抗體可經由將免疫原投予已被修改而能夠在回應抗原挑戰時製造完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉基因動物來製備。該等動物通常含有全部或一部分的人類免疫球蛋白基因座，這些人類免疫球蛋白基因座可替代內源性免疫球蛋白基因座，或者存在於染色體外或被隨機整合入動物的染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座大致上已被去活化。用於從轉基因動物取得人類抗體之方法的回顧，參見，例如Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。來自由該等動物產生之完整抗體的人類可變區可進一步，例如藉由與不同的人類恆定區組合來修改。

人類抗體亦可藉由基於雜交瘤的方法製造。用於製造人類單株抗體之人類骨髓瘤和小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株已有描述(參見，例如Kozbor J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63)。經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 103：3557-3562(2006)中。

人類抗體亦可藉由噬菌體展示法產生(參見，例如US 6,248,516、US 5,403,484、US 5,969,108、US 5,885,793、 US 6,696,248、US 5,849,500)。用於從抗體庫選擇人類抗體的技術為本技藝所已知。(參見，例如Carmen,S.et al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；及Siriwardena,D.et al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431)。例如，可使用噬菌體展示法，其涉及使人類抗體可變區以單鏈抗體(scFv)之形式表現在噬菌體表面上並選擇結合抗原之噬菌體(Nature(1991),352,(6336),p.624-628,Journal of Molecular Biology(1992),227,(2),p.381-388，及Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。同樣地，亦可使用另一噬菌體展示法，其涉及使人類抗體Fab(抗原結合片段)表現在噬菌體的表面上並選擇結合抗原之噬菌體(WO 97/08320和WO 01/05950)。可分析基於抗原結合所選擇之噬菌體的基因，從而測定編碼結合該抗原之人類抗體可變區的DNA序列。當結合該抗原之scFv或Fab的DNA序列已清楚後，從其萃取CDR序列並可製備具有該序列之表現載體，再引入合適之宿主中，接著表現基因以取得人類抗體(WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455及Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。

人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體展示庫的Fv選殖株可變結構域序列來生成。然後，可將該等可變結構域序列與所欲之人類恆定結構域組合。用於從抗體庫選擇人類抗體之技術為本技藝所已知。

人化抗體可根據已知技術經由將單株抗體人化來製備。通常，將非人類抗體人化以降低對人類之免疫原性，但同時保留該親代非人類抗體之特異性和親和力。人化抗體及製造彼等之方法可在，例如Alamagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中審視。

本發明亦包含人類抗體之片段，例如上述抗體的部分，其包含至少一個抗原結合位點。抗體片段之實例包括Fab片段、Fab'片段，F(ab')₂片段，Fv片段，雙功能抗體或單鏈抗體分子及其他片段，只要其展現出所需之結合人類FGFR4的能力。為了審視某些抗體片段可參見Hudson et al.,Nat.Met.9：129-134(2003)。

雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點，可能為二價或雙特異性之抗體片段。參見，例如Hudson et al,(2003)。單鏈抗體為包含重鏈可變結構域之全部或部分，或輕鏈可變結構域之全部或部分的抗體片段。抗體片段可藉由各種技術製備，包括，但不限於蛋白水解分解完整抗體及如本文所描述之藉由重組宿主(例如大腸桿菌或噬菌體)製造。

於某些實施態樣中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少二個不同位點具有結合特異性之單株抗體。

於某些實施態樣中，該結合特異性之一係針對FGFR4，而另一結合特異性係針對任何其他抗原。

於某些實施態樣中，雙特異性抗體可結合FGFR4的二個不同的抗原決定部位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位在表現FGFR4之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段之形式。

用於製造多特異性抗體之技術包括，但不限於重組共同表現具有不同特異性的二個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對和“杵臼”結構(knob in hole)基因工程。多特異性抗體亦可藉由下述方法製造：用於製造抗體Fc-異二聚體分子之基因工程靜電轉向效應；交聯二種或多種抗體或片段；使用白胺酸拉鍊來製造雙特異性抗體；使用用於製造雙特異性抗體之“雙功能抗體”技術及使用單鏈Fv並依說明製備三特異性抗體。本文亦包括具有三或更多個功能性抗原結合位點之經基因工程製造的抗體，包括“章魚抗體(octopus antibody)”。

於某些實施態樣中，本文所提供之抗體的胺基酸序列變體可列入考慮，只要其展現出所需之結合人類FGFR4的能力。例如，提高抗體之結合親和力及/或其他生物學性能可能是理想的。抗體之胺基酸序列變體可藉由在編碼該抗體之核苷酸序列中引入適當的修改或藉由肽合成來製備。該等修改包括，例如從抗體之胺基酸序列刪去殘基及/或插入殘基及/或取代殘基。可製造任何組合之缺失、插入和替代以取得最終之構建物，惟其該最終構建物擁有所需之特性，例如結合抗原。

抗體之術語“結合(bind或binding)”意指至少暫時與靶的抗原(即，人類FGFR4之包含含有抗原決定部位的片段) 交互作用或聯結。

於某些實施態樣中，本文提供之抗體的解離常數(Kd)≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10^-8M或更小，例如從10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10¹³M)。

於一實施態樣中，藉由經放射標記之抗原結合分析(放射免疫分析，RIA)來測量Kd值，此分析係以所欲抗體之Fab形式及其抗原進行。

根據另一實施態樣，Kd係使用表面等離子體共振分析與經固定之抗原測量。根據本發明之較佳實施態樣，該抗體為針對如本文所描述之人類FGFR4的抗原決定部位之人類單株抗體。

本申請案之發明者發現針對介於人類FGFR4之胺基酸119至284之間的抗原決定部位的抗體或其功能性片段或功能性衍生物在治療和診斷應用上特別有用。特佳的為針對介於人類FGFR4之胺基酸152至240之間且更佳為針對介於人類FGFR4之胺基酸230至240之間的抗原決定部位的抗體。根據特佳之實施態樣，本發明之抗體係針對包含胺基酸序列RYNY、基本上由胺基酸序列RYNY所組成或由胺基酸序列RYNY所組成的抗原決定部位。

較佳地，本發明之人類抗體所識別之抗原決定部位係位於人類FGFR4之Ig-樣結構域2。

本發明之抗體可為各種免疫球蛋白(Ig)類型，例如IgA-、IgD-、IgE-、IgG-或IgM型，較佳為IgG-或IgM 型，包括，但不限於IgG1-、IgG2-、IgG3-、IgG4-、IgM1和IgM2型。於一較佳之實施態樣中，該抗體為IgG1型。

於本發明之某些實施態樣中，該抗體可包含如下述之特定的重鏈互補決定區CDRH1、CDRH2及/或CDRH3。

於一實施態樣中，該人類抗體包含具有如SEQ ID NO：1至6之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDRH1)。

於進一步之實施態樣中，該抗體包含具有如SEQ ID NO：7至12之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列的重鏈互補決定區2(CDRH2)。

再於進一步之實施態樣中，該抗體包含具有如SEQ ID NO：13至20之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列的重鏈互補決定區3(CDRH3)。

根據本發明之抗體亦可包含特定之輕鏈互補決定區CDRL1、CDRL2及/或CDRL3。

因此，於一實施態樣中，該抗體包含具有如SEQ ID NO：21至23和68之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(CDRL1)。

於進一步之實施態樣中，該抗體包含具有如SEQ ID NO：24至27之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(CDRL2)。

再於進一步之實施態樣中，該抗體包含具有如SEQ ID NO：28至35之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(CDRL3)。

較佳地，本發明之抗體可在一個重鏈內包含特定之CDR組合(即，CDRH1、CDRH2和CDRH3之組合)。

因此，於一較佳之實施態樣中，該抗體包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3之重鏈，其中CDRH1係選自如SEQ ID NO：1至6中所示之序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列，CDRH2係選自如SEQ ID NO：7至12中所示之序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列，且CDRH3係選自如SEQ ID NO：13至20中所示之序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列。

最佳地，本發明之抗體包含含有三個CDR之重鏈，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3之組合係選自表1中所示者。應理解的是，表1中的每一行代表CDRH1、CDRH2和CDRH3的一種特定組合。

根據本發明，更佳地，該抗體在一個輕鏈內包含CDR之特定組合(即CDRL1、CDRL2和CDRL3之特定組合)。

因此，於一較佳之實施態樣中，該抗體包含含有互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3之輕鏈，其中CDRL1具有如SEQ ID NO：21至23和68之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：24至27之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO：28至35之任一序列中所示之胺基酸序列或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之胺基酸序列。

最佳地，本發明之抗體包含含有三個CDR之輕鏈，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3之組合係選自表2中所示者。應理解的是，表2中的每一行代表CDRL1、CDRL2和CDRL3的一種特定組合。

如上述，抗體之互補決定區(CDR)可鄰接框構區。含有三個CDR之抗體的重鏈或輕鏈含有，例如四個框構區。

此外，本發明亦包含那些能與特徵為上述重鏈及/或輕鏈CDR之特定抗體識別同一人類FGFR4上之抗原決定部位的抗體。那些抗體之功能性片段和功能性衍生物亦在本發明之範圍內。為了測定該抗體所識別之FGFR4上的抗原決定部位，可使用源自人類FGFR4之胞外結構域的胺基酸序列之以化學方法製備之蛋白序列衍生的短肽陣列來定位並鑑別抗體之抗原決定部位(Reinicke W.,Methods Mol.Biol.2004,248：443-63)。標示本發明之抗體所結合之FGFR4胞外結構域中的抗原決定部位位置的另一種方法包含Snaps/SELDI(Wang et al.,Int.J.Cancer,2001,June 15；92(6)：871-6)或者可進行諸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述之例行交叉阻斷分析。

根據特佳之實施態樣，本發明之人類抗體包含含有至少一個選自由下列所組成之群組的CDR之重鏈：(a)如SEQ ID NO：1至6中所示之CDRH1，或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之CDRH1序列，(b)如SEQ ID NO：7至12中所示之CDRH2，或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之CDRH2序列，及(c)如SEQ ID NO：13至20中所示之CDRH3，或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之CDRH3序列，及/或包含至少一個選自由下列所組成之群組的CDR之輕鏈(d)如SEQ ID NO：21至23或68中所示之CDRL1，或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之CDRL1序列，(e)如SEQ ID NO：24至27中所示之CDRL2，或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之CDRL2序列，及(f)如SEQ ID NO：28至35中所示之CDRL3，或來自該等序列但有1或2個胺基酸相異之CDRL3序列。

於本發明之一較佳之實施態樣中，該人類抗體包含如SEQ ID NO：52至59之任一序列或與該等序列有1或2個胺基酸相異之序列中所示的重鏈可變區(VH)。此外，較佳地，本發明之人類抗體包含如SEQ ID NO：60至67之任一序列或與該等序列有1或2個胺基酸相異之序列中所示之輕鏈可變區(VL)。特佳之人類抗體為包含如SEQ ID NO：52至59之任一序列中所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：60至67之任一序列中所示的輕鏈可變區之抗體。

特佳者為人類抗體(U4-1)，其包含含有如SEQ ID NO：1中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：7中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：13中所示之CDRH3的重鏈且包含含有如SEQ ID NO：21中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：24中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：28中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：52之重鏈可變區及根據SEQ ID NO：60之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈可變區之序列與SEQ ID NO：52和60中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-2)，其包含含有如SEQ ID NO：2中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：7中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：14中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：22中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：24中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：29中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：53之重鏈可變區及根據 SEQ ID NO：61之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：53和61中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-3)，其包含含有如SEQ ID NO：3中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：8中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：15中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：23中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：25中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：30中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：54之重鏈可變區及根據SEQ ID NO：62之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：54和62中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-4)，其包含含有如SEQ ID NO：4中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：9中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：16中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：22中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：24中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：31中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：55之重鏈可變區及根據 SEQ ID NO：63之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：55和63中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-5)，其包含含有如SEQ ID NO：5中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：10中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：17中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：22中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：24中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：32中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：56之重鏈可變區及根據SEQ ID NO：64之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：56和64中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-6)，其包含含有如SEQ ID NO：6中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：12中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：19中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：22中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：26中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：34中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：58之重鏈可變區及根據 SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：58和66中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-7)，其包含含有如SEQ ID NO：3中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：7中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：20中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：68中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：27中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：35中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：59之重鏈可變區及根據SEQ ID NO：67之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：59和67中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

特佳者為人類抗體(U4-8)，其包含含有如SEQ ID NO：4中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：11中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：18中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：22中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：24中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：33中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：57之重鏈可變區及根據 SEQ ID NO：65之輕鏈可變區。本發明亦包含其中該重鏈及/或輕鏈之可變區的序列與SEQ ID NO：57和65中所示之序列相差1或2個胺基酸的人類抗體。

亦為較佳者的有人類抗體(U4-9)，其包含含有如SEQ ID NO：3中所示之CDRH1、如SEQ ID NO：8中所示之CDRH2及如SEQ ID NO：15中所示之CDRH3的重鏈並包含含有如SEQ ID NO：68中所示之CDRL1、如SEQ ID NO：27中所示之CDRL2及如SEQ ID NO：35中所示之CDRL3的輕鏈。本發明亦包含其中有一或多個CDR有1或2個胺基酸相異的人類抗體或識別在人類FGFR4上之相同抗原決定部位的抗體。於一特佳之實施態樣中，該人類抗體包含根據SEQ ID NO：54之重鏈可變區及根據SEQ ID NO：67之輕鏈可變區。較佳地，抗體U4-9包含抗體U4-3所特有之重鏈及抗體U4-7所特有之輕鏈。在本申請案所提供之實驗中，抗體U4-9證明對FGFR4之親和力較U4-3更高。

如上述，本發明之抗體在其結合特異性和生物活性方面，尤其是其識別人類抗FGFR4之抗原決定部位以減少細胞生長和細胞移行之能力方面、其活化其他抗腫瘤劑及/或使腫瘤細胞對治療性處置敏感化的能力方面顯示出有利之特性。本發明之抗體U4-1至U4-9具有內源性抗腫瘤活性。其特異結合FGFR4且較佳地，顯示出不與其他FGF受體FGFR1-3b、c交叉反應。

該抗體能夠抑制配體結合人類FGFR4。該抗體對配體結合FGFR4之效果可藉由在無(對照組)或有抗FGFR4抗體之存在下將表現此受體之細胞(例如MDA-MB453乳癌細胞)與經放射標記之配體一起培育來測定。那些降低配體對FGFR4受體之結合親和力的抗體或阻斷配體與FGFR4結合之抗體可被鑑定出。已知之FGFR4配體包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18、FGF19及FGF20。內源性表現FGF19之細胞株為Huh-7。本發明之抗體能夠至少部分抑制這些配體結合人類FGFR4。本發明之特佳抗體能夠阻斷一或多種上述配體之結合至少達60%、較佳為至少達70%，更佳為至少達80%或87%。特佳之本發明抗體為那些能夠阻斷FGF19與人類FGFR4之結合至少達80%，更佳為至少85%或至少90%者。

阻斷配體結合人類FGFR4可導致FGFR4信號傳導受抑制。為了選擇可減少由配體誘導之FGFR4磷酸化的抗體，將細胞預先與緩衝液(對照組)或抗體一起培育，再以配體或對照緩衝液處理之。然後，可將細胞溶解並將粗溶胞產物離心以除去不溶之物質。將上清液與抗體特異性純FGFR4和蛋白A-瓊脂糖一起培育以達到有效沉澱。清洗後，可藉由SDS-PAGE將免疫沉澱物分開。然後，以抗磷酸酪胺酸抗體探測凝膠之西方點墨。可視化後，將點墨剝離並以抗FGFR4抗體再次探測。可進行凝膠之反射掃描光密度分析以量化所討論之抗體對由HRG誘導之複合體形成的效果。選擇那些相對於對照組(未經處理之細胞)而言可減少FGFR4磷酸化的抗體。

可進行玻管內實驗以測定本發明抗體抑制經配體刺激之細胞增殖的能力。將適當數量之所欲細胞與在合適之培養基中稀釋的抗體一起培育。將配體直接加入抗體溶液中以刺激細胞，然後使其生長72小時。添加Alamar Blue^TM(Thermo Fisher Scientific，Waltham，麻薩諸塞州；美國)並在37℃下，黑暗中培育。每30分鐘測量590nm處之吸光度。

為了選擇那些可減少由FGFR4介導之細胞移行的抗體，可進行轉移(transmigration)實驗。將血清飢餓細胞與抗體一起培育。可將適當數目之細胞放置在具有8μm孔之經塗層的transwell盤(BD Biosciences公司，美國加州聖荷西)的上方小室中。在單獨使用刺激培養基或含有趨化劑的情況中，係在底部小室中使用於。使細胞移行並隨後染色。計算染色之細胞核；抑制百分比係相對於對照抗體的抑制程度來表示。

我們發現，與已知之抗FGFR4抗體相比較，本發明之抗體具有提升之抗腫瘤活性。該治療性抗體之抗腫瘤效力可在人類異種移植腫瘤研究中評估。在這些研究中，人類腫瘤係以異種移植物之形式生長在免疫缺陷小鼠中，而治療效力係藉由腫瘤生長抑制(TGI)程度測量。為了測定本發明之FGFR4抗體是否干擾裸鼠中人類癌細胞的腫瘤生長，將細胞植入裸鼠中。腫瘤係生長在動物背部的皮下或動物側面。治療可立即開始或當腫瘤達到一定的平均體積時開始。在第一次治療之前，將小鼠隨機分配並進行統計試驗以確保各治療組間之起始腫瘤體積的均勻性(平均值、中位數和標準偏差)。治療開始時先投予25mg/kg之負荷劑量，隨後每週經由腹膜內途徑注射二次25mg/kg。

本發明之抗體適合用於醫療中，尤其是用於人類醫療。抗體可用於預防及/或治療與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病。可使用本發明之抗體預防及/或治療之疾病的實例詳細說明於下文中。

此外，本發明之抗體可作為診斷劑，例如用於診斷與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病。可使用本發明之抗體診斷之疾病的實例描述於下文中。

本發明之抗體可與異源基團，例如效應子基團偶合。該等抗體共軛結合物特別適合用於治療應用。術語“效應子基團”可指細胞毒性基團，諸如放射性同位素或放射性核素、毒素、治療基團或本技藝中已知之另一效應子基團。其中該抗體與治療基團偶合之共軛結合物，所謂的抗體-藥物共軛結合物(ADC)為特佳者。或者，本發明之抗體可與標記基團偶合。該等抗體共軛結合物特別適合用於診斷應用。如本文所使用之術語“標記基團”係指可檢測之標記，例如經放射標記之胺基酸或生物素部分、螢光標記物、酶或本技藝已知之任何其他類型標記。本發明之抗體或抗體片段連接放射性同位素可，例如對腫瘤治療提供益處。不像化療及其他形式之癌症治療，放射免疫療法或投予放射性同位素-抗體組合物可瞄準癌細胞，但對周圍正常健康組織的損害最小。

本發明之另一實施態樣為融合蛋白，其中係將如上述定義之抗體融合至介白素-2(IL-2)。介白素2為由T輔助細胞製造之15kDa細胞因子，其刺激細胞毒性T淋巴細胞及NK細胞。IL-2已在臨床上用於治療黑色素瘤及腎細胞癌，以刺激癌症患者之免疫系統。實現在腫瘤中之長時間的IL-2高劑量可誘導持久的抗腫瘤反應而導致排拒原本可能致命的腫瘤。本發明中已證明將IL-2納入包含本發明之抗體的融合蛋白中，但同時保持其活性是可能。因此，其中本發明之抗體融合至IL-2的融合蛋白適合作為投遞系統，其可保留抗原結合特異性並擁有IL-2之完全活性。

本發明亦關於編碼如上述之抗體的核酸分子。術語“核酸分子”包含DNA，例如單股或雙股DNA或RNA。該DNA可為基因組、cDNA或合成來源或彼等之組合。本發明之核酸分子可以可操作方式連接至表現控制序列，即，連接至對於使該編碼核酸序列之表現生效而言是必要的序列。該等表現控制序列可包括啟動子、增強子、核糖體結合位點及/或轉錄終止序列。合適之表現控制序列的具體實例為本技藝所已知。

根據較佳之實施態樣，本發明針對選自由下列所組成之群組的分離之核酸分子

(a)編碼如上述所定義之抗體、其片段或衍生物之核酸序列，

(b)如SEQ ID NO：36至43及SEQ ID NO：44至51中任一項所示之核酸序列。

(c)與(a)或(b)中之任一序列互補的核酸序列，及

(d)能在嚴格條件下與(a)、(b)或(c)雜交之核酸序列。

根據本發明之特佳的實施態樣，核酸分子包含編碼抗體之重鏈可變區的序列和編碼抗體之輕鏈可變區的序列。於一替換之實施態樣中，提供兩種核酸分子之組合，其中一個核酸分子編碼抗體之輕鏈，而另一核酸分子編碼抗體之重鏈。較佳地，編碼該重鏈可變區之核酸序列係選自如SEQ ID NO：36至43之任一項所示之序列。較佳地，編碼該抗體輕鏈可變區之核酸序列係選自如SEQ ID NO：44至51之任一項所示的序列。特佳者為包含至少一個如SEQ ID NO：36至43中所示之序列及至少一個如SEQ ID NO：44至51中所示之序列的核酸序列之組合。該核酸序列可存在於一個分離之核酸分子內或可在二個分離之核酸分子的組合內。

術語“在嚴格條件下雜交”意指兩個核酸片段在如，例如Sambrook et al.,"Expression of cloned Genes in E.coli" in Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA中所描述的標準化雜交條件下彼此雜交。該等條件為，例如在約45℃下，在6.0×SSC(檸檬酸鈉生理鹽水(Saline Sodium Citrate))中雜交，接著，在50℃下以2.0×SSC進行清洗步驟，較佳為在65℃下以2.0×SSC進行清洗或在50℃下以 0.2×SSC進行清洗，較佳為在65℃下以0.2×SSC進行清洗。

本發明之核酸分子可位在載體上，該載體可另外含有複製起源及/或選擇標記基因。載體之實例有，例如質粒、黏粒、噬菌體、病毒，等。因此，本發明之進一步的實施態樣為包含如本文所揭示之核酸序列的載體。較佳地，該載體為表現載體。該載體可為，例如噬菌體、質粒、病毒或逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體可為具有複製能力的或為複製缺陷的。於後一種情況中，病毒繁殖通常僅在互補性宿主/細胞中發生。

本發明之核酸分子可連結含有用於在宿主中繁殖之可選擇標記的載體。一般而言，質粒載體係在沉澱物中，諸如磷酸鈣沉澱物或氯化銣沉澱物或在與帶電荷之脂質複合的複合體中或在碳基團簇，諸如富勒烯(fullerene)中引入。若該載體為病毒，可在施放於宿主細胞前先在玻管內使用適當之包裝細胞株包裝。

較佳地，本發明之載體為表現載體，其中該核酸分子係以可操作方式連接一或多個允許在原核及/或真核宿主細胞中轉錄和可選擇地表現之控制序列。該核酸分子之表現包含核酸分子之轉錄，較佳為轉錄入可轉譯之mRNA內。確保在真核細胞(較佳為哺乳動物細胞)中表現的調控元件為熟習本技藝之人士所熟知。其通常包含確保轉錄起始的調控序列及可選擇地，包含確保轉錄終止及轉錄子穩定化的多聚A信號。額外的調控元件可包括轉錄及轉譯增強子。允許在原核宿主細胞中表現之可能的調控元件包含，例如大腸桿菌中之lac、trp或tac啟動子，而允許在真核宿主細胞中表現之調控元件的實例有酵母菌中之AOXI或GAL-1啟動子或哺乳動物及其他動物細胞中之CMV(巨細胞病毒)-、SV40(猿猴病毒40)-、RSV啟動子(勞氏肉瘤病毒)、CMV-增強子、SV40增強子或珠蛋白(globin)內含子。除了負責轉錄起始的元件外，該等，調控元件亦可包含轉錄終止信號，諸如SV40多聚A位點或tk-多聚A位點，多核苷酸之下游。在此背景下，合適之表現載體為本技藝所已知，諸如Okayama-Berg cDNA表現載體pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3或pSPORTI(Thermo Fisher Scientific)。較佳地，該載體為表現載體及/或基因轉移或靶向載體。源自病毒，諸如逆轉錄病毒、痘苗病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒之表現載體可用於將本發明之多核苷酸或載體投遞入靶細胞群。熟習本技藝之人士所熟知之方法可用於構建重組病毒載體；參見，例如Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001,3 ^rd edition),N.Y.及Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中所描述之技術。或者，本發明之核酸分子可被重新構建入脂質體中以供投遞至靶細胞。此外，本發明關於包含如上述之核酸分子或載體之宿主。該核酸分子或載體可根據本技藝中已知之任何方法藉由轉化、轉染或轉導被引入宿主中。

該宿主可為原核或真核細胞或非人類之轉基因動物。存在於該宿主中之本發明的多核苷酸或載體可被整合入宿主之基因組中或者其可保持在染色體外。在此方面，亦應理解的是，本發明之核酸分子可用於“基因靶向”及/或“基因置換”，用於恢復突變基因或經由同源重組來創建的突變基因；參見，例如Mouellic,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(1990),4712-4716；Joyner,Gene Targeting,A Practical Approach,Oxford University Press。

該宿主可為任何原核或真核細胞，諸如細菌、昆蟲、真菌、植物、動物、哺乳動物或較佳為人類細胞。較佳之真菌細胞為，例如酵母屬之真菌細胞，尤其是釀酒酵母菌種之真菌細胞。術語“原核”意圖包括可以多核苷酸轉化或轉染，用於表現本發明之變體多肽的所有細菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌，諸如，例如大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。編碼本發明之變體多肽之突變體形式的多核苷酸可使用本技藝一般技術人士普遍所知的任何技術來轉化或轉染宿主。用於製備稠合之可操作地連接之基因及在細菌或動物細胞中表現他們的方法為本技藝所周知(Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001，第3版)。其中描述之基因構建體和方法可用於在，例如原核宿主中表現本發明之變體抗體、抗體片段或其衍生物。一般而言，使用含有啟動子序列(其促進該插入之核酸分子的有效轉錄)之表現載體與宿主有關。該表現載體通常含有複製起點、啟動子和終止子，以及能提供該轉化細胞之表型選擇的特定基因。轉化之原核宿主可根據本技藝中已知之技術在發酵器中生長並培養以達到最佳之細胞生長。然後，可從生長培養基、細胞溶胞產物或細胞膜餾分中分離出本發明之抗體、抗體片段或其衍生物。由微生物或其他方式表現之本發明的抗體、抗體片段或其衍生物可藉由任何習知方式分離和純化，諸如，例如製備型色譜分離及免疫學分離，諸如那些涉及使用單株或多株抗體者。

根據本發明之一種實施態樣，該宿主為人、細菌、動物、真菌、兩棲動物或植物細胞。較佳之動物細胞包括，但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、小鼠胚胎纖維母細胞(NIH-3T3)及許多其他細胞株，包括人類細胞。

於另一較佳之實施態樣中，該動物細胞為昆蟲細胞。較佳之昆蟲細胞包括，但不限於來自SF9細胞株之細胞。

較佳地，該細胞為哺乳動物細胞，例如倉鼠、兔子或人類細胞。最佳地，該細胞為人類細胞。該人類細胞包括，但不限於人胚胎腎細胞(HEK293、293T、293 freestyle)。此外，該人類細胞株包括，但不限於HeLa細胞、人肝細胞癌細胞(例如HEPG2、Huh-7)、A549細胞。根據另一實施態樣，本發明之宿主為非人類轉基因動物。本發明提供包含一或多種本發明之核酸分子的轉基因非人類動物，其可用於製造本發明之抗體。抗體可在組織或體液，例如山羊、牛、馬、豬、大鼠、小鼠、兔、倉鼠或其他哺乳動物之乳汁、血液或尿中製造並從其中回收。參見，例如美國專利案第5,827,690；5,756,687；5,750,172；和5,741,957號。如上述，包含人類免疫球蛋白基因座之非人類轉基因動物可藉由以FGFR4或其部分免疫化來製備。

本發明之抗體可藉由其中該抗體係從如上述之宿主取得的方法來製備。因此，本發明之進一步的實施態樣為用於製備抗體的方法，其包含在允許合成該抗體的條件下培養本發明之宿主並從該培養回收該抗體。

轉化之宿主可根據本技藝中已知之技術生長在發酵器中並培養以達到最佳之細胞生長。一旦表現後，本發明之全抗體、其二聚體、個別輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式可根據本技藝之標準程序純化，包括硫酸銨沉澱、親和柱、柱色層分析、凝膠電泳，等；參見Scopes,"Protein Purification",Springer-Verlag,N.Y.(1982)。然後，可從生長培養基、細胞溶胞產物或細胞膜餾分分離出本發明之抗體或其對應之免疫球蛋白鏈。由，例如微生物表現之本發明的抗體或免疫球蛋白鏈的分離和純化可藉由任何習知方式進行，諸如，例如製備型色譜分離及免疫學分離，諸如那些涉及使用針對，例如本發明抗體之恆定區的單株或多株抗體者。

熟習本技藝之人士將可清楚察知本發明之抗體可進一步與其他部分(例如藥物靶向和成像應用)偶合。該等偶合可在抗體或抗原表現在黏附側之後以化學方式進行或可將該偶合產物經基因工程處理入本發明之抗體或抗原的DNA層級。然後，令DNA表現在合適之宿主系統中並收集該表現之蛋白質，且若需要時，復原之。

根據一實施態樣，在允許表現編碼該抗體之核酸分子的條件下培養如上述之重組細胞。該抗體可從該培養之細胞或培養上清液收集。較佳地，該抗體係從哺乳動物，尤其是從人類細胞製備。

本發明還有另一態樣係關於包含如上述之抗體、共軛結合物、融合蛋白、核酸分子、載體或宿主，可選擇地連同醫藥上可接受之載體的醫藥組成物。

術語“載體”包括那些在使用之劑量和濃度下，對接觸到它們的細胞或哺乳動物無毒性的試劑，例如稀釋劑、穩定劑、佐劑或其他類型之賦形劑。醫藥上可接受之載體的實例為本技藝所周知且包括磷酸鹽緩衝之生理鹽水溶液、水、乳液、諸如油/水乳液、各種類型之潤濕劑、無菌溶液，等。通常，該醫藥上可接受之載體為可用於投遞藥物，尤其是用於投遞抗體分子的水性pH緩衝溶液。該醫藥組成物可藉由眾所周知之習知方法配製，即，藉由將活性劑與載體及可選擇地，其他經常被納入該調製劑中之試劑混合來配製。例如，該組成物可被配製成凍乾調製劑、水溶液、分散液或固體製劑的形式。

合適之組成物的投予可藉由不同方法生效，例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部、皮內、鼻內或支氣管內投予。本發明之組成物亦可直接投予在靶的位點，例如藉由基因槍(biolistic)投遞至外部或內部靶的位點(如大腦)。該劑量方案將由主治醫生及臨床因素決定。

本發明亦包含投予有需要該醫藥組成物之個體該醫藥組成物，尤其是罹患與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之病症的人類患者。如醫學技藝中所周知的，用於任一患者之劑量係取決於許多因素，包括患者的尺寸、體表面和面積、年齡、欲投予之特殊化合物、性別、投予時間和途徑、一般健康狀況和其他欲同時投予之藥物。根據欲治療之病況的類型和嚴重性，可，例如藉由一或多次分開投予或藉由連續輸注來投予有此需要之患者約1μg/kg至15mg/kg之活性成分。根據上述因素，典型之日劑量可在約1μg/kg至約100mg/kg的範圍內。為了在數天或更長的時間內重複投予，根據欲治療之病況，該治療係持續到發生所需之疾病或症狀受抑制。該組成物可藉由任何合適之途徑投予，例如藉由腸胃道外、皮下、鼻內、血管內、靜脈內、動脈內或鞘內注射或輸注。

進展可藉由定期評估來監測。本發明之組成物可經由局部或全身途徑投予。用於腸胃道外投予之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑之實例為聚乙烯、丙二醇、聚乙二醇、植物油，諸如橄欖油及可注射之有機酯，諸如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩衝介質。腸胃道外載劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油(fixed oil)。靜脈內載劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑(諸如那些基於林格氏右旋糖者)，等。亦可存有防腐劑及其他添加劑，諸如，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體，等。

根據本發明之活性劑可與其他活性劑一起投予。該另外之活性劑可單獨投予或為本發明之醫藥組成物的一部分。

根據本發明之一較佳實施態樣，本發明之醫藥組成物可根據該醫藥組成物之所欲用途包含其他試劑。特佳地，該醫藥組成物包含其他活性劑，像，例如另外之抗腫瘤劑、小分子抑制劑、抗腫瘤劑或化療劑。本發明亦關於包含本發明之抗體與至少一種其他抗腫瘤劑之組合的醫藥組成物。該等組合能有效地，例如抑制異常之細胞生長。

本技藝目前已知許多抗腫瘤劑。於一實施態樣中，該抗腫瘤劑係選自治療性蛋白之群組，包括，但不限於抗體或免疫調節蛋白。

於另一實施態樣中，該抗腫瘤劑係選自下列群組：小分子抑制劑或由下列所組成之化療劑：有絲分裂抑制劑、激酶抑制劑、烷化劑、抗代謝物、插入之抗體、生長因子抑制劑、細胞週期抑制劑、酶、拓撲異構酶抑制劑、組蛋白脫乙醯酶抑制劑、抗存活劑、生物反應修飾劑、抗激素，例如抗雄激素和抗血管生成劑。

當然，上述之另外的活性劑不僅可與本發明之抗體在共有之醫藥組成物內一起投予，但它們亦可分別投予。

再於另一實施態樣中，本發明關於診斷方法，其包含測定患者組織或患者樣本中之FGFR4的量及/或定位。於本實施態樣中，特佳為使用如上述之攜帶標記基團的抗體。將所得之患者組織或患者樣本的結果與參考數據相比較可允許診斷與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病。本發明之診斷方法可用於檢測不同細胞、組織或其他合適之樣本中不欲之人類FGFR4的表現、過度表現或過度活躍。因此，可評估與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病發作或疾病狀態。本發明之診斷方法亦可包括在所得結果之基礎上建立用於該患者之治療方案的步驟。

於另一實施態樣中，本發明關於評估表現FGFR4之細胞是否存在的方法，其包含將本發明之抗體與懷疑其表面上帶有FGFR4的細胞或組織接觸。用於檢測樣本中之FGFR4表現的合適方法可為酶聯免疫吸附分析(ELISA)或免疫組織化學(IHC)。

ELISA分析可在微量滴定盤格式中進行，其中，例如微量滴定盤之孔中吸附抗FGFR4抗體。以阻斷劑，諸如乳蛋白或白蛋白漂洗並處理孔以防止非特異性吸附分析物。接著，以測試樣本處理孔。將測試樣本或標準物漂洗掉後，以經標記(例如與生物素共軛結合)之二級抗FGFR4抗體處理孔。將過量之二級抗體清洗去除後，檢測該標記物，例如以抗生物素蛋白共軛結合之辣根過氧化物酶(HRP)及合適之顯色受質檢測。藉由與從標準樣本發展之標準曲線相比較來測定該測試樣本中之FGFR4抗原的濃度。

在IHC方面，可使用經石蠟包埋之組織，其中該組織係，例如先在二甲苯中脫蠟，然後脫水(例如使用乙醇)並在蒸餾水中漂洗。藉由福馬林固定及石蠟包埋而被屏蔽之抗原性抗原決定部位可經由脫去抗原決定部位之屏蔽、酶分解或皂苷而暴露出。為了脫去抗原決定部位之屏蔽，可將石蠟切片在蒸鍋、水浴或微波爐中，在抗原決定部位修復液(例如2N HCL溶液，pH 1.0)加熱20至40分鐘。在酶分解的情況中，可將組織切片在37℃下，在不同的酶溶液(諸如蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈黴蛋白酶(pronase)、胃蛋白酶(pepsin)，等)中培育1030分鐘。

漂洗掉抗原決定部位恢復溶液或過量的酶後，以阻斷緩衝液處理組織切片，以防止非特異性交互作用。加入適當濃度之初級抗FGFR4抗體。將過量之初級抗體漂洗掉並將切片在室溫下，在過氧化物酶阻斷溶液中培育10分鐘。進行另一次清洗步驟後，將組織切片與經標記之二級抗體(例如以可作為酶之錨的基團標記)一起培育。因此，其實例為可被與鏈親和素偶合之辣根過氧化物酶識別之經生物素標記的二級抗體。檢測抗體/酶複合物可經由與合適之顯色受質一起培育來達成。

於另外之實施態樣中，本發明關於阻斷FGFR4功能之方法，其包含在其中該抗體能夠阻斷FGFR4功能之條件下將本發明之抗體與懷疑其表面上帶有FGFR4的細胞或組織接觸。該接觸可在玻管內或活體內進行。

此外，本發明關於用於診斷或治療與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病的套組。本發明之套組包含至少一種如上述之抗體、核酸分子及/或載體。此外，該套組可進一步包含至少一種其他活性劑或其他組分。較佳地，本發明之診斷套組包含如上文中描述之經標記的抗體。此外，該診斷套組可包含關於相同類型之組織或樣本中之FGFR4的量及/或定位的參考數據。參考數據可從一或多個健康個體及/或從一或多個具有已知之疾病狀態的個體取得。比較該參考數據可允許診斷與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病。基於所取得之結果可建立用於該患者之治療方案。

根據本發明，與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病為，例如過度增殖性疾病，諸如癌症。可根據本發明來診斷、預防及/或治療之癌症可選自由下列所組成之群組：肝細胞癌、乳癌、胃癌、結腸癌、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、前列腺癌(prostate cancer)、卵巢癌、軟組織肉瘤、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和肺腺癌及其他表現或過度表現FGFR4之癌症和腫瘤轉移形成。

根據另一實施態樣，該與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病為代謝疾病，尤其是代謝症候群或肥胖。

根據再另一實施態樣，該與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之疾病為心室肥厚、心臟肥大或慢性腎臟病。

本發明將藉由下列圖形及實施例更詳細地說明。

第1圖顯示使用經藻紅蛋白(phycoerythrin)標記之抗人IgG抗體測定與Huh-7結合之抗體U4-3、U4-5和U4-6。

第2圖顯示抗FGFR4抗體U4-3和U4-9結合FGFR4之胞外結構域的測定結果。

第3圖顯示抗原與可逆式捕獲之抗體U4-3的交互作用分析的結果。

第4圖顯示本發明之抗體U4-3與抗體GT-13之物種特異性的比較。

第5圖為顯示人類抗體U4-3結合不同FGF受體之圖形。從圖中可以看出抗體U4-3以高特異性識別人類FGFR4且不會與FGFR族之其他成員交叉反應。

第6圖為顯示抗體結合FGFR4之不同胞外結構域的柱狀圖。

第7圖為顯示測定用於抗體U4-3和GT-13之FGFR4結合抗原決定部位的圖形。由圖中可以看出，被強調之四肽序列RYNY可被U4-3識別，但無法被GT-13識別。

第8圖為顯示測定抗體U4-3與FGFR4之結合的柱狀圖。結果係從FGFR4胞外結構域之丙胺酸掃描誘變取得。從圖中可以看出，FGFR4之結合為高度特異性且D2結構域中之誘變導致結合顯著減少。

第9圖為顯示抗FGFR4抗體U4-3結合配體的圖形。所顯示之hIgG為比較性實例。

第10圖(A)顯示使用不同之U4-3抗體濃度來測定濃度依賴性抑制由b-FGF介導之ERK磷酸化的代表性免疫點墨。

第10圖(B)為顯示來自第10圖(A)之量化數據的柱狀圖。

第11圖顯示藉由抗FGFR4抗體U4-3抑制Huh-7細胞中之內源性FGFR4磷酸化。A：免疫沉澱(IP)；B：全部細胞溶胞產物；C：11A之量化。

第12圖顯示使用抗體U4-3和U4-9之NIH 3T3球體生長分析。

第13圖為顯示在抗FGFR4抗體U4-3或對照IgG抗體之存在下，Huh-7細胞中軟瓊脂株落生長之抑制情形的柱狀圖。

第14圖為顯示在抗體U4-3和對照IgG之存在下培養之ZR-75-1細胞的細胞生長分析結果的柱狀圖。

第15圖為顯示使用不同濃度之U4-3和對照IgG之MG-63球狀體生長分析結果的柱狀圖。

第16圖為顯示在小鼠腫瘤模型中由抗FGFR4抗體 U4-3或GT-13介導之生長抑制結果的圖形。A：劑量-反應；B：不同抗體，C：與GT-13比較。

第17圖在Huh-1(A)及Hep3B(B)腫瘤模型中使用抗體U4-3抑制活體內生長。

第18圖在SNU-761人類肝臟異種移植模型中使用抗體U4-3抑制活體內生長。

第19圖在源自患者之胃異種移植腫瘤模型中的活體內效力。

第20圖在人類結腸異種移植腫瘤模型SW620中的活體內效力。

實施例1：生成FGFR4特異性抗體 分離Fab抗體片段

使用n-CoDeR Fab庫編碼的文(Biolnvent，瑞典Lund)來分離識別人類FGFR4的Fab抗體片段。針對人類FGFR4-Fc(R & D系統，明尼阿波利斯，明尼蘇達州；美國)、人類FGFR4-His/Myc或穩定表現人類FGFR4之大鼠肌母細胞株L6(ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州；美國)進行篩選作為差別淘選法。在陰性選擇中使用其他族之人類FGFR-Fc(R & D系統)，人類Fc(Jackson Immuno Research，Newmarket；英國)和L6細胞。在液體淘選中，以EZ連接NHS-產色-生物素(EZ-Link NHS-Chromogenic-Biotin)(Thermo Fisher Scientific)將人類FGFR4-Fc和人類 FGFR4-His/Myc生物素化。加入Dynabeads M-280鏈親和素(Thermo Fisher Scientific)以回收FGFR4結合噬菌體。在固體淘選中，將人類FGFR4-Fc和人類FGFR4-His/Myc直接固定在聚苯乙烯球上。將噬菌體與小珠一起培育，藉由清洗除去球或表現FGFR4之L6細胞和未結合之部分。藉由與胰蛋白酶一起培育來釋出經結合之噬菌體並在大腸桿菌中擴增。在五次不同的淘選後，以Fab-表現質粒轉化大腸桿菌(TOP10F')，最後表現個別Fab選擇株。

實施例2：鑑定獨特之FGFR4結合Fab

依下述測試來自上述第三輪淘選之Fab的結合：將1皮莫耳之FGFR4-Fc或FGFR4-His/Myc塗層在ELISA盤的每一個孔上並在4℃下培育一整夜。清洗和阻斷後，將表現該Fab之大腸桿菌TOP10F'的培養基加入孔中並培育1小時。最後，經由與過氧化物酶共軛結合之抗His抗體(R&D系統)或過氧化物酶共軛結合之抗人類Fab(Jackson Immuno Research)一起培育來檢測經結合之Fab。藉由加入Super Signal ELISA Pico化學發光受質(Super Signal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate)(Thermo Fisher Scientific)來檢測信號。使用標準測序技術來分析FGFR4-結合Fab的序列以鑑定獨特之選殖株，並藉由流式細胞儀分析經純化之獨特Fab與表現人類FGFR4(瞬時或穩定表現)之L6或293T細胞的結合。經確認，FGFR4-結合Fab選殖株藉由使用標準重組技術被轉化成IgG格式。

實施例3：經由Elk1螢光素酶報告子基因分析測試FGFR4結合Fab的信號中和活性

經由Elk1螢光素酶報告子基因分析來測試Fab結合FGFR4之功能性，係依下述建立該Elk1螢光素酶報告子基因分析：將穩定表現整合素αv和整合素β3之HEK293細胞接種在96孔培養盤上並根據製造商之實驗計劃使用脂質體轉染試劑2000(Lipofectamine 2000)以下列群組瞬時轉染：pcDNA-DEST40-hFGFR4、pcDNA-DEST40、pFA2-Elk1(Agilent Technologies，Santa Clara，加州；美國)、pFR-Luc2CP，含有置於pGAL4.12[luc2CP]和pGL4.74[hRluc/TK](Promega，美國威斯康辛州麥迪遜)之選殖位點的5×pFR-Luc的GAL4結合元件(Agilent Technologies)。第二天，將細胞與Fab(在DMEM 2%FBS中稀釋成濃度為10、1、0.1μg/ml)在37℃下一起培育1小時，再與配體10ng/ml(重組人類FGF-17(rhFGF17)，R&D系統)一起培育6小時。最後，藉由加入Dual Glo螢光素酶分析系統受質(Promega)來測定螢光素酶活性。計算特定(螢火蟲螢光素酶)活性對信號之標準化(海腎螢光素酶(renilla luciferase))比例，不同Fab之數值係以相對於對照組數值之百分比顯示(表3)。測試之所有Fab顯示出顯著之抑制活性，在1μg/ml下降低信號超過50%，在10μg/ml下降低超過35%。

實施例4：藉由流式細胞儀測定在Huh-7細胞中之抗FGFR4抗體的KD。

將Huh-7細胞(從JCRB細胞庫取得)在標準條件下，在37℃和5%CO₂下培養在含有10%FBS之DMEM中。以5mM EDTA(在PBS中)收穫細胞並將每一樣本200,000個細胞與指定之抗FGFR4抗體(1：3系列稀釋；起始濃度為30μg/ml)在4℃下一起培育30分鐘。培育後，清洗細胞並使用經藻紅蛋白標記之抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research)測定經結合之抗體。以BD Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences，聖荷西，加州；美國)測量結合Huh-7之抗體並使用AccuriC6軟體分析。隨後，使用Prism(GraphPad軟體，拉荷亞，加州；美國)測定該平衡解離常數(K_D)。計算之U3 Pharma抗體的K_D值非常相似(介於0.2至1.6nM之間)。第1圖顯示代表性實驗並獨立地測定其餘抗體之K_D值。結果發現當與所有測試之U3 Pharma抗體相比較時，GT-13之親和力較低(表4)。

實施例5：藉由ELISA測定抗體U4-3和U4-9針對FGFR4之胞外結構域(ECD)的K _D 。

從Bio-Rad公司(Hercules，加州；美國)取得小鼠抗His標籤抗體並以2μg/ml之濃度塗層在MaxiSorp®平底96孔ELISA盤(Sigma，聖路易斯，密蘇里州；美國)上。塗層後，加入濃度為0.01μg/ml之人類FGFR4的胞外結構域(經myc-和His標籤)。除去未經結合之蛋白後，加入指定之抗FGFR4抗體(1：4系列稀釋，起始濃度為10μg/ml)，最後，在來自BMG Labtech(奧滕貝格(Ortenberg)；德國)的Fluostar Omega螢光盤分析儀上，使用鹼性磷酸酶偶合之山羊抗人類IgG F(ab')片段，以AttoPhos®AP螢光受質系統(Promega)檢測結合。代表性結果顯示於第2圖中。接著，使用Graph Pad Prism計算U4-3、-5和-9之解離常數(表5)。測試之所有抗體顯示出優異之KD，而所觀察到之U4-3的數值類似於先前所觀察者。

實施例6：使用Biacore分析測定U4-3之K _D 。

應用標準之胺偶合來製備山羊抗人類IgG捕捉S-CM5感測器晶片(該參考之流動池亦含有該捕獲抗體)。藉由注入200mM EDC和50mM NHS之混合物共7分鐘(10μl/min)來將羧甲基化之葡聚醣(CMD)表面活化。隨後，注入在10mM醋酸鈉pH 5.0中稀釋之30μg/ml抗人類IgG抗體共7分鐘(10μl/min)。以1M乙醇胺pH 8.5將剩餘之未反應的酯淬火(7分鐘，10μl/ml)。抗人類IgG抗體所得之表面密度為17892-18376RU。

在25℃，HBS分析緩衝液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，50μM EDTA，0.05%Tween 20)中使用BiacoreTM T100儀器(GE Healthcare Bio-Sciences(Piscataway，紐澤西州；美國))進行抗原與可逆式捕獲之抗體的交互作用分析。在流動池上捕獲37-38RU之特異性抗體。隨後，以單一循環模式分別注入抗原之5種系列三倍稀釋液(3.7、11.1、33.3、100和300nM)共2分鐘(50μl/min)。在相同流速下記錄解離10分鐘。使用含有抗人類IgG捕獲抗體之流動池作為參考。藉由重複注入輔以最終百分比5%之1,4-二噁烷的10mM甘胺酸pH 1.7來完成完全再生(從捕獲表面去除特異性抗體連同結合之抗原)。

使用Biacore T100評估軟體2.0.3版，藉由全面擬合應用二價分析物結合模型來進行數據處理(例如空白運行減法(blank run subtraction))和評估。經由kd1除以ka1來計算平衡解離常數KD1。第3圖顯示出抗體U4-3之代表性測量；此抗體和U4-9之K_D值(3個測量值之平均值)報告於表6中。

實施例7：藉由流式細胞儀測定物種特異性。

從CLS取得Hek293細胞(Cell Lines Service,Eppelheim；德國)並在標準條件下，在37℃和5%CO₂下培養在含有10%FBS的DMEM中。在第0天，以4×10⁵個細胞/10cm皿之密度接種細胞。24小時後，以來自大鼠、小鼠、人或食蟹猴之編碼FGFR4的質粒轉染細胞。令細胞表現該蛋白質48小時，然後以在PBS中的5mM EDTA從培養皿將細胞分離出，接著與指定濃度之抗FGFR4抗體U4-3或GT-13一起培育。使用與藻紅蛋白共軛結合之抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research歐洲)來測定結合。以BD Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences公司)取得數據並使用AccuriC6軟體進行分析。抗體滴定實驗(起始濃度為10μg/ml；1：3稀釋)可允許計算抗體之解離常數(見下表)。該抗體顯示出在非常低的濃度[1μg/ml]下對所有已測試之物種具有類似的親和力且在顯示出對人類和獼猴蛋白具最佳結合的物種之間K_D值彼此相當。然而，當與GT-13相比較時，U4-3在測試的所有物種之間顯示出較佳之結合。

實施例8：結合其他FGFR。

依指示(胞外結構域，Fc嵌合體)以從R & D系統取得之重組人類FGFR(或作為對照組之BSA)將購自Thermo Fisher Scientific之Nunc MaxiSorp®平底96孔ELISA盤塗層，最終濃度為100μg/孔並根據製造商之說明處理。依指示與抗FGFR4抗體U4-3一起培育後，使用自Promega公司購得之AttoPhos®AP螢光受質系統(AttoPhos®AP Fluorescent Substrate System)，以與鹼性磷酸酶偶合之山羊抗人類IgG F(ab')檢測結合及以來自BMG Labtech之Fluostar Omega螢光分析儀檢測結合。結果顯示於第5圖中。

抗體U4-3以高特異性識別人類FGFR4，且重要的是，不會與FGFR族之其他成員交叉反應。

實施例9：測定抗體結合FGFR4之不同胞外結構域。

從CLS取得Hek293細胞並在標準條件，在37℃，5%CO₂下培養在含有10%FBS之DMEM中。在第0天，接種細胞並在24小時後以編碼含有該指定結構域之FGFR4的質粒轉染細胞。令細胞表現該蛋白質48小時，然後以在PBS中的5mM EDTA從培養皿分離出細胞，接著再與指定之抗FGFR4抗體一起培育。使用與藻紅蛋白共軛結合之抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research歐洲)來測定結合。以BD Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences公司)取得數據並使用AccuriC6軟體進行分析。U4-3與FGFR4之結合大部分發生在受體之Ig樣結構域2且在Ig樣結構域1(胺基酸22至180)和3(胺基酸249至349)處未觀察到結合。結果顯示於第6圖中。

實施例10：測定結合FGFR4之抗原決定部位。

使用標準Fmoc化學，根據靶的蛋白(人類FGFR4胞外結構域之結構域2)之胺基酸序列合成肽類並使用具清除劑之三氟酸去保護。使用支架上化學連接之肽(Chemically Linked Peptides on Scaffolds)(CLIPS)技術在化學支架上合成該限制性肽以重新建構象型抗原決定部位。藉由在聚丙烯PEPSCAN卡(455肽格式/卡)上與0.5mM CLIPS模板溶液(諸如在碳酸氫銨(20mM，pH 7.9)/乙腈(1：1(v/v))中之1,3-雙(溴甲基)苯)反應來將肽類中之多個半胱胺酸的側鏈偶合至CLIPS模板。將卡在溶液中輕輕搖晃30至60分鐘，同時完全度覆蓋在溶液中。最後，以過量H₂O廣泛清洗該卡並在70℃下，在中斷緩衝液(其含有在PBS(pH7.2)中之1%SDS/0.1%β-巰基乙醇)中超音波處理30分鐘，接著在H₂O中藉由超音波再處理45分鐘。在PEPSCAN為基礎之ELISA中測試抗體與每個肽的結合。將含有共價連接之肽類的455-孔信用卡格式聚丙烯卡與初級抗體溶液(例如包含在阻斷溶液中稀釋之1μg/ml，例如在PBS/1%吐溫中之4%馬血清、5%卵白蛋白(w/v))一起培育。清洗(3×10分鐘)後，將肽與抗體過氧化物酶共軛結合物之1：1000稀釋液在25℃下培育1小時(或鏈親和素-HRP)。清洗(3×10分鐘)後，加入過氧化物酶受質2,2'-連氮基-二-3-乙基苯噻唑啉磺酸化物(ABTS)及2μl之3%H₂O₂。一小時後，測量顏色發展並以電偶合元件(CCD)-照相機和圖像處理系統量化。第7圖顯示出測試之抗體在肽識別中的差異；尤其是強調之四肽序列RYNY可被U4-3識別，GT-13則無法識別。

實施例11：丙胺酸掃描誘變FGFR4胞外結構域。

從CLS取得Hek293細胞並在標準條件下，在37℃和5%CO₂下培養在含有10%FBS的DMEM中。在第0天，以2×10⁵個細胞/60mm皿之密度接種細胞。24小時後，以 4.8μg編碼FGFR4之胞外結構域2(D2)的質粒轉染細胞(表7)。該表現之蛋白攜帶flag標籤且不同處在於如下述之胺基酸序列。令細胞表現該蛋白質60小時(其間有更換培養基)，最後以在PBS中的5mM EDTA從培養皿將細胞分離出。將細胞與指定濃度之抗FGFR4抗體U4-3一起培育並使用與藻紅蛋白共軛結合之抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research歐洲)測定結合。以BD Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences公司)取得數據並使用AccuriC6軟體進行分析。將該螢光強度對flag標籤之表現標準化。結果顯示於第8圖中。

FGFR4之結合為高度特異性且在D2結構區中之單一胺基酸誘變導致結合顯著減少。

實施例12：藉由抗FGFR4抗體抑制配體結合。

根據製造商之說明以從R & D系統取得之重組人類FGFR4(胞外結構域，Fc嵌合體)將購自Thermo Fisher Scientific之Nunc MaxiSorp®平底96孔ELISA盤塗層，最終濃度為4μg/孔並處理。將每個孔與1.2μg/ml來自R & D系統之重組FGF-19一起培育，隨後以指定濃度之抗 FGFR4抗體U4-3處理之。培育和清洗後，以0.2μg/ml之生物素化抗FGF19抗體(R & D系統)檢測經結合之FGF-19，再與鹼性磷酸酶共軛結合之鏈親和素一起培育。經由與AttoPhos® AP螢光受質系統(Promega)一起培育來觸發酶催化性反應並以來自BMG Labtech之Fluostar Omega螢光分析儀檢測。數據顯示出U4-3能夠有效地與FGF-19競爭結合受體。結果顯示於第9圖中。

實施例13：藉由U4-3抑制由b-FGF誘導之ERK磷酸化。

在標準組織培養條件(37℃，5%CO₂)下，使用含有10%FBS的DMEM將穩定表現全長人類FGFR4之L6細胞(ATCC)平皿接種在12孔培養皿中(1×10⁵個細胞/孔)。第二天，以含有指定濃度之抗FGFR4或對照抗體的生長培養基替換該培養基。1小時後，將濃度為20ng/ml之b-FGF(R & D系統)加入指定的孔中。培育10分鐘後，以冷PBS快速清洗孔，再將它們在含有磷酸酶(默克公司，Darmstadt，德國)和蛋白酶(羅氏公司，Basel；瑞士)抑制劑的緩衝劑中溶解細胞。最後，將樣本進行凝膠電泳，再使用來自Cell Signaling(Danvers公司，麻薩諸塞州；美國)之抗ERK和磷酸-ERK抗體進行免疫點墨(在硝基纖維素膜上)。使用來自Li-Cor(林肯公司，內布拉斯加州；美國)之奧德賽(Odyssey)檢測儀連同適當之經螢光標記的二級抗體檢測條帶並量化之。以奧德賽軟體量化條帶並繪製成pERK和總ERK強度之間的比。第10(A)圖顯示出代表性免疫點墨且10(B)顯示出隨後之量化數據。U4-3顯示出以濃度依賴之方式抑制由b-FGF介導之ERK磷酸化。

實施例14：藉由與U4-3抗體一起培育來抑制內源性FGFR4磷酸化。

將在標準條件下，在37℃和5%CO₂下培養在含有10%FBS的DMEM中之Huh-7細胞(自JCRB細胞庫取得)接種在60mm培養皿中(每一培養皿2×10⁵個細胞)。第二天，除去培養基並依指示以含有抗FGFR抗體U4-3(0.1、1、3及10μg/ml)或對照IgG之生長培養基取代之。6天受，以PBS清洗細胞二次並將細胞在IP溶胞緩衝劑(含有來自默克公司之磷酸酶抑制劑和來自羅氏公司之蛋白酶抑制劑)中溶解。使用抗FGFR4抗體(小鼠)及來自GE Healthcare Bio-Sciences公司之rProtein A Sepharose Fast Flow基質將總FGFR4進行免疫沉澱。清洗基質，最後，藉由電泳分離樣本。將蛋白質從凝膠轉移至硝基纖維素膜上並以識別磷酸化之酪胺酸殘基的抗體(檢測pFGFR4)或以識別總FGFR4之抗體(Santa Cruz Dallas，德州；美國)進行點墨，以確保樣本的相等加載。使用適當之二級抗體和來自Li-Cor(林肯，內布拉斯加州；美國)之奧德賽檢測儀檢測條帶。免疫沉澱之代表性掃描顯示於第11(A)圖中，而全細胞溶胞產物之免疫點墨顯示於第11(B)圖中。掃描條帶後，以奧德賽軟體測定FGFR4和pFGFR4之間的比並對IgG對照值標準化，可參見第11(C)圖。抗 FGFR4抗體U4-3顯示出在所有測試之濃度下均強烈抑制FGFR4磷酸化。

實施例15：NIH3T3球體生長分析

將穩定表現人類FGFR4和人類FGF19之NIH3T3細胞培養在含有10%FBS、500μg/ml G418及150μg/ml潮黴素之RPMI1640中。在實驗的第一天，將2000個細胞接種在含有指定濃度之U4-3或U4-9抗體的96孔PrimeSurface盤(Sumitomo Bakelite，東京；日本)的每一個孔內。在標準組織培養箱(37℃和5%CO₂)中培育5天後，使用來自Perkin Elmer公司的VICTOR分析儀(Waltham，麻薩諸塞州；美國)，以CellTiter-Glo®發光細胞存活力分析(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay)(Promega公司)測定細胞生長。將數值對未經處理的樣本標準化，而二種抗體均有效地減少細胞生長超過70%。計算IC50值並測定出分別為24.7nM和10.6nM(U4-9)。結果顯示於第12圖中。

實施例16：抑制Huh-7肝癌細胞之軟瓊脂株落生長

將Huh-7細胞(JCRB細胞庫)在標準條件下，在37℃和5%CO₂下培養在含有10%FBS的DMEM中。以PBS/0.05%胰蛋白酶收穫細胞並重新懸浮於上層瓊脂培養基(Iscove氏修飾之Dulbecco氏培養基(IMDM)，0.4瓊脂，20%FBS)中，再小心地放在固化之底層瓊脂培養基 (0.75%瓊脂，20%FBS在IMDM中)上。96孔盤的每個孔中含有2,000個細胞。在抗FGFR4抗體U4-3(最高濃度30μg/ml)或對照IgG抗體的存在下培育這些孔；隨著時間推移觀察株落形成(約3週)。使用來自Sigma(聖路易斯，密蘇里州；美國)的MTT試劑將存活細胞染色並使用來自Oxford Optronix(Abingdon；英國)之株落計數系統量化株落，再對未經處理之對照組標準化。當與對照抗體相比較時，該測試之抗FGFR4抗體U4-3顯示出以濃度倚賴方式抑制Huh-7細胞生長。結果顯示於第13圖中。

實施例17：ZR-75-1乳癌細胞生長分析。

將ZR-75-1細胞(CLS)培養在輔以10%FBS、10μg/ml胰島素及2mM麩胺醯胺之RPMI1640中。在實驗當天，將2000個細胞接種在含有指定量之抗體的6孔盤的各個孔中。總共將細胞培養16天(37℃及5%CO₂)且每週更換培養基和抗體二次。最後，除去該培養基並以0.5%結晶紫溶液(Carl Roth，Karlsruhe，德國)為細胞染色。以株落計數系統(Oxford Optronix)計算可見之株落並對未接受任何處理之孔(NT)標準化。結果顯示於第14圖中。當與對照處理相比較時，U4-3可有效抑制約50%之可見株落形成。

實施例18：MG-63骨肉瘤球體生長分析。

將1000個培養在MEM(10%FBS)中之MG-63細胞 (ATCC)接種在含有指定量之抗體的96孔PrimeSurface盤(Sumitomo Bakelite)中的每個孔中。在標準組織培養箱(37℃和5%CO₂)中培育5天後，使用來自Perkin Elmer公司的VICTOR分析儀，以CellTiter-Glo®發光細胞存活力分析(Promega公司)測定細胞生長。結果顯示於第15圖中。抗體U4-3減少細胞生長約25%；濃度為0.4μg/ml時已可觀察到此結果。

實施例19：活體內抑制Huh-7腫瘤生長。

小鼠腫瘤模型中由抗FGFR4抗體介導之生長抑制。從查爾斯河實驗室(波士頓，麻薩諸塞州；美國)取得雌性NU/NU裸鼠。出生後六週，經由皮下途徑為動物注射5x10⁶個Huh-7細胞(在基質膠(Matrigel)中，BD Biosciences公司)。注射14天後，匯集具類似腫瘤體積之動物並經由腹膜內注射以抗FGFR4抗體治療之(q3dx3)。在接種腫瘤後第15、18、21和24天，應用公式[體積=0.52×(寬度)²×(長度)]測量腫瘤體積(以mm³計)。第16(A)圖顯示出當以Huh-7處理時的腫瘤生長抑制係呈劑量依賴性，最大生長抑制(約68%)係在25mpk之劑量下觀察到。在10mpk之劑量下，U4-3和U4-9顯示出可比擬之腫瘤生長抑制(第16(B)圖)。當使用相同之給藥方案直接比較U4-3與GT-13時，U4-3顯示出卓越之療效且統計學上明顯較佳地抑制腫瘤生長(第16(C)圖)。

實施例20：在Huh-1和Hep3B腫瘤模型中之活體內生長抑制。 實施例A：在Huh-1腫瘤模型中由抗FGFR4抗體介導之生長抑制。

經由皮下途徑為雌性Balb/c裸鼠(5-6週齡)注射5×10⁶個Huh-1細胞。當腫瘤大小達到150mm³後，藉由腹膜內注射投予抗FGFR4抗體[25mpk]以每週治療動物二次，共3週。依指示，使用公式(L×W²)/2，藉由卡尺測量腫瘤體積(以mm³計)。結果顯示於第17(A)圖。

實施例B：在Hep3B腫瘤模型中由抗FGFR4抗體介導之生長抑制。

依上述處理動物，但使用Hep3B細胞並使用基質膠(BD Biosciences公司)植入。依上述在指定時間測定腫瘤體積。結果顯示於第17(B)圖中。

腫瘤生長受到U4-3抑制，且在Huh-1細胞的情況中，腫瘤生長受抑制達50%以上。

實施例21：活體內抑制SNU-761腫瘤生長。

於另一老鼠肝臟腫瘤模型中由抗FGFR4抗體介導之生長抑制。

自上海靈長生物科技有限公司(LC，上海，中國)取得雌性BALB/c裸鼠。出生後七週，經由皮下途徑為動物注射在0.1ml PBS中之1×10⁷個SNU-761腫瘤細胞(1：1在基質膠中，BD Biosciences公司，聖荷西，加州；美國)。當平均腫瘤尺寸達到119m³時開始治療。經由腹膜內注射投予抗FGFR4抗體，每週二次，共5週。由於腫瘤體積可影響任何指定治療的有效性，根據小鼠之腫瘤體積，使用隨機區組設計將小鼠分配在各組中。這確保所有組別具有可相比較之基線。使用隨機區組設計來分配實驗動物，確保每隻動物具有相同的機率被分配至任何指定的治療組，因而將系統誤差最小化。使用卡尺，每週二維測量腫瘤體積二次，並使用公式：V=0.5a×b ²(其中a和b分別為腫瘤之長徑和短徑)，以mm³表示體積。

以mm³表示之腫瘤體積係在第95天至130天測量，測量之間隔時間為約3至4天。第18圖顯示出當以抗FGFR4抗體U4-3治療時，人類肝臟SNU-761異種移植癌細胞之腫瘤生長的抑制情形。在皮下SNU-761人類肝臟異種移植癌模型中，在25mg/kg之劑量水準下，U4-3顯示出顯著之抗腫瘤活性。腫瘤生長抑制之計算為%TGI=1-(Ti-T0)/(Vi-VO))*100；Ti為治療組在測量日的幾何平均腫瘤體積；T0為治療組在D1的幾何平均腫瘤體積；Vi為對照組在測量日的幾何平均腫瘤體積；V0為對照組在D1的幾何平均腫瘤體積。

實施例22：在源自患者之胃異種移植腫瘤模型中的活體內效力。

在源自患者之胃異種移植腫瘤模型GA0080中由抗 FGFR4抗體介導之生長抑制。

自上海靈長生物科技有限公司(LC，上海，中國)取得雌性BALB/c裸鼠(八至九週齡)。選擇源自女性患者之HuPrime®胃癌模型GA0080來進行此效力研究。此模型之病理學為中等至低分化之腺癌。

收穫來自經接種選定之初級人胃組織的繁殖小鼠之腫瘤片段並用於接種入BALB/c裸鼠中。經由皮下途徑接種在每隻小鼠之右側(直徑2至4mm)以發展腫瘤。當腫瘤平均大小達到約153mm³時開始治療。根據其腫瘤大小將小鼠隨機分為2組實驗組。從第1天至第22天，按1、4、8、11、15、18、22之時程表將FGFR4抗體U4-3投予荷瘤小鼠。依上述測量二次腫瘤大小。

第19圖顯示當以抗FGFR4抗體U4-3治療時，HuPrime®胃癌模型GA0080之腫瘤生長的抑制情形。U4-3證實在胃異種移植模型中之抗腫瘤活性為約25%。

實施例23：在人類結腸癌異種移植腫瘤模型中之活體內效力。

在人類結腸癌(SW620)異種移植腫瘤模型中由抗FGFR4抗體介導之生長抑制。

從查爾斯河公司(Sulzfeld，德國)取得雌性NMRI裸鼠(五至六週齡)。經由皮下途徑為20隻雌性NMRI裸鼠在左側接種在100μl PBS中之5×10⁶個SW620腫瘤細胞(ATTC編號CCL-227)。第12天，當腫瘤平均大小達到約 150至200mm³後，根據其腫瘤大小將該20隻帶腫瘤之鼠隨機分為2組，每組10隻。從第1天至第38天，按13、17、20、24、27、31、34和38之時程表經由腹膜內途徑每週投予帶腫瘤之鼠二次抗FGFR4抗體U4-3。依上述每週測量二次腫瘤大小。第20圖顯示當以抗FGFR4抗體U4-3治療時，腫瘤生長的抑制情形。U4-3證明顯著抑制初級腫瘤生長。

<110> 德商第一三共歐洲公司(Daiichi Sankyo Europe GmbH)

<120> 人類抗-FGFR4抗體

<140> TW104126103

<141> 2015-08-11

<150> EP 14180555

<151> 2014-08-11

<160> 68

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VH CDRH1

<400> 1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VH CDRH1

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VH,U4-7-VH和U4-9-VH CDRH1

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VH和U4-8-VH CDRH1

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VH CDRH1

<400> 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VH CDRH1

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VH,U4-2-VH和U4-7-VH CDRH2

<400> 7

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VH和U4-9-VH CDRH2

<400> 8

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VH CDRH2

<400> 9

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VH CDRH2

<400> 10

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VH CDRH2

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<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VH CDRH2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VH CDRH3

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VH CDRH3

<400> 14

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VH和U4-9-VH CDRH3

<400> 15

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VH CDRH3

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VH CDRH3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VH CDRH3

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VH CDRH3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7-VH CDRH3

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VL CDRL1

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VL,U4-4-VL,U4-5-VL,U4-6-VL和U4-8-VL CDRL1

<400> 22

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VL CDRL1

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VL,U4-2-VL,U4-4-VL,U4-5-VL和U4-8-VL CDRL2

<400> 24

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VL CDRL2

<400> 25

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VL CDRL2

<400> 26

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7-VL和U4-9-VL CDRL2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VL CDRL3

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VL CDRL3

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VL CDRL3

<400> 30

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VL CDRL3

<400> 31

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VL CDRL3

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<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VL CDRL3

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VL CDRL3

<400> 34

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7-VL和U4-9-VL CDRL3

<400> 35

<210> 36

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VH

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VH

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VH和U4-9-VH

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VH

<400> 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VH

<400> 40

<210> 41

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VH

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<210> 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VH

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<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VL

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<212> DNA

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<220>

<223> U4-2-VL

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VL

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<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VL

<400> 47

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<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VL

<400> 48

<210> 49

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VL

<400> 49

<210> 50

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VL

<400> 50

<210> 51

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7-VL和U4-9-VL

<400> 51

<210> 52

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VH

<400> 52

<210> 53

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VH

<400> 53

<210> 54

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VH和U4-9-VH

<400> 54

<210> 55

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VH

<400> 55

<210> 56

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VH

<400> 56

<210> 57

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VH

<400> 57

<210> 58

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VH

<400> 58

<210> 59

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7-VH

<400> 59

<210> 60

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-1-VL

<400> 60

<210> 61

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-2-VL

<400> 61

<210> 62

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-3-VL

<400> 62

<210> 63

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-4-VL

<400> 63

<210> 64

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-5-VL

<400> 64

<210> 65

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-8-VL

<400> 65

<210> 66

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-6-VL

<400> 66

<210> 67

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7-VL和U4-9-VL

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> U4-7和U4-9 CDRL1

<400> 68

Claims

一種針對介於人類FGFR4之胺基酸119至248之間的抗原決定部位之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其中該抗體包含重鏈，該重鏈包含：(a)如SEQ ID NO：3中所示之CDRH1，(b)如SEQ ID NO：8中所示之CDRH2，及(c)如SEQ ID NO：15中所示之CDRH3，及輕鏈，該輕鏈包含：(d)如SEQ ID NO：23中所示之CDRL1，(e)如SEQ ID NO：25中所示之CDRL2，及(f)如SEQ ID NO：30中所示之CDRL3。
一種針對介於人類FGFR4之胺基酸119至248之間的抗原決定部位之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其中該抗體包含重鏈，該重鏈包含：(a)如SEQ ID NO：3中所示之CDRH1，(b)如SEQ ID NO：8中所示之CDRH2，及(c)如SEQ ID NO：15中所示之CDRH3，及輕鏈，該輕鏈包含：(d)如SEQ ID NO：68中所示之CDRL1，(e)如SEQ ID NO：27中所示之CDRL2，及(f)如SEQ ID NO：35中所示之CDRL3。
如申請專利範圍第1項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其包含如SEQ ID No：54中所示之重鏈可變區及如SEQ ID No：62中所示之輕鏈可變區。
如申請專利範圍第2項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其包含如SEQ ID No：54所示之重鏈可變區及如SEQ ID No：67所示之輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其為Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、Fv片段、雙功能抗體(diabody)或單鏈抗體分子。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型之抗體。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其中該抗體為FGFR4傳信之抑制劑。
如申請專利範圍第7項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其中該抗體抑制FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21及/或FGF23結合至FGFR4。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其中該抗體對FGFR1-3b、FGFR1-3c不具有交叉反應性。
一種共軛結合物，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，其中該抗體係與標記基團及/或效應子基團偶合，其中該標記基團係選自經放射標記之胺基酸、生物素部分、螢光標記物、或酶之可檢測之標記，且其中該效應子基團係細胞毒性基團、放射性同位素、毒素、或治療基團。
如申請專利範圍第10項之共軛結合物，其中該抗體係與治療基團偶合。
一種融合蛋白，其包含融合至IL-2之如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物。
一種經分離之核酸分子，其係選自由下列所組成之群組：(a)編碼如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物，或如申請專利範圍第12項之融合蛋白的核酸序列，(b)如SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：46之任一序列中所示之核酸序列或如SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：51之任一序列中所示之核酸序列，及(c)與(a)或(b)中之任一序列互補的核酸序列。
一種包含如申請專利範圍第13項之核酸序列之載體，其中該核酸序列係可操作地連接至控制序列。
如申請專利範圍第14項之載體，其為表現載體。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第13項之核酸或如申請專利範圍第14或15項之載體。
如申請專利範圍第16項之宿主細胞，其為人類細胞、細菌、動物細胞、真菌細胞、兩棲動物細胞或植物細胞。
如申請專利範圍第16或17項之宿主細胞，其為非人類轉基因動物細胞。
一種製造如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物或如申請專利範圍第12項之融合蛋白的方法，其包含從如申請專利範圍第16至18項中任一項之宿主細胞取得該抗體或融合蛋白之步驟。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物、或如申請專利範圍第12項之融合蛋白、如申請專利範圍第13項之核酸分子、如申請專利範圍第14至15項中任一項之載體、如申請專利範圍第16至18項中任一項之宿主細胞或藉由如申請專利範圍第19項之方法產生的抗體。
如申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其包含另一活性劑。
一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物、如申請專利範圍第12項之融合蛋白、如申請專利範圍第13項之核酸分子、如申請專利範圍第14至15項中任一項之載體、如申請專利範圍第16至18項中任一項之宿主細胞、或如申請專利範圍第20至21項中任一項之醫藥組成物之用途，其係用於製造供診斷及/或治療與FGFR4表現、過度表現及/或過度活躍相關之癌症之藥物。
如申請專利範圍第22項之用途，其中該癌症為選自由下列所組成之群組：肝細胞癌、乳癌、胃癌、結腸癌、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、前列腺癌(prostate cancer)、卵巢癌、軟組織肉瘤、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和肺腺癌及其他表現或過度表現FGFR4之癌症和腫瘤轉移形成。
一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物、如申請專利範圍第12項之融合蛋白、如申請專利範圍第13項之核酸分子、如申請專利範圍第14至15項中任一項之載體、如申請專利範圍第16至18項中任一項之宿主細胞、或如申請專利範圍第20至21項中任一項之醫藥組成物之用途，其係用於製造供診斷及/或治療代謝性疾病之藥物。
如申請專利範圍第24項之用途，其中該代謝性疾病係代謝症候群或肥胖。
一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物、如申請專利範圍第12項之融合蛋白、如申請專利範圍第13項之核酸分子、如申請專利範圍第14至15項中任一項之載體、如申請專利範圍第16至18項中任一項之宿主細胞、或如申請專利範圍第20至21項中任一項之醫藥組成物之用途，其係用於製造供診斷及/或治療左心室肥厚、心臟肥大或慢性腎臟病之藥物。
一種用於體外診斷與FGFR4之表現、過度表現及/或過度活躍相關之病況的方法，其包含將樣本與如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物或如申請專利範圍第12項之融合蛋白接觸並檢測FGFR4之存在。
一種套組，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、或該抗體之功能片段或功能衍生物、如申請專利範圍第10至11項中任一項之共軛結合物、如申請專利範圍第12項之融合蛋白、如申請專利範圍第13項之核酸分子或如申請專利範圍第14至15項中任一項之載體，及另外之抗腫瘤劑。