ES2764418T3 - Anticuerpo anti-FGFR4 humano - Google Patents

Abstract

Anticuerpo humano que se dirige contra un epítopo entre los aminoácidos 119-248 de FGFR4 humano que comprende la secuencia de aminoácidos RYNY, o un fragmento funcional o derivado funcional de dicho anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende (i) una cadena pesada que comprende: una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRH1) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (CDRH2) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 7-12, y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (CDRH3) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 13-20, y (ii) una cadena ligera que comprende: una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (CDRL1) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 21-23 y 68, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (CDRL2) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 24-27, y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (CDRL3) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 28-35.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-FGFR4 humano

La presente invención se refiere a anticuerpos novedosos contra el receptor de FGF 4 (FGFR4) y al uso médico de los mismos, en particular para el diagnóstico de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión o hiperactividad de FGFR y para el tratamiento de cánceres que expresan FGFR4.

Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) son una familia de factores de crecimiento con diversas actividades biológicas con miembros implicados en la angiogénesis, cicatrización de heridas, desarrollo embrionario y diversas rutas de señalización endocrinas. La familia de FGF humanos comprende 18 miembros, que son moléculas de señalización estructuralmente relacionadas. Ejercen su actividad biológica interaccionando con sus receptores relacionados (FGFR), una familia de tirosina cinasas receptoras. La familia de FGFR de mamífero tiene cuatro miembros: FGFR1-4, consistiendo cada uno en tres dominios de tipo inmunoglobulina extracelulares (D1-D3), un dominio transmembrana de un único tramo y un dominio de tirosina cinasa dividido intracelular. Los FGF interaccionan principalmente con los dominios D2 y D3. Cada FGFR se une a un subconjunto específico de los FGF. La mayoría de los FGF pueden unirse a varios subtipos de FGFR diferentes, mientras que otros activan específicamente un receptor o una isoforma de un receptor.

Las interacciones receptor-ligando dan como resultado la dimerización y autofosforilación de receptor, formación de complejos con proteínas asociadas a membrana y auxiliares citosólicas, y el inicio de múltiples cascadas de señalización. El sistema de señalización de FGFR-FGF desempeña papeles importantes en el desarrollo y la reparación tisular regulando funciones y procesos celulares tales como crecimiento, diferenciación, migración, morfogénesis y angiogénesis.

La señalización de FGFR4 se activa mediante varios FGF que también activan otros miembros de la familia de FGFR (Ornitz et al., 1996, J. Biol. Chem., 1996, 271:15292-7) mientras que FGF19 es específico para FGFR4 (Xie et al., 1999, Cytokine, 11(10):720-35). La activación del receptor FGFR4 da como resultado varios tipos de señalización celular, incluyendo el establecimiento de una ruta de señalización mediada por cascada de fosforilación tras la estimulación de FGFR4 mediante FGF. Tras la unión del ligando al dominio extracelular de FGFR4, la dimerización de receptor y posterior fosforilación de residuos de tirosina cinasa residuos da como resultado la activación de rutas de señalización induciendo la unión de moléculas de señalización al receptor (Vainikka et al., 1992, EMBO, 11(12):4273-4280, y 1994, J. Biol. Chem. 269:18320-18326). Por ejemplo, FGFR4 se asocia con PLCy1, y se ha observado un aumento en la activación de MAP cinasa y la síntesis de ADN tras una simulación de FGF. La interacción adicional con otros miembros de la familia de receptores de factor de crecimiento FGF humanos puede expandir el potencial de señalización de FGFR4 y es un medio no sólo para la diversificación de señal sino también para la amplificación de señal (McKeehan W. L. y Kan M., 1994, Mol. Reprod. Dev. 39:69-82). Se ha encontrado que una serina cinasa de 85 kDa regula de manera negativa la fosforilación de tirosina de FGFR4, pero no se ha esclarecido su función exacta (Vainikka et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:1270-1273). Se ha demostrado que la asociación de FGFR4 con NCAM media en la adhesión dependiente de integrina (Cavallaro et al., 2001, Nat. Cell Biol. 3:650-657), lo cual puede desempeñar un papel decisivo en la metástasis tumoral.

Se ha notificado que FGFR4 tiene varios papeles celulares. El receptor está implicado en el control de diversos procedimientos de diferenciación celular in vitro e in vivo tales como diferenciación y regeneración de músculo esquelético, diferenciación mesenquimatosa u osteogénesis o bien en la formación de alveolos durante el desarrollo hepático posnatal. Además, se describe FGFR4 en el control de ácido biliar y homeostasis del colesterol y se piensa que está implicado en el control de la adiposidad. Además, el equilibrio entre producción biliar y producción de colesterol se controla mediante FGFR4 in vitro e in vivo. FGFR4 también está implicado en determinados fenómenos tumorales tales como el desarrollo de carcinomas hepatocelulares o cánceres de colon, o en la proliferación de células de fibroadenoma de mama o de células epiteliales de cáncer de mama tales como motilidad de células de carcinoma de mama o colorrectal. La sobreexpresión de FGFR4 también se describe en determinadas líneas de cáncer de páncreas y se correlaciona con la malignidad de astrocitoma.

La implicación de FGFR4 en diversos trastornos hace que el receptor sea una diana interesante para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. En este contexto, una estrategia eficaz es el uso de anticuerpos contra FGFR4. En particular, son deseables anticuerpos que interfieren con la señalización mediada por FGFR4. Se describen ejemplos de anticuerpos anti-FGFR4 en la bibliografía, tal como en las solicitudes internacionales WO 03/063893, WO 2012/138975, WO 2013/0183319 y en la solicitud estadounidense US 2011/0150903. El documento WO 2010/004204 da a conocer anticuerpos contra FGFR4 que son antagonistas e inhiben la interacción entre FGFR4 y FGF19. Los anticuerpos son específicos para FGFR4 y no se unen a otros receptores de FGF. Se identificó que el epítopo de unión estaba ubicado en el dominio extracelular 2. Bumbaca et al. (mAbs 3:4, 1-11; 2011) describen un anticuerpo anti-FGFR4 humanizado que se une con alta especificidad al receptor de FGF 4. Este anticuerpo se usa en el presente documento como ejemplo comparativo y se denomina GT-13. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de nuevos anticuerpos anti-FGFR4.

El problema subyacente a la presente invención era proporcionar anticuerpos anti-FGFR4 novedosos y métodos para usar los mismos en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4.

En particular, había una necesidad de nuevos anticuerpos humanos contra FGFR4. Un problema que se produce habitualmente con anticuerpos producidos de manera recombinante es que las secuencias de proteína de anticuerpos producidos en un sistema inmunitario no humano son parcialmente distintas de anticuerpos homólogos que se producen de manera natural en seres humanos. Por tanto, son potencialmente inmunogénicas cuando se administran a pacientes humanos. Por tanto, se encontró que anticuerpos monoclonales diseñados para su administración a seres humanos deben modificarse preferiblemente para aumentar su similitud a variantes de anticuerpos producidas de manera natural en seres humanos. Son especialmente ventajosos los anticuerpos que son completamente humanos, es decir, que no contienen ninguna parte que sea de origen no humano. Por tanto, la presente invención tiene el objetivo de proporcionar anticuerpos anti-FGFR4 humanos que sean ventajosos para el uso de diagnóstico y terapéutico con seres humanos. Los anticuerpos deseados deben prevenir preferiblemente la señalización de FGFR4. La invención tal como se describe en el presente documento cumple esta demanda y proporciona beneficios adicionales.

Un primer aspecto de la invención es un anticuerpo humano que se dirige contra un epítopo entre los aminoácidos 119-248, preferiblemente los aminoácidos 152-240 (dominio 2 de tipo Ig), más preferiblemente entre los aminoácidos 230 y 240 de FGFR4 humano o un fragmento funcional o derivado funcional de dicho anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende

(i) una cadena pesada que comprende:

una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRH1) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de s Eq ID NO: 1-6, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (CDRH2) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 7-12, y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (CDRH3) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 13-20, y

(ii) una cadena ligera que comprende:

una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (CDRL1) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 21-23 y 68, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (CDRL2) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 24-27, y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (CDRL3) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 28-35.

El anticuerpo es adecuado para su uso en medicina, particularmente medicina humana, más particularmente para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4.

La invención también proporciona conjugados que incluyen un anticuerpo tal como se describe en el presente documento. En particular, los conjugados de anticuerpo-fármaco son un objeto de la invención.

Otro aspecto de la invención es una proteína de fusión, en la que un anticuerpo de la invención está unido a IL-2. Un aspecto adicional de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, opcionalmente en unión operativa a una secuencia de control de la expresión.

Un aspecto adicional de la invención es una célula huésped, que comprende la molécula de ácido nucleico. La célula puede usarse para la preparación del anticuerpo.

Todavía un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere a un anticuerpo humano tal como se define en la reivindicación 1 dirigido contra FGFR4 o un fragmento funcional o derivado funcional del mismo. El término “anticuerpo” se refiere particularmente a moléculas que comprenden al menos una cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una cadena ligera de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera puede comprender un dominio variable y uno constante. El sitio de unión a antígeno puede estar formado a partir de los dominios variables de una cadena pesada y ligera. Una región variable (también denominada dominio variable) comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR), por ejemplo una región CDR1, una CDR2 y una CDR3, y regiones de entramado (FR) que flanquean las CDR. El término “región determinante de la complementariedad” lo entiende fácilmente el experto (véase, por ejemplo, Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988) y se refiere a los tramos de aminoácidos dentro del dominio variable de un anticuerpo que entran principalmente en contacto con el antígeno y especificidad de anticuerpo determinada. Esta región también se conoce como la región hipervariable.

El término “anticuerpo humano” abarca anticuerpos totalmente humanos o humanizados, en los que se prefieren anticuerpos totalmente humanos. Pueden prepararse anticuerpos humanos a partir de animales modificados por ingeniería genética, por ejemplo animales que comprenden un sistema inmunitario xenogénico o a partir de bibliotecas de presentación de anticuerpos según técnicas conocidas. Se describen anticuerpos humanos de manera general en van Dijk y van de Winkel (Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)) y Lonberg (Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008)). Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Tales animales contienen normalmente la totalidad o una porción de los loci de inmunoglobulina humanos, que sustituyen a los loci de inmunoglobulina endógenos, o que están presentes de manera extracromosómica o integrados aleatoriamente dentro de los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógenos se han inactivado generalmente. Para una revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase, por ejemplo, Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Regiones variables humanas a partir de anticuerpos intactos generados mediante tales animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo mediante combinación con una región constante humana diferente.

También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63). También se describen anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma de células B humanas en Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 103: 3557-3562 (2006).

También pueden generarse anticuerpos humanos mediante métodos de presentación en fago (véanse, por ejemplo, los documentos US 6.248.516, US 5.403.484, US 5.969.108, US 5.885.793, US 6.696.248, US 5.849.500). En la técnica se conocen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos. (Véanse, por ejemplo, Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; y Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431). Por ejemplo, puede usarse un método de presentación en fago, que implica hacer que se expresen regiones variables de anticuerpos humanos como anticuerpo de cadena sencilla (scFv) sobre la superficie de fagos y seleccionar fagos que se unen a antígenos (Nature (1991), 352, (6336), págs. 624-628, Journal of Molecular Biology (1992), 227, (2), págs. 381-388, y Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs. 1105-1116). Asimismo, también puede usarse otro método de presentación en fagos, que implica hacer que se exprese Fab (fragmento de unión a antígeno) de anticuerpo humano sobre la superficie de fago y seleccionar fagos que se unen a antígenos (documentos WO 97/08320 y WO 01/05950). Pueden analizarse genes de los fagos seleccionados basándose en la unión a antígeno para así determinar secuencias de ADN que codifican para regiones variables de anticuerpos humanos que se unen a los antígenos. Cuando se aclara la secuencia de ADN de scFv o Fab que se une a los antígenos, se extraen secuencias de CDR a partir de la misma y pueden prepararse vectores de expresión que tienen las secuencias e introducirse en huéspedes apropiados, seguido por expresión génica para obtener anticuerpos humanos (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, págs. 433-455, y Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs. 1105-1116).

También pueden generarse anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fagos derivadas de seres humanos. Tañes secuencias de dominio variable pueden combinarse entonces con un dominio constante humano deseado. En la técnica se conocen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos.

Pueden prepararse anticuerpos humanizados mediante humanización de anticuerpos monoclonales según técnicas conocidas. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad frente a seres humanos, al tiempo que se conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Se revisan anticuerpos humanizados y métodos de preparación de los mismos, por ejemplo, en Alamagro y Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008).

La invención también abarca fragmentos funcionales de anticuerpos humanos, por ejemplo porciones de los anticuerpos anteriormente mencionados que comprenden al menos un sitio de unión a antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')², fragmentos Fv, diacuerpos o moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y otros fragmentos siempre que muestren la capacidad deseada de unirse a FGFR4 humano. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat. Met. 9: 129-134 (2003).

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, Hudson et al., (2003). Los anticuerpos de cadena sencilla son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. Pueden prepararse fragmentos de anticuerpo mediante diversas técnicas incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como producción mediante huéspedes recombinantes (por ejemplo E. coli o fago) tal como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes.

En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es por FGFR4 y la otra es por cualquier otro antígeno.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de FGFR4. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos frente a células que expresan FGFR4. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes e ingeniería de “botón en ojal”. También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos mediante modificación por ingeniería de efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo; reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos; uso de cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos; uso de tecnología de “diacuerpos” para producir anticuerpos biespecíficos y uso de Fv de cadena sencilla y preparación de anticuerpos triespecíficos tal como se describe. En el presente documento también se incluyen anticuerpos modificados por ingeniería con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo “anticuerpos de tipo pulpo”.

El término “unirse” o “unión” de un anticuerpo significa una interacción o asociación al menos temporal con o a un antígeno diana, es decir FGFR4 humano, comprendiendo fragmentos del mismo que contienen un epítopo.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de ^{disociación (Kd) de < 1 |iM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10}-8 ^{M o menos, por ejemplo desde 10}-8 ^{M hasta 10}-13 ^{M, por ejemplo de 10}-9 ^{M a 10}13 ^M).

En una realización, Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (radioinmunoensayo, RIA) realizado con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno.

Según otra realización, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial con antígeno inmovilizado. Según una realización preferida de la presente invención, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra un epítopo de FGFR4 humano tal como se describe en el presente documento.

Los inventores de la presente solicitud encontraron que anticuerpos tal como se definen en la reivindicación 1 dirigidos contra un epítopo entre los aminoácidos 119-284 de FGFR4 humano o fragmentos funcionales o derivados funcionales de los mismos son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Se prefieren particularmente anticuerpos humanos dirigidos contra un epítopo entre los aminoácidos 152-240 y más preferiblemente entre los aminoácidos 230 y 240 de FGFR4 humano. Según una realización particularmente preferida, el anticuerpo de la invención se dirige contra un epítopo que comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos RYNY.

El epítopo reconocido por un anticuerpo humano de la invención está ubicado preferiblemente en el dominio 2 de tipo Ig de FGFR4 humano.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de diversos tipos de inmunoglobulina (Ig), por ejemplo del tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, preferiblemente del tipo IgG o IgM incluyendo, pero sin limitarse al, tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 y IgM2. En una realización preferida el anticuerpo es del tipo IgG1.

El anticuerpo comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada específicas CDRH1, CDRH2 y CDRH3 tal como se describe a continuación en el presente documento.

El anticuerpo humano comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRH1) que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6.

Además, el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (CDRH2) que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 7-12.

Además, el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (CDRH3) que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 13-20.

El anticuerpo según la invención también comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera específicas CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

Por consiguiente, el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 ^{(CDRL1) que tiene la secuencia de aminoácidostal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 21-23 y} 68^. Además, el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (CDRL2) que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 24-27.

Además, el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (CDRL3) que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 28-35.

El anticuerpo de la presente invención puede comprender preferiblemente una combinación específica de CDR (es decir de CDRH1, CDRH2 y CDRH3) dentro de una cadena pesada.

Lo más preferiblemente, el anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada que comprende tres CDR, en el que la combinación de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se selecciona de las mostradas en la tabla 1. Se entiende que cada línea de esta tabla representa una combinación específica de una CDRH1, una CDRH2 y una CDRH3.

Tabla 1

Según la presente invención, se prefiere adicionalmente que el anticuerpo comprenda una combinación específica de CDR dentro de una cadena ligera (es decir de CDRL1, CDRL2 y CDRL3).

Lo más preferiblemente, el anticuerpo de la invención comprende una cadena ligera que comprende tres CDR, en el que la combinación de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se selecciona de las mostradas en la tabla 2. Se entiende que cada línea de esta tabla representa una combinación específica de una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3.

Tabla 2

Tal como se describió anteriormente, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo pueden estar flanqueadas por regiones de entramado. Una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que contiene tres CDR contiene por ejemplo cuatro regiones de entramado.

Los fragmentos funcionales y derivados funcionales de esos anticuerpos también están dentro del alcance de la invención. Para determinar el epítopo en FGFR4 reconocido por el anticuerpo, pueden usarse matrices químicamente preparadas de secuencias de proteína derivadas de péptidos cortos derivados de la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de FGFR4 humano para ubicar e identificar epítopos de anticuerpo (Reinicke W., Methods Mol. Biol. 2004, 248: 443-63). Un método adicional para mapear los epítopos en el dominio extracelular de FGFR4 a los que se unen los anticuerpos de la invención comprende Snaps/SELDI (Wang et al., Int. J. Cancer, ^{2001, 15 de junio; 92 (}6^{): 871-6) o puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como se describe en} Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada (VH) tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 52-59. Además, el anticuerpo humano de la invención comprende preferiblemente una región variable de cadena ligera (VL) tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID No : 60-67.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-1) que comprende una cadena pesada que comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 1, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 7 y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 21, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID n O: 24 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 28. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 52 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 60.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-2) que comprende una cadena pesada que comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 7 y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 22, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID ⁿ O: 24 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 29. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 53 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 61.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-3) que comprende una cadena pesada que comprende una ^{CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 3, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO:} 8 ^{y una CDRH3 tal} como se muestra en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 23, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID ⁿ O: 25 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 30. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 54 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 62.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-4) que comprende una cadena pesada que comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 9 y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 22, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID ⁿ O: 24 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 31. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 55 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 63.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-5) que comprende una cadena pesada que comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ⁱD NO: 5, una CDRH2 tal como se muestra en ^s E^q ID ⁿ O: 10 y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 22, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 24 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 32.

En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 64.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-6) que comprende una cadena pesada que comprende una ^{CDRH1 tal como se muestra en SEQ iD NO:} 6^{, una CDRH2 tal como se muestra en s Eq ID n O: 12 y una CDRH3} tal como se muestra en SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 22, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 26 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 34. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de ^{cadena pesada según SEQ ID NO: 58 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO:} 66^.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-7) que comprende una cadena pesada que comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 3, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 7 y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ^{ID NO:} 68^{, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID n O: 27 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO:} 35. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 59 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 67.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano (U4-8) que comprende una cadena pesada que comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ iD NO: 4, una CDRH2 tal como se muestra en ^s E^q ID ⁿ O: 11 y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 22, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 24 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 33. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 57 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 65.

También se prefiere un anticuerpo humano (U4-9) que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1 ^{tal como se muestra en SEQ ID NO: 3, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO:} 8 ^{y una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO:} 68^, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 27 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 35. En una realización particularmente preferida el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 54 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 67. El anticuerpo U4-9 comprende preferiblemente la cadena pesada tal como se especifica para el anticuerpo U4-3 y la cadena ligera tal como se especifica para el anticuerpo U4-7. En los experimentos proporcionados en la presente solicitud el anticuerpo U4-9 demostró tener una afinidad superior por en uno o dos aminoácidos o anticuerpos que reconocen el mismo epítopo en FGFR4 humano. En una realización particularmente preferida el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada según SEQ ID NO: 54 y una región variable de cadena ligera según SEQ ID NO: 67. El anticuerpo U4-9 comprende preferiblemente la cadena pesada tal como se especifica para el anticuerpo U4-3 y la cadena ligera tal como se especifica para el anticuerpo U4-7. En los experimentos proporcionados en la presente solicitud el anticuerpo U4-9 demostró tener una afinidad superior por FGFR4 con respecto a U4-3.

Tal como se mencionó anteriormente, los anticuerpos de la invención muestran propiedades ventajosas con respecto a su especificidad de unión y actividad biológica, en particular con respecto a su capacidad para reconocer epítopos del anticuerpo anti-FGFR4 humano, para reducir el crecimiento celular y la migración celular, su capacidad para activar un agente antineoplásico adicional y/o sensibilizar células tumorales frente a un tratamiento terapéutico. Los anticuerpos de la invención U4-1 a U4-9 tienen actividad antitumoral intrínseca. Se unen específicamente a FGFR4 y preferiblemente no muestran ninguna reactividad cruzada frente a otros receptores de FGF, FGFR1-3b, c. Los anticuerpos son capaces de inhibir la unión de ligando a FGFR4 humano. El efecto del anticuerpo sobre la unión de ligando a FGFR4 puede determinarse incubando células que expresan este receptor (por ejemplo células de cáncer de mama MDA-MB453) con ligando radiomarcado en ausencia (control) o presencia del anticuerpo anti-FGFR4. Pueden identificarse aquellos anticuerpos que reducen la afinidad de unión de ligando por el receptor FGFR4 o que bloquean la unión de ligando a FGFR4. Los ligandos de FGFR4 conocidos incluyen FGF1, FGF2, ^{FGF4, FGF}6^{, FGF}8^{, FGF9, FGF17, FGF18, FGF19 y FGF20. Una línea celular que expresa de manera endógena} FGF19 es Huh-7. Los anticuerpos de la invención pueden inhibir al menos parcialmente la unión de estos ligandos a FGFR4 humano. Los anticuerpos particularmente preferidos de la presente invención pueden bloquear la unión de uno o más de los ligandos anteriores en al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70% y más preferiblemente al menos el 80% o el 87%. Se prefieren particularmente los anticuerpos de la invención que bloquean la unión de FGF19 a FGFR4 humano en al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85% o al menos el 90%.

El bloqueo de la unión de ligando a FGFR4 humano da como resultado la inhibición de la señalización de FGFR4. Para seleccionar anticuerpos que reducen la fosforilación de FGFR4 inducida por ligando, pueden incubarse previamente células con tampón (control) o anticuerpo, después se tratan con ligando o un tampón de control. Después se someten las células a lisis y pueden centrifugarse los lisados brutos para eliminar material insoluble. Pueden incubarse los sobrenadantes con el FGFR4 puro específico de anticuerpo y proteína A-Sepharose para permitir una precipitación eficiente. Tras el lavado, pueden separarse los inmunoprecipitados mediante SDS-PAGE. Después se analizan inmunotransferencias de tipo Western de los geles con anticuerpo anti-fosfotirosina. Tras la visualización, pueden separarse las inmunotransferencias y volver a analizarse con un anticuerpo anti-FGFR4. Puede realizarse densitometría de exploración de reflectancia del gel con el fin de cuantificar el efecto del anticuerpo en cuestión sobre la formación inducida por HRG del complejo. Se seleccionan los anticuerpos que reducen la fosforilación de FGFR4 con respecto al control (células sin tratar).

Pueden llevarse a cabo experimentos in vitro con el fin de determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para inhibir la proliferación celular estimulada por ligando. Se incuba un número apropiado de células de interés con anticuerpos diluidos en medio apropiado. Se estimulan células añadiendo ligando directamente a una disolución de anticuerpo y después se dejan crecer durante 72 h. Se añade Alamar Blue™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; EE.UU.) y se incuban a 37°C en la oscuridad. Se mide la absorbancia a 590 nm cada 30 min.

Para seleccionar los anticuerpos que reducen la migración celular mediada por FGFR4, pueden realizarse experimentos de transmigración. Se incuban células privadas de suero con anticuerpo. Puede colocarse un número ^{apropiado de células en la cámara superior de placas Transwell recubiertas con poros de} 8 ^{|im (BD Biosciences,} San Jose, CA; EE.UU.). En el caso de estimulación se usa medio solo o que contiene un agente quimiotáctico en la cámara inferior. Se deja que las células migren y posteriormente se tiñen. Se cuentan los núcleos teñidos; la inhibición en porcentaje se expresa como inhibición con respecto a un anticuerpo de control.

Se encontró que los anticuerpos de la invención tienen una actividad antitumoral mejorada en comparación con anticuerpos anti-FGFR4 conocidos. La eficacia antitumoral de anticuerpos terapéuticos puede evaluarse en estudios de tumores de xenoinjertos humanos. En estos estudios, se hacen crecer tumores humanos como xenoinjertos en ratones inmunocomprometidos y se mide la eficacia terapéutica mediante el grado de inhibición del crecimiento tumoral (TGI). Con el fin de determinar si los anticuerpos contra FGFR4 de la invención interfieren con el crecimiento tumoral de células cancerosas humanas en ratones desnudos, se implantan células en ratones desnudos. Se hacen crecer tumores por vía subcutánea en el lomo o en los costados del animal. Puede iniciarse el tratamiento inmediatamente o cuando los tumores alcanzan un determinado volumen medio. Antes del primer tratamiento, se aleatorizan los ratones y se realizan pruebas estadísticas para garantizar la uniformidad en los volúmenes tumorales de partida (media, mediana y desviación estándar) a través de grupos de tratamiento. Se inicia el tratamiento con una dosis de carga de 25 mg/kg seguida por inyecciones de 25 mg/kg dos veces por semana mediante inyección intraperitoneal.

El anticuerpo de la presente invención es adecuado para su uso en medicina, particularmente para su uso en medicina humana. El anticuerpo puede usarse en el tratamiento de cánceres que expresan o sobreexpresan FGFR4 seleccionados de carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma. Además, el anticuerpo de la invención puede usarse como agente de diagnóstico, para el diagnóstico de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4. A continuación en el presente documento se describen ejemplos de enfermedades que pueden diagnosticarse usando un anticuerpo de la invención.

El anticuerpo de la presente invención puede estar acoplado a un grupo heterólogo, por ejemplo un grupo efector. Un conjugado de anticuerpo de este tipo es especialmente adecuado para aplicaciones terapéuticas. El término “grupo efector” puede referirse a un grupo citotóxico, tal como un radioisótopo o un radionúclido, una toxina, un grupo terapéutico u otro grupo efector conocido en la técnica. Se prefieren particularmente conjugados en los que el anticuerpo está acoplado a un grupo terapéutico, denominados conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC). Alternativamente, el anticuerpo de la invención puede estar acoplado a un grupo de marcado. Un conjugado de anticuerpo de este tipo es particularmente adecuado para aplicaciones de diagnóstico. Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo de marcado” se refiere a un marcador detectable, por ejemplo un resto de biotina o aminoácido radiomarcado, un marcador fluorescente, una enzima o cualquier otro tipo de marcador que se conoce en la técnica. La unión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención a radioisótopos, por ejemplo, proporciona ventajas para tratamientos de tumores. A diferencia de la quimioterapia y otras formas de tratamiento del cáncer, la radioinmunoterapia o la administración de una combinación de radioisótopo-anticuerpo selecciona como diana las células cancerosas con daño mínimo al tejido sano normal circundante.

Una realización adicional de la presente invención es una proteína de fusión en la que un anticuerpo tal como se definió anteriormente se fusiona a interleucina 2 (IL-2). La interleucina 2 es una citocina de 15 kDa producida por células T cooperadoras que estimula linfocitos T citotóxicos y células NK. Se ha usado IL-2 de manera clínica en el tratamiento de melanoma y carcinoma de células renales para estimular los sistemas inmunitarios del paciente con cáncer. Lograr una alta dosis prolongada de IL-2 en el tumor puede dar como resultado la inducción de una respuesta antitumoral duradera que conduce al rechazo de un tumor de lo contrario mortal. En la presente invención se ha demostrado que es posible incorporar IL-2 en una proteína de fusión que incluye un anticuerpo de la invención al tiempo que se mantiene su actividad. Por tanto, una proteína de fusión en la que un anticuerpo de la invención está fusionado a IL-2 es adecuada para servir como sistema de administración que conserva especificidad de unión a antígeno y presenta la actividad completa de IL-2.

La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo tal como se describió anteriormente. El término “molécula de ácido nucleico” abarca ADN, por ejemplo ADN o ARN de cadena sencilla o doble. El ADN puede ser genómico, ADNc o de origen sintético, o una combinación de los mismos. La molécula de ácido nucleico de la invención puede estar en unión operativa a una secuencia de control de la expresión, es decir con una secuencia que es necesaria para realizar la expresión de secuencias de ácido nucleico codificantes. Tales secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores, potenciadores, sitios de unión ribosómicos y/o secuencias de terminación de la transcripción. En la técnica se conocen ejemplos específicos de secuencias de control de la expresión adecuadas.

Según una realización preferida, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo tal como se definió anteriormente,

(b) una secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 36-43 y SEQ ID NO: 44­ 51,

(c) una secuencia de ácido nucleico complementaria a una cualquiera de las secuencias en (a) o (b), y

(d) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse a (a), (b) o (c) en condiciones rigurosas.

Según una realización particularmente preferida de la invención, una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica para la región variable de la cadena pesada y una secuencia que codifica para la región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En una realización alternativa, se proporciona una combinación de dos moléculas de ácido nucleico, en la que una molécula de ácido nucleico codifica para la cadena ligera del anticuerpo y la otra molécula de ácido nucleico codifica para la cadena pesada del anticuerpo. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena pesada se selecciona preferiblemente de las secuencias tal como se muestran en una cualquiera de SEQ ID NO: 36-43. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se selecciona preferiblemente de las secuencias tal como se muestran en una cualquiera de SEQ ID NO: 44-51. Se prefiere particularmente una combinación de secuencias de ácido nucleico que comprende al menos una de las secuencias tal como se muestran en SEQ ID NO: 36-43 y al menos una de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 44-51. Las secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes dentro de una molécula de ácido nucleico aislada o en una combinación de dos moléculas de ácido nucleico aisladas.

El término “hibridarse en condiciones rigurosas” significa que dos fragmentos de ácido nucleico se hibridan entre sí en condiciones de hibridación normalizadas tal como se describe, por ejemplo en Sambrook et al., “Expression of cloned Genes in E. cotí’ en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, EE.UU. Tales condiciones son, por ejemplo, hibridación en 6,0 x SSC (citrato salino de sodio) a aproximadamente 45°C seguido por una etapa de lavado con 2,0 x SSC a 50°C, preferiblemente 2,0 x SSC a 65°C o 0,2 x SSC a 50°C, preferiblemente 0,2 x Ss C a 65°C.

La molécula de ácido nucleico de la invención puede estar ubicada en un vector que puede contener adicionalmente un origen de replicación y/o un gen marcador de selección. Ejemplos de vectores son, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, etc. Por tanto, una realización adicional de la invención es un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico tal como se da a conocer en el presente documento. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión. Dicho vector puede ser, por ejemplo, un vector de fago, plásmido, viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. En este último caso, la propagación viral sólo se producirá generalmente en huéspedes/células complementarios/as.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden unirse a un vector que contiene marcadores seleccionables para la propagación en un huésped. Generalmente, se introduce un vector de plásmido en un precipitado tal como un precipitado de fosfato de calcio o precipitado de cloruro de rubidio o en un complejo con un lípido cargado o en agrupaciones basadas en carbono tales como fullerenos. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro usando una línea celular de empaquetamiento apropiada antes de su aplicación a células huésped.

Preferiblemente, el vector de la invención es un vector de expresión, en el que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a una o más secuencias de control que permiten la transcripción y opcionalmente la expresión en células huésped procariotas y/o eucariotas. La expresión de dicha molécula de ácido nucleico comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico, preferiblemente para dar un ARNm traducible. Los expertos en la técnica conocen bien elementos reguladores que garantizan la expresión en células eucariotas, preferiblemente células de mamífero. Habitualmente comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción así como de la traducción. Los elementos reguladores posibles que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOXI o GAL-1 en levadura o el promotor de CMV (citomegalovirus), VS40 (virus del simio 40), VSR (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de VS40 o un intrón de globina en células de mamífero y otros animales. Además de elementos que son responsables del inicio de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción tales como el sitio de VS40-poli-A o el sitio de tk-poli-A, en el sentido de 3' del polinucleótido. En este contexto, en la técnica se conocen vectores de expresión adecuados tales como vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg ^{pcDVI (Pharmacia), pCDM}8^{, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 o pSPORTI (Thermo Fisher Scientific). Preferiblemente,} dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de direccionamiento o transferencia génica. Pueden usarse vectores de expresión derivados a partir de virus tales como retrovirus, virus vaccina, virus adenoasociado, virus del herpes o virus del papiloma bovino para la administración de los polinucleótidos o el vector de la invención al interior de una población celular seleccionada como diana. Los métodos que conocen bien los expertos en la técnica pueden ser

Además, la invención se refiere a una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector tal como se describió anteriormente. La molécula de ácido nucleico o el vector pueden introducirse en el interior de la célula huésped mediante transformación, transfección o transducción según cualquier método conocido en la técnica.

Dicha célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota. El polinucleótido o vector de la invención que está presente en el huésped puede o bien integrarse en el genoma del huésped o bien puede mantenerse de manera extracromosómica. Con respecto a esto, también es posible entender que la molécula de ácido nucleico de la invención puede usarse para “direccionamiento génico” y/o “sustitución génica”, para restaurar un gen mutante o para crear un gen mutante mediante recombinación homóloga; véase, por ejemplo, Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.

La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal, de mamífero o preferiblemente humana. Células fúngicas preferidas son, por ejemplo, las del género Saccharomyces, en particular las de la especie S. cerevisiae. Se pretende que el término “procariota” incluya todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con un polinucleótido para la expresión de un polipéptido variante de la invención. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Un polinucleótido que codifica para una forma mutante de polipéptidos variantes de la invención puede usarse para transformar o transfectar el huésped usando cualquiera de las técnicas habitualmente conocidas por los expertos habituales en la técnica. En la técnica se conocen bien métodos para preparar genes fusionados operativamente unidos y para la expresión de los mismos en bacterias o células animales (Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001, 3a edición). Los constructos genéticos y métodos descritos en el mismo pueden usarse para la expresión de anticuerpos variantes, fragmentos de anticuerpo o derivados de los mismos de la invención, por ejemplo, en huéspedes procariotas. En general, se usan vectores de expresión que contienen secuencias de promotor, que facilitan la transcripción eficiente de la molécula de ácido nucleico insertada, en relación con el huésped. El vector de expresión contiene normalmente un origen de replicación, un promotor y un terminador así como genes específicos que pueden proporcionar selección fenotípica de las células transformadas. Las células huésped procariotas transformadas pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica para alcanzar un crecimiento celular óptimo. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o derivados de los mismos de la invención pueden aislarse entonces a partir del medio de crecimiento, listados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o derivados de los mismos de la invención expresados de manera microbiana o de otro modo pueden realizarse mediante cualquier medio convencional, tal como, por ejemplo, separaciones por cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales.

Según una realización de la invención, la célula huésped es una célula humana, bacteriana, animal, fúngica, de anfibio o vegetal. Las células animales preferidas incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH-3T3) y varias otras líneas celulares, incluyendo células humanas.

En otra realización preferida, dicha célula animal es una célula de insecto. Las células de insecto preferidas incluyen, pero no se limitan a, células de las líneas celulares SF9.

Preferiblemente, la célula es una célula de mamífero, por ejemplo una célula de hámster, conejo o humana. Lo más preferiblemente, la célula es una célula humana. Dichas células humanas incluyen, pero no se limitan a, células de riñón embrionario humano (HEK293, 293T, 293 freestyle). Además, dichas líneas celulares humanas incluyen, pero no se limitan a, células HeLa, células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo HEPG2, Huh-7), células A549.

El anticuerpo de la invención puede prepararse mediante un método en el que dicho anticuerpo se obtiene a partir de una célula huésped tal como se describió anteriormente en el presente documento. Por tanto, una realización adicional de la presente invención es un método para la preparación de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones que permiten la síntesis de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Las células huésped transformadas pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención pueden purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N.Y. (1982). El anticuerpo o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente(s) de la invención pueden aislarse entonces a partir del medio de crecimiento, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de los anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina de la invención expresados, por ejemplo, de manera microbiana pueden realizarse mediante cualquier medio convencional, tal como, por ejemplo, separaciones por cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra la región constante del anticuerpo de la invención.

Resultará evidente para los expertos en la técnica que los anticuerpos de la invención pueden acoplarse adicionalmente a otros restos, por ejemplo aplicaciones de obtención de imágenes y direccionamiento de fármacos. Tal acoplamiento puede llevarse a cabo químicamente tras la expresión del anticuerpo o antígeno en el lado de unión o el producto de acoplamiento puede introducirse por ingeniería en el anticuerpo o antígeno de la invención a nivel de ADN. Después se expresan los ADN en un sistema huésped adecuado y se recogen las proteínas expresadas y vuelven a naturalizarse si es necesario.

Según una realización, se cultiva una célula recombinante tal como se describió anteriormente en condiciones que permiten la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpo. El anticuerpo puede recogerse a partir de la célula cultivada o del sobrenadante de cultivo. Preferiblemente, el anticuerpo se prepara a partir de una célula de mamífero, particularmente a partir de una célula humana.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, el conjugado o la proteína de fusión tal como se describió anteriormente, opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

El término “portador” incluye agentes, por ejemplo diluyentes, estabilizantes, adyuvantes u otros tipos de excipientes que no son tóxicos para la célula o el mamífero que va a exponerse a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En la técnica se conocen bien ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, etc. Con frecuencia, el portador farmacéuticamente aceptable es una disolución acuosa de pH tamponado que es útil para la administración de fármacos, particularmente para la administración de moléculas de anticuerpo. La composición farmacéutica puede formularse mediante métodos convencionales bien conocidos, es decir mezclando el agente activo con portadores y opcionalmente otros agentes que se incorporan habitualmente en la formulación. Por ejemplo, la composición puede formularse en forma de formulaciones liofilizadas, disoluciones acuosas, dispersiones o preparaciones sólidas. La administración de las composiciones adecuadas puede realizarse mediante diferentes maneras, por ejemplo mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. Las composiciones de la invención también pueden administrarse directamente al sitio diana, por ejemplo mediante administración biolística a un sitio diana externo o interno, tal como el cerebro. El régimen de dosificación se determinará por el médico encargado y por factores clínicos.

Tal como se conoce bien en las ciencias médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área y superficie corporal, edad, el compuesto particular que va a administrarse, sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos que estén administrándose simultáneamente. Dependiendo del tipo y la gravedad del estado que va a tratarse, pueden administrarse aproximadamente de 1 |ig/kg a 15 mg/kg del principio activo a un paciente que lo necesita, por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede oscilar ^{entre aproximadamente} 1 ^{|ig/kg y aproximadamente} 100 ^{mg/kg, dependiendo de los factores mencionados} anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado que va a tratarse, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de la enfermedad o los síntomas. La composición puede administrarse mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante infusión o inyección parenteral, subcutánea, intranasal, intravascular, intravenosa, intraarterial o intratecal.

Puede monitorizarse el avance mediante evaluación periódica. Las composiciones de las invenciones pueden administrarse por vía local o sistémica. Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenos, glicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa en solución de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa en solución de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares.

El agente activo según la presente invención puede administrarse junto con otros agentes activos. El/los agente(s) activo(s) adicional(es) puede(n) administrarse por separado o como parte de la composición farmacéutica de la presente invención.

Según una realización preferida de la invención, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales dependiendo del uso previsto de la composición farmacéutica. Se prefiere particularmente que la composición farmacéutica comprenda agentes activos adicionales tales como, por ejemplo un agente antineoplásico adicional, inhibidor de molécula pequeña, agente antitumoral o agente quimioterápico. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención en combinación con al menos un agente antineoplásico adicional. Tal combinación es eficaz, por ejemplo, en la inhibición del crecimiento celular anómalo.

Actualmente se conocen muchos agentes antineoplásicos en la técnica. En una realización, el agente antineoplásico se selecciona del grupo de proteínas terapéuticas incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos o proteínas inmunomoduladoras.

El agente antineoplásico también puede seleccionarse del grupo de inhibidores de moléculas pequeñas o agentes quimioterápicos que consisten en inhibidores mitóticos, inhibidores de cinasas, agentes alquilantes, antimetabolitos, anticuerpos de intercalación, inhibidores de factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de histona desacetilasa, agentes antisupervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo antiandrógenos y agentes antiangiogénesis.

Evidentemente, los agentes activos adicionales anteriormente mencionados pueden no sólo administrase junto con el anticuerpo de la invención dentro de una composición farmacéutica mutua, sino que también pueden administrarse por separado.

Para su uso de diagnóstico, se prefiere particularmente usar un anticuerpo que porta un grupo de marcado tal como se describió anteriormente. Una comparación del resultado obtenido para el tejido de paciente o la muestra de paciente con datos de referencia permite el diagnóstico de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4. El método de diagnóstico de la invención es útil para detectar una expresión, sobreexpresión o hiperactividad de FGFR4 humano no deseada en diferentes células, tejidos u otras muestras adecuadas. Por consiguiente, puede evaluarse la aparición o el estado patológico de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4. El método de diagnóstico también puede incluir una etapa de establecer un régimen de tratamiento para el paciente basándose en los resultados obtenidos. En un método de evaluación para determinar la presencia de células que expresan FGFR4, puede ponerse el anticuerpo de la invención en contacto con células o tejido que se sospecha que portan FGFR4 sobre su superficie. Métodos adecuados para detectar la expresión de FGFR4 en una muestra pueden ser un ensayo de inmunoabsorción asociado a enzimas (ELISA) o inmunohistoquímica (IHC).

En otra realización, la presente invención se refiere a un método de evaluación para determinar la presencia de células que expresan FGFR4 que comprende poner en contacto el anticuerpo de la invención con células o tejido que se sospecha que portan FGFR4 sobre su superficie. Métodos adecuados para detectar la expresión de FGFR4 en una muestra pueden ser un ensayo de inmunoabsorción asociado a enzimas (ELISA) o inmunohistoquímica (IHC).

Puede llevarse a cabo un ensayo ELISA en un formato de placa de microtitulación, en el que, por ejemplo, en pocillos de una placa de microtitulación se adsorbe un anticuerpo anti-FGFR4. Se aclaran los pocillos y se tratan con un agente de bloqueo tal como proteína de la leche o albúmina para prevenir la adsorción no específica del analito. Posteriormente, se tratan los pocillos con una muestra de prueba. Tras eliminar mediante aclarado la muestra de prueba o el patrón, se tratan los pocillos con un segundo anticuerpo anti-FGFR4 que está marcado, por ejemplo, mediante conjugación con biotina. Tras eliminar mediante lavado el anticuerpo secundario en exceso, se detecta la etiqueta, por ejemplo con peroxidasa del rábano conjugada con avidina (HRP) y un sustrato cromogénico adecuado. Se determina una concentración del antígeno de FGFR4 en la muestra de prueba mediante comparación con una curva patrón desarrollada a partir de muestras de patrón.

Para IHC, pueden usarse tejidos incrustados en parafina, en los que en primer lugar, por ejemplo, se desparafinizan los tejidos en xileno y después se deshidratan, por ejemplo, con etanol y se aclaran en agua destilada. Epítopos antigénicos enmascarados mediante fijación con formalina e incrustación en parafina pueden exponerse mediante desenmascaramiento de epítopos, digestión enzimática o saponina. Para el desenmascaramiento de epítopos, ^{pueden calentarse secciones de parafina en un dispositivo de vapor, baño de agua u horno microondas durante} 20^­ 40 minutos en una disolución de recuperación de epítopo tal como, por ejemplo, disolución de HCl 2 N (pH 1,0). En el caso de digestión enzimática, pueden incubarse secciones tisulares a 37°C durante 1030 minutos en diferentes disoluciones de enzimas tales como proteinasa K, tripsina, pronasa, pepsina, etc.

Tras eliminar mediante aclarado la disolución de recuperación de epítopo o la enzima en exceso, se tratan secciones tisulares con un tampón de bloqueo para prevenir interacciones no específicas reconocidas por peroxidasa del rábano acoplada con estreptavidina. La detección del complejo de anticuerpo/enzima se logra incubando con un sustrato cromogénico adecuado.

El bloqueo de la función de FGFR4 puede realizarse poniendo en contacto el anticuerpo de la invención con células o un tejido que se sospecha que portan FGFR4 sobre su superficie en condiciones en las que el anticuerpo puede bloquear la función de FGFR4. La puesta en contacto puede ser in vitro o in vivo.

Además, la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos un anticuerpo, proteína de fusión, molécula de ácido nucleico y/o vector tal como se describió anteriormente. Además, el kit comprende al menos un agente antineoplásico adicional. Un kit de diagnóstico de la presente invención comprende preferiblemente un anticuerpo marcado tal como se describió anteriormente en el presente documento. Además, el kit de diagnóstico puede comprender datos de referencia sobre la cantidad y/o ubicación de FGFR4 en el mismo tipo de tejido o muestra. Los datos de referencia pueden obtenerse a partir de uno o más sujetos sanos y/o a partir de uno o más sujetos con un estado patológico conocido. Una comparación de dichos datos de referencia permite el diagnóstico de enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4. Basándose en los resultados obtenidos, puede establecerse un régimen de tratamiento para el paciente.

Según el método de diagnóstico de la presente invención, enfermedades asociadas con la expresión, sobreexpresión y/o hiperactividad de FGFR4 son, por ejemplo, enfermedades hiperproliferativas tales como cáncer. El cáncer que puede diagnosticarse según la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma.

La presente invención se explicará en más detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Leyendas de figuras

La figura 1 muestra la determinación de unión de anticuerpo a Huh-7 para los anticuerpos U4-3, U4-5 y U4-6 usando un anticuerpo anti-IgG humana marcado con ficoeritrina.

La figura 2 muestra la determinación de la unión de anticuerpos contra FGFR4, U4-3 y U4-9, al dominio extracelular de FGFR4.

La figura 3 muestra los resultados de un análisis de interacción de antígeno con anticuerpo U4-3 capturado de manera reversible.

La figura 4 muestra una comparación de la especificidad de especie del anticuerpo U4-3 de la invención en comparación con el anticuerpo GT-13.

La figura 5 es un gráfico que muestra la unión del anticuerpo humano U4-3 a diferentes receptores de FGF. Tal como puede observarse el anticuerpo U4-3 reconoce FGFR4 humano con alta especificidad y no presenta reacción cruzada con otros miembros de la familia de FGFR.

^{La figura} 6 ^{es un gráfico de barras que muestra la unión de anticuerpo a diferentes dominios extracelulares de} FGFR4.

La figura 7 es un gráfico que muestra la determinación del epítopo de unión de FGFR4 para los anticuerpos U4-3 y GT13. Puede observarse que la secuencia tetrapeptídica resaltada RYNY se reconoce por U4-3 pero no por GT-13. ^{La figura} 8 ^{es un gráfico de barras que muestra la determinación de la unión de anticuerpo U4-3 a FGFR4. Los} resultados se obtuvieron a partir de mutagénesis de barrido con alanina del dominio extracelular de FGFR4. Tal como puede observarse, la unión de FGFR4 es altamente específica y la mutagénesis de un único ácido en el dominio D2 dio como resultado una unión significativamente reducida.

La figura 9 es un gráfico que muestra la unión de ligando mediante anticuerpo anti-FGFR4, U4-3. Se muestra hlgG como ejemplo comparativo.

La figura 10(A) muestra una inmunotransferencia representativa para la determinación de la inhibición mediada por la concentración de la fosforilación de ERK mediada por bFGF usando diferentes concentraciones de anticuerpo de U4-3.

La figura 10(B) es un gráfico de barras que muestra una cuantificación de los datos a partir de la figura 10(A).

La figura 11 muestra la inhibición de la fosforilación de FGFR4 endógeno mediante anticuerpo anti-FGFR4, U4-3, en células Huh-7. A: IP; B: lisados celulares totales; C: cuantificación de 11A.

La figura 12 muestra un ensayo de crecimiento esferoide de NIH 3T3 usando anticuerpos U4-3 y U4-9.

La figura 13 es un gráfico de barras que muestra la inhibición del crecimiento de colonias en agar blando en células Huh-7 en presencia de anticuerpo anti-FGFR4, U4-3, o anticuerpo IgG de control.

La figura 14 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo de crecimiento celular de células ZR-75-1 cultivadas en presencia de anticuerpo U4-3 e IgG de control.

La figura 15 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo de crecimiento esferoide de MG-63 usando diferentes concentraciones de U4-3 e IgG de control.

La figura 16 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento mediada por anticuerpo contra FGFR4, U4-3 o GT-13, en un modelo de tumor murino. A: respuesta a la dosis; B: diferentes anticuerpos, C: comparación con GT-13.

La figura 17 la inhibición del crecimiento in vivo en modelos de tumor Huh-1 (A) y Hep3B (B) usando el anticuerpo U4-3.

Ejemplos

Ejemplo 1: generación de anticuerpos específicos para FGFR4

Aislamiento de fragmentos de anticuerpo Fab

Se usó la biblioteca n-CoDeR Fab (BioInvent, Lund, Suecia) para aislar fragmentos de anticuerpo Fab que reconocían FGFR4 humano. El examen se estableció como un enfoque de cribado diferencial frente a FGFR4 humano-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN; EE.UU.), FGFR4 humano-His/Myc o la línea celular de mioblasto de ^{rata L}6 ^{(ATCC, Manassas, VA; EE.UU.) que expresaba de manera estable FGFR4 humano. En la selección negativa} se usó otra familia de FGFR humanos-Fc (R&D Systems), Fc humano (Jackson Immuno Research, Newmarket; ^{R.U.) y células L}6^{. En el cribado líquido, se biotinilaron FGFR4 humano-Fc y FGFR4 humano-His/Myc con NHS-}biotina cromogénica EZ-Link (Thermo Fisher Scientific). Se añadieron Dynabeads M-280 con estreptavidina (Thermo Fisher Scientific) para recuperar fagos de unión a FGFR4. En el cribado sólido, se inmovilizaron directamente FGFR4 humano-Fc y FGFR4 humano-His/Myc sobre bolas de poliestireno. Se incubaron fagos con las perlas, las ^{bolas o células L}6 ^{que expresaban FGFR4 y se retiraron fracciones sin unir mediante lavado. Se liberaron fagos} unidos mediante incubación con tripsina y se amplificaron en E. coli. Tras un total de cinco cribados diferentes, se transformaron E. coli (TOP10F') con los plásmidos de expresión de Fab y finalmente se expresaron clones de Fab individuales.

Ejemplo 2: identificación de Fab de unión a FGFR4 únicos

Se sometieron a prueba Fab procedentes del cribado de tercera ronda tal como se describió anteriormente para determinar la unión de la siguiente manera: se recubrió 1 pmol de FGFR4-Fc o FGFR4-His/Myc en cada pocillo de una placa de ELISA y se incubó durante la noche a 4°C. Tras el lavado y bloqueo se añadieron los medios de cultivo de E. coli TOP10F' que expresaban el Fab a los pocillos y se incubaron durante 1 h. Finalmente, se detectó el Fab unido mediante incubación con anticuerpo anti-His conjugado con peroxidasa (R&D Systems) o anticuerpo anti-Fab humano conjugado con peroxidasa (Jackson Immuno Research). Se detectó la señal añadiendo sustrato picoquimioluminiscente de ELISA Super Signal (Thermo Fisher Scientific). Se secuenciaron Fab de unión a FGFR4 para identificar clones únicos usando técnicas de secuenciación convencionales y se sometieron a ensayo Fab únicos ^{purificados para determinar la unión a células L}6 ^{o 293T que expresaban FGFR4 humano (expresión transitoria o} estable) mediante citometría de flujo. Se convirtieron clones de Fab de unión a FGFR4, confirmados, a formato de IgG usando técnicas recombinantes convencionales.

Ejemplo 3: actividad de neutralización de señal mediante Fab de unión a FGFR4 mediante ensayo de gen indicador de luciferasa Elk1

Se sometió a prueba la funcionalidad de Fab que se unían a FGFR4 mediante ensayo de gen indicador de luciferasa Elk1, que se estableció de la siguiente manera:

Se sembraron células HEK293 que expresaban de manera estable integrina av e integrina p3 sobre una placa de cultivo de 96 pocillos y se transfectaron de manera transitoria con pcDNA-DEST40-hFGFR4, pcDNA-DEST40, pFA2-Elk1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA; EE.UU.), pFR-Luc2CP, que contenía 5 x elemento de unión a GAL4 de pFR-Luc (Agilent Technologies) colocado en los sitios de clonación de pGAL4.12[luc2CP] y pGL4.74 [hRluc/TK] (Promega, Madison, WI; EE.UU.) usando Lipofectamine 2000 según el protocolo del fabricante. Al día siguiente, se incubaron las células con Fab (diluidos en DMEM con FBS al 2% a concentraciones de 10, 1, 0,1 pg/ml) durante 1 h a 37°C seguido por incubación con ligando 10 ng/ml (FGF-17 humano recombinante ((rhFGF17), R&D Systems)) ^durante 6 ^{h. Finalmente se determinó la actividad luciferasa añadiendo sustrato de sistema de ensayo de luciferasa} Dual-Glo (Promega). Se calculó la razón de actividad específica (luciferasa de luciérnaga) con respecto a la señal para la normalización (luciferasa de renilla) y se presentan valores para los diferentes Fab como porcentaje con respecto a valores de control (tabla 3). Todos los Fab sometidos a prueba mostraron una actividad inhibidora significativa, reduciendo la señal en más del 50% a 1 pg/ml y más del 35% a 10 pg/ml.

Tabla 3: actividad de neutralización de señal mediante Fab que se unen a FGFR4 mediante ensayo de gen indicador de luciferasa Elk1.

Ejemplo 4: determinación de K^d para anticuerpo anti-FGFR4 en células Huh-7 mediante citometría de flujo.

Se cultivaron células Huh-7 (obtenidas a partir del banco de células JCRB) en DMEM que contenía FBS al 10% en ^{condiciones convencionales a 37°C y CO}2 ^{al 5%. Se recogieron células con EDTA 5 mM (en PBS) y se incubaron} 200.000 células por muestra con el anticuerpo anti-FGFR4 indicado (dilución en serie 1:3; concentración inicial de 30 pg/ml) durante 30 min a 4°C. Tras la incubación, se lavaron las células y se determinó el anticuerpo unido usando un anticuerpo anti-IgG humana marcado con ficoeritrina (Jackson Immuno Research). Se midió la unión de ^{anticuerpo a Huh-7 con un citómetro de flujo BD Accuri C}6 ^{(BD Biosciences, San Jose, CA; EE.UU.) y se analizó usando el software AccuriC}6^{. Posteriormente, se determinó la constante de disociación en el equilibrio (Kd) usando} Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). Los valores de K^d calculados para los anticuerpos U3 Pharma eran muy similares (entre 0,2 y 1,6 nM). La figura 1 muestra un experimento representativo y la K^d para los anticuerpos restantes se determinó de manera independiente. Se encontró que la afinidad por GT-13 era inferior en comparación con todos los anticuerpos U3 Pharma sometidos a prueba (tabla 4).

Tabla 4: valores de constante de disociación (K^d) para los anticuerpos contra FGFR4 humano indicados.

Ejemplo 5: determinación de K^d para los anticuerpos U4-3 y U4-9 contra el dominio extracelular (ECD) de FGFR4 mediante ELISA.

Se obtuvo anticuerpo de ratón anti-etiqueta His a partir de Bio-Rad (Hercules, CA; EE.UU.) y se recubrió sobre placas de ELISA de 96 pocillos de fondo plano MaxiSorp® (Sigma, St. Louis, MO; EE.UU.) a una concentración de 2 pg/ml. Tras el recubrimiento, se añadió el dominio extracelular de FGFR4 humano (marcado con etiqueta myc e His) a una concentración de 0,01 pg/ml. Tras la retirada de proteína sin unir, se añadió el anticuerpo anti-FGFR4 indicado (dilución en serie 1:4, concentración inicial de 10 pg/ml) y finalmente se detectó la unión con el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP (Promega) usando un anticuerpo de cabra anti-fragmento F(ab') de IgG humana acoplado a fosfatasa alcalina en el instrumento de lector de placas fluorescente Fluostar Omega de BMG Labtech (Ortenberg; Alemania). En la figura 2 se muestra un resultado representativo. Posteriormente, se calcularon las constantes de disociación para U4-3, 5 y 9 usando Graph Pad Prism (tabla 5). Todos los anticuerpos sometidos a prueba mostraron K^d excelentes y el valor observado para U4-3 era similar al observado anteriormente.

Tabla 5: valores de constante de disociación (K^d) para U4-3 contra FGFR4 humano (dominio extracelular).

^Ejemplo 6^{: determinación de Kd para U4-3 usando el ensayo Biacore.}

Se aplicó acoplamiento de amina convencional para preparar un chip sensor S-CM5 de captura de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (la célula de flujo de referencia también contenía el anticuerpo de captura). Se activó la superficie de dextrano carboximetilado (CMD) inyectando una mezcla de EDC 200 mM y NHS 50 mM durante 7 min (10 pl/min). Posteriormente, se inyectó anticuerpo anti-IgG humana 30 pg/ml diluido en acetato de Na 10 mM pH 5,0 durante 7 minutos (10 pl/min). Se extinguieron los ésteres sin reaccionar restantes con etanolamina 1 M pH 8,5 (7 min, 10 pl/ml). Se obtuvieron las densidades de superficie de 17892-18376 UR para el anticuerpo anti-IgG humana.

Se realizaron análisis de interacción de antígeno con anticuerpo capturado de manera reversible usando un instrumento BiacoreTM T100 (GE Healthcare Bio-Sciences (Piscataway, NJ; EE.UU.)) a 25°C en tampón de análisis HBS (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 50 pM, Tween 20 al 0,05%). Se capturaron 37-38 UR de anticuerpo específico en una célula de flujo. Posteriormente se inyectaron cinco diluciones en serie de tres veces de antígeno (3,7, 11,1, 33,3, 100 y 300 nM) en modo de un único ciclo durante 2 min, respectivamente (50 pl/min). Se registró la disociación durante 10 min a la misma tasa de flujo. Una célula de flujo que contenía anticuerpo de captura anti-IgG humana sirvió como referencia. Se logró la regeneración completa (retirada de anticuerpo específico junto con antígeno unido a partir de la superficie de captura) mediante inyecciones repetidas de glicina 10 mM pH 1,7 complementada con un porcentaje final del 5% de 1,4-dioxano.

Se realizaron el procesamiento de datos (por ejemplo, resta de ejecución con blanco) y la evaluación mediante ajuste global aplicando un modelo de unión a analito bivalente usando el software de evaluación Biacore T100 ^{versión 2.0.3. Se calculó la constante de disociación en el equilibrio KD}1 ^{dividiendo kd}1 ^{entre ka}1^{. La figura 3 muestra una medida representativa para el anticuerpo U4-3; en la tabla} 6 ^{se notifican valores de Kd para este} anticuerpo y U4-9 (promedio de 3 medidas).

^Tabla 6^{: valores de constante de disociación (Kd) para los anticuerpos indicados usando el ensayo Biacore.}

Ejemplo 7: determinación de la especificidad de especie mediante citometría de flujo.

Se obtuvieron células Hek293 a partir de CLS (Cell Lines Service, Eppelheim; Alemania) y se cultivaron en DMEM ^{que contenía FBS al 10% en condiciones convencionales a 37°C y CO}2 ^{al 5%. En el día 0, se sembraron las células a 4x10}5 ^{células/placa de 10 cm. Tras 24 h, se transfectaron las células con plásmidos que codificaban para FGFR4} de rata, ratón, ser humano o mono cynomolgus. Se dejó que las células expresaran las proteínas durante 48 h y después se disociaron a partir de la placa con EDTA 5 mM en PBS seguido por incubación con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-FGFR4, U4-3 o GT-13. Se determinó la unión usando un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con ficoeritrina (Jackson Immuno Research Europe). Se adquirieron datos con un citómetro de flujo BD ^{Accuri C}6 ^{(BD Biosciences) y se analizaron usando el software AccuriC}6^{. Un experimento de valoraciones de} anticuerpo (concentración inicial de 10 |ig/ ml; dilución 1:3) permitió el cálculo de las constantes de disociación para los anticuerpos (véase la tabla a continuación). El anticuerpo ya mostró una afinidad similar por todas las especies ^{sometidas a prueba a concentraciones muy bajas} [1 ^{|ig/ml] y las Kd fueron comparables entre especies mostrando} una mejor unión contra proteína humana y de cynomolgus. Sin embargo, U4-3 mostró una mejor unión en todas las especies sometidas a prueba en comparación con GT-13.

Tabla 7: valores de constante de disociación (K^d) para los anticuerpos contra FGFR4 indicados de diferentes especies.

^Ejemplo 8^{: unión a otros FGFR.}

Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos de fondo plano MaxiSorp® adquiridas de Thermo Fisher Scientific con FGFR humano recombinante (o BSA como control) tal como se indica (dominio extracelular, quimera de Fc) adquirido a partir de R&D Systems a una concentración final de 100 |ig/pocillo y se procesaron según las instrucciones del fabricante. Tras la incubación con anticuerpo anti-FGFR4, U4-3, tal como se indica, se detectó la unión con un anticuerpo de cabra anti-F(ab') de IgG humana acoplado con fosfatasa alcalina usando el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP adquirido de Promega y se detectó con el lector de placas fluorescente Fluostar Omega de BMG Labtech. Los resultados se muestran en la figura 5.

El anticuerpo U4-3 reconoce el FGFR4 humano con alta especificidad y, de manera importante, no presenta reacción cruzada con otros miembros de la familia de FGFR.

Ejemplo 9: determinación de anticuerpo que se unen a diferentes dominios extracelulares de FGFR4.

Se obtuvieron células Hek293 a partir de CLS y se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10% en condiciones ^{convencionales a 37°C y CO}2 ^{al 5%. En el día 0, se sembraron las células y tras 24 h se transfectaron las células} con plásmidos que codificaban para FGFR4 que contenía el dominio indicado. Se dejó que las células expresaran las proteínas durante 48 h y después se disociaron a partir de la placa EDTA 5 mM en p Bs seguido por incubación con el anticuerpo anti-FGFR4 indicado. Se determinó la unión usando un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con ^{ficoeritrina (Jackson Immuno Research Europe). Se adquirieron datos con un citómetro de flujo BD Accuri C}6 ^{(BD Biosciences) y se analizaron usando el software AccuriC}6^{. La unión de U4-3 a FGFR4 se produjo principalmente en} el dominio 2 de tipo Ig en el receptor y no se observó ninguna unión en dominios 1 (aminoácidos 22-180) y 3 ^{(aminoácidos 249-349) de tipo Ig. Los resultados se muestran en la figura} 6^.

Ejemplo 10: determinación del epítopo de unión de FGFR4.

Se sintetizaron péptidos basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína diana (dominio 2 de dominio extracelular de FGFR4 humano) usando química de Fmoc convencional y se desprotegieron usando ácido trifluórico con eliminadores. Se sintetizaron los péptidos restringidos en andamiajes químicos con el fin de reconstruir epítopos conformacionales, usando tecnología de péptidos químicamente unidos en andamiajes (CLIPS). Se acoplaron las cadenas laterales de las múltiples cisteínas en los péptidos a moldes de CLIPS mediante reacción sobre tarjetas de PEPSCAN de polipropileno (455 formatos de péptido/tarjeta) con una disolución 0,5 mM de molde de CLIPS tal como 1,3-bis(bromometil)benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (1:1(v/v)). Se agitaron suavemente las tarjetas en la disolución durante de 30 a 60 min mientras estaban completamente cubiertas en ^{disolución. Finalmente, se lavaron extensamente las tarjetas con exceso de H}2^{O y se sonicaron en tampón de} alteración que contenía SDS al 1%/p-mercaptoetanol al 0,1% en PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 min, seguido por ^{sonicación en H}2^{O durante otros 45 min. Se somete a prueba la unión de anticuerpo a cada péptido en un ELISA} basado en PEPSCAN. Las tarjetas de polipropileno con formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos que contenían los péptidos covalentemente unidos se incubaron con disolución de anticuerpo primario que consistía, por ejemplo, en 1 |ig/ml diluido en disolución de bloqueo, por ejemplo el suero de caballo al 4%, ovoalbúmina al 5% (p/v) en PBS/Tween al 1%. Tras lavar (3 x 10 min), se incubaron los péptidos con una dilución 1:1000 de anticuerpo conjugado con peroxidasa durante 1 h a 25°C (o estreptavidina-HRP). Tras lavar ( 3 x 10 min), se añadieron el ^{sustrato de peroxidasa, sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 |il de H}2^O2 ^{al 3%. Tras una hora,} se midió el desarrollo de color y se cuantificó con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes. La figura 7 muestra diferencias en el reconocimiento de péptidos mediante los anticuerpos sometidos a prueba; en particular, la secuencia tetrapeptídica destacada RYNY se reconoce por U4-3 pero no por GT-13.

Ejemplo 11: dominio extracelular de FGFR4 de mutagénesis de barrido con alanina.

Se obtuvieron células Hek293 a partir de CLS y se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10% en condiciones ^{convencionales a 37°C y CO}2 ^{al 5%. En el día 0, se sembraron las células a 2x10}5 ^{células/placa de 60 mm. Tras 24} h, se transfectaron las células con 4,8 |ig de un plásmido que codificaba para el dominio extracelular 2 (D2) del FGFR4 (tabla 7). Las proteínas expresadas portaban una etiqueta flag y diferían en cuanto a la secuencia de aminoácidos tal como se describe a continuación. Se dejó que las células expresaran la proteína durante 60 h (con cambio de medios entre medias) y finalmente se disociaron a partir del plato con EDTA 5 mM en PBS. Se incubaron las células con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-FGFR4, U4-3, y se determinó la unión usando un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con ficoeritrina (Jackson Immuno Research). Se adquirieron datos con un ^{citómetro de flujo BD Accuri C}6 ^{(BD Biosciences) y se analizaron usando el software AccuriC}6^{. Se normalizó la} intensidad de fluorescencia con respecto a la expresión de la etiqueta flag. Los resultados se muestran en la figura 8.

La unión de FGFR4 era altamente específica y la mutagénesis de un único aminoácido en el dominio D2 dio como resultado una unión significativamente reducida.

Tabla 7: constructos de ADN para mutagénesis de un único aminoácido

Ejemplo 12: inhibición de la unión de ligando mediante anticuerpos anti-FGFR4.

Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos de fondo plano Nunc MaxiSorp® adquiridas a partir de Thermo Fisher Scientific con FGFR4 humano recombinante (dominio extracelular, quimera de Fc; adquirido de R&D Systems) a una concentración final de 4 jug/pocMlo y se procesaron según las instrucciones del fabricante. Se incubó cada pocillo con 1,2 |ig/ml de FGF-19 recombinante de R&D Systems, seguido por tratamiento con la concentración indicada de anticuerpo anti-FGFR4. Tras la incubación y lavados, se detectó FGF-19 unido con 0,2 |ig/ml de anticuerpo anti-FGF19 biotinilado (R&D Systems) seguido por incubación con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina. Se desencadenó la reacción enzimática mediante incubación con el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP (Promega) y se detectó con el lector de placas fluorescente Fluostar Omega de BMG Labtech. Los datos muestran que U4-3 puede competir eficazmente con la unión de FGF-19 al receptor. Los resultados se muestran en la figura 9.

Ejemplo 13: inhibición de la fosforilación de ERK inducida por b-FGF mediante U4-3.

^{Se sembraron células L}6 ^{(ATCC) que expresaban de manera estable FGFR4 humano de longitud completa en} placas de 12 pocillos (1x10⁵ células/pocillo) usando DMEM que contenía FBS al 10% en condiciones convencionales de cultivo tisular (37°C, CO² al 5%). Al día siguiente, se sustituyeron los medios por medios de crecimiento que contenían las concentraciones indicadas de anticuerpos anti-FGFR4 o de control. Tras 1 h, se añadió bFGF (R&D Systems) a una concentración de 20 ng/ml a los pocillos indicados. Tras la incubación durante 10 min, se lavaron rápidamente los pocillos con PBS fría antes de someterse a lisis en tampón que contenía inhibidores de fosfatasa (Merck, Darmstadt, Alemania) y proteasa (Roche, Basilea; Suiza). Finalmente se sometieron muestras a electroforesis en gel seguido por inmunotransferencia (sobre membranas de nitrocelulosa) usando anticuerpos contra ERK y fosfo-ERK de Cell Signaling (Danvers, MA; EE.UU.). Se detectaron las bandas y se cuantificaron usando el instrumento de detección Odyssey de Li-Cor (Lincoln, NE; EE.UU.) junto con anticuerpos secundarios apropiados marcados de manera fluorescente. Se cuantificaron las bandas con el software Odyssey y se trazaron como una razón entre la intensidad de pERK y de ERK total. La figura 10(A) muestra una inmunotransferencia representativa y la 10(B) los datos cuantificados posteriores. U4-3 muestra una inhibición dependiente de la concentración de la fosforilación de ERK mediada por b-FGF.

Ejemplo 14: inhibición de la fosforilación de FGFR4 endógeno mediante incubación con anticuerpo U4-3.

Se sembraron células Huh-7 (obtenidas a partir del banco de células JCRB), cultivadas en DMEM que contenía FBS al 10% en condiciones convencionales a 37°C y CO² al 5%, en placas de 60 mm (2x10⁵ células por placa). Al día siguiente se retiraron los medios y se sustituyeron por medios de crecimiento que contenían el anticuerpo anti-^{FGFR, U4-3 (0,1, 1, 3 y 10 |ig/ ml) o IgG de control tal como se indica. Tras} 6 ^{días, se lavaron las células dos veces} con PBS y se sometieron a lisis en tampón de lisis de IP (que contenía inhibidor de fosfatasa de Merck e inhibidor de proteasa de Roche). Se inmunoprecipitó FGFR4 total usando un anticuerpo anti-FGFR4 (ratón) y matriz rProtein A Sepharose Fast Flow de GE Healthcare Bio-Sciences. Se lavó la matriz y finalmente se separaron las muestras mediante electroforesis. Se transfirieron proteínas a partir de geles a membranas de nitrocelulosa y sometieron a transferencia con anticuerpos que reconocían residuos de tirosina fosforilados (detección de pFGFR4) o con un anticuerpo que reconocía FGFR4 total (Santa Cruz Dallas, TX; EE.UU.) para garantizar una carga igual de las muestras. Se detectaron las bandas usando los anticuerpos secundarios apropiados y el instrumento de detección Odyssey de Li-Cor. En la figura 11(A) se muestra una exploración representativa para la inmunoprecipitación y en la figura 11(B) la inmunotransferencia de lisados de células completas. Tras explorarse las bandas, se determinó la razón entre FGFR4 y pFGFR4 con el software Odyssey y se normalizó con respecto a valores de control de IgG tal como puede observarse en la figura 11(C). El anticuerpo anti-FGFR4, U4-3, mostró una fuerte inhibición de la fosforilación de FGFR4 a todas las concentraciones sometidas a prueba.

Ejemplo 15: ensayo de crecimiento esferoide de NIH3T3

Se cultivaron células NIH3T3 que expresaban de manera estable FGFR4 humano y FGF19 humano en RPMI1640 que contenía FBS al 10%, G418500 |ig/ml e higromicina 150 |ig/ml. En el primer día del experimento, se sembraron 2.000 células en cada pocillo de una placa PrimeSurface de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite, Tokio; Japón) que contenía la concentración indicada de anticuerpo U4-3 o U4-9. Tras una incubación de 5 días en una incubadora de cultivo tisular convencional (37°C y CO² al 5%), se determinó el crecimiento celular con el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) usando un lector de placas VICTOR de Perkin Elmer (Waltham, MA; EE.UU.). Se normalizaron los valores con respecto a muestras sin tratar y ambos anticuerpos redujeron eficazmente el crecimiento celular en más del 70%. Se calcularon valores de CI50 y se determinó que eran de 24,7 nM y 10,6 nM (U4-9), respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 12.

Ejemplo 16: inhibición del crecimiento de colonias en agar blando en células de cáncer de hígado Huh-7

Se cultivaron células Huh-7 (banco de células JCRB) en DMEM que contenía FBS al 10% en condiciones convencionales a 37°C y CO² al 5%. Se recogieron las células con PBS/tripsina al 0,05% y volvieron a suspenderse en medios de agar superior (medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), 0,4 agar, FBS al 20%) y se pusieron cuidadosamente sobre medios de agar inferior solidificado (agar al 0,75%, FBS al 20% en IMDM). Cada pocillo de una placa de 96 pocillos contenía 2.000 células. Se incubaron los pocillos en presencia de anticuerpo anti-FGFR4 (concentración superior de 30 |ig/ml) o anticuerpo IgG de control; se observó la formación de colonias a lo largo del tiempo (aproximadamente 3 semanas). Se tiñeron las células viables usando reactivo MTT de Sigma (St. Louis, MO; EE.UU.) y se cuantificaron las colonias usando el sistema de recuento de colonias de Oxford Optronix (Abingdon; R.U.) y se normalizaron con respecto al control sin tratar. El anticuerpo anti-FGFR4, U4-3, sometido a prueba mostró una inhibición dependiente de la concentración del crecimiento de células Huh-7 en comparación con anticuerpo de control. Los resultados se muestran en la figura 13.

Ejemplo 17: ensayo de crecimiento de células de cáncer de mama ZR-75-1.

Se cultivaron células ZR-75-1 (CLS) en RPMI1640 complementado con FBS al 10%, insulina 10 |ig/ml y glutamina ^{2 mM. En el día del experimento, se sembraron 2.000 células en cada pocillo de una placa de} 6 ^{pocillos en medios}

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   i . Anticuerpo humano que se dirige contra un epítopo entre los aminoácidos 119-248 de FGFR4 humano que comprende la secuencia de aminoácidos rYnY, o un fragmento funcional o derivado funcional de dicho anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende

   (i) una cadena pesada que comprende:

   una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRH1) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (CDRH2) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 7-12, y

   una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (CDRH3) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 13-20, y

   (ii) una cadena ligera que comprende:

   una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (CDRL1) que tiene la secuencia tal ^{como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 21-23 y} 68^{, una región determinante de la} complementariedad de cadena ligera 2 (CDRL2) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 24-27, y

   una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (CDRL3) que tiene la secuencia tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 28-35.
2. 2. Anticuerpo según una cualquiera de la reivindicación 1 que comprende una cadena pesada que comprende (a) una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 3,

   ^{(b) una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO:} 8^{, y}

   (c) una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 15, y

   una cadena ligera que comprende

   (d) una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 23,

   (e) una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 25, y

   (f) una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 30.
3. 3. Anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, que comprende una región variable de cadena pesada tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 52-59 y/o una región variable de cadena ligera tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 60-67.
4. 4. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende una región variable de cadena pesada tal como se muestra en SEQ ID NO: 54 y una región variable de cadena ligera tal como se muestra en SEQ ID NO: 62.
5. 5. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla.
6. 6. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
7. 7. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un inhibidor de la señalización de FGFR4, en particular en el que el anticuerpo es un inhibidor de la unión de ligando a ^{FGRF4, y preferiblemente inhibe la unión de FGF1, FGF2, FGF4, FGF}6^{, FGF}8^{, FGF9, FGF17, FGF18,} FGF19, FGF20, FGF21 y/o FGF23 a FGFR4.
8. 8. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo no tiene ninguna reactividad cruzada frente a FGFR1-3b, c.
9. 9. Conjugado que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está acoplado a un grupo de marcado y/o a un grupo efector, preferiblemente a un grupo terapéutico.
10. 10. Proteína de fusión que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 fusionado a IL-2.
11. 11. Molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en:

    (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o un derivado del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o un conjugado según la reivindicación 9 o una ^{proteína de fusión según la reivindicación} 10^,

    (b) una secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 36-43 y SEQ ID NO: 44-51,

    (c) una secuencia de ácido nucleico complementaria a una cualquiera de las secuencias en (a) o (b); y (d) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse a (a), (b) o (c) en condiciones rigurosas.
12. 12. Vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 11, preferiblemente vector de expresión, en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una secuencia de control.
13. 13. Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 11 o el vector según la ^{reivindicación} 12^{, que es una célula humana, bacteriana, animal, fúngica, de anfibio o vegetal, con la} condición de que se excluyen líneas celulares embrionarias humanas.
14. 14. Procedimiento de fabricación de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, un conjugado según la reivindicación 9 o una proteína de fusión según la reivindicación 10, que comprende la etapa de obtener dicho anticuerpo, conjugado de anticuerpo o proteína de fusión a partir de la célula huésped según la reivindicación 13.
15. 15. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, un conjugado según la reivindicación 9, una proteína de fusión según la reivindicación 7 o un anticuerpo generado mediante el procedimiento según la reivindicación 14.
16. 16. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento de cánceres que expresan o sobreexpresan FGFR4 seleccionados de carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma.
17. 17. Conjugado según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de cánceres que expresan o sobreexpresan FGFR4 seleccionados de carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma.
18. 18. Proteína de fusión según la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de cánceres que expresan o sobreexpresan FGFR4 seleccionados de carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma.
19. 19. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, para su uso en el tratamiento de cánceres que expresan o sobreexpresan FGFR4 seleccionados de carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma.
20. 20. Método in vitro para diagnosticar cánceres que expresan o sobreexpresan FGFR4 seleccionados de carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon y osteosarcoma, comprendiendo el método poner en contacto una muestra con un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, un conjugado según la reivindicación 9 o una proteína de fusión según la reivindicación 10, detectar la presencia de FGFR4, y comparar el resultado obtenido con datos de referencia sobre la cantidad y/o ubicación de FGFR4 en el mismo tipo de muestra obtenida a partir de uno o más sujetos sanos y/o a partir de uno o más sujetos con un estado patológico conocido.
21. 21. Kit que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, un conjugado según la reivindicación 9, una proteína de fusión según la reivindicación 10, una molécula de ácido nucleico según la ^{reivindicación} 11 ^{o un vector según la reivindicación} 12^{, y un agente antineoplásico adicional.}