CN111683680A - 抗rspo3抗体 - Google Patents

抗rspo3抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN111683680A
CN111683680A CN201880079067.5A CN201880079067A CN111683680A CN 111683680 A CN111683680 A CN 111683680A CN 201880079067 A CN201880079067 A CN 201880079067A CN 111683680 A CN111683680 A CN 111683680A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cancer
seq
rspo3
rspo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880079067.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111683680B (zh
Inventor
徐祖安
洪慧贞
张腾元
石全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Health
Original Assignee
Institute Of Health
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Health filed Critical Institute Of Health
Publication of CN111683680A publication Critical patent/CN111683680A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111683680B publication Critical patent/CN111683680B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

一种分离的抗体，包含：重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，该重链可变区序列系选自SEQ ID NOs：2、6、10和14；以及轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，该轻链可变区序列系选自SEQ ID NOs：4、8、12和16；其中，该抗体与RSPO3蛋白特异性地结合。

Description

抗RSPO3抗体
【技术领域】
本申请案主张2018年12月7日于美国智慧财产局提出之临时申请案第62/595,845号案之优先权，该等申请案之整体内容系合并于此参考。
【先前技术】
R-脊椎蛋白(R-spondin，RSPO)分泌蛋白有RSPO1、2、3和4四类，该蛋白家族包含血小板反应素I型重复区(thrombospondin type 1 repeat，TSR-1)之结构域(domain)，参见Jin and Yoon(2012)，The international journal of biochemistry&cell biology(44)：2278-2287。人类的RSPO蛋白家族成员具有40％-60％的胺基酸序列相似性，分别由234至272个胺基酸组成，包含：(i)N端疏水性讯息胜肽，用于促进RSPO的分泌；(ii)两个富含半胱胺酸的furin-like结构域(furin-like cysteine-rich domain，FU-CRD)；(iii)血小板反应素I(TSR-1)结构域；以及(iv)C端区域具有带正电荷残基且富含碱性胺基酸结构域。其中，FU-CRD对于RSPO促进Wnt/β-catenin讯息传递(Wnt/β-catenin-dependentsignaling)具有调节功能，参见de Lau et al.(2012).Genome biology(13)：242；及Kimet al.(2008).Molecular biology of the cell(19)：2588-2596。而TSR-1结构域则在Frizzled(Fz)/平面细胞极化(planar cell polarity，PCP)讯息传递调控中，扮演了稳定结构机转之角色。
RSPO在脊椎动物发育和干细胞生长中具有多效功能。一些研究证实RSPO可增强Wnt途径的讯息传递，以活化β-catenin蛋白与Wnt配体，目前有两个机制模型说明，参见Jinand Yoon(2012)；de Lau et al(2014).Genes&development(28)：305-316；Kontermann，R.E.(2012).Archives of biochemistry and biophysics(526)：194-205。其中一个模型提出RSPO系直接结合到LRP5/6和LGR4/5/6受体作为活化配体，在受体上和Wnt与FZD一起活化癌细胞中Wnt/β-catenin蛋白讯息传递，参见Wang et al.(2013)Genes&development(27)：1339-1344。或者，RSPO还可透过干扰DKK1介导的LRP6和Kremen结合，以拮抗DKK1介导的胞吞作用。在另一个模型中，RSPO结合至ZNFR3以及其同源物RNF43作为负回馈调节剂，以加速在细胞表面的FZD和LRP6受体的转换率，参见Jin和Yoon(2012)。
WNT讯息传递涉及调控细胞增殖、分化、迁移以及生存，参见Niehrs(2012).Naturereviews.Molecular cell biology(13)：767-779。因此，研究WNT讯息传递途径以做为治疗癌症的可能目标，参见Madan和Virshup(2015).Molecular cancer therapeutics(14)：1087-1094。人类遗传学研究和基因标靶法证实，RSPO具有成为经典和非经典WNT调节剂的能力。MacDonald等人(2009).Developmental cell(17)：9-26。RSPO3基因融合造成FZD和LRP5/6细胞表面结合，进而活化WNT讯息传递，参见Madan et al.(2015).Oncogene(35)：2197-2207。于某些难以治疗的癌症患者中，证实其具有RSPO融合基因，参见Madan et al.(2015)。举例而言，在5-10％的结肠癌中可发现蛋白质酪胺酸磷酸酶受体K型(proteintyrosine phosphatase receptor type K)与RSPO3融合而形成(PTPRK)-RSPO3，参见Seshagiri et al(2012).Nature(488)：660-664。在10％的APC野生型结肠癌和1-11％的卵巢癌、食道癌、肺癌和头颈癌中发现了活化的WNT讯息传递，参见Seshagiri et al.(2012)。在324个NSCLC患者中，大约有1～2％被诊断出具有EIF3E(e1)-RSPO2(e1)、及PTPRK(e1)-RSPO3(e2)、及PTPRK(e7)-RSPO3(e2)，参见Browning et al(2001).Trends inbiochemical sciences(26)：284；Parker and Zhang(2013).Chinese journal of cancer(32)：594-603。最近有两篇研究报告证实，RSPO3抗体对于具有RSPO3-融合基因或RSPO3-诱发下游β-catenin蛋白过度表现之讯息传递的癌症具有拮抗活性，参见Storm et al(2016).Nature(529)：97-100；Chartier et al.(2016).Cancer research(76)：713-723。因此，经由增强的RSPO-Wnt讯息传递会驱动部分癌症。相关文献指出RSPO3抗体对于包含结肠癌、肺癌和卵巢癌的多种癌症的抗癌治疗具有显著的成效。
【发明内容】
在一态样中，本发明揭露一种分离的抗体。该分离的抗体包含：源自重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区序列系选自SEQ ID NO：2、6、10和14；以及源自轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区序列系选自SEQID NO：4、8、12和16；其中，该抗体与RSPO3蛋白特异性地结合。
在一些实施例中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系源自SEQ ID NO：2，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系源自SEQ ID NO：4。
在一些实施例中，该抗体包含与SEQ ID NO：2序列至少80％相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：4序列至少80％相同之一轻链可变区。
在一些实施例中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系源自SEQ ID NO：6，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系源自SEQ ID NO：8。该抗体可包含与SEQ ID NO：6序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：8序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同之一轻链可变区。
在一些实施例中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：10，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：12。该抗体可包含与SEQ ID NO：10序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：12序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同之一轻链可变区。
在一些实施例中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系源自SEQ ID NO：14，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系源自SEQ ID NO：16。该抗体可包含与SEQ ID NO：14序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：16序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同之一轻链可变区。
本说明书所述之抗体可与RSPO3蛋白中的构形决定或线性表位结合。该抗体可为一IgG抗体、含有一Fc区的一抗体、一Fab片段、一Fab′片段、一F(ab′)2片段、一单链抗体、一单链可变区片段多聚体(scFv multimer)、一单价抗体、一多价抗体、或一嵌合抗体。
在一些实施例中，抗体是人源化的。在一些实施例中，该抗体与另一分子(例如，一小分子药物、一细胞标靶部分、一细胞毒性剂、一免疫调节剂、一多肽、一核酸分子、一可检测标记或一聚合物)共轭(conjugate)以产生免疫复合物。
本文还描述了一种分离的核酸分子，包含编码本文所揭露之任何抗体之一核酸序列。
在另一态样中，本文提供一种宿主细胞，含有该分离的核酸。
在一态样中，揭露了一种组成物，其含有本文所述之抗体。该组成物可更包含一医药可接受之载体及/或另一治疗剂(例如，另一种癌症药物、细胞毒性剂或免疫调节剂)。
透过使细胞与一有效量的如本文所述之任何抗体接触，本文所述之任何抗体可用于抑制细胞中的RSPO3或Wnt讯息传递。
透过使细胞与一有效量的该抗体接触，该抗体也可被用于抑制癌细胞生长或癌细胞转移。
在另一态样中，本文记载了一种治疗一主体的癌症的方法，包括向主体施用一有效剂量的如本文所揭露之任何抗体。
在一些实施例中，该癌症系RSPO3阳性癌症、RSPO3-融合阳性癌症、具有腺瘤性结肠瘜肉(APC)突变的癌症、具有β-catenin蛋白突变的癌症或具有WNT讯息传递过度活化的癌症。在一些实施例中，该方法还包括在向主体施用抗体之前，确定主体之癌症是否具有上述突变或畸变之一。该癌症可为结肠癌、白血病、结肠直肠癌、卵巢癌、胰脏癌、肺癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、摄护腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、神经胶母细胞瘤或头颈癌。在一些实施例中，该方法更包含向该主体施用另一治疗剂。
本文还提供了一种在一样本中检测RSPO3蛋白或其片段之方法。该方法包含使该样本与本文所述之任何抗体接触；以及测定该抗体和一RSPO3蛋白或其片段之间的特异性结合。在一些实施例中，该RSPO3蛋白系人类RSPO3。
本文描述了一种辨别与一RSPO3蛋白特异性地结合之一抗体变体的方法。该方法包含在本文所述之任何抗体之一或多个互补决定区中引入一或多个修饰以产生一抗体变体；以及辨别与一RSPO3蛋白特异性结合之一抗体变体。
在附图和以下描述中记载了一或多个实施例的细节。根据说明书和图式以及申请专利范围，可轻易得知实施例的其他特征、目的和优点。
【图式简单说明】
图1是使用RSPO3融合瘤B1作为用于筛选单一细胞株模型的示意图和图片。(A)示意图为单一殖株选择过程；(B)透过有限稀释和放大测定单一殖株；(C)转移殖株并且评估Ab表现；以及(D)在T25-cm2组织培养瓶中放大具高Ab表现量的细胞。
图2为抗RSPO3融合瘤抗体反应性的西方墨点法组图。这些融合瘤抗体与RSP01-4抗原免疫墨点法反应，图中标示了标准液的分子量。(A)A1、A2、A4、A5、A6和A9殖株；(B)B1、B3、B4、B8和B9殖株。
图3为以ELISA测量抗RSPO3融合瘤抗体反应性的图表。这些融合瘤抗体与RSPO1-4抗原免疫墨点法反应，其反映RSPO3抗原。(A)A1、A2、A4、A5、A6和A9殖株；(B)B1、B3、B4、B8和B9殖株。
图4为抑制β-catenin活性的RSPO3 Ab标靶典型WNT讯息传递途径和体外测试的图表。(A)A1、A2、A4、A5、A6和A9殖株；(B)B1、B3、B4、B8和B9殖株；(C)增加A4和A6殖株的剂量依存反应对于RSPO-WNT讯息传递的影响。在20μg/mL抗RSPO3抗体殖株A1、A2、A4、A5、A6、A9或131R002的存在下，将MDA-MB436 TCF/LEF-Luc细胞与Wnt3a(20ng/mL)和RSPO3(50ng/mL)之组合物一起培养。作为对照组，将细胞与Wnt3a和RSPO3之组合物、只有Wnt3a、只有RSPO3或不添加一起培养。将细胞培养16小时后，以One-Glo Luciferase Assay System进行荧光素酶活性测定。
图5是hRSPO3和mRSPO3的胺基酸序列的比对。
图6是抗RSPO3抗体抑制Wnt3a和RSPO3合并处理诱发WNT下游报导基因荧光素酶活性的图表。(A)hB1或131R010对由Wnt3a和人类RSPO3(h)或老鼠RSPO3(m)刺激的RSPO-Wnt讯息传递的剂量相关性抑制；(B)MDA-MB436 TCF/LEF-Luc细胞在20ug/mL抗RSPO3抗体殖株hB1或131R010的存在下，与Wnt3a(20ng/mL)和hRSPO3(50ng/mL)组合物一起培养。将细胞培养16小时后，以One-Glo Luciferase Assay System进行进行荧光素酶活性测定。
图7是使用Biacore测量α-RSPO3抗体-抗原相互作用的结合动力学的图表。使用Biacore T200产生结合感测图谱，然后将搜集数值拟合至简单的1∶1相互作用模型。将一系列浓度的hB1(0.39-6.25nM)以单次循环注入，不同浓度注射之间表面无需进行再生。监测该结合2分钟，最终解离时间为15分钟。将hRSPO3以27.5RU固定在CM5芯片上。
图8是透过Pep-set定位RSPO3蛋白上的α-RSPO3 Ab表位的图表。这些柱形图代表每10-mer寡肽与RSPO3 Ab 131R010(A)、131R002(B)和融合瘤A6(C)结合的能力，如图中所示。QNASRGRRQR(SEQ ID NO：74)；ASRGRRQRRM(SEQ ID NO：75)；RGRRQRRMHP(SEQ ID NO：76)；RRQRRMHPNV(SEQ ID NO：77)；CLSCKPRLFF(SEQ ID NO：78)；SCKPRLFFAL(SEQ ID NO：79)；ERGKKGRERK(SEQ ID NO：80)；GKKGRERKRK(SEQ ID NO：81)；KGRERKRKKP(SEQ ID NO：82)；RERKRKKPNK(SEQ ID NO：83)；RENKQQQKKR(SEQ ID NO：84)。
图9是研究多种α-RSPO3抗体表位的示意图和图表。(A)将不同RSPO3片段涂覆在ELISA盘上，接着添加生物素标签化的hB1(一种α-RSPO3抗体)到每一孔中。接着加入链霉亲和素-HRP以侦测结合的生物素抗体。(B)将生物素的环肽(1μg/ml)和生物素化的重组人类RSPO3(100ng/ml)添加于NeutrAvidin预涂覆的孔盘中。为了检测不同环肽和hB1之间的结合，接着将2μg/ml的hB1加到孔盘中的每一个孔中。为了检测结合的抗RSPO3抗体，接着将山羊抗人类IgG-Fc-HPR抗体(Chemicon)添加于孔盘。
图10是不同的α-RSPO3抗体对RSPO3与LGR5或RNF43的竞争性结合的图表。将重组hRSPO3涂覆在孔盘上以检测是否不同的α-RSPO3抗体可跟RSPO3与LGR5或RNF43的结合竞争。(A)将重组LGR5(22-560)-Fc与生物素复合(Biotinylation)以利检测。然后分别将生物素复合化的LGR5与不同浓度的α-RSPO3抗体或同型对照Ab混合且添加到RSPO3涂覆的孔中。然后加入链霉亲和素-HRP以检测结合的生物素化LGR5；(B)将重组His标记的RNF43和不同的α-RSPO3抗体的混合物分别加到每个RSPO3涂覆的孔中，然后加入小鼠抗His标记抗体-HRP以检测结合的RNF43。以1XPBST洗涤孔盘去除多余的侦测抗体后，将TMB溶液加到每孔中10分钟。然后使用2N HCL终止呈色反应，马上测量每孔在450nm的光学密度。
图11为不同α-RSPO3抗体于DLD-1细胞迁徙模型中影响的图表。直方图计算细胞迁徙至闭合百分比。
图12为抗RSPO3单株抗体特异性抑制体内结肠直肠癌PDX模型CR3150肿瘤生长图表。每周用hB1、131R010或对照剂(PBS)治疗小鼠两次，持续4.5周。在治疗的第5天，在第二次给药后24小时牺牲对照组和hB1组的3只小鼠，以收集肿瘤。自该时间点，从第5天至第58天，对照组、hB1或131R010组分别剩下5、3和3只小鼠。数据以平均值±SEM表示。由于肿瘤体积达到人道终点，分别在第39天和第46天将对照组中的一只小鼠和未处理组中的一只小鼠进行安乐死，而研究结束时的最终肿瘤体积数值仍列入计算。
图13为评估CR3150PDX模型中hB1的分子反应图表。在第2次给药后2天内或是在最后一次给药后29天，利用Q-PCR分析肠道干细胞标志(Axin2和LGR5)、下游标志(TCF7)、癌症干细胞标志(CD133和CD44)和分化标志(CEACAM7和KRT20)的表现。
图14为评估hB1于RSPOhighNCI-H2030肺癌CDX模型中的功效图表。每周用25mg/kg的hB1或131R010或对照组治疗小鼠一次，持续4周。在治疗的第28天，在第5次给药后24小时，将对照组、131R010和hB1的7只小鼠牺牲以收集肿瘤。数据以平均值±SEM表示。在治疗的第51天，将卡铂(Carboplatin)、hB1、131R010及其与卡铂组合之组别的7只小鼠牺牲以收集肿瘤。数据以平均值±SEM表示。
图15为带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人类SNU-1411结肠异种移植肿瘤的抗肿瘤功效的图表。将肿瘤细胞注射到小鼠中，当肿瘤达到200mm3时开始治疗。每隔一周给予抗体(25mg/kg)一次(Q2W)，且每周给予紫杉醇(20mg/kg)一次(Q1W)。抗体和卡铂(Carboplatin)均透过静脉注射给药。从第1天至第32天给予紫杉醇，从第1天至第46天给予组合用药组。透过静脉注射给予抗体和紫杉醇。对于每个治疗周期，在第1天给予抗体，在第3天给予紫杉醇。在指定的天数进行肿瘤和体重测量。平均值±SEM。*：两者皆进行单因子变异数分析检定后进行Tukey’s试后比较检定，p＜0.05vs.对照mAb。
图16是RSPO3在胰脏癌组织中表现的图表。以抗RSPO3mAb hB1对由80个患者样本所组成的胰脏癌组织微数组进行染色。透过3DHISTECH的数字玻片扫描仪扫描了整个切片的图像。该图展示了在癌组织数组和正常组织数组中表现RSPO3的病例的百分比。
图17是RSPO3在肺癌组织中表现的图表。以抗RSPO3 mAb hB1对由50个患者样本组成的肺癌组织微数组进行染色。透过3DHISTECH的数字玻片扫描仪扫描了整个切片的图像。该图展示了在癌组织数组和正常组织数组中表现RSPO3的病例的百分比。
图18是RSPO3在乳癌组织中表现的图表。以抗RSPO3 mAb hB1对由75个患者样本组成的肺癌组织微数组进行染色。透过3DHISTECH的数字玻片扫描仪扫描了整个切片的图像。该图展示了在侵袭性乳管癌组织数组中表现RSPO3的病例的百分比。
图19是RSPO3在结肠癌组织中表现的图表。以抗RSPO3 mAb hB1对由64个患者样本组成的结肠癌组织微数组进行染色。透过3DHISTECH的数字玻片扫描仪扫描了整个切片的图像。该图展示了在结肠直肠癌组织数组中表现RSPO3的病例的百分比。
【实施方式】
本文描述了新颖抗RSPO3抗体。特别的是此人源化抗体hB1在体内及体外对于具有RSPO3-融合基因或RSPO3过度表现的癌症均展现了抗癌功效。下列数据表示：(1)hB1对于RSPO3的结合亲合力达到pM范围内；(2)在β-catenin蛋白TCF/LEF-Luc报导系统中，hB1和rosmantuzumab抗体展现相同的中和效力；(3)hB1和rosmantuzumab在CR3150结肠直肠癌PDX模型中展现相同的抗癌功效；(4)hB1在NCI-H2030和SNU-1411癌症异种移植模型中展现抗癌功效；(5)hB1可用于测定样本中RSPO3的含量；以及(6)hB1和rosmantuzumab与不同的表位(epitope)结合。
下表列出抗体A4、A6、B1和hB1的重链和轻链可变区的序列。透过4种不同方法(IMGT、Chothia、KABAT和Honegger)所预测的互补决定区(CDR)也列在表中。
抗体A4
Figure GDA0002574794970000111
Figure GDA0002574794970000121
粗体文字：互补决定区
抗体A6
Figure GDA0002574794970000122
Figure GDA0002574794970000131
粗体文字：互补决定区
抗体B1
Figure GDA0002574794970000132
Figure GDA0002574794970000141
粗体文字：互补决定区
抗体hB1
Figure GDA0002574794970000151
Figure GDA0002574794970000161
粗体文字：互补决定区
本文揭露了一种抗RSPO3抗体，包含：源自重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区序列系选自SEQ ID NOs：2、6、10和14；以及源自轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区序列系选自SEQ ID NOs：4、8、12和16。在各区中的三个CDR如上所示。本领域具有通常知识者可利用本领域中所习知的各种方法辨别CDR。
该抗体可与RSPO3特异性地结合，即比其他非RSPO3蛋白具有更高的RSPO3结合亲和力，且可破坏RSPO3与其配体间的相互作用。该抗体可结合的RSPO3蛋白包括人类RSPO3(例如，GenBank登录号NP_116173)、小鼠RSPO3或其他哺乳动物同源物。在一些实施例中，该抗体与抗体A4、A6、B1或hB1结合相同的表位。
本文所用之术语「抗体」包括具有抗原结合活性的各种抗体结构，包括但不限于：单株抗体、多株抗体、全长抗体或其片段、含有Fc区的抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2片段、单链抗体、单链可变区片段多聚体(scFv multimer)、单价抗体、多价抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
本文所揭露的抗体序列及其CDR，本领域具有通常知识者可利用本文所述之方法或本领域习知之方法，例如重组方法，以各种形式产生一抗RSPO3抗体。
本文亦揭露一种分离的核酸分子(例如，表现载体)，其包括编码本文所述的抗RSPO3抗体或其成分的核酸序列。举例而言，核酸序列可编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16，或是含有一或多个来自这些序列的CDR的一多肽。本文亦提供一种宿主细胞，其含有该核酸分子。该核酸分子和宿主细胞可用来产生该抗RSPO3抗体。
任何本文所述抗体可用于抑制RSPO3与其配体间的结合、抑制RSPO3功能、检测样本中的RSPO3蛋白或其片段(例如，在免疫测定中)、结合表现RSPO3的组织或细胞(例如，用于辨别一细胞或是分离一RSPO3表现细胞)、抑制癌症细胞的生长或转移、治疗患者的癌症或是产生抗RSPO3抗体变体。
术语「样本」可指涉任何生物样本，例如体液样本、血液样本、细胞样本、尿液样本、唾液样本或组织样本。
可将本文所述的任何抗RSPO3抗体配制成适合于各种给药途径的医药组成物，例如静脉内、关节内、结膜、颅内、腹膜内、胸膜内、肌肉内、脊髓或皮下给药途径。药物组成物可为水溶液或冷冻干燥制剂。其可含有医药可接受之载体，例如缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。医药组成物可包括其他与抗RSPO3抗体一起作用的活性成分，例如其他治疗剂。医药组成物可用于治疗主体中的癌症或肿瘤。
抗RSPO3抗体还可与另一分子或部分共轭，例如蛋白质或胜肽、药物(例如细胞毒性药物)、可侦测之标记(例如荧光标记)或是固体支撑(例如珠或盘)。这些抗体复合物可用于各种目的，例如治疗癌症或侦测样本中的RSPO3。
任何一种抗RSPO3抗体均可用于治疗癌症或肿瘤，包括但不限于：结肠癌、白血病、结肠直肠癌、卵巢癌、胰脏癌、肺癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、摄护腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、神经胶母细胞瘤和头颈癌。治疗可单独进行或是与其他药物或疗法一起进行。在一些实施例中，与对照组(例如另一种癌症、正常组织或是正常细胞)相比，该癌症或肿瘤具有较高的RSPO3表现量，或携带RSPO-融合基因或RSPO3异位。在一些实施例中，该癌症或肿瘤具有adenomatous polyposis coli(APC)突变、β-catenin突变或WNT讯息传递的过度活化。选择性地，在向主体施用抗RSPO3抗体之前，可使用本领域习知的方法，以确定在主体中该癌症或肿瘤是否出现较高的RSPO3表现量、或具有RSPO-融合基因或RSPO3异位、APC突变、β-catenin突变或过度活化的WNT讯息传递。
「主体」系指人类或非人类动物。「治疗」或「治疗方法」是指向患有疾病的主体施用化合物或组成物，其目的是治愈、缓解、减轻、补救、推迟疾病的发作或改善失调、失调的症状、失调之后的疾病状态或是对失调的倾向。「有效量」是指能够在治疗的主体中产生医学上期望结果的化合物或组成物的量。
本文所述之抗RSPO3抗体可被修饰以产生具有所需特性的抗RSPO3抗体，例如改善稳定度、结合特异性、或体内功效。可藉由引入一或多个修饰到编码抗体的核酸序列中或是藉由胜肽合成以制备抗体变体。可将修饰引入至一或多个CDR中，或是引入至CDR外部的位点。修饰可举例包括：缺失、插入及/或取代。可使用本领域习知技术制造抗体变体。可将修饰随机引入或于特定位点引入。丙胺酸扫描式突变技术可用于辨别可修饰的残基而不破坏抗体的抗原结合活性和特异性。
以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本发明的其余部分。无需进一步详细说明，本领域具有通常知识者可根据本文之叙述，充分利用本发明。本文引用的所有出版物均透过引用完整并入本文。
实施例1：材料及方法
1.细胞株
除了ExpiCHO-S细胞是来自Thermo Fisher Scientific以外，细胞株是构自ATCC。DLD-1和NCI-H2030细胞株生长在含有10％FBS的RPMI中，293T细胞株是生长在含有10％FBS的DMEM中，而ExpiCHO-S是生长在ExpiCHOTM表现培养基(Thermo)中。从韩国细胞库取得人类SNU-1411结肠肿瘤细胞，并培养在有10％FBS(v/v)及青霉素(100U/ml)/链霉素(100μg/ml)的RPMI培养基中。将培养物置于37℃、5％CO2/95％空气的潮湿培养箱中。
2.报导基因试验
WNT讯号传递会造成β-catenin蛋白/TCF依赖性转录反应。MDA-MB436-TCF/LEF-Luc细胞由Kelvin Kun-Chih Tsai博士提供，其系用于监测WNT讯号转递途径的活性。请见，例如，Wang等人(2013).Gastroenterology(145)：1110-1120。将MDA-MB436-TCF/LEF-Luc细胞种在含有10％FBS的RSPO培养基的黑色平底96孔盘(Costar)中，并在37℃、5％CO2下培养过夜。在培养24小时后，用抗RSPO3抗体、20ng/ml Wnt3a(R&D system)和RSPO配体(Peprotech Systems)处理细胞，并且进一步适当地培养16小时。使用Bright-Glo荧光素酶分析(Promega)以测量荧光素酶活性。
3.融合瘤的生成和RSPO3抗体的纯化
对RSPO3的小鼠单株抗体是由LTK BioLaboratories(Taiwan)所生产。使用约0.5-1.5mg的RSPO3于小鼠中以进行免疫作用。接着使用融合免疫脾脏细胞和骨髓瘤细胞来产生融合瘤细胞，并且分离11个融合瘤细胞殖株。将融合瘤培养在含有IMDM(GIBCO)和去活化的20％FBS的96孔盘中。然后，使用如下所述之标准ELISA和西方墨点法以挑选阳性细胞殖株，以筛选对RSPO3有结合能力的细胞上清液。将来自阳性殖株的细胞次选殖到96孔盘中，提取单一殖株并且逐渐适应在含有去活化20％FBS的无血清培养基(SFM，HyClone)中生长。请见图1。透过腹膜内注射将融合瘤细胞注射到小鼠的体内，以诱发腹水性肿瘤的生成并产生腹水。根据标准步骤将腹水加到蛋白A-Sepharose上。纯化的RSPO3抗体以不具氮化物的PBS进行透析。
4.从融合瘤中定序和转殖RSPO3抗体
为了确定融合瘤中IgG重链和轻链的cDNA序列，从融合瘤细胞中分离总RNA，并使用随机六聚体以反转录酶制备cDNA。将小鼠Ig-引子套组(Novagen，69831-3)和Ig-引子混合物(列于表1)用于PCR放大反应，以进行可变区测定。将PCR产物转殖到pJET1.2/blunt转殖载体(CloneJET PCR cloning Kit，Thermo)中以进行DNA序列分析。以上揭露了RSPO3抗体相应的基因编码及编码胺基酸序列。
表1.用于RSPO3抗体可变区转殖的引子组
Figure GDA0002574794970000201
Figure GDA0002574794970000211
R＝A或G；Y＝C或T；M＝A或C；K＝G或T；S＝C或G；W＝A或T；H＝A或C或T；B＝C或G或T；V＝A或C或G；D＝A或G或T。
5.来自ExpiCHO-S细胞的B1、hB1和参照抗体131R010的建构、表现和纯化
自融合瘤产生之抗体VH及VL区的cDNA序列系由GeneDireX，Inc合成。分别在pFUSEss-CHIg-hG1e1和pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen)的重链及轻链的恒定区(CH和CL)之前引入合成的可变区。对于pFUSEss-CHIg-hG1e1转殖，以EcoRI和Nhe I切割位点在hIL2讯号序列下，插入重链可变区以使胺基酸序列得以完整表达(in frame)。分别透过EcoRI和BsiWI将轻链可变区插入pFUSE2ss-CLIg-hk。为了将pcDNA3.4(Invitogen)作为抗体表现载体，使用hIgHG-F/hIgHG-R和CLIg-F/CLIg-R引子，放大来自先前建构的pFUSEss质体的重链及轻链的全长抗体，然后进行如标准步骤所述之TA TOPO转殖(Thermo)。
hIgHG-F；
5‘-CATGCCTAGGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3’(SEQ ID NO：52)
hIgHG-R：5’-GGGTTTCATATGTCATTTACCCGGAGACAGG-3’(SEQ ID NO：53)
CLIg-F：5’-GGAAGATATCCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3’(SEQ ID NO：54)
CLIg-R：5’-CCTTAATTAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’(SEQ ID NO：55)
对于重组抗体的产生，则将编码重链和轻链(例如pcDNA3.4-hB1H和pcDNA3.4-hB1L)的重组质体pcDNA3.4以2∶3的比例转染至ExpiCHO-STM细胞，在8-10天后依标准步骤收取ExpiCHOTM表现培养基。使用Mabselect SuReTM XL(GE Healthcare)亲和性管柱层析法，纯化上清液以得到抗体。
6.融合瘤抗体对于RSPO3-结合的反应性
为了评估抗体的RSPO-结合能力，纯化的抗体与RSPO1、2、3和4反应，进行免疫墨点法。以抓取缓冲液配制重组RSPO3(2μg/ml)，涂覆于96孔高结合聚苯乙烯盘(Corning)后，在4℃下放置过夜。再以含有0.05％Tween 20的PBS(即PBST)洗涤两次经涂覆的孔盘。在室温下，于该孔盘中加入PBST-10％BSA阻断剂，进行ELISA标准步骤测定1小时。
7.抗体亚类区别
关于抗体亚型分类，以上面所述之RSPO3涂覆微量滴定板，然后根据厂商的说明书，使用Zymed Laboratories的Mouse MonoAb ID Kit(HRP)进行测定。
8.抗体工程：抗体人源化
为了制造人源化和全功能的RSPO3抗体，在本研究中使用了抗体人源化技术，此服务由工业技术研究所(ITRI)(新竹，台湾)所提供。具有理想胺基酸序列的人源化抗体如上所示。然而，抗体表面重塑方法通常在亲和性和稳定性会出现些微变化。参见Roguska etal.(1996).Protein Eng(9)：895-904；Roguska et al.(1994).Proc Natl Acad Sci USA(91)：969-973。
9.RSPO3抗体的结合筛选
如ForteBio的手册中所述，以生物素化的RSPO3(10μg/ml)包覆streptavidin-coated的传感器。抗体浓度在0.75至93.8nM范围之间，以调过pH值、含0.5％BSA之PBS进行定量动力学结合分析。所有步骤均在30℃下，以1000rpm的连续摇动速度进行。
10.RSPO3抗体的结合试验
在25℃下，使用装有CM5Series S Sensor Chip(GE Healthcare)的Biacore T200生物传感器，进行α-RSPO3抗体与重组人类RSPO3蛋白(hRSPO3)之间的结合动力学。使用pH7.4的HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P20)。将hRSPO3蛋白固定在CM5传感器芯片上，涂层密度为约27.5反应单位(RU)。在HBS-EP中将α-RSPO3抗体从6.25nM以2倍连续稀释至0.39nM，并以30μL/min的流速在芯片表面上注射120秒，最后进行900秒的解离。分别扣除从对照表面所得之讯号，以及从作用缓冲液所得之讯号，以校正获得的感测图谱。用BIAcore T200评估软件3.0、1∶1结合模型，拟合感测图谱(Fitted Curves)，以产生α-RSPO3抗体的亲和常数(KD值)。此外，使用所制备的α-RSPO3抗体连续稀释液和涂有huRSPO3的芯片表面，分开进行重复测量。
11.PepSet ELISA测定抗体结合表位
利用PepSet序列数据库，进行测定α-RSPO3 hB1抗体和RSPO3结合表位之ELISA分析。推测的RSPO3胺基酸序列(GenBank存取号NP_116173)系作为对照序列，以设计涵盖RSPO3成熟结构域之带有生物素化线型序列胜肽之PepSet数据库。该数据库由Mimotopes(Victoria，Australia)合成，长度以10个胺基酸为一个单位，总长度为121个胜肽，其中每条以两个胺基酸残基偏移；N端胜肽为Biotin-SGSG-PEPTIDE-NH2而C端胜肽为Biotin-SGSG-PEPTIDE-OH。将胜肽(1-3mg)溶于200微升的80/20DMSO/水混合物中，并在含有0.1％BSA和0.1％迭氮化钠的PBS中，以1∶200的比例进一步稀释作为反应溶液。为了在孔盘中的每个孔上附着不同的生物素化胜肽，使用了涂有NeutrAvidin孔盘(Thermo ScientificPierce，Rockford，1L)。用含有0.1％Tween 20的1X PBS洗涤孔盘三次，然后将100ml生物素化的胜肽溶液添加到孔盘的每个孔中。在室温下培养1小时后，再次使用1X PBST洗涤孔盘三次。然后将10μg/ml的α-RSPO3抗体加到孔盘的每个孔中，并将孔盘摇晃1小时。再次洗涤孔盘三次以除去未与胜肽结合的抗体。为了检测结合的抗RSPO3抗体，接着将山羊抗人类IgG-Fc-HPR添加于孔盘1小时。用1X PBST洗涤孔盘去除多余的检测抗体后，于每孔加入100μl四甲基联苯胺(TMB)溶液20分钟。使用2NHCl终止呈色反应后，立即测定每孔450nm的光学密度。
12.利用具有链间双硫键的合成环肽测定抗体结合表位
为了在孔盘上附着不同的生物素化胜肽或蛋白质，将生物素化的环肽(1μg/ml)和生物素化的重组人类RSPO3(100ng/ml)添加于预先涂覆NeutrAvidin的孔盘(ThermoScientific Pierce)中。首先，用0.1M DTT处理环肽以产生还原态的胜肽。为了检查hB1和不同环肽之间的结合，在每孔中加入2μg/ml的hB1。在培养和洗涤后，将山羊抗人类IgG-Fc-HPR(Chemicon)添加到孔盘中。用1X PBST洗涤孔盘除去多余的检测抗体后，在每孔中加入100μl的四甲基联苯胺(TMB)溶液10分钟。使用2N HCl终止呈色反应后，立刻测定每孔在450nm的光学密度。
13.抗体/受体/配体结合的竞争性ELISA
为了检测不同的α-RSPO3抗体是否会与LGR5或RNF43竞争对RSPO3的结合，将500ng/ml的重组人类RSPO3(Peprotech)涂覆在孔盘上。将重组LGR5(22-560)-Fc(R&D)与生物素共轭，然后分别将生物素化的LGR5(30ng/ml)与不同浓度的α-RSPO3抗体或同型对照抗体混合，并添加到涂有RSPO3的孔中。然后加入抗链霉亲和素-HR抗体以检测结合的生物素化LGR5。将500ng/ml的重组人类RSPO3(Peprotech)涂覆于孔盘上。
为了检测不同的α-RSPO3抗体是否可能与RSPO3对于RNF43的结合竞争，分别在每孔中加入200ng/ml的重组Hig-标记的RNF43(RNF43-His16108-H08H，Sino Biological)，及20μg/ml的不同α-RSPO3抗体的混合物。然后加入小鼠抗His标记抗体-HRP(BioLegend)，以检测RNF43-His的结合。在培养后，用1X PBST洗涤孔盘以除去多余的检测抗体，再加入100μl的四甲基联苯胺(TMB)溶液到每孔中。使用2N HCl终止呈色反应后，立刻测定每孔在450nm的光学密度。
14.α-RSPO3抗体对人类结肠直肠腺癌DLD1细胞迁徙能力的影响
将每孔40000个DLD-1细胞种入具有含有10％FBS的RPMI培养基的Culture-Insert2 Well(ibidi，Martinsried，Germany)中16小时。移除培养小室后，在低血清(0.5％)培养基及20ng/ml Wnt3a与50ng/ml RSPO3，于控制组中加入人类IgG1抗体(100μg/ml)或实验组中加入抗RSPO3抗体(100μg/ml)。然后将样本置于活细胞图像延时显微镜系统(LeicaAF6000 LX)中，以观察DLD-1细胞的迁移。在一开始的时候选择每孔在10X物镜下的三个位置，并且透过Zyla 4.2 sCMOS相机，在每30分钟获取这些位置的相位图，追踪60个小时。
15.评估hB1在CR3150 RSPOhigh PDX模型中的功效
为了评估临床前的体内功效，在研究中使用源自结肠直肠癌患者的异种移植物(PDX)模型CR3150，系由Crown Bioscience Inc.(Taicang，China)提供服务。雌BALB/c裸鼠在右侧皮下接种一原发性CR3150肿瘤片段(直径2-3mm)。当平均肿瘤大小到达约190mm3时，将带肿瘤的小鼠随机分组，且每周腹腔注射25mg/kg的待测物或载体(PBS)两次，持续4.5周。每周用卡尺量肿瘤体积两次且用公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(TV)＝0.5×a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。当动物的肿瘤大小达到人道终点时进行牺牲，并且研究结束时的最终肿瘤体积数值也列入计算。
肿瘤体积的统计分析包含平均值和标准偏差。由于这两种治疗方案是独立的，为了进行每种治疗与对照组之间的比较，进行独立样本t检定。使用SPSS 18.0分析所有数据，P＜0.05则具有统计学意义。
16.评估CR3150 PDX模型中hB1引发分子反应
用Q-PCR分析RSPO3融和PDX膜型的肿瘤细胞。用TRIzol试剂(Invitrogen，#15596-018)萃取RNA，并利用M-MLV RT、RNase H Minus(Promega，#M3682)合成cDNA。使用实时定量RT-PCR(KAPA SYBR FAST qPCR Kit，KAPABIOSYSTEMS，#KK4604)测定经抗体处理之小鼠异种移殖生长的人类肿瘤的基因变化(copy number)。将2μl cDNA添加至18μl PCR混合物中，透过在95℃下进行1分钟的起始步骤开始反应，然后进行40次循环的放大，包括在95℃下2秒和在60℃下30秒。用LightCycler 1.0系统(Roche)进行实时PCR反应和数据分析。以GAPDH作为内源性基因监控以利校正(normalization)。用于PCR分析的引子组列于表2中。
表2.用于Q-PCR分析的引子组
GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO：56)
GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO：57)
LGR5-F TGATGACCATTGCCTACAC(SEQ ID NO：58)
LGR5-R GTAAGGTTTATTAAAGAGGAGAAG(SEQ ID NO：59)
AXIN2-F TCCCCACCTTGAATGAAGAA(SEQ ID NO：60)
AXIN2-R TGGTGGCTGGTGCAAAGA(SEQ ID NO：61)
TCF7-F CACCCGGCCATTGTGC(SEQ ID NO：62)
TCF7-R GCTTTTCCCTCGACCGC(SEQ ID NO：63)
CD133F GCATTGGCATCTTCTATGGTT(SEQ ID NO：64)
CD133-R CGCCTTGTCCTTGGTAGTGT(SEQ ID NO：65)
CD44-F TCCAACACCTCCCAGTATGACA(SEQ ID NO：66)
CD44-R TCTTCAGGATTCGTTCTGTATT(SEQ ID NO：67)
CEACAM7-F GCCAAACAGTGCCCAGACC(SEQ ID NO：68)
CEACAM7-R CTCTCGACCGTTGTGTGCG(SEQ ID NO：69)
KRT20-F ACGCCAGAACAACGAATACC(SEQ ID NO：70)
KRT20-R ACGACCTTGCCATCCACTAC(SEQ ID NO：71)
17.评估hB1在源自RSPOhigh NCI-H2030肺癌细胞的异种移植(CDX)模型中的功效
为了评估临床前体内功效，在研究中使用源自RSPOhigh NCI-H2030肺癌细胞的异种移植(CDX)模型。在雌性裸鼠的右侧皮下接种一NCI-H2030片段(5*106)。当平均肿瘤大小到达约250mm3时，将带肿瘤的小鼠随机分组，且每周静脉注射25mg/kg的待测物、50mg/kg的卡铂(Carboplatin)或空白对照组(同型IgG)，持续4周。每三天(一天给药和休息2天)用卡尺测量肿瘤体积，且用公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(TV)＝0.5×a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。当动物的肿瘤大小达到人道终点时进行牺牲，并且在研究结束时的最终肿瘤体积数值也列入计算。
肿瘤体积的统计分析包含平均值和标准偏差。由于这两种治疗方案是独立的，为了进行每种治疗与对照组之间的比较，执行独立样本。使用Prism的二因子变异数分析(2way ANOVA)多重比较检定分析所有数据。P＜0.05则具有统计学意义。
18.抗RSPO3抗体与卡铂(Carboplatin)合并使用对带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的SNU-1411结肠异种移植肿瘤生长的影响
为了确定抗体对于SNU-1411异种移植肿瘤的影响，将带有肿瘤的动物随机分组，并且当平均肿瘤体积达到约150-200mm3时开始治疗。每隔一周(Q2W)给予抗体一次，且每周给予紫杉醇一次(Q1W)。抗体和紫杉醇皆是透过静脉注射给予。使用电子卡尺每周测量肿瘤生长两次。用公式(LxW2)/2计算肿瘤体积，其中L是肿瘤的最长轴，W是肿瘤的最短轴。每周记录动物体重一次。频繁地检查小鼠任何不良药物相关副作用的明显迹象。在研究结束时，对所有小鼠实施行安乐死。
19.统计分析
数据以平均值±S.EM表示。透过非参数t检定分析组间平均值的差异。使用单因子变异数分析检定(one-way ANOVA test)进行多重比较再进行Tukey’s试后比较检定。p＜0.05的差异则是显著不同的。用于统计分析的软件是GraphPad Prism4(GraphPadSoftware Inc.)。
20.基于组织微数组(TMA)的免疫组织化学方法
以hB1评估组织玻片中RSPO3蛋白的IHC标记强度进行评分和分析。所有组织微数组玻片均取自US Biomax。胰腺癌组织微数组玻片(PA807)，包含35例腺癌、1例类癌、1例腺细胞癌、1例腺鳞癌、1例岛细胞瘤以及1例鳞状细胞癌、27例癌旁胰腺组织以及13例正常胰脏组织，每例中的单核用hB1(1∶100)染RSPO3。非小细胞肺癌(NSCLC)组织微数组载玻片(LC10012b)包含45例的伴有相应的癌旁肺组织的NSCLC(26例鳞状细胞癌、18例腺癌和1例腺鳞癌)及5例正常肺组织，每例以hB1(1∶100)染RSPO3。侵袭性乳管癌组织微数组玻片(BR1505c)，包含75例侵袭性乳管癌，每例以hB1(1∶100)染色RSPO3。结直肠癌和相应的癌旁正常组织以及淋巴结转移癌微数组玻片(CO10012b)，包含36例结直肠腺癌和相应的癌旁正常组织、9例淋巴结转移癌和9例正常淋巴结组织，加上10例正常结肠直肠组织，以hB1(1∶40)对RSPO3染色。
由两名经过委员会认证的病理学家评估玻片的讯号强度。根据先前的报告，免疫分数(范围：0、2-8)被定义为比例分数+强度分数(比例分数：0＝0/100，1＝1/100～1/10，2＝1/10～1/3，3＝1/3～2/3，4＝2/3～1以及5＝100/100；强度分数：0＝阴性，1＝微弱，2＝中间以及3＝强)。
实施例2：α-RSPO3融合瘤抗体对RSPO1-4结合的反应性
为了评估抗体的RSPO结合能力，将由源自初始批次-A殖株(A1、A2、A4、A5、A6、A9)以及批次-B殖株(B1、B3、B4、B8和B9)的几个转殖的融合瘤培养物的上清液所得之纯化单株抗体(mAb)，在免疫墨点法中与RSPO1、2、3和4反应。来自初始批次-A殖株的所有mAb对于RSPO3展现强烈的反应性。请见图2(A)。只有B4和B9mAb对于RSPO3展现反应性。请见图2(B)。然后对于所有与RSPO3反应的mAb进行4种不同RSPO(RSPO1-4)的结合选择性的评估。其结果显示，在ELISA测定中，来自殖株A1、A2、A4、A6、B1和B8的mAb仅与RSPO3反应。请见图3。
为了评估抗体的RSPO3结合亲和力，由Octet systems进行动力学测定。将批次-A殖株(A1、A4、A6、A9)的纯化单株抗体(mAb)与参考Ab-131R002，进行与RSPO-3结合的检测。请见表3。所有批次-A殖株的抗RSPO3抗体均展现出高度追踪标靶结合亲和力，其范围落在1.04 x 10-8至7.8 x 10-8M之间。
表3.RSPO3蛋白与抗RSPO3抗体间的结合亲和力。
Figure GDA0002574794970000311
实施例3：RSPO3-WNT讯号传递途径的抑制
OncoMed Pharmaceuticals Inc.已发展了几种RSPO3-结合抗体(rosmantuzumab(131R010)和131R002)。为了作为我们研究的参考对照，根据先前技术(US2014/0017253A1)所提之胺基酸序列，建构和表现抗体Rosmantuzumab和131R002。之后，对自行研发的小鼠6种mAb(A1、A2、A4、A6、B1、B8)和131R002对照mAb分别进行生物功能性测试。这些α-RSPO3小鼠mAb对RSPO-LGR讯号传递途径具显著的抑制活性。请见图4(A)和(B)。仅有殖株A4、A6和B1在含有RSPO3-WNT下游讯号传递途径TCF/LEF-Luc报导系统的MDA-MB436报告细胞株中，以剂量依赖性方式展现显著的抑制效果。请见图4(C)。然后进行抗体分型来辨识型别和亚型别。发现殖株A4、A6和B1分别为IgG1、IgG2a和IgG1的同型，如表4所示。
表4.抗体分型
Figure GDA0002574794970000312
Figure GDA0002574794970000321
实施例4：α-RSPO3的人源化修饰
对融合瘤的mAb的mRNA序列进行定序，然后进行cDNA合成与CHO细胞中表现。在表现和纯化对应于A4、A6和B1融合瘤的重组IgG后，确认这些IgG于RSPO3结合及中和的作用。选择殖株B1进行人源化。在分子模拟的辅助之下，透过可变区重塑方法以人源化小鼠mAb。请见例如Safdari等人(2013).Biotechnol Genet Eng Rev(29)：175-186。人源化技术包含自鼠类移植互补决定区(CDR)到人类IgG骨架上，以及抗体可变区序列中的T细胞表位的去除，以避免人类抗鼠抗体(HAMA)反应，减少病患潜在的免疫原性。然后将人源化的α-RSPO3mAb在CHO细胞中表现，并且对所纯化的抗体进行结合亲和力的分析，以进行不同体外和体内实验。请见例如Liu等人(2008).Immunol Rev(222)：9-27。下文中的实验结果证实了抗体工程成功产生人源化α-RSPO3抗体hB1，其系源自鼠类植株B1。
实施例4：hB1和rosmantuzumab在RSPO-WNT中和测定和抗原结合动力学测定中展现相等的效力
对主要待测物hB1的体内和体外抗癌活性进行特性测定，并且和正在进行第1a/1b期临床试验的rosmantuzumab比较。hB1 mAb是根据人类RSPO3(hRSPO 3)作为抗原所产生的。了解hB1是否可辨识及中和鼠类RSPO3(mRSPO3)很重要，因为大多数临床前体内研究会在小鼠中进行。hRSPO3和mRSPO3之间的胺基酸序列比对如图5所示。hB1可中和hRSPO3或mRSPO3，以抑制WNT报导基因讯号。请见图6(A)。如WNT报导试验所示，hB1和rosmantuzumab的50％抑制浓度(IC50)分别为58.0和58.7nM。请见图6(B)。
为了测量hB1与hRSPO3的结合系数，使用Biacore T200进行动力学测定。将hRSPO3蛋白固定在CM5传感器芯片上，涂层密度约为27.5反应单位(RU)。如图7所示，hB1与hRSPO3的结合亲和力类似于rosmantuzumab与hRSPO3的结合亲和力。平衡解离常数KD均为皮穆尔浓度(pM)。请见表5。
表5.使用Biacore生物传感器测定抗体-抗原互相作用的结合动力学之特征。
Figure GDA0002574794970000331
实施例5：结合表位的测定
为了鉴定α-RSPO3 Ab的结合表位，经由Mimotope，Inc.制备源自hRSPO3胺基酸序列的重迭型胜肽库(每个胜肽10mer，偏移：2个胺基酸残基，涵盖完整的hRSPO3的胜肽总数：122)。测量α-RSPO3 mAb与源自hRSPO3的重迭型胜肽的结合。鉴定后可能为结合表位的胺基酸序列如表6所示。包含131R002和rosmantuzuma的参考抗体与来自RSPO3片段的胺基酸(a.a.)7-11和a.a.35-42反应，且融合瘤A6α-RSPO3 mAb与RSPO3序列的a.a.5-11、35-42以及195-198反应。然而，A4和hB1 mAb均未出现可侦测的结合讯号。这个结果表明hB1和rosmantuzuma辨识hRSPO3上的不同结合表位。根据使用线型肽的表位定位结果(图8和表6)，可知hB1有可能与huRSPO3上的构型决定表位结合。此观察结果对于证明hB1和rosmantuzuma之间的不同结合模式是重要的。
表6.藉由胜肽扫描以进行α-RSPO3 mAb的表位测定
Figure GDA0002574794970000341
为了进一步研究α-RSPO3 Ab构型表位，使用重组RSPO3片段序列蛋白和环肽扫描以缩小其目标序列的范围。结果证实hB1辨识了RSPO3蛋白中的c-末端截断区。RSPO3中的hB1结合表位范围被缩小至a.a.33-86。请见图9(A)。RSPO3含有Furin-like半胱胺酸区域。截至目前为止，RSPO3的3D结构尚未被报导。此外，设计四种环肽(a.a.40-47、44-53、56-75和79-94)以测定α-RSPO3 mAb和源自hRSPO3的环肽的结合。其结果证实hB1识别了在RSPO3FR1区域(包含残基56-74)中含有结构域的所选表位。请见图9(B)。hB1可标靶RSPO3Furin-like区域中的新颖表位(包含残基56-75)以中和RSPO-WNT途径。
实施例6：hB1与LGR5竞争并与RSPO3结合
为了检测不同的α-RSPO3抗体是否会和LGR5或RNF43竞争而与RSPO3的结合，进行Ab/受体/配体结合竞争ELISA测定。作为α-RSPO3参考抗体的131R010和5D6是由OncoMed和Genetech所提供。在受体结合位点上，基于ELISA测定的不同，α-RSPO3抗体与LGR5表面受体竞争与RSPO3结合的相互作用。
结果显示，与对照Ab组相比，这些α-RSPO3抗体与LGR5竞争并与RSPO3结合。请见图10(A)。
此外，设计竞争受体/配体竞争测定法，以测定辅助受体RNF43在其受体结合位点的结合能力。我们的结果证实了hB1和131R010并不干扰RNF43和RSPO3之间的结合。5D6与LGR5和RNF43竞争并与huRSPO3结合。请见图10(B)。我们的结果证实，hB1对RSPO3的中和显著降低了LGR5依赖性途径对于WNT/β-catenin蛋白讯号传递途径活化的贡献。
实施例7：α-RSPO3 Ab抑制人类结肠直肠腺癌DLD-1细胞的细胞迁移能力
由于RSPO3-Wnt讯息传递反应不仅调控细胞入侵，还调控细胞迁移，因此进行愈合测定以检测α-RSPO3 mAb如何影响迁移能力。Wnt3a和RSPO3处理增强DLD细胞(带有adenomatous polyposis coli(APC)基因缺失)的迁移活性。在Wnt3a和RSPO3处理的存在下，比较了同型对照Ab和hB1对DLD-1迁移活性的影响。发现在Wnt3a和RSPO3存在下，hB1和131R010α-RSPO3 mAb均能够抑制DLD-1细胞的愈合活性。请见图11。
实施例8：hB1抑制CR3150 PDX肿瘤生长
CR3150结肠肿瘤系来自35岁的亚洲女性患者。CR3150肿瘤是具有PTPRK-RSPO3融合基因的中度分化管状腺瘤。一开始将带有肿瘤的小鼠分成四个实验组，即空白组(PBS)、hB1、131R010和未治疗组。从第1天到第29天，每周两次将待测物或空白对照物腹腔注射至小鼠体内。如图12所示，在治疗后第58天研究终止时，对照组的平均肿瘤体积达到1867.6±475.7mm3。用hB1(25mg/kg)治疗的组别引起明显的肿瘤生长抑制(TGI＝60.8％，p＝0.179)，其最终平均肿瘤体积为871.2±227.7mm3。请见图12。用131R010(25mg/kg)治疗的组别亦产生抗肿瘤活性(TGI＝71.0％，p＝0.067)，其最终平均肿瘤体积为680.2±38.2mm3。请见图12。在第46天，当用相对的肿瘤体积来比较处理组与对照组的差异时，统计显著的抗肿瘤活性被记为TGI＝68.4％，p＝0.041(hB1治疗)，以及TGI＝69.8％，p＝0.039(131R010治疗)。因此，hB1和131R010被认为在本研究中具有治疗益处。另外，本研究中没有严重的体重下降。总而言之，作为单一药剂的hB1和131R010对来自CR3150患者的结肠直肠癌模型展现出显著抗肿瘤活性。
实施例9：在CR3150 PDX模型中α-RSPO3 Ab降低了分子反应
为了评估CR3150 PDX模型中hB1的分子反应，测量肠道干细胞标志(Axin2和LGR5)、Wnt下游标志(TCF7)、癌症干细胞标志(CD133和CD44)和分化标志(CEACAM7和KRT20)的表现程度。结果显示，在hB1处理组别中，肠道干细胞标志(Axin2和LGR5)和Wnt下游标志(TCF7)在早期的表现明显低于对照组。请见图13。在自行研发的RSPO3 Ab最后一次给药后的29天内，分析癌症干细胞标志(CD133和CD44)和分化标志(CEACAM7和KRT20)的表现，与对照组相比显著降低。请见图13。
实施例10：α-RSPO3 Ab抑制NCI-H2030 RSPOhighCDX模型肿瘤生长
NCI-H2030肺癌细胞系源自肺癌患者的淋巴结。NCI-H2030细胞显示有RSPO3过度表现。首先将带有肿瘤的小鼠分成六个实验组以接受：1)空白组，2)hB1，3)131R010，4)卡铂(Carboplatin)+空白组，5)卡铂+hB1和6)卡铂+131R010。请见图14。从第1天到第29天，每周一次将待测物或空白对照物透过静脉向小鼠给药。在给药后第29天，对照组的平均肿瘤体积达到1702±298.1mm3。以hB1(25mg/kg)处理展现了明显的肿瘤生长抑制效果，最终平均肿瘤体积为1124±471.8mm3。用同样剂量进行131R010处理，也产生抗肿瘤活性，最终平均肿瘤体积为1327.4±194.3mm3。hB1在本研究中显示出治疗益处。此外，本研究中没有严重的体重下降。总而言之，hB1作为单一药剂或与卡铂组合给药，对H2030肺癌CDX模型表现了显著的抗癌活性。此外，在NCI-H2030癌症异种移植模型中，hB1表现出比rosmantuzumab更好的抗癌功效。
实施例11：α-RSPO3 Ab抑制带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人类SNU-1411结肠异种移植肿瘤
在带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人类SNU-1411结肠异种移植肿瘤中，将单独给予抗RSPO3抗体hB1以及控制组抗RSPO3抗体OMP-131R10，或是与紫杉醇合并使用，进行活性比较。在本研究过程中开始处理之后，不同组别中的平均肿瘤大小的结果，如图15所示。在第18天，对照mAb组的平均肿瘤尺寸到达1071mm3。当单独使用131R10和hB1时，与对照组相比，对于SNU-1411肿瘤并没有抗肿瘤活性(以单因子变异数分析，进行Tukey’s事后检定比较分析，p＞0.05vs.对照mAb)。请见图15上方。在第18天时，131R10的平均肿瘤体积为1265mm3且HB1的平均肿瘤体积为1177mm3。在第18天时，相对于对照mAb处理的组别，单独使用紫杉醇降低69％的肿瘤体积(以单因子变异数分析，进行Tukey’s事后检定比较分析，p＜0.05vs.对照mAb)。请见图15上方。在第18天时，与对照mAb处理的组别相比，131R10加上紫杉醇的组合以及hB1加上紫杉醇的组合，分别减少78％和86％的肿瘤体积(以单因子变异数分析，进行Tukey’s事后检定比较分析，p＜0.05vs.对照mAb组)。请见图15上方。相较于单独使用紫杉醇，两种组合之间并没有显著差异(以单因子变异数分析，进行Tukey’s事后检定比较分析，p＞0.05vs.紫杉醇组)。请见图15上方。表7总结第18天hB1、131R10、紫杉醇及其组合的抗肿瘤功效。一般来说，作为单一药剂和与紫杉醇合并使用的抗体治疗耐受性良好。
对照mAb和抗RSPO3单一药剂组于第18天最后一次给药后24小时终止，对于紫杉醇及组合用药组之动物则持续进行治疗，以确认治疗反应持续时间。治疗3周后紫杉醇的抗肿瘤功效丧失，在第32天(治疗后31天)时平均肿瘤体积达到950mm3。请见图15。另一方面，在第32天，两个组合用药组仍维持肿瘤生长的抑制，相对于单独使用紫杉醇，131R10加紫杉醇使肿瘤体积减少了82％，hB1加紫杉醇使肿瘤体积减少了75％(p＜0.05vs.紫杉醇，先进行单因子变异数分析后，进行Tukey’s pairwise比较)。请见图15下方。表8总结了在第32天(治疗后31天)的紫杉醇及其合并组合抗肿瘤活性。从第36天开始，合并组合的抗肿瘤功效开始减少。在第46天研究结束时，hB1加紫杉醇的平均肿瘤体积为874±247mm3，而131R10加紫杉醇的平均肿瘤体积为399±138mm3。
表7.在第18天，在带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人类SNU-1411
结肠异种移植肿瘤中，131R10和hB1作为单一药剂和其与紫杉醇合并使用的抗肿瘤功效。
Figure GDA0002574794970000381
Figure GDA0002574794970000391
*：p＜0.05vs.对照mAb，先进行单因子变异数分析检定，接着进行Tukey’s事后比较分析
表8.在第32天，在带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人类SNU-1411结肠异种移植肿瘤中，131R10、hB1与紫杉醇之组合的抗肿瘤功效。
Figure GDA0002574794970000392
*：p＜0.05vs.紫杉醇，先进行单因子变异数分析检定，接着进行Tukey’s事后检定
综上所述，本研究显示，单独用hB1或131R10进行治疗2周，对于带有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人类SNU-1411结肠异种移植肿瘤并没有抗肿瘤效果，但是和紫杉醇合并组合使用则有类似于紫杉醇治疗组的抗肿瘤活性。紫杉醇介导的生长抑制在治疗后3周消失，而hB1或131R10与紫杉醇的合并组合在治疗后4周仍然有效。两种合并组别在治疗后35天恢复肿瘤生长，131R10加紫杉醇的速率低于hB1加紫杉醇。
实施例12：以α-RSPO3抗体hB1分析乳癌、结肠癌、胰脏癌及肺癌组织微数组中RSPO3免疫组织化学表现
为了评估RSPO3在正常和疾病状态的癌组织中的不同表现，利用基于组织微数组(TMA)的免疫组织化学(IHC)，来评估其与乳癌、结肠癌、胰脏癌、肺癌患者的病理学特征的关联性。使用RSPO3抗体hB1评估RSPO3在80个胰脏癌和正常病例组织数组中的表现。结果显示91％(21/23)的肿瘤出现低到高的RSPO3阳性染色。相比之下，只有8.7％(2/23)在胰脏管腺癌病例中出现阴性染色。结果表示，与正常或癌旁胰腺组织相比，在晚期TNM胰脏管腺癌中更常观察到较高的RSPO3表现。请见图16。
使用RSPO3抗体hB1评估RSPO3在50个肺非小细胞癌和正常病例组织数组中的表现，结果显示92.3％(24/26)的肿瘤出现低到高的RSPO3阳性染色，而只有在7.7％(2/26)的鳞状细胞癌病例中出现阴性染色。请见图17。
使用RSPO3抗体hB1评估RSPO3在侵袭性乳管癌组织数组的RSPO3表现，结果显示72％(54/75)的肿瘤样本出现低到高的RSPO3阳性染色，然而仅有28％(21/75)的侵袭性乳管癌的病例出现阴性染色。请见图18。
使用RSPO3抗体hB1评估RSPO3在64个结肠直肠癌和相应的相邻正常组织微数组中的表现，结果显示91.7％(33/36)的肿瘤出现强烈的RSPO3阳性染色，而仅有8.3％(3/36)的结肠直肠腺癌病例出现低度的染色。请见图19。
本研究更发现，hB1检测到的高RSPO3染色与胰脏癌、肺癌或乳癌患者的远处转移显著相关。
本说明书中公开的所有特征可以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可使用于相同、等同或类似目的的其他特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所揭露的每个特征仅是等同或类似特征的通用系列的示例。
根据以上描述，本领域具有通常知识者可轻易确定所描述的实施例的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对实施例进行各种改变和修改以使其适应各种用途和情况。因此，其他实施例也在申请专利范围内。
Figure IDA0002526556870000011
Figure IDA0002526556870000021
Figure IDA0002526556870000031
Figure IDA0002526556870000041
Figure IDA0002526556870000051
Figure IDA0002526556870000061
Figure IDA0002526556870000071
Figure IDA0002526556870000081
Figure IDA0002526556870000091
Figure IDA0002526556870000101
Figure IDA0002526556870000111
Figure IDA0002526556870000121

Claims (28)

1.一种分离的抗体，包含：
一重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，该重链可变区序列系选自SEQID NO：2、6、10和14；以及
一轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，该轻链可变区序列系选自SEQID NO：4、8、12和16；
其中，该抗体与RSPO3蛋白特异性地结合。
2.如权利要求1所述之抗体，其中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：2，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：4。
3.如权利要求2所述之抗体，其中，该抗体包含与SEQ ID NO：2序列至少80％相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：4序列至少80％相同之一轻链可变区。
4.如权利要求1所述之抗体，其中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：6，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：8。
5.如权利要求4所述之抗体，其中，该抗体包含与SEQ ID NO：6序列至少80％相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：8序列至少80％相同之一轻链可变区。
6.如权利要求1所述之抗体，其中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：10，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：12。
7.如权利要求6所述之抗体，其中，该抗体包含与SEQ ID NO：10序列至少80％相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：12序列至少80％相同之一轻链可变区。
8.如权利要求1所述之抗体，其中，该重链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：14，且该轻链CDR1、CDR2和CDR3系来自SEQ ID NO：16。
9.如权利要求8所述之抗体，其中，该抗体包含与SEQ ID NO：14序列至少80％相同之一重链可变区，以及与SEQ ID NO：16序列至少80％相同之一轻链可变区。
10.如权利要求1至9任一项所述之抗体，其中，该抗体系与RSPO3蛋白中的构形决定或线性表位结合。
11.如权利要求1所述之抗体，其中，该抗体系一IgG抗体、含有一Fc区的一抗体、一Fab片段、一Fab’片段、一F(ab′)2片段、一单链抗体、一单链可变区片段多聚体、一单价抗体、一多价抗体或一嵌合抗体。
12.如权利要求1所述之抗体，其中，该抗体系人源化的。
13.如权利要求1至12所述之抗体，其中，该抗体系与另一分子共轭的。
14.一种分离的核酸分子，包含编码如权利要求1至13任一项所述之抗体之一核酸序列。
15.一种宿主细胞，包含如权利要求14所述之该分离的核酸。
16.一种组成物，包含如权利要求1至13任一项所述之抗体。
17.如权利要求16所述之组成物，更包含一医药可接受之载体。
18.如权利要求16或17所述之组成物，更包含另一治疗剂。
19.一种抑制细胞中RSPO3之方法，包含使该细胞与一有效量的如权利要求1至13任一项所述之该抗体接触。
20.一种抑制细胞中Wnt讯息传递的方法，包含使该细胞与一有效量的如权利要求1至13任一项所述之该抗体接触。
21.一种抑制癌细胞生长或癌细胞转移的方法，包含使该细胞与一有效量的如权利要求1至13任一项所述之抗体接触。
22.一种治疗一主体的癌症的方法，包含向该主体施用一有效量的如权利要求1至13任一项所述之抗体。
23.如权利要求22所述之方法，其中该癌症系RSPO3阳性癌症、RSPO3-融合阳性癌症、具有腺瘤性结肠瘜肉(APC)突变的癌症、具有β-catenin突变的癌症或具有Wnt讯息传递过度活化的癌症。
24.一种如权利要求23所述之方法，其中该癌症系结肠癌、白血病、结肠直肠癌、卵巢癌、胰脏癌、肺癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、摄护腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、神经胶母细胞瘤或头颈癌。
25.如权利要求22至24任一项所述之方法，更包含向该主体施用另一治疗剂。
26.一种在一样本中检测RSPO3蛋白或其片段之方法，包含：
使该样本与如权利要求1至13任一项所述之抗体接触；以及
测定该抗体和RSPO3蛋白或其片段之间的特异性结合。
27.一种如权利要求26所述之方法，其中该RSPO3蛋白系人类RSPO3。
28.一种辨别与RSPO3蛋白特异性结合之一抗体变体的方法，包含：在如权利要求1至13任一项所述之抗体之一或多个互补决定区中引入一或多个修饰以产生一抗体变体；以及辨别与RSPO3蛋白特异性结合之一抗体变体。
CN201880079067.5A 2017-12-07 2018-12-06 抗rspo3抗体 Active CN111683680B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762595845P 2017-12-07 2017-12-07
US62/595,845 2017-12-07
PCT/US2018/064236 WO2019113306A2 (en) 2017-12-07 2018-12-06 Anti-rspo3 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111683680A true CN111683680A (zh) 2020-09-18
CN111683680B CN111683680B (zh) 2023-10-27

Family

ID=66749949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880079067.5A Active CN111683680B (zh) 2017-12-07 2018-12-06 抗rspo3抗体

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11623951B2 (zh)
EP (2) EP3720492A4 (zh)
JP (1) JP7370997B2 (zh)
KR (1) KR20200096275A (zh)
CN (1) CN111683680B (zh)
AU (1) AU2018378668A1 (zh)
TW (1) TWI702050B (zh)
WO (1) WO2019113306A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112500476A (zh) * 2020-12-16 2021-03-16 南京基蛋生物医药有限公司 一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物和筛选该引物的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102554222B1 (ko) * 2023-03-21 2023-07-11 순천향대학교 산학협력단 신규한 항-인간 알스폰딘3 항체 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140017253A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Oncomed Pharmaceuticals, Inc RSPO3 Binding Agents and Uses Thereof
US20150147333A1 (en) * 2013-10-18 2015-05-28 Genentech, Inc. Anti-rspo antibodies and methods of use
CN106536556A (zh) * 2014-04-04 2017-03-22 生态学有限公司 结合lgr5的人源化抗体
US20170266276A1 (en) * 2014-12-02 2017-09-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination Therapy For Treatment of Cancer
US20170319688A1 (en) * 2016-04-14 2017-11-09 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8795667B2 (en) 2007-12-19 2014-08-05 Macrogenics, Inc. Compositions for the prevention and treatment of smallpox
EP2731625B1 (en) * 2011-07-15 2018-04-18 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Rspo binding agents and uses thereof
GB201501004D0 (en) * 2015-01-21 2015-03-04 Cancer Rec Tech Ltd Inhibitors

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140017253A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Oncomed Pharmaceuticals, Inc RSPO3 Binding Agents and Uses Thereof
US20150147333A1 (en) * 2013-10-18 2015-05-28 Genentech, Inc. Anti-rspo antibodies and methods of use
CN105744954A (zh) * 2013-10-18 2016-07-06 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
CN106536556A (zh) * 2014-04-04 2017-03-22 生态学有限公司 结合lgr5的人源化抗体
US20170266276A1 (en) * 2014-12-02 2017-09-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination Therapy For Treatment of Cancer
US20170319688A1 (en) * 2016-04-14 2017-11-09 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112500476A (zh) * 2020-12-16 2021-03-16 南京基蛋生物医药有限公司 一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物和筛选该引物的方法
CN112500476B (zh) * 2020-12-16 2024-02-23 南京基蛋生物医药有限公司 一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物和筛选该引物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
TWI702050B (zh) 2020-08-21
US11623951B2 (en) 2023-04-11
KR20200096275A (ko) 2020-08-11
JP2021508254A (ja) 2021-03-04
WO2019113306A3 (en) 2019-07-18
EP4115904A3 (en) 2023-04-12
US20210163580A1 (en) 2021-06-03
AU2018378668A1 (en) 2020-06-25
EP4115904A2 (en) 2023-01-11
TW201938195A (zh) 2019-10-01
CN111683680B (zh) 2023-10-27
EP3720492A2 (en) 2020-10-14
JP7370997B2 (ja) 2023-10-30
WO2019113306A2 (en) 2019-06-13
AU2018378668A2 (en) 2020-07-02
EP3720492A4 (en) 2021-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2756275C2 (ru) Антитела, специфические к рецептору полиовируса (pvr) человека
KR102365972B1 (ko) 항-pd-1 항체 및 이의 용도
JP6502590B1 (ja) 抗Ｔｉｍ−３抗体
AU2012319299B2 (en) Anti c-Met antibody and uses thereof
EP1937815B1 (en) Methods and compositions for modulating tumor cell activity
JP2020504095A (ja) 抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせのための抗Ｔｉｍ−３抗体
EP2848631B1 (en) Use of an anti-ang2 antibody
JP6689847B2 (ja) がんの治療における使用のための抗−ｃｋ８抗体
KR102428255B1 (ko) 위암의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법
KR20230132544A (ko) 신규한 항-그렘린1 항체
JP2015515487A (ja) 抗ｐｄｇｆ−ｃ抗体
CN111683680B (zh) 抗rspo3抗体
US20210130453A1 (en) Combination of lif inhibitors and pd-1 axis inhibitors for use in treating cancer
JP2022502417A (ja) 抗ｏｘ４０抗体、その抗原結合フラグメント、および医薬用途
CN114786722A (zh) 抗类趋化因子受体1人源化抗体及其治疗应用
KR102312922B1 (ko) Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체
JP2024509701A (ja) 抗ｓ１００ａ４ヒト化抗体、使用及び方法
KR20230158058A (ko) 시알산-결합 ig-유사 렉틴 15에 특이적인 항체 및 이의 용도
KR20150014077A (ko) 항 Ang2 항체
KR20150028087A (ko) 항 Ang2 항체를 포함하는 혈관누수 차단제
EP4310098A1 (en) Semenogelin neutralizing antibody and epitope and application thereof
KR20180042431A (ko) 암 치료용 안티-서비빈 항체

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant