KR102428255B1

KR102428255B1 - 위암의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR102428255B1
Application number: KR1020187019707A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 프뢰르
Original assignee: 프로가스트린 에 캔서스 에스.에이 알.엘.
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2022-08-03
Also published as: JP2019505784A; EP3397966B1; KR20220100099A; AU2022263503A1; CA3009740A1; JP7478708B2; US20190011449A1; KR20180105642A; JP2021167831A; CN108700588A; KR102477179B1; AU2017204685B2; EP3954998A1; AU2017204685A1; EP3397966A1; JP2024041982A; CA3193501A1; SG11201805141QA; EA201891528A1; JP6909795B2

Abstract

본 발명은 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법 및 위암의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 프로가스트린에 결합하는 항체를 포함하고 상기 방법은 프로가스트린에 결합하는 항체의 사용을 포함한다.

Description

위암의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법

본 발명은 암의 시험관 내 진단, 예방 및 치료에 관한 것으로, 보다 구체적으로 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법, 및 위암의 예방 또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 프로가스트린-결합 분자, 특히 항-hPG 항체를 포함하는 반면, 본 발명에 따른 방법은 프로가스트린-결합 분자, 특히 항-hPG 항체의 사용을 포함한다.

위암 (gastric cancer 또는 stomach cancer)은 암의 5번째 주요 원인이고 암으로 인한 사망의 3번째 주요 원인으로 사례의 7% 및 사망률의 9%를 차지한다. 다수의 연구에서 입증된 바와 같이, 위암의 가장 흔한 원인은 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 세균에 의한 감염으로, 헬리코박터 파일로리 감염과 위암 사이의 연관성이 연구에서 나타났다.

위암은 위의 내벽 (lining)으로부터 발생하고, 그 후에 암은 신체의 다른 부위, 특히 간, 폐, 뼈, 복부의 내벽 및 림프절로 확산될 수 있다. 일반적으로 치료에는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 및 표적 요법이 단독 또는 병용하여 포함된다. 그러나 결과는 종종 전 세계적으로 5년 생존율이 10% 미만으로 불량하다. 이는 주로 대부분의 사람이 생존율에 직접적인 영향을 미치는, 진행된 질병을 갖는 경우에만 검출되기 때문이다. 일부 아시아 국가에서는, 선별 노력이 더 높은 생존율과 연관이 있는 것으로 나타났다.

임상적 진단은 내시경 검사에서 수행되는 생검을 기초로 한다. 그 후에 의학적 이미지화가 사용되어 질병이 신체의 다른 부분으로 확산되었는지 여부를 결정한다.

따라서, 위암의 예방 또는 치료를 위한 새로운 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재하는 것과 같이, 위암의 신속하고, 신뢰성 있으며, 비용-효과적인 진단을 가능케 하는 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

이것이 본 발명의 목적이다.

본 발명은 대상체(subject)로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린의 검출을 포함하는, 위암의 시험관 내 진단을 위한 새로운 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 시료 내 프로가스트린의 양이 결정되고, 그로써 프로가스트린의 정량을 가능케 한다. 본 발명은 또한 프로가스트린에 결합하는 항체를 포함하는, 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물, 및 단독으로 또는 위암에 대한 임의의 다른 공지된 예방 또는 치료 방법과 조합하여, 프로가스트린에 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 사용을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

101개 아미노산 펩티드 (아미노산 서열 참조: AAB19304.1)인 인간 프리-프로가스트린은 가스트린 유전자의 일차 번역 산물이다. 프로가스트린은 프리프로가스트린으로부터 처음 21개 아미노산 (시그널 펩티드)의 절단에 의해 형성된다. 프로가스트린의 80개 아미노산 사슬은 절단 및 개질 효소에 의해 수개의 생물학적 활성 가스트린 호르몬 형태로 추가 처리된다: 프로가스트린의 아미노산 38-71을 포함하는, 가스트린 34 (G34) 및 글리신-연장 가스트린 34 (G34-Gly), 프로가스트린의 아미노산 55 내지 71을 포함하는, 가스트린 17 (G17) 및 글리신-연장 가스트린 17 (G17-Gly).

진단 또는 요법을 위한 항-인간 프로가스트린 (항-hPG) 단일클론 항체 및 이들의 용도가 하기 문헌에 기술되어 있다: 결장직장암에 대해 WO 2011/083088, 유방암에 대해 WO 2011/083090, 췌장암에 대해 WO 2011/083091, 결장직장암 및 위장관암에 대해 WO 2011/116954, 및 간 병리학에 대해 WO 2012/013609 및 WO 2011/083089.

본 발명은, 단지 예시로서 제시되고 발명의 의도된 범주를 제한하지 않는, 본원에 주어진 상세한 설명 및 첨부의 도면으로부터 더 완전히 이해될 것이다.

첫 번째 양태에서, 본 발명은 위암의 존재 위험성의 시험관 내 평가를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린을 검출하는 단계를 포함한다. 시료 내 프로가스트린의 존재는 위암이 존재할 위험성이 있음을 나타낸다.

따라서, 첫 번째 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 위암의 존재 위험성을 평가하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

a) 상기 대상체로부터의 생물학적 시료를 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 단계, 및

b) 상기 시료에서 프로가스트린에 대한 상기 프로가스트린-결합 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결합은 위암의 존재 위험성을 나타낸다.

프로가스트린-결합 분자의 결합은 당업자에게 이용가능한 다양한 분석에 의해 검출될 수 있다. 이 분석을 수행하기 위한 임의의 적합한 수단이 본 발명에 포함되지만, 특히 FACS, ELISA, RIA, 웨스턴-블롯 및 IHC가 언급될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 대상체에서 위암의 존재 위험성을 시험관 내 평가하기 위한 본 발명에 따른 방법은:

a) 상기 대상체로부터의 생물학적 시료를 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 단계,

b) 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 시료 내 적어도 10 pM의 프로가스트린의 농도는 위암의 존재 위험성을 나타낸다.

일단 시료 내 존재하는 프로가스트린의 농도가 결정되면, 그 결과를 위암에 걸리지 않은 개인(들)로부터의 시험 시료에 대해 유사한 방식으로 수득된 대조군 시료(들)의 것과 비교할 수 있다. 만약 프로가스트린의 농도가 시험 시료에서 현저히 더 상승한다면, 이는 그로부터 시료가 유래된 대상체가 위암에 걸릴 가능성이 증가한 것으로 결론 지을 수 있다.

따라서, 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:

c) 기준 시료에서 프로가스트린의 기준 농도를 결정하는 단계,

d) 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도를 프로가스트린의 상기 기준 농도와 비교하는 단계,

e) 단계 d)의 비교로부터, 위암의 존재 위험성을 평가하는 단계.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대상체에서 위암을 진단하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

b) 상기 시료에서 프로가스트린에 대한 상기 프로가스트린-결합 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결합은 상기 대상체에서 위암의 존재를 나타낸다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

b) 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 시료 내 적어도 10 pM의 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 위암의 존재를 나타낸다.

본 발명에 따른 방법의 더욱 특정한 구현예에서, 상기 생물학적 시료 내 적어도 10 pM, 적어도 20 pM, 적어도 30 pM의 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 위암의 존재를 나타낸다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:

a) 기준 시료에서 프로가스트린의 기준 농도를 결정하는 단계,

b) 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도를 프로가스트린의 상기 기준 수준 또는 농도와 비교하는 단계,

c) 단계 d)의 비교로부터, 위암의 존재를 진단하는 단계.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대상체에서 전이된 위암을 진단하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

b) 상기 시료에서 프로가스트린에 대한 상기 프로가스트린-결합 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결합은 상기 대상체에서 전이된 위암의 존재를 나타낸다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 전이된 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

a) 상기 생물학적 시료를 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 단계,

b) 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 수준 또는 농도를 생물학적 분석에 의해 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물학적 시료 내 적어도 10 pM 이상의 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 전이된 위암의 존재를 나타낸다.

본 발명에 따른 방법의 더욱 특정한 구현예에서, 상기 생물학적 시료 내 적어도 10 pM, 적어도 20 pM, 적어도 30 pM, 적어도 40 pM 또는 적어도 50 pM의 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 전이된 위암의 존재를 나타낸다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:

b) 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도를 프로가스트린의 상기 기준 농도와 비교하는 단계,

c) 단계 d)의 비교로부터, 전이된 위암의 존재를 진단하는 단계.

특정한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법에 관한 것으로, 이는 생물학적 시료에서 프로가스트린의 농도를 결정하고 수득된 상기 값을 기준 시료에서의 프로가스트린의 농도와 비교하는 것을 포함한다.

더욱 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 진단을 위한 방법에 있어, 상기 대상체의 생물학적 시료는 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자와 접촉하고, 여기서 상기 프로가스트린-결합 분자는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.

"대상체에서 위암의 존재 위험성의 평가"라는 표현은 기준 대상체 또는 가치와 비교할 때, 주어진 대상체가 위암에 걸리게 될 상대적 확률의 결정을 지시한다. 본 발명에 따른 방법은 임상 시험, 생검 및, 예를 들어 펩시노겐과 같은 위암의 공지된 바이오마커 수준의 결정과 같은 다른 방법 또는 지표와 조합하여, 상기 위험을 평가하는 도구를 나타낸다

"시험관 내 진단"이라는 표현은 대상체가 특정 질환으로부터 고통 받는지 여부를 결정하는 것을 의미한다. 위암의 진단은 적어도 상기 대상체의 증상 및 펩시노겐 검출의 임상적 관찰을 포함하는 것으로 알려져 있다. 펩시노겐 검사는 현재 바이오마커로 사용되지만 위암을 검출하는 이 검사의 정확도가 낮은데, 민감도는 35.8% 내지 62.3% 범위로 추정된다 (Yanaoka et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008). 일부 바이오마커가 발견 시기에서 확인되었지만, 대부분 체계적인 평가 과정의 부재로 인해, 이들을 임상으로 전환하는데 여전히 중요한 도전이 존재한다 (Pepe et al, J Natl Cancer Inst, 2008).

따라서, 본 발명에 따른 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법은 진단 과정 내에서 도구로 고려될 수 있다.

더욱 특정한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법에 관한 것으로, 이는 상기 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도 결정 및 위암의 공지된 바이오마커, 바람직하게는 펩시노겐의 결정을 포함한다.

"위암 (gastric cancer)"이라는 표현은 또한 "위암 (stomach cancer)"을 나타내고, 이는 특히 "위 암종"을 포함하지만, 또한 위 내부에서 발생할 수 있는 림프종 및 중간엽 종양도 또한 포함한다. "위암"이라는 표현은 또한 전이와 연관된 위암, 특히, 간, 폐, 뼈, 복부 및 림프절 전이를 포함한다.

용어 "프로가스트린"은 포유류 프로가스트린 펩티드, 특히 인간 프로가스트린을 지시한다. 의심의 여지 없이, 어떠한 명세서 없이도, "인간 프로가스트린"이라는 표현은 서열번호: 1의 서열의 인간 PG를 지칭한다. 인간 프로가스트린은 특히 상기에 언급된 생물학적 활성 가스트린 호르몬 형태에는 존재하지 않는 N-말단 및 C-말단을 포함한다. 바람직하게는, 상기 N-말단 도메인의 서열은 서열번호: 2로 표시된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 C-말단 도메인의 서열은 서열번호: 3으로 표시된다.

본 발명에 따른 방법에서 프로가스트린의 농도 결정은 생화학 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행된다.

바람직하게는, 시료 내 프로가스트린의 수준 결정은 상기 시료를 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키고 프로가스트린에 대한 상기 프로가스트린-결합 분자의 결합을 측정하는 것을 포함한다.

발현 수준이 단백질 수준에서 측정되는 경우, 이는 특히, 예컨대 항체와 같은 특이적 프로가스트린-결합 분자의 사용, 특히 바이오틴화를 이용한 세포막 염색 또는 다른 동등한 기법에 이은 특이적 항체를 이용한 면역침전, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 ELISPOT, 효소-연계 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성면역분석 (RIA), 면역조직화학 (IHC), 면역형광 (IF), 항체 마이크로어레이, 또는 면역조직화학과 결합된 조직 마이크로어레이와 같은 익히 알려진 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 다른 적합한 기법에는 FRET 또는 BRET, 단일 또는 다중 여기 파장을 이용하고 개조된 광학 방법 중 어느 하나를 적용하는 단일 세포 현미경 또는 조직화학 방법, 예컨대 전기화학적 방법 (전압전류 및 전류측정 기법), 원자력 현미경, 및 무선 주파수 방법, 예를 들어 다극 공명 분광법, 공초점 및 비-공초점, 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사율, 투과율 및 복굴절 또는 굴절률의 검출 (예컨대, 표면 플라스몬 공명, 타원계측법, 공명 거울 방법, 격자 결합기 도파로 방법 또는 간섭 측정), 세포 ELISA, 유동 세포계측, 동위원소, 자기 공명 이미지화, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 (SDS-PAGE); HPLC-질량 분석; 액체 크로마토그로피/질량 분석/질량 분석 (LC-MS/MS))이 포함된다. 이들 모든 기법은 당해 분야에 익히 알려져 있으며 본원에서 더 상세히 설명할 필요는 없다. 이러한 다양한 기법은 프로가스트린 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다.

상기 방법은 특히 다음 중에서 선택될 수 있다: 면역-검출에 기반한 방법, 웨스턴 블롯에 기반한 방법, 질량 분석에 기반한 방법, 크로마토그래피에 기반한 방법, 및 유동 세포계측에 기반한 방법. 이 분석을 수행하는데 임의의 적합한 방법이 본 발명에 포함되지만, FACS, ELISA, RIA, 웨스턴-블롯 및 IHC와 같은 방법이 본 발명의 방법을 수행하는데 특히 유용하다.

더욱 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법은, 바람직하게는 RIA 및 ELISA 중에서 선택된 기법을 토대로 면역효소 분석을 이용하여 대상체로부터의 생물학적 시료를 프로가스트린 결합 분자를 접촉시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 "생물학적 시료"는, 예를 들어 위암 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 전사체의 핵산 또는 폴리펩티드를 함유하는 생물학적 조직 또는 유체이다. 이러한 시료는 프로가스트린의 발현 수준의 결정을 가능케 해야 한다. 프로가스트린은 분비 단백질로 알려져 있다. 따라서 프로가스트린 단백질의 수준을 결정하기에 바람직한 생물학적 시료는 생물학적 유체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "생물학적 유체"는 생물학적 기원의 물질을 포함하는 임의의 유체를 의미한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 생물학적 유체에는 포유류와 같은 동물, 바람직하게는 인간 대상체의 체액을 포함한다. 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 뇌척수액 (CSF), 타액, 땀 및 소변을 포함하는 임의의 체액일 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 바람직한 액체 생물학적 시료는 혈액 시료, 혈장 시료, 또는 혈청 시료를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 생물학적 시료는 혈액 시료이다. 실제로, 이러한 혈액 시료는 환자로부터 완전히 무해한 혈액 수집으로부터 수득될 수 있고, 따라서 대상체에서 종양이 발생할 위험의 비-침습적 평가를 가능케 한다.

본원에 사용된 바와 같이 "생물학적 시료"는 또한 암이 고형 암인 경우, 시험되는 환자의 고형 암 시료를 포함한다. 이러한 고형 암 시료는 당업자가 본 발명의 바이오마커 수준에 대한 임의의 유형의 평가를 수행하는 것을 가능케 한다. 일부 경우에는, 본 발명에 따른 방법은 환자로부터 고형 암 시료를 취하는 예비 단계를 추가로 포함한다. "고형 암 시료"란, 종양 조직 시료를 지칭한다. 암성 환자의 경우에서조차, 종양 부위인 조직은 여전히 비-종양의 건강한 조직을 포함한다. 따라서 "암 시료"는 환자로부터 취해진 종양 조직으로 제한되어야 한다. 상기 "암 시료"는 생검 시료이거나 외과적 절제 요법으로부터 취해진 시료일 수 있다.

생물학적 시료는 전형적으로 진핵 유기체, 가장 바람직하게는 포유류, 또는 조류, 파충류 또는 어류로부터 수득된다. 실제로, 본원에 기술된 방법에 적용될 수 있는 "대상체"는 인간, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지 (pig), 돼지 (swine), 양 및 원숭이를 포함하는 임의의 포유류 동물; 또는 조류; 파충류; 또는 어류일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이고; 인간 대상체는 "환자"로 알려질 수 있다.

본원에서 "생물학적 시료의 수득"이란, 본 발명에 기술된 방법에 사용하기 위한 생물학적 시료를 수득하는 것을 의미한다. 가장 흔하게는, 이는 동물로부터 세포 시료를 제거함으로써 이루어질 것이지만, 또한 이전에 단리된 세포 (예컨대, 다른 사람, 다른 시간, 다른 목적으로 단리됨)를 사용하거나 또는 본 발명의 방법을 생체 내 수행함으로써 달성될 수 있다. 치료 또는 결과 이력이 있는 기록 조직이 특히 유용할 것이다.

이 시료는 수득될 수 있고 필요하다면 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 특히, 시료가 공복 상태의 대상체로부터 취해져야 함이 당업계에 익히 알려져 있다.

프로가스트린의 농도 결정은 공지 부피의 시료에서 프로가스트린의 양을 결정하는 것과 관련이 있다. 프로가스트린의 농도는, 예를 들어 비율 또는 백분율로서 기준 시료에 대해 상대적으로 표현될 수 있다. 농도는 또한 상기 농도 결정에 사용된 방법에 따라서, 신호의 강도 또는 국소화로서 표현될 수 있다. 바람직하게는, 시료 내 화합물의 농도는 상기 시료 내 관련 화합물의 전체 농도의 표준화 후에 표현되는데, 예를 들어 단백질의 수준 또는 농도는 시료 내 단백질의 전체 농도의 표준화 후 표현된다.

바람직하게는, 상기 대상체가 위암에 걸릴 위험성은 상기 생물학적 시료에서 측정된 프로가스트린의 수준을 기준 수준과 비교함으로써 결정된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기준 수준"은 기준 시료 내 고려 중인 위암 마커, 즉 프로가스트린의 발현 수준을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기준 시료"는 질병이 없는 것으로 알려진 대상체, 바람직하게는 2개 이상의 대상체, 또는 대안적으로 일반 대중으로부터 수득된 시료를 의미한다. 프로가스트린의 적합한 기준 발현 수준은 여러 적합한 대상체에서 상기 마커의 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있고, 그러한 기준 수준은 특정 대상체 집단에 대해 조정될 수 있다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대 값; 상대 값; 상한 또는 하한을 갖는 값; 범위 값; 평균 (average) 값; 중앙 값, 평균 (mean) 값, 또는 특정 대조군 또는 기저선 값에 대한 값일 수 있다. 기준 값은, 예를 들어 보다 이른 시점이지만, 시험되는 대상체로부터의 시료로부터 수득된 값과 같은 개별 시료 값을 기초로 할 수 있다. 기준 값은 예컨대 연대순 연령 매칭된 그룹의 대상체 집단으로부터의 다수의 시료를 기초로 하거나, 또는 시험되는 시료를 포함 또는 배제하는 시료의 풀 (pool)을 기초로 할 수 있다.

유리하게는, "기준 수준"은 암에 관해서 공지된 특정 상태를 갖는 대상체로부터의 생물학적 시료로부터 수득된, 미리 결정된 프로가스트린 수준이다. 특정 구현예에서, 단계 (b)에서 시험 시료와의 비교에 사용된 기준 수준은 건강한 대상체로부터의 생물학적 시료로부터, 또는 암에 걸린 대상체로부터의 생물학적 시료로부터 얻어질 수 있고; 기준 발현 프로파일이 또한 건강한 대상체의 생물학적 시료의 풀로부터 또는 암에 걸린 대상체로부터의 시료의 풀로부터 수득될 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에서, 기준 시료는 임의의 암, 바람직하게는 임의의 병리로부터 면제된 대상체로부터 수집된다. 환자로부터 수집된 생물학적 시료의 특성에 따라서, 기준 시료가 상기 생물학적 시료의 동일한 특성의 생물학적 시료일 것으로 이해된다.

프로가스트린의 수준은 프로가스트린-결합 분자, 바람직하게는 프로가스트린을 인식하는 항체에 의해 결합되는 프로가스트린의 양을 결정함으로써 본 발명의 방법에서 결정된다.

"프로가스트린-결합 분자"란, 본원에서 프로가스트린에는 결합하지만, 가스트린-17 (G17), 가스트린-34 (G34), 글리신-연장된 가스트린-17 (G17-Gly), 또는 글리신-연장된 가스트린-34 (G34-Gly)에는 결합하지 않는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 프로가스트린-결합 분자는, 예를 들어 항체 분자 또는 수용체 분자와 같은 임의의 프로가스트린-결합 분자일 수 있다. 바람직하게는, 프로가스트린-결합 분자는 항-프로가스트린 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

특정 구현예에 따르면, 본 발명은 위암의 적어도 하나의 임상적 증상을 나타내는 대상체로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린의 농도를 결정하는 것을 포함하는, 위암의 시험관 내 진단 방법에 관한 것이다.

또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 암 및/또는 전이의 적어도 하나의 임상적 증상을 나타내는 대상체로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린의 농도를 결정하는 것을 포함하는, 위암의 시험관 내 방법에 관한 것이다.

"결합하는", "결합한다", 등이란, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리적 조건에서 상대적으로 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것으로 의도된다. 2개의 분자가 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당해 분야에 익히 알려져 있고, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 BSA 또는 카제인과 같은 비-특이적 분자에의 결합에 대한 이들의 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 프로가스트린에 결합한다. 더욱 특정한 구현예에서, 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 프로가스트린에만 결합한다.

특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 위암의 진단을 위한 방법에서, 대상체로부터의 생물학적 시료는 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자와 접촉하고, 이때 상기 분자의 프로가스트린에 대한 친화도는 상기에 기술된 것과 같은 방법에 의해 결정되는 바와 같이, 적어도 100 nM, 적어도 90 nM, 적어도 80 nM, 적어도 70 nM, 적어도 60 nM, 적어도 50 nM, 적어도 40 nM, 적어도 30 nM, 적어도 20 nM, 적어도 10 nM, 적어도 5 nM, 적어도 1 nM, 적어도 100 pM, 적어도 10 pM, 또는 적어도 1 pM이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 대상체로부터의 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도 검출을 포함하는, 위암의 진단을 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 생물학적 시료는 항-hPG 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 다중클론 및 단일클론 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 항체 (또는 "면역글로불린")는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질로 이루어진다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (또는 도메인) (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 "상보성 결정 영역" (CDR) 또는 "초가변 영역"으로 불리는, 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있는데, 이들은 주로 항원의 에피토프에의 결합을 담당하고, 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는, 더 보존된 영역이 산재된다. 항체의 경쇄 및 중쇄 내 CDR을 동정하고 이들의 서열을 결정하는 방법은 당업자에게 익히 알려져 있다. 의심의 소지를 없애기 위해, 본문에 반대되는 지시가 없는 한, CDR이라는 표현은 IMGT에 의해 정의되는 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역을 의미하고, 상기 IMGT 고유 넘버링은 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역인, CDR1-IMGT: 27 내지 38, CDR2의 표준화된 경계 (delimitation)를 제공한다.

IMGT 고유 넘버링은 항원 수용체, 사슬 유형, 또는 종이 무엇이든 가변 도메인을 비교하기 위해 정의되었다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. IMGT 고유 넘버링에서, 보존된 아미노산은 항상 동일한 위치, 예를 들어 시스테인 23 (1st-CYS), 트립토판 41 (보존적-TRP), 소수성 아미노산 89, 시스테인 104 (2nd-CYS), 페닐알라닌 또는 트립토판 118 (J-PHE 또는 J-TRP)을 갖는다. IMGT 고유 넘버링은 프레임워크 영역 (FR1-IMGT: 위치 1 내지 26, FR2-IMGT: 39 내지 55, FR3-IMGT: 66 내지 104 및 FR4-IMGT: 118 내지 128) 및 상보성 결정 영역: CDR1-IMGT: 27 내지 38, CDR2-IMGT: 56 내지 65 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117의 표준화된 경계를 제공한다. 갭은 비점유된 위치를 나타내므로, CDR-IMGT 길이 (대괄호 사이에 표시되고 점으로 구분됨, 예컨대 [8.8.13])는 중요한 정보가 된다. IMGT 고유 넘버링은 IMGT Colliers de Perles로 지정된, 2D 그래픽 표현 [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], 및 IMGT/3Dstructure-DB에서의 3D 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에 사용된다.

각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 효과기 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 상이한 이소형 (즉, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)일 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화된 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체 및 IgM 항체.

"다중클론 항체"는 하나 이상의 다른, 비-동일한 항체 중에서 또는 이들의 존재하에서 생산된 항체이다. 일반적으로, 다중클론 항체는 비-동일한 항체를 생산하는 몇몇 다른 B-림프구의 존재하에서 B-림프구로부터 생산된다. 일반적으로, 다중클론 항체는 면역화된 동물로부터 직접 수득된다.

용어 "단일클론 항체"는 거의 균질한 항체 집단으로부터의 항체를 지칭하며, 상기 집단은 최소한의 비율로 발견될 수 있는 소수의 가능한 자연-발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 포함한다. 단일클론 항체는 하이브리도마와 같은 단일 세포 클론의 성장으로부터 발생하고, 하나의 클래스 및 서브클래스의 중쇄 및 하나의 유형의 경쇄를 특징으로 한다.

항체의 "항원-결합 단편"이라는 표현은, 상기 항체의 표적 (또한 일반적으로 항원으로 언급됨), 일반적으로 동일한 에피토프에 결합하는 능력을 보유하고, 항체의 아미노산 서열의 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 10개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 20개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 40개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 50개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 60개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 70개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 80개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 90개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 100개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 125개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 150개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 175개의 연속 아미노산 잔기, 또는 적어도 200개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다.

특정 구현예에서, 상기 항원-결합 단편은 그로부터 이들이 유래하는 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 여전히 바람직한 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 그로부터 이들이 유래하는 항체의 2, 3, 4 또는 5개 CDRs, 더욱 바람직하게는 6개 CDRs을 포함한다.

"항원-결합 단편"은, 제한 없이, Fv, scFv (sc는 단쇄임), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아바디, 또는 XTEN (확장된 재조합 폴리펩티드) 또는 PAS 모티프와 같은 무질서화된 펩티드를 갖는 융합 단백질, 또는 폴리(에틸렌) 글리콜 ("페길화") (Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG 또는 Fab'-PEG로 불리는 페길화된 단편) ("PEG"는 폴리(에틸렌) 글리콜임)과 같은 폴리(알킬렌) 글리콜의 부가와 같은 화학적 변형에 의해, 또는 리포좀 내 도입에 의해 그의 반감기가 증가될 것인 임의의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 단편은 본 발명에 따른 항체의 특징적 CDR의 적어도 하나를 갖는다. 바람직하게는, 상기 "항원-결합 단편"은 그로부터 이들이 유래하는 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 부분 서열을 구성하거나 이들을 포함할 것이고, 상기 부분 서열은 그로부터 이들이 유래된 항체와 동일한 특이성 및, 바람직하게는 표적에 대해 그로부터 이들이 유래된 항체의 친화도의 적어도 1/100과 동일한, 더욱 바람직한 방식으로는 그의 적어도 1/10과 동일한 충분한 친화도를 보유하기에 충분하다.

또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 위암의 진단을 위한 방법에서, 대상체로부터의 생물학적 시료는 프로가스트린에 결합하는 항체와 접촉되고, 여기서 상기 항체는 당업자에게 공지된 면역화 방법에 의해 수득된 것이고, 면역원으로서 그의 아미노산 서열이 프로가스트린의 아미노산 서열의 전체 또는 부분을 포함하는 펩티드를 사용한다. 더욱 구체적으로, 상기 면역원은 하기 중에서 선택된 펩티드를 포함한다:

· 아미노산 서열이 전장 프로가스트린, 특히 서열번호: 1의 전장 인간 프로가스트린의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드,

· 아미노산 서열이 전장 프로가스트린, 특히 서열번호: 1의 전장 인간 프로가스트린의 아미노산 서열에 상응하는 펩티드,

· 아미노산 서열이 프로가스트린의 N-말단 부분의 일부 또는 전체 아미노산 서열에 상응하는 펩티드, 특히 SWKPRSQQPDAPLG (서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드, 및

· 아미노산 서열이 프로가스트린의 C-말단 부분의 일부 또는 전체 아미노산 서열에 상응하는 펩티드, 특히 QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드,

· 아미노산 서열이 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열의 일부에 상응하는 펩티드, 특히 프로가스트린의 아미노산 71-80에 상응하는 아미노산 서열 FGRRSAEDEN (서열번호: 40)을 포함하는 펩티드

당업자는 그러한 면역화가 원하는 바와 같이 다중클론 또는 단일클론 항체 중 하나를 생성하도록 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 유형의 항체 각각을 수득하는 방법은 당해 분야에 익히 알려져 있다. 따라서 당업자는 임의의 주어진 항원에 대한 다중클론 및/또는 단일클론 항체를 생성하기 위한 방법을 용이하게 선택하고 실행할 것이다.

인간 프로가스트린의 아미노산 서열 1-14 (N-말단 극단)에 상응하는, 아미노산 서열 "SWKPRSQQPDAPLG"를 포함하는 면역원을 사용하여 생성된 단일클론 항체의 예시에는, 하기 표 1 내지 4에 개시된 바와 같이, mAb3, mAb4, mAb16, 및 mAb19 및 mAb20으로 명명된 단일클론 항체가 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 단일클론 항체가 기술되어 있지만, 이들 항체가 실제로 프로가스트린에 결합하는지 여부는 명확하지 않다 (WO 2006/032980). 에피토프 맵핑의 실험적 결과에 따르면 mAb3, mAb4, mAb16, 및 mAb19 및 mAb20이 상기 hPG N-말단 아미노산 서열 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 서열번호: 2로 표시되는 프로가스트린의 N-말단 내부의 에피토프를 특이적으로 인식하는 다중클론 항체가 당해 분야에 기술되어 있다 (예컨대, WO 2011/083088 참조).

하이브리도마 기탁	mAb	아미노산 서열		서열번호:
6B5B11C10	mAb3	VH CDR 1	GYIFTSYW	서열번호: 4
		VH CDR 2	FYPGNSDS	서열번호: 5
		VH CDR 3	TRRDSPQY	서열번호: 6
		VL CDR 1	QSIVHSNGNTY	서열번호: 7
		VL CDR 2	KVS	서열번호: 8
		VL CDR 3	FQGSHVPFT	서열번호: 9

하이브리도마 기탁	mAb	아미노산 서열		서열번호:
20D2C3G2	mAb4	VH CDR 1	GYTFSSW	서열번호: 10
		VH CDR 2	FLPGSGST	서열번호: 11
		VH CDR 3	ATDGNYDWFAY	서열번호: 12
		VL CDR 1	QSLVHSSGVTY	서열번호: 13
		VL CDR 2	KVS	서열번호: 14
		VL CDR 3	SQSTHVPPT	서열번호: 15

하이브리도마 기탁	mAb	아미노산 서열		서열번호:
1E9D9B6	mAb16	VH CDR 1	GYTFTSYY	서열번호: 16
		VH CDR 2	INPSNGGT	서열번호: 17
		VH CDR 3	TRGGYYPFDY	서열번호: 18
		VL CDR 1	QSLLDSDGKTY	서열번호: 19
		VL CDR 2	LVS	서열번호: 20
		VL CDR 3	WQGTHSPYT	서열번호: 21

하이브리도마 기탁	mAb	아미노산 서열		서열번호:
1B3B4F11	mAb19	VH CDR 1	GYSITSDYA	서열번호: 22
		VH CDR 2	ISFSGYT	서열번호: 23
		VH CDR 3	AREVNYGDSYHFDY	서열번호: 24
		VL CDR 1	SQHRTYT	서열번호: 25
		VL CDR 2	VKKDGSH	서열번호: 26
		VL CDR 3	GVGDAIKGQSVFV	서열번호: 27

인간 프로가스트린의 아미노산 서열 55-80에 상응하는 아미노산 서열 "QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN" (프로가스트린의 C말단 부분)을 포함하는 면역원을 사용하여 생성될 수 있는 단일클론 항체의 예시에는 하기 표 5 및 6에서 mAb8 및 mAb13으로 지정된 항체가 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다. 에피토프 맵핑의 실험 결과에 따르면, mAb13이 상기 hPG C-말단 아미노산 서열 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.

하이브리도마 기탁	mAb	아미노산 서열		서열번호:
1C10D3B9	mAb8	VH CDR 1	GFTFTTYA	서열번호: 28
		VH CDR 2	ISSGGTYT	서열번호: 29
		VH CDR 3	ATQGNYSLDF	서열번호: 30
		VL CDR 1	KSLRHTKGITF	서열번호: 31
		VL CDR 2	QMS	서열번호: 32
		VL CDR 3	AQNLELPLT	서열번호: 33

하이브리도마 기탁	mAb	아미노산 서열		서열번호:
2C6C3C7	mAb13	VH CDR 1	GFIFSSYG	서열번호: 34
		VH CDR 2	INTFGDRT	서열번호: 35
		VH CDR 3	ARGTGTY	서열번호: 36
		VL CDR 1	QSLLDSDGKTY	서열번호: 37
		VL CDR 2	LVS	서열번호: 38
		VL CDR 3	WQGTHFPQT	서열번호: 39

다른 예시에는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 면역원을 사용하여 생성된 항-hPG 단일클론 및/또는 다중클론 항체가 포함된다.

더욱 특정한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법에서 상기 생물학적 시료는 항-hPG 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉하고, 상기 항-hPG 항체는 N-말단 항-hPG 항체 및 C-말단 항-hPG 항체 중에서 선택된다.

용어 "N-말단 항-hPG 항체" 및 "C-말단 항-hPG 항체"는 hPG의 N-말단 부분에 위치하는 아미노산을 포함하는 에피토프 또는 hPG의 c-말단 부분에 위치하는 아미노산을 포함하는 에피토프 각각에 결합하는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "N-말단 항-hPG 항체"는 그의 서열이 서열번호: 2로 표시되는 프로가스트린의 도메인에 위치하는 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 다른 바람직한 구현예에서, 용어 "C-말단 항-hPG 항체"는 그의 서열이 서열번호: 3으로 표시되는 프로가스트린의 도메인에 위치하는 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.

용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합된 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 부분집합이고 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 그러한 아미노산을 가지고 있다. 에피토프는 또한 입체형태적일 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹 분류인 결정인자를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 특정 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 항체에 의해 결합된 에피토프의 결정은 당업자에게 공지된, 임의의 에피토프 맵핑 기법에 의해 수행될 수 있다. 에피토프는 단백질의 아미노산 서열 내에 연속적으로 위치한 상이한 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 또한 단백질의 아미노산 서열 내에 연속적으로 위치하지 않은 아미노산을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단일클론 항체이다:

· 서열번호: 4, 5 및 6 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 4, 5 및 6 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 7, 8 및 9 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 7, 8 및 9 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 서열번호: 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10, 11 및 12 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 13, 14 및 15 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 서열번호: 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 16, 17 및 18 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 19, 20 및 21 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 서열번호: 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 22, 23 및 24 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 25, 26 및 27 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 서열번호: 28, 29 및 30 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 28, 29 및 30 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 31, 32 및 33 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 31, 32 및 33 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체, 및

· 서열번호: 34, 35 및 36 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 34, 35 및 36 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 37, 38 및 39 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 37, 38 및 39 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체.

본 발명의 측면에서, 핵산 또는 아미노산의 두 서열 사이의 "퍼센트 동일성" 또는 "% 동일성"은 최적 정렬 후 수득된, 비교되는 두 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미하고, 이 백분율은 순전히 통계적이며 두 서열 사이의 차이는 이들의 길이를 따라 무작위적으로 분포된다. 두 핵산 또는 아미노산 서열의 비교는 전통적으로 이들을 최적으로 정렬한 후 서열을 비교함으로써 수행되고, 상기 비교는 분절에 의해 또는 "정렬 창 (alignment window)"을 사용하여 수행할 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 수기에 의한 비교에 추가로, 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 나타내는 아미노산 서열의 경우, 바람직한 예시는 기준 서열, 특정 변형, 특히 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환, 절단 또는 연장을 함유하는 것들이 포함된다. 하나 이상의 연속적 또는 비-연속적 아미노산의 경우, 치환된 아미노산이 "동등한" 아미노산으로 대체되는 치환이 바람직하다. 여기서, "동등한 아미노산"이라는 표현은 상응하는 항체 및 하기에 정의된 그러한 특정 예시의 생물학적 활성을 변형하지 않으면서 구조적 아미노산의 하나를 치환할 수 있는 임의의 아미노산을 나타내는 것을 의미한다.

동등한 아미노산은 이들이 치환되는 아미노산과 이들의 구조적 상동성 또는 생성될 수 있는 다양한 항체들 사이의 생물학적 활성의 비교 시험 결과에 따라 결정될 수 있다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 항체는 인간화된 항체이다.

본원에 사용된 바와 같이, "인간화된 항체"라는 표현은 비인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 영역을 함유하고, 상기 항체 분자의 다른 부분은 하나 또는 몇몇 인간 항체로부터 유래한 것인 항체를 의미한다. 또한, 골격 분절 잔기의 일부 (프레임워크, FR로 불림)는 당업자에게 공지된 기법에 따라서 결합 친화도를 보존하도록 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986). 인간화의 목적은 항체의 전체 항원 결합 친화도 및 특이성을 유지하면서, 인간으로의 도입을 위해, 뮤린 항체와 같은 이종 항체의 면역원성의 감소이다.

본 발명의 인간화된 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, Singer et al., J. Immun., 150: 2844-2857, 1992에 기술된 것들). 이러한 인간화된 항체는 시험관 내 진단 또는 생체 내 예방 및/또는 치료적 처치를 비롯한 방법에서의 이들의 용도에 바람직하다. 다른 인간화 기법이 또한 당업자에게 공지되어 있다. 실제로, 항체는 CDR-그라프팅 (EP 0　451　261; EP 0　682　040; EP 0　939　127; EP 0　566　647; US 5,530,101; US 6,180,370; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,639,641; US 6,054,297; US 5,886,152; 및 US 5,877,293), 베니어링 (veneering) 또는 리서피싱 (resurfacing) (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 91: 969-973), 및 사슬 셔플링 (U.S. Pat. No. 5,565,332)을 포함하는 다양한 기법을 이용하여 인간화될 수 있다. 인간 항체는 파아지 디스플레이 방법을 비롯해 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 U.S. Pat. Nos. 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 및 5,814,318; 및 국제특허출원공개 번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.

더욱 특정한 구현예에서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 인간화된 항체이고:

· 서열번호: 4, 5 및 6 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 4, 5 및 6 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 7, 8 및 9 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 7, 8 및 9 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체,

· 서열번호: 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10, 11 및 12 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 13, 14 및 15 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체,

· 서열번호: 16, 17 및 18의아미노산 서열 각각, 또는 서열번호: 16, 17 및 18 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 19, 20 및 21 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체,

· 서열번호: 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 22, 23 및 24 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 25, 26 및 27 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체,

· 서열번호: 28, 29 및 30 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 28, 29 및 30 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 31, 32 및 33 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 31, 32 및 33 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체, 및

· 서열번호: 34, 35 및 36 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 34, 35 및 36 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 37, 38 및 39 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 37, 38 및 39 각각의 서열과의 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 적어도 1개, 선호적으로 적어도 2개, 선호적으로 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체.

여기서 상기 항체는 또한 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 포함한다.

제1 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 생물학적 시료를 hPG의 에피토프에 결합하는 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 에피토프는 hPG의 C-말단 부분 내에 위치하거나 또는 hPG의 N-말단 부분 내에 위치한다.

보다 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 생물학적 시료를 hPG의 에피토프에 결합하는 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 에피토프는 hPG의 아미노산 10 내지 14, hPG의 아미노산 9 내지 14, hPG의 아미노산 4 내지 10, hPG의 아미노산 2 내지 10 및 hPG의 아미노산 2 내지 14에 상응하는 아미노산 서열 중에서 선택된 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, hPG의 아미노산 서열은 서열번호: 1이다.

보다 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 생물학적 시료를 hPG의 에피토프에 결합하는 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 에피토프는 hPG의 아미노산 71 내지 74, hPG의 아미노산 69 내지 73, hPG의 아미노산 71 내지 80 (서열번호: 40), hPG의 아미노산 76 내지 80 및 hPG의 아미노산 67 내지 74에 상응하는 아미노산 서열 중에서 선택된 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, hPG의 아미노산 서열은 서열번호: 1이다.

제1 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 프로가스트린의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 항체를 포함한다.

보다 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 프로가스트린의 에피토프를 인식하는 항체를 포함하고, 상기 에피토프는 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 hPG의 잔기 10 내지 14, hPG의 잔기 9 내지 14, hPG의 잔기 4 내지 10, hPG의 잔기 2 내지 10 또는 hPG의 잔기 2 내지 14를 포함할 수 있고, hPG의 아미노산 서열은 서열번호: 1이다.

보다 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 프로가스트린의 에피토프를 인식하는 항체를 포함하고, 상기 에피토프는 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 hPG의 잔기 71 내지 74, hPG의 잔기 69 내지 73, hPG의 잔기 71 내지 80 (서열번호: 40), hPG의 잔기 76 내지 80 또는 hPG의 잔기 67 내지 74를 포함할 수 있고, hPG의 아미노산 서열은 서열번호: 1이다.

본 발명에 따른 위암의 시험관 내 진단을 위한 방법의 특정 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 시료를 프로가스트린의 제1 부분에 결합하는 제1 분자 및 프로가스트린의 제2 부분에 결합하는 제2 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 더욱 특정한 구현예에서, 상기 프로가스트린-결합 분자가 항체인 경우, 대상체로부터의 생물학적 시료는 프로가스트린의 제1 에피토프에 결합하는 항체 및 프로가스트린의 제2 에피토프에 결합하는 제2 항체와 접촉한다.

바람직한 구현예에서, 위암의 진단을 위한 본 발명의 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린의 검출을 포함한다.

더욱 바람직한 구현예에서, 위암의 진단을 위한 본 발명의 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린의 농도 결정을 포함한다.

또 다른 특정 구현예에서, 위암의 진단을 위한 본 발명의 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 시료에서 프로가스트린의 농도 검출을 포함하고, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청 및 혈장으로부터 선택된다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기에 기술된 바와 같이 대상체로부터의 시료를 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 시료에서 상기 항-hPG 항체의 결합은 상기 대상체에서 위암의 존재를 나타낸다.

더욱 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기에 기술된 바와 같이 상기 대상체로부터의 시료를 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 혈장 내 10 pM을 능가하는 프로가스트린의 농도는 상기 대상체 내 위암의 존재를 나타낸다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기에 기술된 바와 같이 상기 대상체로부터의 시료를 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 시료 내 10 pM, 20 pM, 30 pM 또는 40 pM을 능가하는 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 위암의 존재를 나타낸다.

더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기에 기술된 바와 같이 상기 대상체로부터의 시료를 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 시료 내 10 pM, 바람직하게는 20 pM, 더욱 바람직하게는 30 pM, 더욱 더 바람직하게는 40 pM, 더 더욱 바람직하게는 50 pM을 능가하는 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 전이된 위암의 존재를 나타낸다

본 발명은 또한 위암에 대한 치료 전에 환자로부터 수득된, 위암의 체액 또는 생검과 같은 제1 시료에서 프로가스트린의 농도를 결정하고, 이어서 제1 시료 내 프로가스트린의 농도를 치료 후 동일한 환자로부터 수득된 제2 시료에서의 농도와 비교함으로써, 화학요법, 생물학적 요법, 면역요법 또는 항체 요법과 같은, 환자에서 위암에 대한 치료의 효능을 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 제1 시료 대비 제2 시료에서의 프로가스트린 농도의 감소는 이 치료가 효과적이었음을 나타낸다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도를 시료 내 프로가스트린의 농도의 미리 결정된 수치와 비교하는 것을 포함하고, 더욱 특정한 구현예에서, 상기 미리 결정된 수치는 위암이 없는 집단에서의 수치의 평균 (mean) 또는 평균 (average) 결정에 근거한 시료 수치의 평균 또는 평균, 환자가 위암을 갖지 않는 것으로 알려진 경우에 수득된 프로가스트린 농도 수치 중에서 선택된다.

특정 구현예에서, 위암의 시험관 내 진단을 위한 본 발명에 따른 방법은 상기 환자로부터의 시료에서 프로가스트린의 농도 결정 및 위암의 제2 진단 테스트를 포함한다. 더욱 특정한 구현예에서, 위암의 시험관 내 진단을 위한 본 발명에 따른 방법은 상기 환자로부터의 시료 내 프로가스트린의 농도 결정 및 위암의 제2 진단 테스트를 포함하고, 여기서 상기 제2 진단 테스트는: 펩시노겐, 그렐린, 트레포일 인자 3 (TFF3) 및 순환하는 GC-연관 항원 (MG7-Ag) (Leja et al, 2014) 중에서 선택된 특정 바이오마커의 검출을 포함한다.

본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 위암에 대해 치료되었거나 치료 중인 환자로부터의 시료에서 시간의 경과에 따른 프로가스트린의 수준 결정을 포함한다.

두 번째 양태에서, 본 발명의 청구 대상은 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체 조성물은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 비경구, 경막내, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 주입 또는 볼루스 투여를 포함하는 다양한 경로에 의한 투여를 위해, 이로 제한되는 것은 아니지만, 수성 현탁액을 포함하는 상이한 제형으로서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 비경구 투여용으로 제제화되고, 일부 특정 구현예에서, 주입에 의한 정맥내 주사용으로 제제화된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은 0.001 mg/kg 내지 약 250 mg/kg 범위의 본 발명의 항-프로가스트린 항체의 유효 용량을 포함하고, 이는 단일 투여에 의해, 또는 간격을 둔 다수의 투여에 걸쳐서 주어질 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 카멜화된 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체 및 IgM 항체 중에서 선택되는 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기에 기술된 것들이다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 인간화된 항체이다.

더욱 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은, 상기에 기술된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5000 nM, 적어도 500 nM, 100 nM, 80 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 또는 적어도 0.1 pM의 프로가스트린에 대한 친화도를 갖는 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

더욱 더 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은 프로가스트린-결합 항체를 포함하고, 상기 프로가스트린-결합 분자, 또는 이의 항원-결합 단편은 중화 항체이다.

"중화 항-PG 항체"라는 표현은 PG에 결합하여 PG-의존적 신호전달을 차단함으로써, 종양 세포, 특히 위 종양 세포에서 PG-유도성 반응의 저해를 초래하는 항체를 지칭한다. 위암 세포의 PG-유도성 반응의 저해는 세포 분화의 억제, 세포 사멸의 억제, 및/또는 세포 증식의 자극에 의해 매개될 수 있다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은 프로가스트린-결합 항체를 포함하고, 상기 프로가스트린-결합 분자, 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된 항체이다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은 프로가스트린-결합 항체를 포함하고, 상기 프로가스트린-결합 분자, 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 분자에 접합된다.

또 다른 특정 구현예에서, 환자에서 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물은 프로가스트린-결합 항체를 포함하고, 상기 환자는 본 발명에 따른 방법에 의해 위암으로 진단되었고, 프로가스트린의 농도는 기준 시료에서의 것보다 상기 환자로부터의 생물학적 시료에서 더 높다.

더 특정한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 N-말단 항-프로가스트린 항체 및 C-말단 항-프로가스트린 항체 중에서 선택된다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물은 상기에 기술된 바와 같은 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

더 특정한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 항-프로가스트린 항체는 0.001 mg/kg 내지 250 mg/kg의 용량으로, 바람직하게는 적어도 0.005 mg/kg, 적어도 0.01 mg/kg, 적어도 0.05 mg/kg, 적어도 0.1 mg/kg, 적어도 0.5 mg/kg, 적어도 1 mg/kg, 적어도 5 mg/kg, 적어도 10 mg/kg, 적어도 50 mg/kg 또는 적어도 100 mg/kg의 용량으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물, 및 항암 치료적 분자를 포함하는 부품의 키트에 관한 것이다.

실제로, 본원에 기술된 바와 같이 항-PG 단일클론 항체를 이용한 치료는 다른 요법과 조합되거나 또는 그에 대해 보조적일 수 있다. 다른 요법의 비-제한적인 예시에는 화학요법 치료, 방사선 요법, 외과적 절제 및 항체 요법이 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물, 및 화학요법 분자, 표적 요법 분자 중에서 선택된 항암 치료적 분자를 포함하는 부품의 키트에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 위암의 치료를 위한 조성물 및 화학요법 분자를 포함하는, 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한, 부품의 키트에 관한 것이다. 이 목적에 유용한 화학요법 분자에는 폴레이트 길항제, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, DNA 알킬화 분자, DNA 가교-결합 약물, 항생제, 백금 복합체, 프로테오솜 저해제, 유사분열 방추 독 (mitotic spindle poisons), 토포이소머라제 저해제, 티로신 키나제 저해제 및 기타가 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.

다른 특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 및 또 다른 표적 요법 분자를 포함하는 조성물을 포함하는, 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한, 부품의 키트에 관한 것이다. 이러한 표적 요법 분자에는 세툭시맙 또는 파니투무맙과 같은 EGFR을 표적하는 항체, 베바시주맙과 같은 VEGF를 표적하는 항체, 트라스트주맙 또는 퍼투주맙과 같은 HER2를 표적하는 항체, 펨브롤리주맙과 같은 PD-1 및 PDL-1을 표적하는 항체, 이필리무맙과 같은 CTLA-4를 표적하는 항체, 에를로티닙과 같은 EGFR을 표적하는 소분자 약물, 베무라페닙 또는 다브라페닙과 같은 BRAF를 표적하는 소분자 약물, 아플리베르셉트와 같은 VEGF를 표적하는 재조합 융합 단백질이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 위암의 진단을 위한 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 위암의 예방 또는 치료를 위한 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.

더 특정한 양태에서, 본 발명은 환자에서 위암의 예방 또는 치료를 위한 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것으로, 상기 환자의 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도가 결정되었고 기준 생물학적 시료의 프로가스트린의 농도보다 더 높다.

더 특정한 양태에서, 환자에서 위암의 예방 또는 치료를 위한 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것으로, 상기 환자는 전이를 나타낸다.

더욱 더 특정한 양태에서, 본 발명은 환자에서 위암의 예방 또는 치료를 위한 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것으로, 상기 환자는 전이를 나타내고 상기 환자의 생물학적 시료 내 프로가스트린의 농도가 결정되었고 기준 생물학적 시료의 프로가스트린의 농도보다 더 높다.

조합을 구성하는 구성성분은 그 조합의 최대 효능을 달성하기 위해 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여될 수 있고; 이는 각각의 투여에 대해 신속 투여에서 연속 관류까지 그의 지속 시간에서 달라질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "동시 투여"는 단일의 독특한 약제학적 형태로 조성물의 두 화합물의 투여를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "개별 투여"는 동시에 별개의 약제학적 형태로 본 발명에 따른 조성물의 두 화합물의 투여를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "순차 투여"는 별개의 약제학적 형태로 본 발명에 따른 조성물의 두 화합물의 연속적 투여를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"은 질병의 증상을 예방, 완화, 감소 또는 개선하거나 치료되는 환자의 생존을 연장하는데 효과적인 화합물 (또는 화합물들)의 최소 농도를 지칭한다.

본 발명의 구현예의 특징이 하기에 후술되는 실시예의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1: 위암 환자 (n=15), 및 대조군 환자 (n=103)에서 프로가스트린의 중앙 혈장 농도 - 만 휘트니 양측 검정, ** p<0.001
도 2: 초-저 부착 조건에서 대조군 (CT Hz) 또는 항-PG 인간화된 항체 (PG Hz)로의 처리 후 형성된 AGS 구의 개수 - 양측 t-검정, * p<0.05.

실시예

실시예 1: 다중클론 항체를 사용한 혈장 프로가스트린 농도의 검출

혈장 프로가스트린 수준을 2개의 특이적 항-프로가스트린 항체의 사용을 통해 ELISA에 의해 정량하였다: 포획 항체는 플레이트의 웰 상에 코팅되는 반면, 발현 항체 (revelation antibody)는 프로가스트린을 검출하고 신호의 발현을 매개하기 위해 사용된다.

본 실시예에서, 정량은 그의 반응이 빛을 방출하는 기질의 사용을 통해, 포획 항체에 의해 보유된 항원에 결합된 항체의 발광 양에 비례하는 값의 부여를 가능케 하는 ELISA 방법을 토대로 한다.

재료

시료 및 장치는 표 7에 열거된다:

명칭	공급자	참조
Plates MaxiSORP white Nunc, 96 웰	Dutscher	# 055221
소디움 카보네이트/바이카보네이트	Sigma	# 21851
DPBS 1×	Lonza	# P04-36500
트윈-20	Biosolve	# 20452335
BSA	Euromedex	# 04-100-810-C
스트렙타비딘-HRP	Pierce (Thermo)	# 21130
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Pierce (Thermo)	# 37074
항-프로가스트린 다중클론 항체	Eurogentec	/

표준 프로토콜에 따라서 N-말단 프로가스트린 (서열번호: 2) 또는 hPG의 아미노산 71 내지 80에 상응하고 서열 FGRRSAEDEN (서열번호: 40)을 갖는 C-말단 프로가스트린으로 토끼를 면역화하여 다중클론 항체를 수득하였다.

이 분석에 사용된 프로가스트린에 대한 다중클론 항체의 결합 특성은 다음과 같다: G34-Gly, G34, G17-Gly, G17에 대한 결합, 전장 프로가스트린에 대한 결합 부재.

한 캡슐 용량을 100 ml의 MilliQ 워터에 용해시켜 카보네이트 - 소디움 바이카보네이트의 용액 (50 mM, pH 9.6)을 제조하여 96웰 플레이트를 코팅하였다. 프로가스트린의 C-말단 FGRRSAEDEN (서열번호: 40)을 사용하여 수득된 다중클론 항체에 상응하는 포획 항체 (3 μg /ml)의 용액을 탄산염 완충제 중에 제조한다. 100 μl의 항체 용액을 각 웰에 첨가하고 4℃에서 16시간 (하룻밤) 동안 인큐베이션하였다. 그 후에 항체 용액을 제거함으로써 플레이트를 차단하고 300 μl 1× PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척한 후, 웰당 200 μl의 차단 완충제 (1× PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA)를 첨가하고, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 완충제를 그 후에 제거하고, 웰을 300 μl 1× PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척하였다.

혈장 희석을 다음과 같이 수행한다: 1/2, 1/5 및 1/10로 희석된 순수한 혈장을 사용한다. 1× PBS / 0.1% 트윈 20 / 0.1% BSA 중의 순수한 혈장으로부터 희석액을 제조한다.

대조군 시험을 위해, 프로가스트린의 공지의 농도가 존재하는 ELISA에서, 프로가스트린 희석액을 다음과 같이 준비한다: 스톡 재조합 PG (대장균에서 생산된 전장 인간 프로가스트린 및 글루타치온 아가로스/Tag 제거 (Tev)/IMAC 대조 정제/투석으로 정제된 친화도, Institut Pasteur, Paris, France)를 3회 반복으로 0.45 mg/ml (45 μM)의 농도로 준비한다. 프로가스트린 농도의 범위는 다음과 같이 제조하였다:

- 용액 A: 전-희석 1/10, 2 μl의 스톡 + 18 μl의 완충제

- 용액 B: 전-희석 1/100, 10 μl의 A + 90 μl의 완충제

- 용액 C: 전-희석 1/1000, 10 μl의 B + 90 μl의 완충제

- 용액 D: 500 pM, 5,55 μl의 C + 494.5 μl의 희석액

- 용액 E: 250 pM, 250 μl의 D + 250 μl의 희석액

- 용액 F: 100 pM, 200 μl의 E + 300 μl의 희석액

- 용액 G: 50 pM, 250 μl의 F + 250 μl의 희석액

- 용액 H: 25 pM, 200 μl의 G + 200 μl의 희석액

- 용액 I: 10 pM, 100 μl의 H + 150 μl의 희석액

재조합 PG의 범위는 선형이고, 이에 사용된 항체에 따라서 다소 포괄적일 수 있다.

시험 시료의 제조를 위해, 대략 500 μl의 각 시료를 별도로 설정하고 결과의 분석 (및 필요하다면 확인) 전까지 보관한다. 범위 및/또는 혈장의 각 시점의 100 μl를 순수하게 분석하고, 1/2, 1/5 및 1/10로 희석하고, 플레이트 상에서 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다.

시험의 발현을 위해, 플레이트를 300 μl 1× PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척한다. 항체가 면역원으로서 프로가스트린의 N-말단 부분을 사용하여 수득되었고, 0.5 μg/ml로 비오틴에 결합된 것인, 다중클론 토끼 항-프로가스트린 항체의 용액을 1× PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA 중에 희석하여 제조한다. 100 μl의 이 용액을 각 웰에 첨가한다. 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행한다. 검출 항체를 제거함으로써 스트렙타비딘-HRP를 이용한 발현을 수행하고 300 μl 1× PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척한 후, 1× PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA로 희석된 20 ng/ml의 스트렙타비딘-HRP의 용액을 제조한다. 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하기 전에 이 용액 100 μl를 각 웰에 첨가한다.

검출은 스트렙타비딘-HRP를 제거하고 300 μl 1× PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척한 후, 웰당 100 μl의 화학발광 기질 용액을 첨가하는 것으로 이루어진다. 사용 전에 30분간 동일 부피의 2개 용액, SuperSignal ELISA Femto 키트, 20 ml + 20 ml을 혼합하여 기질 용액을 제조하고, 어두운 곳에서 실온 보관한다. 어두은 곳에서 5분간의 실온 인큐베이션 후 발광을 판독한다.

각 조건에 대해서, 시험을 3회 반복 실시하고 범위의 결과는 프로가스트린 농도에 따른 발광의 변화를 보여주는 그래프로 제시될 것이다. 각 혈장 희석에 대해서, 상응하는 범위의 선형 회귀 분석선의 방정식 (1 / 10th로 희석된 시료의 경우 범위 1 / 10th)을 사용하여 프로가스트린의 농도가 결정된다.

방법 및 결과

위암을 갖는 환자 (n = 15)에서 프로가스트린의 중앙 혈장 농도는 17.9 pM인 반면, 대조군 환자 (n = 103)에서 프로가스트린의 중앙 혈장 농도는 0 pM이다 (도 1). 이들 데이터는 위암을 갖는 환자가 건강한 대조군 개인에 비해 그들의 혈장에 더 높은 수준의 프로가스트린을 가짐을 입증한다.

이들 데이터는 위암을 갖는 환자가 건강한 대조군 개인에 비해 그들의 혈장에 더 높은 수준의 프로가스트린을 가짐을 입증한다.

실시예 2: 단일클론 항-프로가스트린 항체를 사용한 프로가스트린 농도의 검출

Nunc MaxiSORP 96-웰 플레이트의 웰을 다음과 같이 제1 프로가스트린-특이적 항체로 코팅한다. 프로가스트린의 카르복시 말단 영역에 특이적인 항-프로가스트린 단일클론 항체를 MilliQ 워터 중의 50 mM, pH 9.6 소디움 카보네이트/바이카보네이트 완충제의 용액 중에 3 μg/ml의 농도로 희석한다.

그 후에 총 100 μl의 항체 용액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 결합 후, 항체 용액을 웰로부터 제거한 후, 이를 100 μl 세척 완충제 (1× PBS / 0.1% 트윈-20)으로 3회 세척한다. 총 100 μl의 차단 완충제 (1× PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA)를 이어서 각 웰에 첨가하고 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 그 후에 차단 완충제를 제거하고 웰을 세척 완충제로 3회 세척한다. 이어서 환자로부터 단리된 혈장 또는 혈청 시료를 일련의 희석, 전형적으로 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10 희석에서 100 μl의 부피로 각 웰에 첨가한 후, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 혈장 또는 혈청 시료를 2회 반복 분석한다.

분석은 또한 2개의 표준 곡선을 포함한다. 제1 표준 곡선은 웰당 1 ng, 0.5 ng, 0.25 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.01 ng, 및 0 ng의 최종 양으로 재조합 프로가스트린의 희석액을 사용하여 작성된다. 음성 대조군으로 제공되는, 제2 표준 곡선은 시험 시료와 동일한 희석으로, 즉 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10으로 차단 완충제 중에 희석된 프로가스트린-음성 인간 혈청으로부터 작성된다. 대안적으로, 혈장 시료가 분석되는 경우, 음성 대조군으로 제공되는, 제2 표준 곡선은 시험 시료와 동일한 희석으로, 즉 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10으로 차단 완충제 중에 희석된 프로가스트린-음성 인간 혈장으로부터 작성된다.

혈장 또는 혈청 시료와의 인큐베이션이 종료한 후, 웰 내용물을 제거하고 웰을 100 μl/웰의 세척 완충제로 3회 세척하고, 그 후 제1 항체에 결합된 프로가스트린을 하기와 같이, 프로가스트린에 특이적인 제2 항체를 사용하여 검출한다.

프로가스트린의 아미노-말단 영역에 특이적인 비오틴-결합 항-프로가스트린 단일클론 항체를, 항체에 따라서, 0.1 내지 10 μl g/ml의 농도로 차단 완충제 중에 희석한다. 그 후에 총 100 μl의 항체 용액을 각 웰에 첨가하고 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.

제2 항체 결합이 종료한 후, 플레이트를 100 μl/웰의 세척 완충제로 3회 세척하고, 그 후에 100 μl의 스트렙타비딘-HRP 용액 (차단 완충제 중 25 ng/ml)을 각 웰에 첨가하고 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 스트렙타비딘-HRP 용액과의 인큐베이션이 종료한 후, 플레이트를 100 μl/웰의 세척 완중제로 3회 세척한다. 그 후에, Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Chemiluminescent Substrate 키트를 사용하여 준비된 100 μl의 화학발광 기질을 각 웰에 첨가하고, 어두운 곳에서 5분간 실온 인큐베이션한 후, 발광분석기 (luminometer) 상에서 판독한다.

발광분석기 판독에 기초하여, 선형 회귀 분석을 사용해 표준 곡선 데이터에 상응하는 방정식을 도출한다. 이 방정식을 이용하여, 다양한 환자 시료 내 프로가스트린의 농도를 계산한다.

프로가스트린의 중앙 혈장 농도를 위암을 갖는 환자에서 계산하고 대조군 환자의 혈장 내 프로가스트린의 중앙 혈장 농도와 비교한다. 이들 데이터는 위암을 갖는 환자가 건강한 대조군 개인에 비해 그들의 혈장에 증가된 수준의 프로가스트린을 가짐을 입증한다.

실시예 3: 암 세포주에 대한 항-hPG 항체의 중화 활성

3.1. 항-hPG 단일클론 항체의 중화 활성

KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1은 위암 연구에 통상적으로 사용되는 세포주로서, 프로가스트린을 생산하여 분비한다. PG에 대한 단일클론 항체를 이들 상이한 세포주에서 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험한다. 상이한 항-hPG 단일클론 항체를 사용하여 각 KATO-III, AGS, MGC-803 및 SNU-1 세포주로부터의 세포 생존을 시험한다.

각 실험에 대해, 50,000개 세포를 송아지 태아 혈청을 함유하는 배지 중의 6-웰 플레이트에 접종하고 8시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 밤새 혈청-고갈시키고, 접종 (시점 "T0") 후 24시간째에 염색하고, 세포를 송아지 태아 혈청의 부재하에서, 6회 반복하여 매 12시간마다 48시간 동안 1 내지 20 μg/ml의 단일클론 대조군 항체 (단일클론 항체 항-퓨로마이신) (CT mAb), 또는 1 내지 20 μg/ml 항-hPG mAb로 처리하고, 이때 상기 mAb는 C-말단 항-hPG 단일클론 항체 또는 N-말단 항-hPG 단일클론 항체이다.

상기 mAb는 하기 중에서 선택되는 C-말단 항-hPG 항체이거나:

- 서열번호: 28, 29 및 30의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 31, 32 및 33의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,

- 서열번호: 34, 35 및 36의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 37, 38 및 39의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.

또는 하기 중에서 선택되는 N-말단 항-hPG 항체이다:

- 서열번호: 4, 5 및 6 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 7, 8 및 9의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

- 서열번호: 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,

- 서열번호: 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,

- 서열번호: 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.

각 실험에 대해, 대조군 웰에서 T0에서 세포의 수를 계수한다.

구체적으로, 대조군 및 항-hPG mAb 처리된 웰 둘 다에서 살아 있는 세포의 수를 48시간째에 계수한 후, 각 세포 계수 및 T0에서 결정된 세포 계수 사이의 차이를 계산한다. 그 후에 항-hPG mAb-처리된 세포의 결과 수를 대조군 mAb-처리된 세포의 수의 백분율로서 표시한다.

항-hPG 단일클론 항체로의 처리는 대조군 항체로의 처리에 비해 세포 수를 감소시킨다. Tukey 사후 (post-hoc) 검정을 이용한 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 사용해 통계학적 유의성을 결정한다: * = p<0.05, ** = p<0.01, 및 *** = p<0.001. 각 세포주에서, 항-hPG 항체는 세포 생존을 감소시킨다.

3.2. 세포 생존에 대한 항-hPG 인간화된 항체의 중화 활성

PG에 대한 인간화된 항체를 KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1 세포주의 증식을 저해하는 이들의 능력에 대해 시험한다. 각각의 KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1 세포주로부터의 세포 생존을 상이한 항-hPG 인간화된 항체를 사용하여 시험한다.

각 실험에 대해, 50,000개 세포를 송아지 태아 혈청을 함유하는 배지 중의 6-웰 플레이트에 접종하고 8시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 밤새 혈청-고갈시키고, 접종 (시점 "T0") 후 24시간째에 염색하고, 세포를 송아지 태아 혈청의 부재하에서, 6회 반복하여 매 12시간마다 48시간 동안 1 내지 20 μg/ml의 인간화된 대조군 항체 (항-인간 FcG1, BioXCell) (CT Hz), 또는 1 내지 20 μg/ml 항-hPG Hz로 처리하고, 이때 상기 Hz는 C-말단 항-hPG 인간화된 항체 또는 N-말단 항-hPG 인간화된 항체이다. 각 실험에 대해, 대조군 웰에서 T0에서 세포의 수를 계수한다.

구체적으로, 대조군 및 항-hPG Hz 처리된 웰 둘 다에서 살아 있는 세포의 수를 48시간째에 계수한 후, 각 세포 계수 및 T0에서 결정된 세포 계수 사이의 차이를 계산한다. 그 후에 항-hPG Hz-처리된 세포의 결과 수를 대조군 mAb-처리된 세포의 수의 백분율로서 표시한다.

항-hPG Hz 항체로의 처리는 대조군 항체로의 처리에 비해 세포 수를 감소시킨다. Tukey 사후 검정을 이용한 일원배치 분산분석을 사용해 통계학적 유의성을 결정한다: * = p<0.05, ** = p<0.01, 및 *** = p<0.001. 각 세포주에서, 항-hPG 항체는 세포 생존을 감소시킨다.

3.3. 암 줄기세포 빈도에 대한 항-hPG 단일클론 항체의 중화 활성

PG에 대한 단일클론 항체를 KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1 세포주에서 암 줄기세포 (CSC)의 빈도를 감소시키는 이들의 능력에 대해 극도 제한 희석 분석 (Extreme Limiting Dilution Assay, ELDA)을 이용해 시험한다. 각각의 KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1 세포주로부터의 CSC 빈도를 상이한 항-hPG 단일클론 항체를 사용하여 시험한다.

각 실험에 대해, 세포를 FACS Aria 유동 세포계측기를 사용해 웰당 고정된 세포 농도로 초-저 부착 (ULA) P96 (96-웰 플레이트)에 접종하고, 웰당 1 내지 500개의 농도 범위를 사용한다. 세포를 M11 배지 함유 ULA 플레이트에서 최대 11일간 배양하고 (Macari et al, Oncogene, 2015) 1 내지 20 μg/ml의 단일클론 대조군 항체 (단일클론 항체 항-퓨로마이신) (CT mAb), 또는 1 내지 20 μg/ml의 항-hPG mAb으로 매 3일 또는 4일마다 처리하고, 이때 상기 mAb는 C-말단 항-hPG 단일클론 항체 또는 N-말단 항-hPG 단일클론 항체이다.

구체적으로, 인큐베이션 시기의 말기에, 플레이트를 위상차 현미경으로 관찰하고 세포 농도당 양성 웰의 수를 평가한다. 마지막으로, ELDA 웹툴 (http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)을 사용하여 각 처리군의 CSC 빈도를 계산하고 그룹 사이의 임의의 통계적 차이를 시험한다 (변형된 카이-제곱 점정).

항-hPG 단일클론 항체로의 처리는 대조군 항체로의 처리에 비해 CSC 빈도를 감소시킨다.

3.4. 암 줄기세포 빈도에 대한 항-hPG 인간화된 항체의 중화 활성

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구 형성 분석

PG에 대한 인간화된 항체를 KATO-III, AGS, 및 SNU-1 세포주에서 암 줄기세포 (CSC)의 빈도를 감소시키는 이들의 능력에 대해 구 형성 분석을 이용해 시험한다.

각 실험에 대해, 700개 세포를 24-웰 초-저 부착 (ULA)에 접종한다. 세포를 M11 배지 함유 ULA 플레이트에서 최대 7일간 배양하고 (Macari et al, Oncogene, 2015) 매 3일 또는 4일마다 20 μg/ml의 인간화된 대조군 항체 (항-인간 FcG1, BioXCell) (CT Hz), 또는 20 μg/ml의 항-hPG Hz (PG Hz)로 처리하고, 이때 상기 Hz는 C-말단 항-hPG 인간화된 항체 또는 N-말단 항-hPG 인간화된 항체이다.

구체적으로, 인큐베이션 시기의 말기에, 명시야 현미경으로 웰의 사진을 찍고, 그 사진을 분석하여 25 μm 초과의 평균 직경을 갖는 구를 계수한다.

항-hPG 인간화된 항체로의 처리는 대조군 항체로의 처리에 비해 CSC 빈도를 감소시킨다.

극도 제한 희석 분석

PG에 대한 인간화된 항체를 KATO-III, AGS 및 MGC-803세포주에서 암 줄기세포 (CSC)의 빈도를 감소시키는 이들의 능력에 대해 극도 제한 희석 분석 (ELDA)을 이용해 시험한다. 각각의 KATO-III, AGS 및 MGC-803 세포주로부터의 CSC 빈도를 상이한 항-hPG 인간화된 항체를 사용하여 시험한다.

각 실험에 대해, 세포를 FACS Aria 유동 세포계측기를 사용해 웰당 고정된 세포 농도로 초-저 부착 (ULA) P96 (96-웰 플레이트)에 접종하고, 웰당 1 내지 500개의 농도 범위를 사용한다. 세포를 M11 배지 함유 ULA 플레이트에서 최대 11일간 배양하고 (Macari et al, Oncogene, 2015) 1 내지 20 μg/ml의 인간화된 대조군 항체 (항-인간 FcG1, BioXCell) (CT Hz), 또는 1 내지 20 μg/ml의 항-hPG Hz로 매 3일 또는 4일마다 처리하고, 이때 상기 Hz는 C-말단 항-hPG 인간화된 항체 또는 N-말단 항-hPG 인간화된 항체이다.

3.5. WNT/β-카테닌 경로에 대한 항-hPG 단일클론 항체의 중화 활성

KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1은 위암 연구에 통상적으로 사용되는 세포주로서, 프로가스트린을 생산하여 분비한다. PG에 대한 단일클론 항체를 판독 (read-out)으로서, 익히-알려진 WNT/β-카테닌 경로 표적 유전자인, 단백질 서비빈의 발현을 이용해 이들 상이한 세포주에서 WNT/β-카테닌 경로를 저해하는 이들의 능력을 시험한다. 각 KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1 세포주로부터의 서비빈 발현을 상이한 항-hPG 단일클론 항체를 사용하여 시험한다.

각 실험에 대해, 50,000개 세포를 송아지 태아 혈청을 함유하는 배지 중의 6-웰 플레이트에 접종하고 8시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 밤새 혈청-고갈시키고, 세포 접종 후 24시간째에 염색하고, 세포를 송아지 태아 혈청의 부재하에서, 4회 반복하여 매 12시간마다 72시간 동안 1 내지 20 μg/ml의 단일클론 대조군 항체 (단일클론 항체 항-퓨로마이신) (CT mAb), 또는 1 내지 20 μg/ml 항-hPG mAb로 처리하고, 이때 상기 mAb는 C-말단 항-hPG 단일클론 항체 또는 N-말단 항-hPG 단일클론 항체이다.

구체적으로, 72시간의 처리 후, 세포를 수확하고 RIPA 완충제를 사용하여 총 단백질을 추출한다. 그 후에 CT mAb 또는 항-hPG mAb 처리된 세포로부터 동량의 단백질을 항-서비빈 항체 (단일클론 항체, #2802, Cell Signaling) 및 로우딩 대조군으로서 항-액틴 항체 (단일클론 항체, #A4700, SIGMA)를 사용한 웨스턴 블롯에 적용한다. GBOX 케미 시스템 (Syngene)을 사용하여 정량을 수행한다.

항-hPG 단일클론 항체로의 처리는 대조군 항체로의 처리에 비해 서비빈 발현을 감소시킨다. 언페어드 스튜던츠 T-검정 (unpaired Student's T-test)을 이용해 통계학적 유의성을 결정한다: * = p<0.05, ** = p<0.01, 및 *** = p<0.001.

3.6. WNT/β-카테닌 경로에 대한 항-hPG 인간화된 항체의 중화 활성

PG에 대한 인간화된 항체를 판독으로서, 익히-알려진 WNT/β-카테닌 경로 표적 유전자인, 단백질 서비빈의 발현을 이용해 이들 상이한 세포주에서 WNT/β-카테닌 경로를 저해하는 이들의 능력을 시험한다. 각 KATO-III, AGS, MGC-803, 및 SNU-1 세포주로부터의 서비빈 발현을 상이한 항-hPG 인간화된 항체를 사용하여 시험한다.

각 실험에 대해, 50,000개 세포를 송아지 태아 혈청을 함유하는 배지 중의 6-웰 플레이트에 접종하고 8시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 밤새 혈청-고갈시키고, 세포 접종 후 24시간째에 염색하고, 세포를 송아지 태아 혈청의 부재하에서, 4회 반복하여 매 12시간마다 72시간 동안 1 내지 20 μg/ml의 인간화된 대조군 항체 (항-인간 FcG1, BioXCell) (CT Hz), 또는 1 내지 20 μg/ml 항-hPG Hz로 처리하고, 이때 상기 Hz는 C-말단 항-hPG 인간화된 항체 또는 N-말단 항-hPG 인간화된 항체이다.

구체적으로, 72시간의 처리 후, 세포를 수확하고 RIPA 완충제를 사용하여 총 단백질을 추출한다. 그 후에 CT Hz 또는 항-hPG Hz 처리된 세포로부터 동량의 단백질을 항-서비빈 항체 (단일클론 항체, #2802, Cell Signaling) 및 로우딩 대조군으로서 항-액틴 항체 (단일클론 항체, #A4700, SIGMA)를 사용한 웨스턴 블롯에 적용한다. GBOX 케미 시스템 (Syngene)을 사용하여 정량을 수행한다.

항-hPG 인간화된 항체로의 처리는 대조군 항체로의 처리에 비해 서비빈 발현을 감소시킨다. 언페어드 스튜던츠 T-검정을 이용해 통계학적 유의성을 결정한다: * = p<0.05, ** = p<0.01, 및 *** = p<0.001.

참고 문헌

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Artificial <220> <223> Amino acids 55-80, C-terminal extremity of human progastrin <400> 3 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 20 25 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6B5B11C10 CDR-H1 <400> 4 Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6B5B11C10 CDR-H2 <400> 5 Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6B5B11C10 CDR-H3 <400> 6 Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6B5B11C10 CDR-L1 <400> 7 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6B5B11C10 CDR-L2 <400> 8 Lys Val Ser 1 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 6B5B11C10 CDR-L3 <400> 9 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 20D2C3G2 CDR-H1 <400> 10 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Trp 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 20D2C3G2 CDR-H2 <400> 11 Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 20D2C3G2 CDR-H3 <400> 12 Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 20D2C3G2 CDR-L1 <400> 13 Gln Ser Leu Val His Ser Ser Gly Val Thr Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 20D2C3G2 CDR-L2 <400> 14 Lys Val Ser 1 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 20D2C3G2 CDR-L3 <400> 15 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1E9D9B6 CDR-H1 <400> 16 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1E9D9B6 CDR-H2 <400> 17 Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1E9D9B6 CDR-H3 <400> 18 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1E9D9B6 CDR-L1 <400> 19 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1E9D9B6 CDR-L2 <400> 20 Leu Val Ser 1 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1E9D9B6 CDR-L3 <400> 21 Trp Gln Gly Thr His Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1B3B4F11 CDR-H1 <400> 22 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1B3B4F11 CDR-H2 <400> 23 Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1B3B4F11 CDR-H3 <400> 24 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1B3B4F11 CDR-L1 <400> 25 Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1B3B4F11 CDR-L2 <400> 26 Val Lys Lys Asp Gly Ser His 1 5 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1B3B4F11 CDR-L3 <400> 27 Gly Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val 1 5 10 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1C10D3B9 CDR-H1 <400> 28 Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Ala 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1C10D3B9 CDR-H2 <400> 29 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr 1 5 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1C10D3B9 CDR-H3 <400> 30 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1C10D3B9 CDR-L1 <400> 31 Lys Ser Leu Arg His Thr Lys Gly Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1C10D3B9 CDR-L2 <400> 32 Gln Met Ser 1 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1C10D3B9 CDR-L3 <400> 33 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2C6C3C7 CDR-H1 <400> 34 Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2C6C3C7 CDR-H2 <400> 35 Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2C6C3C7 CDR-H3 <400> 36 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2C6C3C7 CDR-L1 <400> 37 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2C6C3C7 CDR-L2 <400> 38 Leu Val Ser 1 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2C6C3C7 CDR-L3 <400> 39 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acids 71-80 of progastrin <400> 40 Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 1 5 10

Claims

단일클론 프로가스트린-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물로서,
상기 단일클론 프로가스트린-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 프로가스트린에는 특이적으로 결합하나 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장 가스트린-34(G34-Gly)에는 결합하지 않고,
상기 단일클론 프로가스트린-결합 항체가 하기 중에서 선택되는 항체인, 조성물:
- 서열번호: 4, 5 및 6 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 7, 8 및 9 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
- 서열번호: 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
- 서열번호: 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
- 서열번호: 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
- 서열번호: 28, 29 및 30 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 31, 32 및 33 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 및
- 서열번호: 34, 35 및 36 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 37, 38 및 39 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
제1항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간화 항체인 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄의 불변영역도 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일클론 프로가스트린-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 N-말단 항-프로가스트린 항체 및 C-말단 항-프로가스트린 항체 중에서 선택되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일클론 프로가스트린-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 중화 항체인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일클론 프로가스트린-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포독성 분자에 접합된 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 위암이 전이성인 것인, 조성물.
위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 단일클론 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 및 항암 치료적 분자(anti-cancer therapeutic molecule)를 포함하는, 위암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 부품의 키트.
제9항에 있어서, 상기 조성물 및 상기 항암 치료적 분자가 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여되는 것인, 부품의 키트.
제9항에 있어서, 상기 항암 치료적 분자가 화학요법 분자인 것인, 부품의 키트.
제11항에 있어서, 상기 화학요법 분자가 폴레이트 길항제, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, DNA 알킬화 분자, DNA 가교-결합 약물, 항생제, 백금 복합체, 프로테오솜(proteasome) 저해제, 유사분열 방추 독(mitotic spindle poisons), 토포이소머라제 저해제 및 티로신 키나제 저해제 중에서 선택되는 것인, 부품의 키트.
제9항에 있어서, 상기 항암 치료적 분자가 EGFR을 표적하는 항체; VEGF를 표적하는 항체; HER2를 표적하는 항체; PD-1 및 PDL-1을 표적하는 항체; CTLA-4를 표적하는 항체; EGFR을 표적하는 소분자 약물; BRAF를 표적하는 소분자 약물; 및 VEGF를 표적하는 재조합 융합 단백질 중에서 선택되는 것인, 부품의 키트.
제13항에 있어서,
EGFR을 표적하는 항체가 세툭시맙 또는 파니투무맙이거나;
HER2를 표적하는 항체가 트라스트주맙 또는 퍼투주맙이거나;
PD-1 및 PDL-1을 표적하는 항체가 펨브롤리주맙이거나;
CTLA-4를 표적하는 항체가 이필리무맙이거나;
EGFR을 표적하는 소분자 약물이 에를로티닙이거나;
BRAF를 표적하는 소분자 약물이 베무라페닙 또는 다브라페닙이거나; 또는
VEGF를 표적하는 재조합 융합 단백질이 아플리베르셉트인, 부품의 키트.
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