ES2899360T3 - Composiciones y procedimientos para detectar y tratar cáncer gástrico - Google Patents

Abstract

Composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico que comprende un anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la que: - dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une específicamente a progastrina pero no se une a gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 prolongada con glicina (G17-Gly) o gastrina-34 prolongada con glicina (G34-Gly), y - dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina es un anticuerpo elegido de entre: - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 4, 5 y 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 7, 8 y 9, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os13, 14 y 15, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 16, 17 y 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 19, 20 y 21, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 22, 23 y 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 25, 26 y 27, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 28, 29 y 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 31, 32 y 33, respectivamente, y - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os34, 35 y 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 37, 38 y 39, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para detectar y tratar cáncer gástrico

Campo de la exposición

La presente exposición se refiere al diagnóstico in vitro, la prevención y el tratamiento de cáncer, más particularmente se refiere a procedimientos para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico, y a procedimientos y a composiciones para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico. Las composiciones según la exposición comprenden una molécula de unión a progastrina, en particular un anticuerpo anti-hPG, mientras que los procedimientos según la exposición comprenden la utilización de una molécula de unión a progastrina, y particularmente a un anticuerpo anti-hPG.

Antecedentes

El cáncer gástrico, o cáncer de estómago, se considera la quinta causa principal de cáncer y la tercera causa principal de muerte por cáncer, constituyendo el 7% de los casos y el 9% de las muertes. Tal como han demostrado numerosos estudios, la causa más común de cáncer gástrico es infección por la bacteria Helicobacter pylori, habiendo demostrado los estudios una asociación entre la infección por Helicobacter pylori y el cáncer gástrico.

El cáncer gástrico se desarrolla a partir de la mucosa gástrica, luego el cáncer puede diseminarse a otras partes del cuerpo, y en particular al hígado, a los pulmones, a los huesos, al revestimiento abdominal y a los ganglios linfáticos. Los tratamientos incluyen habitualmente cirugía, quimioterapia, radioterapia y terapia dirigida, solas o en combinación. Sin embargo, los desenlaces clínicos son a menudo desfavorables con una tasa de supervivencia global a los 5 años inferior al 10%. Esto se debe en gran medida a que a la mayoría de las personas se les detecta únicamente cuando la enfermedad ya está avanzada, lo que tiene una consecuencia directa en la tasa de supervivencia. En algunos países asiáticos, se ha demostrado que los esfuerzos de cribado están asociados con mayores tasas de supervivencia.

El diagnóstico clínico se basa en la biopsia, que se realiza con endoscopia. Luego puede utilizarse obtención de imágenes médicas para determinar si la enfermedad se ha diseminado a otras partes del cuerpo.

Quig He y colaboradores han investigado el efecto sobre el crecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico humano de una combinación de un antisuero antigastrina y fármacos citotóxicos; no se divulga ningún anticuerpo monoclonal de unión a progastrina (Qing He et al., 2015. J Canc, 6, 448-456). El documento US 2014/227.301 divulga unas composiciones inmunogénicas que comprenden péptidos generados a partir de las diferentes formas procesadas de preprogastrina y su utilización para inhibir el crecimiento de células de cáncer gástrico humano.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de unos procedimientos que permitan un diagnóstico rápido, fiable y económico de cáncer gástrico, al igual que sigue existiendo la necesidad de nuevas composiciones y procedimientos para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico.

Este es el objetivo de la presente exposición.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas, y cualesquiera otros aspectos o formas de realización expuestos en la presente memoria son únicamente para información.

La presente exposición proporciona ahora procedimientos para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico, en los que dicho procedimiento comprende la detección de progastrina en una muestra biológica de un sujeto. Preferentemente, se determina la cantidad de progastrina en dicha muestra, permitiendo así la cuantificación de progastrina. La presente exposición también proporciona una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico, en la que dicha composición comprende un anticuerpo que se une a progastrina, y unos procedimientos para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico que comprenden la utilización de una composición que comprende un anticuerpo que se une a progastrina, solo o en combinación con cualquier otro procedimiento de prevención o terapéutico conocido contra el cáncer gástrico.

Descripción detallada

La preprogastrina humana, un péptido de 101 aminoácidos (referencia de la secuencia de aminoácidos: AAB19304.1), es el producto de traducción primario del gen gastrina. La progastrina se forma mediante escisión de los primeros 21 aminoácidos (el péptido señal) de la preprogastrina. La cadena de 80 aminoácidos de progastrina se procesa adicionalmente mediante escisión y enzimas de modificación para dar varias formas de hormona gastrina biológicamente activas: gastrina 34 (G34) y gastrina 34 prolongada con glicina (G34-Gly), que comprenden los aminoácidos 38 a 71 de progastrina, gastrina 17 (G17) y gastrina 17 prolongada con glicina (G17Gly), que comprenden los aminoácidos 55 a 71 de progastrina.

En los siguientes documentos se han descrito anticuerpos monoclonales anti-progastrina humana (anti-hPG) y su utilización para diagnóstico o terapia: el documento WO 2011/083 088 para cáncer colorrectal, el documento WO 2011/083090 para cáncer de mama, el documento WO 2011/083091 para cáncer pancreático, el documento WO 2011/116954 para cáncer colorrectal y gastrointestinal, y los documentos WO 2012/013609 y WO 2011/083 089 para hepatopatologías.

En primer lugar, la presente exposición se refiere a un procedimiento para la evaluación in vitro de un riesgo de la presencia de cáncer gástrico, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de detectar progastrina en una muestra biológica de un sujeto. La presencia de progastrina en la muestra indica que existe un riesgo de la presencia de cáncer gástrico.

Por tanto, en la presente memoria se divulga un procedimiento in vitro para evaluar el riesgo de la presencia de cáncer gástrico en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, y

b) detectar la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión un riesgo de la presencia de cáncer gástrico.

La unión de la molécula de unión a progastrina puede detectarse mediante diversos ensayos disponibles para el experto en la materia. Aunque dentro de la exposición se incluye cualquier medio adecuado para llevar a cabo los ensayos, pueden mencionarse, en particular, FACS, ELISA, RIA, inmunotransferencia de tipo Western e IHC. Preferentemente, el procedimiento según la exposición para la evaluación in vitro de un riesgo de la presencia de cáncer gástrico en un sujeto comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicha muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina,

b) determinar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica, siendo una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM en dicha muestra biológica indicativa de un riesgo de la presencia de cáncer gástrico.

Una vez determinada la concentración de progastrina presente en la muestra, puede compararse el resultado con aquellos de las muestras de control, que se obtienen de una manera similar a las muestras de prueba pero a partir de unos individuos que se sabe que no padecen un cáncer gástrico. Si la concentración de progastrina es significativamente más elevada en la muestra de prueba, puede concluirse que existe una probabilidad aumentada de que el sujeto a partir del cual se derivó presente un cáncer gástrico.

Por tanto, el procedimiento divulgado en la presente memoria comprende preferentemente las etapas adicionales siguientes:

c) determinar una concentración de progastrina de referencia en una muestra de referencia,

d) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicha concentración de progastrina de referencia,

e) evaluar, a partir de la comparación de la etapa d), el riesgo de la presencia de cáncer gástrico.

La presente exposición también se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar cáncer gástrico en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, y

b) detectar la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión la presencia de cáncer gástrico en dicho sujeto.

Preferentemente, el procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico en un sujeto comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicha muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina,

b) determinar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica, siendo una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM en dicha muestra biológica indicativa de la presencia de cáncer gástrico en dicho sujeto.

En particular, una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM, por lo menos 20 pM, por lo menos 30 pM, en dicha muestra biológica es indicativa de la presencia de cáncer gástrico en dicho sujeto.

Preferentemente, el procedimiento divulgado en la presente memoria comprende las etapas adicionales siguientes: c) determinar una concentración de progastrina de referencia en una muestra de referencia,

d) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicho nivel o dicha concentración de progastrina de referencia,

e) diagnosticar, a partir de la comparación de la etapa d), la presencia de cáncer gástrico.

La presente exposición también se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar cáncer gástrico metastatizado en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) poner en contacto la muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, y

b) detectar la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión la presencia de cáncer gástrico metastatizado en dicho sujeto.

Un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico metastatizado en un sujeto, a partir de una muestra biológica de dicho sujeto, comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicha muestra biológica con por lo menos una molécula de unión a progastrina, b) determinar, mediante un ensayo bioquímico, el nivel o la concentración de progastrina en dicha muestra biológica, siendo una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM mayor en dicha muestra biológica indicativa de la presencia de cáncer gástrico metastatizado en dicho sujeto.

En particular, una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM, por lo menos 20 pM, por lo menos 30 pM, por lo menos 40 pM o por lo menos 50 pM en dicha muestra biológica es indicativa de la presencia de cáncer gástrico metastatizado en dicho sujeto.

El procedimiento divulgado en la presente memoria comprende preferentemente las etapas adicionales siguientes: c) determinar una concentración de progastrina de referencia en una muestra de referencia,

d) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicha concentración de progastrina de referencia,

e) diagnosticar, a partir de la comparación de la etapa d), la presencia de cáncer gástrico metastatizado. En particular, la presente exposición se refiere a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico en un sujeto, que comprende determinar la concentración de progastrina en una muestra biológica y comparar dicho valor obtenido con la concentración de progastrina en una muestra de referencia.

Más particularmente, en un procedimiento para el diagnóstico de cáncer gástrico tal como se divulga en la presente memoria, la muestra biológica de dicho sujeto se pone en contacto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, siendo dicha molécula de unión a progastrina un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

La expresión “evaluación de un riesgo de la presencia de cáncer gástrico en un sujeto” designa la determinación de una probabilidad relativa de que un sujeto dado padezca cáncer gástrico, cuando se compara con un sujeto o valor de referencia. Un procedimiento según la exposición representa una herramienta en la evaluación de dicho riesgo, en combinación con otros procedimientos o indicadores tales como exploración clínica, biopsia y determinación del nivel de un biomarcador conocido de cáncer gástrico, tal como, por ejemplo, pepsinógeno La expresión “diagnóstico in vitro’’ significa determinar si un sujeto padece una afección particular. Se sabe que el diagnóstico de cáncer gástrico implica por lo menos una observación clínica de los síntomas de dicho sujeto y de la detección de pepsinógeno. Actualmente se utiliza la prueba de pepsinógeno como biomarcador, pero la precisión de esta prueba para detectar cáncer gástrico es baja, con estimaciones de sensibilidad que oscilan entre el 35.8% y el 62.3% (Yanaoka et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008). Aunque en la fase de descubrimiento se identificaron algunos biomarcadores, sigue siendo un gran desafío transferirlos a la clínica, principalmente debido a la falta de un proceso de evaluación sistemático (Pepe et al., J Natl Cancer Inst, 2008).

Por tanto, un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico, según la presente exposición, puede considerarse como una herramienta dentro de un proceso de diagnóstico.

En particular, la presente exposición se refiere a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico en un sujeto, y comprende la determinación de la concentración de progastrina en dicha muestra biológica y la determinación de un biomarcador conocido de cáncer gástrico, preferentemente pepsinógeno..

La expresión “cáncer gástrico” también designa “cáncer de estómago”, incluye en particular “carcinomas gástricos”, pero también linfomas y tumores mesenquimatosos que también pueden desarrollarse dentro del estómago. La expresión “cáncer gástrico” también implica cáncer gástrico asociado con metástasis, en particular metástasis al hígado, a los pulmones, a los huesos, al abdomen y a los ganglios linfáticos.

El término “progastrina” designa el péptido progastrina de mamífero, y particularmente progastrina humana. Para evitar dudas, sin ninguna especificación, la expresión “progastrina humana” se refiere a la PG humana de secuencia SEC ID n.°1. La progastrina humana comprende, en particular, un dominio N-terminal y uno C-terminal que no están presentes en las formas de hormona gastrina biológicamente activas mencionadas anteriormente. Preferentemente, la secuencia de dicho dominio N-terminal está representada por SEC ID n.°2. Preferentemente, la secuencia de dicho dominio C-terminal está representada por SEC ID n.° 3.

La determinación de la concentración de progastrina, en un procedimiento según la exposición, se realiza mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia de la bioquímica.

Preferentemente, determinar los niveles de progastrina en una muestra incluye poner en contacto dicha muestra con una molécula de unión a progastrina y medir la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progastrina.

Cuando se miden los niveles de expresión a nivel de proteína, esto puede realizarse, en particular, utilizando moléculas de unión a progastrina específicas tales como, por ejemplo, anticuerpos, en particular utilizando tecnologías bien conocidas tales como tinción de la membrana celular utilizando biotinilación u otras técnicas equivalentes seguido de inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, inmunotransferencia de tipo Western, ELISA o ELISPOT, ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF), micromatrices de anticuerpos o micromatrices tisulares acopladas a inmunohistoquímica. Otras técnicas adecuadas incluyen FRET o BRET, procedimientos histoquímicos o microscópicos unicelulares utilizando una longitud de onda de excitación única o múltiple y aplicando cualquiera de los procedimientos ópticos adaptados, tales como procedimientos electroquímicos (técnicas de voltametría y amperometría), microscopía de fuerza atómica y procedimientos de radiofrecuencia, por ejemplo, espectroscopía de resonancia multipolar, confocal y no confocal, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o índice de refracción (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, elipsometría, un procedimiento de espejo resonante, un procedimiento de guía de ondas de acoplador de rejilla o interferometría), ELISA celular, citometría de flujo, técnica radioisotópica, obtención de imágenes por resonancia magnética, análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE); HPLC-espectroscopía de masas; cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (CL-EM/EM)). Todas estas técnicas se conocen bien en la materia y no es necesario detallarlas adicionalmente en la presente memoria. Estas diferentes técnicas pueden utilizarse para medir los niveles de progastrina.

Dicho procedimiento puede elegirse, en particular, de entre: un procedimiento basado en inmunodetección, un procedimiento basado en inmunotransferencia de tipo Western, un procedimiento basado en espectrometría de masas, un procedimiento basado en cromatografía y un procedimiento basado en citometría de flujo. Aunque dentro de la exposición se incluye cualquier medio adecuado para llevar a cabo los ensayos, procedimientos tales como FACS, ELISA, RIA, inmunotransferencia de tipo Western e IHC son particularmente útiles para llevar a cabo el procedimiento de la exposición.

Más particularmente, un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico según la exposición comprende poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con una molécula de unión a progastrina utilizando un ensayo inmunoenzimático, preferentemente basado en técnicas elegidas de entre RIA y ELISA.

Un “muestra biológica”, tal como se utiliza en la presente memoria, es una muestra de tejido o fluido biológico que contiene ácidos nucleicos o polipéptidos, por ejemplo, de una proteína, un polinucleótido o un transcrito de cáncer gástrico. Una muestra de este tipo debe permitir la determinación de los niveles de expresión de progastrina. Se sabe que la progastrina es una proteína secretada. Las muestras biológicas preferidas para la determinación del nivel de la proteína progastrina incluyen, por tanto, fluidos biológicos. Un “fluido biológico”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa cualquier fluido que incluya material de origen biológico. Los fluidos biológicos preferidos para su utilización en la presente exposición incluyen fluidos corporales de un animal, por ejemplo, un mamífero, preferentemente un sujeto humano El fluido corporal puede ser cualquier fluido corporal, incluyendo, pero sin limitarse a sangre, plasma, suero, linfa, líquido cefalorraquídeo (LCR), saliva, sudor y orina. Preferentemente, dichas muestras biológicas líquidas preferidas incluyen muestras tales como una muestra de sangre, una muestra de plasma o una muestra de suero. Más preferentemente, la muestra biológica es una muestra de sangre. De hecho, una muestra de sangre de este tipo puede obtenerse mediante una extracción de sangre completamente inocua del paciente y, por tanto, permite una evaluación no invasiva de los riesgos de que el sujeto desarrolle un tumor.

Una “muestra biológica”, tal como se utiliza en la presente memoria, también incluye una muestra de cáncer sólido del paciente que va a someterse a prueba, cuando el cáncer es un cáncer sólido. Tal muestra de cáncer sólido permite al experto realizar cualquier tipo de medición del nivel del biomarcador de la exposición. En algunos casos, los procedimientos según la exposición pueden comprender además una etapa preliminar de tomar una muestra de cáncer sólido del paciente. Por “muestra de cáncer sólido” quiere decirse una muestra de tejido tumoral. Incluso en un paciente con cáncer, el tejido que es el sitio del tumor todavía comprende tejido sano no tumoral. La “muestra de cáncer” debe limitarse, por tanto, a tejido tumoral tomado del paciente. Dicha “muestra de cáncer” puede ser una muestra de biopsia o una muestra tomada a partir de una terapia de resección quirúrgica.

Una muestra biológica se obtiene normalmente a partir de un organismo eucariota, lo más preferentemente un mamífero, o un ave, reptil o pez. De hecho, un “sujeto” que puede someterse al procedimiento descrito en la presente memoria puede ser cualquier animal mamífero, incluyendo humano, perro, gato, ganado bovino, cabra, cerdo, ganado porcino, oveja y mono; o un ave; reptil; o pez. Preferentemente, un sujeto es un ser humano; un sujeto humano puede denominarse “paciente”.

Por “obtener una muestra biológica” quiere decirse en la presente memoria obtener una muestra biológica para su utilización en los procedimientos descritos en esta exposición. La mayoría de las veces, esto se realizará retirando una muestra de células de un animal, pero también puede lograrse utilizando células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o para otro propósito), o realizando los procedimientos de la exposición in vivo. Serán particularmente útiles los tejidos de archivo, que presentan antecedentes de tratamiento o desenlace clínico.

Esta muestra puede obtenerse, y si es necesario prepararse, según procedimientos conocidos por un experto en la materia. En particular, en la materia se conoce bien que la muestra debe extraerse de un sujeto en ayunas.

La determinación de la concentración de progastrina se refiere a la determinación de la cantidad de progastrina en un volumen de muestra conocido. La concentración de progastrina puede expresarse en relación con una muestra de referencia, por ejemplo, como relación o porcentaje. La concentración también puede expresarse como intensidad o localización de una señal, dependiendo del procedimiento utilizado para la determinación de dicha concentración. Preferentemente, la concentración de un compuesto en una muestra se expresa después de la normalización de la concentración total de compuestos relacionados en dicha muestra, por ejemplo, el nivel o la concentración de una proteína se expresa después de la normalización de la concentración total de proteínas en la muestra.

Preferentemente, el riesgo de que dicho sujeto padezca cáncer gástrico se determina comparando el nivel de progastrina medido en dicha muestra biológica con un nivel de referencia.

El término “nivel de referencia”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al nivel de expresión del marcador de cáncer gástrico en consideración, es decir, progastrina, en una muestra de referencia. Una “muestra de referencia”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa una muestra obtenida de sujetos, preferentemente dos o más sujetos, que se sabe que están libres de la enfermedad o, alternativamente, de la población general. Los niveles de expresión de progastrina de referencia adecuados pueden determinarse midiendo los niveles de expresión de dicho marcador en varios sujetos adecuados, y tales niveles de referencia pueden ajustarse a poblaciones de sujetos específicas. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto; un valor relativo; un valor que presenta un límite superior o uno inferior; un intervalo de valores; un valor promedio; un valor de mediana, un valor medio o un valor en comparación con un valor de control o de nivel inicial particular. Un valor de referencia puede estar basado en un valor de muestra individual tal como, por ejemplo, un valor obtenido a partir de una muestra del sujeto que está sometiéndose a prueba, pero en un punto temporal más temprano. El valor de referencia puede estar basado en un gran número de muestras, tal como de una población de sujetos del grupo de edades cronológicas coincidentes, o basado en un conjunto de muestras incluyendo o excluyendo la muestra que va a someterse a prueba.

Ventajosamente, un “nivel de referencia” es un nivel de progastrina predeterminado, obtenido a partir de una muestra biológica de un sujeto con un estado particular conocido en cuanto al cáncer. En particular, el nivel de referencia utilizado para la comparación con la muestra de prueba en la etapa (b) puede haberse obtenido a partir de una muestra biológica de un sujeto sano, o a partir de una muestra biológica de un sujeto que padece cáncer; se entiende que el perfil de expresión de referencia también puede obtenerse a partir de un conjunto de muestras biológicas de sujetos sanos o a partir de un conjunto de muestras de sujetos que padecen cáncer.

En particular, en el procedimiento de la exposición, la muestra de referencia se recoge de sujetos que no padecen ningún cáncer, y preferentemente ninguna patología. Debe entenderse que, según la naturaleza de la muestra biológica recogida de un paciente, la muestra de referencia será una muestra biológica de la misma naturaleza que dicha muestra biológica.

El nivel de progastrina se determina en el presente procedimiento determinando la cantidad de progastrina que está unida por una molécula de unión a progastrina, preferentemente un anticuerpo que reconoce a progastrina.

Por “molécula de unión a progastrina” quiere hacerse referencia en la presente memoria a cualquier molécula que se une a progastrina, pero que no se une a gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 prolongada con glicina (G17-Gly) o gastrina-34 prolongada con glicina (G34-Gly). La molécula de unión a progastrina de la presente exposición puede ser cualquier molécula de unión a progastrina, tal como, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una molécula de receptor. Preferentemente, la molécula de unión a progastrina es un anticuerpo anti-progastrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En particular, la presente exposición se refiere a un procedimiento de diagnóstico in vitro de un cáncer gástrico que comprende determinar la concentración de progastrina en una muestra biológica de un sujeto, mostrando dicho sujeto por lo menos un síntoma clínico de cáncer gástrico.

En particular, la presente exposición se refiere a un procedimiento de diagnóstico in vitro de un cáncer gástrico que comprende determinar la concentración de progastrina en una muestra biológica de un sujeto, mostrando dicho sujeto por lo menos un síntoma clínico de cáncer y/o de metástasis.

Por “unión”, “se une” o similares quiere decirse que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, forma un complejo con un antígeno que, en condiciones fisiológicas, es relativamente estable. En la materia se conocen bien procedimientos para determinar si dos moléculas se unen, e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. En particular, dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a progastrina con una afinidad que es por lo menos dos veces superior a su afinidad para la unión a una molécula inespecífica tal como BSA o caseína. Más particularmente, dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une únicamente a progastrina.

En particular, en un procedimiento para el diagnóstico de cáncer gástrico según la exposición, una muestra biológica del sujeto se pone en contacto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, siendo la afinidad de dicha molécula por la progastrina de por lo menos 100 nM, por lo menos 90 nM, por lo menos 80 nM, por lo menos 70 nM, por lo menos 60 nM, por lo menos 50 nM, por lo menos 40 nM, por lo menos 30 nM, por lo menos 20 nM, por lo menos 10 nM, por lo menos 5 nM, por lo menos 1 nM, por lo menos 100 pM, por lo menos 10 pM o por lo menos 1 pM, tal como se determina mediante un procedimiento tal como el anteriormente descrito.

En particular, la presente exposición se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de cáncer gástrico, que comprende detectar la concentración de progastrina en una muestra biológica de un sujeto, poniéndose dicha muestra biológica en contacto con un anticuerpo anti-hPG, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Se pretende que el término “anticuerpo”, tal como se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos policlonales y monoclonales. Un anticuerpo (o “inmunoglobulina”) consiste en una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región (o dominio) variable de cadena pesada (en la presente memoria abreviada como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (en la presente memoria abreviada como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) o “regiones hipervariables”, que son las principales responsables de la unión de un epítopo de un antígeno, y que están intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado (FR). Un experto conoce bien un procedimiento para identificar las CDR dentro de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo y determinar su secuencia. Para evitar dudas, en ausencia de cualquier indicación de lo contrario en el texto, la expresión CDR significa las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo tal como se define mediante IMGT, proporcionando la numeración única IMGT una delimitación normalizada de las regiones de entramado y de las regiones determinantes de complementariedad, CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2.

La numeración única IMGT se ha definido para comparar los dominios variables independientemente del receptor de antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única IMGT, los aminoácidos conservados siempre presentan la misma posición, por ejemplo, cisteína 23 (1a CYS), triptófano 41 ^{(TRP CONSERVADO), aminoácido hidrófobo 89, cisteína 104 (}2a CYS), fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J TRP). La numeración única IMGT proporciona una delimitación normalizada de las regiones de entramado (FR1-IMGT posiciones 1 a 26, FR2-I^m G^t: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Dado que los huecos representan posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ejemplo [8.8.13]) se convierten en información crucial. La numeración única IMGT se utiliza en representaciones gráficas en 2D, designadas IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras en 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los factores o tejidos huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento. Los anticuerpos pueden ser de isotipos diferentes (concretamente IgA, IgD, IgE, IgG o IgM).

Más particularmente, dicho anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre el grupo que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos camelizados, anticuerpos IgA1, anticuerpos IgA2, anticuerpos IgD, anticuerpos IgE, anticuerpos IgG1, anticuerpos IgG2, anticuerpos IgG3, anticuerpos IgG4 y anticuerpos IgM.

Un “anticuerpo policlonal” es un anticuerpo que se produjo entre o en presencia de uno o más de otros anticuerpos no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en presencia de varios otros linfocitos B que producen anticuerpos no idénticos. Habitualmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir de un animal inmunizado.

El término “anticuerpo monoclonal” designa un anticuerpo que surge de una población de anticuerpos casi homogénea, comprendiendo la población anticuerpos idénticos excepto por algunas posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden encontrarse en proporciones mínimas. Un anticuerpo monoclonal surge del crecimiento de un clon celular único, tal como un hibridoma, y se caracteriza por cadenas pesadas de una clase y subclase y cadenas ligeras de un tipo.

Se pretende que la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo indique cualquier péptido, polipéptido o proteína que conserva la capacidad de unirse a la diana (generalmente también denominada antígeno) de dicho anticuerpo, generalmente el mismo epítopo, y que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 10 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 15 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 20 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 25 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 40 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 50 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 60 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 70 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 80 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 90 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 100 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 125 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 150 residuos de aminoácido contiguos, por lo menos 175 residuos de aminoácido contiguos o por lo menos 200 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo.

En particular, dicho fragmento de unión a antígeno comprende por lo menos una CDR del anticuerpo a partir del cual se deriva. Todavía preferentemente, dicho fragmento de unión a antígeno comprende 2, 3, 4 o 5 CDR, más preferentemente las 6 CDR, del anticuerpo a partir del cual se deriva.

Los “fragmentos de unión a antígeno” pueden seleccionarse, sin limitación, de entre el grupo que consiste en Fv, scFv (sc por cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', diacuerpos o fragmentos scFv-Fc, o proteínas de fusión con péptidos desordenados tales como XTEN (polipéptido recombinante extendido) o motivos PAS, o cualquier fragmento cuya semivida aumentaría mediante modificación química, tal como la adición de poli(alquilen)glicol tal como poli(etilen)glicol (“pegilación”) (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) (“PEG” por poli(etilen)glicol), o mediante incorporación en un liposoma, presentando dichos fragmentos por lo menos una de las CDR características del anticuerpo según la exposición. Preferentemente, dichos “fragmentos de unión a antígeno” estarán constituidos por o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo a partir del cual se derivan, siendo dicha secuencia parcial suficiente para conservar la misma especificidad de unión que el anticuerpo a partir del cual desciende y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, de manera más preferida a por lo menos 1/10, de la afinidad del anticuerpo a partir del cual desciende, con respecto a la diana.

En particular, en un procedimiento para el diagnóstico de cáncer gástrico según la exposición, una muestra biológica de un sujeto se pone en contacto con un anticuerpo que se une a progastrina, habiéndose obtenido dicho anticuerpo mediante un procedimiento de inmunización conocido por un experto en la materia, utilizándose como inmunógeno un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende la totalidad o una parte de la secuencia de aminoácidos de progastrina. Más particularmente, dicho inmunógeno comprende un péptido elegido de entre:

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de progastrina de longitud completa, y particularmente progastrina humana de longitud completa de SEC ID n.° 1,

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos de progastrina, y particularmente progastrina humana de longitud completa de SEC ID n.° 1,

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte o a la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de progastrina, y en particular péptidos que comprenden, o consisten en, la secuencia de aminoácidos: SWk Pr SQQPDa PlG (SEC ID n.° 2), y

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte o a la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de progastrina, y en particular péptidos que comprenden, o consisten en, la secuencia de aminoácidos: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEC ID n.° 3),

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de progastrina, y en particular péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40) correspondiente a los aminoácidos 71-80 de progastrina.

El experto se dará cuenta de que puede utilizarse tal inmunización para generar anticuerpos o bien policlonales o bien monoclonales, según se desee. En la materia se conocen bien procedimientos para obtener cada uno de estos tipos de anticuerpos. Por tanto, el experto seleccionará e implementará fácilmente un procedimiento para generar anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra cualquier antígeno dado.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales que se generaron utilizando un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos “SWKPRSQQPDAPLG”, correspondiente a la secuencia de aminoácidos 1-14 de progastrina humana (extremo N-terminal), incluyen, pero no se restringen a, los anticuerpos monoclonales designados como: AcM3, AcM4, AcM16 y AcM19 y AcM20, tal como se describen en las tablas 1 a 4 siguientes. Se han descrito otros anticuerpos monoclonales, aunque no resulta claro si estos anticuerpos realmente se unen a progastrina (documento WO 2006/032980). Los resultados experimentales del mapeo de epítopos muestran que AcM3, AcM4, AcM16, y AcM19 y AcM20 se unen específicamente a un epítopo dentro de dicha secuencia de aminoácidos N-terminal de hPG. En la materia se han descrito anticuerpos policlonales que reconocen específicamente un epítopo dentro del extremo N-terminal de progastrina representado por SEC ID n.° 2 (véase, por ejemplo, el documento WO 2011/083088).

Tabla 1

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales que pueden generarse utilizando un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos “QGPWLEEe EeAYGWMDFGRRSAEDEN” (parte C-terminal de progastrina), correspondiente a la secuencia de aminoácidos 55-80 de progastrina humana, incluyen, pero no se restringen a, los anticuerpos designados como: AcM8 y AcM13 en las tablas 5 y 6 siguientes. Los resultados experimentales del mapeo de epítopos muestran que AcM13 se une específicamente a un epítopo dentro de dicha secuencia de aminoácidos C-terminal de hPG.

Tabla 5

Tabla 6

Otros ejemplos incluyen anticuerpos monoclonales y/o policlonales anti-hPG generados utilizando un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 40.

Más particularmente, en un procedimiento según la exposición, dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo anti-hPG o fragmento de unión a antígeno del mismo, eligiéndose dicho anticuerpo anti-hPG de entre anticuerpos anti-hPG N-terminales y anticuerpos anti-hPG C-terminales.

Los términos “anticuerpos anti-hPG N-terminales” y “anticuerpos anti-hPG C-terminales” designan anticuerpos que se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos ubicados en la parte N-terminal de hPG o a un epítopo que comprende los aminoácidos ubicados en la parte C-terminal de hPG, respectivamente. Preferentemente, el término “anticuerpos anti-hPG N-terminales” se refiere a anticuerpos que se unen a un epítopo ubicado en un dominio de progastrina cuya secuencia está representada por SEC ID n.° 2. Preferentemente, el término “anticuerpos antihPG C-terminales” se refiere a anticuerpos que se unen a un epítopo ubicado en un dominio de progastrina cuya secuencia está representada por SEC ID n.° 3.

El término “epítopo” se refiere a una región de un antígeno que está unido por un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y presentan los aminoácidos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción.

Los epítopos también pueden ser conformacionales. Los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y pueden presentar características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. La determinación del epítopo unido por un anticuerpo puede realizarse mediante cualquier técnica de mapeo de epítopos conocida por un experto en la materia. Un epítopo puede comprender diferentes aminoácidos que están ubicados secuencialmente dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína. Un epítopo también puede comprender aminoácidos que no están ubicados secuencialmente dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína.

En particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 4, 5 y 6, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 4, 5 y 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 7, 8 y 9, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 7, 8 y 9, respectivamente,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias s Ec ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 13, 14 y 15, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 13, 14 y 15, respectivamente,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos de entre, preferentemente tres, de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 16, 17 y 18, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 16, 17 y 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 19, 20 y 21, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 19, 20 y 21, respectivamente,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 22, 23 y 24, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 22, 23 y 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os25, 26 y 27, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 25, 26 y 27, respectivamente,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente por lo menos tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 28, 29 y 30, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 28, 29 y 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 31, 32 y 33, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 31, 32 y 33, respectivamente, y

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 34, 35 y 36, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 34, 35 y 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 37, 38 y 39, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 37, 38 y 39, respectivamente.

En el sentido de la presente exposición, el “porcentaje de identidad” o “% de identidad” entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos significa el porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácido idénticos entre las dos secuencias que van a compararse, obtenido después de la alineación óptima, siendo este porcentaje puramente estadístico y distribuyéndose al azar las diferencias entre las dos secuencias a lo largo de su longitud. La comparación de dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se lleva a cabo tradicionalmente comparando las secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, pudiendo llevarse a cabo dicha comparación por segmento o utilizando una “ventana de alineación”. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de por comparación manual, por medio de procedimientos conocidos por un experto en la materia.

Para la secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, con una secuencia de aminoácidos de referencia, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que contienen la secuencia de referencia, determinadas modificaciones, en particular una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, truncamiento o prolongación. En el caso de sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en las que los aminoácidos sustituidos se reemplazan por aminoácidos “equivalentes”. En la presente memoria, se pretende que la expresión “aminoácidos equivalentes” indique cualquier aminoácido que probablemente se sustituya por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar, no obstante, las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de aquellos ejemplos específicos definidos a continuación.

Los aminoácidos equivalentes pueden determinarse o bien por su homología estructural con los aminoácidos por los que se sustituyen o bien por los resultados de pruebas comparativas de la actividad biológica entre los diversos anticuerpos que probablemente se generen.

En particular, el anticuerpo utilizado en el procedimiento de la exposición puede ser un anticuerpo humanizado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “anticuerpo humanizado” significa un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, derivándose las demás partes de la molécula de anticuerpo de uno o varios anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos del segmento principal (denominado FR por entramado) pueden modificarse para conservar la afinidad de unión, según técnicas conocidas por un experto en la materia (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986). El objetivo de la humanización es una reducción de la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, tal como un anticuerpo murino, para su introducción en un humano, mientras se mantiene la especificidad y la afinidad de unión a antígeno completas del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados de la exposición, o fragmentos de los mismos, pueden prepararse mediante técnicas conocidas por un experto en la materia (tales como, por ejemplo, las descritas en los documentos Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992). Se prefieren tales anticuerpos humanizados para su utilización en procedimientos que implican el diagnóstico in vitro o el tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. El experto en la materia también conoce otras técnicas de humanización. De hecho, los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una variedad de técnicas, incluyendo injerto de CDR (documentos EP 0451 261; EP 0682 040; EP 0939 127; EP 0 566647; US 5.530.101; US 6.180.370; US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.639.641; US 6.054.297; US 5.886.152; y US 5.877.293), rebarnizado o rechapado (documentos EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 91:969-973) e mezcla de cadenas (patente estadounidense n.° 5.565.332). Los anticuerpos humanos pueden elaborarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia, incluyendo procedimientos de presentación en fagos. Véanse también las patentes estadounidenses n.os 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; y las publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.

Más particularmente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 4, 5 y 6, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con ^{las secuencias SEC ID n.os 4, 5 y} 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 7, 8 y 9, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con ^{las secuencias SEC ID n.os 7,} 8 y 9, respectivamente,

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias s Ec ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 13, 14 y 15, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 13, 14 y 15, respectivamente,

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 16, 17 y 18, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias s Ec ID n.os16, 17 y 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 19, 20 y 21, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os19, 20 y 21, respectivamente,

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 22, 23 y 24, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 22, 23 y 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 25, 26 y 27, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os25, 26 y 27, respectivamente,

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 28, 29 y 30, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 28, 29 y 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 31, 32 y 33, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 31, 32 y 33, respectivamente, y

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os34, 35 y 36, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias s Ec ID n.os34, 35 y 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 37, 38 y 39, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.os 37, 38 y 39, respectivamente,

comprendiendo dicho anticuerpo también unas regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

Un procedimiento según la exposición comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo antihPG que se une a un epítopo de hPG, estando dicho epítopo ubicado dentro de la parte C-terminal de hpG, o a un epítopo ubicado dentro de la parte N-terminal de hPG.

Más específicamente, un procedimiento según la exposición comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-hPG que se une a un epítopo de hPG, incluyendo dicho epítopo incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de progastrina elegida de entre una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 10 a 14 de hPG, los aminoácidos 9 a 14 de hPG, los aminoácidos 4 a 10 de hPG, los aminoácidos 2 a 10 de hPG y los aminoácidos 2 a 14 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.

Más específicamente, un procedimiento según la exposición comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-hPG que se une a un epítopo de hPG, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de progastrina elegida de entre una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 71 a 74 de hPG, los aminoácidos 69 a 73 de hPG, los aminoácidos 71 a 80 de hPG (SEC ID n.° 40), los aminoácidos 76 a 80 de hPG y los aminoácidos 67 a 74 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.

Una composición según la exposición comprende un anticuerpo que reconoce un epítopo que incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de progastrina.

Más específicamente, una composición según la exposición comprende un anticuerpo que reconoce un epítopo de progastrina, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de progastrina, pudiendo incluir dicha secuencia de aminoácidos los residuos 10 a 14 de hPG, los residuos 9 a 14 de hPG, los residuos 4 a 10 de hPG, los residuos 2 a 10 de hPG o los residuos 2 a 14 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.

Más específicamente, una composición según la exposición comprende un anticuerpo que reconoce un epítopo de progastrina, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de progastrina, pudiendo incluir dicha secuencia de aminoácidos los residuos 71 a 74 de hPG, los residuos 69 a 73 de hPG, los residuos 71 a 80 de hPG (SEC ID n.° 40), los residuos 76 a 80 de hPG o los residuos 67 a 74 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.

En particular, dicho procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico según la exposición, dicho procedimiento comprende una etapa de poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con una primera molécula que se une a una primera parte de progastrina y con una segunda molécula que se une a una segunda parte de progastrina. Más particularmente, cuando dicha molécula de unión a progastrina es un anticuerpo, una muestra biológica de un sujeto se pone en contacto con un anticuerpo que se une a un primer epítopo de progastrina y con un segundo anticuerpo que se une a un segundo epítopo de progastrina.

Preferentemente, el procedimiento de la presente exposición para el diagnóstico de cáncer gástrico comprende la detección de progastrina en una muestra biológica de un sujeto humano.

Más preferentemente, el procedimiento de la presente exposición para el diagnóstico de cáncer gástrico comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra biológica de un sujeto humano.

En particular, el procedimiento de la presente exposición para el diagnóstico de cáncer gástrico comprende la detección de la concentración de progastrina en una muestra biológica de un sujeto humano, seleccionándose dicha muestra biológica de entre sangre, suero y plasma.

Todavía preferentemente, el procedimiento de la presente exposición comprende poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se describió anteriormente, indicando la unión de dicho anticuerpo anti-hPG en la muestra la presencia de cáncer gástrico en dicho sujeto.

Más particularmente, el procedimiento de la presente exposición comprende poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se describió anteriormente, siendo una concentración de progastrina superior a 10 pM en dicho plasma indicativa de la presencia de cáncer gástrico en dicho sujeto.

Más preferentemente, el procedimiento de la presente exposición comprende poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se describió anteriormente, siendo una concentración de progastrina superior a 10 pM, 20 pM, 30 pM o 40 pM en dicha muestra indicativa de la presencia de cáncer gástrico en dicho sujeto.

Todavía más preferentemente, el procedimiento de la presente exposición comprende poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se describió anteriormente, siendo una concentración de progastrina superior a 10 pM, preferentemente 20 pM, más preferentemente 30 pM, todavía más preferentemente 40 pM, incluso más preferentemente 50 pM, en dicha muestra indicativa de la presencia de cáncer gástrico metastatizado en dicho sujeto.

La presente exposición también se refiere a procedimientos para monitorizar la eficacia de un tratamiento de cáncer gástrico en un paciente, tales como quimioterapia, bioterapia, inmunoterapia o terapia con anticuerpos, determinando la concentración de progastrina en una primera muestra, tal como un fluido corporal o una biopsia de cáncer gástrico, obtenida de un paciente antes del tratamiento de cáncer gástrico, y luego comparando la concentración de progastrina en la primera muestra con la de una segunda muestra obtenida del mismo paciente después del tratamiento, en los que una reducción de la concentración de progastrina en dicha segunda muestra en comparación con dicha primera muestra indica que el tratamiento fue eficaz.

En una forma de realización particular, un procedimiento según la exposición comprende comparar la concentración de progastrina en una muestra biológica obtenida de un paciente con un valor predeterminado de concentración de progastrina en la muestra, más particularmente, dicho valor predeterminado se elige de entre: una media, o un promedio, de valores de la muestra basándose en la determinación de la media, o del promedio, del valor en una población libre de cáncer gástrico, un valor de concentración de progastrina obtenido cuando se sabía que el paciente estaba libre de cáncer gástrico.

En una forma de realización particular, un procedimiento según la exposición para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra de dicho paciente y una segunda prueba de diagnóstico de cáncer gástrico. Más preferentemente, un procedimiento según la exposición para el diagnóstico in vitro de cáncer gástrico comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra de dicho paciente y una segunda prueba de diagnóstico de cáncer gástrico, comprendiendo dicha segunda prueba de diagnóstico la detección de un biomarcador particular elegido de entre: pepsinógeno, grelina, factor de trébol 3 (TFF3) y antígeno circulante asociado a GC (MG7-Ag) (Leja et al., 2014).

En particular, la exposición describe un procedimiento que comprende la determinación del nivel de progastrina a lo largo del tiempo en muestras de un paciente que se ha tratado, o está tratándose, de cáncer gástrico.

Adicionalmente, el objeto de la presente exposición se refiere a una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico, comprendiendo dicha composición un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Las composiciones de anticuerpo para su utilización en los procedimientos de la exposición pueden prepararse como formulaciones diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, una suspensión acuosa, para administración mediante una variedad de vías, incluyendo, pero sin limitarse a, administración parenteral, intratecal, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, infusión o en bolo. En algunas formas de realización, la composición se formula para administración parenteral, y en algunas formas de realización específicas, inyección intravenosa mediante infusión.

En una forma de realización particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición comprende una dosis eficaz de los anticuerpos anti-progastrina de la exposición que oscila entre 0,001 mg/kg y aproximadamente 250 mg/kg, que puede suministrarse en una única administración o a lo largo de múltiples administraciones separadas.

En una forma de realización particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición comprende un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, seleccionado de entre anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos camelizados, anticuerpos IgA1, anticuerpos IgA2, anticuerpos IgD, anticuerpos IgE, anticuerpos IgG1, anticuerpos IgG2, anticuerpos IgG3, anticuerpos IgG4 y anticuerpos IgM. Preferentemente, dichos anticuerpos son los descritos anteriormente. Más preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos humanizados.

En una forma de realización más particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición comprende un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que presenta una afinidad por la progastrina de por lo menos 5000 nM, por lo menos 500 nM, 100 nM, 80 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM o por lo menos 0.1 pM, tal como se determina mediante un procedimiento tal como el anteriormente descrito.

En una forma de realización incluso más particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico comprende un anticuerpo de unión a progastrina, siendo dicha molécula de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, un anticuerpo neutralizante.

La expresión “anticuerpo neutralizante anti-PG” designa un anticuerpo que se une a PG y bloquea la señalización dependiente de PG, dando como resultado la inhibición de las respuestas inducidas por PG en células tumorales, y particularmente en células de tumor gástrico. La inhibición de las respuestas inducidas por PG de células de cáncer gástrico puede estar mediada por la represión de la diferenciación celular, la represión de la muerte celular y/o la estimulación de la proliferación celular.

En otra forma de realización particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico comprende un anticuerpo de unión a progastrina, siendo dicha molécula de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, un anticuerpo humanizado.

En una forma de realización particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico comprende un anticuerpo de unión a progastrina, conjugándose dicha molécula de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, con una molécula citotóxica.

En otra forma de realización particular, una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico en un paciente comprende un anticuerpo de unión a progastrina, en la que a dicho paciente se le ha diagnosticado cáncer gástrico mediante un procedimiento según la presente exposición, siendo una concentración de progastrina superior en una muestra biológica de dicho paciente que en una muestra de referencia.

En un aspecto más particular, la presente exposición se refiere a una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición, seleccionándose dicho anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de entre anticuerpos anti-progastrina N-terminales y anticuerpos anti-progastrina C-terminales.

Adicionalmente, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición y un portador farmacéuticamente aceptable. Más específicamente, la composición farmacéutica para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición comprende un anticuerpo tal como se describió anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

Más particularmente, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición y un portador farmacéuticamente aceptable, administrándose dicho anticuerpo anti-progastrina a una dosis de entre 0.001 mg/kg y 250 mg/kg, y preferentemente a una dosis de por lo menos 0.005 mg/kg, por lo menos 0.01 mg/kg, por lo menos 0.05 mg/kg, por lo menos 0.1 mg/kg, por lo menos 0.5 mg/kg, por lo menos 1 mg/kg, por lo menos 5 mg/kg, por lo menos 10 mg/kg, por lo menos 50 mg/kg o por lo menos 100 mg/kg. Adicionalmente, la presente exposición se refiere a un kit de elementos que comprende una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico, según la exposición, y una molécula terapéutica anticancerosa.

De hecho, el tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-PG tal como se describe en la presente memoria puede combinarse con, o ser complementario a, otra terapia. Los ejemplos no limitativos de otra terapia incluyen tratamiento quimioterápico, radioterapia, resección quirúrgica y terapia con anticuerpos.

Adicionalmente, la presente exposición se refiere a un kit de elementos que comprende una composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico, según la exposición, y una molécula terapéutica anticancerosa elegida de entre: una molécula quimioterápica, una molécula de terapia dirigida.

En una forma de realización particular, la presente exposición se refiere a kits de elementos que comprenden, para la administración simultánea, secuencial o por separado, una composición para el tratamiento de cáncer gástrico según la exposición y una molécula quimioterápica. Las moléculas quimioterápicas útiles para este propósito incluyen, pero no se limitan a, antagonistas de folato, antagonistas de purina, antagonistas de pirimidina, moléculas alquilantes de ADN, fármacos reticulantes de ADN, antibióticos, complejos de platino, inhibidores del proteasoma, venenos del huso mitótico, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de tirosina cinasa y otros.

En otra forma de realización particular, la presente exposición se refiere a kits de elementos que comprenden, para la administración simultánea, secuencial o por separado, una composición según la exposición y una composición que comprende otra molécula de terapia dirigida. Tal molécula de terapia dirigida incluye, pero no se limita a, anticuerpos que seleccionan como diana EGFR, tales como cetuximab o panitumumab, anticuerpos que seleccionan como diana VEGF, tales como bevacizumab, anticuerpos que seleccionan como diana HER2, tales como trastuzumab o pertuzumab, anticuerpos que seleccionan como diana PD-1 y PDL-1, tales como pembrolizumab, anticuerpos que seleccionan como diana CTLA-4, tales como ipilimumab, fármacos de molécula pequeña que seleccionan como diana EGFR, tales como erlotinib, fármacos de molécula pequeña que seleccionan como diana BRAF, tales como vemurafenib o dabrafenib, una proteína de fusión recombinante que selecciona como diana VEGF, tal como aflibercept.

Adicionalmente, la presente exposición se refiere a la utilización de un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para el diagnóstico de cáncer gástrico.

Adicionalmente, la presente exposición se refiere a la utilización de un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico.

Más particularmente, la presente exposición se refiere a la utilización de un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico en un paciente, habiéndose determinado la concentración de progastrina en una muestra biológica de dicho paciente y siendo superior a la concentración de progastrina de una muestra biológica de referencia.

Más particularmente, la presente exposición se refiere a la utilización de un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico en un paciente, presentando dicho paciente metástasis.

Incluso más particularmente, la presente exposición se refiere a la utilización de un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico en un paciente, presentandodicho paciente metástasis y habiéndose determinado la concentración de progastrina en una muestra biológica de dicho paciente y siendo superior a la concentración de progastrina de una muestra biológica de referencia.

Los constituyentes de los que se compone la combinación pueden administrarse de manera simultánea, por separado o secuencialmente de manera que se obtenga la máxima eficacia de la combinación; siendo posible que cada administración varíe en cuanto a su duración desde una administración rápida hasta una perfusión continua. Tal como se utiliza en la presente memoria, “administración simultánea” se refiere a la administración de los dos compuestos de la composición según una forma farmacéutica individual y única. Tal como se utiliza en la presente memoria, “administración por separado” se refiere a la administración, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composición según la exposición en formas farmacéuticas distintas. Tal como se utiliza en la presente memoria, “administración secuencial” se refiere a la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición según la exposición, cada uno en una forma farmacéutica distinta.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la concentración o cantidad mínima de un compuesto (o de compuestos) que es eficaz para prevenir, aliviar, reducir o mejorar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del paciente que está tratándose.

Leyenda de las figuras

Figura 1: concentración plasmática media de progastrina en pacientes con cáncer gástrico (n=15) y en pacientes de control (n=103) - prueba de Mann Whitney bilateral, ** p<0,001

Figura 2: número de esferas de AGS formadas tras el tratamiento con anticuerpo humanizado de control (CT Hz) o anti-PG (PG Hz) en condiciones de ultrabaja adherencia - prueba de la t bilateral, * p<0,05.

Ejemplos

Ejemplo 1 (ejemplo ilustrativo): detección de la concentración plasmática de progastrina utilizando anticuerpos policlonales

Se cuantificaron los niveles en plasma de progastrina mediante ELISA a través de la utilización de dos anticuerpos anti-progastrina específicos: los anticuerpos de captura se recubren sobre los pocillos de la placa, mientras que los anticuerpos de revelado se utilizan para detectar la progastrina y mediar en el revelado de la señal.

En el presente ejemplo, la cuantificación se basa en el procedimiento de ELISA que permite, a través de la utilización de un sustrato cuya reacción emite luz, asignar un valor proporcional a la cantidad de luminiscencia de anticuerpos unidos al antígeno retenido por los anticuerpos de captura.

Material

Los reactivos y el aparato se enumeran en la tabla 7:

Tabla 7

Los anticuerpos policlonales se obtuvieron inmunizando a un conejo con progastrina N-terminal (SEC ID n.° 2) o con progastrina C-terminal que corresponde a los aminoácidos 71 a 80 de hPG y tiene la secuencia FGRRSAEDEN (SEC ID n.°40), según protocolos convencionales.

Las características de unión de los anticuerpos policlonales contra progastrina utilizados en este ensayo son las siguientes: ausencia de unión a G34-Gly, g 34, G17-Gly, G17, unión a progastrina de longitud completa.

Se recubren placas de 96 pocillos preparando una disolución de carbonato/bicarbonato de sodio, 50 mM, pH 9.6, disolviendo el contenido de una cápsula en 100 ml de agua MilliQ. Se prepara una disolución de anticuerpo de captura (3 |ig/ml), correspondiente a anticuerpos policlonales obtenidos utilizando la parte C-terminal de progastrina FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40), en tampón carbonato. Se añaden 100 microlitros de disolución de anticuerpo a cada pocillo y se incuba a 4°C durante 16 horas (1 noche). Luego se bloquean las placas eliminando la disolución de anticuerpo y lavando 3 veces con 300 |il de 1X PBS / Tween-20 al 0,1%, luego añadiendo 200 |il de tampón de bloqueo (1X pBS / Tween-20 al 0,1% / b Sa al 0,1%) por pocillo, y se incuban 2 horas a 22°C. Luego se elimina el tampón de bloqueo y se lavan los pocillos 3 veces con 300 |il de 1X PBS / Tween-20 al 0,1%.

Se realiza la dilución de plasma de la manera siguiente: se utiliza plasma puro, diluido 1/2, 1/5 y 1/10. Las diluciones se preparan a partir de plasma puro en 1X PBS / Tween 20 al 0,1% / BSA al 0,1%.

Para la prueba de control, ELISA en presencia de una concentración conocida de progastrina, se prepara la dilución de progastrina de la manera siguiente: se prepara PG recombinante madre (progastrina humana de longitud completa producida en E. coli y purificada por afinidad con glutatión-agarosa/retirada de etiqueta (Tev)/purificación con el contador de IMAC/diálisis, del Instituto Pasteur, París, Francia) a una concentración de 0,45 mg/ml (45 microM), por triplicado. Los intervalos de concentraciones de progastrina se prepararon de la manera siguiente:

- Disolución A: dilución previa 1/10, 2 |il de disolución madre 18 |il del tampón

- Disolución B: dilución previa 1/100, 10 |il de A 90 |il del tampón

- Disolución C: dilución previa 1/1000, 10 |il de B 90 |il del tampón

- Disolución D: 500 pM, 5,55 |il de C 494,5 |il del diluyente

- Disolución E: 250 pM, 250 |il de D 250 |il del diluyente

- Disolución F: 100 pM, 200 |il de E 300 |il del diluyente

- Disolución G: 50 pM, 250 |il de F 250 |il del diluyente

- Disolución H: 25 pM, 200 |il de G 200 |il del diluyente

- Disolución I: 10 pM, 100 |il de H 150 |il del diluyente

El intervalo de PG recombinante es lineal y, por tanto, puede ser más o menos extenso según el anticuerpo utilizado.

Para la preparación de muestras de prueba, se apartan aproximadamente 500 |il de cada muestra y se almacenan hasta el análisis (y la confirmación, si fuera necesaria) de los resultados. Se someten a ensayo 100 |il de cada punto del intervalo y/o plasmas puros, se diluyen 1/2, 1/5 y 1/10, y se incuban durante 2 horas a 22°C en las placas.

Para el revelado de la prueba, se lavan las placas 3 veces con 300 |il de 1X PBS / Tween-20 al 0,1%. Se prepara una disolución del anticuerpo policlonal de conejo anti-progastrina, en la que dichos anticuerpos se han obtenido utilizando la parte N-terminal de progastrina como inmunógeno, acoplada a biotina a 0,5 |ig/ml, mediante dilución en 1X PBS / Tween-20 al 0,1% / BSA al 0,1%. Se añaden 100 |il de esta disolución a cada pocillo. La incubación tiene lugar durante 1 hora a 22°C. El revelado con estreptavidina-HRP se realiza retirando el anticuerpo de detección y lavando 3 veces con 300 |il de 1X PBS / Tween-20 al 0,1%, luego preparando una disolución de estreptavidina-HRP a 20 ng/ml diluida en 1X PBS / Tween-20 al 0,1% / BSA al 0,1%, añadiéndose 100 |il de esta disolución a cada pocillo, antes de la incubación durante 1 hora a 22°C.

La detección consiste en eliminar la estreptavidina-HRP y lavar 3 veces con 300 |il de 1X PBS / Tween-20 al 0,1%, luego añadir 100 |il de disolución de sustrato quimioluminiscente por pocillo. La disolución de sustrato se prepara mezclando volúmenes iguales de las dos disoluciones del kit SuperSignal ELISA Femto, 20 ml 20 ml, 30 minutos antes de su utilización y se almacena a temperatura ambiente en la oscuridad. La luminiscencia se lee después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Para cada condición, la prueba se realiza por triplicado y los resultados de los intervalos se presentarán como un gráfico que muestra el cambio en la luminiscencia en función de la concentración de progastrina. Para cada dilución de plasma, la concentración de progastrina se determina utilizando la ecuación de la recta de regresión lineal del intervalo correspondiente (intervalo 1/10° para una muestra diluida 1/10°).

Procedimientos y resultados

La mediana de la concentración plasmática de progastrina es de 17.9 pM en pacientes con cáncer gástrico (n=15), mientras que la mediana de la concentración plasmática de progastrina es de 0 pM en pacientes de control (n=103) (figura 1). Estos datos demuestran que los pacientes con cáncer gástrico presentan mayores niveles de progastrina en su plasma en comparación con individuos de control sanos.

Estos datos demuestran que los pacientes con cáncer gástrico presentan una mayor concentración de progastrina en su plasma en comparación con individuos de control sanos.

Ejemplo 2 (ejemplo ilustrativo): detección de la concentración de progastrina utilizando anticuerpos monoclonales anti-progastrina

Se recubren los pocillos de placas Nunc MaxiSORP de 96 pocillos con un primer anticuerpo específico de progastrina de la manera siguiente. Se diluyen anticuerpos monoclonales anti-progastrina específicos para la región carboxilo-terminal de progastrina hasta una concentración de 3 |ig/ml en una disolución de tampón carbonato/bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6, en agua MilliQ.

Luego se añaden un total de 100 |il de la disolución de anticuerpo a cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incuban durante la noche a 4°C. Después de la unión, se retira la disolución de anticuerpo de los pocillos, que luego se lavan tres veces con 100 |il de tampón de lavado (1X PBS / Tween-20 al 0,1%). Luego se añaden un total de 100 |il de tampón de bloqueo (1X PBS / Tween-20 al 0,1% / BSA al 0,1%) a cada pocillo y se incuban durante 2 horas a 22°C. Luego se retira el tampón de bloqueo y se lavan los pocillos tres veces con tampón de lavado. Luego se añaden a los pocillos muestras de plasma o suero aisladas de pacientes en un volumen de 100 |il en una serie de dilución, normalmente diluciones 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10, y luego se incuban durante 2 horas a 22°C. Se analizan las muestras de plasma o suero por duplicado.

Los ensayos también incluyen dos curvas de calibración. La primera curva de calibración se prepara utilizando diluciones de progastrina recombinante hasta una cantidad final de 1 ng, 0,5 ng, 0,25 ng, 0,1 ng, 0,05 ng, 0,01 ng y 0 ng por pocillo. La segunda curva de calibración, que sirve como control negativo, se prepara a partir de suero humano negativo para progastrina diluido en tampón de bloqueo a las mismas diluciones que las muestras de prueba, es decir, 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10. Alternativamente, cuando están sometiéndose a ensayo muestras de plasma, la segunda curva de calibración, que sirve como control negativo, se prepara a partir de plasma humano negativo ^{para progastrina diluido en tampón de bloqueo a las mismas diluciones que las muestras de prueba, es decir,} 1 :1 , 1:2, 1:5 y 1:10.

Después de completar la incubación con las muestras de plasma o suero, se retira el contenido de los pocillos y se lavan los pocillos tres veces con tampón de lavado, 100 |il/pocillo, después de lo cual se detecta la progastrina unido al primer anticuerpo utilizando un segundo anticuerpo específico para progastrina, de la manera siguiente.

Se diluyen anticuerpos monoclonales anti-progastrina acoplados con biotina específicos para la región aminoterminal de progastrina en tampón de bloqueo hasta una concentración de entre 0,1 y 10 |il g/ml, dependiendo del anticuerpo. Luego se añaden un total de 100 |il de la disolución de anticuerpo a cada pocillo y se incuban durante 1 hora a 22°C.

Después de completar la unión del anticuerpo secundario, se lavan las placas tres veces con tampón de lavado, 100 |il/pocillo, después de lo cual se añaden 100 |il de una disolución de estreptavidina-HRP (25 ng/ml en tampón de bloqueo) a cada pocillo y se incuban durante 1 hora a 22°C. Después de completar la incubación con la disolución de estreptavidina-HRP, se lavan las placas tres veces con tampón de lavado, 100 ^l/pocillo. Después de eso, se añaden 100 |il por pocillo de sustrato quimioluminiscente, preparado utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente de máxima sensibilidad SuperSignal ELISA Femto de Pierce, se incuban durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se leen en un luminómetro.

Basándose en las lecturas con el luminómetro, se utiliza análisis de regresión lineal para derivar la ecuación de las rectas correspondientes a los datos de la curva de calibración. Utilizando esta ecuación, entonces se calcula la concentración de progastrina en las diversas muestras de paciente.

La mediana de la concentración plasmática de progastrina se calcula en pacientes con cáncer gástrico y se compara con la mediana de la concentración plasmática de progastrina en plasma de pacientes de control. Estos datos demuestran que los pacientes con cáncer gástrico presentaron niveles elevados de progastrina en su plasma en comparación con individuos de control sanos.

Ejemplo 3: actividad neutralizante de anticuerpos anti-hPG en líneas celulares de cáncer

3.1. Actividad neutralizante de anticuerpos monoclonales anti-hPG

KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1 son líneas celulares habitualmente utilizadas para estudiar el cáncer gástrico que producen y secretan progastrina. Se someten a prueba los anticuerpos monoclonales contra PG para determinar su capacidad para inhibir la proliferación en estas líneas celulares diferentes. Se somete a prueba la supervivencia de las células de cada línea celular, KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1, utilizando anticuerpos monoclonales anti-hPG diferentes.

Para cada experimento, se siembran 50.000 células en placas de 6 pocillos en medio que contiene suero de ternero fetal y se incuban durante 8 horas. Se les priva de suero a las células durante la noche y, comenzando a las 24 horas después de la siembra (tiempo “T0”), se tratan las células por sextuplicado cada 12 h durante 48 horas, en ausencia de suero de ternero fetal, con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpos monoclonales de control (anticuerpo monoclonal anti-puromicina) (CT AcM), o con entre 1 y 20 |ig/ml de AcM anti-hPG, siendo dicho AcM un anticuerpo monoclonal anti-hPG C-terminal o un anticuerpo monoclonal anti-hPG N-terminal.

Dicho AcM es un anticuerpo anti-hPG C-terminal seleccionado de entre:

- un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 28, 29 y 30, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 31, 32 y 33,

- un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 34, 35 y 36, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 37, 38 y 39,

o un anticuerpo anti-hPG N-terminal seleccionado de entre:

- Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 4, 5 y 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 7, 8 y 9,

- Un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 13, 14 y 15, respectivamente,

- Un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 16, 17 y 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 19, 20 y 21, respectivamente,

- Un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os22, 23 y 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 25, 26 y 27, respectivamente.

Para cada experimento, se cuenta el número de células a T0 en un pocillo de control.

Específicamente, se cuenta el número de células vivas tanto en los pocillos de control como en los tratados con AcM anti-hPG a las 48 horas, luego se calcula la diferencia entre cada recuento de células y el recuento de células determinado a T0. Luego se expresa el número resultante de células tratadas con AcM anti-hPG como porcentaje del número de células tratadas con AcM de control.

El tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hPG reduce el número de células en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control. La significación estadística se determina utilizando ANOVA unilateral con una prueba a posteriori de Tukey: * = p<0,05, ** = p<0,01 y *** = p<0,001. En cada línea celular, los anticuerpos anti-hPG reducen la supervivencia celular.

3.2. Actividad neutralizante de anticuerpos humanizados anti-hPG sobre la supervivencia celular

Se someten a prueba anticuerpos humanizados contra PG para determinar su capacidad para inhibir la proliferación de las líneas celulares KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1. Se somete a prueba la supervivencia de las células de cada línea celular, KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1, utilizando anticuerpos humanizados anti-hPG diferentes.

Para cada experimento, se siembran 50.000 células en placas de 6 pocillos en medio que contiene suero de ternero fetal y se incuban durante 8 horas. Se les priva de suero a las células durante la noche y, comenzando a las 24 horas después de la siembra (tiempo “T0”), se tratan las células por sextuplicado cada 12 h durante 48 horas, en ausencia de suero de ternero fetal, con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpos humanizados de control (anticuerpo anti-FcG1 humana, de BioXCell) (CT Hz), o con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpo Hz anti-hPG, siendo dicho anticuerpo Hz un anticuerpo humanizado anti-hPG C-terminal o un anticuerpo humanizado anti-hPG N-terminal. Para cada experimento, se cuenta el número de células a T0 en un pocillo de control.

Específicamente, se cuenta el número de células vivas tanto en los pocilios de control como en los tratados con anticuerpo Hz anti-hPG a las 48 horas, luego se calcula la diferencia entre cada recuento de células y el recuento de células determinado a T0. Luego se expresa el número resultante de células tratadas con anticuerpo Hz antihPG como porcentaje del número de células tratadas con AcM de control.

El tratamiento con anticuerpos Hz anti-hPG reduce el número de células en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control. La significación estadística se determina utilizando ANOVA unilateral con una prueba a posteriori de Tukey: * = p<0,05, ** = p<0,01 y *** = p<0,001. En cada línea celular, los anticuerpos anti-hPG reducen la supervivencia celular.

3.3. Actividad neutralizante de anticuerpos monoclonales anti-hPG sobre la frecuencia de células madre cancerosas

Se someten a prueba anticuerpos monoclonales contra PG para determinar su capacidad para reducir la frecuencia de células madre cancerosas (CSC) en las líneas celulares KATO-III, AGS, MGC-803 y s NU-1 utilizando el ensayo de dilución limitante extrema (ELDA). Se somete a prueba la frecuencia de CSC de cada línea celular, KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1, utilizando anticuerpos monoclonales anti-hPG diferentes.

Para cada experimento, se siembran las células en P96 (placas de 96 pocillos) de ultrabaja adherencia (ULA) a concentraciones celulares fijas por pocillo utilizando un citómetro de flujo FACS Aria, y se utiliza un intervalo de concentraciones de entre una y 500 células por pocillo. Se cultivan las células durante hasta 11 días en placas de ULA con medio M11 (Macari et al., Oncogene, 2015) y se tratan cada 3 o 4 días con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpos monoclonales de control (anticuerpo monoclonal anti-puromicina) (CT AcM), o con entre 1 y 20 |ig/ml de AcM anti-hPG, siendo dicho AcM un anticuerpo monoclonal anti-hPG C-terminal o un anticuerpo monoclonal anti-hPG N-terminal.

Específicamente, al final de la fase de incubación, se observan las placas con un microscopio de contraste de fases y se evalúa el número de pocillos positivos por concentración celular. Finalmente, se utiliza la herramienta web ELDA (http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) para calcular las frecuencias de CSC de cada grupo de tratamiento y someter a prueba cualquier diferencia estadística entre grupos (prueba de la Chi-cuadrado modificada).

El tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hPG reduce la frecuencia de CSC en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control.

3.4. Actividad neutralizante de anticuerpos humanizados anti-hPG sobre la frecuencia de células madre cancerosas

• Ensayo de formación de esferas

Se someten a prueba anticuerpos humanizados contra PG para determinar su capacidad para reducir la frecuencia de células madre cancerosas (CSC) en las líneas celulares KATO-III, AGS y SNU-1 utilizando un ensayo de formación de esferas.

Para cada experimento, se siembran 700 células en placas de 24 pocillos de ultrabaja adherencia (ULA). Se cultivan las células durante hasta 7 días en placas de ULA con medio M11 (Macari et al., Oncogene, 2015) y se tratan cada 3 o 4 días con 20 |ig/ml de anticuerpos humanizados de control (anticuerpo anti-FcG1 humana, de BioXCell) (CT Hz), o con 20 |ig/ml de anticuerpo Hz anti-hPG (PG Hz), siendo dicho anticuerpo Hz un anticuerpo humanizado anti-hPG C-terminal o un anticuerpo humanizado anti-hPG N-terminal.

Específicamente, al final de la fase de incubación, se toman fotografías de los pocillos mediante microscopía de campo claro, se analizan las imágenes y se cuentan las esferas con un diámetro medio superior a 25 |im.

El tratamiento con anticuerpos humanizados anti-hPG reduce la frecuencia de CSC en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control.

• Ensayo de dilución limitante extrema

Se someten a prueba anticuerpos humanizados contra PG para determinar su capacidad para reducir la frecuencia de células madre cancerosas (CSC) en las líneas celulares KATO-III, AGS y MGC-803 utilizando un ensayo de dilución limitante extrema (ELDA). Se somete a prueba la frecuencia de CSC de cada línea celular, KATO-III, AGS y MGC-803, utilizando anticuerpos humanizados anti-hPG diferentes.

Para cada experimento, se siembran las células en P96 (placas de 96 pocillos) de ultrabaja adherencia (ULA) a concentraciones celulares fijas por pocillo utilizando un citómetro de flujo FACS Aria, y se utiliza un intervalo de concentraciones de entre una y 500 células por pocillo. Se cultivan las células durante hasta 11 días en placas de ULA con medio M11 (Macari et al., Oncogene, 2015) y se tratan cada 3 o 4 días con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpos humanizados de control (anticuerpo anti-FcG1 humana, de BioXCell) (CT Hz) o con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpo Hz anti-hPG, siendo dicho anticuerpo Hz un anticuerpo humanizado anti-hPG C-terminal o un anticuerpo humanizado anti-hPG N-terminal.

Específicamente, al final de la fase de incubación, se observan las placas con un microscopio de contraste de fases y se evalúa el número de pocillos positivos por concentración celular. Finalmente, se utiliza la herramienta web ELDA (http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) para calcular las frecuencias de CSC de cada grupo de tratamiento y someter a prueba cualquier diferencia estadística entre grupos (prueba de la Chi-cuadrado modificada).

El tratamiento con anticuerpos humanizados anti-hPG reduce la frecuencia de CSC en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control.

3.5. Actividad neutralizante de anticuerpos monoclonales anti-hPG sobre la ruta de WNT/p-catenina

KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1 son líneas celulares habitualmente utilizadas para estudiar el cáncer gástrico que producen y secretan progastrina. Se sometieron a prueba anticuerpos monoclonales contra PG para determinar su capacidad para inhibir la ruta de WNT/p-catenina en estas líneas celulares diferentes utilizando la expresión de la proteína survivina, un gen diana de la ruta de WNT/p-catenina bien conocido, como lectura. Se somete a prueba la expresión de survivina de cada línea celular, KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1, utilizando anticuerpos monoclonales anti-hPG diferentes.

Para cada experimento, se siembran 50.000 células en placas de 6 pocillos en medio que contiene suero de ternero fetal y se incuban durante 8 horas. Se les priva de suero a las células durante la noche y, comenzando 24 horas después de la siembra, se tratan las células por cuadruplicado cada 12 h durante 72 horas, en ausencia de suero de ternero fetal, con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpos monoclonales de control (anticuerpo monoclonal antipuromicina) (CT AcM) o con entre 1 y 20 |ig/ml de AcM anti-hPG, siendo dicho AcM un anticuerpo monoclonal antihPG C-terminal o un anticuerpo monoclonal anti-hPG N-terminal.

Específicamente, después de 72 horas de tratamiento, se recogen las células y se extraen las proteínas totales utilizando tampón RIPA. Luego se somete una misma cantidad de proteína de células tratadas con CT AcM o AcM anti-hPG a inmunotransferencia de tipo Western utilizando anticuerpo anti-survivina (anticuerpo monoclonal, #2802 de Cell Signaling) y anticuerpo anti-actina como control de carga (anticuerpo monoclonal, #A4700 de SIGMA). La cuantificación se realiza utilizando el sistema GBOX Chemi de Syngene.

El tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-hPG reduce la expresión de survivina en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control. La significación estadística se determina utilizando una prueba de la T de Student para datos independientes: * = p<0,05, ** = p<0,01 y *** = p<0,001.

3.6. Actividad neutralizante de anticuerpos humanizados anti-hPG sobre la ruta de WNT/p-catenina

Se someten a prueba anticuerpos humanizados contra PG para determinar su capacidad para inhibir la ruta de WNT/p-catenina en las líneas celulares KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1 utilizando la expresión de la proteína survivina, un gen diana de la ruta de WNT/p-catenina bien conocido, como lectura. Se somete a prueba la expresión de survivina de cada línea celular, KATO-III, AGS, MGC-803 y SNU-1, utilizando anticuerpos humanizados antihPG diferentes.

Para cada experimento, se siembran 50.000 células en placas de 6 pocillos en medio que contiene suero de ternero fetal y se incuban durante 8 horas. Se les priva de suero a las células durante la noche y, comenzando 24 horas después de la siembra, se tratan las células por cuadruplicado cada 12 h durante 72 horas, en ausencia de suero de ternero fetal, con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpos humanizados de control (anticuerpo anti-FcG1 humana, de BioXCell) (CT Hz) o con entre 1 y 20 |ig/ml de anticuerpo Hz anti-hPG, siendo dicho anticuerpo Hz un anticuerpo humanizado anti-hPG C-terminal o un anticuerpo humanizado anti-hPG N-terminal.

Específicamente, después de 72 horas de tratamiento, se recogen las células y se extraen las proteínas totales utilizando tampón RIPa . Luego se somete una misma cantidad de proteína de células tratadas con CT Hz o anticuerpo Hz anti-hPG a inmunotransferencia de tipo Western utilizando anticuerpo anti-survivina (anticuerpo monoclonal, #2802 de Cell Signaling) y anticuerpo anti-actina como control de carga (anticuerpo monoclonal, #A4700 de SIGMA). La cuantificación se realiza utilizando el sistema GBOX Chemi de Syngene.

El tratamiento con anticuerpos humanizados anti-hPG reduce la expresión de survivina en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control. La significación estadística se determina utilizando una prueba de la T de Student para datos independientes: * = p<0,05, ** = p<0,01 y *** = p<0,001.

Referencias bibliográficas

- Qing He et al., 2015. J Canc, 6, 448-456

- Yanaoka et al., Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008, 17(4)

- Pepe et al., J Natl Cancer Inst, 2008, Oct., 100(20)

- Leja et al., Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2014, Dic., 28(6)

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Composición para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico que comprende un anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la que:

• dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une específicamente a progastrina pero no se une a gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 prolongada con glicina (G17-Gly) o gastrina-34 prolongada con glicina (G34-Gly), y

• dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina es un anticuerpo elegido de entre:

- un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 4, 5 y 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 7, 8 y 9, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 10, 11 y 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os13, 14 y 15, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 16, 17 y 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 19, 20 y 21, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 22, 23 y 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 25, 26 y 27, respectivamente, - un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 28, 29 y 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 31, 32 y 33, respectivamente, y

- un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os34, 35 y 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.os 37, 38 y 39, respectivamente.

2. Composición para su utilización según la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.

3. Composición para su utilización según la reivindicación 2, en la que dicho anticuerpo monoclonal también comprende unas regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

4. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre anticuerpos anti-progastrina N-terminales y anticuerpos anti-progastrina C-terminales.

5. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo neutralizante.

6. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho anticuerpo monoclonal de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se conjuga con una molécula citotóxica.

7. Composición para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho cáncer gástrico es metastásico.

8. Composición farmacéutica para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico, en la que dicha composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

9. Kit de elementos para su utilización en la prevención o el tratamiento de cáncer gástrico que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una molécula terapéutica anticancerosa.

10. Kit de elementos para su utilización según la reivindicación 9, en el que dicha composición y dicha molécula terapéutica anticancerosa se administran de manera simultánea, secuencial o por separado.

11. Kit de elementos para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que dicha molécula terapéutica anticancerosa es una molécula quimioterápica.

12. Kit de elementos para su utilización según la reivindicación 11, en el que dicha molécula quimioterápica se elige de entre antagonistas de folato, antagonistas de purina, antagonistas de pirimidina, moléculas alquilantes de ADN, fármacos reticulantes de ADN, antibióticos, complejos de platino, inhibidores del proteasoma, venenos del huso mitótico, inhibidores de topoisomerasa e inhibidores de tirosina cinasa.

13. Kit de elementos para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en el que dicha molécula terapéutica anticancerosa se elige de entre anticuerpos que seleccionan como diana EGFR, tales como cetuximab o panitumumab, anticuerpos que seleccionan como diana VEGF, tales como bevacizumab, anticuerpos que seleccionan como diana HER2, tales como trastuzumab o pertuzumab, anticuerpos que seleccionan como diana PD-1 y PDL-1, tales como pembrolizumab, anticuerpos que seleccionan como diana CTLA-4, tales como ipilimumab, fármacos de molécula pequeña que seleccionan como diana EGFR, tales como erlotinib, fármacos de molécula pequeña que seleccionan como diana BRAF, tales como vemurafenib o dabrafenib, y una proteína de fusión recombinante que selecciona como diana VEGF, tal como aflibercept.