TW201938195A

TW201938195A - 抗rspo3抗體

Info

Publication number: TW201938195A
Application number: TW107143984A
Authority: TW
Inventors: 徐祖安; 洪慧貞; 張騰元; 全石
Original assignee: 財團法人國家衛生研究院
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2019-10-01
Also published as: TWI702050B; US11623951B2; KR20200096275A; JP2021508254A; WO2019113306A3; EP4115904A3; US20210163580A1; AU2018378668A1; EP4115904A2; CN111683680A; CN111683680B; EP3720492A2; JP7370997B2; WO2019113306A2; AU2018378668A2; EP3720492A4

Abstract

一種分離的抗體，包含：重鏈可變區序列的重鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該重鏈可變區序列係選自SEQ ID NOs：2、6、10和14；以及輕鏈可變區序列的輕鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該輕鏈可變區序列係選自SEQ ID NOs：4、8、12和16；其中，該抗體與RSPO3蛋白特異性地結合。

Description

抗RSPO3抗體

本申請案主張2018年12月7日於美國智慧財產局提出之臨時申請案第62/595,845號案之優先權，該等申請案之整體內容係合併於此參考。

R-脊椎蛋白(R-spondin，RSPO) 分泌蛋白有RSPO1、2、3和4四類，該蛋白家族包含血小板反應素I型重複區(thrombospondin type 1 repeat，TSR-1)之結構域 (domain)，參見Jin and Yoon(2012)，The international journal of biochemistry & cell biology (44): 2278-2287。人類的RSPO蛋白家族成員具有40%-60%的胺基酸序列相似性，分別由234至272個胺基酸組成，包含：(i)N端疏水性訊息胜肽，用於促進RSPO的分泌；(ii)兩個富含半胱胺酸的furin-like結構域(furin-like cysteine-rich domain，FU-CRD)；(iii) 血小板反應素I (TSR-1) 結構域；以及(iv) C端區域具有帶正電荷殘基且富含鹼性胺基酸結構域。其中，FU-CRD對於RSPO促進Wnt/β-catenin訊息傳遞(Wnt/β‑catenin-dependent signaling)具有調節功能，參見de Lau et al. (2012). Genome biology (13): 242；及 Kim et al. (2008). Molecular biology of the cell (19): 2588-2596。而TSR-1結構域則在Frizzled (Fz)/平面細胞極化(planar cell polarity，PCP)訊息傳遞調控中，扮演了穩定結構機轉之角色。

RSPO在脊椎動物發育和幹細胞生長中具有多效功能。一些研究證實RSPO可增強Wnt途徑的訊息傳遞，以活化b-catenin蛋白與Wnt配體，目前有兩個機制模型說明，參見Jin and Yoon (2012)； de Lau et al (2014). Genes & development (28): 305-316； Kontermann, R. E. (2012). Archives of biochemistry and biophysics (526): 194-205。其中一個模型提出RSPO係直接結合到LRP5/6和LGR4/5/6受體作為活化配體，在受體上和Wnt與FZD一起活化癌細胞中Wnt/b-catenin蛋白訊息傳遞，參見Wang et al. (2013) Genes & development (27): 1339-1344。或者，RSPO還可透過干擾DKK1介導的LRP6和Kremen結合，以拮抗DKK1介導的胞吞作用。在另一個模型中，RSPO結合至ZNFR3以及其同源物RNF43作為負回饋調節劑，以加速在細胞表面的FZD和LRP6受體的轉換率，參見Jin和Yoon (2012)。

WNT訊息傳遞涉及調控細胞增殖、分化、遷移以及生存，參見Niehrs (2012). Nature reviews. Molecular cell biology (13): 767-779。因此，研究WNT訊息傳遞途徑以做為治療癌症的可能標的，參見Madan和Virshup (2015). Molecular cancer therapeutics (14): 1087-1094。人類遺傳學研究和基因標靶法證實，RSPO具有成為經典和非經典WNT調節劑的能力。MacDonald等人(2009). Developmental cell (17): 9-26。RSPO3基因融合造成FZD和LRP5/6細胞表面結合，進而活化WNT訊息傳遞，參見 Madan et al. (2015). Oncogene (35): 2197-2207。於某些難以治療的癌症患者中，證實其具有RSPO融合基因，參見Madan et al. (2015)。舉例而言，在5-10％的結腸癌中可發現蛋白質酪胺酸磷酸酶受體K型(protein tyrosine phosphatase receptor type K)與RSPO3融合而形成(PTPRK)–RSPO3，參見Seshagiri et al (2012). Nature (488): 660-664。在10％的APC野生型結腸癌和1-11％的卵巢癌、食道癌、肺癌和頭頸癌中發現了活化的WNT訊息傳遞，參見Seshagiri et al. (2012)。在324個NSCLC患者中，大約有1~2 % 被診斷出具有EIF3E(e1)-RSPO2(e1)、及PTPRK(e1)-RSPO3(e2)、及PTPRK(e7)-RSPO3(e2)，參見Browning et al (2001). Trends in biochemical sciences (26): 284； Parker and Zhang (2013). Chinese journal of cancer (32): 594-603。最近有兩篇研究報告證實，RSPO3抗體對於具有RSPO3-融合基因或RSPO3-誘發下游 b-catenin蛋白過度表現之訊息傳遞的癌症具有拮抗活性，參見Storm et al (2016). Nature (529): 97-100；Chartier et al. (2016). Cancer research (76): 713-723。因此，經由增強的RSPO-Wnt訊息傳遞會驅動部分癌症。相關文獻指出RSPO3抗體對於包含結腸癌、肺癌和卵巢癌的多種癌症的抗癌治療具有顯著的成效。

在一態樣中，本發明揭露一種分離的抗體。該分離的抗體包含：源自重鏈可變區序列的重鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，重鏈可變區序列係選自SEQ ID NO：2、6、10和14；以及源自輕鏈可變區序列的輕鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，輕鏈可變區序列係選自SEQ ID NO：4、8、12和16；其中，該抗體與RSPO3蛋白特異性地結合。

在一些實施例中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係源自SEQ ID NO: 2，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係源自SEQ ID NO:4。

在一些實施例中，該抗體包含與SEQ ID NO: 2序列至少80%相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 4序列至少80%相同之一輕鏈可變區。

在一些實施例中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係源自SEQ ID NO: 6，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係源自SEQ ID NO:8。該抗體可包含與SEQ ID NO: 6序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 8 序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同之一輕鏈可變區。

在一些實施例中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 10，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO:12。該抗體可包含與SEQ ID NO: 10序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 12 序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同之一輕鏈可變區。

在一些實施例中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係源自SEQ ID NO: 14，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係源自SEQ ID NO:16。該抗體可包含與SEQ ID NO: 14序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 16 序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同之一輕鏈可變區。

本說明書所述之抗體可與RSPO3蛋白中的構形決定或線性表位結合。該抗體可為一IgG抗體、含有一Fc區的一抗體、一Fab片段、一Fab'片段、一F(ab')₂ 片段、一單鏈抗體、一單鏈可變區片段多聚體(scFv multimer)、一單價抗體、一多價抗體、或一嵌合抗體。

在一些實施例中，抗體是人源化的。在一些實施例中，該抗體與另一分子(例如，一小分子藥物、一細胞標靶部分、一細胞毒性劑、一免疫調節劑、一多肽、一核酸分子、一可檢測標記或一聚合物)共軛(conjugate)以產生免疫複合物。

本文還描述了一種分離的核酸分子，包含編碼本文所揭露之任何抗體之一核酸序列。

在另一態樣中，本文提供一種宿主細胞，含有該分離的核酸。

在一態樣中，揭露了一種組成物，其含有本文所述之抗體。該組成物可更包含一醫藥可接受之載體及/或另一治療劑(例如，另一種癌症藥物、細胞毒性劑或免疫調節劑)。

透過使細胞與一有效量的如本文所述之任何抗體接觸，本文所述之任何抗體可用於抑制細胞中的RSPO3或Wnt訊息傳遞。

透過使細胞與一有效量的該抗體接觸，該抗體也可被用於抑制癌細胞生長或癌細胞轉移。

在另一態樣中，本文記載了一種治療一主體的癌症的方法，包括向主體施用一有效劑量的如本文所揭露之任何抗體。

在一些實施例中，該癌症係RSPO3陽性癌症、RSPO3-融合陽性癌症、具有腺瘤性結腸瘜肉(APC)突變的癌症、具有β-catenin蛋白突變的癌症或具有WNT訊息傳遞過度活化的癌症。在一些實施例中，該方法還包括在向主體施用抗體之前，確定主體之癌症是否具有上述突變或畸變之一。該癌症可為結腸癌、白血病、結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、攝護腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤或頭頸癌。在一些實施例中，該方法更包含向該主體施用另一治療劑。

本文還提供了一種在一樣本中檢測RSPO3蛋白或其片段之方法。該方法包含使該樣本與本文所述之任何抗體接觸；以及測定該抗體和一RSPO3蛋白或其片段之間的特異性結合。在一些實施例中，該RSPO3蛋白係人類RSPO3。

本文描述了一種辨別與一RSPO3蛋白特異性地結合之一抗體變體的方法。該方法包含在本文所述之任何抗體之一或多個互補決定區中引入一或多個修飾以產生一抗體變體；以及辨別與一RSPO3蛋白特異性結合之一抗體變體。

在附圖和以下描述中記載了一或多個實施例的細節。根據說明書和圖式以及申請專利範圍，可輕易得知實施例的其他特徵、目的和優點。

本文描述了新穎抗RSPO3抗體。特別的是此人源化抗體hB1在體內及體外對於具有RSPO3-融合基因或RSPO3過度表現的癌症均展現了抗癌功效。下列數據表示：(1)hB1對於RSPO3的結合親合力達到pM範圍內；(2)在β-catenin蛋白TCF/LEF-Luc報導系統中，hB1和rosmantuzumab抗體展現相同的中和效力；(3)hB1和rosmantuzumab在CR3150結腸直腸癌PDX模型中展現相同的抗癌功效；(4)hB1在NCI-H2030和SNU-1411癌症異種移植模型中展現抗癌功效；(5)hB1可用於測定樣本中RSPO3的含量；以及(6)hB1和rosmantuzumab與不同的表位(epitope)結合。

下表列出抗體A4、A6、B1和hB1的重鏈和輕鏈可變區的序列。透過4種不同方法(IMGT、Chothia、KABAT和Honegger)所預測的互補決定區(CDR)也列在表中。

抗體 A4
粗體文字: 互補決定區

抗體A6
粗體文字: 互補決定區

抗體 B1
粗體文字: 互補決定區

抗體 hB1
粗體文字: 互補決定區

本文揭露了一種抗RSPO3抗體，包含：源自重鏈可變區序列的重鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，重鏈可變區序列係選自SEQ ID NOs：2、6、10和14；以及源自輕鏈可變區序列的輕鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，輕鏈可變區序列係選自SEQ ID NOs：4、8、12和16。在各區中的三個CDR如上所示。本領域具有通常知識者可利用本領域中所習知的各種方法辨別CDR。

該抗體可與RSPO3特異性地結合，即比其他非RSPO3蛋白具有更高的RSPO3結合親和力，且可破壞RSPO3與其配體間的相互作用。該抗體可結合的RSPO3蛋白包括人類RSPO3(例如，GenBank登錄號NP_116173)、小鼠RSPO3或其他哺乳動物同源物。在一些實施例中，該抗體與抗體A4、A6、B1或hB1結合相同的表位。

本文所用之術語「抗體」包括具有抗原結合活性的各種抗體結構，包括但不限於：單株抗體、多株抗體、全長抗體或其片段、含有Fc區的抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab')₂ 片段、單鏈抗體、單鏈可變區片段多聚體(scFv multimer)、單價抗體、多價抗體、人源化抗體和嵌合抗體。

本文所揭露的抗體序列及其CDR，本領域具有通常知識者可利用本文所述之方法或本領域習知之方法，例如重組方法，以各種形式產生一抗RSPO3抗體。

本文亦揭露一種分離的核酸分子(例如，表現載體)，其包括編碼本文所述的抗RSPO3抗體或其成分的核酸序列。舉例而言，核酸序列可編碼SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16，或是含有一或多個來自這些序列的CDR的一多肽。本文亦提供一種宿主細胞，其含有該核酸分子。該核酸分子和宿主細胞可用來產生該抗RSPO3抗體。

任何本文所述抗體可用於抑制RSPO3與其配體間的結合、抑制RSPO3功能、檢測樣本中的RSPO3蛋白或其片段(例如，在免疫測定中)、結合表現RSPO3的組織或細胞(例如，用於辨別一細胞或是分離一RSPO3表現細胞)、抑制癌症細胞的生長或轉移、治療患者的癌症或是產生抗RSPO3抗體變體。

術語「樣本」可指涉任何生物樣本，例如體液樣本、血液樣本、細胞樣本、尿液樣本、唾液樣本或組織樣本。

可將本文所述的任何抗RSPO3抗體配製成適合於各種給藥途徑的醫藥組成物，例如靜脈內、關節內、結膜、顱內、腹膜內、胸膜內、肌肉內、脊髓或皮下給藥途徑。藥物組成物可為水溶液或冷凍乾燥製劑。其可含有醫藥可接受之載體，例如緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。醫藥組成物可包括其他與抗RSPO3抗體一起作用的活性成分，例如其他治療劑。醫藥組成物可用於治療主體中的癌症或腫瘤。

抗RSPO3抗體還可與另一分子或部分共軛，例如蛋白質或胜肽、藥物(例如細胞毒性藥物)、可偵測之標記(例如螢光標記)或是固體支撐(例如珠或盤)。這些抗體複合物可用於各種目的，例如治療癌症或偵測樣本中的RSPO3。

任何一種抗RSPO3抗體均可用於治療癌症或腫瘤，包括但不限於：結腸癌、白血病、結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、攝護腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤和頭頸癌。治療可單獨進行或是與其他藥物或療法一起進行。在一些實施例中，與對照組(例如另一種癌症、正常組織或是正常細胞)相比，該癌症或腫瘤具有較高的RSPO3表現量，或攜帶RSPO-融合基因或RSPO3異位。在一些實施例中，該癌症或腫瘤具有adenomatous polyposis coli (APC)突變、β-catenin突變或WNT訊息傳遞的過度活化。選擇性地，在向主體施用抗RSPO3抗體之前，可使用本領域習知的方法，以確定在主體中該癌症或腫瘤是否出現較高的RSPO3表現量、或具有RSPO-融合基因或RSPO3異位、APC突變、β-catenin突變或過度活化的WNT訊息傳遞。

「主體」係指人類或非人類動物。「治療」或「治療方法」是指向患有疾病的主體施用化合物或組成物，其目的是治癒、緩解、減輕、補救、延緩疾病的發作或改善失調、失調的症狀、失調之後的疾病狀態或是對失調的傾向。「有效量」是指能夠在治療的主體中產生醫學上期望結果的化合物或組成物的量。

本文所述之抗RSPO3抗體可被修飾以產生具有所需特性的抗RSPO3抗體，例如改善穩定度、結合特異性、或體內功效。可藉由引入一或多個修飾到編碼抗體的核酸序列中或是藉由胜肽合成以製備抗體變體。可將修飾引入至一或多個CDR中，或是引入至CDR外部的位點。修飾可舉例包括：缺失、插入及/或取代。可使用本領域習知技術製造抗體變體。可將修飾隨機引入或於特定位點引入。丙胺酸掃描式突變技術可用於辨別可修飾的殘基而不破壞抗體的抗原結合活性和特異性。

以下具體實施例應被解釋為僅是說明性的，並且不以任何方式限制本發明的其餘部分。無需進一步詳細說明，本領域具有通常知識者可根據本文之敘述，充分利用本發明。本文引用的所有出版物均透過引用完整併入本文。

實施例1：材料及方法

1. 細胞株

除了ExpiCHO-S細胞是來自Thermo Fisher Scientific以外，細胞株是構自ATCC。DLD-1和NCI-H2030細胞株生長在含有10% FBS的RPMI中，293T細胞株是生長在含有10% FBS的DMEM中，而ExpiCHO-S是生長在ExpiCHO™表現培養基(Thermo)中。從韓國細胞庫取得人類SNU-1411結腸腫瘤細胞，並培養在有10% FBS (v/v)及青黴素(100 U/ml)/鏈黴素(100 μg/ml)的RPMI培養基中。將培養物置於37℃、5％CO₂ /95％空氣的潮濕培養箱中。

2. 報導基因試驗

WNT訊號傳遞會造成b-catenin蛋白/TCF依賴性轉錄反應。MDA-MB436-TCF/LEF-Luc細胞由Kelvin Kun-Chih Tsai博士提供，其係用於監測WNT訊號轉遞途徑的活性。請見，例如，Wang等人(2013).Gastroenterology (145): 1110-1120。將MDA-MB436-TCF/LEF-Luc細胞種在含有10％FBS的RSPO培養基的黑色平底96孔盤(Costar)中，並在37℃、5％CO₂ 下培養過夜。在培養24小時後，用抗RSPO3抗體、20 ng/ml Wnt3a(R＆D system)和RSPO配體(Peprotech Systems)處理細胞，並且進一步適當地培養16小時。使用Bright-Glo螢光素酶分析(Promega)以測量螢光素酶活性。

3. 融合瘤的生成和RSPO3抗體的純化

對RSPO3的小鼠單株抗體是由LTK BioLaboratories (Taiwan)所生產。使用約0.5-1.5 mg 的RSPO3於小鼠中以進行免疫作用。接著使用融合免疫脾臟細胞和骨髓瘤細胞來產生融合瘤細胞，並且分離11個融合瘤細胞殖株。將融合瘤培養在含有IMDM(GIBCO)和去活化的20％FBS的96孔盤中。然後，使用如下所述之標準ELISA和西方墨點法以挑選陽性細胞殖株，以篩選對RSPO3有結合能力的細胞上清液。將來自陽性殖株的細胞次選殖到96孔盤中，提取單一殖株並且逐漸適應在含有去活化20 % FBS的無血清培養基(SFM, HyClone)中生長。請見圖1。透過腹膜內注射將融合瘤細胞注射到小鼠的體內，以誘發腹水性腫瘤的生成並產生腹水。根據標準步驟將腹水加到蛋白A-Sepharose上。純化的RSPO3抗體以不具氮化物的PBS進行透析。

4. 從融合瘤中定序和轉殖RSPO3抗體

為了確定融合瘤中IgG重鏈和輕鏈的cDNA序列，從融合瘤細胞中分離總RNA，並使用隨機六聚體以反轉錄酶製備cDNA。將小鼠Ig-引子套組(Novagen, 69831-3)和Ig-引子混合物(列於表1)用於PCR放大反應，以進行可變區測定。將PCR產物轉殖到pJET1.2/blunt轉殖載體(CloneJET PCR cloning Kit，Thermo)中以進行DNA序列分析。以上揭露了RSPO3抗體相應的基因編碼及編碼胺基酸序列。
表 1. 用於RSPO3抗體可變區轉殖的引子組
R = A或G； Y = C 或 T；M = A 或 C； K = G 或 T； S = C 或 G； W = A 或 T； H = A 或 C 或 T； B = C 或 G 或 T； V = A 或 C 或 G； D = A 或 G 或 T。

5. 來自ExpiCHO-S細胞的B1、hB1和參照抗體131R010的建構、表現和純化

自融合瘤產生之抗體VH及VL區的cDNA序列係由GeneDireX,Inc合成。分別在pFUSEss-CHIg-hG1e1和pFUSE2ss-CLIg-hk (InvivoGen)的重鏈及輕鏈的恆定區(CH和CL)之前引入合成的可變區。對於pFUSEss-CHIg-hG1e1轉殖，以EcoRI和Nhe I切割位點在hIL2訊號序列下，插入重鏈可變區以使胺基酸序列得以完整表達(in frame)。分別透過EcoRI和BsiWI將輕鏈可變區插入pFUSE2ss-CLIg-hk。為了將pcDNA3.4(Invitogen)作為抗體表現載體，使用hIgHG-F/hIgHG-R和CLIg-F/CLIg-R引子，放大來自先前建構的pFUSEss質體的重鏈及輕鏈的全長抗體，然後進行如標準步驟所述之TA TOPO轉殖(Thermo)。
hIgHG-F; 5‘-CATGCCTAGGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3’ (SEQ ID NO: 52)
hIgHG-R: 5’-GGGTTTCATATGTCATTTACCCGGAGACAGG-3’
(SEQ ID NO: 53)
CLIg-F: 5’-GGAAGATATCCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3’
(SEQ ID NO: 54)
CLIg-R : 5’-CCTTAATTAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’
(SEQ ID NO: 55)

對於重組抗體的產生，則將編碼重鏈和輕鏈(例如pcDNA3.4-hB1H和pcDNA3.4-hB1L)的重組質體pcDNA3.4以2:3的比例轉染至ExpiCHO-S™細胞，在8-10天後依標準步驟收取ExpiCHO^TM 表現培養基。使用Mabselect SuRe^TM XL(GE Healthcare)親和性管柱層析法，純化上清液以得到抗體。

6. 融合瘤抗體對於RSPO3-結合的反應性

為了評估抗體的RSPO-結合能力，純化的抗體與RSPO1、2、3和4反應，進行免疫墨點法。以抓取緩衝液配製重組RSPO3(2 μg/ml)，塗覆於96孔高結合聚苯乙烯盤(Corning)後，在4℃下放置過夜。再以含有0.05% Tween 20的PBS (即PBST)洗滌兩次經塗覆的孔盤。在室溫下，於該孔盤中加入PBST–10% BSA阻斷劑，進行ELISA標準步驟測定1小時。

7. 抗體亞類區別

關於抗體亞型分類，以上面所述之RSPO3塗覆微量滴定板，然後根據廠商的說明書，使用Zymed Laboratories的Mouse MonoAb ID Kit (HRP)進行測定。

8. 抗體工程：抗體人源化

為了製造人源化和全功能的RSPO3抗體，在本研究中使用了抗體人源化技術，此服務由工業技術研究所(ITRI)(新竹，台灣)所提供。具有理想胺基酸序列的人源化抗體如上所示。然而，抗體表面重塑方法通常在親和性和穩定性會出現些微變化。參見Roguska et al. (1996). Protein Eng (9): 895-904； Roguska et al. (1994). Proc Natl Acad Sci U S A (91): 969-973。

9. RSPO3抗體的結合篩選

如ForteBio的手冊中所述，以生物素化的RSPO3(10 µg/ml)包覆streptavidin-coated的傳感器。抗體濃度在0.75至93.8 nM範圍之間，以調過pH值、含0.5% BSA之PBS進行定量動力學結合分析。所有步驟均在30℃下，以1000 rpm的連續搖動速度進行。

10. RSPO3抗體的結合試驗

在25℃下，使用裝有CM5 Series S Sensor Chip (GE Healthcare)的Biacore T200生物感測器，進行α-RSPO3抗體與重組人類RSPO3蛋白(hRSPO3)之間的結合動力學。使用pH 7.4的HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA，0.005％v/v表面活性劑P20)。將hRSPO3蛋白固定在CM5感測器晶片上，塗層密度為約27.5反應單位(RU)。在HBS-EP中將α-RSPO3抗體從6.25 nM以2倍連續稀釋至0.39 nM，並以30 μL/min的流速在晶片表面上注射120秒，最後進行900秒的解離。分別扣除從對照表面所得之訊號，以及從作用緩衝液所得之訊號，以校正獲得的感測圖譜。用BIAcore T200評估軟體3.0、1:1結合模型，擬合感測圖譜(Fitted Curves)，以產生α-RSPO3抗體的親和常數(KD值)。此外，使用所製備的α-RSPO3抗體連續稀釋液和塗有huRSPO3的晶片表面，分開進行重複測量。

11. PepSet ELISA測定抗體結合表位

利用PepSet序列資料庫，進行測定a-RSPO3 hB1抗體和RSPO3結合表位之ELISA分析。推測的RSPO3胺基酸序列(GenBank存取號NP_116173)係作為對照序列，以設計涵蓋RSPO3成熟結構域之帶有生物素化線型序列胜肽之PepSet資料庫。該資料庫由Mimotopes (Victoria, Australia)合成，長度以10個胺基酸為一個單位，總長度為121個胜肽，其中每條以兩個胺基酸殘基偏移；N端胜肽為Biotin-SGSG-PEPTIDE-NH2而C端胜肽為Biotin-SGSG-PEPTIDE-OH。將胜肽(1-3mg)溶於200微升的80/20 DMSO/水混合物中，並在含有0.1％ BSA和0.1％疊氮化鈉的PBS中，以1：200的比例進一步稀釋作為反應溶液。為了在孔盤中的每個孔上附著不同的生物素化胜肽，使用了塗有NeutrAvidin孔盤(Thermo Scientific Pierce, Rockford, lL)。用含有0.1％Tween 20的1X PBS洗滌孔盤三次，然後將100 ml生物素化的胜肽溶液添加到孔盤的每個孔中。在室溫下培養1小時後，再次使用1X PBST洗滌孔盤三次。然後將10 μg/ ml的a-RSPO3抗體加到孔盤的每個孔中，並將孔盤搖晃1小時。再次洗滌孔盤三次以除去未與胜肽結合的抗體。為了檢測結合的抗RSPO3抗體，接著將山羊抗人類IgG-Fc-HPR添加於孔盤1小時。用1X PBST洗滌孔盤去除多餘的檢測抗體後，於每孔加入100 μl四甲基聯苯胺(TMB)溶液20分鐘。使用2N HCl終止呈色反應後，立即測定每孔450nm的光學密度。

12. 利用具有鏈間雙硫鍵的合成環肽測定抗體結合表位

為了在孔盤上附著不同的生物素化胜肽或蛋白質，將生物素化的環肽(1μg/ml)和生物素化的重組人類RSPO3(100 ng/ml)添加於預先塗覆NeutrAvidin的孔盤(Thermo Scientific Pierce)中。首先，用0.1M DTT處理環肽以產生還原態的胜肽。為了檢查hB1和不同環肽之間的結合，在每孔中加入2 µg/ ml的hB1。在培養和洗滌後，將山羊抗人類IgG-Fc-HPR(Chemicon)添加到孔盤中。用1X PBST洗滌孔盤除去多餘的檢測抗體後，在每孔中加入100μl的四甲基聯苯胺(TMB)溶液10分鐘。使用2N HCl終止呈色反應後，立刻測定每孔在450nm的光學密度。

13. 抗體/受體/配體結合的競爭性ELISA

為了檢測不同的a-RSPO3抗體是否會與LGR5或RNF43競爭對RSPO3的結合，將500 ng/ml的重組人類RSPO3(Peprotech)塗覆在孔盤上。將重組LGR5(22-560)-Fc (R&D)與生物素共軛，然後分別將生物素化的LGR5(30 ng/ml)與不同濃度的a-RSPO3抗體或同型對照抗體混合，並添加到塗有RSPO3的孔中。然後加入抗鏈黴親和素-HRP抗體以檢測結合的生物素化LGR5。將500ng/ml的重組人類RSPO3(Peprotech)塗覆於孔盤上。

為了檢測不同的a-RSPO3抗體是否可能與RSPO3對於RNF43的結合競爭，分別在每孔中加入200 ng/ml的重組Hig-標記的RNF43(RNF43-His16108-H08H, Sino Biological)，及20 μg/ml的不同a-RSPO3抗體的混合物。然後加入小鼠抗His標記抗體-HRP(BioLegend)，以檢測RNF43-His的結合。在培養後，用1X PBST洗滌孔盤以除去多餘的檢測抗體，再加入100 ml的四甲基聯苯胺(TMB)溶液到每孔中。使用2N HCl終止呈色反應後，立刻測定每孔在450nm的光學密度。

14. a-RSPO3抗體對人類結腸直腸腺癌DLD1細胞遷徙能力的影響

將每孔40000個DLD-1細胞種入具有含有10 % FBS 的RPMI培養基的Culture-Insert 2 Well (ibidi, Martinsried, Germany)中16小時。移除培養小室後，在低血清(0.5 %)培養基及20 ng/ ml Wnt3a與50 ng/ml RSPO3，於控制組中加入人類IgG1抗體(100 μg/ ml)或實驗組中加入抗RSPO3抗體(100 μg/ ml)。然後將樣本置於活細胞圖像延時顯微鏡系統(Leica AF6000 LX)中，以觀察DLD-1細胞的遷移。在一開始的時候選擇每孔在10X物鏡下的三個位置，並且透過Zyla 4.2 sCMOS相機，在每30分鐘獲取這些位置的相位圖，追蹤60個小時。

15. 評估hB1在CR3150 RSPO^high PDX模型中的功效

為了評估臨床前的體內功效，在研究中使用源自結腸直腸癌患者的異種移植物(PDX)模型CR3150，係由Crown Bioscience Inc. (Taicang, China)提供服務。雌BALB/c裸鼠在右側皮下接種一原發性CR3150腫瘤片段(直徑2-3mm)。當平均腫瘤大小到達約190 mm³ 時，將帶腫瘤的小鼠隨機分組，且每週腹腔注射25 mg/kg的待測物或載體(PBS)兩次，持續4.5週。每週用卡尺量腫瘤體積兩次且用公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(TV)=0.5×a×b² ，其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑。當動物的腫瘤大小達到人道終點時進行犧牲，並且研究結束時的最終腫瘤體積數值也列入計算。

腫瘤體積的統計分析包含平均值和標準差。由於這兩種治療方案是獨立的，為了進行每種治療與對照組之間的比較，進行獨立樣本t 檢定。使用SPSS 18.0分析所有數據，P ＜0.05則具有統計學意義。

16. 評估CR3150 PDX模型中hB1引發分子反應

用Q-PCR分析RSPO3融和PDX膜型的腫瘤細胞。用TRIzol試劑(Invitrogen, #15596-018)萃取RNA，並利用M-MLV RT、RNase H Minus(Promega, #M3682)合成cDNA。使用即時定量RT-PCR(KAPA SYBR FAST qPCR Kit, KAPABIOSYSTEMS, #KK4604)測定經抗體處理之小鼠異種移殖生長的人類腫瘤的基因變化(copy number)。將2 µl cDNA添加至18 µl PCR混合物中，透過在95℃下進行1分鐘的起始步驟開始反應，然後進行40次循環的放大，包括在95℃下2秒和在60℃下30秒。用LightCycler 1.0系統(Roche)進行即時PCR反應和數據分析。以GAPDH作為內源性基因監控以利校正(normalization)。用於PCR分析的引子組列於表2中。
表2. 用於Q-PCR分析的引子組

17. 評估hB1在源自RSPO^high NCI-H2030肺癌細胞的異種移植(CDX)模型中的功效

為了評估臨床前體內功效，在研究中使用源自RSPO^high NCI-H2030肺癌細胞的異種移植(CDX)模型。在雌性裸鼠的右側皮下接種一NCI-H2030片段(5*10⁶ )。當平均腫瘤大小到達約250 mm³ 時，將帶腫瘤的小鼠隨機分組，且每週靜脈注射25 mg/kg的待測物、50 mg/kg的卡鉑(Carboplatin)或空白對照組(同型IgG)，持續4週。每三天(一天給藥和休息2天)用卡尺測量腫瘤體積，且用公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(TV)=0.5×a×b² ，其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑。當動物的腫瘤大小達到人道終點時進行犧牲，並且在研究結束時的最終腫瘤體積數值也列入計算。

腫瘤體積的統計分析包含平均值和標準差。由於這兩種治療方案是獨立的，為了進行每種治療與對照組之間的比較，執行獨立樣本。使用Prism的二因子變異數分析(2way ANOVA)多重比較檢定分析所有數據。P ＜0.05則具有統計學意義。

18. 抗RSPO3抗體與卡鉑(Carboplatin)合併使用對帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的SNU-1411結腸異種移植腫瘤生長的影響

為了確定抗體對於SNU-1411異種移植腫瘤的影響，將帶有腫瘤的動物隨機分組，並且當平均腫瘤體積達到約150-200 mm³ 時開始治療。每隔一週(Q2W)給予抗體一次，且每週給予紫杉醇一次(Q1W)。抗體和紫杉醇皆是透過靜脈注射給予。使用電子卡尺每週測量腫瘤生長兩次。用公式(LxW² )/2計算腫瘤體積，其中L是腫瘤的最長軸，W是腫瘤的最短軸。每週記錄動物體重一次。頻繁地檢查小鼠任何不良藥物相關副作用的明顯跡象。在研究結束時，對所有小鼠實施行安樂死。

19. 統計分析

數據以平均值±S.E.M表示。透過非參數t檢定分析組間平均值的差異。使用單因子變異數分析檢定(one-way ANOVA test)進行多重比較再進行Tukey’s試後比較檢定。p ＜0.05的差異則是顯著不同的。用於統計分析的軟體是GraphPad Prism4(GraphPad Software Inc.)。

20. 基於組織微陣列(TMA)的免疫組織化學方法

以hB1評估組織玻片中RSPO3蛋白的IHC標記強度進行評分和分析。所有組織微陣列玻片均取自US Biomax。胰腺癌組織微陣列玻片(PA807)，包含35例腺癌、1例類癌、1例腺細胞癌、1例腺鱗癌、1例島細胞瘤以及1例鱗狀細胞癌、27例癌旁胰腺組織以及13例正常胰臟組織，每例中的單核用hB1(1:100)染RSPO3。非小細胞肺癌(NSCLC)組織微陣列載玻片(LC10012b)包含45例的伴有相應的癌旁肺組織的NSCLC(26例鱗狀細胞癌、18例腺癌和1例腺鱗癌)及5例正常肺組織，每例以hB1(1：100)染RSPO3。侵襲性乳管癌組織微陣列玻片(BR1505c)，包含75例侵襲性乳管癌，每例以hB1(1：100)染色RSPO3。結直腸癌和相應的癌旁正常組織以及淋巴結轉移癌微陣列玻片(CO10012b)，包含36例結直腸腺癌和相應的癌旁正常組織、9例淋巴結轉移癌和9例正常淋巴結組織，加上10例正常結腸直腸組織，以hB1(1:40)對RSPO3染色。

由兩名經過委員會認證的病理學家評估玻片的訊號強度。根據先前的報告，免疫分數(範圍：0、2-8)被定義為比例分數+強度分數(比例分數：0 = 0/100，1 = 1/100~ 1/10，2 = 1/10~ 1/3，3 = 1/3~ 2/3，4 = 2/3~ 1以及 5 = 100/100；強度分數：0 = 陰性，1 = 微弱，2 = 中間以及 3 = 強)。

實施例2：a-RSPO3融合瘤抗體對RSPO1-4結合的反應性

為了評估抗體的RSPO結合能力，將由源自初始批次-A殖株(A1、A2、A4、A5、A6、A9)以及批次-B殖株(B1、B3、B4、B8和B9)的幾個轉殖的融合瘤培養物的上清液所得之純化單株抗體(mAb)，在免疫墨點法中與RSPO1、2、3和4反應。來自初始批次-A殖株的所有mAb對於RSPO3展現強烈的反應性。請見圖2(A)。只有B4和B9 mAb對於RSPO3展現反應性。請見圖2(B)。然後對於所有與RSPO3反應的mAb進行4種不同RSPO (RSPO1-4)的結合選擇性的評估。其結果顯示，在ELISA測定中，來自殖株A1、A2、A4、A6、B1和B8的mAb僅與RSPO3反應。請見圖3。

為了評估抗體的RSPO3結合親和力，由Octet systems進行動力學測定。將批次-A殖株(A1、A4、A6、A9)的純化單株抗體(mAb)與參考Ab-131R002，進行與RSPO-3結合的檢測。請見表3。所有批次-A殖株的抗RSPO3抗體均展現出高度追蹤標靶結合親和力，其範圍落在1.04 x 10^-8 至7.8 x 10^-8 M之間。
表3. RSPO3蛋白與抗RSPO3抗體間的結合親和力。

實施例3：RSPO3-WNT訊號傳遞途徑的抑制

OncoMed Pharmaceuticals Inc.已發展了幾種RSPO3-結合抗體(rosmantuzumab(131R010)和131R002)。為了作為我們研究的參考對照，根據先前技術(US22014/0017253A1)所提之胺基酸序列，建構和表現抗體Rosmantuzumab和131R002。之後，對自行研發的小鼠6種mAb(A1、A2、A4、A6、B1、B8)和131R002對照mAb分別進行生物功能性測試。這些a-RSPO3小鼠mAb對RSPO-LGR訊號傳遞途徑具顯著的抑制活性。請見圖4(A)和(B)。僅有殖株A4、A6和B1在含有RSPO3-WNT下游訊號傳遞途徑TCF/LEF-Luc報導系統的MDA-MB436報告細胞株中，以劑量依賴性方式展現顯著的抑制效果。請見圖4(C)。然後進行抗體分型來辨識型別和亞型別。發現殖株A4、A6 和B1分別為IgG1、IgG2a和IgG1的同型，如表4所示。
表4. 抗體分型

實施例4：a-RSPO3的人源化修飾

對融合瘤的mAb的mRNA序列進行定序，然後進行cDNA合成與CHO細胞中表現。在表現和純化對應於A4、A6和B1融合瘤的重組IgG後，確認這些IgG於RSPO3結合及中和的作用。選擇殖株B1進行人源化。在分子模擬的輔助之下，透過可變區重塑方法以人源化小鼠mAb。請見例如Safdari等人(2013). Biotechnol Genet Eng Rev (29): 175-186。人源化技術包含自鼠類移植互補決定區(CDR)到人類IgG骨架上，以及抗體可變區序列中的T細胞表位的去除，以避免人類抗鼠抗體(HAMA)反應，減少病患潛在的免疫原性。然後將人源化的a-RSPO3 mAb在CHO細胞中表現，並且對所純化的抗體進行結合親和力的分析，以進行不同體外和體內實驗。請見例如Liu等人(2008). Immunol Rev (222): 9-27。下文中的實驗結果證實了抗體工程成功產生人源化a-RSPO3抗體hB1，其係源自鼠類植株B1。

實施例4：hB1和rosmantuzumab在RSPO-WNT中和測定和抗原結合動力學測定中展現相等的效力

對主要待測物hB1的體內和體外抗癌活性進行特性測定，並且和正在進行第1a/1b期臨床試驗的rosmantuzumab比較。hB1 mAb是根據人類RSPO3(hRSPO 3)作為抗原所產生的。了解hB1是否可辨識及中和鼠類RSPO3(mRSPO3)很重要，因為大多數臨床前體內研究會在小鼠中進行。hRSPO3和mRSPO3之間的胺基酸序列比對如圖5所示。hB1可中和hRSPO3或mRSPO3，以抑制WNT報導基因訊號。請見圖6(A)。如WNT報導試驗所示，hB1和rosmantuzumab的50 % 抑制濃度(IC₅₀ )分別為58.0和58.7 nM。請見圖6(B)。

為了測量hB1與hRSPO3的結合系數，使用Biacore T200進行動力學測定。將hRSPO3蛋白固定在CM5感測器晶片上，塗層密度約為27.5反應單位(RU)。如圖7所示，hB1與hRSPO3的結合親和力類似於rosmantuzumab與hRSPO3的結合親和力。平衡解離常數KD均為皮莫爾濃度(pM)。請見表5。
表5. 使用Biacore生物感測器測定抗體-抗原互相作用的結合動力學之特徵。

實施例5：結合表位的測定

為了鑑定a-RSPO3 Ab的結合表位，經由Mimotope, Inc.製備源自hRSPO3胺基酸序列的重疊型胜肽庫(每個胜肽10 mer，偏移：2個胺基酸殘基，涵蓋完整的hRSPO3的胜肽總數：122)。測量a-RSPO3 mAb與源自hRSPO3的重疊型胜肽的結合。鑑定後可能為結合表位的胺基酸序列如表6所示。包含131R002和rosmantuzuma的參考抗體與來自RSPO3片段的胺基酸(a.a.)7-11和a.a. 35-42反應，且融合瘤A6 a-RSPO3 mAb與RSPO3序列的a.a. 5-11、35-42以及195-198反應。然而，A4和hB1 mAb均未出現可偵測的結合訊號。這個結果表明hB1和rosmantuzuma辨識hRSPO3上的不同結合表位。根據使用線型肽的表位定位結果(圖8和表6)，可知hB1有可能與huRSPO3上的構型決定表位結合。此觀察結果對於證明hB1和rosmantuzuma之間的不同結合模式是重要的。
表6. 藉由胜肽掃描以進行a-RSPO3 mAb的表位測定

為了進一步研究a-RSPO3 Ab構型表位，使用重組RSPO3片段序列蛋白和環肽掃描以縮小其目標序列的範圍。結果證實hB1辨識了RSPO3蛋白中的c-末端截斷區。RSPO3中的hB1結合表位範圍被縮小至a.a. 33-86。請見圖9(A)。RSPO3含有Furin-like半胱胺酸區域。截至目前為止，RSPO3的3D結構尚未被報導。此外，設計四種環肽(a.a.40-47、44-53、56-75和79-94)以測定a-RSPO3 mAb和源自hRSPO3的環肽的結合。其結果證實hB1識別了在RSPO3 FR1區域(包含殘基56-74)中含有結構域的所選表位。請見圖9(B)。hB1可標靶RSPO3Furin-like區域中的新穎表位(包含殘基56-75)以中和RSPO-WNT途徑。

實施例6：hB1與LGR5競爭並與RSPO3結合

為了檢測不同的a-RSPO3抗體是否會和LGR5或RNF43競爭而與RSPO3的結合，進行Ab/受體/配體結合競爭ELISA測定。作為a-RSPO3參考抗體的131R010和5D6是由OncoMed和Genetech所提供。在受體結合位點上，基於ELISA測定的不同，a-RSPO3抗體與LGR5表面受體競爭與RSPO3結合的相互作用。

結果顯示，與對照Ab組相比，這些a-RSPO3抗體與LGR5競爭並與RSPO3結合。請見圖10(A)。

此外，設計競爭受體/配體競爭測定法，以測定輔助受體RNF43在其受體結合位點的結合能力。我們的結果證實了hB1和131R010並不干擾RNF43和RSPO3之間的結合。5D6與LGR5和RNF43競爭並與huRSPO3結合。請見圖10(B)。我們的結果證實，hB1對RSPO3的中和顯著降低了LGR5依賴性途徑對於WNT/β-catenin蛋白訊號傳遞途徑活化的貢獻。

實施例7：a-RSPO3 Ab抑制人類結腸直腸腺癌DLD-1細胞的細胞遷移能力

由於RSPO3-Wnt訊息傳遞反應不僅調控細胞入侵，還調控細胞遷移，因此進行癒合測定以檢測a-RSPO3 mAb如何影響遷移能力。Wnt3a和RSPO3處理增強DLD細胞(帶有adenomatous polyposis coli (APC)基因缺失)的遷移活性。在Wnt3a和RSPO3處理的存在下，比較了同型對照Ab和hB1對DLD-1遷移活性的影響。發現在Wnt3a和RSPO3存在下，hB1和131R010 a-RSPO3 mAb均能夠抑制DLD-1細胞的癒合活性。請見圖11。

實施例8：hB1抑制CR3150 PDX腫瘤生長

CR3150結腸腫瘤係來自35歲的亞洲女性患者。CR3150腫瘤是具有PTPRK-RSPO3 融合基因的中度分化管狀腺瘤。一開始將帶有腫瘤的小鼠分成四個實驗組，即空白組(PBS)、hB1、131R010和未治療組。從第1天到第29天，每週兩次將待測物或空白對照物腹腔注射至小鼠體內。如圖12所示，在治療後第58天研究終止時，對照組的平均腫瘤體積達到1867.6±475.7 mm³ 。用hB1(25 mg/kg)治療的組別引起明顯的腫瘤生長抑制(TGI = 60.8％，p = 0.179)，其最終平均腫瘤體積為871.2±227.7 mm³ 。請見圖12。用131R010 (25 mg/kg) 治療的組別亦產生抗腫瘤活性(TGI = 71.0％，p = 0.067)，其最終平均腫瘤體積為680.2±38.2 mm³ 。請見圖12。在第46天，當用相對的腫瘤體積來比較處理組與對照組的差異時，統計顯著的抗腫瘤活性被記為TGI = 68.4%，p = 0.041(hB1治療)，以及TGI = 69.8%，p = 0.039 (131R010治療)。因此，hB1和131R010被認為在本研究中具有治療益處。另外，本研究中沒有嚴重的體重下降。總而言之，作為單一藥劑的hB1和131R010對來自CR3150患者的結腸直腸癌模型展現出顯著抗腫瘤活性。

實施例9：在CR3150 PDX模型中α-RSPO3 Ab降低了分子反應

為了評估CR3150 PDX模型中hB1的分子反應，測量腸道幹細胞標誌(Axin2和LGR5)、Wnt下游標誌(TCF7)、癌症幹細胞標誌(CD133和CD44)和分化標誌(CEACAM7和KRT20)的表現程度。結果顯示，在hB1處理組別中，腸道幹細胞標誌(Axin2和LGR5)和Wnt下游標誌(TCF7)在早期的表現明顯低於對照組。請見圖13。在自行研發的RSPO3 Ab最後一次給藥後的29天內，分析癌症幹細胞標誌(CD133和CD44)和分化標誌(CEACAM7和KRT20)的表現，與對照組相比顯著降低。請見圖13。

實施例10：α-RSPO3 Ab抑制NCI-H2030 RSPO^high CDX模型腫瘤生長

NCI-H2030肺癌細胞係源自肺癌患者的淋巴結。NCI-H2030細胞顯示有RSPO3過度表現。首先將帶有腫瘤的小鼠分成六個實驗組以接受：1) 空白組，2) hB1，3) 131R010，4) 卡鉑(Carboplatin)+空白組，5) 卡鉑+hB1和6) 卡鉑+131R010。請見圖14。從第1天到第29天，每週一次將待測物或空白對照物透過靜脈向小鼠給藥。在給藥後第29天，對照組的平均腫瘤體積達到1702±298.1mm³ 。以hB1 (25 mg/kg)處理展現了明顯的腫瘤生長抑制效果，最終平均腫瘤體積為1124 ± 471.8 mm³ 。用同樣劑量進行131R010處理，也產生抗腫瘤活性，最終平均腫瘤體積為1327.4 ± 194.3 mm³ 。hB1在本研究中顯示出治療益處。此外，本研究中沒有嚴重的體重下降。總而言之，hB1作為單一藥劑或與卡鉑組合給藥，對H2030肺癌CDX模型表現了顯著的抗癌活性。此外，在NCI-H2030癌症異種移植模型中，hB1表現出比rosmantuzumab更好的抗癌功效。

實施例11：α-RSPO3 Ab抑制帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人類SNU-1411結腸異種移植腫瘤

在帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人類SNU-1411結腸異種移植腫瘤中，將單獨給予抗RSPO3抗體hB1以及控制組抗RSPO3抗體OMP-131R10，或是與紫杉醇合併使用，進行活性比較。在本研究過程中開始處理之後，不同組別中的平均腫瘤大小的結果，如圖15所示。在第18天，對照mAb組的平均腫瘤尺寸到達1071 mm³ 。當單獨使用131R10和hB1時，與對照組相比，對於SNU-1411腫瘤並沒有抗腫瘤活性(以單因子變異數分析，進行Tukey’s事後檢定比較分析，p＞0.05 vs.對照mAb)。請見圖15上方。在第18天時，131R10的平均腫瘤體積為1265 mm³ 且HB1的平均腫瘤體積為1177 mm³ 。在第18天時，相對於對照mAb處理的組別，單獨使用紫杉醇降低69 %的腫瘤體積 (以單因子變異數分析，進行Tukey’s事後檢定比較分析，p＜0.05 vs.對照mAb)。請見圖15上方。在第18天時，與對照mAb處理的組別相比，131R10加上紫杉醇的組合以及hB1加上紫杉醇的組合，分別減少78%和86 %的腫瘤體積(以單因子變異數分析，進行Tukey’s事後檢定比較分析，p＜0.05 vs.對照mAb組)。請見圖15上方。相較於單獨使用紫杉醇，兩種組合之間並沒有顯著差異(以單因子變異數分析，進行Tukey’s事後檢定比較分析，p＞0.05 vs.紫杉醇組)。請見圖15上方。表7總結第18天hB1、131R10、紫杉醇及其組合的抗腫瘤功效。一般來說，作為單一藥劑和與紫杉醇合併使用的抗體治療耐受性良好。

對照mAb和抗RSPO3單一藥劑組於第18天最後一次給藥後24小時終止，對於紫杉醇及組合用藥組之動物則持續進行治療，以確認治療反應持續時間。治療3週後紫杉醇的抗腫瘤功效喪失，在第32天(治療後31天)時平均腫瘤體積達到950 mm³ 。請見圖15。另一方面，在第32天，兩個組合用藥組仍維持腫瘤生長的抑制，相對於單獨使用紫杉醇，131R10加紫杉醇使腫瘤體積減少了82%，hB1加紫杉醇使腫瘤體積減少了75% ( p＜0.05 vs. 紫杉醇，先進行單因子變異數分析後，進行Tukey’s pairwise 比較)。請見圖15下方。表8總結了在第32天(治療後31天)的紫杉醇及其合併組合抗腫瘤活性。從第36天開始，合併組合的抗腫瘤功效開始減少。在第46天研究結束時，hB1加紫杉醇的平均腫瘤體積為874 ± 247 mm³ ，而131R10加紫杉醇的平均腫瘤體積為399 ± 138 mm³ 。
表7. 在第18天，在帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人類SNU-1411結腸異種移植腫瘤中，131R10和hB1作為單一藥劑和其與紫杉醇合併使用的抗腫瘤功效。
*: p＜0.05 vs. 對照mAb，先進行單因子變異數分析檢定，接著進行Tukey’s 事後比較分析
表8. 在第32天，在帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人類SNU-1411結腸異種移植腫瘤中，131R10、hB1與紫杉醇之組合的抗腫瘤功效。
*: p＜0.05 vs. 紫杉醇，先進行單因子變異數分析檢定，接著進行Tukey’s事後檢定

綜上所述，本研究顯示，單獨用hB1或131R10進行治療2週，對於帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人類SNU-1411結腸異種移植腫瘤並沒有抗腫瘤效果，但是和紫杉醇合併組合使用則有類似於紫杉醇治療組的抗腫瘤活性。紫杉醇介導的生長抑制在治療後3週消失，而hB1或131R10與紫杉醇的合併組合在治療後4週仍然有效。兩種合併組別在治療後35天恢復腫瘤生長，131R10加紫杉醇的速率低於hB1加紫杉醇。

實施例12：以α-RSPO3抗體hB1分析乳癌、結腸癌、胰臟癌及肺癌組織微陣列中RSPO3免疫組織化學表現

為了評估RSPO3在正常和疾病狀態的癌組織中的不同表現，利用基於組織微陣列(TMA)的免疫組織化學(IHC)，來評估其與乳癌、結腸癌、胰臟癌、肺癌患者的病理學特徵的關聯性。使用RSPO3抗體hB1評估RSPO3在80個胰臟癌和正常病例組織陣列中的表現。結果顯示91％(21/23)的腫瘤出現低到高的RSPO3陽性染色。相比之下，只有8.7％(2/23)在胰臟管腺癌病例中出現陰性染色。結果表示，與正常或癌旁胰腺組織相比，在晚期TNM胰臟管腺癌中更常觀察到較高的RSPO3表現。請見圖16。

使用RSPO3抗體hB1評估RSPO3在50個肺非小細胞癌和正常病例組織陣列中的表現，結果顯示92.3％(24/26)的腫瘤出現低到高的RSPO3陽性染色，而只有在7.7％(2/26)的鱗狀細胞癌病例中出現陰性染色。請見圖17。

使用RSPO3抗體hB1評估RSPO3在侵襲性乳管癌組織陣列的RSPO3表現，結果顯示72％(54/75)的腫瘤樣本出現低到高的RSPO3陽性染色，然而僅有28％(21/75)的侵襲性乳管癌的病例出現陰性染色。請見圖18。

使用RSPO3抗體hB1評估RSPO3在64個結腸直腸癌和相應的相鄰正常組織微陣列中的表現，結果顯示91.7％(33/36)的腫瘤出現強烈的RSPO3陽性染色，而僅有8.3％(3/36)的結腸直腸腺癌病例出現低度的染色。請見圖19。

本研究更發現，hB1檢測到的高RSPO3染色與胰臟癌、肺癌或乳癌患者的遠處轉移顯著相關。

本說明書中公開的所有特徵可以任何組合方式組合。本說明書中公開的每個特徵可使用於相同、等同或類似目的的其他特徵代替。因此，除非另有明確說明，否則所揭露的每個特徵僅是等同或類似特徵的通用系列的示例。

根據以上描述，本領域具有通常知識者可輕易確定所描述的實施例的基本特徵，並且在不脫離其精神和範圍的情況下，可對實施例進行各種改變和修改以使其適應各種用途和情況。因此，其他實施例也在申請專利範圍內。

無。

圖1是使用RSPO3融合瘤B1作為用於篩選單一細胞株模型的示意圖和圖片。(A)示意圖為單一殖株選擇過程；(B)透過有限稀釋和放大測定單一殖株；(C)轉移殖株並且評估Ab表現；以及(D)在T25-cm² 組織培養瓶中放大具高Ab表現量的細胞。

圖2為抗RSPO3融合瘤抗體反應性的西方墨點法組圖。這些融合瘤抗體與RSP01-4抗原免疫墨點法反應，圖中標示了標準液的分子量。(A)A1、A2、A4、A5、A6和A9殖株；(B)B1、B3、B4、B8和B9殖株。

圖3為以ELISA測量抗RSPO3融合瘤抗體反應性的圖表。這些融合瘤抗體與RSPO1-4抗原免疫墨點法反應，其反映RSPO3抗原。(A)A1、A2、A4、A5、A6和A9殖株；(B)B1、B3、B4、B8和B9殖株。

圖4為抑制β-catenin活性的RSPO3 Ab標靶典型WNT訊息傳遞途徑和體外測試的圖表。(A)A1、A2、A4、A5、A6和A9殖株；(B)B1、B3、B4、B8和B9殖株； (C)增加A4和A6殖株的劑量依存反應對於RSPO-WNT訊息傳遞的影響。在20 µg/mL抗RSPO3抗體殖株A1、A2、A4、A5、A6、A9或131R002的存在下，將MDA-MB436 TCF/LEF-Luc細胞與Wnt3a (20 ng/mL)和RSPO3 (50 ng/mL)之組合物一起培養。作為對照組，將細胞與Wnt3a和RSPO3之組合物、只有Wnt3a、只有RSPO3或不添加一起培養。將細胞培養16小時後，以One-Glo Luciferase Assay System進行螢光素酶活性測定。

圖5是hRSPO3和mRSPO3的胺基酸序列的比對。

圖6是抗RSPO3 抗體抑制 Wnt3a和RSPO3合併處理誘發WNT下游報導基因螢光素酶活性的圖表。(A)hB1或131R010對由Wnt3a和人類RSPO3 (h)或老鼠 RSPO3 (m)刺激的RSPO-Wnt訊息傳遞的劑量依存性抑制；(B)MDA-MB436 TCF/LEF-Luc細胞在20 ug/mL抗RSPO3抗體殖株hB1或131R010的存在下，與Wnt3a (20 ng/mL)和hRSPO3 (50 ng/mL)組合物一起培養。將細胞培養16小時後，以One-Glo Luciferase Assay System進行進行螢光素酶活性測定。

圖7是使用Biacore測量a-RSPO3抗體-抗原相互作用的結合動力學的圖表。使用Biacore T200產生結合感測圖譜，然後將蒐集數值擬合至簡單的1：1相互作用模型。將一系列濃度的hB1(0.39-6.25 nM)以單次循環注入，不同濃度注射之間表面無需進行再生。監測該結合2分鐘，最終解離時間為15分鐘。將hRSPO3以27.5RU固定在CM5晶片上。

圖8是透過Pep-set定位RSPO3蛋白上的a-RSPO3 Ab表位的圖表。這些直條圖代表每10-mer寡肽與RSPO3 Ab 131R010(A)、131R002 (B)和融合瘤A6 (C)結合的能力，如圖中所示。QNASRGRRQR (SEQ ID NO: 74)；ASRGRRQRRM (SEQ ID NO: 75)；RGRRQRRMHP (SEQ ID NO: 76)；RRQRRMHPNV (SEQ ID NO: 77)；CLSCKPRLFF (SEQ ID NO: 78)；SCKPRLFFAL (SEQ ID NO: 79)； ERGKKGRERK (SEQ ID NO: 80)；GKKGRERKRK (SEQ ID NO: 81)； KGRERKRKKP (SEQ ID NO: 82)；RERKRKKPNK (SEQ ID NO: 83)； RENKQQQKKR (SEQ ID NO: 84)。

圖9是研究多種a-RSPO3抗體表位的示意圖和圖表。(A)將不同RSPO3片段塗覆在ELISA盤上，接著添加生物素標籤化的hB1(一種a-RSPO3抗體)到每一孔中。接著加入鏈黴親和素-HRP以偵測結合的生物素抗體。(B)將生物素的環肽(1μg/ml)和生物素化的重組人類RSPO3(100 ng/ml)添加於NeutrAvidin預塗覆的孔盤中。為了檢測不同環肽和hB1之間的結合，接著將2 μg/ml的hB1加到孔盤中的每一個孔中。為了檢測結合的抗RSPO3抗體，接著將山羊抗人類IgG-Fc-HPR抗體(Chemicon)添加於孔盤。

圖10是不同的a-RSPO3抗體對RSPO3與LGR5或RNF43的競爭性結合的圖表。將重組hRSPO3塗覆在孔盤上以檢測是否不同的a-RSPO3抗體可跟RSPO3與LGR5或RNF43的結合競爭。(A)將重組LGR5(22-560)-Fc與生物素複合 (Biotinylation)以利檢測。然後分別將生物素複合化的LGR5與不同濃度的a-RSPO3抗體或同型對照Ab混合且添加到RSPO3塗覆的孔中。然後加入鏈黴親和素-HRP以檢測結合的生物素化LGR5；(B)將重組His標記的RNF43和不同的a-RSPO3抗體的混合物分別加到每個RSPO3塗覆的孔中，然後加入小鼠抗His標記抗體-HRP以檢測結合的RNF43。以1XPBST洗滌孔盤去除多餘的偵測抗體後，將TMB溶液加到每孔中10分鐘。然後使用2N HCL終止呈色反應，馬上測量每孔在450nm的光學密度。

圖11為不同a-RSPO3抗體於DLD-1細胞遷徙模型中影響的圖表。長條圖計算細胞遷徙至閉合百分比。

圖12為抗RSPO3單株抗體特異性抑制體內結腸直腸癌PDX模型CR3150腫瘤生長圖表。每週用hB1、131R010或對照劑(PBS)治療小鼠兩次，持續4.5週。在治療的第5天，在第二次給藥後24小時犧牲對照組和hB1組的3隻小鼠，以收集腫瘤。自該時間點，從第5天至第58天，對照組、hB1或131R010組分別剩下5、3和3隻小鼠。數據以平均值±SEM表示。由於腫瘤體積達到人道終點，分別在第39天和第46天將對照組中的一隻小鼠和未處理組中的一隻小鼠進行安樂死，而研究結束時的最終腫瘤體積數值仍列入計算。

圖13為評估CR3150 PDX模型中hB1的分子反應圖表。在第2次給藥後2天內或是在最後一次給藥後29天，利用Q-PCR分析腸道幹細胞標誌(Axin2和LGR5)、下游標誌(TCF7)、癌症幹細胞標誌(CD133和CD44)和分化標誌(CEACAM7和KRT20)的表現。

圖14為評估hB1於RSPO^high NCI-H2030肺癌CDX模型中的功效圖表。每週用25 mg /kg的hB1或131R010或對照組治療小鼠一次，持續4週。在治療的第28天，在第5次給藥後24小時，將對照組、131R010和 hB1的7隻小鼠犧牲以收集腫瘤。數據以平均值±SEM表示。在治療的第51天，將卡鉑(Carboplatin)、hB1、131R010及其與卡鉑組合之組別的7隻小鼠犧牲以收集腫瘤。數據以平均值±SEM表示。

圖15為帶有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合基因的人類SNU-1411結腸異種移植腫瘤的抗腫瘤功效的圖表。將腫瘤細胞注射到小鼠中，當腫瘤達到200 mm³ 時開始治療。每隔一週給予抗體(25 mg/kg)一次(Q2W)，且每週給予紫杉醇(20 mg/kg)一次(Q1W)。抗體和卡鉑(Carboplatin)均透過靜脈注射給藥。從第1天至第32天給予紫杉醇，從第1天至第46天給予組合用藥組。透過靜脈注射給予抗體和紫杉醇。對於每個治療週期，在第1天給予抗體，在第3天給予紫杉醇。在指定的天數進行腫瘤和體重測量。平均值±SEM。 *：兩者皆進行單因子變異數分析檢定後進行Tukey’s 試後比較檢定，p＜0.05 vs.對照mAb。

圖16是RSPO3在胰臟癌組織中表現的圖表。以抗RSPO3 mAb hB1對由80個患者樣本所組成的胰臟癌組織微陣列進行染色。透過3DHISTECH的數位玻片掃描儀掃描了整個切片的圖像。該圖展示了在癌組織陣列和正常組織陣列中表現RSPO3的病例的百分比。

圖17是RSPO3在肺癌組織中表現的圖表。以抗RSPO3 mAb hB1對由50個患者樣本組成的肺癌組織微陣列進行染色。透過3DHISTECH的數位玻片掃描儀掃描了整個切片的圖像。該圖展示了在癌組織陣列和正常組織陣列中表現RSPO3的病例的百分比。

圖18是RSPO3在乳癌組織中表現的圖表。以抗RSPO3 mAb hB1對由75個患者樣本組成的肺癌組織微陣列進行染色。透過3DHISTECH的數位玻片掃描儀掃描了整個切片的圖像。該圖展示了在侵襲性乳管癌組織陣列中表現RSPO3的病例的百分比。

圖19是RSPO3在結腸癌組織中表現的圖表。以抗RSPO3 mAb hB1對由64個患者樣本組成的結腸癌組織微陣列進行染色。透過3DHISTECH的數位玻片掃描儀掃描了整個切片的圖像。該圖展示了在結腸直腸癌組織陣列中表現RSPO3的病例的百分比。

無。

Claims

一種分離的抗體，包含：一重鏈可變區序列的重鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該重鏈可變區序列係選自SEQ ID NO：2、6、10和14；以及一輕鏈可變區序列的輕鏈互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該輕鏈可變區序列係選自SEQ ID NO：4、8、12和16；其中，該抗體與RSPO3蛋白特異性地結合。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 2，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO:4。
如申請專利範圍第2項所述之抗體，其中，該抗體包含與SEQ ID NO: 2序列至少80%相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 4序列至少80%相同之一輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 6，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 8。
如申請專利範圍第4項所述之抗體，其中，該抗體包含與SEQ ID NO: 6序列至少80%相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 8 序列至少80%相同之一輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 10，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 12。
如申請專利範圍第6項所述之抗體，其中，該抗體包含與SEQ ID NO: 10序列至少80%相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 12 序列至少80%相同之一輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，該重鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 14，且該輕鏈CDR1、CDR2和CDR3係來自SEQ ID NO: 16。
如申請專利範圍第8項所述之抗體，其中，該抗體包含與SEQ ID NO: 14序列至少80%相同之一重鏈可變區，以及與SEQ ID NO: 16 序列至少80%相同之一輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至9項任一項所述之抗體，其中，該抗體係與RSPO3蛋白中的構形決定或線性表位結合。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，該抗體係一IgG抗體、含有一Fc區的一抗體、一Fab片段、一Fab’片段、一F(ab')₂ 片段、一單鏈抗體、一單鏈可變區片段多聚體、一單價抗體、一多價抗體或一嵌合抗體。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，該抗體係人源化的。
如申請專利範圍第1至12項所述之抗體，其中，該抗體係與另一分子共軛的。
一種分離的核酸分子，包含編碼如申請專利範圍第1至13項任一項所述之抗體之一核酸序列。
一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第14項所述之該分離的核酸。
一種組成物，包含如申請專利範圍第1至13項任一項所述之抗體。
如申請專利範圍第16項所述之組成物，更包含一醫藥可接受之載體。
如申請專利範圍第16或17項所述之組成物，更包含另一治療劑。
一種抑制細胞中RSPO3之方法，包含使該細胞與一有效量的如申請專利範圍第1至13項任一項所述之該抗體接觸。
一種抑制細胞中Wnt訊息傳遞的方法，包含使該細胞與一有效量的如申請專利範圍第1至13項任一項所述之該抗體接觸。
一種抑制癌細胞生長或癌細胞轉移的方法，包含使該細胞與一有效量的如申請專利範圍第1至13項任一項所述之抗體接觸。
一種治療一主體的癌症的方法，包含向該主體施用一有效量的如申請專利範圍第1至13項任一項所述之抗體。
如申請專利範圍第22項所述之方法，其中該癌症係RSPO3陽性癌症、RSPO3-融合陽性癌症、具有腺瘤性結腸瘜肉(APC)突變的癌症、具有β-catenin突變的癌症或具有Wnt訊息傳遞過度活化的癌症。
一種如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該癌症係結腸癌、白血病、結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、攝護腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤或頭頸癌。
如申請專利範圍第22至24項任一項所述之方法，更包含向該主體施用另一治療劑。
一種在一樣本中檢測RSPO3蛋白或其片段之方法，包含：使該樣本與如申請專利範圍第1至13項任一項所述之抗體接觸；以及測定該抗體和RSPO3蛋白或其片段之間的特異性結合。
一種如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該RSPO3蛋白係人類RSPO3。
一種辨別與RSPO3蛋白特異性結合之一抗體變體的方法，包含：在如申請專利範圍第1至13項任一項所述之抗體之一或多個互補決定區中引入一或多個修飾以產生一抗體變體；以及辨別與RSPO3蛋白特異性結合之一抗體變體。