KR20210024007A - 암이 있는 개체에서 항-lif 항체 치료에 대한 반응을 개선하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

항-LIF 항체로의 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 선택하고 치료하는 방법이 본원에 기재된다.

Description

암이 있는 개체에서 항-LIF 항체 치료에 대한 반응을 개선하기 위한 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 전체 내용이 참조로서 본원에 모두 포함되는 2018년 6월 18일에 출원된 유럽 출원 일련 번호 제18382431.7호, 및 2019년 2월 22일에 출원된 유럽 출원 일련 번호 제19382131.1호를 우선권으로 주장한다.

백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor: LIF)는 시토카인의 인터류킨-6(Interleukin 6: IL-6) 패밀리의 일원이다. LIF의 알려진 생리학적 활성, LIF 결핍의 임상적 특징, 및 건강한 조직과 종양에서의 LIF 발현에 대한 비임상 연구를 기초로 할 때, LIF의 억제는 내성이 우수하고, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC), 췌장암, 난소암 및 다형아교모세포종(glioblastoma multiforme: GBM)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 고형 종양에서 항-종양 효능을 야기하는 것으로 예상된다.

표적 특이적 치료제로 암을 치료할 때 임상의가 직면하게 되는 한 가지 문제는 모든 종양이 주어진 표적 특이적 치료제에 반응성일 수 없다는 것이다. LIF 또는 LIF 수용체를 발현하는 것으로 알려진 종양 유형의 경우에도 개별 종양 간에 상당한 이질성이 있다. 추가로, LIF 또는 LIF 수용체를 발현하는 종양 모두가 유사하게 반응할 수는 없고, 이에 따라 항-LIF 치료용 항체로의 치료로부터 가장 유리할 수 있는 개체를 결정하기 위한 효과적인 방법이 필요하다.

본 개시는 치료용 항-LIF 항체를 상기 항체에 반응할 가능성이 가장 큰 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법, 및 치료용 항-LIF 항체에 반응할 가능성이 가장 큰 개체를 결정하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 기준 수준을 초과하는 mRNA 또는 단백질 수준에서 LIF 또는 LIF 수용체의 발현을 나타내는 종양 또는 암이 있는 환자는 LIF 치료용 항체로 효과적으로 치료될 수 있다. 추가로, 치료용 항-LIF 항체로의 치료로 유리할 개체를 결정할 수 있는 여러 비-LIF 바이오마커가 기재되어 있다. 이러한 비-LIF 바이오마커는 단독으로 또는 LIF 또는 LIF 수용체 수준을 측정하는 검정과 함께 사용될 수 있다. 비-LIF 바이오마커는 면역억제성 징후를 나타내는 면역조절성 분자를 포함하고, 이들은 면역억제성 세포 유형, 면역억제성 시토카인, 또는 면역억제성 케모카인의 존재를 포함한다. 면역억제성 징후와 함께 LIF 또는 LIF 수용체 수준을 결정하는 것은 치료용 항-LIF 항체로의 치료를 결정하는 방법에 대한 예측력을 증가시킬 것으로 예상된다.

일 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 LIF의 수준을 결정하는 단계, 및 LIF의 수준이 LIF의 기준 수준보다 높은 경우 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3)을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 38에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 39에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 영역, 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체이다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF 단백질 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 면역조직화학을 포함한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 항-LIF 항체로 염색 양성인 세포의 약 1%, 2%, 3%. 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 50%이다.

특정 구현예에서, 기준 수준은 약 100의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 1 내지 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 60, 약 1 내지 약 90, 약 1 내지 약 120, 약 1 내지 약 150, 약 1 내지 약 180, 약 1 내지 약 210, 약 1 내지 약 240, 약 1 내지 약 270, 약 1 내지 약 300, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 150, 약 30 내지 약 180, 약 30 내지 약 210, 약 30 내지 약 240, 약 30 내지 약 270, 약 30 내지 약 300, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 150, 약 60 내지 약 180, 약 60 내지 약 210, 약 60 내지 약 240, 약 60 내지 약 270, 약 60 내지 약 300, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 150, 약 90 내지 약 180, 약 90 내지 약 210, 약 90 내지 약 240, 약 90 내지 약 270, 약 90 내지 약 300, 약 120 내지 약 150, 약 120 내지 약 180, 약 120 내지 약 210, 약 120 내지 약 240, 약 120 내지 약 270, 약 120 내지 약 300, 약 150 내지 약 180, 약 150 내지 약 210, 약 150 내지 약 240, 약 150 내지 약 270, 약 150 내지 약 300, 약 180 내지 약 210, 약 180 내지 약 240, 약 180 내지 약 270, 약 180 내지 약 300, 약 210 내지 약 240, 약 210 내지 약 270, 약 210 내지 약 300, 약 240 내지 약 270, 약 240 내지 약 300, 또는 약 270 내지 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 1, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 150, 약 180, 약 210, 약 240, 약 270, 또는 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 적어도 약 1, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 150, 약 180, 약 210, 약 240, 또는 약 270의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 최대 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 150, 약 180, 약 210, 약 240, 약 270, 또는 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 10 내지 약 100의 IHC-스코어이거나 이를 초과한다.

특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)을 포함한다. 특정 구현예에서, ELISA는 전기화학발광을 검출한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 개체로부터의 비희석된 생물학적 샘플에서 약 1 pg/mL 내지 약 10 pg/mL의 LIF이다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 5번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 10번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 5번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 10번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF mRNA 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 5번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 10번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 5번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 10번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 25번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 50번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 25번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 50번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF mRNA 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 25번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 50번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 25번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 50번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF DNA 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 포함한다. 특정 구현예에서, PCR은 정량 PCR을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 시퀀싱 반응은 차세대 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈장이다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈청이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 종양 생검이다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준을 초과하는 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준 미만인 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역조절성 분자는 MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, PD-L1, CCL7, CCL2, CCL3, 및 CCL22로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 방법은 II형 대식세포(M2) 마커의 DNA, mRNA, 또는 단백질의 기준 수준을 초과하는 II형 대식세포(M2) 마커의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, M2 마커는 CD206, CD163, PF4, CTSK, 및 ARG1으로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질이다. 특정 구현예에서, 방법은 LIFR의 기준 수준을 초과하는 LIF 수용체(LIFR)의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 면역조절성 세포에서 검출된다. 특정 구현예에서, 인간암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 두경부 편평 세포 암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 췌장암, 전립선암, 다형아교모세포종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 LIF의 수준을 결정하는 단계, 및 치료량의 항-LIF 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3)을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 38에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 39에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 영역, 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체이다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF 단백질 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 면역조직화학을 포함한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 항-LIF 항체로 염색 양성인 세포의 약 1%, 2%, 3%. 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 50%이다.

특정 구현예에서, 기준 수준은 약 100의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 1 내지 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 60, 약 1 내지 약 90, 약 1 내지 약 120, 약 1 내지 약 150, 약 1 내지 약 180, 약 1 내지 약 210, 약 1 내지 약 240, 약 1 내지 약 270, 약 1 내지 약 300, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 150, 약 30 내지 약 180, 약 30 내지 약 210, 약 30 내지 약 240, 약 30 내지 약 270, 약 30 내지 약 300, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 150, 약 60 내지 약 180, 약 60 내지 약 210, 약 60 내지 약 240, 약 60 내지 약 270, 약 60 내지 약 300, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 150, 약 90 내지 약 180, 약 90 내지 약 210, 약 90 내지 약 240, 약 90 내지 약 270, 약 90 내지 약 300, 약 120 내지 약 150, 약 120 내지 약 180, 약 120 내지 약 210, 약 120 내지 약 240, 약 120 내지 약 270, 약 120 내지 약 300, 약 150 내지 약 180, 약 150 내지 약 210, 약 150 내지 약 240, 약 150 내지 약 270, 약 150 내지 약 300, 약 180 내지 약 210, 약 180 내지 약 240, 약 180 내지 약 270, 약 180 내지 약 300, 약 210 내지 약 240, 약 210 내지 약 270, 약 210 내지 약 300, 약 240 내지 약 270, 약 240 내지 약 300, 또는 약 270 내지 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 약 1, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 150, 약 180, 약 210, 약 240, 약 270, 또는 약 300의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 적어도 약 1, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 150, 약 180, 약 210, 약 240, 또는 약 270의 IHC-스코어이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 최대 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 150, 약 180, 약 210, 약 240, 약 270, 또는 약 300의 IHC-스코어이다.

특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 포함한다. 특정 구현예에서, ELISA는 전기화학발광을 검출한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 개체로부터의 비희석된 생물학적 샘플에서 적어도 약 4 pg/mL의 LIF이다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 5번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 10번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 5번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 10번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF mRNA 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 5번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 10번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 5번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 10번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 25번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 암에서 LIF 단백질 발현의 50번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 25번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF 단백질 발현의 50번째 백분위수에 상응한다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF mRNA 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 25번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 동일한 유형의 암에서 LIF mRNA 발현의 50번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 25번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, 기준 수준은 인간 암의 대표 샘플에서 LIF mRNA 발현의 50번째 백분위수에 상응하는 수준이다. 특정 구현예에서, LIF의 수준은 LIF DNA 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 특정 구현예에서, PCR은 정량 PCR을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 시퀀싱 반응은 차세대 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈장이다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈청이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 종양 생검이다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준을 초과하는 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준 미만인 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역조절성 분자는 MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, PD-L1, CCL7, CCL2, CCL3, 및 CCL22로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 방법은 II형 대식세포(M2) 마커의 기준 수준을 초과하는 II형 대식세포(M2) 마커의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, M2 마커는 CD206, CD163, PF4, CTSK, 및 ARG1으로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질이다. 특정 구현예에서, 방법은 LIFR의 기준 수준을 초과하는 LIF 수용체(LIFR)의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 면역조절성 세포에서 검출된다. 특정 구현예에서, 인간암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 두경부 편평 세포 암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 췌장암, 전립선암, 다형아교모세포종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)의 수준을 결정하는 단계, 및 LIF의 수준이 LIF의 기준 수준보다 높은 경우 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 면역조절성 세포에서 검출된다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3)을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 38에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 39에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 영역, 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체이다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 LIFR 단백질의 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIFR 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIFR 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 면역조직화학을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 포함한다. 특정 구현예에서, ELISA는 전기화학발광을 검출한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 유세포 분석을 포함한다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 LIFR mRNA의 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIFR mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIFR mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 LIFR DNA의 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIFR DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIFR DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 특정 구현예에서, PCR은 정량 PCR을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 시퀀싱 반응은 차세대 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈장이다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈청이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 종양 생검이다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준을 초과하는 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준 미만인 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역조절성 분자는 MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, PD-L1, CCL7, CCL2, CCL3, 및 CCL22로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 방법은 II형 대식세포(M2) 마커의 기준 수준을 초과하는 II형 대식세포(M2) 마커의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, M2 마커는 CD206, CD163, PF4, CTSK, 및 ARG1으로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질이다. 특정 구현예에서, 방법은 LIF의 기준 수준을 초과하는 LIF의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 인간암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 두경부 편평 세포 암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 췌장암, 전립선암, 다형아교모세포종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)의 수준을 결정하는 단계, 및 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 면역조절성 세포에서 검출된다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3)을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 38에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 39에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 영역, 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항-LIF 항체는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체이다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 LIFR 단백질의 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIFR 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIFR 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 면역조직화학을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 포함한다. 특정 구현예에서, ELISA는 전기화학발광을 검출한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 유세포 분석을 포함한다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 LIFR mRNA의 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIFR mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIFR mRNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, LIFR의 수준은 LIFR DNA의 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIFR DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIFR DNA를 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 특정 구현예에서, PCR은 정량 PCR을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 검정은 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 시퀀싱 반응은 차세대 시퀀싱 반응을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈장이다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 혈청이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 종양 생검이다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준을 초과하는 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 면역조절성 분자의 기준 수준 미만인 면역조절성 분자의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역조절성 분자는 MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, PD-L1, CCL7, CCL2, CCL3, 및 CCL22로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 방법은 II형 대식세포(M2) 마커의 기준 수준을 초과하는 II형 대식세포(M2) 마커의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, M2 마커는 CD206, CD163, PF4, CTSK, 및 ARG1으로 이루어진 목록으로부터 번역된 mRNA 또는 이로부터 생성된 단백질이다. 특정 구현예에서, 방법은 LIF의 기준 수준을 초과하는 LIF의 DNA, mRNA, 또는 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 인간암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 두경부 편평 세포 암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 암은 췌장암, 전립선암, 다형아교모세포종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.

도 1은 상이한 항-LIF 인간화 항체의 LIF-유도 STAT3 인산화의 억제를 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 인간화 및 모 5D8 항체에 의한 LIF-유도 STAT3 인산화의 억제를 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
도 3a는 h5D8 항체를 이용한 U-251 세포에서 LIF 억제에 대한 IC₅₀을 나타낸 것이다.
도 3b는 내인성 LIF 자극 조건 하에서 pSTAT3의 r5D8 및 h5D8 억제의 대표적인 IC₅₀ 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다. 대표 곡선(n=1 h5D8, n=2 r5D8)이 나타나 있다.
도 4는 본 개시에 기재된 상이한 단클론성 항체의 LIF-유도 STAT3 인산화의 억제를 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
도 5는 인간 환자로부터의 다형아교모세포종(GBM), NSCLC(비소세포 폐 암종), 난소암, 결장직장암 종양 및 췌장 종양에서 LIF 발현의 면역조직화학 염색 및 정량화를 도시한 것이다. 막대는 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 6은 인간화 5D8 항체를 이용한 비소세포 폐암의 마우스 모델에서 실시된 실험을 나타내는 그래프이다.
도 7a는 GBM의 동소 마우스 모델에서 U251 세포의 억제에 대한 r5D8의 영향을 나타낸 것이다. 정량은 26일째에 나타나 있다.
도 7b는 인간 U251 GBM 세포를 발현하는 루시페라제가 접종된 후 주 2회 100 μg, 200 μg, 또는 300 μg의 h5D8 또는 비히클로 처리된 마우스로부터의 데이터를 나타낸 것이다. 종양 크기는 7일째에 생물발광(Xenogen IVIS 스펙트럼)에 의해 결정되었다. 그래프는 평균 ± SEM을 나타내는 가로 막대로 개체 종양 측정을 나타낸다. 통계적 유의성은 독립표본 비-모수 맨-휘트니 U-검정(unpaired non-parametric Mann-Whitney U-test)을 이용하여 계산되었다.
도 8a는 동계 마우스 모델에서 난소암 세포의 성장 억제에 대한 r5D8의 영향을 나타낸 것이다.
도 8b는 25일째 종양의 개별 측정을 나타낸 것이다.
도 8c는 h5D8이 200 μg/마우스로 주 2회 투여될 때 종양 성장의 유의한 감소를 나타낸다는 것을 예시한다(p < 0.05). 기호는 비히클과 비교한 통계적 유의성인 평균 + SEM이다(독립표본 비-모수 맨-휘트니 U-검정으로).
도 9a는 동계 마우스 모델에서 결장직장암 세포의 성장 억제에 대한 r5D8의 영향을 나타낸 것이다.
도 9b는 17일째 종양의 개별 측정을 나타낸 것이다.
도 10a는 CCL22+ 세포의 대표 이미지 및 정량화로 GBM의 동소 마우스 모델에서 종양 부위에 대한 대식세포 침윤의 감소를 나타낸 것이다.
도 10b는 인간 기관형 조직 슬라이스 배양 모델에서 대식세포 분극화의 감소를 나타낸 것이다. 대표 이미지(좌측) 및 정량화(우측)가 나타나 있다.
도 10c는 CCL22+ 세포의 대표 이미지 및 정량화로 난소암의 동계 마우스 모델에서 종양 부위에 대한 대식세포 분극화의 감소를 나타낸 것이다.
도 10d는 CCL22+ 세포의 대표 이미지 및 정량화로 결장직장암의 동계 마우스 모델에서 종양 부위에 대한 대식세포 침윤의 감소를 나타낸 것이다.
도 11a는 r5D8로의 처리 후 난소암의 동계 마우스 모델에서 비-골수 이펙터 세포의 증가를 나타낸 것이다.
도 11b는 r5D8로의 처리 후 결장직장암의 동계 마우스 모델에서 비-골수 이펙터 세포의 증가를 나타낸 것이다.
도 11c는 r5D8로의 처리 후 NSCLC 암의 마우스 모델에서 CD4+ T_REG 세포의 백분율 감소를 나타낸 것이다.
도 12는 항-CD4 및 항-CD8 고갈 항체의 존재 또는 부재에서 복강내 투여되는 PBS(대조) 또는 r5D8로 주 2회 처리된 CT26 종양을 보유한 마우스로부터의 데이터를 나타낸 것이다. 그래프는 평균 종양 부피 + SEM으로 표현된 d13에서의 개별 종양 측정을 나타낸 것이다. 그룹 간 통계적 차이는 독립표본 비-모수 맨-휘트니 U-검정에 의해 결정되었다. R5D8은 CT26 종양의 성장을 억제하였다(^*p < 0.05). r5D8에 의한 종양 성장 억제는 항-CD4 및 항-CD8 고갈 항체의 존재에서 유의하게 감소되었다(^****p < 0.0001).
도 13a는 LIF와의 복합체에서 h5D8 Fab의 공-결정 구조의 개요를 예시한 것이다. gp130 상호작용 부위는 LIF의 표면 상에 맵핑된다(어두운 음영).
도 13b는 100 Ų 초과의 표면적으로 매립된 h5D8 잔기와 염 다리를 형성시키는 잔기를 나타내는, LIF와 h5D8 간의 구체적인 상호작용을 예시한 것이다.
도 14a는 5개의 h5D8 Fab 결정 구조의 중첩을 예시한 것이고, 상이한 화학적 조건에서 결정화됨에도 불구하고 높은 정도의 유사성을 나타내고 있다.
도 14b는 독립표본 Cys100에 의해 매개된 반 데르 발스 상호작용의 광범위 네트워크를 예시한 것이다. 이 잔기는 잘 정렬되어 있고, HCDR1 및 HCDR3의 입체형태를 형상화하는 데 참여하며, 원치 않는 이황화 스크램블링에 관여하지 않는다. 잔기 간 거리는 점선으로 나타나 있고, 라벨링되어 있다.
도 15a는 ELISA에 따른 인간 LIF에 대한 h5D8 C100 돌연변이체의 결합을 예시한 것이다.
도 15b는 ELISA에 따른 마우스 LIF에 대한 h5D8 C100 돌연변이체의 결합을 예시한 것이다.
도 16a는 h5D8이 Octet에 따라 LIF와 LIFR 간의 결합을 차단하지 않는다는 것을 예시한다. LIF 이후 LIFR에 대한 h5D8의 순차적인 결합이 이어진다.
도 16b 및 도 16c는 고정화 LIFR 또는 gp130에 결합하는 LIF/mAb 복합체의 ELISA 분석을 예시한 것이다. 종-특이적 퍼옥시다제 접합 항-IgG 항체의 신호로((-) 및 h5D8의 경우 항-인간 및 r5d8 및 B09의 경우 항-래트) 고정화 LIFR(도 16b) 또는 gp130(도 16c) 코팅 플레이트를 결합하는 mAb/LIF 복합체의 항체 부분이 검출됨.
도 17a 및 도 17b는 72개의 상이한 인간 조직에서 LIF(도 16a) 또는 LIFR(도 16b)의 mRNA 발현을 예시한 것이다.
도 18은 고, 중-고, 중 저, 및 저 수준으로 계층화된 상이한 암 유형에서의 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다. 발현 데이터는 암 게놈 아틀라스로부터 수집된, 22개 적응증에서 수집된 7,769개 샘플에 걸쳐 측정된 LIF 전사물 수준을 나타내며, 데이터세트에 걸쳐 사분위수로 임계 값 지정된다.
도 19a는 CCL7 mRNA 수준과 LIF mRNA 수준의 상관관계(r²)를 나타낸 것이다. 각 적응증에 대한 샘플은 암 게놈 아틀라스로부터 입수하였고, LIF와 CCL7 간의 관련성이 피어슨 상관관계에 의해 평가되었다.
도 19b는 CCL2 mRNA 수준과 LIF mRNA 수준의 상관관계(r²)를 나타낸 것이다. 각 적응증에 대한 샘플은 암 게놈 아틀라스로부터 입수하였고, LIF와 CCL2 간의 관련성이 피어슨 상관관계에 의해 평가되었다.
도 19c는 CCL3 mRNA 수준과 LIF mRNA 수준의 상관관계(r²)를 나타낸 것이다. 각 적응증에 대한 샘플은 암 게놈 아틀라스로부터 입수하였고, LIF와 CCL3 간의 관련성이 피어슨 상관관계에 의해 평가되었다.
도 19d는 CCL22 mRNA 수준과 LIF mRNA 수준의 상관관계(r²)를 나타낸 것이다. 각 적응증에 대한 샘플은 암 게놈 아틀라스로부터 입수하였고, LIF와 CCL22 간의 관련성이 피어슨 상관관계에 의해 평가되었다.
도 20a는 II형 대식세포(M2)에 전형적인 발현 징후와 LIF mRNA 수준의 상관관계(r²)를 나타낸 것이다.
도 20b는 GBM 및 난소암에서 LIF와 CD163, CD206, 및 CCL2 발현 간의 상관관계를 나타낸 것이다. GBM 및 난소암(OV) TCGA 종양 코호트에서 LIF와 CD163, CD206, CCL2 발현(log2 RSEM에서) 간의 회귀 플롯이다.
도 20c는 20개의 GBM 종양으로부터 지시된 마커의 IHC의 상관관계를 나타낸 것이다. R-제곱 계수(R²)에 의한 LIF와 CCL2, CD206, CD163, 및 CXCL9 간의 상관관계가 나타나 있다.
도 20d는 항-LIF 처리 또는 비처리 GL261N 종양으로부터 TAM(CD11b⁺ Ly6G^- Ly6C^-)에서 CCL2⁺ 및 CXCL9⁺의 백분율 및 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸 것이다.
도 20e는 TAM 마커 양성 세포에 대한 이중 양성 세포의 백분율을 나타낸 것이다. CXCL9 정량화는 총 세포 수에 대한 것이다.
도 20f는, 유세포 분석에 의해 결정된, TAM(CD11b⁺ Ly6G^- Ly6C^-) 및 CD8⁺ T 세포(CD3⁺ CD8⁺) 집단에서 CCR2, CXCR3, 및 LIFR 수용체의 백분율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 맨-휘트니 T 검정에 의한 통계 분석. ^*P < 0.05.
도 20g는, 총 플럭스(p/s)로 나타나 있는, CXCL9^-/- 및 CCL2^-/- 마우스 또는 지시된 항체로 처리된 마우스에서 GL261N의 종양 성장을 나타낸 것이다.
도 20h는 지시된 처리에서 종양 침윤 CD8⁺ T 세포의 배수 증가(FI)를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 맨-휘트니 T 검정에 의한 통계 분석. ^*P < 0.05; ^**P < 0.01; ^***P < 0.001; ^****P < 0.0001.
도 20i는 Iba1⁺ 세포에 대한 이중 양성 세포의 백분율 및 총 세포 수에 대한 3일 동안 10 j.tg/ml의 항-LIF와 인큐베이션된 GBM 기관형 슬라이스(환자 1, 환자 2, 환자 3)에서 CXCL9⁺ 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 데이터는 모든 환자의 평균 ± SEM이다. 맨-휘트니 T 검정에 의한 통계 분석. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01; ^***P < 0.001; ^****P < 0.0001.
도 20j는 전체 종양 용해물(n = 8)의 qRT-PCR에 의해 결정된 끝점에서 CT26 종양 중의 M1 및 M2 유전자의 전사물 수준을 나타낸 것이다. 데이터는 IgG1 대조 처리 종양(Hprt, Tbp, Tfrc)의 평균에 대한 배수-변화로 표현된다.
도 20k는 TAM에서 범골수세포 집단(CD45⁺ 세포에서 CD11b⁺), TAM(CD45⁺ 세포에서 CD11b⁺ Ly6C^저 F4/80⁺), MHC II⁺ TAM(CD11b⁺ Ly6C^저 F4/80⁺ 세포에서 MHC II⁺), 및 TAM에서 MHC II 발현의 정량화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타나 있음(n은 각 실험에 대해 표시되어 있음), ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001.
도 21a 및 도 21b는 유세포 분석에 의해 3명의 공여자로부터의 1차 단핵구로부터 분화되고(도 21a) 형광 보정 비드에 대한 보간에 의해 정량화된(도 21b) 1차 대식세포에서 LIF 수용체의 수준을 나타낸 것이다.
도 22는 72시간 동안 LIF 처리(20 nM) 반응에 따른 1차 M₀ 대식세포에서 CD206 및 CD163의 증가를 나타낸 것이다.
도 23은 M₀ 대식세포, 및 M1 및 M2 대식세포(하단 우측 코너)에서 LIF 처리(20 nM) 반응에 따른 CCL22 분비의 증가를 나타낸 것이다.
도 24는 유세포 분석에 의해 결정된 III-C 기 혈청 난소암(2개의 상이한 공여자, 2개의 좌측 패널), 및 III-A 기 폐 선암(2개의 상이한 공여자, 2개의 우측 패널)으로부터의 종양 관련 대식세포에 대한 LIF 수용체 발현을 나타낸 것이다. 대조 플롯은 형광 마이너스 원(FMO) 대조이다.
도 25는 유세포 분석에 의해 결정된 III-C 기 혈청 난소암(2개의 상이한 공여자, 2개의 좌측 패널), 및 III-A 기 폐 선암(2개의 상이한 공여자, 2개의 우측 패널)으로부터의 종양 단핵구 골수 유래 억제 세포(M-MDSC) 종양 다형핵 골수 유래 억제 세포(PMN-MDSC)에 대한 LIF 수용체 발현을 나타낸 것이다. 대조 플롯은 형광 마이너스 원(FMO) 염색을 나타낸다. 샘플은 CD11b⁺ CD33⁺ HLA-DR^저에서 게이팅된다.

상세한 설명

일 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 LIF의 수준을 결정하는 단계, 및 LIF의 수준이 LIF의 기준 수준보다 높은 경우 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다.

또 다른 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 LIF의 수준을 결정하는 단계, 및 치료량의 항-LIF 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다.

또 다른 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)의 수준을 결정하는 단계, 및 LIF의 수준이 LIF의 기준 수준보다 높은 경우 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다.

또 다른 양태에서, 치료용 항-백혈병 억제 인자(LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)의 수준을 결정하는 단계, 및 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 기재된다.

본원에서 사용되는 용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 암, 종양 또는 신생물로 진단되거나, 이를 앓고 있는 것으로 의심되거나, 이를 발병시킬 위험이 있는 개체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 개체는 포유류이다. 특정 구현예에서, 포유류는 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 라마, 알파카 또는 야크이다. 특정 구현예에서, 개체는 인간이다.

달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "면역조절성 분자"는 면역 억제성 케모카인, 면역억제성 시토카인, 또는 관문 억제제 분자를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 선천성 및/또는 적응성 면역계를 조절하거나 이의 조절을 야기하는 종양 또는 종양-미세환경에 존재하는 임의의 분자, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. 면역조절성 분자는 면역조절성 세포, 종양/암 세포 또는 기질 세포에 의해 생성될 수 있다. 면역조절성 분자는 비제한적 예로서 CCL7, CCL2, CCL3, CCL22, MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, 및 PD-L1을 포함한다.

달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "면역조절성 세포"는 면역 조절성 인자를 생성시킬 수 있는 능력을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭하고, 수지상 세포, 대식세포, 종양-관련 대식세포, I형 대식세포, II형 대식세포, 종양 유래 억제 세포, 종양 다형핵 골수 유래 억제 세포(PMN-MDSC), 헬퍼 T 세포, 조절성 T 세포, 활성화된 T 세포, 항원 경험 T 세포, 및 세포독성 T 세포 등을 포함한다.

달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항체의 항원 결합 단편, 즉, 전장 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 중쇄 항체, 단쇄 항체 분자, 예를 들어, 단쇄 가변 영역 단편(scFv), 나노바디 및 별개의 특이성을 갖는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체, 예컨대, 이중특이성 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 항체에 대한 개체의 면역 반응을 감소시키는 방식으로 인간화된다. 예를 들어, 항체는 키메라, 예를 들어, 비-인간 가변 영역을 인간 불변 영역으로의 키메라, 또는 CDR 그라프팅, 예를 들어, 비-인간 CDR 영역을 인간 불변 영역으로의 CDR 그라프팅, 및 가변 영역 골격 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 인간화 후 탈면역화된다. 탈면역화는 항체의 불변 영역에서 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거하거나 돌연변이시키는 것을 수반한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 단클론성이다. 본원에서 사용되는 "재조합 항체"는 상이한 두 개의 종, 또는 두 개의 상이한 공급원으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 항체이며, 합성 분자, 예를 들어, 비-인간 CDR 및 인간 골격 또는 불변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 항체는 재조합 DNA 분자로부터 생성되거나 합성된다. 용어 "암" 및 "종양"은 조절되지 않는 세포 성장을 특성으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태와 관련된다. 암은 세포의 그룹이 통제되지 않는 성장 또는 원치 않는 성장을 나타내는 부류의 질환이다. 암 세포는 또한 다른 위치로 확산될 수 있는데, 이는 전이의 발생으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 체내 암세포의 확산은 림프 또는 혈액을 통해 발생할 수 있다. 통제되지 않은 성장, 침입 및 전이 발생은 암의 악성 성질이라고도 칭해진다. 이러한 악성 성질에 의해서, 전형적으로 침입하거나 전이하지 않는 양성 종양과 암이 구별된다.

본원에서 사용되는 "치료용 항체"는 개체에게 투여되고 암의 치료에 유용한 하나 이상의 유리한 효과를 야기하도록 의도된 것이다. 본 개시의 치료용 항체는 CDR 서열, 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 가변 영역, 또는 h5D8과 동일한 전체 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체, 또는 유사한 결합 특징(에피토프, 친화성, 또는 생물학적 효과)를 지니는 h5D8과 다른 CDR을 포함하고, 암을 치료하는 데 유용한 하나 이상의 유리한 효과를 야기할 수 있다.

본원에서 사용되는 "치료량"은 암을 치료하는 데 유용한 하나 이상의 유리한 효과를 야기하도록 의도된 치료용 항체의 투여량이다. 일부 특정 치료량이 본원에서 구체적으로 논의된다.

본원에서 사용되는 "치료하는" 또는 "치료"는 하나 이상의 유익한 효과를 야기하도록 의도된 질환 상태에서의 개입을 지칭한다. 암/종양 목적을 위해, 치료는 안정 질환, 부분 반응, 완전 반응, 무진행 생존 연장, 전체 생존 연장, 종양 축소, 종양 성장 지연, 종양 성장 정지, 또는 전이의 예방 또는 감소를 야기하도록 의도되거나 야기하는 방법을 포함한다. 특정 경우에, 본원에 기재된 치료 방법은 성공적인 치료 후 유지로서 또는 특정 종양 또는 암의 재발 또는 전이를 예방하기 위해 사용될 수 있다. 모든 개체가 주어진 치료 항체 투여에 동일한 정도로 또는 임의 정도로 반응하지 않을 것이고, 심지어 반응이 검출되지 않는 경우에도 그럼에도 불구하고 이러한 개체들은 치료받은 적이 있는 것으로 간주된다는 것이 이해된다.

본원에서 사용되는 "바이오마커"는 그 존재가 개체의 질환 상태의 지표인 개체에서 측정 가능한 분자이다. 제한 없이, 바이오마커는, 예를 들어, 단백질 및 이들의 번역후 변형, 폴리펩티드, 핵산, DNA, RNA, 아미노산, 지방산, 지질, 스테롤, 탄수화물, 또는 대사물 및 아미노산, 지방산, 지질, 스테롤, 및 탄수화물의 대사 중간체를 포함한다.

본원에서 사용되는 "IHC-스코어"는 시험 샘플에서 LIF 또는 LIF 수용체 발현 수준을 정량화하는 데 사용되는 매개변수와 관련된다. 샘플에서 IHC-스코어는 면역조직화학을 이용하여 항-LIF 또는 LIF 수용체 특이적 항체로 샘플을 염색함으로써 결정된다. 각 종양 세포는 염색 없음의 경우 0에서부터 가장 강한 염색의 경우 3+까지 범위의 강도 수준으로 주어지고, 2+는 중간 정도의 염색 세포의 경우이고 1+는 약한 염색 세포의 경우이다. IHC 스코어는 이후 하기 식으로 계산될 수 있다:

IHC 스코어는 1 내지 300의 범위일 수 있다. 샘플에서 IHC-스코어는 직접적으로 LIF 발현 수준에 관한 지표를 제공하기 위해 사용될 수 있거나, 개체가 항-LIF 치료용 항체로의 치료에 반응할 지의 여부에 관한 지표를 제공하기 위해 기준 IHC-스코어 값과 비교될 수 있다.

본원에서 사용되는 "면역조직화학" 또는 "IHC"는 조직 또는 세포의 샘플에서 특정 항원(바이오마커)에 대해 시험하기 위해 항체, 친화성 분자 및 염색을 이용하는 실험실 시험을 지칭한다. 항체는 효소 또는 형광 염료에 링킹될 수 있다. IHC는 조직 또는 세포 구조, 예를 들어, 핵 또는 세포막 염색을 추가로 설명하기 위해 다른 비-항체 염색 또는 방법과 조합될 수 있다. IHC는 포르말린-고정 파라핀 포매된 또는 동결된 조직 또는 생검 샘플에 대하여 수행될 수 있다. IHC는 또한 후속적으로 스핀 다운되거나 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립에 부착된 세포와 현탁되어 세포에 대하여 수행될 수 있다. IHC 샘플은 적합하게는 가시광 현미경 또는 영상화 또는 형광 현미경 또는 영상화에 의해 분석될 수 있다. 정량화는 수동으로 또는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, Image J)에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는 "기준 수준"은 개체로부터 얻어진 샘플에서 얻어진 값 또는 데이터를 평가하기 위해 참조로서 사용되는 소정의 기준을 지칭한다. 기준 수준은 절대 값; 상대 값; 상한치 또는 하한치를 갖는 값; 다양한 값; 평균 값; 중앙 값; 중간 값; 또는 특정 대조 또는 기준선 값과 비교한 값일 수 있다. 기준 수준은, 예를 들어, 시험되는 대상체로부터의 샘플에서 얻어진 값이지만 보다 이른 시점에 얻어진 값과 같은 개체 샘플 값을 기초로 할 수 있다. 기준 수준은 유사한 생활 연령, 성별, 질환 상태, 또는 그 밖의 매칭되는 그룹의 대상체의 집단으로부터와 같이 다수의 샘플을 기초로 하거나, 시험하고자 하는 샘플을 포함하거나 배제한 샘플의 풀을 기초로 할 수 있다. 기준 수준은 또한 암을 앓고 있는 상이한 개체로부터 얻어진 암/종양 샘플의 대표적인 수로부터 결정될 수 있다. 기준 수준은 또한 암 또는 비-암을 앓고 있는 개체로부터의 생물학적 샘플로부터 결정될 수 있다. 암을 앓고 있거나 비-암을 앓고 있는 개체로부터의 이러한 생물학적 샘플들은, 예를 들어, 조직 생검, 혈액, 혈장, 혈청, 대변 샘플, 소변, 뇌척수액, 자궁경부, 또는 정액을 포함할 수 있다. 대표적인 샘플은 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 개체 또는 개체로부터의 암/종양 생물학적 샘플로부터의 측정을 포함할 수 있다.

참조 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트(%)는 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요 시, 갭을 도입한 후 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은, 참조 폴리펩티드 또는 항체 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율이다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하려는 목적을 위한 정렬은 공지된 다양한 방식, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 전장 서열에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터가 결정될 수 있다. 그러나, 본원의 목적 상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저작되었으며, 소스 코드는, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록된, 미국 저작권청(워싱턴 D.C., 20559)에 사용자 문서와 함께 제출되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc.(사우스 샌프란시스코, 캘리포니아)로부터 공개적으로 이용 가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운용 시스템에서의 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 다르지 않다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %는(대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음) 다음과 같이 계산된다: 분율 X/Y 곱하기 100(여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 매칭으로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 개수이다). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 같지 않을 것임이 인지될 것이다. 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에 기술된 바와 같이 얻어진다.

용어 "에피토프"는 항체와 같이 항원 결합 단백질에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정기를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적화하는 항원 결합 단백질에 의해 결합되는 항원의 영역이고, 항원이 단백질인 경우, 항원 결합 단백질을 직접적으로 접촉하는 특정 아미노산을 포함한다. 가장 흔하게, 에피토프는 단백질에 존재하지만, 일부 예에서 다른 종류의 분자, 예컨대, 당류 또는 지질에 존재할 수 있다. 에피토프 결정기는 분자의 화학적 활성 표면 그룹, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기를 포함할 수 있으며, 특정 3 차원 구조 특징, 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합체에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 아미노산의 선형 서열을 인식한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 아미노산의 입체형태적(비-선형) 배열을 인식한다.

본원에 기재된 항체의 구조적 속성

상보성 결정 영역("CDR")은 항체의 항원 결합 특이성을 주로 담당하는 면역글로불린(항체) 가변 영역의 일부이다. CDR 영역은 항체가 동일한 표적 또는 에피토프를 특이적으로 결합할 때에도 한 항체에서 다음 항체까지 매우 가변적이다. 중쇄 가변 영역은 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3로 약칭되는 세 개의 CDR 영역을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3로 약칭되는 세 개의 CDR 영역을 포함한다. 이러한 CDR 영역은 가장 N-말단인 CDR1 및 가장 C-말단인 CDR3를 갖는 가변 영역에서 연속적으로 정렬된다. CDR 사이에는 구조에 기여하고 CDR 영역에 훨씬 더 적은 가변성을 나타내는 골격 영역이 산재된다. 중쇄 가변 영역은 VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3, 및 VH-FR4로 약칭되는 네 개의 골격 영역을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, 및 VL-FR4로 약칭되는 네 개의 골격 영역을 포함한다. 두 개의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 완전 전장 이가 항체는 다음을 포함할 것이다: 세 개의 고유 중쇄 CDR 및 세 개의 고유 경쇄 CDR을 갖는, 12개의 CDR; 네 개의 고유 중쇄 FR 영역 및 네 개의 고유 경쇄 FR 영역을 갖는, 16개의 FR 영역. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 최소 세 개의 중쇄 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 최소 세 개의 경쇄 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 최소 세 개의 중쇄 CDR 및 세 개의 경쇄 CDR을 포함한다. 주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("카바트" 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("코티아" 넘버링 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," ("콘택트" 넘버링 체계); Lefranc MP et al.,"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" 넘버링 체계); 및 Honegger A and Pluekthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" 넘버링 체계)]에 기재된 것들을 포함하여 임의의 다수의 잘 알려진 체계를 이용하여 용이하게 결정될 수 있다. CDR은 본원에서 카바트, IMGT, 코티아 넘버링 체계, 또는 임의의 세 가지 조합으로 상이한 넘버링 체계를 이용하여 제공된 가변 서열로부터 본원에서 식별된다. 주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용되는 체계에 좌우하여 다를 수 있다. 예를 들어, 카바트 체계는 구조 정렬을 기초로 하는 반면, 코티아 체계는 구조 정보를 기초로 한다. 카바트와 코티아 체계 둘 모두의 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어, "30a"에 의해 수용되는 삽입, 및 일부 항체에서 보이는 결실과 함께 대부분의 공통 항체 영역 서열 길이를 기초로 한다. 두 체계는 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실("indel")을 배치하여 차등적인 넘버링이 있게 한다. 콘택트 체계는 복합 결정 구조의 분석을 기초로 하고, 코티아 넘버링 체계와 다수 측면에서 유사하다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 가변 영역으로부터 규정되는 CDR은 코티아, 카바트, IMGT, 콘택트, 또는 Aho 방법, 또는 이들의 임의의 조합에 따라 규정된 것들을 포함한다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대해 항체를 결합하는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 네이티브 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 여기서 각 도메인은 네 개의 보존된 골격 영역(FR) 및 세 개의 CDR를 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 쪽(2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원을 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 항원을 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조). 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 래트 기원의 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 래트 기원의 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 마우스 기원의 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 마우스 기원의 CDR을 포함한다.

예를 들어, 항체 친화성을 향상시키기 위해 CDR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 체세포 성숙 동안 높은 돌연변이율을 갖는 CDR 인코딩 코돈에서 이루어질 수 있고(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 생성된 변이체는 결합 친화성에 대해 시험될 수 있다. 친화성 성숙(예를 들어, 실수유발 PCR, 사슬 셔플링, CDR의 무작위화, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발 이용)은 항체 친화성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)] 참조). 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)] 참조). 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 흔히 표적화된다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 간의 접촉점을 확인하기 위해 분석된다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 요망되는 성질을 갖는 지의 여부를 결정하기 위해 선별될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 가변 영역 외에 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역(C_H)은 가변 영역에 대해 C-말단인 전장 중쇄 폴리펩티드의 C-말단 단부에 위치한 C_H1, C_H2, C_H3, 및 C_H4로 약칭되는 네 개의 도메인을 포함한다. 경쇄 불변 영역(C_L)은 C_H보다 훨씬 더 작고, 가변 영역에 대해 C-말단인 전장 경쇄 폴리펩티드의 C-말단 단부에 위치한다. 불변 영역은 고도로 보존되고, 약간 상이한 기능 및 성질과 관련된 상이한 동형을 포함한다. 특정 구현예에서, 불변 영역은 표적 항원에 대한 항체 결합에 따라 나뉘어질 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 불변 영역은 중쇄와 경쇄 둘 모두로 항체 결합에 대해 나뉘어질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체에는 경쇄 불변 영역, 중쇄 불변 영역, 또는 이 둘 모두 중 하나 이상이 없다. 대부분의 단클론성 항체는 IgG 동형인데; 이는 추가로 네 개의 서브클래스 IgG₁, IgG₂, IgG₃, 및 IgG₄로 나뉘어진다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 임의의 IgG 서브클래스를 포함한다. 특정 구현예에서, IgG 서브클래스는 IgG₁을 포함한다. 특정 구현예에서, IgG 서브클래스는 IgG₂를 포함한다. 특정 구현예에서, IgG 서브클래스는 IgG₃를 포함한다 특정 구현예에서, IgG 서브클래스는 IgG₄를 포함한다.

항체는 보체 및 Fc 수용체에 대한 결합을 담당하는 단편 결정화 영역(Fc 영역)을 포함한다. Fc 영역은 항체 분자의 C_H2, C_H3, 및 C_H4 영역을 포함한다. 항체의 Fc 영역은 보체 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 활성화시키는 역할을 한다. Fc 영역은 또한 항체의 혈청 반감기에 기여한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료용 항체의 Fc 영역은 보체 매개 세포 용해를 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료용 항체의 Fc 영역은 ADCC를 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료용 항체의 Fc 영역은 보체 매개 세포 용해를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료용 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 수용체는 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 치료용 항체의 Fc 영역은 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 친화성을 증가시킨다.

임상에 유용한 항체는 흔히 인간 개체에서 면역원성을 감소시키기 위해 "인간화"된다. 인간화 항체는 단클론성 항체 요법의 안전성 및 효능을 향상시킨다. 인간화의 한 가지 흔한 방법은 임의의 적합한 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터)에서 단클론성 항체를 생성시키고, 불변 영역을 인간 불변 영역으로 교체하는 것인데, 이러한 방식으로 조작된 항체는 "키메라"로 칭해진다. 또 다른 흔한 방법은 비인간 V-FR을 인간 V-FR로 교체하는 "CDR 그라프팅"이다. CDR 그라프팅법에서, CDR 영역을 제외한 모든 잔기는 인간 기원이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 인간화된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 키메라이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 CDR 그라프팅이다.

치료용 항-LIF 항체로의 치료를 결정하는 방법

바이오마커의 수준이 개체로부터의 샘플에서 기준 수준을 초과하는 경우 치료용 항-LIF 항체로 개체를 치료하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 샘플은 의심되거나 인지한 종양으로부터의 조직 생검과 같이, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 또는 조직 샘플을 포함할 수 있다. 바이오마커는 LIF, LIF 수용체, II형 대식세포(M2) 세포의 마커, 조절성 T 세포의 마커, 활성화된 T 세포, 항원 경험 T 세포, 세포독성 T 세포, 면역억제성 시토카인, 또는 면역억제성 케모카인, 또는 인산화된 STAT3 또는 임의의 다른 면역조절성 분자를 포함할 수 있다. 바이오마커의 수준은 제한 없이 다음과 같은 임의의 흔히 사용되는 분자 또는 세포 기법에 의해 결정될 수 있다: 반정량적 PCR, 디지털 PCR, 실시간 PCR 또는 RNA-seq에 의한, mRNA 정량화; 또는 웨스턴 블롯, 유세포 분석, 질량 세포계수, ELISA, 면역형광, 또는 동종 단백질 정량 검정(예를 들어, AlphaLISA^®)에 의한, 단백질 정량화. 특정 구현예에서, 바이오마커는 특정 바이오마크에 특이적인 항체를 이용하여 면역조직화학에 의해 결정된다. 면역조직화학은 개체로부터의 생검 또는 혈액 샘플에 대하여 수행될 수 있다. 면역조직화학을 이용함으로써, 특정 단백질에 대한 IHC-스코어가 결정되고 기준 수준 또는 대조 샘플과 비교될 수 있다. 추가로, 바이오마커 조합의 단백질, mRNA, 또는 DNA 수준이 치료 판단을 알기 위해 결정될 수 있다.

특정 구현예에서, 바이오마커는 LIF이다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체로 치료되는 개체는 LIF 양성 종양/암을 가짐에 따라 치료를 위해 선택된 적이 있다. 특정 구현예에서, 종양은 LIF 양성이거나 상승된 수준의 LIF를 야기한다. 특정 구현예에서, LIF 양성은 참조 값 또는 일련의 병리학적 기준과 비교하여 결정된다. 특정 구현예에서, LIF 양성 종양은 종양이 유래된 형질전환되지 않은 세포보다 2-배 초과, 3-배, 5-배, 10-배, 100-배 또는 그 초과의 LIF를 발현한다. 특정 구현예에서, 종양은 LIF의 후천적 이소성 발현을 갖는다.

LIF 단백질 수준은 면역조직화학을 이용하여 정량적으로 또는 반정량적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, LIF IHC-스코어는 개체로부터의 샘플에서 계산될 수 있고, IHC 스코어가 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250이거나 이를 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 조직 생검 샘플이다. 특정 구현예에서, LIF 양성 세포의 백분율은 개체로부터의 샘플에서 결정될 수 있고, LIF 양성 세포의 백분율이 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%를 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 조직 생검 샘플이다. LIF-IHC 스코어 기준 수준은 적어도 N개 샘플의 집단에서 관찰된 수준으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, N은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 이상이거나 이를 초과한다. 특정 구현예에서, 샘플은 유사 유형의 암(예를 들어, 특정 암에 대한 기준 수준을 정하는) 또는 모든 암(예를 들어, 모든 암에 대한 기준 수준을 정하는)을 포함한다. 상이한 유형의 암은 h5D8로의 성공적인 치료에 대한 가능성 증가를 지시하는 상이한 기준 수준을 지닐 수 있고, 이에 따라 LIF IHC 스코어는 특정 암에 특이적일 수 있다. 특정 구현예에서, LIF IHC 스코어는 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 두경부 편평 세포 암종 중 어느 하나 이상에 특이적이다.

LIF 단백질 수준은 ELISA 기반 검정을 이용하여 정량적으로 또는 반정량적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 단백질 양은 개체로부터의 샘플에서 결정될 수 있고, 단백질 양이 1 피코그램/밀리리터(pg/mL), 2 pg/mL, 3 pg/mL, 4 pg/mL, 5 pg/mL, 6 pg/mL, 7 pg/mL, 8 pg/mL, 9 pg/mL, 10 pg/mL, 20 pg/mL, 30 pg/mL, 40 pg/mL, 50 pg/mL, 60 pg/mL, 70 pg/mL, 80 pg/mL, 90 pg/mL을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, LIF 단백질 양은 개체로부터의 샘플에서 결정될 수 있고, 단백질 양이 100 pg/mL, 200 pg/mL, 300 pg/mL, 400 pg/mL,500 pg/mL, 600 pg/mL, 700 pg/mL, 800 pg/mL, 900 pg/mL, 1 나노그램/밀리리터(ng/mL), 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL를 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, LIF 단백질 양은 개체로부터의 샘플에서 결정될 수 있고, 단백질 양이 100 피코그램/밀리리터(pg/mL), 200 pg/mL, 300 pg/mL, 400 pg/mL,500 pg/mL, 600 pg/mL, 700 pg/mL, 800 pg/mL, 900 pg/mL, 1 나노그램/밀리리터(ng/mL), 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL를 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플이다. ELISA 기준 수준은 적어도 N개 샘플의 집단에서 관찰된 수준으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, N은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 이상이거나 이를 초과한다. 특정 구현예에서, 샘플은 유사 유형의 암(예를 들어, 특정 암에 대한 기준 수준을 정하는) 또는 모든 암(예를 들어, 모든 암에 대한 기준 수준을 정하는)을 포함한다. 상이한 유형의 암은 h5D8로의 성공적인 치료에 대한 가능성 증가를 지시하는 상이한 기준 수준을 지닐 수 있고, 이에 따라 LIF ELISA 기준은 특정 암에 특이적일 수 있다. 특정 구현예에서, LIF ELISA 기준은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 두경부 편평 세포 암종 중 어느 하나 이상에 특이적이다.

LIF mRNA 수준은 실시간 PCR 또는 RNA-seq를 이용하여 정량적으로 또는 반정량적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, LIF mRNA 수준이 결정될 수 있고, LIF mRNA 수준이 25번째, 30번째, 35번째, 45번째, 50번째, 55번째, 60번째, 65번째, 70번째, 또는 75번째 백분위수에 상응하는 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 백분위수 기준은 적어도 N개 샘플의 집단에서 관찰된 mRNA 수준과 관련된다. 특정 구현예에서, N은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 이상이거나 이를 초과한다. 특정 구현예에서, 샘플은 유사 유형의 암(예를 들어, 특정 암에 대한 기준 수준을 정하는) 또는 모든 암(예를 들어, 모든 암에 대한 기준 수준을 정하는)을 포함한다. 상이한 유형의 암은 h5D8로의 성공적인 치료에 대한 가능성 증가를 지시하는 상이한 기준 수준을 지닐 수 있고, 이에 따라 LIF mRNA 기준 수준은 특정 암에 특이적일 수 있다. 특정 구현예에서, LIF mRNA 기준 수준은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 두경부 편평 세포 암종 중 어느 하나 이상에 특이적이다.

LIF는 LIF 수용체 및 gp130에 결합함으로써 신호전달한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 직접적으로 암 세포에서, 또는 종양 관련 골수 세포(예를 들어, 대식세포 또는 골수 유래 억제성 세포), 기질 세포(암 관련 섬유아세포), 또는 내피 세포에서 LIF 수용체(CD118)를 발현하는 종양 또는 암을 치료하는 데 유용하다. 종양 관련 대식세포는 II형 대식세포(M2)와 같은 특이적인 면역억제성 대식세포일 수 있다.

특정 구현예에서, 바이오마커는 LIF 수용체이다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체로 치료되는 개체는 LIF 수용체 양성 종양/암을 가짐에 따라 치료를 위해 선택된 적이 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체로 치료되는 개체는, 예를 들어, IHC, 유세포 분석, 또는 mRNA 정량화에 의해 평가하는 경우 종양 부위에 대한 LIF 수용체 양성 침윤물을 가짐에 따라 치료를 위해 선택된 적이 있다. 이러한 침윤물은 면역조절성 세포, 예컨대, 종양 관련 대식세포, II형 대식세포, 골수 유래 억제 세포, 종양 단핵구 골수 유래 억제 세포(M-MDSC), 또는 종양 다형핵 골수 유래 억제 세포(PMN-MDSC)를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 LIF 수용체를 발현하는 종양 또는 암을 치료하는 데 유용하다. LIF 수용체 양성 종양은 조직병리학 또는 유세포 분석에 의해 결정될 수 있고, 특정 구현예에서, 이소형 대조보다 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 이상 넘게 LIF 수용체 항체를 결합하는 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 종양은 LIF 수용체의 후천적 이소성 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 암 세포는 암 줄기 세포이다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 양성 종양 또는 암은 항-LIF 수용체를 이용하여 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 단백질 또는 mRNA의 수준은 면역억제성 반응과 관련된 하나 이상의 세포 집단과 관련하여 결정된다. 특정 구현예에서, 세포 집단은 골수 세포, 대식 세포, M2 세포, 호중구, 골수 유래 억제 세포, 종양 M-MDSC, 또는 종양 PMN-MDSC이다.

LIF 수용체 단백질 수준은 면역조직화학을 이용하여 정량적으로 또는 반정량적으로 결정될 수 있다. LIF 수용체에 대한 IHC 검정은 샘플 내 모든 세포, 샘플 내 모든 면역 세포, 샘플 내 모든 골수 유래 세포, 또는 샘플 내 모든 대식세포에서 발현된 LIF 수용체에 기초할 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 IHC-스코어는 개체로부터의 샘플에서 계산될 수 있고, IHC 스코어가 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250이거나 이를 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 조직 생검 샘플이다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 양성 세포의 백분율은 개체로부터의 샘플에서 결정될 수 있고, LIF 수용체 양성 세포의 백분율이 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%를 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 조직 생검 샘플이다. LIF 수용체 IHC 스코어 기준 수준은 적어도 N개 샘플의 집단에서 관찰된 수준으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, N은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 이상이거나 이를 초과한다. 특정 구현예에서, 샘플은 유사 유형의 암(예를 들어, 특정 암에 대한 기준 수준을 정하는) 또는 모든 암(예를 들어, 모든 암에 대한 기준 수준을 정하는)을 포함한다. 상이한 유형의 암은 h5D8로의 성공적인 치료에 대한 가능성 증가를 지시하는 상이한 기준 수준을 지닐 수 있고, 이에 따라 LIF 수용체 IHC 스코어는 특정 암에 특이적일 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 IHC 스코어는 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 두경부 편평 세포 암종 중 어느 하나 이상에 특이적이다.

LIF 수용체 단백질 수준은 유세포 분석 기반 검정을 이용하여 정량적으로 또는 반정량적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 단백질 수준은 개체로부터의 샘플에서 결정될 수 있고, 단백질 양이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플이다. 유세포 분석 기준 수준은 적어도 N개 샘플의 집단에서 관찰된 수준으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, N은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 이상이거나 이를 초과한다. 특정 구현예에서, 샘플은 유사 유형의 암(예를 들어, 특정 암에 대한 기준 수준을 정하는) 또는 모든 암(예를 들어, 모든 암에 대한 기준 수준을 정하는)을 포함한다. 상이한 유형의 암은 h5D8로의 성공적인 치료에 대한 가능성 증가를 지시하는 상이한 기준 수준을 지닐 수 있고, 이에 따라 LIF 유세포 분석 기준 스코어는 특정 암에 특이적일 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 유세포 분석 기준은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 두경부 편평 세포 암종 중 어느 하나 이상에 특이적이다.

LIF 수용체 mRNA 수준은 실시간 PCR 또는 RNA-seq를 이용하여 정량적으로 또는 반정량적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, LIF 수용체 mRNA 수준이 결정될 수 있고, LIF 수용체 mRNA 수준이 25번째, 30번째, 35번째, 45번째, 50번째, 55번째, 60번째, 65번째, 70번째, 또는 75번째 백분위수에 상응하는 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 백분위수 기준은 적어도 N개 샘플의 집단에서 관찰된 mRNA 수준과 관련된다. 특정 구현예에서, N은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 이상이거나 이를 초과한다. 특정 구현예에서, 샘플은 유사 유형의 암(예를 들어, 특정 암에 대한 기준 수준을 정하는) 또는 모든 암(예를 들어, 모든 암에 대한 기준 수준을 정하는)을 포함한다. 상이한 유형의 암은 h5D8로의 성공적인 치료에 대한 가능성 증가를 지시하는 상이한 기준 수준을 지닐 수 있고, 이에 따라 LIF mRNA 기준 수준은 특정 암에 특이적일 수 있다. 특정 구현예에서, LIF mRNA 기준 수준은 비소세포 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 두경부 편평 세포 암종 중 어느 하나 이상에 특이적이다.

치료용 항-LIF 항체로 개체를 치료하는 방법에서 유용한 본원에 기재된 추가의 바이오마커는 면역억제성 바이오마커를 포함한다. LIF 및 LIF 수용체는 다양한 면역조절성 세포 유형에서 신호전달에 중요한 것으로 밝혀졌고, 따라서 면역억제성 바이오마커는 잠재적인 치료 성공의 지표로서 작용할 수 있다. 이러한 바이오마커는 그 자체로, 또는 LIF와 LIF 수용체 수준의 결정과 조합하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제성 바이오마커의 단백질, mRNA, 또는 DNA 수준이 기준 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 면역억제성 바이오마커의 단백질, mRNA, 또는 DNA 수준이 기준 수준을 초과하고 LIF가 기준 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 면역억제성 바이오마커의 단백질, mRNA, 또는 DNA 수준이 기준 수준을 초과하고 LIF 수용체가 기준 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다.

특정 구현예에서, 세 개의 LIF, LIF 수용체 및 면역억제성 바이오마커 모두의 조합이 치료를 위한 개체를 선택하기 위해 이용될 수 있다. 본 개시의 중요한 면역조절성 및 면역억제성 바이오마커는 종양 관련 대식세포에 의해 방출되거나 종양 미세환경에 존재하는 케모카인 및 시토카인; 골수 유래 억제 세포의 마커, 또는 M2 대식세포를 비롯한 대식세포의 마커를 포함하여, 조절성 T 세포, 활성화된 T 세포, 항원 경험 T 세포, 세포독성 T 세포, 및 이들 각각의 기능과 관련된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 바이오마커는 T 조절성 세포에 따라 작용하는 면역조절성 분자, 예컨대, 공동자극성 분자, 항원 제시 분자, 시토카인 또는 케모카인이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 공동자극성 분자, 항원 제시 분자, 시토카인, 또는 케모카인은 MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, PD-L1, CCL7, CCL2, CCL3, 및 CCL22로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 항원 제시 분자는 MHCII이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CXCL9이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CXCL10이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CXCR3이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 공동자극성 분자는 PD-L1이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CCL7이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CCL2이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CCL3이다. 특정 구현예에서, T 조절성 세포에 따라 작용하는 시토카인 또는 케모카인은 CCL22이다. 특정 구현예에서, 환자는 MHCII의 수준이 기준 수준 미만인 경우에 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, MHCII가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 미만인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CXCL9의 수준이 기준 수준 미만인 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CXCL9이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 미만인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CXCL10의 수준이 기준 수준 미만인 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CXCL10이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 미만인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CXCR3의 수준이 기준 수준 미만인 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CXCR3가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 미만인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 PD-L1의 수준이 기준 수준 미만인 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, PD-L1이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 미만인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CCL7의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CCL7이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CCL2의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CCL2가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CCL3의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CCL3가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CCL22의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CCL22가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 면역억제성 바이오마커는 M2 대식 세포이다. 특정 구현예에서, M2 대식 세포의 마커는 CD206, CD163, PF4, CTSK, 및 ARG1로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, M2 대식세포의 마커는 CD206이다. 특정 구현예에서, M2 대식세포의 마커는 CD163이다. 특정 구현예에서, M2 대식세포의 마커는 PF4이다. 특정 구현예에서, M2 대식세포의 마커는 CTSK이다. 특정 구현예에서, M2 대식세포의 마커는 ARG1이다. 특정 구현예에서, 환자는 CD206의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CD206이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CD163의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CD163이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 PF4의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, PF4가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 CTSK의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, CTSK가 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 ARG1의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, ARG1이 대조 항체(예를 들어, 이소형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과인 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 면역억제성 바이오마커의 단백질 수준은 웨스턴 블롯, ELISA, 유세포 분석 또는 IHC에 의해 결정될 수 있고; 면역억제성 바이오마커의 mRNA 수준은 정량적 PCR 또는 RNA-seq에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 면역억제성 바이오마커의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우, 환자는 치료용 항-LIF 항체로의 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 면역억제성 바이오마커의 수준이 기준 수준을 초과하고 LIF가 기준 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 면역억제성 바이오마커의 수준이 기준 수준을 초과하고 LIF 수용체가 기준 수준을 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 세 개의 LIF, LIF 수용체 및 면역억제성 바이오마커 모두의 조합이 치료를 위한 개체를 선택하기 위해 사용될 수 있다.

치료용 항-LIF 항체로의 개체 치료를 결정하는 방법에서 유용한 본원에 기재된 추가의 바이오마커는 LIF 신호전달의 마커를 포함한다. 특정 구현예에서, LIF 신호전달의 마커는 인산화된 STAT3이다. 특정 구현예에서, 환자는 인산화된 STAT3의 수준이 기준 수준을 초과하는 경우 치료를 위해 선택된다. 특정 구현예에서, pSTAT3가 대조 항체(예를 들어, 동형 대조)에 비해 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 초과하는 경우, 치료용 항-LIF 항체가 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료용 항체는 h5D8 또는 이의 항원 결합 단편이다.

치료용 항-LIF 항체

본원에 기재된 5D8 항체는 인간 LIF를 인코딩하는 DNA로 면역화된 래트로부터 생성되었다. 항체의 모 래트 버전은 r5D8로 지칭되고, 인간화된 버전은 h5D8로 지칭된다.

5D8

본원에 기재된 항체는 인간 LIF를 인코딩하는 DNA로 면역화된 래트로부터 생성되었다. 한 가지 그러한 항체(5D8)는 클로닝되고 시퀀싱되었으며, 다음 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다(카바트 및 IMGT CDR 넘버링 방법의 조합 이용): SEQ ID NO: 1(GFTFSHAWMH)에 상응하는 VH-CDR1, SEQ ID NO: 4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)에 상응하는 VH-CDR2, SEQ ID NO: 6(TCWEWDLDF)에 상응하는 VH-CDR3, SEQ ID NO: 9(RSSQSLLDSDGHTYLN)에 상응하는 VL-CDR1, SEQ ID NO: 11(SVSNLES)에 상응하는 VL-CDR2, 및 SEQ ID NO: 13(MQATHAPPYT)에 상응하는 VL-CDR3. 이러한 항체는 CDR 그라프팅에 의해 인간화되었고, 인간화 버전은 h5D8로 지칭된다. V_H 및 V_L 영역은 SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 19에 기재된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 1(GFTFSHAWMH)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VH-CDR1, SEQ ID NO: 4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)에 기재된 것과 적어도 80%, 90%, 또는 95% 동일한 VH-CDR2, 및 SEQ ID NO: 6(TCWEWDLDF)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VH-CDR3를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 9(RSSQSLLDSDGHTYLN)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VL-CDR1, SEQ ID NO: 11(SVSNLES)에 기재된 것과 적어도 80% 동일한 VL-CDR2, 및 SEQ ID NO: 13(MQATHAPPYT)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VL-CDR3를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 1(GFTFSHAWMH)에 기재된 VH-CDR1, SEQ ID NO: 4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)에 기재된 VH-CDR2, SEQ ID NO: 6(TCWEWDLDF)에 기재된 VH-CDR3, SEQ ID NO: 9(RSSQSLLDSDGHTYLN)에 기재된 VL-CDR1, SEQ ID NO: 11(SVSNLES)에 기재된 VL-CDR2, 및 SEQ ID NO: 13(MQATHAPPYT)에 기재된 VL-CDR3을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정의 보존적 아미노산 치환이 본 개시의 CDR의 아미노산 서열에서 고려된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함하고, 10%, 20%, 또는 30% 넘게 결합 친화성에 영향을 미치지 않는다. 특정 구현예에서, LIF를 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 인간 중쇄 골격 영역을 포함한다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 1(GFTFSHAWMH)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VH-CDR1 아미노산 서열, SEQ ID NO: 4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)에 기재된 것과 적어도 80%, 90%, 또는 95% 동일한 VH-CDR2 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 8(TSWEWDLDF)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 9(RSSQSLLDSDGHTYLN)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VL-CDR1 아미노산 서열, SEQ ID NO: 11(SVSNLES)에 기재된 것과 적어도 80% 동일한 VL-CDR2 아미노산 서열, SEQ ID NO: 11(SVSNLES)에 기재된 것과 적어도 80% 동일한 VL-CDR2 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 13(MQATHAPPYT)에 기재된 것과 적어도 80% 또는 90% 동일한 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 1(GFTFSHAWMH)에 기재된 VH-CDR1 아미노산 서열, SEQ ID NO: 4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)에 기재된 VH-CDR2 아미노산 서열, SEQ ID NO: 8(TSWEWDLDF)에 기재된 VH-CDR3, SEQ ID NO: 9(RSSQSLLDSDGHTYLN)에 기재된 VL-CDR1 아미노산 서열, SEQ ID NO: 11(SVSNLES)에 기재된 VL-CDR2 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 13(MQATHAPPYT)에 기재된 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정의 보존적 아미노산 치환이 본 개시의 CDR의 아미노산 서열에서 고려된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함하고, 10%, 20%, 또는 30% 넘게 결합 친화성에 영향을 미치지 않는다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 LIF를 특이적으로 결합한다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 19에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 38에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 19에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37 중 어느 하나에 기재된에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, EQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간쇄 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 35에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 39에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 35에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, 다음을 포함하는 백혈병 억제 인자(LIF)를 특이적으로 결합하는 재조합 항체가 본원에 기재된다: SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); 및 SEQ ID NO: 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3).

특정 구현예에서, 다음을 포함하는 백혈병 억제 인자(LIF)를 특이적으로 결합하는 재조합 항체가 본원에 기재된다: SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); 및 SEQ ID NO: 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3). 특정의 보존적 아미노산 치환이 본 개시의 CDR의 아미노산 서열에서 고려된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함하고, 10%, 20%, 또는 30% 넘게 결합 친화성에 영향을 미치지 않는다.

특정 구현예에서, 다음을 포함하는 백혈병 억제 인자(LIF)를 특이적으로 결합하는 재조합 항체가 본원에 기재된다: SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1); SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2); SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3); SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1); SEQ ID NO: 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3). 특정의 보존적 아미노산 치환이 본 개시의 CDR의 아미노산 서열에서 고려된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산이 상이한 CDR을 포함하고, 10%, 20%, 또는 30% 넘게 결합 친화성에 영향을 미치지 않는다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 22 내지 SEQ ID NO: 25 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 26 내지 SEQ ID NO: 29 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 22 내지 SEQ ID NO: 25 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 26 내지 SEQ ID NO: 29 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 27 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 39에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄; 및 SEQ ID NO: 27 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 LIF를 특이적으로 결합하는 치료용 항체가 본원에 기재된다.

치료적으로 유용한 LIF 항체에 의해 결합된 에피토프

결합 시 LIF 생물학적 활성(예를 들어, STAT3 인산화)을 억제하고 생체내 종양 성장을 억제하며 치료적 효과를 야기하는, 인간 LIF의 고유한 에피토프가 본원에 기재된다. 본 개시의 치료용 항체는 h5D8의 CDR을 포함하지 않지만 h5D8과 동일하거나 유사한 에피토프(아미노산 잔기)에 결합하는 치료용 항체일 수 있다. 유사한 에피토프는 명시된 에피토프의 결합 내에서 결합하는 것이다. 본원에 기재된 에피토프는, 인간 LIF 단백질의 2개의 별개의 위상적 도메인(알파 헬릭스 A 및 C)에 존재하는, 아미노산(인간 LIF의 잔기 13 내지 잔기 32 및 잔기 120 내지 잔기 138)의 2개의 불연속 스트레치로 구성된다. 이러한 결합은 약한(반데르발스 인력(Van der Waals attraction)), 중간(수소 결합) 및 강한(염 다리) 상호작용의 조합이다. 특정 구현예에서, 접촉 잔기는 항-LIF 항체 상의 잔기와 수소 결합을 형성하는 LIF 상의 잔기이다. 특정 구현예에서, 접촉 잔기는 항-LIF 항체 상의 잔기와 염 다리를 형성하는 LIF 상의 잔기이다. 특정 구현예에서, 접촉 잔기는 항-LIF 항체 상의 잔기와 반데르발스 인력을 생성시키고 이의 적어도 5, 4, 또는 3 옹스트롬 내에 있는 LIF 상의 잔기이다. 치료용 항체는 이러한 에피토프를 결합하거나, 이러한 에피토프에 덜 결합하거나, 이러한 에피토프와 중복되고, 본원에 기재된 검정에서 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된, 치료용 항체는 다음 잔기들 중 어느 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개를 결합하는 단리된 항체이다: SEQ ID NO: 40의 A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, 또는 H138. 특정 구현예에서, 다음 잔기들 모두를 결합하는 단리된 항체가 본원에 기재된다: SEQ ID NO: 40의 A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, 또는 H138. 특정 구현예에서, 다음 잔기들 모두를 결합하는 단리된 항체가 본원에 기재된다: SEQ ID NO: 40의 A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, 또는 H138. 특정 구현예에서, 항체는 오로지 강한 상호작용 또는 중간의 상호작용으로 항체와 함께 참여하는 잔기만을 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 오로지 강한 상호작용으로 항체와 함께 참여하는 잔기만을 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 LIF의 헬릭스 A 및 C와 상호작용한다. 특정 구현예에서, 항체는 gp130과의 LIF 상호작용을 차단한다.

치료 적응증

특정 구현예에서, 본원에 개시된 치료용 항체는 세포에서 LIF 신호전달을 억제한다. 특정 구현예에서, U-251 세포에서 혈청 고갈 조건 하에 항체의 생물학적 억제에 대한 IC₅₀은 약 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 1 나노몰 이하이다. 특정 구현예에서, U-251 세포에서 혈청 고갈 조건 하에 항체의 생물학적 억제에 대한 IC₅₀은 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 또는 100 나노몰 이하이다.

특정 구현예에서, 암 또는 종양의 치료에 유용한 항체가 본원에 개시된다. 특정 구현예에서, 암은 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리, 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 골, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 및 간 종양을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 종양은 선종, 선암종, 맥관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배세포종, 교모세포종, 신경교종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경아세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종 및/또는 기형종을 포함한다. 특정 구현예에서, 종양/암은 말단 흑색점 흑색종, 광선 각화증, 선암종, 선낭암종, 선종, 샘육중, 선편평상피 암종, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포암, 기관지샘 암종, 모세혈관 암종, 암종, 암육종, 담관암종, 연골육종, 낭선종, 내배엽동 종양, 자궁내막증식증, 자궁내막간질 육종, 자궁내막모양 선암종, 뇌실막 육종, 스윙 육종, 국소결절성과증식, 위종, 생식선 종양, 교모세포종, 글루카곤종, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간 선종, 간 선종증, 간세포 암종, 인슐리나이트, 상피내 신생물, 상피내 편평 세포 신생물, 침윤성 편평 세포 암종, 대세포 암종, 지방육종, 폐 암종, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 평활근육종, 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피 종양, 신경초 종양, 수모세포종, 수질피종, 중피종, 점막표피 암종, 골수성 백혈병, 신경아세포종, 신경상피 선암종, 결절성 흑색종, 골육종, 난소 암종, 유두 장액 선암종, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 전립선 암종, 폐모세포종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 장액성 암종, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 연조직 암종, 소마토스타틴 분비 종양, 편평 상피 암종, 편평 세포 암종, 미분화 암종, 포도막 흑색종, 사마귀모양 암종, 질/음문 암종, 비포마(VIPpoma), 및 빌름스 종양의 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 항체로 치료될 종양/암은 뇌암, 두경부암, 결장 직장암, 급성 골수성 백혈병, 프레-B-세포 급성 림프모구성 백혈병, 방광암, 성상세포종, 바람직하게는 II, III 또는 IV 등급 성상세포종, 교모세포종, 다형아교모세포종, 소세포암, 및 비소세포 암, 바람직하게는 비소세포 폐암, 폐 선암종, 전이성 흑색종, 안드로겐-독립 전이성 전립선암, 안드로겐-의존 전이성 전립선암, 전립선 선암종, 및 유방암, 바람직하게는 유관 유방암, 및/또는 유방 암종을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체로 치료되는 암은 교모세포종을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 췌장암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 난소암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 폐암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 전립선암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 결장암을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료되는 암은 교모세포종, 췌장암, 난소암, 결장암, 전립선암, 또는 폐암을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 다른 치료에 불응성이다. 특정 구현예에서, 치료되는 암은 재발성이다. 특정 구현예에서, 암은 재발성/불응성 교모세포종, 췌장암, 난소암, 결장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 또는 폐암이다. 특정 구현예에서, 암은 진행성 고형 종양, 교모세포종, 위암, 피부암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 고환암, 갑상선암, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 신장암, 식도암, 난소암, 결장암, 폐암, 림프종, 또는 연조직암을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 비소세포 폐암, 상피 난소 암종, 또는 췌장 선암을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 진행성 고형 종양을 포함한다.

치료 방법

특정 구현예에서, 치료용 항체는, 예를 들어, 피하, 복막내, 정맥내, 근육내, 종양내, 또는 뇌내 등과 같이, 항체-함유 약제학적 조성물의 투여에 적합한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 정맥내로 투여된다. 특정 구현예에서, 항체는 적합한 투여 일정, 예를 들어, 매주, 주 2회, 매달, 월 2회 등으로 투여된다. 특정 구현예에서, 항체는 3주 마다 1회 투여된다. 항체는 임의의 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료적 허용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg이다. 특정 구현예에서, 치료적 허용량은 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg이다. 특정 구현예에서, 치료적 허용량은 약 5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg이다. 치료용 항체는 h5D8 항체가 투여되는 개체의 중량 또는 질량에 상관없이 정량 용량으로 투여될 수 있다. h5D8 항체는, 개체가 적어도 약 37.5 킬로그램의 징량을 갖는 경우, 치료용 항체가 투여되는 개체의 중량 또는 질량에 상관없이 정량 용량으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 75 밀리그램 내지 약 2000 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 225 밀리그램 내지 약 2000 밀리그램, 약 750 밀리그램 내지 약 2000 밀리그램, 약 1125 밀리그램 내지 약 2000 밀리그램, 또는 약 1500 밀리그램 내지 약 2000 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 75 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 225 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 750 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 1125 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 1500 밀리그램으로 투여될 수 있다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 2000 밀리그램으로 투여될 수 있다.

다른 투여량의 치료용 항체가 고려된다. 정량 용량의 치료용 항체는 약 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2025, 2050, 2075, 또는 2100 밀리그램으로 투여될 수 있다. 임의의 이러한 용량은 주 1회, 2주 마다 1회, 3주 마다 1회, 또는 4주 마다 1회 투여될 수 있다.

치료용 항체는 치료용 항체가 투여되는 개체의 체중 또는 질량을 기준으로 한 용량으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 3 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 또는 약 20 mg/kg 내지 약 25 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 h5D8은 약 1 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 3 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 10 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 15 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 20 mg/kg으로 투여될 수 있다. 체중 조절된 용량의 치료용 항체는 약 25 mg/kg으로 투여될 수 있다.

본원에서 구체화된 임의의 용량은 적어도 약 60분의 기간에 걸쳐 정맥내로 투여될 수 있지만; 이러한 기간은 각각의 개별 투여와 관련된 조건을 기준으로 다소 다를 수 있다.

약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 및 희석제

특정 구현예에서, 본 개시의 항체는 멸균액에 현탁되어 투여된다. 특정 구현예에서, 용액은 생리적으로 적절한 염 농도(예를 들어, NaCl)이다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.6% 내지 1.2% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.7% 내지 1.1% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.8% 내지 1.0% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 석시네이트, 포스페이트, 바이카보네이트 및 하이드록시메틸아미노메탄(트리스); 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80(트윈 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20), 폴리소르베이트 및 폴록사머 188; 폴리올/디사카라이드/폴리사카라이드, 예를 들어, 글루코스, 덱스트로스, 만노스, 만니톨, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 및 덱스트란 40; 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 글리신 또는 아르기닌; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌; 및 킬레이팅제, 예를 들어, EGTA 또는 EGTA. 특정 구현예에서, 본 개시의 백금-기반 항신생물제, LIF-결합 폴리펩티드, 또는 백금-기반 항신생물제와 LIF-결합 폴리펩티드 둘 모두는 멸균 용액에 현탁되어 투여된다. 특정 구현예에서, 백금-기반 항신생물제와 LIF-결합 폴리펩티드는 동일한 용액으로부터 투여된다. 특정 구현예에서, 용액은 생리적으로 적절한 염 농도(예를 들어, NaCl)이다. 특정 구현예에서, 용액은 약 0.6% 내지 1.2% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 용액은 약 0.7% 내지 1.1% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 용액은 약 0.8% 내지 1.0% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 고농도 항체 저장액은 약 0.9% NaCl에서 희석될 수 있다. 특정 구현예에서, 용액은 약 0.9% NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 용액은 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 석시네이트, 포스페이트, 바이카보네이트 및 하이드록시메틸아미노메탄(트리스); 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80(트윈 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20), 폴리소르베이트 및 폴록사머 188; 폴리올/디사카라이드/폴리사카라이드, 예를 들어, 글루코스, 덱스트로스, 만노스, 만니톨, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 및 덱스트란 40; 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 글리신 또는 아르기닌; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌; 및 킬레이팅제, 예를 들어, EGTA 또는 EGTA 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체는 동결건조되어 출하/보관되고, 투여 전에 재구성된다. 특정 구현예에서, 동결건조된 항체 제형은 증량제, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 및 덱스트란 40을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항-LIF 항체는 사용 치료 부위에서 희석될 고농도 저장액으로 출하되고 보관될 수 있다. 특정 구현예에서, 저장액은 약 25 mM 히스티딘, 약 6% 수크로스, 약 0.01% 폴리소르베이트, 및 약 20 mg/mL의 항-LIF 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 약 6.0이다. 특정 구현예에서, 개체에게 투여되는 형태는 약 25 mM 히스티딘, 약 6% 수크로스, 약 0.01% 폴리소르베이트 80, 및 약 20 mg/mL의 h5D8 항체를 포함하는 수용액이다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 약 6.0이다.

실시예

하기 예시적인 실시예는 본원에 기재된 조성물 및 방법의 대표적인 구현예이며, 임의의 방식으로 제한하려고 의도된 것이 아니다.

실시예 1-LIF에 특이적인 래트 항체의 생성

인간 LIF의 아미노산 23 내지 아미노산 202를 인코딩하는 cDNA를 발현 플라스미드(Aldevron GmbH, 프라이부르크, 독일)로 클로닝하였다. 입자-충격용 휴대용 장치("유전자 총(gene gun)")를 사용하여 DNA-코팅 금-입자의 진피내 적용에 의해 실험실 래트(Wistar)의 그룹을 면역화시켰다. 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 상의 세포 표면 발현을 LIF 단백질의 N-말단에 추가된 태그를 인식하는 항-태그 항체로 확인하였다. 일련의 면역화 후 혈청 샘플을 수집하고, 상기 언급된 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에 대하여 유세포 분석으로 시험하였다. 항체-생산 세포를 단리하고, 표준 절차에 따라 마우스 골수종 세포(Ag8)와 융합시켰다. LIF에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마를 상술된 바와 같은 유세포 분석 검정에서 선별에 의해 식별하였다. RNA 보호제(RNAlater, ThermoFisher Scientific에 의한 cat. #AM7020)를 사용하여 양성 하이브리도마 세포의 세포 펠렛을 제조하고, 항체의 가변 도메인의 시퀀싱을 위해 추가로 가공하였다.

실시예 2-LIF에 특이적인 마우스 항체의 생성

인간 LIF의 아미노산 23 내지 아미노산 202를 인코딩하는 cDNA를 발현 플라스미드(Aldevron GmbH, 프라이부르크, 독일)로 클로닝하였다. 입자-충격용 휴대용 장치("유전자 총")를 사용하여 DNA-코팅 금-입자의 진피내 적용에 의해 실험실 마우스(NMRI)의 그룹을 면역화시켰다. 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 상의 세포 표면 발현을 LIF 단백질의 N-말단에 추가된 태그를 인식하는 항-태그 항체로 확인하였다. 일련의 면역화 후 혈청 샘플을 수집하고, 상기 언급된 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에 대하여 유세포 분석으로 시험하였다. 항체-생산 세포를 단리하고, 표준 절차에 따라 마우스 골수종 세포(Ag8)와 융합시켰다. LIF에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마를 상술된 바와 같은 유세포 분석 검정에서 선별에 의해 식별하였다. RNA 보호제(RNAlater, ThermoFisher Scientific에 의한 cat. #AM7020)를 사용하여 양성 하이브리도마 세포의 세포 펠렛을 제조하고, 항체의 가변 도메인의 시퀀싱을 위해 추가로 가공하였다.

실시예 3-LIF에 특이적인 래트 항체의 인간화

래트 면역화(5D8)로부터의 하나의 클론을 후속 인간화를 위해 선택하였다. 표준 CDR 그라프팅법을 사용하여 인간화를 실시하였다. 중쇄 및 경쇄 영역을 표준 분자 클로닝 기법을 사용하여 5D8 하이브리도마로부터 클로닝하고, 생거법(Sanger method)에 의해 시퀀싱하였다. 그 후에, BLAST 검색을 인간 중쇄 및 경쇄 가변 서열에 대하여 실시하고, 각각으로부터 4개의 서열을 인간화를 위한 억셉터 프레임워크로서 선택하였다. 이러한 억셉터 프레임워크를 탈면역화시켜 T 세포 반응 에피토프를 제거하였다. 5D8의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 4개의 상이한 중쇄 억셉터 프레임워크(H1 내지 H4), 및 4개의 상이한 경쇄 프레임워크(L1 내지 L4)로 클로닝하였다. 그 후에, 16개의 상이한 항체 모두를 다음에 대하여 시험하였다: CHO-S 세포(Selexis)에서의 발현; LIF-유도 STAT3 인산화의 억제; 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 결합 친화성. 이러한 실험들은 표 1에 요약되어 있다.

[표 1]

형질감염된 세포의 발현 성능을 세포 배양 10일 후에 유가식 배양 내 삼각 플라스크(시딩 3 × 10⁵개 세포/mL, 200 mL 배양 부피)에서 비교하였다. 이 시점에 세포를 수확하고, 단백질 A 컬럼을 사용하여 분비된 항체를 정제한 다음 정량화하였다. H3 중쇄를 사용한 것들을 제외한 모든 인간화 항체가 발현되었다. H2 및 L2 가변 영역은 다른 가변 영역(SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 19)에 비해 잘 수행되었다.

티로신 705에서 LIF-유도 STAT3 인산화의 억제를 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. U251 신경교종 세포를 100,000개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 임의의 처리 전 24시간 동안 완전 배지에서 배양하고, 그 후에 세포를 8시간 동안 혈청 고갈시켰다. 그 후, 10 μg/ml의 농도에서 밤새 지시된 항체로 세포를 처리하였다. 처리 후, 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 방사선-면역침전 검정(radio-immunoprecipitation assay: RIPA) 용해 완충액에서 단백질을 얻고, 정량화하고(BCA-단백질 검정, Thermo Fisher Scientific), 웨스턴 블롯에 사용하였다. 웨스턴 블롯의 경우, 5% 무지방 건조 우유-TBST에서 막을 1시간 동안 차단하고, 일차 항체와 밤새(p-STAT3, 카탈로그 #9145, Cell Signaling 또는 STAT3, 카탈로그 #9132, Cell Signaling) 또는 30분(β-액틴-퍼옥시다제, 카탈로그 #A3854, Sigma-Aldrich) 동안 인큐베이션하였다. 막을 이후 TBST로 세척하고, 이차와 인큐베이션하고, 다시 세척하였다. 단백질을 화학 발광(SuperSignal 기질, 카탈로그 #34076, Thermo Fisher Scientific)에 의해 검출하였다. 이러한 결과들은 도 1에 나타나 있다. pSTAT3 밴드가 어두울수록 더 적은 억제가 존재한다. 레인 표지 5D8(비-인간화 래트), A(HOLO), C(H1L2), D(H1L3) 및 G(H2L2)에서 억제가 높고; H(H2L3), O(H4L2) 및 P(H4L3)에서 억제는 중간이고; B(H1L1), E(H1L4), F(H2L1), I(H2L4), N(H4L1) 및 Q(H4L4)에서는 억제가 없었다.

LIF-유도 STAT3 인산화의 억제를 나타낸 항체들을 이후 SPR에 의해 분석하여 결합 친화도를 결정하였다. 간략히, 아민 커플링된 hLIF에 대한 A(H0L0), C(H1L2), D(H1L3), 및 G(H2L2), H(H2L3) 및 O(H4L2) 인간화 항체의 결합을 Biacore™ 2002 Instrument를 사용하여 관찰하였다. 6개의 리간드 농도에서 모든 센서 칩 표면 상에 생성된 모든 센서그램의 수학적 센서그램 피팅(랭뮤어 상호작용 모델 [A + B = AB])에 의해 키네틱 상수 및 친화도를 결정하였다. 키네틱 상수 및 친화도의 계산에 각 농도의 가장 우수한 피팅 곡선(최소 Chi2)을 사용하였다. 표 1을 참조하라.

실험 설정에는 이가 항체를 피분석물로 사용했기 때문에, 인간화 항체의 표적 결합 기전에 대한 보다 구체적인 통찰을 얻기 위해 가장 우수한 피팅 센서그램을 또한 이가 피분석물 피팅 모델 [A + B = AB; AB + B = AB2]을 기초로 분석하였다. 이가 피팅 모델 [A + B = AB; AB + B = AB2]을 사용한 키네틱 센서그램 분석으로 mAb 샘플의 상대 친화도 순위를 확인하였다.

H2 및 L2를 포함하는 인간화 5D8은 이의 높은 결합 친화도 및 회분 배양으로부터의 높은 수율 때문에 보다 면밀한 분석을 위해 선택되었다.

실시예 4-LIF에 대한 결합을 향상시키는 클론 5D8의 인간화

추가 분석을 위해 H2L2 클론(h5D8)을 선택하고, SPR에 의해 모 래트 5D8(r5D8) 및 마우스 클론 1B2에 대한 결합을 비교하였다. 1B2 항체는 이전에 독일 미생물 및 세균 배양 협회(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH)(DSM ACC3054)에 기탁된 종래에 개시되어 있는 마우스 항-LIF 항체이며, 비교 목적으로 포함되었다. 각각 E. 콜라이 및 HEK-293 세포로부터 정제된 재조합 인간 LI를 리간드로서 사용하였다. 인간 또는 E. 콜라이 공급원으로부터의 LIF를 아민 커플링 화학을 이용하여 Biacore 광학 센서 칩의 표면에 공유 결합하고, 결합 친화도를 키네틱 상수로부터 계산하였다.

물질 및 방법

E. 콜라이로부터의 인간 LIF를 Millipore로부터 입수하고(참조 LIF 1010); HEK-293 세포로부터의 인간 LIF를 ACRO Biosystems로부터 입수하였다(참조 LIF-H521b). LIF를 Biacore 아민 커플링 키트(BR-1000-50; GE-Healthcare, 웁살라)를 사용하여 센서 칩에 커플링하였다. CM5 광학 센서 칩(BR-1000-12; GE-Healthcare, 웁살라)을 사용하여 Biacore™ 2002 Instrument에서 샘플을 작동시켰다. 기계 작동(BR-1001-88; GE-Healthcare, 웁살라) 동안 Biacore HBS-EP 완충액을 사용하였다. 결합 센서그램의 키네틱 분석을 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 증가하는 피분석물 농도에서 모든 센서 칩 표면 상에 생성된 모든 센서그램의 수학적 센서그램 피팅(랭뮤어 상호작용 모델 [A + B = AB])에 의해 키네틱 상수 및 친화도를 결정하였다. 또한, 소정 랭뮤어 항체 - 표적 친화도에 대한 이가 기여(예를 들어, 결합활성 기여)의 추정치를 생성시키기 위해, 성분 분석을 포함하여, 이가 피분석물 센서그램 피팅 모델 [A + B = AB; AB + B = AB₂]을 기초로 센서그램을 분석하였다. 키네틱 상수 및 친화도의 계산에 각 농도의 가장 우수한 피팅 곡선(최소 Chi²)을 사용하였다. 이러한 친화도 실험의 요약은 표 2(E. 콜라이에서 제조된 인간 LIF) 및 표 3(HEK 293 세포에서 제조된 인간 LIF)에 나타나 있다.

[표 2]

[표 3]

이러한 실험 세트로부터의 랭뮤어 1:1 센서그램 피팅 모델은 인간화 5D8(h5D8) 항체가 마우스 1B2 및 r5D8보다 인간 LIF에 대해 약 10배 내지 25배 더 높은 친화도로 결합되었다는 것을 지시한다.

다음으로, h5D8 항체를 SPR에 의해 여러 종의 LIF에 대하여 시험하였다. H5D8 SPR 결합 키네틱을 상이한 종 및 발현 시스템으로부터 유래된 재조합 LIF 피분석물에 대하여 수행하였다: 인간 LIF(E. 콜라이, HEK293 세포); 마우스 LIF(E. 콜라이, CHO 세포); 래트 LIF(E. 콜라이); 시노몰구스 원숭이 LIF(효모, HEK293 세포).

물질 및 방법

h5D8 항체를 비-공유 Fc 특이적 포획에 의해 센서 칩 표면에 고정화하였다. 재조합, Ig(Fc) 특이적 S. 아우레우스 단백질 A/G를 포획제로서 사용하여 LIF 피분석물에 항-LIF 항체의 입체적으로 균일하고 유연한 제시를 가능하게 하였다. LIF 피분석물의 공급원은 다음과 같았다: 인간 LIF(E. 콜라이로부터의; Millipore 참조 LIF 1050); 인간 LIF(HEK 세포로부터의, ACRO Biosystems LIF-H521); 마우스 LIF(E. 콜라이; Millipore Cat. No NF-LIF2010); 마우스 LIF(CHO 세포로부터의; Reprokine 카탈로그 # RCP09056); 원숭이 LIF(효모 Kingfisher Biotech 카탈로그 # RP1074Y); HEK-293 세포에서 생산된 원숭이 LIF. 전체 h5D8은 여러 종으로부터 LIF에 대한 결합을 나타냈다. 이러한 친화성 실험의 요약은 표 4에 나타나 있다.

[표 4]

실시예 5-시험관내에서 STAT3의 LIF-유도 인산화를 억제하는 인간화 클론 5D8

h5D8의 생물학적 활성을 알아보기 위해, LIF 활성화의 세포 배양 모델에서 인간화 및 모 버전을 시험하였다. 도 2a는 신경교종 세포주를 인간 LIF와 함께 인큐베이션했을 때 인간화 클론이 STAT3 인산화(Tyr 705)의 억제 증가를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 2b는 h5D8 항체의 상이한 희석으로 반복된 도 2a의 동일한 설정의 실험을 나타낸 것이다.

방법

U251 신경교종 세포를 150,000개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 임의의 처리 전 24시간 동안 완전 배지에서 배양하였다. 그 후에, 세포를 10 μg/ml의 농도의 r5D8 항-LIF 항체 또는 h5D8 항-LIF 항체로 밤새 처리하거나 처리하지 않았다(대조 세포).

처리 후, 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 방사선-면역침전 검정(RIPA) 용해 완충액에서 단백질을 얻고, 정량화하고(BCA-단백질 검정, Thermo Fisher Scientific), 웨스턴 블롯에 사용하였다. 웨스턴 블롯의 경우, 5% 무지방 우유-TBST에서 막을 1시간 동안 블로킹하고, 일차 항체와 밤새(p-STAT3, 카탈로그 #9145, Cell Signaling 또는 STAT3, 카탈로그 #9132, Cell Signaling) 또는 30분(β-액틴-퍼옥시다제, 카탈로그 #A3854, Sigma-Aldrich) 동안 인큐베이션하였다. 막을 이후 TBST로 세척하고, 필요 시 이차 항체와 인큐베이션하고, 다시 세척하였다. 단백질을 화학 발광(SuperSignal 기질, 카탈로그 #34076, Thermo Fisher Scientific)에 의해 검출하였다.

실시예 6-U-251 세포에서 LIF의 내인성 수준에 대한 h5D8 항체 처리의 IC ₅₀ 값.

U-251 세포에서 혈청 고갈 상태 하에 h5D8의 경우 생물학적 억제에 대한 IC₅₀은 490 피코몰 만큼 낮은 것으로 결정되었다(도 3a). 도 3a 및 도 3b 및 표 5의 대표 결과를 참조하라.

[표 5]

방법

U-251 세포를 6 cm 플레이트 당(조건 당) 600,000개 세포로 시딩하였다. 세포를 혈청 고갈(0.1% FBS) 하에 37℃에서 밤새 상응하는 농도(적정)에서 h5D8로 처리하였다. pSTAT3에 대한 양성 대조로서, 재조합 LIF(R&D #7734-LF/CF)를 사용하여 37℃에서 10분 동안 1.79 nM로 세포를 자극하였다. pSTAT3의 음성 대조로서, JAK I 억제제(Calbiochem #420099)를 37℃에서 30분 동안 1uM로 사용하였다. 그 후에, 중규모 디스커버리 멀티-스폿 검정 시스템 토탈 STAT3(Meso Scale Discovery Multi-Spot Assay System Total STAT3)(Cat# K150SND-2) 및 포스포-STAT3(Tyr705)(Cat# K150SVD-2) 키트의 프로토콜에 따라 용해물에 대하여 얼음 위에서 세포를 수확하여 MSD Meso Sector S600에 의해 검출 가능한 단백질 수준을 측정하였다.

실시예 7-인간 LIF에 특이적으로 결합하는 추가 항체

인간 LIF를 특이적으로 결합하는 다른 래트 항체 클론(10G7 및 6B5)을 식별하였고, 이들의 결합 특징에 대한 요약은 하기에서 표 6에 나타나 있으며, 클론 1B2가 비교로서 사용되었다.

방법

키네틱 실시간 결합 분석을 항-LIF mAb 1B2, 10G7 및 6B5에 대하여 수행하고, CM5 광학 센서 칩의 표면 상에 고정화하여, 재조합 LIF 표적 단백질 [인간 LIF(E. 콜라이); Millipore Cat. No. LIF 1010 및 인간 LIF(HEK293 세포); ACRO Biosystems Cat. No. LIF-H521b]을 피분석물로서 적용하였다.

단일 곡선 피팅 알고리즘뿐만 아니라 글로벌(센서그램 세트의 동시 피팅)을 적용한 랭뮤어 1:1 결합 모델을 이용하여 수학적 센서그램 피팅에 의해 키네틱 상수 및 친화도를 얻었다. 글로벌 피트의 타당성을 k_obs 분석에 의해 평가하였다.

[표 6]

실시예 8-시험관내에서 STAT3의 LIF-유도 인산화를 억제하는 추가의 항 LIF 항체

추가 클론들을 세포 배양물에서 STAT3의 LIF-유도 인산화를 억제하는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 도 4에 나타나 있는 바와 같이, 클론 10G7 및 이전에 구체화된 r5D8은 1B2 클론에 비해 LIF-유도 STAT3 인산화의 억제를 높게 나타냈다. 항-LIF 다클론성 항-혈청(pos.)이 양성 대조군으로 포함되었다. 6B5는 억제를 나타내지 않았지만, 이는 이 실험에 사용된 비-당화 LIF에 결합하는 6B5의 가능한 결핍에 의해 설명될 수 있다.

방법

환자 유래 신경교종 세포를 150,000개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 임의의 처리 전 24시간 동안 B27(Life Technologies), 페니실린/스트렙토마이신 및 성장 인자(20 ng/ml의 EGF 및 20 ng/ml의 FGF-2 [PeproTech])가 보충된 Neurobasal 배지(Life Technologies)로 구성된 GBM 배지에서 세포를 배양하였다. 다음 날, 세포를 E. 콜라이에서 생산된 재조합 LIF 또는 재조합 LIF와 지시된 항체의 혼합물을 15분 동안 처리하거나 처리하지 않았다(최종 농도는 항체의 경우 10 μg/ml, 및 재조합 LIF는 20 ng/ml). 처리 후, 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 방사선-면역침전 검정(RIPA) 용해 완충액에서 단백질을 얻고, 정량화하고(BCA-단백질 검정, Thermo Fisher Scientific), 웨스턴 블롯에 사용하였다. 웨스턴 블롯의 경우, 5% 무지방 우유-TBST에서 막을 1시간 동안 블로킹하고, 일차 항체와 밤새(p-STAT3, 카탈로그 #9145, Cell Signaling) 또는 30분(β-액틴-퍼옥시다제, 카탈로그 #A3854, Sigma-Aldrich) 동안 인큐베이션하였다. 막을 이후 TBST로 세척하고, 필요 시 이차 항체와 인큐베이션하고, 다시 세척하였다. 단백질을 화학 발광(SuperSignal 기질, 카탈로그 #34076, Thermo Fisher Scientific)에 의해 검출하였다.

실시예 9-여러 종양 유형 전반에 걸쳐 고도로 과발현되는 LIF

LIF 발현의 정도를 결정하기 위해 여러 인간 종양 유형에 대하여 면역조직화학을 실시하였다. 도 5에 나타나 있는 바와 같이, LIF는 다형아교모세포종(GBM), 비소세포 폐암(NSCLC), 난소암, 결장직장암(CRC), 및 췌장 종양에서 고도 발현되었다.

실시예 10-비소세포 폐 암종의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는 인간화 클론 h5D8

생체내에서 LIF 양성 암을 억제하는 인간화 5D8 클론의 능력을 알아내기 위해, 이 항체를 비소세포 폐 암종(NSCLC)의 마우스 모델에서 시험하였다. 도 6은 비히클 음성 대조에 비해 이러한 항체로 처리된 마우스에서 종양 성장의 감소를 나타내고 있다.

방법

높은 LIF 수준을 갖는 뮤린 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주 KLN205를 생체내 생물발광 모니터링을 위해 반딧불이 루시페라제 유전자를 발현하는 렌티바이러스로 안정적으로 감염시켰다. 마우스 모델을 개발하기 위해, 5×10⁵개의 KLN205 비소세포 폐암(NSCLC) 세포를 늑간 천자에 의해 8주령된 면역적격 동계 DBA/2 마우스의 좌측 폐에 동소 이식하였다. 마우스를 대조 비히클 또는 15 mg/kg 또는 30 mg/kg의 h5D8 항체로 복막 내로 주 2회 처리하고, 종양 성장을 생물발광에 의해 모니터링하였다. 생물발광 이미징을 위해, 마우스는 1% 내지 2% 흡입된 이소플루란 마취 하에 15 mg/mL의 D-루시페린 0.2 mL를 복막내 주사로 받았다. 고감도 냉각 CCD 카메라로 구성된 IVIS 시스템 2000 시리즈(Xenogen Corp., 앨러미다, CA, USA)를 사용하여 생물발광 신호를 모니터링하였다. Living Image 소프트웨어(Xenogen Corp.)를 사용하여 이미징 데이터를 그리딩하고, 각 테두리 영역 내 전체 생물발광 신호를 통합하였다. 관심 대상의 영역(ROI)에서 전체 광자 플럭스 방출(광자/초)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 결과는 h5D8 항체로의 처리가 종양 퇴행을 촉진한다는 것을 입증해 준다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.

실시예 11-다형아교모세포종의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는 h5D8

인간 세포주 U251을 발현하는 루시페라제를 사용한 동소 GBM 종양 모델에서, r5D8은 주 2회 복막내(IP) 주사로 300 ㎍의 r5D8 및 h5D8이 투여된 마우스에서 종양 부피를 유의하게 감소시켰다. 이 연구의 결과는 도 7a에 나타나 있다(처리 후 26일째에 정량화). 이 실험을 또한 200 μg 또는 300 μg으로 처리된 인간화 h5D8 마우스를 사용하여 실시하였는데, 7일 간의 처리 후에 종양의 통계적으로 유의한 감소가 나타났다.

방법

루시페라제를 안정하게 발현하는 U251 세포를 수확하고, PBS에서 세척하고, 400 g에서 5분 동안 원심분리하고, PBS에 재현탁시키고, 자동 세포 계수기(Countess, Invitrogen)로 계수하였다. 최적의 생존력을 유지하기 위해 세포를 얼음 위에서 보관하였다. 케타민(Ketolar50®)/자일라신(

)(각각 75 mg/kg 및 10 mg/kg)의 복막내 투여로 마우스를 마취하였다. 각 마우스를 정위고정 장치에 조심스럽게 두고, 고정화하였다. 제모 크림으로 머리털을 제거하고, 두피를 메스로 잘라 두개골을 노출시켰다. 조심스럽게 람다의 측방 1.8 mm 및 전방 1 mm 좌표에 드릴로 작은 절개면을 생성시켰다. 5μL의 세포를 Hamilton 30 G 주사기를 사용하여 2.5mm 깊이로 우측 선조체에 접종하였다. 머리 절개면을 히스토아크릴 조직 접착제(Braun)로 닫고, 마우스에 피하 진통제 멜록시캄(Metacam®)(1 mg/ kg)을 주사하였다. 각 마우스에 이식된 최종 세포 수는 3 × 10⁵개였다.

마우스를 h5D8의 복막내 투여로 주 2회 처리하였다. 처리는 종양 세포 접종 직후인 0일에 개시하였다. 마우스는 총 2회 용량의 h5D8 또는 비히클 대조를 받았다.

체중 및 종양 부피: 체중을 2회/주 측정하고, 종양 성장을 7일째에 생물발광에 의해 정량화하였다(Xenogen IVIS 스펙트럼). 생체내 생물발광 활성을 정량화하기 위해, 이소플루오란을 사용하여 마우스를 마취하고, 루시페린 기질(PerkinElmer)(167 ㎍/kg)을 복막내로 주사하였다.

생물발광(Xenogen IVIS 스펙트럼)에 의해 결정하는 경우의 종양 크기를 7일째에 평가하였다. 각 처리군에 대한 개별 종양 측정 및 평균 ± SEM을 계산하였다. 통계적 유의성을 독립표본 비-모수 맨-휘트니 U-검정에 의해 결정하였다.

실시예 12-난소암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는 h5D8

r5D8의 효능을 다른 두 개의 동계 종양 모델에서 평가하였다. 난소 동소 종양 모델 ID8에서, 300 μg의 r5D8의 주 2회 IP 투여는 복부 부피로 측정하는 경우 종양 성장을 유의하게 억제하였다(도 8a 및 도 8b). 도 8c에서의 결과는 h5D8이 또한 200 μg 이상의 용량으로 종양 부피를 감소시켰다는 것을 보여준다.

방법

10% 소 태아 혈청(FBS)(Gibco, Invitrogen), 40 U/mL의 페니실린 및 40 μg/mL의 스트렙토마이신(PenStrep)(Gibco, Invitrogen) 및 0.25 μg/mL의 플라스목신(Invivogen)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM)(Gibco, Invitrogen)에서 ID8 세포를 배양하였다.

ID8 세포를 수확하고, PBS에서 세척하고, 400 g에서 5분 동안 원심분리하고, PBS에서 재현탁시켰다. 최적의 생존력을 유지하기 위해 세포를 얼음 위에서 보관하고, 200 μL의 세포 현탁액을 27 G 바늘로 복막내 주사하였다. 마우스에 이식된 최종 세포 수는 5 × 10⁶개였다.

마우스를 지시된 바와 같이 상이한 용량으로 h5D8의 ip 투여로 주 2회 처리하였다. 체중을 2회/주 측정하고, 캘리퍼(Fisher Scientific)를 사용하여 복부 둘레를 측정함으로써 종양 진행을 모니터링하였다.

실시예 13-결장직장암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는 r5D8

피하 결장 CT26 종양이 있는 마우스에서, r5D8(주 2회 300 ㎍ IP 투여)은 종양 성장을 유의하게 억제하였다(도 9a 및 도 9b).

방법

10% 소 태아 혈청(FBS), 40 U/mL의 페니실린 및 40 μg/mL의 스트렙토마이신(PenStrep) 및 0.25 μg/mL의 플라스목신이 보충된 로스웰 파크 기념 연구소(Roswell Park Memorial Institute) 배지(RPMI [Gibco, Invitrogen])에서 CT26 세포를 배양하였다.

CT26 세포(8 × 10⁵개)를 트립신화하고, PBS로 헹구고, 400 g에서 5분 동안 원심분리하고, 100 μL의 PBS에서 재현탁시켰다. 세포 사멸을 방지하기 위해 세포를 얼음 위에서 보관하였다. CT26 세포를 27 G 바늘을 이용하여 피하 주사를 통해 마우스에게 투여하였다.

300 ㎍의 r5D8, 또는 비히클 대조를 CT26 세포 이식 후 3일째부터 주 2회 복막내 주사(IP)를 통해 마우스에 투여하였다.

체중 및 종양 부피를 주 3회 측정하였다. 종양 부피를 캘리퍼(Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다.

실시예 14-종양 모델에서 염증성 침윤을 감소시키는 r5D8

U251 GBM 동소 모델에서, M2 분극화된 대식세포 마커인 CCL22의 발현은 도 10a에 나타나 있는 바와 같이 r5D8로 처리된 종양에서 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 또한 r5D8을 사용한 생리학적 관련 기관형 조직 슬라이스 배양 모델에서 확인되었는데, 여기서 도 10b에 나타나 있는 바와 같이 처리 후 3명의 환자 샘플이 CCL22 및 CD206(MRC1) 발현(또한 M2 대식세포의 마커)의 유의한 감소를 나타냈다(MRC1과 CCL22 둘 모두에 대하여, 상단의 대조와 하단의 처리 비교). 또한, r5D8은 또한 면역적격 마우스에서 동계 ID8(도 10c) 및 CT26(도 10d) 종양에서 CCL22⁺ M2 대식세포를 감소시켰다.

실시예 15-비-골수 이펙터 세포를 증가시키는 r5D8

추가 면역 기전을 조사하기 위해, 종양 미세환경 내에서 T 세포 및 다른 비-골수 면역 이펙터 세포에 대한 r5D8의 효과를 평가하였다. 난소 동소 ID8 동계 모델에서, r5D8 처리는 도 11a에 나타나 있는 바와 같이 종양내 NK 세포의 증가와 전체 및 활성화된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 증가를 야기하였다. 유사하게, 결장 동계 CT26 종양 모델에서, r5D8은, 도 11b에 나타나 있는 바와 같이, 종양내 NK 세포를 증가시키고, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 증가시키고, CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-reg 세포를 감소시키는 경향이 있었다. CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-reg 세포의 감소 경향은 또한 도 11c에 나타나 바와 같이 r5D8 처리 후 동계 동소 KLN205 종양 모델에서도 관찰되었다. 효능을 매개하기 위한 T 세포의 요건과 일관되게, CT26 모델에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 고갈은 도 12에 나타나 있는 바와 같이 r5D8의 항-종양 효능을 억제하였다.

T 세포 고갈을 위한 방법

10% 소 태아 혈청(FBS [Gibco, Invitrogen]), 40 U/mL의 페니실린 및 40 μg/mL의 스트렙토마이신(PenStrep [Gibco, Invitrogen]) 및 0.25 μg/mL의 플라즈목신(Invivogen)이 보충된 RPMI 배양 배지(Gibco, Invitrogen)에 CT26 세포를 배양하였다. CT26 세포(5 × 10⁵개)를 수집하고, PBS로 헹구고, 400 g에서 5분 동안 원심분리하고, 100 μL의 PBS에서 재현탁시켰다. 세포 사멸을 방지하기 위해 세포를 얼음 위에서 보관하였다. CT26 세포를 27 G 주사기를 이용하여 피하 주사를 통해 마우스의 양옆구리에 투여하였다. 마우스를 연구 설계에 지시된 바와 같이 r5D8의 복막내 투여로 주 2회 처리하였다. 비히클 대조(PBS), 래트 r5D8, 및/또는 항-CD4 및 항-CD8을 연구 설계에 명시된 바와 같이 복막내 주사(IP)를 통해 주 2회 마우스에게 투여하였다. 모든 항체 치료제를 동시에 투여하였다.

실시예 16-인간 LIF와의 복합체에서 h5D8의 결정 구조

h5D8이 결합된 LIF 상의 에피토프를 알아보기 위해 그리고 결합에 참여하는 h5D8의 잔기를 알아보기 위해, h5D8의 결정 구조를 3.1 옹스트롬의 분해능으로 분해하였다. 공-결정 구조는 LIF의 N-말단 루프가 h5D8의 경쇄와 중쇄 가변 영역 사이의 중앙에 위치한다는 것을 보여주었다(도 13a). 또한, h5D8은 LIF의 헬릭스 A 및 C 상의 잔기와 상호작용하고, 이에 의해 비연속 및 입체형태 에피토프를 형성시켰다. 결합은 여러 염-다리, H-결합 및 반 데르 발스 상호작용에 의해 유도되었다(표 7, 도 13b). LIF의 h5D8 에피토프는 gp130과의 상호작용 영역에 걸쳐 있었다. 문헌[Boulanger, M.J., Bankovich, A.J., Kortemme, T., Baker, D. & Garcia, K.C. Convergent mechanisms for recognition of divergent cytokines by the shared signaling receptor gp130. Molecular cell 12, 577-589 (2003)]을 참조하라. 결과는 하기에서 표 7에 요약되어 있고, 도 13에 도시되어 있다.

[표 7]

방법

LIF를 HEK 293S(Gnt I^-/-) 세포에서 일시적으로 발현하고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피, 그리고 이어서 20 mM 트리스 pH 8.0 및 150 mM NaCl에서 겔-여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 재조합 h5D8 Fab를 HEK 293F 세포에서 일시적으로 발현하고, KappaSelect 친화성 크로마토그래피, 그리고 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 h5D8 Fab 및 LIF를 1:2.5 몰비로 혼합하고, EndoH를 사용하여 탈당화 전 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 겔-여과 크로마토그래피를 사용하여 복합체를 정제하였다. 복합체를 20 mg/mL로 농축시키고, 희소 매트릭스 스크린(sparse matrix screen)을 사용하여 결정화 시험을 위해 설정하였다. 결정은 19%(v/v)의 이소프로판올, 19 %(w/v)의 PEG 4000, 5 %(v/v)의 글리세롤, 0.095 M 소듐 시트레이트 pH 5.6을 함유하는 조건에서 4℃에서 형성되었다. 결정은 커네디언 라이트 소스(Canadian Light Source: CLS)의 08ID-1 빔라인에서 3.1 Å의 분해능으로 회절되었다. 데이터를 문헌[Kabsch et al. Xds. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 125-132 (2010)]에 따라 XDS를 사용하여 수집하고, 프로세싱하고, 스케일링하였다. 구조를 문헌[McCoy et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr 40, 658-674 (2007)]에 따라 페이저(Phaser)를 사용하여 분자 치환에 의해 결정하였다. 구조가 허용되는 R_work 및 R_free로 수렴될 때까지 Coot 및 phenix.refine을 사용하여 모델 구축 및 정교화의 여러 반복을 수행하였다. 각각 문헌[Emsley et al. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 486-501 (2010)]; 및 문헌[Adams, et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 213-221 (2010)]을 참조하라. 도면을 PyMOL(PyMOL 분자 그래픽스 시스템, 버전 2.0 슈뢰딩거, LLC)에서 생성시켰다.

실시예 17-LIF에 높은 특이성을 갖는 h5D8

목적은 결합 특이성을 알아보기 위해 다른 LIF 패밀리 구성원에 대한 h5D8의 결합을 시험하는 것이었다. Octet96 분석을 이용하는 경우, 인간 LIF에 대한 h5D8 결합은 두 단백질 모두가 E. 콜라이에서 생산될 때 LIF의 최고 상동성 IL-6 패밀리 구성원 온코스타틴 M(OSM)에 대한 결합보다 대략 100배 더 컸다. 두 단백질 모두가 포유류계에서 생산될 때, h5D8은 OSM에 대한 결합을 나타내지 않았다. 데이터는 표 8에 요약되어 있다.

[표 8]

방법

Octet 결합 실험: 시약을 제조업체의 제공 메뉴얼에 따라 사용하고 제조하였다. 다음과 같이 Octet 데이터 획득 소프트웨어 버전 9.0.0.26을 이용하여 염기성 키네틱 실험을 수행하였다: 센서/프로그램의 설정: i) 평형(60초); ii) 로딩(15초); iii) 베이스라인(60초); iv) 회합(180초); v) 해리(600초).

시토카인에 대한 h5D8의 Octet 친화도: 다음과 같이 Octet 데이터 획득 소프트웨어 버전 9.0.0.26을 이용하여 염기성 키네틱 실험을 수행하였다: 아민 반응성 2 세대 바이오센서(AR2G)를 물에서 최소 15분 동안 수화하였다. 바이오센서에 대한 h5D8의 아민 접합을 아민 커플링 2 세대 키트를 사용하여 ForteBio Technical Note 26(참고문헌 참조)에 따라 수행하였다. 침지 단계는 다음과 같이 30℃, 1000 rpm에서 수행하였다: i) 수중 60초 평형; ii) 수중 20 mM ECD, 10 mM 설포-NHS에서 300초 활성화; iii) 10 mM 소듐 아세테이트, pH 6.0에서 10 μg/ml h5D8의 600초 고정화; iv) 1 M 에탄올아민, pH 8.5에서 300초 켄칭; v) 수중 120초 베이스라인. 그 후에, 30℃, 1000 rpm에서 다음 침지 및 판독 단계로 키네틱 실험을 수행하였다: vi) 1 X 키네틱 완충액에서 60초 베이스라인; vii) 1 X 키네틱 완충액에서 시토카인의 적절한 연속 희석의 180초 회합; viii) 1X 키네틱 완충액에서 300초 해리; ix) 각각 10 mM 글리신 pH 2.0과 1 X 키네틱 완충액 간의 교대로 3회 재생성/중화 사이클(각각에서 3회 사이클 동안 5초). 재생성 후, 바이오센서를 후속 결합 분석에 재사용하였다.

포유류 세포로부터 생산된 인간 재조합 LIF는 ACROBiosystems(LIF-H521b)로부터이고; 포유류 세포에서 생산된 인간 재조합 OSM은 R & D(8475-OM/CF)로부터이고; E. 콜라이 세포에서 생산된 인간 재조합 OSM은 R & D(295-OM-050/CF)로부터였다.

실시예 18-h5D8 fab의 결정 구조

넓은 스펙트럼의 화학적 조건 하에서 h5D8 Fab의 다섯 가지 결정 구조를 알아보았다. 이러한 구조들의 고분해능은 CDR 잔기의 입체형태가 소수 가요성과 연관되며, 상이한 화학적 환경에서 매우 유사하다는 것을 지시했다. 이러한 항체의 독특한 특징은 가변 중쇄 영역의 위치 100에서 비-표준 시스테인의 존재였다. 구조 분석은 시스테인이 짝을 이루지 않고 용매에 대체로 접근 가능하지 않다는 것을 나타냈다.

H5D8 Fab를 이의 IgG 파파인 분해에 의해 얻고, 이어서 표준 친화성, 이온 교환 및 크기 크로마토그래피 기법을 이용하여 정제하였다. 증기 확산법을 이용하여 결정을 얻었고, 1.65 Å 내지 2.0 Å 범위 분해능으로 다섯 가지 결정 구조를 알아내는 것이 가능했다. 모든 구조는, 5.6, 6.0, 6.5, 7.5 및 8.5의 다섯 개의 상이한 pH 수준에 걸친 범위의 결정화 조건에도 불구하고, 동일한 결정학적 공간 그룹에서 유사한 단위 셀 치수(P212121, a~53.8 Å, b~66.5 Å, c~143.3 Å)로 분해되었다. 이로써, 이러한 결정 구조들은 결정 패킹 인공물에 의해 방해받지 않고 넓은 스펙트럼의 화학적 조건에 걸쳐 h5D8 Fab의 3-차원 배치의 비교를 가능하게 하였다.

이후에 모델링된 모든 상보성 결정 영역(CDR) 잔기에 대해 전자 밀도를 관찰하고, 이들을 이후에 모델링하였다. 특히, LCDR1 및 HCDR2는 얕은 LCDR3 및 HCDR3 영역과 함께 파라토프의 중앙에 결합 홈을 형성하는 확장된 입체형태를 채택하였다(도 14a). 다섯 가지 구조는 모든 잔기에 걸쳐 매우 유사했으며, 전원자 평균 제곱근 편차는 0.197 Å 내지 0.327 Å의 범위였다(도 14a). 이러한 결과는 CDR 잔기의 입체형태가 5.6 내지 8.5 범위의 pH 수준 및 150 mM 내지 1 M 범위의 이온 강도를 포함하여 다양한 화학적 환경에서 유지되었다는 것을 지시했다. h5D8 파라토프의 정전 표면의 분석은 양으로 및 음으로 하전된 영역이 우세한 소수성 패치 없이 친수성 성질에 동등하게 기여했다는 것을 보여주었다. h5D8은 HCDR3의 염기(Cys100)에서 비-표준 시스테인의 드문 특징을 갖는다. 다섯 가지 구조 모두에서, 이러한 자유 시스테인은 정렬되어 있었고, 임의의 이황화 스크램블을 형성하지 않았다. 추가로, 이는 Cys(시스테인화) 또는 글루타티온(글루타티온화)의 첨가에 의해 변형되지 않으며, 중쇄의 Leu4, Phe27, Trp33, Met34, Glu102 및 Leu105의 주쇄 및 측쇄 원자와 반 데르 발스 상호작용(3.5 Å 내지 4.3 Å의 거리)을 일으켰다(도 14b). 마지막으로, Cys100은 CDR1 및 HCDR3의 입체형태를 매개하는 데 관여하는 것으로 보이는 우세하게 매립된 구조적 잔기였다. 따라서, 다섯 가지 결정 구조에서 이러한 영역의 균일한 배치에 의해 관찰되는 바와 같이, 다른 시스테인과 반응성을 가질 가능성은 낮다.

방법

H5D8-1 IgG를 Catalent Biologics로부터 입수하고, pH 6.0에서 25 mM 히스티딘, 6% 수크로스, 0.01% 폴리소르베이트 80에서 제형화시켰다. 제형화된 IgG를 10K MWCO 농축기(Millipore)를 사용하여 PBS로 광범위하게 완충액-교환한 후, PBS, 1.25 mM EDTA, 10 mM 시스테인 중에 37℃에서 1시간 동안 1:100 마이크로그램 파파인(Sigma)으로 분해하였다. 파파인-분해된 IgG를 AKTA Start 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)을 통해 유동시켰다. h5D8 Fab를 함유한 단백질 A 유동물을 회수하고, 10 K MWCO 농축기(Millipore)를 사용하여 20 mM 소듐 아세테이트, pH 5.6으로 완충액-교환하였다. 얻어진 샘플을 AKTA Pure 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 Mono S 양이온 교환 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 1 M 염화칼륨 구배로의 용리에 의해 우세한 h5D8 Fab 피크가 생성되었고, 이를 회수하고, 농축시키고, pH 8.0에서 20 mM 트리스-HCl, 150 mM 염화나트륨에서 Superdex 200 증가 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기 동질성으로 정제하였다. 고순도의 h5D8 Fab가 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 확인되었다.

정제된 h5D8 Fab를 10K MWCO 농축기(Millipore)를 사용하여 25 mg/mL로 농축시켰다. Oryx 4 디스펜서(Douglas Instruments)를 사용하여 20℃에서 희소 매트릭스 96-조건 상업적 스크린 JCSG TOP96(Rigaku Reagents) 및 MCSG-1(Anatrace)로 증기 확산 결정화 실험을 설정하였다. 결정을 얻고, 다음 5개의 결정화 조건에서 4 일 후에 수확하였다: 1) 0.085 M 소듐 시트레이트, 25.5%(w/v) PEG 4000, 0.17 M 암모늄 아세테이트, 15%(v/v) 글리세롤, pH 5.6; 2) 0.1 M MES, 20%(w/v) PEG 6000, 1 M 염화리튬, pH 6.0; 3) 0.1 M MES, 20%(w/v) PEG 4000, 0.6 M 염화나트륨, pH 6.5; 4) 0.085 M 소듐 HEPES, 17%(w/v) PEG 4000, 8.5%(v/v) 2-프로판올, 15%(v/v) 글리세롤, pH 7.5; 및 5) 0.08 M 트리스, 24%(w/v) PEG 4000, 0.16 M 염화마그네슘, 20%(v/v) 글리세롤, pH 8.5. 액체 질소에서 급속-동결하기 전에, 결정을 함유하는 모액에 5% 내지 15%(v/v) 글리세롤 또는 10%(v/v) 에틸렌 글리콜을 필요에 따라 보충하였다. 결정을 Advanced Photon Source, 빔라인 23-ID-D(시카고, IL)에서 X-선 싱크로트론 방사선에 주어지게 하고, 회절 패턴을 Pilatus3 6M 검출기에서 기록하였다. 데이터 XDS를 사용하여 프로세싱하고, 구조를 페이저를 사용하여 분자 치환에 의해 결정하였다. Coot의 반복적 모델 구축으로 PHENIX에서 정제를 수행하였다. 도면은 PyMOL에 의해 생성시켰다. 모든 소프트웨어는 SBGrid를 통해 접근하였다.

실시예 19-결합을 보존하는 h5D8의 시스테인 100에서의 돌연변이

h5D8의 분석은 중쇄의 가변 영역에서 위치 100에 자유 시스테인 잔기(C100)를 보여주었다. 인간 및 마우스 LIF에 대한 결합 및 친화성을 특징으로 하기 위해 C100을 각각의 자연 발생 아미노산으로 치환함으로써 H5D8 변이체를 생성시켰다. ELISA 및 Octet 검정을 이용하여 결합을 특징으로 하였다. 결과는 표 9에 요약되어 있다. ELISA EC50 곡선은 도 15(도 15a 인간 LIF 및 도 15b 마우스 LIF)에 나타나 있다.

[표 9]

방법

ELISA: 인간 및 마우스 LIF에 대한 h5D8 C100 변이체의 결합을 ELISA에 의해 알아보았다. 재조합 인간 또는 마우스 LIF 단백질을 4℃에서 밤새 1 ug/mL로 Maxisorp 384-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 1x 블로킹 완충액으로 블로킹하였다. 각 h5D8 C100 변이체의 적정제를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 결합되게 하였다. 플레이트를 PBS+0.05% 트윈-20으로 3회 세척하였다. HRP-접합 항-인간 IgG를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 결합되게 하였다. 플레이트를 PBS+0.05% 트윈-20으로 3회 세척하고, 1x TMB 기질을 이용하여 현상하였다. 반응을 1 M HCl로 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Graphpad Prism을 사용하여 도면 생성 및 비-선형 회귀 분석을 수행했다.

Octet RED96: 인간 및 마우스 LIF에 대한 h5D8 C100 변이체의 친화성을 Octet RED96 시스템을 사용하여 BLI에 의해 알아보았다. h5D8 C100 변이체를 1x 키네틱 완충액에서 30초 베이스라인 후 7.5 μg/mL로 항-인간 Fc 바이오센서 상에 로딩하였다. 인간 또는 마우스 LIF 단백질의 적정제를 90초 동안 로딩된 바이오센서에 회합시키고, 300초 동안 1x 키네틱 완충액에서 해리되게 하였다. 1:1 글로벌 피트 모델을 이용하여 데이터 분석 소프트웨어에 의해 K_D를 계산하였다.

실시예 20-시험관내에서 gp130에 대한 LIF의 결합을 차단하는 h5D8

h5D8이 LIF의 LIFR에 대한 결합을 막았는지의 여부를 알아보기 위해, Octet RED 96 플랫폼을 이용한 분자 결합 분석을 수행하였다. 항-인간 Fc 포획에 의해 AHC 바이오센서 상에 H5D8을 로딩하였다. 그 후에, 바이오센서를 LIF에 침지하였고, 예상된 바와 같이, 회합이 관찰되었다(도 16a, 중앙 세 번째). 후속적으로, 바이오센서를 상이한 농도의 LIFR에 침지시켰다. 용량-의존적 회합이 관찰되었다(도 16a, 우측 세 번째). 대조 실험은 이러한 회합이 h5D8과 또는 바이오센서와 LIFR의 비-특이적 상호작용 때문이 아니라 LIF-특이적(도시되지 않음)었다는 것을 보여주었다.

h5D8과 LIF의 결합을 추가로 특징으로 하기 위해, 일련의 ELISA 결합 실험을 실시하였다. H5D8과 LIF를 예비-인큐베이션한 후, 재조합 인간 LIFR(hLIFR) 또는 gp130로 코팅된 플레이트에 도입하였다. h5D8/LIF 복합체와 코팅된 기질 간의 결합 결여는 h5D8이 어떠한 방식으로든 수용체에 대한 LIF의 결합을 방해했다는 것을 지시한다. 추가로, LIF를 결합하지 않았거나(이소형 대조, (-)로 표시) 인지한 결합 부위에서 LIF를 결합한 대조 항체(B09는 LIF 결합에 대해 gp130 또는 LIFR과 경쟁하지 않고; r5D8은 h5D8의 래트 모 버전임)를 또한 사용하였다. ELISA 결과는 h5D8/LIF 복합체가 hLIFR(r5D8/LIF 복합체와 마찬가지로)을 결합할 수 있었다는 것을 보여주었는데, 이는 이러한 항체들이 LIF/LIFR 회합을 막지 않았다는 것을 지시한다(도 16a). 대조적으로, h5D8/LIF 복합체(및 r5D8/LIF 복합체)는 재조합 인간 gp130을 결합할 수 없었다(도 16b). 이는 LIF가 h5D8에 결합될 때 LIF의 gp130 결합 부위가 영향을 받았다는 것을 지시한다.

실시예 21-인간 조직에서의 LIF 및 LIFR 발현

LIF 및 LIFR의 발현 수준을 알아보기 위해 다수의 상이한 유형의 인간 조직에서 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 도 17a 및 도 17b에 나타나 있는 평균 발현 수준은 전체 RNA 100 ng 당 사본수로 주어진다. 대부분의 조직은 전체 RNA 100 ng 당 적어도 100개의 사본을 발현하였다. LIF mRNA 발현은 인간 지방 조직(장간막-회장 [1]), 혈관 조직(맥락막-총 [6] 및 장간막 [8]) 및 탯줄 [68] 조직에서 가장 높았고; 뇌 조직(피질 [20] 및 흑질 [28])에서 가장 낮았다. LIFR mRNA 발현은 인간 지방 조직(장간막 회장 [1]), 혈관 조직(폐 [9]), 뇌 조직 [11-28] 및 갑상선 [66] 조직에서 가장 높았고; PBMC [31]에서 가장 낮았다. 시노몰구스 조직에서 LIF 및 LIFR mRNA 발현 수준은 인간 조직에서 관찰된 것들과 유사했고, 여기서 LIF 발현은 지방 조직에서 높고, LIFR 발현은 지방 조직에서 높고 PBMC에서 낮았다(데이터 도시되지 않음).

도 17a 및 도 17b에 대한 조직 넘버링은 다음과 같다: 1 - 지방(장간막-회장); 2 - 부신; 3 - 방광; 4 - 방광(삼각부); 5 - 혈관(대뇌: 중-대뇌-동맥); 6 - 혈관(맥락막-총); 7 - 혈관(관상 동맥); 8 - 혈관(장간막(결장)); 9 - 혈관(폐); 10 - 혈관(신장); 11 - 뇌(편도); 12 - 뇌(미상); 13 - 뇌(소뇌); 14 - 뇌(피질: 대상회-전방); 15 - 뇌(피질: 대상회-후방); 16 - 뇌(피질: 전두-외측); 17 - 뇌(피질: 전두-내측); 18 - 뇌(피질: 후두); 19 - 뇌(피질: 두정); 20 - 뇌(피질: 측두); 21 - 뇌(등-솔기-핵); 22 - 뇌(해마); 23 - 뇌(시상하부: 전두); 24 - 뇌(시상하부: 후두); 25 - 뇌(청반); 26 - 뇌(연수); 27 - 뇌(중격핵); 28 - 뇌(흑질); 29 - 유방; 30 - 맹장; 31- 말초 혈액 단핵 세포(PBMC); 32 - 결장; 33 - 배근 신경절(DRG); 34 - 십이지장; 35 - 나팔관; 36 - 쓸개; 37 - 심장(좌심방); 38 - 심장(좌심실); 39 - 회장; 40 - 공장; 41 - 신장(피질); 42 - 신장(연수); 43 - 신장(골반); 44 - 간(실질); 45 - 간(기관지: 1차); 46 - 간(기관지: 3 차); 47 - 폐(실질); 48 - 림프선(편도); 49 - 근육(골격); 50 - 식도; 51 - 난소; 52 - 췌장; 53 - 솔방울샘; 54 - 뇌하수체; 55 - 태반; 56 - 전립선; 57 - 직장; 58 - 피부(포피); 69 - 척수; 60 - 비장(실질); 61 - 위(공동); 62 - 위(몸통); 63 - 위(기저부); 64 - 위(유문관); 65 - 고환; 66 - 갑상선; 67 - 기관; 68 - 탯줄; 69 - 요관; 70 - 자궁(자궁경부); 71 - 자궁(자궁근층); 및 72 - 수정관.

실시예 22-용량 선택, 용량 증분 및 정량 투여

항-LIF 항체 용량 선택, 용량 증분 및 정량 투여가 후술된다. 마우스 및 시노몰구스 원숭이를 h5D8의 안전성 평가를 위해 사용하였다.

최대 100 mg/kg으로 매주 IV 투여를 받은 마우스 및 원숭이의 4-주 GLP 독성 연구에서 치료-관련 부작용은 관찰되지 않았다. 따라서, 최고 비-중증 독성 용량(HNSTD)은 > 100 mg/kg이고, 연구 조건 하에 두 종 모두에서 무관찰 부작용 수준(no-observed-adverse-effect-level: NOAEL)이 100 mg/kg IV로 확립되었다. 인간 등가 용량(HED)을 확립하도록 투여량을 조정하였다. HED 추정을 위해 체표면적(BSA)-기반 조정 접근법을 채택하였다. 이러한 GLP 독성 연구를 기초로 할 때, 최대 권장 시작 용량(MRSD)은 하기 나타나 있는 바와 같이 추정되었다:

● 10-배 안전 계수로 마우스 NOAEL로부터 0.81 mg/kg IV HED

● 마우스에서 1/10 중증 독성 용량을 기준으로 10 mg/kg IV 초과

● 10-배 안전 계수로 시노몰구스 원숭이 NOAEL로부터 3.2 mg/kg IV HED

● 1/6 HNSTD 기준으로 16.7 mg/kg IV 초과

독성 연구를 기초로 하고 1 상 연구에서 진행성 암 환자 집단에 대하여 보수적인 접근법을 취할 때, 1 mg/kg(또는 75 mg 정량 용량) IV의 MRSD가 데이터에 의해 뒷받침되었다.

약리학적 활성 용량(PAD)이 또한 MRSD 설정에서 고려되었다. 현재까지 이용 가능한 마우스 약리학 모델의 약리학, PK 및 LIF 안정화 데이터를 기초로 할 때, 다음 접근법을 이용하여 PAD를 추정하였다. U251 마우스 이종이식 모델의 용량-반응을 기초로 할 때, 최적의 유효 용량은 주 2회 약 300 μg IP인 것으로 여겨졌고; 이러한 용량 수준은 약 230 μg/mL의 마지막 용량 이전의 최저 혈청 수준과 관련이 있었다. 이 모델에서 이러한 300 μg 용량으로 혈청 LIF 수준의 최대 안정화가 달성되었다는 증거가 있었는데, 이는 또한 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg 용량에서 마우스 GLP 독성 연구의 혈청 LIF 안정화 데이터에 의해 뒷받침되었다. 원숭이 PK 데이터에 적합하고 인간에 맞게 조정된 2-구획 모델을 기초로 한 PK 모델을 이용하는 경우, 3주마다 1500 mg의 임상 용량이 약 500 μg/mL의 C_최저를 제공할 것이다. 유사하게, 이러한 U251 마우스 이종이식 모델에서 주 2회 20 ㎍의 최소 유효 용량은 약 20 ㎍/mL의 최종 용량 이전의 최저 혈청 수준과 관련이 있었고; 이러한 20 μg 용량에서 최대 혈청 LIF 안정화의 단지 약 50%만이 달성되었다는 증거가 있었으며, 이는 마우스 PK-내성 연구에서 0.5 mg/kg IV의 용량에서 최소 LIF 안정화의 증거에 의해 뒷받침되었다. 3주마다 75 mg의 임상 용량은 약 25 μg/mL의 C_최저를 제공할 것이다. 마우스 동계 모델에서 이용 가능한 추가 PK-PD(LIF 안정화) 데이터는 U251 마우스 이종이식 모델로부터 도출된 PAD를 뒷받침하였다.

따라서, 75 mg i.v.의 시작 용량은 마우스 및 원숭이의 독성 데이터와 마우스 이종 이식 모델의 최소 유효 용량 둘 모두를 기초로 할 때 적절한 것으로 여겨졌다. 독성학 데이터에 의해 1500 mg 내지 2000 mg의 최대 임상 용량이 뒷받침되었다. 시험-물품 관련 부작용 결과의 부재와 연관하여, 동물 모델에서 선형 PK의 관찰을 기초로 정량-투여 접근법은 적절했다.

실시예 23-상이한 암에서의 LIF 발현

암 유형에 관계없이 LIF 수준을 기초로 치료를 설정하는 것은 상이한 암 유형에서 LIF 발현의 이질성이 있는 경우 실현 가능한 방법일 것이다. 도 18은 그러한 특정 암이 더 높은 빈도의 높은 LIF mRNA 수준을 갖는다는 것을 나타낸다. 심지어 비교적 높은 빈도의 저-LIF 발현을 갖는 암은 항-LIF 치료로부터 유리할 개체의 서브세트를 가졌다.

방법

RNA 시퀀싱 데이터는 22개 적응증에 걸쳐 7,769개 샘플에 대하여 암 게놈 아틀라스 저장소로부터 입수하였다. LIF 전사물 발현은 모든 샘플에 걸쳐 계산된 LIF 발현의 최상위, 상위 중간, 하위 중간 및 최하 사분위수를 기초로 고, 중-고, 중-저, 및 저로 임계 값 지정되었다.

실시예 24-상이한 암에서 T 조절성 케모카인과 상관관계가 있는 LIF 발현

앞서 언급된 바와 같이, LIF 억제는 마우스 및 인간 생체외 모델(도 10a 내지 도 10d)에서 면역억제성 대식세포 집단(예를 들어, M2 대식세포)을 감소시키고, NSCLC(도 11c) 및 침윤의 마우스 모델에서 조절성 CD4+ T 세포를 감소시키는 효과를 갖는다. 따라서, 고수준의 LIF와 T 조절성 케모카인 둘 모두를 갖거나 골수 세포 또는 M2 대식세포에 의해 분비된 암은 항-LIF 치료에 반응할 가능성이 높은 개체의 서브세트를 정할 수 있다. T 조절성 세포는 면역 억제성 CD4+ 세포이고, 친염증 환경을 뒷받침하는 M1 대식세포와 대조적으로, M2 대식세포는 조직에서 항-염증성 면역억제 환경을 뒷받침하는 대식세포이다. 도 19a 내지 도 19d는 상이한 T 조절성 케모카인 CCL7(도 19a), CCL2(도 19b), CCL3(도 19a), 및 CCL22(도 19a)의 LIF mRNA 및 mRNA의 발현에 대한 상관관계를 나타낸 것이다. 마찬가지로, 도 20a는 M2 대식세포 징후를 정하는 mRNA와 mRNA의 발현에 대한 상관관계를 나타낸 것이다. 이들은 면역 억제성 징후가 존재하는 경우(예를 들어, M2 마커, T 조절성 케모카인, 또는 T 조절성 세포의 발현에 기초하여) 항-LIF 치료용 항체에 대한 잠재적인 반응자로서 LIF 발현이 있는 개체의 집단(심지어 저 또는 중-저 LIF인 개체의 경우에도)을 세분화하는 기준을 제공한다.

LIF와 CCL2, CD163 및 CD206 간에 유의한 긍정적인 상관관계가 둘 모두 인간 GBM 및 난소암의 TCGA 데이터세트의 분석에서 보였다(도 20b). LIF와 CXCL9 간에는 상관관계가 관찰되지 않았지만(데이터 도시되지 않음), 종양 전반에 걸쳐 비교적 낮은 수준의 CXCL9 mRNA가 관찰되었다. 이러한 결과들은 20명의 GBM 환자 코호트를 분석하고 종양의 LIF, CXCL9, CCL2, CD163 및 CD206 IHC를 수행함으로써 단백질 수준에서 검증되었다. LIF와 CCL2, CD163 및 CD206 간에 강력한 긍정적인 상관관계가 관찰되었다(도 20c). CXCL9는 단리된 세포 집락에서 발현되었는데, 이는 종양에 존재하는 저수준의 CXCL9 mRNA를 설명해 준다. 특히, CXCL9는 인간 GBM에서 LIF와 역 상관관계를 나타냈다(도 20c).

CXCL9 및 CCL2는 CD8⁺ T 세포 종양 침윤, 및 TAM 및 Treg의 동원에 각각 중요한 케모카인으로 두드러졌다. TAM(CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^-)에서 LIF의 중화에 의한 CXCL9 및 CCL2 조절이 확인되었다(도 20d). TAM의 면역염색 및 단리는 CXCL9, CCL2, CD206 및 CD163이 주로 TAM에서 발현되고(도 20e), 항-LIF(h5D8)로의 처리가 이들의 발현을 조절했다(도 20d, 도 20e)는 것을 나타냈다. CXCR3(CXCL9 수용체), CCR2(CCL2 수용체) 및 LIFR은 TAM 및 CD8⁺ T 세포에서 발현되었다(도 20f).

CXCL9 및 CCL2 녹아웃(CXCL9^-/-, CCL2^-/-) 마우스 모델을 사용하여 LIF 종양원성 기능에서 CXCL9 및 CCL2의 조절 관련성에 대하여 시험하였다. 이러한 마우스 모델들에서 종양을 CXCL9 및 CCL2에 대항하는 차단 항체로 처리하였다. 흥미롭게도, LIF의 억제에 대한 항-종양 반응은 CCL2^-/- 마우스에서가 아니라 CXCL9^-/- 마우스에서 둔화되었다(도 20g). 유사하게, CCL2 항체가 아니라 CXCL9 중화 항체는 항-LIF(h5D8)에 대한 항-암 반응을 저해하였다(도 20g). 이러한 결과들은 항-LIF(h5D8) 반응의 주요 매개자가 CXCL9였다는 것을 지시하였다. 예상된 바와 같이, CXCL9의 차단은 항-LIF(h5D8)에 반응하여 CD8⁺ T 세포 종양 침윤을 감소시켰다(도 20h).

LIF가 실제 암 환자로부터의 종양에서 CXCL9의 억제를 통해 면역 세포 종양 침윤을 조절하는지 확인하기 위해, 환자로부터 갓 얻은 GBM 시편으로부터 기관형 조직 배양물을 생성시켰다. 이러한 기관형 모델은 환자 종양의 조직 구조와 기질(면역 세포 포함)을 유지하는 종양의 슬라이스의 단기 배양을 가능하게 한다. 3명의 환자로부터의 기관형 조직 배양물의 종양 세포는 고수준의 LIF를 발현하였다(도 20i). 3개의 배양물 모두에서, Iba1 마커에 의해 검출된 바와 같이 TAM의 큰 침윤이 존재했고, 대부분의 TAM은 CCL2, CD163 및 CD206을 발현하였다. 흥미롭게도, LIF에 대항하는 중화 항체로의 3-일 기관형 배양물 처리는 CCL2, CD163 및 CD206의 감소 및 CXCL9 발현의 증가를 촉진하였다(도 20i).

항-LIF(h5D8) 처리 인간 대식세포에서의 상기 관찰과 유사하게, 항-LIF(h5D8) 처리는 CT26 종양에서 M2 마커 CD206 및 CD163의 하향-조절을 유도한 것으로 관찰되었다(도 20j). 대조적으로, 항-LIF(h5D8) 처리는 CXCL9, CXCL10, 및 PD-L1을 포함하여 면역-자극성 M1 마커의 발현 증가를 유도하였다(도 20j). 이러한 결과들은 추가로 또한 항-LIF(h5D8) 처리 MC38 종양에서 TAM 표현형을 검사함으로써 확장되었다. 처리된 종양은 전체 골수성 또는 TAM 집단의 전체 빈도에 차이를 나타내지 않은 것으로 관찰된 반면, 항-LIF(h5D8) 처리는 MHCII를 발현하는 TAM의 비율과 MHCII의 전체 발현 수준 둘 모두의 증가를 유도하였다(도 20k). MC38 TAM이 CT26 모델에서 M2 대식세포를 표현형화하는 데 사용된 주요 마커인 CD206을 발현하지 않았기 때문에 CT26 및 MC38 모델에 걸쳐 M1/M2 왜곡의 병렬 비교는 가능하지 않았다. 종합하면, 이러한 데이터들은 항-LIF 처리가 두 개의 독립적인 전임상 종양 모델에서 종양 성장을 억제한다는 것을 입증해 준다. 이 분석은 항-LIF 처리가 TAM 표현형에 영향을 미쳤지만, TAM 또는 전체 골수 세포의 총 개수에는 영향을 미치지 않았다는 것을 입증해 주는데, 이는 관찰된 효능이 항-종양 면역에 유리한 TAM의 재프로그래밍을 통해 어느 정도 개연성 있게 발생한다는 것을 시사한다.

방법

RNA 시퀀싱 데이터는 암 게놈 아틀라스 저장소로부터 입수하였다. LIF 발현과 다양한 T 조절성 세포 케모카인(CCL7, CCL2, CCL3 및 CCL22) 사이의 연관성을 방광암, 뇌암, 유방암, 결장암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 자궁암 샘플에 대한 피어슨 상관관계를 기초로 계산하였다. LIF 발현과 M2 대식세포를 나타내는 전사 징후 사이의 연관성을 방광암, 뇌암, 유방암, 결장암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 자궁암 샘플에 대한 피어슨 상관관계를 기초로 계산하였다.

세포를 mRNA 추출(RNeasy 미니 또는 마이크로 키트, Qiagen), 역전사(mRNA의 경우 BioRad로부터의 iScript Reverse Supermix)를 위해 용해시키고, qRT-PCR을 제조업체의 권고에 따라 Applied Biosystems로부터 Taqman 프로브를 사용하여 수행하였다. 파라핀-포매 절편의 경우, 제조업체 지시에 따라 고순도 FFPET RNA 단리 키트(Roche)를 사용함으로써 RNA를 얻었다. CFX384 TouchTM 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad)에서 반응을 수행하고, 결과를 대조 샘플에 비한 Ct 방법에 의해 계산되는 배수 변화로 표현하였다. 뮤린 또는 인간 ACTB 또는 GAPDH를 내부 정규화 대조로서 사용하였다.

마우스 유전자 2.1 ST로 Affymetrix 마이크로어레이 플랫폼에서 RNA를 분석하였다. 다음으로, 이를 로버스트-마이크로어레이 평균(Robust-Microarray Average: RMA)을 기초로 정규화시켰다. 항-LIF 처리 마우스에서 차별 발현된 것으로 확인된 유전자를 limma Bioconductor 패키지를 사용하여 쌍을 이룬 샘플을 고려하여 베이지안 선형 회귀(Bayesian linear regression)를 통해 식별하였다.

마우스 실험에서, 핵을 DAPI로 역염색하고, 레이저 스캐닝 공초점 NIKON Eclipse Ti 현미경을 사용하여 이미지를 캡처했다. ImageJ에 의해 3 마리 내지 5 마리 마우스/그룹으로 각 마우스의 2개 내지 3개의 상이한 필드의 CD11b, Iba1, 또는 CD3에 대해 양성인 모든 또는 최대 100개의 세포를 계수하고, Iba1 내부의 CCL2, CD206, 및 CD163에 양성인 그러한 세포(GL261N 모델의 경우) 또는 CD68/CD11b(ID8 모델의 경우) 양성 집단의 백분율을 계산함으로써 면역형광의 정량화를 수행하였다. CXCL9의 경우, 전체 세포 집단 내에서 이러한 시토카인의 신호로 둘러싸인 세포의 백분율로 이를 계산하였다. 기관형 슬라이스의 경우, 각 환자(n = 3)의 3개 내지 4개 필드를 정량화하였다. 기관형 조직 면역형광의 경우, 조건 당 5개의 상이한 Z-스택 이미지를 Fiji-ImageJ 소프트웨어로 프로세싱하였다. CD8⁺ T 세포의 경우, 전체 집단들 중에서 CD8⁺ T 세포의 백분율을 계산하였다. 그래프에서 데이터는 평균 ± SEM으로 나타나 있다.

면역형광 항체: 인간/뮤린 CCL2(Novus Biologicals, 1:200), 인간/뮤린 CD11b(AbCam; 1:2000), 인간/뮤린 Iba1(Wako; 1:1000), 뮤린 CD68(AbCam; 1:200), 인간/뮤린 CD206(Abcam; 1:500), 뮤린 CD163(Abcam; 1:200), CXCL9(뮤린 Novus Biologicals 1:200; 인간 Thermo Fischer Scientific; 1:200), 및 인간 CD8(DAKO; 1:200).

인간 GBM 시편을 발데브론 대학 병원 및 클리닉 병원으로부터 입수하였다. 임상 프로토콜은 모든 대상체로부터 얻어진 사전 동의와 함께 발데브론 연구 기관 감독 위원회(Vall d'Hebron Institutional Review Board) 및 클리닉 병원(CEIC)에 의해 승인되었다.

GBM 기관형 슬라이스 배양물을 다음과 같이 생성시켰다. 절제 후, 수술 시편을 5 mm 내지 10 mm 길이 및 1 mm 내지 2 mm 폭의 직사각형 블록으로 메스에 의해 절단하고, 6-웰 플레이트 내에 0.4 μm 막 배양 삽입물(Millipore)로 개별적으로 옮겼다. 삽입물을 6-웰 플레이트에 넣기 전에, B27(Life Technologies), 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies) 및 성장 인자(20 ng/ml의 EGF 및 20 ng/ml의 FGF-2)(PeproTech)가 보충된 1.2 ml의 Neurobasal 배지(Life Technologies)를 각 웰에 넣었다. 배양을 일정한 습도, 95% 공기 및 5% CO₂와 함께 37℃에서 유지시켰다. 1일 후, 슬라이스를 래트 항-마우스/인간 LIF 차단 항체(h5D8)(항-LIF로 지칭됨)(하우스에서 생성) 또는 이의 상응하는 정상 IgG(10 ㎍/ml)로 3일 동안 처리하였다. 차단 CXCL9 연구를 위해, 인간 CXCL9(R&D Systems)에 대항하는 중화 마우스 단클론성 항체를 배양물에 1.5 μg/ml로 첨가하였다. 일부 경우에, 0.1 ng/ml의 인간 rIFNγ(R&D Systems)를 24시간 동안 첨가하였다. 동시에, Lymphosep(Biowest)를 사용하여 원심분리 밀도 분리에 의해 동일한 환자의 전혈로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 얻었다. PBMC를 사용할 때까지 10% 불활성화 FBS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI 배지에서 저온보존하였다. 면역 세포 침윤 검정의 경우, 대조 또는 항-LIF 슬라이스를 완전 RPMI 배지에서 24-웰 플레이트에 1 × 10⁶개의 PBMC의 후속 첨가와 함께 매트리겔(Matrigel)(Corning)에 포매시켰다. 또한, 상층액을 수집하고, 기관형 슬라이스를 매트리겔로부터 회수하고, IF 및 유세포 분석을 위해 추가로 가공하였다. 일부 조건에서, PBMC를 10⁶개 세포/ml 농도의 PBS로 재현탁시키고, 5 μM 세포 추적 CFSE(Invitrogen)와 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 RPMI로 세척하고, 매트리겔에 포매된 절편에 첨가하였다. 24시간 후, 각 조건 당 5개의 상이한 부위에서 이동 세포를 계수함으로써 현미경 하에 매트리겔로의 형광 PBMC 침입을 평가하였다.

슬라이드를 탈파라핀화시키고, 수화시켰다. pH 6 또는 pH 9 시트레이트 항원 복구 용액(DAKO), 10분 10% 퍼옥시다제(H2O2) 및 차단 용액(2% BSA)을 사용하여 1시간 동안 실온에서 항원 복구를 수행하였다. 검출 시스템으로서, EnVision FLEX +(DAKO)를 제조업체의 지시에 따라 사용하고, 이어서 헤마톡실린으로의 역염색, 탈수 및 마운팅(DPX)을 수행하였다. 환자로부터의 GBM 종양에서 LIF, CCL2, CD163, CD206, 및 CXCL9 염색의 정량화를 0 내지 300의 범위로 주어지는 H 스코어(3 × 강 염색 백분율 + 2 × 중 염색 백분율 + 약 염색 백분율)로 표현하였다. p-STAT3, Ki67, CC3, 및 CD8의 정량화를 ImageJ에 의해 그룹 당 5 마리의 마우스로 마우스 당 3개의 상이한 필드의 총 세포 수를 계수하고, 양성 세포의 백분율을 계산함으로써 수행하였다. 그래프에서 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.

면역조직화학 항체: 인간 LIF(Atlas; 1 : 200), 뮤린 LIF(AbCam; 1:200), 뮤린 p-STAT3(Cell Signaling; 1:50), 뮤린 Ki67(AbCam; 1:200), 뮤린 절단-카스파제3(CC3)(Cell Signaling; 1:500), 뮤린 CD8(Bioss; 1:200), 인간/뮤린 CCL2(Novus Biologicals, 1:200), 인간 CXCL9(Thermo Fischer Scientific; 1:100) 및 인간 CD163(Leica Novacastra; 1:200).

실시예 25-II형(M2) 대식세포 분극화를 유도하는 LIF

이중 LIF-면역억제성 징후 계층화는 잠재적으로 특히 항-LIF 치료용 처치에 반응하는 경향이 있는 개체를 식별하는 강력한 방법이다. 이에 대한 추가 증거는 도 21a 및 도 21b, 도 22, 및 도 23에 나타나 있다. 도 21a 및 도 21b는 인간 일차 대식세포가 단핵구를 50 ng/ml의 M-CSF와 7d 동안 배양한 후 LIF 수용체를 상향 조절한다는 것을 나타낸다. 세 개의 상이한 개체로부터의 세포가 나타나 있다. 도 22 및 도 23은 추가로 LIF와 72시간의 배양 후, 일차 인간 대식세포가 대식세포 표면 마커 CD206 및 CD163(도 22), 및 CCL22의 분비(도 23)를 상향조절한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, CCL22 분비는 M2 분극화 대식세포에서 훨씬 더 강력했다(도 23, 하단 우측). 이러한 데이터는 LIF 발현과 면역억제성 징후의 존재 사이의 역학적 연관성을 제공하는데, 이는 환자 치료를 선택하는 데 있어서 이중 LIF-면역 억제성 징후가 모든 암 유형 및 모든 조직에 적용될 수 있다는 것을 지시한다.

방법

10% 열-불활성화 FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 50 ng/ml의 M-CSF와 RPMI-1640배지에서 7일 동안 배양함으로써 CD14⁺ 말초 인간 단핵구로부터 대식세포를 분화하였다. 일부 실험에서, 20 nM LIF, 또는 PBS(대조용), 또는 100 ng/ml LPS 및 25 ng/ml IFNγ(M1 분극화용), 또는 20 ng/ml 각각의 IL-4, IL-10 및 TGFβ(M2 분극화용)가 첨가된 동일한 배지에서 지시된 추가 시간 동안 배양함으로써 이를 수행하였다.

실시예 26-상이한 암으로부터의 골수 세포에서 LIF 수용체 발현

종양 성장 및 암의 생존에 중요한 이중 LIF-면역억제성 징후의 가능성에 대한 추가 지지는 인간 종양 관련 대식세포가 실제로 LIF 수용체를 발현한다는 것이다. 도 24 및 도 25는 난소암 및 폐암의 해리된 종양 세포의 3/4으로부터 단리된 대식세포가 LIF 수용체를 발현한다는 것을 나타낸다(도 24). 추가로, LIF 수용체는 종양 관련 골수 유래 억제 세포인 단핵구 골수 유래 억제 세포(M-MDSC)와 다형핵 골수 유래 억제 세포(PMN-MDSC) 둘 모두의 세포 표면에서 발현된다(도 25).

본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 나타나 있고 기술되어 있지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 다수 수정, 변화, 및 대체가 이제 본 발명으로부터 벗어남 없이 당업자에게 이루어질 것이다. 본원에 기재된 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 발행 특허, 및 기타 문헌은 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 발행 특허, 또는 기타 문헌이 그 전체가 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 포함된다. 참조로서 포함된 문헌에 포함되어 있는 정의는 이들이 본 개시에서의 정의와 모순되는 경우에 배제된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태인 부정관사 및 정관사는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 포괄하는 것으로 의도된다.

달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 양에 적어도 10% 부근의 양을 지칭한다.

서열

SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LIMITED FUNDACIO PRIVADA INSTITUT D' INVESTIGACI?ONCOL?ICA DE VALL HEBRON FUNDACIO PRIVADA INSTITUCIO CATALANA DE RECERCA I ESTUDIS AVANCATS <120> METHODS FOR IMPROVING RESPONSE TO ANTI-LIF ANTIBODY TREATMENT IN INDIVIDUALS WITH CANCER <130> LIF-201-WO-PCT <140> PCT/IB2019/000806 <141> 2019-06-17 <150> EP 18382431.7 <151> 2018-06-18 <150> EP 19382131.1 <151> 2019-02-22 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser His Ala Trp Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser His Ala Trp 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 His Ala Trp Met His 1 5 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Gln Ile Lys Ala Lys Ser Asp Asp Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly 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Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 40 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 40 Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile Arg His 1 5 10 15 Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln 20 25 30 Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln 35 40 45 Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val 50 55 60 Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Ala Lys Leu 65 70 75 80 Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu Gly Thr Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro Ser Ala Leu Ser Leu His 100 105 110 Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn 115 120 125 Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Gly His Val Asp Val 130 135 140 Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Val Leu 165 170 175 Ala Gln Ala Phe 180 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 41 Glu Gln Leu Glu Glu Ser Val Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Leu Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Trp Thr Gly Ser Thr Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Val Pro Gly Asp Gly Tyr Ala Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 42 Gly Thr Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro 1 5 10 15 Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser 20 25 30 Ser Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Met Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Ala Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Val Ala 85 90 95 Ser Ser Ser Tyr Phe Val Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val 100 105 110

Claims (28)

1. 치료용 항-백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 항체로 암이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 기준 수준을 초과하는 LIF의 수준을 결정하는 단계, 및 LIF의 수준이 LIF의 기준 수준보다 높은 경우 치료량의 항-LIF 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 치료용 항-LIF 항체는
   a) SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1);
   b) SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 2(VH-CDR2);
   c) SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 3(VH-CDR3);
   d) SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1);
   e) SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 2(VL-CDR2); 및
   f) SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 3(VL-CDR3)을 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 38에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 21에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 치료용 항-LIF 항체는 SEQ ID NO: 30 내지 SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 39에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 영역, 및 SEQ ID NO: 34 내지 SEQ ID NO: 37에 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 항-LIF 항체는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체인, 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 항-LIF 항체는 인간화되는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, LIF의 수준은 LIF 단백질 수준이고, 수준을 결정하는 것은 LIF 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정을 수행하는 단계 또는 LIF 단백질을 검출하는 적어도 하나의 검정 결과를 받는 단계를 포함하는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 검정은 면역조직화학을 포함하는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 기준 수준은 항-LIF 항체로 염색 양성인 세포의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 35%인, 방법.
10. 제8항에 있어서, 기준 수준은 약 10 내지 약 100의 IHC-스코어이거나 이를 초과하는, 방법.
11. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)을 포함하는, 방법.
12. 제11항에 있어서, ELISA는 전기화학발광을 검출하는, 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 기준 수준은 개체로부터의 비희석된 생물학적 샘플에서 약 4 pg/mL의 LIF인, 방법.
14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, LIF의 기준 수준은 동일한 유형의 LIF 양성 인간 암에서 LIF 단백질 발현의 5번째 백분위수, 10번째 백분위수, 25번째 백분위수, 또는 50번째 백분위수에 상응하는, 방법.
15. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, LIF의 기준 수준은 인간 암에서 LIF 단백질 발현의 5번째 백분위수, 10번째 백분위수, 25번째 백분위수, 또는 50번째 백분위수에 상응하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 인간 암은 폐암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 비뇨생식기암, 부인과암, 위장관암, 내분비계암, 다형아교모세포종, 유방암, 흑색종, 결장직장암, 담관암, 자궁경부암, 자궁내막암, 두경부 편평 세포 암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 인간 암은 비소세포 폐암, 다형아교모세포종, 상피 난소 암종, 췌장 선암, 및 이들의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함하는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 혈액 샘플은 혈장인, 방법.
20. 제18항에 있어서, 혈액 샘플은 혈청인, 방법.
21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함하는, 방법.
22. 제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 종양 생검인, 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절성 분자의 기준 수준을 초과하는 면역조절성 분자의 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
24. 제23항에 있어서, 면역조절성 분자는 CCL7, CCL2, CCL3, 및 CCL22로부터 선택되는, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절성 분자의 기준 수준 미만인 면역조절성 분자의 단백질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 면역조절성 분자는 MHCII, CXCL9, CXCL10, CXCR3, 및 PD-L1로부터 선택되는, 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, II형 대식세포(M2) 마커의 단백질의 기준 수준을 초과하는 II형 대식세포(M2) 마커의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
28. 제27항에 있어서, M2 마커는 CD206, CD163, PF4, CTSK, 및 ARG1로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.

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