CN112703202A - 用于改善患有癌症的个体对抗lif抗体治疗的反应的方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了选择和治疗可能对抗LIF抗体的治疗产生反应的患者的方法。

Description

用于改善患有癌症的个体对抗LIF抗体治疗的反应的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年6月18日提交的欧洲申请序列号18382431.7和2019年2月22日提交的欧洲申请序列号19382131.1的权益，其全部通过引用以其整体特此并入。

背景技术

白血病抑制因子(LIF)是白细胞介素6(IL-6)细胞因子家族的成员。根据LIF的已知生理学活性、LIF缺乏的临床特征以及健康组织和肿瘤中LIF表达的非临床研究，预期在一系列实体瘤中对LIF的抑制作用是很好耐受的并产生抗肿瘤功效，这些实体瘤包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、卵巢癌和多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

当用靶标特异性治疗剂治疗癌症时，临床医生面临的一个问题是，并非所有肿瘤都可能对给定的靶标特异性治疗剂产生反应。即使对于已知表达LIF或LIF受体的肿瘤类型，各种肿瘤之间也存在明显的异质性。另外地，并非所有表达LIF或LIF受体的肿瘤都可能产生类似的反应，因此需要有效的方法来确定可能最受益于抗LIF治疗性抗体治疗的个体。

发明内容

本披露涉及治疗个体的癌症的方法，其包括向最可能对治疗性抗LIF抗体产生反应的那些个体施用所述抗体，以及确定哪些个体最可能对治疗性抗LIF抗体产生反应的方法。患有如下肿瘤或癌症的患者可以用LIF治疗性抗体有效治疗，这些肿瘤或癌症展现出超过如本文所述的参考水平的mRNA或蛋白水平上的LIF或LIF受体表达。另外地，描述了几种非LIF生物标记物，其可以确定将从治疗性抗LIF抗体治疗中受益的个体。这些非LIF生物标记物可以单独使用，或与测量LIF或LIF受体水平的测定一起使用。非LIF生物标记物包括指示免疫抑制特征的免疫调节分子，这些包括免疫抑制细胞类型、免疫抑制细胞因子或免疫抑制趋化因子的存在。设想的是，确定LIF或LIF受体水平以及免疫抑制特征将增加确定用治疗性抗LIF抗体进行的治疗的方法的预测能力。

在一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的LIF水平，并在该LIF水平大于该LIF参考水平时，向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括：免疫球蛋白重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：1-3中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ IDNO：4或5中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：6-8中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：9或10中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11或12中任一项所阐述的氨基酸序列；以及免疫球蛋白轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：14、15、17或38具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链可变区以及与SEQ ID NO：18-21具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链可变区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：30-33或39具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链区以及与SEQ ID NO：34-37具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体是包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的IgG抗体。在某些实施例中，该LIF水平是LIF蛋白水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF蛋白的测定，或接收至少一种检测LIF蛋白的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括免疫组织化学。在某些实施例中，该参考水平为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或50％的抗LIF抗体阳性染色细胞。

在某些实施例中，该参考水平是约100的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是约1至约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是约1至约30、约1至约60、约1至约90、约1至约120、约1至约150、约1至约180、约1至约210、约1至约240、约1至约270、约1至约300、约30至约60、约30至约90、约30至约120、约30至约150、约30至约180、约30至约210、约30至约240、约30至约270、约30至约300、约60至约90、约60至约120、约60至约150、约60至约180、约60至约210、约60至约240、约60至约270、约60至约300、约90至约120、约90至约150、约90至约180、约90至约210、约90至约240、约90至约270、约90至约300、约120至约150、约120至约180、约120至约210、约120至约240、约120至约270、约120至约300、约150至约180、约150至约210、约150至约240、约150至约270、约150至约300、约180至约210、约180至约240、约180至约270、约180至约300、约210至约240、约210至约270、约210至约300、约240至约270、约240至约300或约270至约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是约1、约30、约60、约90、约120、约150、约180、约210、约240、约270或约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是至少约1、约30、约60、约90、约120、约150、约180、约210、约240或约270的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是至多约30、约60、约90、约120、约150、约180、约210、约240、约270或约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是或超过约10至约100的IHC评分。

在某些实施例中，至少一种测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施例中，该ELISA检测电化学发光。在某些实施例中，在未稀释的来自该个体的生物学样品中，该参考水平为约1pg/mL至约10pg/mL的LIF。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第5百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第10百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第5百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第10百分位数。在某些实施例中，该LIF水平是LIF mRNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF mRNA的测定，或接收至少一种检测LIF mRNA的测定的结果。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第5百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第10百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第5百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第10百分位数的水平。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第25百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第50百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第25百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第50百分位数。在某些实施例中，该LIF水平是LIF mRNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF mRNA的测定，或接收至少一种检测LIF mRNA的测定的结果。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第25百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第50百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第25百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第50百分位数的水平。在某些实施例中，该LIF水平是LIF DNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF DNA的测定，或接收至少一种检测LIF DNA的测定的结果。在某些实施例中，至少一种测定包括聚合酶链式反应(PCR)。在某些实施例中，该PCR包括定量PCR。在某些实施例中，该至少一种测定包括测序反应。在某些实施例中，该测序反应包括下一代测序反应。在某些实施例中，该生物学样品包括血液样品。在某些实施例中，该血液样品是血浆。在某些实施例中，该血液样品是血清。在某些实施例中，该生物学样品包括组织样品。在某些实施例中，该生物学样品是肿瘤活检。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的超过该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的低于该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该免疫调节分子选自由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：MHCII、CXCL9、CXCL10、CXCR3、PD-L1、CCL7、CCL2、CCL3和CCL22。在某些实施例中，该方法进一步包括确定II型巨噬细胞(M2)标记物的超过该II型巨噬细胞(M2)标记物的DNA、mRNA或蛋白参考水平的水平。在某些实施例中，该M2标记物是由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：CD206、CD163、PF4、CTSK、和ARG1。在某些实施例中，该方法进一步包括确定LIF受体(LIFR)的超过LIFR参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，在免疫调节细胞上检测该LIFR水平。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：胰腺癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤及其组合。

在另一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的LIF水平，并施用治疗量的该抗LIF抗体。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括：免疫球蛋白重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：1-3中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO：4或5中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：6-8中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：9或10中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11或12中任一项所阐述的氨基酸序列；以及免疫球蛋白轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：14、15、17或38具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链可变区以及与SEQID NO：18-21具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链可变区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：30-33或39具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链区以及与SEQ ID NO：34-37具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体是包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的IgG抗体。在某些实施例中，该LIF水平是LIF蛋白水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF蛋白的测定，或接收至少一种检测LIF蛋白的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括免疫组织化学。在某些实施例中，该参考水平为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或50％的抗LIF抗体阳性染色细胞。

在某些实施例中，该参考水平是约100的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是约1至约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是约1至约30、约1至约60、约1至约90、约1至约120、约1至约150、约1至约180、约1至约210、约1至约240、约1至约270、约1至约300、约30至约60、约30至约90、约30至约120、约30至约150、约30至约180、约30至约210、约30至约240、约30至约270、约30至约300、约60至约90、约60至约120、约60至约150、约60至约180、约60至约210、约60至约240、约60至约270、约60至约300、约90至约120、约90至约150、约90至约180、约90至约210、约90至约240、约90至约270、约90至约300、约120至约150、约120至约180、约120至约210、约120至约240、约120至约270、约120至约300、约150至约180、约150至约210、约150至约240、约150至约270、约150至约300、约180至约210、约180至约240、约180至约270、约180至约300、约210至约240、约210至约270、约210至约300、约240至约270、约240至约300或约270至约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是约1、约30、约60、约90、约120、约150、约180、约210、约240、约270或约300的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是至少约1、约30、约60、约90、约120、约150、约180、约210、约240或约270的IHC评分。在一些实施例中，该参考水平是至多约30、约60、约90、约120、约150、约180、约210、约240、约270或约300的IHC评分。

在某些实施例中，至少一种测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施例中，该ELISA检测电化学发光。在某些实施例中，在未稀释的来自该个体的生物学样品中，该参考水平为至少约4pg/mL的LIF。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第5百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第10百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第5百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第10百分位数。在某些实施例中，该LIF水平是LIFmRNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF mRNA的测定，或接收至少一种检测LIF mRNA的测定的结果。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIFmRNA表达的第5百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第10百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第5百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第10百分位数的水平。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第25百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性癌症中LIF蛋白表达的第50百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第25百分位数。在某些实施例中，该LIF参考水平对应于人类癌症的代表性样品中LIF蛋白表达的第50百分位数。在某些实施例中，该LIF水平是LIF mRNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF mRNA的测定，或接收至少一种检测LIF mRNA的测定的结果。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第25百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于相同类型的癌症中LIF mRNA表达的第50百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第25百分位数的水平。在某些实施例中，该参考水平是对应于人类癌症的代表性样品中LIF mRNA表达的第50百分位数的水平。在某些实施例中，该LIF水平是LIF DNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF DNA的测定，或接收至少一种检测LIF DNA的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括聚合酶链式反应(PCR)。在某些实施例中，该PCR包括定量PCR。在某些实施例中，该至少一种测定包括测序反应。在某些实施例中，该测序反应包括下一代测序反应。在某些实施例中，该生物学样品包括血液样品。在某些实施例中，该血液样品是血浆。在某些实施例中，该血液样品是血清。在某些实施例中，该生物学样品包括组织样品。在某些实施例中，该生物学样品是肿瘤活检。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的超过该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的低于该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该免疫调节分子选自由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：MHCII、CXCL9、CVCL10、CXCR3、PD-Ll、CCL7、CCL2、CCL3和CCL22。在某些实施例中，该方法进一步包括确定II型巨噬细胞(M2)标记物的超过该II型巨噬细胞(M2)标记物的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该M2标记物是由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：CD206、CD163、PF4、CTSK、和ARGl。在某些实施例中，该方法进一步包括确定LIF受体(LIFR)的超过LIFR参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，在免疫调节细胞上检测该LIFR水平。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：胰腺癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤及其组合。

在另一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的白血病抑制因子受体(LIFR)水平，并在该LIFR水平大于该LIFR参考水平时，向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。在某些实施例中，在免疫调节细胞上检测该LIFR水平。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括：免疫球蛋白重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：1-3中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ IDNO：4或5中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：6-8中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ IDNO：9或10中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11或12中任一项所阐述的氨基酸序列；以及免疫球蛋白轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQID NO：13所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：14、15、17或38具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链可变区以及与SEQ ID NO：18-21具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链可变区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：30-33或39具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链区以及与SEQ ID NO：34-37具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体是包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的IgG抗体。在某些实施例中，该LIFR水平是LIFR蛋白水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIFR蛋白的测定，或接收至少一种检测LIFR蛋白的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括免疫组织化学。在某些实施例中，该至少一种测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施例中，该ELISA检测电化学发光。在某些实施例中，该至少一种测定包括流式细胞术。在某些实施例中，该LIFR水平是LIFR mRNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIFR mRNA的测定，或接收至少一种检测LIFRmRNA的测定的结果。在某些实施例中，该LIFR水平是LIFR DNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIFR DNA的测定，或接收至少一种检测LIFR DNA的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括聚合酶链式反应(PCR)。在某些实施例中，该PCR包括定量PCR。在某些实施例中，该至少一种测定包括测序反应。在某些实施例中，该测序反应包括下一代测序反应。在某些实施例中，该生物学样品包括血液样品。在某些实施例中，该血液样品是血浆。在某些实施例中，该血液样品是血清。在某些实施例中，该生物学样品包括组织样品。在某些实施例中，该生物学样品是肿瘤活检。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的超过该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的低于该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该免疫调节分子选自由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：MHCII、CXCL9、CXCL10、CXCR3、PD-L1、CCL7、CCL2、CCL3和CCL22。在某些实施例中，该方法进一步包括确定II型巨噬细胞(M2)标记物的超过该II型巨噬细胞(M2)标记物的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该M2标记物是由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：CD206、CD163、PF4、CTSK、和ARG1。在某些实施例中，该方法进一步包括确定LIF的超过LIF的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：胰腺癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤及其组合。

在另一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的白血病抑制因子受体(LIFR)水平，并向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。在某些实施例中，在免疫调节细胞上检测该LIFR水平。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括：免疫球蛋白重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：1-3中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO：4或5中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：6-8中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：9或10中任一项所阐述的氨基酸序列；免疫球蛋白轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11或12中任一项所阐述的氨基酸序列；以及免疫球蛋白轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：14、15、17或38具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链可变区以及与SEQID NO：18-21具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链可变区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：30-33或39具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链区以及与SEQ ID NO：34-37具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链区。在某些实施例中，该治疗性抗LIF抗体是包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的IgG抗体。在某些实施例中，该LIFR水平是LIFR蛋白水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIFR蛋白的测定，或接收至少一种检测LIFR蛋白的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括免疫组织化学。在某些实施例中，该至少一种测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施例中，该ELISA检测电化学发光。在某些实施例中，该至少一种测定包括流式细胞术。在某些实施例中，该LIFR水平是LIFR mRNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIFR mRNA的测定，或接收至少一种检测LIFR mRNA的测定的结果。在某些实施例中，该LIFR水平是LIFR DNA水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIFR DNA的测定，或接收至少一种检测LIFR DNA的测定的结果。在某些实施例中，该至少一种测定包括聚合酶链式反应(PCR)。在某些实施例中，该PCR包括定量PCR。在某些实施例中，该至少一种测定包括测序反应。在某些实施例中，该测序反应包括下一代测序反应。在某些实施例中，该生物学样品包括血液样品。在某些实施例中，该血液样品是血浆。在某些实施例中，该血液样品是血清。在某些实施例中，该生物学样品包括组织样品。在某些实施例中，该生物学样品是肿瘤活检。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的超过该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该方法进一步包括确定免疫调节分子的低于该免疫调节分子的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该免疫调节分子选自由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：MHCII、CXVCL9、CXVCL10、CXCR3、PD-L1、CCL7、CCL2、CCL3和CCL22。在某些实施例中，该方法进一步包括确定II型巨噬细胞(M2)标记物的超过该II型巨噬细胞(M2)标记物的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该M2标记物是由以下清单转录的mRNA或由以下清单产生的蛋白质，该清单由以下组成：CD206、CD163、PF4、CTSK、和ARG1。在某些实施例中，该方法进一步包括确定LIF的超过LIF的参考水平的DNA、mRNA或蛋白水平。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌及其组合。在某些实施例中，该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：胰腺癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤及其组合。

附图说明

图1描绘了蛋白质印迹，其示出了不同抗LIF人源化抗体对LIF诱导的STAT3磷酸化的抑制。

图2A和2B描绘了蛋白质印迹，其示出了人源化和亲本5D8抗体对LIF诱导的STAT3磷酸化的抑制。

图3A示出了使用h5D8抗体在U-251细胞中抑制LIF的IC₅0。

图3B示出了在内源性LIF刺激条件下对pSTAT3的r5D8和h5D8抑制的代表性IC₅₀剂量反应曲线。示出的是代表性曲线(n＝1h5D8，n＝2r5D8)。

图4描绘了蛋白质印迹，其示出了本披露中描述的不同单克隆抗体对LIF诱导的STAT3磷酸化的抑制。

图5描绘了来自人类患者的多形性胶质母细胞瘤(GBM)、NSCLC(非小细胞肺癌)、卵巢癌、结肠直肠癌肿瘤和胰腺肿瘤中LIF表达的免疫组织化学染色和定量。条代表平均值+/-SEM。

图6是示出使用人源化5D8抗体在非小细胞肺癌小鼠模型中进行的实验的图。

图7A示出了r5D8对GBM原位小鼠模型中U251细胞的抑制作用。示出第26天的定量。

图7B示出了来自小鼠的数据，该小鼠接种了表达萤光素酶的人U251 GBM细胞，然后每周两次用100、200或300μg的h5D8或媒介物治疗。在第7天通过生物发光(精诺真公司(Xenogen)IVIS光谱)确定肿瘤大小。该图示出了个体肿瘤测量，水平条表示平均值±SEM。使用未配对的非参数Mann-Whitney U检验计算统计显著性。

图8A示出了在同系小鼠模型中r5D8对卵巢癌细胞生长的抑制作用。

图8B示出了在第25天的个体肿瘤测量。

图8C展示了当以每周两次200μg/小鼠施用时，h5D8示出了肿瘤生长的显著降低(p＜0.05)。符号为平均值+SEM，与媒介物相比的统计学显著性(使用未配对的非参数Mann-Whitney U检验)。

图9A示出了在同系小鼠模型中r5D8对结肠直肠癌细胞生长的抑制作用。

图9B示出了在第17天的个体肿瘤测量。

图10A示出了GBM原位小鼠模型中巨噬细胞向肿瘤部位浸润的减少，具有代表性图像和CCL22+细胞的定量。

图10B示出了人类器官型组织切片培养模型中巨噬细胞极化的减少。示出的是代表性图像(左)和定量(右)。

图10C示出了卵巢癌同系小鼠模型中巨噬细胞向肿瘤部位极化的减少，具有代表性图像和CCL22+细胞的定量。

图10D示出了结肠直肠癌同系小鼠模型中巨噬细胞向肿瘤部位浸润的减少，具有代表性图像和CCL22+细胞的定量。

图11A示出了在用r5D8治疗后卵巢癌同系小鼠模型中非骨髓效应细胞的增加。

图11B示出了在用r5D8治疗后结肠直肠癌同系小鼠模型中非骨髓效应细胞的增加。

图11C示出了在用r5D8治疗后NSCLC癌症小鼠模型中CD4+T_REG细胞的百分比降低。

图12示出了在存在或不存在抗CD4和抗CD8耗竭抗体的情况下腹膜内施用PBS(对照)或r5D8每周两次治疗的携带CT26肿瘤的小鼠的数据。该图示出了在d13的个体肿瘤测量，表示为平均肿瘤体积+SEM。组间的统计差异通过未配对的非参数Mann-Whitney U检验确定。R5D8抑制CT26肿瘤的生长(*p＜0.05)。在存在抗CD4和抗CD8耗竭抗体的情况下，r5D8对肿瘤的生长抑制作用显著降低(****p＜0.0001)。

图13A展示了与LIF复合的h5D8 Fab的共晶体结构的概观。gp130相互作用位点映射在LIF的表面上(深色阴影)。

图13B展示了LIF与h5D8之间的详细相互作用，其示出了形成盐桥的残基和掩埋表面积大于

的h5D8残基。

图14A展示了五个h5D8 Fab晶体结构的叠加，并且指示尽管在不同化学条件下结晶，但高度相似。

图14B展示了由未配对的Cys100介导的范德华相互作用的广泛网络。该残基是有序的，参加塑造HCDR1和HCDR3的构象，并且不参与不希望的二硫键错配。残基之间的距离以虚线示出并标记。

图15A通过ELISA展示了h5D8 C100突变体与人LIF的结合。

图15B通过ELISA展示了h5D8 C100突变体与小鼠LIF的结合。

图16A通过Octet展示了h5D8不阻断LIF和LIFR之间的结合。h5D8与LIF的顺序结合，随后进行LIFR。

图16B和16C展示了与固定的LIFR或gp130结合的LIF/mAb复合物的ELISA分析。物种特异性过氧化物酶缀合的抗IgG抗体的信号((-)和h5D8的抗人抗体，r5d8和B09的抗大鼠抗体)检测结合固定的LIFR(图16B)或gp130(图16C)涂层板的mAb/LIF复合物的抗体部分。

图17A和17B展示了72种不同的人类组织中LIF(图16A)或LIFR(图16B)的mRNA表达。

图18显示了在不同癌症类型中的mRNA表达水平，其分为高、中-高、中低和低水平。表达数据表示在从22种适应症中收集、从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)中收集的7,769个样品中测得的LIF转录物水平，并以数据集中的四分位数为阈值。

图19A示出了LIF mRNA水平与CCL7 mRNA水平的相关性(r²)。每种适应症的样品均来自癌症基因组图谱，并通过皮尔森相关性评估了LIF与CCL7之间的关联。

图19B示出了LIF mRNA水平与CCL2 mRNA水平的相关性(r²)。每种适应症的样品均来自癌症基因组图谱，并通过皮尔森相关性评估了LIF与CCL2之间的关联。

图19C示出了LIF mRNA水平与CCL3 mRNA水平的相关性(r²)。每种适应症的样品均来自癌症基因组图谱，并通过皮尔森相关性评估了LIF与CCL3之间的关联。

图19D示出了LIF mRNA水平与CCL22 mRNA水平的相关性(r²)。每种适应症的样品均来自癌症基因组图谱，并通过皮尔森相关性评估了LIF与CCL22之间的关联。

图20A示出了LIF mRNA水平与II型巨噬细胞(M2)所特有的表达特征的相关性(r²)。

图20B示出了GBM和卵巢癌中LIF与CD163、CD206和CCL2表达之间的相关性。GBM和卵巢癌(OV)TCGA肿瘤队列中LIF与CD163、CD206和CCL2表达(以log2 RSEM计)之间的回归图。

图20C示出了来自20个GBM肿瘤的指示标记物的IHC的相关性。示出了LIF与CCL2、CD206、CD163和CXCL9之间的相关性，以R平方系数(R²)表示。

图20D示出了来自抗LIF治疗的或未治疗的GL261N肿瘤的TAM(CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^-)中CCL2⁺和CXCL9⁺的百分比和平均荧光强度(MFI)。

图20E示出了双阳性细胞相对于TAM标记阳性细胞的百分比。CXCL9定量是相对于细胞总数而言的。

图20F示出了通过流式细胞术确定的TAM(CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^-)和CD8⁺T细胞(CD3⁺CD8⁺)群中的CCR2、CXCR3和LIFR受体的百分比。数据呈现为平均值±SEM。通过Mann-Whitney T检验进行统计分析。*P＜0.05。

图20G示出了GL261N在CXCL9^-/-和CCL2^-/-小鼠或用指示抗体治疗的小鼠中的肿瘤生长，以总通量(p/s)示出。

图20H示出了在指示治疗中，肿瘤浸润性CD8⁺T细胞的倍数增加(FI)。数据是平均值±SEM。通过Mann-Whitney T检验进行统计分析。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。

图20I示出了相对于Iba1⁺细胞的双阳性细胞的百分比，以及相对于细胞总数的、用10j.tg/ml抗LIF孵育3天的GBM器官型切片(患者1、2、3)中CXCL9⁺细胞的百分比。数据为所有患者的平均值±SEM。通过Mann-Whitney T检验进行统计分析。*P＜0.05，**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。

图20J示出了通过全肿瘤裂解物(n＝8)的qRT-PCR确定的、在终点处CT26肿瘤中M1和M2基因的转录物水平。数据表示为相对于IgG1对照处理的肿瘤(Hprt、Tbp、Tfrc)的平均值的倍数变化。

图20K示出了全骨髓(pan Myeloid)细胞群(CD45⁺细胞中的CD11b⁺)、TAM(CD45⁺细胞中的CD11b⁺Ly6C^低F4/80⁺)、MHC^II+TAM(CD11b⁺Ly6C^低F4/80⁺细胞中的MHC II⁺)以及TAM中的MHCII表达的定量。数据示为平均值±s.e.m。(指示了每个实验的n)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图21A和21B示出了通过流式细胞术(图21A)获得的并通过对荧光校准珠进行插值来定量(图21B)的、从来自3个不同供体的原代单核细胞分化的原代巨噬细胞上的LIF受体的水平。

图22示出了响应于LIF治疗(20nM)72小时，原代M₀巨噬细胞中CD206和CD163的增加。

图23示出了响应于LIF治疗(20nM)，M_O巨噬细胞以及M1和M2巨噬细胞(右下角)中CCL22分泌的增加。

图24示出了通过流式细胞术确定的来自III-C期浆液性卵巢癌(两个不同的供体，两个左侧分图)和III-A期肺腺癌(两个不同的供体，两个右侧分图)的肿瘤相关巨噬细胞上的LIF受体表达。对照绘图是荧光减一(FMO)对照。

图25示出了通过流式细胞术确定的来自III-C期浆液性卵巢癌(两个不同的供体，两个左侧分图)和III-A期肺腺癌(两个不同的供体，两个右侧分图)的肿瘤单核细胞髓源性抑制细胞(M-MDSC)、肿瘤多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSC)上的LIF受体表达。对照绘图表示荧光减一(FMO)染色。样品按CD11b⁺CD33⁺HLA-DR^低进行门控。

具体实施方式

在一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的LIF水平，并在该LIF水平大于该LIF参考水平时，向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。

在另一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的LIF水平，并施用治疗量的该抗LIF抗体。

在另一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的白血病抑制因子受体(LIFR)水平，并在该LIFR水平大于该LIFR参考水平时，向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。

在另一个方面，本文描述了一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的白血病抑制因子受体(LIFR)水平，并向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。

如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”是指被诊断出、怀疑患有癌症、肿瘤或赘生物或者处于发展癌症、肿瘤或赘生物的风险下的个体。在某些实施例中，该个体是哺乳动物。在某些实施例中，该哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、母牛、绵羊、猪、山羊、美洲驼、羊驼或牦牛。在某些实施例中，该个体是人。

如本文所用，除非另有指示，否则术语“免疫调节分子”是指存在于肿瘤或肿瘤微环境中的调节或引起先天和/或适应性免疫系统的调节的任何分子、多肽或蛋白质，包括但不限于免疫抑制趋化因子、免疫抑制细胞因子或检查点抑制剂分子。免疫调节分子可以由免疫调节细胞、肿瘤/癌细胞或基质细胞产生。通过非限制性举例的方式，免疫调节分子包括CCL7、CCL2、CCL3、CCL22、MHCII、CXCL9、CXCL10、CXCR3和PD-L1。

如本文所用，除非另有指示，否则术语“免疫调节细胞”是指免疫系统中具有产生免疫调节因子的能力的任何细胞，包括树突细胞、巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞、I型巨噬细胞、II型巨噬细胞、髓源抑制细胞、肿瘤多形核髓源抑制细胞(PMN-MDSC)、辅助T细胞、调节性T细胞、活化的T细胞、经历抗原的T细胞、细胞毒性T细胞等。

如本文所用，除非另有指示，否则术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段，即，保留与全长抗体结合的抗原特异性结合能力的抗体片段，例如，保留一个或多个CDR区的片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；重链抗体、单链抗体分子，例如，单链可变区片段(scFv)、纳米抗体和由具有不同特异性的抗体片段形成的多特异性抗体，诸如双特异性抗体。在某些实施例中，以降低个体对该抗体的免疫反应的方式将这些抗体人源化。例如，该抗体可以是嵌合的，例如，具有人恒定区的非人可变区，或CDR移植的，例如，具有人恒定区和可变区框架序列的非人CDR区。在某些实施例中，人源化后抗体是去免疫化的。去免疫化涉及去除或使该抗体恒定区中的一个或多个T细胞表位突变。在某些实施例中，本文所述的抗体是单克隆的。如本文所用，“重组抗体”是包括衍生自两种不同物种或两种不同来源的氨基酸序列的抗体，并且包括合成分子，例如，包括非人CDR和人框架或恒定区的抗体。在某些实施例中，本发明的重组抗体由重组DNA分子产生或合成。术语“癌症”和“肿瘤”涉及以细胞生长失调为特征的哺乳动物的生理状况。癌症是一类疾病，其中一组细胞显示不受控制的生长或不想要的生长。癌细胞也可以扩散到其他位置，这可能导致转移的形成。癌细胞在体内的扩散可以例如通过淋巴或血液发生。不受控制的生长、侵袭和转移形成也被称为癌症的恶性特性。这些恶性特性使癌症与良性肿瘤区分开来，良性肿瘤典型地不会侵袭或转移。

如本文所用，“治疗性抗体”是施用给个体的抗体，并且旨在产生可用于治疗癌症的一种或多种有益作用。本披露的治疗性抗体包括具有与h5D8相同的CDR序列、重链和/或轻链免疫球蛋白可变区、或完整的免疫球蛋白重链和轻链或不同于h5D8的CDR但具有相似结合特性(表位、亲和力、或生物学效应)并可以产生可用于治疗癌症的一种或多种有益作用的抗体。

如本文所用，“治疗量”是旨在产生可用于治疗癌症的一种或多种有益作用的治疗性抗体的剂量量。一些具体的治疗量在本文中详细讨论。

如本文所用，“治疗(treating或treatment)”是指在疾病状态下进行的旨在产生一种或多种有益作用的干预。针对癌症/肿瘤目的，治疗包括旨在引起或确实引起疾病稳定、部分反应、完全反应、无进展生存期延长、总体生存期延长、肿瘤收缩、肿瘤生长延迟、肿瘤生长停滞或者预防或减少转移的方法。在某些情况下，本文所述的治疗方法可以用作成功治疗后的维持或预防特定肿瘤或癌症的复发或转移。理解的是，并不是所有的个体都会对给定的治疗性抗体施用产生相同程度的反应，或者根本没有反应，但是即使没有检测到反应，这些个体仍然被认为已经进行了治疗。

如本文所用，“生物标记物”是个体中的可测量分子，其存在指示该个体的疾病状态。生物标记物包括但不限于例如蛋白质及其翻译后修饰、多肽、核酸、DNA、RNA、氨基酸、脂肪酸、脂质、固醇、碳水化合物或者氨基酸、脂肪酸、脂质、固醇和碳水化合物的代谢产物和代谢中间体。

如本文所用，“IHC评分”涉及用以定量测试样品中的LIF或LIF受体表达水平的参数。样品的IHC评分是通过使用免疫组织化学用抗LIF或LIF受体特异性抗体对样品进行染色来确定的。给出的每个肿瘤细胞的强度水平从0不染色到3+最强染色变动，2+为中等染色细胞且1+为弱染色细胞。然后可以通过以下公式计算出IHC评分：

[1×(％1+细胞)+2×(％2+细胞)+3×(％3+细胞)]

IHC评分可从1到300变动。样品的IHC评分可直接用于提供有关LIF表达水平的指示，或可与参考IHC评分值进行比较以提供有关个体是否会对抗LIF治疗性抗体治疗产生反应的指示。

如本文所用，“免疫组织化学”或“IHC”是指使用抗体、亲和分子和染色剂来测试组织或细胞样品中的某些抗原(生物标记物)的实验室测试。抗体可以与酶或荧光染料连接。IHC可以与其他非抗体染色剂或进一步精心制作组织或细胞结构的方法(例如核或细胞膜染色剂)组合使用。IHC可以在福尔马林固定的石蜡包埋或冷冻的组织或活检样品上进行。IHC也可以在悬浮的细胞上进行，随后将细胞离心下来或粘附在显微镜载玻片或盖玻片上。可以通过可见光显微镜检或成像或者荧光显微镜检或成像适当地分析IHC样品。可以手动或通过计算机程序(例如，Image J)进行定量。

如本文所用，“参考水平”涉及预定标准，该预定标准用作评价从获得自个体的样品获得的值或数据的参考。参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列值；均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考水平可以基于个体样品值，诸如像从来自正测试的受试者但是在较早的时间点的样品中获得的值。参考水平可以基于大量样品，诸如来自具有相似实龄、性别、疾病状态的受试者群体或其他方面匹配的组，或者基于包括或排除待测样品的样品池。参考水平也可以由代表性数目的来自罹患癌症的不同个体的癌症/肿瘤样品来确定。参考水平也可以由来自罹患癌症或未罹患癌症的个体的生物学样品来确定。来自罹患癌症或未罹患癌症的个体的这些生物学样品可以包括例如组织活检、血液、血浆、血清、粪便样品、尿液、脑脊髓液、巴氏涂片或精液。代表性样品可以包括来自至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个体或者来自个体的癌症/肿瘤生物学样品的测量结果。

相对于参考多肽或抗体序列的序列同一性百分比(％)是候选序列中与参考多肽或抗体序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入缺口后，必要时，要获得最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分数的目的的比对可以通过已知的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech，Inc.)编写，源代码已与用户文档一起归档在华盛顿特区20559的美国版权局中，其中在美国版权注册号TXU510087下进行了注册。该ALIGN-2程序可从加利福尼亚南旧金山的基因泰克公司公开获得，或可以从源代码中进行编译。该ALIGN-2程序应编译为在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且没有变化。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对/与/相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(替代性地这可以用短语表示为对/与/相对于给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序ALIGN-2评定为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，否则本文使用的所有％氨基酸序列一致性值都是使用ALIGN-2计算机程序如刚才前一段所述获得的。

术语“表位”包括能够被抗原结合蛋白诸如抗体结合的任何决定簇。表位是由靶向该抗原的抗原结合蛋白结合的抗原区，并且当抗原是蛋白质时，表位包括直接接触抗原结合蛋白的特定氨基酸。表位最常位于蛋白质上，但在一些情况下可以位于其他种类的分子(诸如糖或脂质)上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。在某些实施例中，本文披露的抗体识别氨基酸的线性序列。在某些实施例中，本文披露的抗体识别氨基酸的构象(非线性)阵列。

本文所述抗体的结构属性

互补决定区(“CDR”)是免疫球蛋白(抗体)可变区的一部分，其主要负责抗体的抗原结合特异性。即使抗体特异性结合相同的靶点或表位，CDR区也从一个抗体到另一个抗体高度可变。重链可变区包括三个CDR区，缩写为VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；轻链可变区包括三个CDR区，缩写为VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。这些CDR区在可变区中连续排列，其中CDR1是最N末端，而CDR3是最C末端。散布在CDR之间的是框架区，其有助于结构并且显示出比CDR区少得多的可变性。重链可变区包括四个框架区，缩写为VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3和VH-FR4；轻链可变区包括四个框架区，缩写为VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和VL-FR4。包括两条重链和轻链的完整的全尺寸二价抗体将包括：12个CDR，其具有三个独特的重链CDR和三个独特的轻链CDR；16个FR区，其具有四个独特的重链FR区和四个独特的轻链FR区。在某些实施例中，本文所述的抗体最少包括三个重链CDR。在某些实施例中，本文所述的抗体最少包括三个轻链CDR。在某些实施例中，本文所述的抗体最少包括三个重链CDR和三个轻链CDR。给定的CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一个来容易地确定，包括Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]，”第5版美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院公共卫生服务(“卡巴特(Kabat)”编号方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273，927-948(“乔西亚(Chothia)”编号方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]262：732-745(1996)，“Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding sitetopography[抗体-抗原相互作用：接触分析和结合位点拓扑图]”(“接触”编号方案)；Lefranc MP等人，“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains[IMGT独特的免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域编码]，”Dev Comp Immunol[发育与比较免疫学]，2003年1月；27(1)：55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegger A和Plückthun A，“Yetanother numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automaticmodeling and analysis tool[免疫球蛋白可变结构域的又另一种编号方案：自动建模和分析工具]，”J Mol Biol[分子生物学杂志]，2001年6月8日；309(3)：657-70(“Aho”编号方案)所述的那些。本文从使用不同编号系统提供的可变序列中鉴定出CDR，本文中使用卡巴特、IMGT、乔西亚编号系统或这三种的任何组合。给定CDR或FR的边界可能会有所不同，取决于用于鉴定的方案。例如，卡巴特方案基于结构比对，而乔西亚方案基于结构信息。卡巴特和乔西亚方案的编号均基于最常见的抗体区序列长度，通过插入字母(例如“30a”)进行插入，并且一些抗体中显现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“indel”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。接触方案基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与乔西亚编号方案相似。在某些实施例中，由本文披露的可变区定义的CDR包括根据乔西亚、卡巴特、IMGT、接触(Contact)或Aho方法或其任何组合定义的那些。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其涉及抗体与抗原的结合。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包括四个保守框架区(FR)和三个CDR(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology[Kuby免疫学]，第六版，W.H.Freeman and Co.[W.H.弗里曼公司]，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库(参见例如，Portolano等人，J.Immunol.[免疫学杂志]150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature[自然]352：624-628(1991))。在某些实施例中，本文所述的抗体包括大鼠来源的可变区。在某些实施例中，本文所述的抗体包括大鼠来源的CDR。在某些实施例中，本文所述的抗体包括小鼠来源的可变区。在某些实施例中，本文所述的抗体包括小鼠来源的CDR。

可以在CDR中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在体细胞成熟过程中以高突变率在CDR编码密码子中进行此类改变(参见，例如，Chowdhury，MethodsMol.Biol.[分子生物学方法]207：179-196(2008))，并且可以测试所得变体的结合亲和力。亲和力成熟(例如，使用易错PCR、链改组、CDR随机化或寡核苷酸定向诱变)可用于改善抗体亲和力(参见例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]178：1-37(2001))。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定涉及抗原结合的CDR残基(参见例如Cunningham和Wells Science[科学]，244：1081-1085(1989))。CDR-H3和CDR-L3特别是通常靶向的。替代性地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定该抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。

在某些实施例中，本文所述的抗体除可变区外还包括恒定区。该重链恒定区(C_H)包括四个结构域，缩写为C_H1、C_H2、C_H3和C_H4，位于完整重链多肽的C末端，即可变区的C末端。该轻链恒定区(C_L)比该C_H小得多，且位于完整轻链多肽的C末端，即可变区的C末端。该恒定区是高度保守的，且包括与稍微不同的功能和特性相关的不同同种型。在某些实施例中，该恒定区对于结合靶抗原的抗体是可有可无的。在某些实施例中，该抗体的恒定区、重链和轻链对于抗体结合都是可有可无的。在某些实施例中，本文所述的抗体缺少轻链恒定区、重链恒定区或两者中的一个或多个。大多数单克隆抗体为IgG同种型；进一步分为四个亚类IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。在某些实施例中，本文所述的抗体包括任何IgG亚类。在某些实施例中，该IgG亚类包括IgG₁。在某些实施例中，该IgG亚类包括IgG₂。在某些实施例中，该IgG亚类包括IgG₃。在某些实施例中，该IgG亚类包括IgG₄。

抗体包括负责与补体和Fc受体结合的片段可结晶区(Fc区)。该Fc区包括该抗体分子的C_H2、C_H3和C_H4区。抗体的Fc区负责活化补体和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。该Fc区也有助于抗体的血清半衰期。在某些实施例中，本文所述的治疗性抗体的Fc区包括促进补体介导的细胞裂解的一个或多个氨基酸取代。在某些实施例中，本文所述的治疗性抗体的Fc区包括促进ADCC的一个或多个氨基酸取代。在某些实施例中，本文所述的治疗性抗体的Fc区包括减少补体介导的细胞裂解的一个或多个氨基酸取代。在某些实施例中，本文所述的治疗性抗体的Fc区包括增加该抗体与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代。在某些实施例中，该Fc受体包括FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)或其任何组合。在某些实施例中，本文描述的治疗性抗体的Fc区包括一个或多个氨基酸取代，其增加了该抗体的血清半衰期。在某些实施例中，增加该治疗性抗体的血清半衰期的一个或多个氨基酸取代增加了该抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力。

在临床上有用的抗体通常被“人源化”以降低人类个体的免疫原性。人源化抗体改善了单克隆抗体治疗的安全性和功效。一种人源化的常用方法是在任何合适的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)中产生单克隆抗体，并用人恒定区代替恒定区，以此方式改造的抗体称为“嵌合的”。另一种常见的方法是“CDR移植”，其用人V-FR代替非人V-FR。在CDR移植方法中，除CDR区外的所有残基都是人源的。在某些实施例中，本文所述的抗体是人源化的。在某些实施例中，本文所述的抗体是嵌合的。在某些实施例中，本文所述的抗体是CDR移植的。

确定用治疗性抗LIF抗体进行的治疗的方法

本文描述了包括当来自个体的样品中生物标记物的水平超过参考水平时用治疗性抗LIF抗体治疗个体的方法。样品可以包括血液样品、血浆样品、血清样品、尿液样品、粪便样品或组织样品(例如来自可疑或已知肿瘤的组织活检)。生物标记物可以包括LIF、LIF受体、II型巨噬细胞(M2)细胞的标记物、调节性T细胞的标记物、活化的T细胞、经历抗原的T细胞、细胞毒性T细胞、免疫抑制细胞因子或免疫抑制趋化因子、或磷酸化STAT3或任何其他免疫调节分子。可以通过任何常用的分子或细胞技术来确定生物标记物的水平，诸如但不限于：通过半定量PCR、数字PCR、实时PCR或RNA-seq进行mRNA定量；通过蛋白质印迹、流式细胞术、质谱法、ELISA、免疫荧光或均质蛋白定量测定(例如

)进行蛋白质定量。在某些实施例中，使用对特定生物标记物具有特异性的抗体通过免疫组织化学来确定生物标记物。免疫组织化学可以对来自个体的活检或血液样品进行。使用免疫组织化学，可以确定某种蛋白质的IHC评分，并将其与参考水平或对照样品进行比较。另外地，可以确定生物标记物的组合的蛋白质、mRNA或DNA水平，以告知治疗决策。

在某些实施例中，该生物标记物是LIF。在某些实施例中，已经将用本披露的抗体治疗的个体选择为具有LIF阳性肿瘤/癌症用于治疗。在某些实施例中，该肿瘤是LIF阳性或产生升高水平的LIF。在某些实施例中，与参考值或一组病理学标准相比，确定LIF阳性。在某些实施例中，LIF阳性肿瘤表达衍生该肿瘤的非转化细胞的2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或更多的LIF。在某些实施例中，该肿瘤已获得LIF的异位表达。

LIF蛋白水平可以使用免疫组织化学定量或半定量确定。在某些实施例中，可以在来自个体的样品中计算LIF IHC评分，并且如果IHC评分是或超过约1、5、10、25、50、75、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250，则将治疗性抗LIF抗体施用给个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，该样品是组织样品或组织活检样品。在某些实施例中，可以确定来自个体的样品中的LIF阳性细胞的百分比，并且如果LIF阳性细胞的百分比超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，该样品是组织样品或组织活检样品。该LIF-IHC评分参考水平衍生自至少N个样品的群体中观察到的水平。在某些实施例中，N等于或大于20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多。在某些实施例中，该样品包含相同类型的癌症(例如，定义特定癌症的参考水平)或所有癌症(例如，定义所有癌症的参考水平)。不同类型的癌症可能拥有不同的参考水平，指示成功用h5D8治疗的机会增加，因此，LIF IHC评分对于某些癌症而言可能是特定的。在某些实施例中，LIF IHC评分对于非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和头颈部鳞状细胞癌中的任何一种或多种而言是特定的。

LIF蛋白水平可以使用基于ELISA的测定来定量或半定量确定。在某些实施例中，可以确定来自个体的样品中的LIF蛋白量，并且如果该蛋白量超过1皮克/毫升(pg/mL)、2pg/mL、3pg/mL、4pg/mL、5pg/mL、6pg/mL、7pg/mL、8pg/mL、9pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、30pg/mL、40pg/mL、50pg/mL、60pg/mL、70pg/mL、80pg/mL、90pg/mL，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，可以确定来自个体的样品中的LIF蛋白量，并且如果该蛋白量超过100pg/mL、200pg/mL、300pg/mL、400pg/mL、500pg/mL、600pg/mL、700pg/mL、800pg/mL、900pg/mL、1纳克/毫升(ng/mL)、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，可以确定来自个体的样品中的LIF蛋白量，并且如果该蛋白量超过100皮克/毫升(pg/mL)、200pg/mL、300pg/mL、400pg/mL、500pg/mL、600pg/mL、700pg/mL、800pg/mL、900pg/mL、1纳克/毫升(ng/mL)、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，该样品是血液样品、血浆样品或血清样品。该ELISA参考水平衍生自至少N个样品的群体中观察到的水平。在某些实施例中，N等于或大于20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多。在某些实施例中，该样品包含相同类型的癌症(例如，定义特定癌症的参考水平)或所有癌症(例如，定义所有癌症的参考水平)。不同类型的癌症可能拥有不同的参考水平，指示成功用h5D8治疗的机会增加，因此，LIF ELISA参考对于某些癌症而言可能是特定的。在某些实施例中，LIF ELISA参考对于非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和头颈部鳞状细胞癌中的任何一种或多种而言是特定的。

LIF mRNA水平可以使用实时PCR或RNA-seq定量或半定量确定。在某些实施例中，可以确定LIF mRNA水平，并且如果LIF mRNA水平超过对应于第25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75百分位数的水平，则向该个体施用治疗性抗LIF抗体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。百分位数参考涉及在至少N个样品的群体中观察到的mRNA水平。在某些实施例中，N等于或大于20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多。在某些实施例中，该样品包含相同类型的癌症(例如，定义特定癌症的参考水平)或所有癌症(例如，定义所有癌症的参考水平)。不同类型的癌症可能拥有不同的参考水平，指示成功用h5D8治疗的机会增加，因此，LIF mRNA参考水平对于某些癌症而言可能是特定的。在某些实施例中，LIF mRNA参考水平对于非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和头颈部鳞状细胞癌中的任何一种或多种而言是特定的。

LIF通过与LIF受体和gp130结合而发出信号。在某些实施例中，本文披露的抗体可用于治疗表达LIF受体(CD118)的癌症或肿瘤，直接作用于癌细胞或作用于肿瘤相关骨髓细胞(例如，巨噬细胞或髓源抑制细胞)、基质细胞(癌症相关成纤维细胞)或内皮细胞。肿瘤相关巨噬细胞可以是特异性的免疫抑制巨噬细胞，诸如II型巨噬细胞(M2)。

在某些实施例中，该生物标记物是LIF受体。在某些实施例中，已经将用本披露的抗体治疗的个体选择为具有LIF受体阳性肿瘤/癌症用于治疗。在某些实施例中，已经将用本披露的抗体治疗的个体选择为如通过例如IHC、流式细胞术或mRNA定量评估的具有向肿瘤部位的LIF受体阳性浸润物的个体以进行治疗。这些浸润物可以包括免疫调节细胞，诸如肿瘤相关巨噬细胞、II型巨噬细胞、髓源抑制细胞、肿瘤单核细胞髓源性抑制细胞(M-MDSC)或肿瘤多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSC)。

在某些实施例中，本文披露的抗体可用于治疗表达LIF受体的癌症或肿瘤。LIF受体阳性肿瘤可以通过组织病理学或流式细胞术确定，并且在某些实施例中，其包括以同种型对照的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多结合LIF受体抗体的细胞。在某些实施例中，该肿瘤已经获得了该LIF受体的异位表达。在某个实施例中，该癌细胞是癌症干细胞。在某些实施例中，可以使用抗LIF受体通过免疫组织化学来确定LIF受体阳性肿瘤或癌症。在某些实施例中，确定与一个或多个免疫抑制反应相关细胞群相关的LIF受体蛋白或mRNA的水平。在某些实施例中，该细胞群是骨髓细胞、巨噬细胞、M2细胞、嗜中性粒细胞、髓源抑制细胞、肿瘤M-MDSC或肿瘤PMN-MDSC。

LIF受体蛋白水平可以使用免疫组织化学定量或半定量确定。对LIF受体的IHC测定可以基于样品中所有细胞、样品中所有免疫细胞、样品中所有髓源细胞或样品中所有巨噬细胞上表达的LIF受体。在某些实施例中，可以在来自个体的样品中计算LIF受体IHC评分，并且如果IHC评分是或超过约1、5、10、25、50、75、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250，则将治疗性抗LIF抗体施用给个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，该样品是组织样品或组织活检样品。在某些实施例中，可以确定来自个体的样品中的LIF受体阳性细胞的百分比，并且如果LIF受体阳性细胞的百分比超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，该样品是组织样品或组织活检样品。该LIF受体IHC评分参考水平衍生自至少N个样品的群体中观察到的水平。在某些实施例中，N等于或大于20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多。在某些实施例中，该样品包含相同类型的癌症(例如，定义特定癌症的参考水平)或所有癌症(例如，定义所有癌症的参考水平)。不同类型的癌症可能拥有不同的参考水平，指示成功用h5D8治疗的机会增加，因此，LIF受体IHC评分对于某些癌症而言可能是特定的。在某些实施例中，LIF受体IHC评分对于非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和头颈部鳞状细胞癌中的任何一种或多种而言是特定的。

LIF受体蛋白水平可以使用基于流式细胞术的测定来定量或半定量确定。在某些实施例中，可以确定来自个体的样品中的LIF受体蛋白水平，并且如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，蛋白量是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，该样品是血液样品、血浆样品或血清样品。该流式细胞术参考水平衍生自至少N个样品的群体中观察到的水平。在某些实施例中，N等于或大于20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多。在某些实施例中，该样品包含相同类型的癌症(例如，定义特定癌症的参考水平)或所有癌症(例如，定义所有癌症的参考水平)。不同类型的癌症可能拥有不同的参考水平，指示成功用h5D8治疗的机会增加，因此，LIF流式细胞术参考评分对于某些癌症而言可能是特定的。在某些实施例中，LIF流式细胞术参考对于非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和头颈部鳞状细胞癌中的任何一种或多种而言是特定的。

LIF受体mRNA水平可以使用实时PCR或RNA-seq定量或半定量确定。在某些实施例中，可以确定LIF受体mRNA水平，并且如果LIF受体mRNA水平超过对应于第25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75百分位数的水平，则向该个体施用治疗性抗LIF抗体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。百分位数参考涉及在至少N个样品的群体中观察到的mRNA水平。在某些实施例中，N等于或大于20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多。在某些实施例中，该样品包含相同类型的癌症(例如，定义特定癌症的参考水平)或所有癌症(例如，定义所有癌症的参考水平)。不同类型的癌症可能拥有不同的参考水平，指示成功用h5D8治疗的机会增加，因此，LIF mRNA参考水平对于某些癌症而言可能是特定的。在某些实施例中，LIF mRNA参考水平对于非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和头颈部鳞状细胞癌中的任何一种或多种而言是特定的。

本文描述的并且在用治疗性抗LIF抗体治疗个体的方法中有用的其他生物标记物包括免疫抑制生物标记物。本文显示LIF和LIF受体对于各种免疫调节细胞类型中的信号传导是重要的，因此，免疫抑制生物标记物可以用作潜在治疗成功的指标。这些生物标记物可以独自使用，或与确定LIF和LIF受体水平组合使用。在某些实施例中，如果免疫抑制生物标记物的蛋白质、mRNA或DNA水平超过参考水平，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，如果免疫抑制生物标记物的蛋白质、mRNA或DNA水平超过参考水平并且LIF超过参考水平，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，如果免疫抑制生物标记物的蛋白质、mRNA或DNA水平超过参考水平并且LIF受体超过参考水平，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。

在某些实施例中，LIF、LIF受体和免疫抑制生物标记物的全部三个的组合可以用于选择要治疗的个体。本披露的重要的免疫调节和免疫抑制生物标记物包括与调节性T细胞、活化的T细胞、经历抗原的T细胞、细胞毒性T细胞及其各自功能相关的那些，包括肿瘤相关巨噬细胞释放的或存在于肿瘤微环境中的趋化因子和细胞因子；髓源抑制细胞的标记物、或巨噬细胞(包括M2巨噬细胞)的标记物。在某些实施例中，该生物标记物是作用于T调节细胞的免疫调节分子，诸如共刺激分子、抗原呈递分子、细胞因子或趋化因子。在某些实施例中，作用于T调节细胞的共刺激分子、抗原呈递分子、细胞因子或趋化因子选自以下清单，该清单由以下组成：MHCII、CXCL9、CXCL10、CXCR3、PD-L1、CCL7、CCL2、CCL3和CCL22。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的抗原呈递分子是MHCII。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CXCL9。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CXCL10。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CXCR3。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的共刺激分子是PD-L1。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CCL7。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CCL2。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CCL3。在某些实施例中，该作用于T调节细胞的细胞因子或趋化因子是CCL22。在某些实施例中，如果MHCII水平低于参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，该对照抗体是MHCII的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CXCL9水平低于参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，该对照抗体是CXCL9的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CXCL10水平低于参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，该对照抗体是CXCL10的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CXCR3水平低于参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，该对照抗体是CXCR3的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果PD-L1水平低于参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，该对照抗体是PD-L1的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CCL7水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CCL7是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CCL2水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CCL2是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CCL3水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CCL3是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CCL22水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CCL22是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该免疫抑制生物标记物是M2巨噬细胞标记物。在某些实施例中，该M2巨噬细胞标记物选自以下清单，该清单由以下组成：CD206、CD163、PF4、CTSK、和ARG1。在某些实施例中，该M2巨噬细胞标记物是CD206。在某些实施例中，该M2巨噬细胞标记物是CD163。在某些实施例中，该M2巨噬细胞标记物是PF4。在某些实施例中，该M2巨噬细胞标记物是CTSK。在某些实施例中，该M2巨噬细胞标记物是ARG1。在某些实施例中，如果CD206水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CD206是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CD163水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CD163是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果PF4水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，PF4是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果CTSK水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，CTSK是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果ARG1水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，ARG1是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。免疫抑制生物标记物的蛋白水平可通过蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术或IHC确定；免疫抑制生物标记物的mRNA水平可以通过定量PCR或RNA-seq确定。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。在某些实施例中，如果本文所述的免疫抑制生物标记物的水平超过参考水平，则选择患者用治疗性抗LIF抗体进行治疗。在某些实施例中，如果免疫抑制生物标记物的水平超过参考水平并且LIF超过参考水平，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，如果免疫抑制生物标记物的水平超过参考水平并且LIF受体超过参考水平，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，LIF、LIF受体和免疫抑制生物标记物的全部三个的组合可以用于选择要治疗的个体。

本文描述的并且在确定用治疗性抗LIF抗体对个体进行的治疗的方法中有用的其他生物标记物包括LIF信号传导标记物。在某些实施例中，该LIF信号传导标记物是磷酸化STAT3。在某些实施例中，如果磷酸化STAT3水平超过参考水平，则选择患者进行治疗。在某些实施例中，如果与对照抗体(例如同种型对照)相比，pSTAT3是该对照抗体的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，则将治疗性抗LIF抗体施用给该个体。在某些实施例中，该治疗性抗体是h5D8或其抗原结合片段。

治疗性抗LIF抗体

本文所述的5D8抗体是由用编码人LIF的DNA免疫的大鼠产生的。该抗体的亲本大鼠形式称为r5D8，人源化形式称为h5D8。

5D8

本文所述的抗体是由用编码人LIF的DNA免疫的大鼠产生的。对一种这样的抗体(5D8)进行了克隆和测序，并且该抗体包括具有以下氨基酸序列的CDR(使用Kabat和IMGTCDR编号方法的组合)：对应于SEQ ID NO：1(GFTFSHAWMH)的VH-CDR1、对应于SEQ ID NO：4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)的VH-CDR2、对应于SEQ ID NO：6(TCWEWDLDF)的VH-CDR3、对应于SEQ ID NO：9(RSSQSLLDSDGHTYLN)的VL-CDR1、对应于SEQ ID NO：11(SVSNLES)的VL-CDR2以及对应于SEQ ID NO：13(MQATHAPPYT)的VL-CDR3。该抗体已通过CDR移植被人源化，且该人源化版本被称为h5D8。SEQ ID NO：15和19阐述了V_H和V_L区。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括与SEQ ID NO：1(GFTFSHAWMH)所阐述的至少80％或90％相同的VH-CDR1、与SEQ ID NO：4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)所阐述的至少80％、90％或95％相同的VH-CDR2以及与SEQ ID NO：6(TCWEWDLDF)所阐述的至少80％或90％相同的VH-CDR3。在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括与SEQ ID NO：9(RSSQSLLDSDGHTYLN)所阐述的至少80％或90％相同的VL-CDR1、与SEQ ID NO：11(SVSNLES)所阐述的至少80％相同的VL-CDR2以及与SEQ ID NO：13(MQATHAPPYT)所阐述的至少80％或90％相同的VL-CDR3。在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括SEQ ID NO：1(GFTFSHAWMH)所阐述的VH-CDR1、SEQ ID NO：4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)所阐述的VH-CDR2、SEQ ID NO：6(TCWEWDLDF)所阐述的VH-CDR3、SEQ ID NO：9(RSSQSLLDSDGHTYLN)所阐述的VL-CDR1、SEQ ID NO：11(SVSNLES)所阐述的VL-CDR2以及SEQ ID NO：13(MQATHAPPYT)所阐述的VL-CDR3。在本披露的CDR的氨基酸序列中设想了某些保守氨基酸取代。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：1、4、6、9、11和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：1、4、6、9、11和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸，且不会对结合亲和力造成大于10％、20％或30％的影响。在某些实施例中，特异性结合LIF的抗体包括一个或多个人重链框架区。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括与SEQ ID NO：1(GFTFSHAWMH)所阐述的至少80％或90％相同的VH-CDR1氨基酸序列、与SEQ ID NO：4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)所阐述的至少80％、90％或95％相同的VH-CDR2氨基酸序列、以及与SEQ ID NO：8(TSWEWDLDF)所阐述的至少80％或90％相同的VH-CDR3氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括与SEQ ID NO：9(RSSQSLLDSDGHTYLN)所阐述的至少80％或90％相同的VL-CDR1氨基酸序列、与SEQ ID NO：11(SVSNLES)所阐述的至少80％相同的VL-CDR2氨基酸序列以及与SEQ ID NO：13(MQATHAPPYT)所阐述的至少80％或90％相同的VL-CDR3氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括SEQ ID NO：1(GFTFSHAWMH)所阐述的VH-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4(QIKAKSDDYATYYAESVKG)所阐述的VH-CDR2氨基酸序列、SEQ IDNO：8(TSWEWDLDF)所阐述的VH-CDR3氨基酸序列、SEQ ID NO：9(RSSQSLLDSDGHTYLN)所阐述的VL-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：11(SVSNLES)所阐述的VL-CDR2氨基酸序列以及SEQ IDNO：13(MQATHAPPYT)所阐述的VL-CDR3氨基酸序列。在本披露的CDR的氨基酸序列中设想了某些保守氨基酸取代。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：1、4、8、9、11和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：1、4、8、9、11和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸，且不会对结合亲和力造成大于10％、20％或30％的影响。

在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链可变区，该人源化重链可变区包括与SEQ ID NO：14、15或17中任一项所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链可变区，该人源化重链可变区包括SEQ ID NO：14、15和17中任一项所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化轻链可变区，该人源化轻链可变区包括与SEQ ID NO：18-21中任一项所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化轻链可变区，该人源化轻链可变区包括SEQ ID NO：18-21中任一项所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，该抗体特异性结合人LIF。

在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链可变区，该人源化重链可变区包括与SEQ ID NO：15所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链可变区，该人源化轻链可变区包括与SEQ ID NO：19所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链可变区，该人源化重链可变区包括SEQ ID NO：15所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链可变区，其包括SEQ ID NO：19所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链可变区，该人源化重链可变区包括与SEQ ID NO：38所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链可变区，该人源化轻链可变区包括与SEQ ID NO：19所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链可变区，该人源化重链可变区包括SEQ ID NO：38所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链可变区，其包括SEQ ID NO：19所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括与SEQ ID NO：30-33中任一项所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括与SEQ IDNO：34-37中任一项所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括SEQ ID NO：30-33中任一项所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括SEQ ID NO：34-37中任一项所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括与SEQ ID NO：31所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链，该人源化轻链包括与SEQ IDNO：35所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括SEQ ID NO：31所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括SEQID NO：35所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括与SEQ ID NO：39所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链，该人源化轻链包括与SEQ ID NO：35所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括SEQ ID NO：39所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括SEQ ID NO：35所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合白血病抑制因子(LIF)的重组抗体，其包括：重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：3所阐述的氨基酸序列；重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO：4所阐述的氨基酸序列；重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：7所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：9所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合白血病抑制因子(LIF)的重组抗体，其包括：重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：2所阐述的氨基酸序列；重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO：5所阐述的氨基酸序列；重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：6所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：10所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：12所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。在本披露的CDR的氨基酸序列中设想了某些保守氨基酸取代。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：2、5、6、10、12和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：2、5、6、10、12和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸，且不会对结合亲和力造成大于10％、20％或30％的影响。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合白血病抑制因子(LIF)的重组抗体，其包括：重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：3所阐述的氨基酸序列；重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO：4所阐述的氨基酸序列；重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：7所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：9所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11所阐述的氨基酸序列；轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。在本披露的CDR的氨基酸序列中设想了某些保守氨基酸取代。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：3、4、7、9、11和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸。在某些实施例中，该抗体包括CDR，其与SEQ ID NO：3、4、7、9、11和13中任一项所阐述的氨基酸序列相差1、2、3或4个氨基酸，且不会对结合亲和力造成大于10％、20％或30％的影响。

在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括与SEQ ID NO：22-25中任一项所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括与SEQ IDNO：26-29中任一项所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括SEQ ID NO：22-25中任一项所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括SEQ ID NO：26-29中任一项所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括与SEQ ID NO：23所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括与SEQ ID NO：27所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括SEQ ID NO：23所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括SEQ ID NO：27中任一项所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括与SEQ ID NO：39所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括与SEQ ID NO：27所阐述的氨基酸序列至少约80％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，本文描述了一种特异性结合LIF的治疗性抗体，其包括人源化重链，该人源化重链包括SEQ ID NO：39所阐述的氨基酸序列；以及人源化轻链，其包括SEQ ID NO：27中任一项所阐述的氨基酸序列。

由治疗上有用的LIF抗体结合的表位

本文描述了人LIF的独特表位，其在被结合时抑制LIF的生物学活性(例如，STAT3磷酸化)且在体内抑制肿瘤生长，并且产生治疗作用。本披露的治疗性抗体可以是不包含h5D8的CDR但是结合至与h5D8相同或相似的表位(氨基酸残基)的治疗性抗体。相似的表位是在指定表位的范围内结合的表位。本文所述的表位由两个不连续的氨基酸片段(从人LIF的残基13到残基32和残基120到138)组成，它们存在于人LIF蛋白的两个不同拓扑域(α螺旋A和C)。这种结合是弱(范德华力吸引)、中等(氢结合)和强(盐桥)相互作用的组合。在某些实施例中，接触残基是LIF上的残基，其与抗LIF抗体上的残基形成氢键。在某些实施例中，接触残基是LIF上的残基，其与抗LIF抗体上的残基形成盐桥。在某些实施例中，接触残基是LIF上的残基，其与抗LIF抗体上的残基形成范德华力并在至少5、4或3埃之内。该治疗性抗体可以结合该表位，结合至该表位的较小形式，或与该表位重叠，并用于本文所述的测定中。

在某些实施例中，本文描述的治疗性抗体是分离的抗体，其结合以下残基中的任何一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个：SEQ ID NO：40的A13、I14、R15、H16、P17、C18、H19、N20、Q25、Q29、Q32、D120、R123、S127、N128、L130、C131、C134、S135或H138。在某些实施例中，本文描述了结合以下所有残基的分离的抗体：SEQ ID NO：40的A13、I14、R15、H16、P17、C18、H19、N20、Q25、Q29、Q32、D120、R123、S127、N128、L130、C131、C134、S135或H138。在某些实施例中，本文描述了结合以下所有残基的分离的抗体：SEQ ID NO：40的A13、I14、R15、H16、P17、C18、H19、N20、Q25、Q29、Q32、D120、R123、S127、N128、L130、C131、C134、S135或H138。在某些实施例中，该抗体仅结合和该抗体一起参与强或中等相互作用的残基。在某些实施例中，该抗体仅结合和该抗体一起参与强相互作用的残基。在某个实施例中，该抗体与LIF的螺旋A和C相互作用。在某个实施例中，该抗体阻断LIF与gp130的相互作用。

治疗适应症

在某些实施例中，本文披露的治疗性抗体抑制细胞中的LIF信号传导。在某些实施例中，用于在血清饥饿条件下在U-251细胞中生物抑制该抗体的IC₅₀小于或等于约100、75、50、40、30、20、10、5或1纳摩尔。在某些实施例中，用于在血清饥饿条件下在U-251细胞中生物抑制该抗体的IC₅₀小于或等于约900、800、700、600、500、400、300、200或100纳摩尔。

在某些实施例中，本文披露了可用于治疗癌症或肿瘤的抗体。在某些实施例中，该癌症包括乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾脏、肾脏、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸和肝肿瘤。在某些实施例中，可以用本发明的抗体治疗的肿瘤包括腺瘤、腺癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和/或畸胎瘤。在某些实施例中，该肿瘤/癌症选自以下的组：肢端雀斑痣性黑素瘤、光化性角化病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞肿瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细管类癌、癌、癌肉瘤、胆管癌、软骨肉瘤、囊腺瘤、皮内窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室间隔肉瘤、尤文肉瘤、局灶性结节性增生、胃腺瘤、生殖细胞系肿瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝脏腺癌、肝细胞癌、胰岛素瘤(insulinite)、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、平滑肌肉瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、间皮瘤、粘液表皮样癌、髓性白血病、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头浆液性腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、前列腺癌、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌性肿瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑素瘤、疣状癌、阴道/外阴癌、血管活性肠肽瘤(VIPpoma)和威尔姆氏瘤(Wilm’stumor)。在某些实施例中，要用一种或多种本发明的抗体治疗的肿瘤/癌症包括脑癌、头颈癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病、前B细胞急性淋巴母细胞性白血病、膀胱癌、星形细胞瘤(优选II、III或IV级星形细胞瘤)、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、小细胞癌和非小细胞癌(优选非小细胞肺癌)、肺腺癌、转移性黑素瘤、非雄激素依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖性转移性前列腺癌、前列腺腺癌和乳腺癌(优选乳腺导管癌和/或乳腺癌)。在某些实施例中，用本披露的抗体治疗的癌症包括胶质母细胞瘤。在某些实施例中，用本披露的一种或多种抗体治疗的癌症包括胰腺癌。在某些实施例中，用本披露的一种或多种抗体治疗的癌症包括卵巢癌。在某些实施例中，用本披露的一种或多种抗体治疗的癌症包括肺癌。在某些实施例中，用本披露的一种或多种抗体治疗的癌症包括前列腺癌。在某些实施例中，用本披露的一种或多种抗体治疗的癌症包括结肠癌。在某些实施例中，所治疗的癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌。在某个实施例中，该癌症对其他治疗是难治的。在某个实施例中，该治疗的癌症是复发的。在某个实施例中，该癌症是复发/难治性胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌或肺癌。在某些实施例中，该癌症包括晚期实体瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、皮肤癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肾癌、食道癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、淋巴瘤或软组织癌。在某些实施例中，该癌症包括非小细胞肺癌、上皮性卵巢癌或胰腺腺癌。在某些实施例中，该癌症包括晚期实体瘤。

治疗方法

在某些实施例中，这些治疗性抗体可以通过适合于施用含抗体的药物组合物的任何途径来施用，诸如像皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、肿瘤内或脑内等。在某些实例中，静脉内施用这些抗体。在某些实施例中，以合适的剂量时间表，例如每周、每周两次、每月、每月两次等施用该抗体。在某些实施例中，每三周一次施用该抗体。可以任何治疗有效量施用该抗体。在某些实施例中，该治疗上可接受的量为约0.1mg/kg与约50mg/kg之间。在某些实施例中，该治疗上可接受的量为约1mg/kg与约40mg/kg之间。在某些实施例中，该治疗上可接受的量为约5mg/kg与约30mg/kg之间。该治疗性抗体可以平剂量施用，而与h5D8抗体所施用个体的体重或质量无关。不论施用该治疗性抗体的个体的体重或质量如何，均可以平剂量施用该h5D8抗体，条件是该个体的质量至少约为37.5千克。可以从约75毫克至约2000毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以从约225毫克至约2000毫克、约750毫克至约2000毫克、约1125毫克至约2000毫克或约1500毫克至约2000毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以约75毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以约225毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以约750毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以约1125毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以约1500毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以约2000毫克施用平剂量的治疗性抗体。

预期治疗性抗体的其他剂量。可以约50、100、150、175、200、250、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2025、2050、2075或2100毫克施用平剂量的治疗性抗体。可以每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用这些剂量中的任何一种。

可以基于被施用治疗性抗体的个体的体重或质量的剂量来施用该治疗性抗体。可以从约1mg/kg至约25mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。可以从约3mg/kg至约25mg/kg、约10mg/kg至约25mg/kg、约15mg/kg至约25mg/kg或约20mg/kg至约25mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。可以约1mg/kg施用体重调整剂量的h5D8。可以约3mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。可以约10mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。可以约15mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。可以约20mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。可以约25mg/kg施用体重调整剂量的治疗性抗体。

本文详述的任何剂量均可在至少约60分钟的时间段内静脉内施用；但是，根据与每个个体施用相关的条件，此时间段可能会多少有所不同。

药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂

在某些实施例中，本披露的抗体悬浮在无菌溶液中施用。在某些实施例中，该溶液包括生理上合适的盐浓度(例如，NaCl)。在某些实施例中，该溶液包括约0.6％与1.2％之间的NaCl。在某些实施例中，该溶液包括约0.7％与1.1％之间的NaCl。在某些实施例中，该溶液包括约0.8％与1.0％之间的NaCl。在某些实施例中，可以在约0.9％NaCl中稀释抗体的高度浓缩的母液。在某些实施例中，该溶液包括约0.9％NaCl。在某些实施例中，该溶液进一步包括以下一项或多项：缓冲液，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如，聚山梨酯80(吐温80)、聚山梨酯20(吐温20)、聚山梨酯和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如，葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖酐40；氨基酸，例如，组氨酸、甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如，抗坏血酸、蛋氨酸；以及螯合剂，例如，EGTA或EGTA。在某些实施例中，本披露的抗体在施用前被冻干运输/储存和重构。在某些实施例中，冻干的抗体配制品包括增量剂，诸如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖酐40。在某个实施例中，本披露的抗LIF抗体可以作为浓缩的母液运输和储存，在治疗部位使用时对该母液进行稀释。在某些实施例中，该母液包括约25mM组氨酸、约6％蔗糖、约0.01％聚山梨酸酯和约20mg/mL的抗LIF抗体。在某些实施例中，溶液的pH是约6.0。在某些实施例中，施用给个体的形式是包括约25mM组氨酸、约6％蔗糖、约0.01％聚山梨酯80和约20mg/mL h5D8抗体的水溶液。在某些实施例中，溶液的pH是约6.0。

实例

以下说明性实例代表了本文所述的组合物和方法的实施例，并不意味着以任何方式进行限制。

实例1-对LIF具有特异性的大鼠抗体的产生

将编码人LIF的氨基酸23-202的cDNA克隆到表达质粒(阿尔德弗龙公司(AldevronGmbH)，弗莱堡，德国)中。使用手持式粒子轰击装置(“基因枪”)，通过皮内施用涂有DNA的金粒子对各组实验大鼠(威斯达(Wistar))进行免疫。用识别添加到LIF蛋白N末端的标签的抗标签抗体证实了瞬时转染的HEK细胞上的细胞表面表达。一系列免疫后收集血清样品，并在流式细胞术中对用上述表达质粒瞬时转染的HEK细胞进行测试。分离产生抗体的细胞，并根据标准程序与小鼠骨髓瘤细胞(Ag8)融合。如上所述，通过在流式细胞术测定中进行筛选来鉴定产生对LIF具有特异性的抗体的杂交瘤。使用RNA保护剂(RNAlater，目录号AM7020，赛默飞世尔科技公司)制备阳性杂交瘤细胞的细胞沉淀，并进一步处理以用于抗体可变结构域的测序。

实例2-对LIF具有特异性的小鼠抗体的产生

将编码人LIF的氨基酸23-202的cDNA克隆到表达质粒(阿尔德弗龙公司(AldevronGmbH)，弗莱堡，德国)中。使用手持式粒子轰击装置(“基因枪”)，通过皮内施用涂有DNA的金粒子对各组实验小鼠(NMRI)进行免疫。用识别添加到LIF蛋白N末端的标签的抗标签抗体证实了瞬时转染的HEK细胞上的细胞表面表达。一系列免疫后收集血清样品，并在流式细胞术中对用上述表达质粒瞬时转染的HEK细胞进行测试。分离产生抗体的细胞，并根据标准程序与小鼠骨髓瘤细胞(Ag8)融合。如上所述，通过在流式细胞术测定中进行筛选来鉴定产生对LIF具有特异性的抗体的杂交瘤。使用RNA保护剂(RNAlater，目录号AM7020，赛默飞世尔科技公司)制备阳性杂交瘤细胞的细胞沉淀，并进一步处理以用于抗体可变结构域的测序。

实例3-对LIF具有特异性的大鼠抗体的人源化

从大鼠免疫中选择一个克隆(5D8)用于随后的人源化。使用标准CDR移植方法进行人源化。使用标准分子克隆技术从5D8杂交瘤中克隆出重链和轻链区，并通过Sanger方法测序。然后针对人的重链和轻链可变序列进行BLAST搜索，并从每个可变序列中选择4个序列作为用于人源化的受体框架。将这些受体框架去免疫化以除去T细胞反应表位。将5D8的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3克隆到4个不同的重链受体框架(H1至H4)和4个不同的轻链框架(L1至L4)中。然后对所有16种不同的抗体测试：在CHO-S细胞(斯莱希斯(Selexis))中的表达；LIF诱导的STAT3磷酸化的抑制；以及通过表面等离子体共振(SPR)的结合亲和力。这些实验总结于表1中。

细胞培养10天后，在分批补料培养中的锥形瓶中(接种3x10⁵个细胞/mL，200mL培养体积)比较转染细胞的表达性能。在这一点上，收获细胞并使用蛋白A柱纯化分泌的抗体，然后定量。所有人源化抗体均表达，但使用H3重链的抗体除外。与其他可变区(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19)相比，H2和L2可变区表现良好。

通过蛋白质印迹确定在酪氨酸705上LIF诱导的STAT3磷酸化的抑制。将U251神经胶质瘤细胞以100,000个细胞/孔的密度铺板在6孔板中。在进行任何治疗之前，将细胞在完全培养基中培养24小时，之后将血清饥饿8小时。之后，将含有指示抗体的细胞以10μg/ml的浓度过夜。治疗后，在包含放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液的磷酸酶和蛋白酶抑制剂中获得蛋白质，进行定量(BCA蛋白质测定，赛默飞世尔科技公司)并用于蛋白质印迹。对于蛋白质印迹，将膜在5％脱脂奶粉-TBST中阻断1小时，并与一抗孵育过夜(p-STAT3，目录号9145，细胞信号传导公司(Cell Signaling)或STAT3，目录号9132，细胞信号传导公司)或30分钟(β-肌动蛋白过氧化物酶，目录号A3854，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。然后将膜用TBST洗涤，与二抗一起孵育并再次洗涤。通过化学发光检测蛋白质(SuperSignal底物，目录号34076，赛默飞世尔科技公司)。这些结果示出于图1中。pSTAT3条带越黑，抑制作用越小。在标记为5D8(非人源化大鼠)、A(H0L0)、C(H1L2)、D(H1L3)和G(H2L2)的泳道中，抑制作用较高；在H(H2L3)、O(H4L2)和P(H4L3)中抑制作用中等；在B(H1L1)、E(H1L4)、F(H2L1)、I(H2L4)、N(H4L1)和Q(H4L4)中没有抑制作用。

然后通过SPR分析展现出抑制LIF诱导的STAT3磷酸化的抗体，以确定结合亲和力。简而言之，使用Biacore^TM 2002仪器观察到了A(H0L0)、C(H1L2)、D(H1L3)和G(H2L2)、H(H2L3)和O(H4L2)人源化抗体与胺偶联的hLIF的结合。在六个配体浓度下，通过在所有传感器芯片表面上生成的所有传感图的数学传感图拟合(朗格缪尔相互作用模型[A+B＝AB])确定动力学常数和亲和力。将每个浓度的最佳拟合曲线(最小Chi2)用于计算动力学常数和亲和力。参见表1。

由于实验设置使用二价抗体作为分析物，因此还根据二价分析物拟合模型[A+B＝AB；AB+B＝AB2]分析最佳拟合传感图，以便获得对人源化抗体的靶标结合机制的更详细见解。使用二价拟合模型[A+B＝AB；AB+B＝AB2]进行的动力学传感图分析证实了mAb样品的相对亲和力分级。

包括H2和L2的人源化5D8因其高结合亲和力和高分批培养产率，而被选作更深入的分析。

实例4-克隆5D8的人源化改善了与LIF的结合

选择H2L2克隆(h5D8)进行进一步分析，并通过SPR比较与亲本大鼠5D8(r5D8)和小鼠克隆1B2的结合。该1B2抗体是先前披露的小鼠抗LIF抗体，先前存放于DeutscheSammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM ACC3054)，并用于比较目的。分别将从大肠杆菌和HEK-293细胞中纯化的重组人LI用作配体。使用胺偶联化学将人或大肠杆菌来源的LIF共价偶联至Biacore光学传感器芯片的表面，并根据动力学常数计算结合亲和力。

材料和方法

来自大肠杆菌的人LIF获自密理博公司(Millipore)，参考号LIF 1010；来自HEK-293细胞的人LIF获自ACRO生物系统公司(ACROBiosystems)，参考LIF-H521b。使用Biacore胺偶联试剂盒(BR-1000-50；GE医疗集团(GE-Healthcare)，乌普萨拉)，将LIF与传感器芯片偶联。使用CM5光学传感器芯片(BR-1000-12；GE医疗集团，乌普萨拉)在Biacore^TM 2002仪器上运行样品。在机器运行(BR-1001-88；GE医疗集团，乌普萨拉)期间使用Biacore HBS-EP缓冲液。结合传感图的动力学分析是使用BIAevaluation 4.1软件进行的。在分析物浓度渐增的情况下，通过在所有传感器芯片表面上生成的所有传感图的数学传感图拟合(朗格缪尔相互作用模型[A+B＝AB])确定动力学常数和亲和力。传感图也根据二价分析物传感器图拟合模型[A+B＝AB；AB+B＝AB₂]进行分析，包括成分分析，以便生成对确定的朗格缪尔抗体-靶亲和力(例如亲和力贡献)的二价贡献的估计。将每个浓度的最佳拟合曲线(最小Chi²)用于计算动力学常数和亲和力。这些亲和力实验的概览示于表2(在大肠杆菌中制成的人LIF)和表3(在HEK293细胞中制成的人LIF)。

来自这组实验的朗格缪尔1∶1传感图拟合模型指示，人源化5D8(h5D8)抗体与人LIF的亲和力是小鼠1B2和r5D8的约10-25倍。

接下来，通过SPR针对多个物种的LIF测试了h5D8抗体。对源自不同物种和表达系统的重组LIF分析物进行了h5D8 SPR结合动力学：人LIF(大肠杆菌，HEK293细胞)；小鼠LIF(大肠杆菌，CHO细胞)；大鼠LIF(大肠杆菌)；食蟹猴LIF(酵母，HEK293细胞)。

材料和方法

该h5D8抗体通过非共价Fc特异性捕获固定在传感器芯片表面。重组的Ig(Fc)特异性金黄色葡萄球菌蛋白A/G被用作捕获剂，从而可以将抗LIF抗体在空间上均匀且灵活地呈递给LIF分析物。LIF分析物的来源如下：人LIF(来自大肠杆菌；密理博参考号LIF 1050)；人LIF(来自HEK细胞，ACRO生物系统公司LIF-H521)；小鼠LIF(大肠杆菌；密理博公司目录号NF-LIF2010)；小鼠LIF(来自CHO细胞；瑞普罗金公司(Reprokine)目录号RCP09056)；猴LIF(酵母，翠丰生物技术公司(Kingfisher Biotech)目录号RP1074Y)；HEK-293细胞中产生的猴LIF。总体而言，h5D8展现出与几种物种的LIF结合。该亲和力实验的概览示于表4中。

实例5-人源化克隆5D8在体外抑制LIF诱导的STAT3磷酸化

为了确定h5D8的生物学活性，在LIF活化的细胞培养模型中测试了人源化和亲本形式。图2A示出了当神经胶质瘤细胞系与人LIF一起孵育时，人源化克隆展现对STAT3磷酸化(Tyr 705)的抑制作用增加。图2B示出了用不同稀释度的h5D8抗体重复进行的图2A相同设置的实验。

方法

将U251神经胶质瘤细胞以150,000个细胞/孔的密度铺板在6孔板中。在进行任何治疗之前，将细胞在完全培养基中培养24小时。之后，用r5D8抗LIF抗体或h5D8抗LIF抗体以10μg/ml的浓度过夜治疗或不治疗(对照细胞)。

治疗后，在包含放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液的磷酸酶和蛋白酶抑制剂中获得蛋白质，进行定量(BCA蛋白质测定，赛默飞世尔科技公司)并用于蛋白质印迹。对于蛋白质印迹，将膜在5％脱脂乳-TBST中阻断1小时，并与一抗孵育过夜(p-STAT3，目录号9145，细胞信号传导公司或STAT3，目录号9132，细胞信号传导公司)或30分钟(β-肌动蛋白过氧化物酶，目录号A3854，西格玛奥德里奇公司)。然后将膜用TBST洗涤，必要时与二抗一起孵育，并再次洗涤。通过化学发光检测蛋白质(SuperSignal底物，目录号34076，赛默飞世尔科技公司)。

实例6-U-251细胞中LIF的内源性水平的h5D8抗体治疗的IC₅₀值。

确定了在血清饥饿条件下在U-251细胞中对h5D8的生物抑制作用的IC₅₀低至490皮摩尔(图3A)。参见图3A和3B和表5的代表性结果。

方法

将该U-251细胞以每6cm板600,000个细胞接种(每种条件)。在血清饥饿(0.1％FBS)下，在37℃下用h5D8以相应的浓度(滴定)处理细胞过夜。作为pSTAT3的阳性对照，将重组LIF(R&D#7734-LF/CF)用于在37℃以1.79nM刺激细胞10分钟。作为pSTAT3的阴性对照，将JAK I抑制剂(Calbiochem#420099)用于在37℃以1uM使用30分钟。然后按照Meso ScaleDiscovery多点检测系统总STAT3(目录号K150SND-2)和Phospho-STAT3(Tyr705)(目录号K150SVD-2)试剂盒的方案在冰上收获细胞作为裂解物，以测量通过MSD Meso Sector S600可检测的蛋白水平。

实例7-与人LIF特异性结合的其他抗体

鉴定了特异性结合人LIF的其他大鼠抗体克隆(10G7和6B5)，其结合特征的概览显示在下表6中，将克隆1B2用作比较。

方法

使用重组LIF靶蛋白[人LIF(大肠杆菌)；密理博公司目录号LIF 1010和人LIF(HEK293细胞)；ACRO生物系统公司目录号LIF-H521b]作为分析物，对固定在CM5光学传感器芯片表面的抗LIF mAb 1B2、10G7和6B5进行动力学实时结合测定。

动力学常数和亲和力是通过使用朗格缪尔1∶1结合模型应用全局(传感图集的同时拟合)以及单曲线拟合算法通过数学传感图拟合获得的。通过k_obs分析评估全局拟合的合理性。

实例8-其他抗LIF抗体在体外抑制LIF诱导的STAT3磷酸化

测试了其他克隆在细胞培养物中抑制LIF诱导的STAT3磷酸化的能力。如图4所示，与1B2克隆相比，克隆10G7和先前详述的r5D8展现出对LIF诱导的STAT3磷酸化的高度抑制。包括抗LIF多克隆抗血清(阳性)作为阳性对照。尽管6B5没有展现出抑制作用，这可能是由于6B5与本实验中使用的未糖基化LIF的结合可能缺乏。

方法

将患者来源的神经胶质瘤细胞以150,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中。在任何治疗之前，在补充有B27(生命技术公司(Life Technologies))、青霉素/链霉素和生长因子(20ng/ml EGF和20ng/ml FGF-2[派普泰克公司(PeproTech)])的神经元基础培养基(Neurobasal medium)(生命技术公司)组成的GBM培养基中培养细胞24小时。第二天，是否用大肠杆菌中产生的重组LIF或重组LIF和该指示抗体的混合物处理细胞15分钟(抗体的最终浓度为10μg/ml，重组LIF的最终浓度为20ng/ml)。治疗后，在包含放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液的磷酸酶和蛋白酶抑制剂中获得蛋白质，进行定量(BCA蛋白质测定，赛默飞世尔科技公司)并用于蛋白质印迹。对于蛋白质印迹，将膜在5％脱脂乳-TBST中阻断1小时，并与一抗孵育过夜(p-STAT3，目录号9145，细胞信号传导公司)或30分钟(β-肌动蛋白过氧化物酶，目录号A3854，西格玛奥德里奇公司)。然后将膜用TBST洗涤，必要时与二抗一起孵育，并再次洗涤。通过化学发光检测蛋白质(SuperSignal底物，目录号34076，赛默飞世尔科技公司)。

实例9-LIF在多种肿瘤类型中高度过表达

对多种人肿瘤类型进行了免疫组织化学实验，以确定LIF表达的程度。如图5所示，LIF在多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠直肠癌(CRC)和胰腺肿瘤中高表达。

实例10-人源化克隆h5D8在非小细胞肺癌小鼠模型中抑制肿瘤生长

为了确定人源化5D8克隆在体内抑制LIF阳性癌症的能力，在非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠模型中测试了该抗体。图6示出了与媒介物阴性对照相比，用该抗体治疗的小鼠的肿瘤生长降低。

方法

具有高LIF水平的鼠非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系KLN205被表达萤火虫萤光素酶基因的慢病毒稳定感染，用于体内生物发光监测。为了建立小鼠模型，通过肋间穿刺将5x10⁵个KLN205非小细胞肺癌(NSCLC)细胞原位植入8周龄免疫感受态同系DBA/2小鼠的左肺中。每周两次用对照媒介物或用15mg/kg或30mg/kg的h5D8抗体腹膜内治疗小鼠，且通过生物发光监测肿瘤的生长。对于生物发光成像，小鼠在1％-2％吸入异氟烷麻醉下接受了0.2mL 15mg/mL D-萤光素的腹膜内注射。使用IVIS系统2000系列(精诺真公司(XenogenCorp.)，阿拉米达，加利福尼亚州，美国)监测生物发光信号，其由高灵敏度的冷却CCD相机组成。使用Living图像软件(精诺真公司)对成像数据进行网格化，且在每个框状区域中整合总生物发光信号。使用目的区域(ROI)中的总光子通量发射(光子/秒)分析数据。结果证明用h5D8抗体治疗促进肿瘤消退。数据呈现为平均值±SEM。

实例11-h5D8在多形性胶质母细胞瘤小鼠模型中抑制肿瘤生长

在使用表达萤光素酶的人细胞系U251的原位GBM肿瘤模型中，r5D8显著降低每周两次腹膜内(IP)注射施用300μg r5D8和h5D8的小鼠的肿瘤体积。该研究的结果示于图7A中(治疗后第26天的定量)。该实验还使用200μg或300μg人源化h5D8治疗小鼠进行，治疗7天后显示出统计学上显著的肿瘤减少。

方法

收获稳定表达萤光素酶的U251细胞，在PBS中洗涤，以400g离心5分钟，重悬于PBS中，并用自动细胞计数器(Countess，英杰公司(Invitrogen))计数。将细胞保持在冰上以维持最佳生存力。腹膜内注射氯胺酮

/木糖胺

(分别为75mg/kg和10mg/kg)麻醉小鼠。将每只小鼠小心地放置在立体定向设备中并固定。用脱毛膏去除头部的头发，并用解剖刀切开头部皮肤以露出头骨。用钻头小心地在λ侧面1.8mm，前面1mm的位置上做一个小切口。使用Hamilton 30G注射器将5μL细胞接种到深度为2.5mm的右纹体中。用Hystoacryl组织粘合剂(博朗公司(Braun))闭合头部切口，并给小鼠注射皮下镇痛药美洛昔康

(1mg/kg)。植入每只小鼠的最终细胞数为3x10⁵。

每周两次腹膜内施用h5D8治疗小鼠。肿瘤细胞接种后立即在第0天开始治疗。小鼠共接受2剂h5D8或媒介物对照。

体重和肿瘤体积：测量体重2次/周，且在第7天通过生物发光定量肿瘤生长(精诺真公司IVIS光谱)。为了定量体内的生物发光活性，使用异氟烷麻醉小鼠，且腹膜内注射萤光素底物(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))(167μg/kg)。

在第7天评估通过生物发光(精诺真公司IVIS光谱)确定的肿瘤大小。计算每个治疗组的个体肿瘤测量和平均值±SEM。由未配对的非参数Mann-Whitney U检验确定统计显著性。

实例12-h5D8在卵巢癌小鼠模型中抑制肿瘤生长

在其他两个同系肿瘤模型中评估r5D8的功效。在卵巢原位肿瘤模型ID8中，按腹部体积测量，每周两次腹膜内施用300μg r5D8显著抑制肿瘤生长(图8A和8B)。图8C的结果示出了h5D8在200μg及以上的剂量下也减少了肿瘤体积。

方法

在补充有10％胎牛血清(FBS)(Gibco，英杰公司)、40U/mL青霉素和40μg/mL链霉素(PenStrep)(Gibco，英杰公司)和0.25μg/mL血浆霉素(Plasmocin)(因韦真公司(Invivogen))的杜尔贝科氏改良伊格培养基(DMEM)中培养ID8细胞。

收获ID8细胞，在PBS中洗涤，以400g离心5分钟，并且重悬于PBS中。将细胞置于冰上以保持最佳生存力，并用27G针腹膜内注射200μL细胞悬液。植入小鼠体内的最终细胞数为5x10⁶。

每周两次按照指示的不同剂量经腹膜内施用h5D8对小鼠进行治疗。测量体重2次/周，且通过使用卡尺(飞世尔科技公司(FisherScientific))测量腹围来监测肿瘤的进展。

实例13-r5D8在结肠直肠癌小鼠模型中抑制肿瘤生长

在患有皮下结肠CT26肿瘤的小鼠中，r5D8(每周两次腹膜内施用300μg)显著抑制了肿瘤的生长(图9A和9B)。

方法

在补充有10％胎牛血清(FBS)、40U/mL青霉素和40μg/mL链霉素(PenStrep)和0.25μg/mL血浆霉素的洛斯维公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培养基(RPMI[Gibco，英杰公司])中培养CT26细胞。

用胰蛋白酶消化CT26细胞(8x10⁵)，用PBS冲洗，以400g离心5分钟，并且重悬于100μL PBS中。将细胞置于冰上以避免细胞死亡。使用27G针通过皮下注射将该CT26细胞施用于小鼠。

从CT26细胞植入后第3天起，每周两次通过腹膜内注射(IP)向小鼠施用300μgr5D8或媒介物对照。

每周测量三次体重和肿瘤体积。使用卡尺(飞世尔科技公司)测量肿瘤体积。

实例14-r5D8减少了肿瘤模型中的炎性浸润

如图10A所示，在U251 GBM原位模型中，在用r5D8治疗的肿瘤中CCL22(M2极化巨噬细胞的标记物)的表达显著降低。如图10B所示，在使用r5D8的生理相关器官型组织切片培养模型中也证实了这一发现，其中三个患者样品在治疗后CCL22和CD206(MRC1)表达(也是M2巨噬细胞的标记物)显著降低(比较MRC1和CCL22的上限(对照)和下限(经治疗))。此外，r5D8还降低了免疫感受态小鼠中同系ID8(图10C)和CT26(图10D)肿瘤中的CCL22⁺M2巨噬细胞。

实例15-r5D8增加非骨髓效应细胞

为了研究其他免疫机制，评估了r5D8对肿瘤微环境内T细胞和其他非骨髓免疫效应细胞的作用。如图11A所示，在卵巢原位ID8同系模型中，r5D8治疗导致肿瘤内NK细胞增加以及总数和活化的CD4⁺和CD8⁺T细胞增加。如图11B所示，类似地，在结肠同系CT26肿瘤模型中，r5D8增加了瘤内NK细胞，增加了CD4+和CD8+T细胞，且趋向于减少CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-reg细胞。如图11C所示，在r5D8治疗后同系原位KLN205肿瘤模型中还观察到了CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-reg细胞减少的趋势。如图12所示，与T细胞介导功效的要求一致，CT26模型中CD4⁺和CD8⁺T细胞的耗竭抑制了r5D8的抗肿瘤功效。

T细胞耗竭的方法

在补充有10％胎牛血清(FBS[Gibco，英杰公司])、40U/mL青霉素和40μg/mL链霉素(PenStrep[Gibco，英杰公司])和0.25μg/mL血浆霉素(因韦真公司)的RPMI培养基(Gibco，英杰公司)中培养CT26细胞。收集CT26细胞(5x10⁵)，用PBS冲洗，以400g离心5分钟，并且重悬于100μL PBS中。将细胞置于冰上以避免细胞死亡。使用27G注射器通过皮下注射将CT26细胞在两肋施用给小鼠。如研究设计所示，每周两次腹膜内施用r5D8治疗小鼠。如研究设计所述，每周两次通过腹膜内注射(IP)向小鼠施用媒介物对照(PBS)、大鼠r5D8和/或抗CD4和抗CD8。伴随施用所有抗体治疗。

实例16-与人LIF复合的h5D8的晶体结构

将h5D8的晶体结构解析到3.1埃的分辨率，以便确定h5D8与之结合的LIF上的表位，且确定参与结合的h5D8残基。共晶体结构揭示，LIF的N末端环位于h5D8轻链和重链可变区之间的中心位置(图13A)。另外，h5D8与LIF的螺旋A和C上的残基相互作用，从而形成不连续的和构象性的表位。结合是由几种盐桥、H-键和范德华相互作用驱动的(表7，图13B)。LIF的h5D8表位跨越了与gp130相互作用的区域。参见Boulanger，M.J.，Bankovich，A.J.，Kortemme，T.，Baker，D.&Garcia，K.C.Convergent mechanisms for recognition ofdivergent cytokines by the shared signaling receptor gpl30[通过共享的信号传导受体gp130识别不同细胞因子的收敛机制].Molecular cell[分子细胞]12，577-589(2003)。结果总结在下表7中，并在图13中进行了描绘。

方法

将LIF在HEK 293S(Gnt I^-/-)细胞中瞬时表达，并使用Ni-NTA亲和层析纯化，随后在20mM Tris pH 8.0和150mM NaCl中进行凝胶过滤层析。将重组h5D8 Fab在HEK 293F细胞中瞬时表达，并使用KappaSelect亲和层析随后阳离子交换层析进行纯化。将纯化的h5D8Fab和LIF以1∶2.5的摩尔比混合，并在室温下孵育30分钟，之后使用EndoH去糖基化。随后使用凝胶过滤层析纯化复合物。将该复合物浓缩至20mg/mL，并使用稀疏矩阵筛选进行结晶试验。在包含19％(v/v)异丙醇、19％(w/v)PEG 4000、5％(v/v)甘油、0.095M柠檬酸钠pH 5.6的条件下于4℃形成晶体。该晶体在加拿大光源(CLS)的08ID-1光束线上衍射到

的分辨率。根据Kabsch等人Xds.Acta crystallographica.Section D[晶体学报D部分]，Biological crystallography[生物晶体学]66，125-132(2010)，使用XDS收集、处理和缩放数据。根据McCoy等人Phaser crystallographic software[移相器晶体学软件].J ApplCrystallogr[应用晶体学杂志]40，658-674(2007)，使用移相器通过分子置换来确定结构。使用Coot和phenix.refine进行了模型构建和完善的几次迭代，直到结构收敛到可接受的R_工作和R_自由。分别参见Emsley等人Features and development of Coot[Coot的特征和开发].Acta crystallographica.Section D[晶体学报D部分]，Biologicalcrystallography[生物晶体学]66，486-501(2010)；和Adams等人PHENIX：a comprehensivePython-based system for macromolecular structure solution[PHENIX：全面的基于Python的高分子结构解决方案系统].Acta crystallographica.Section D[晶体学报D部分]，Biological crystallography[生物晶体学]66，213-221(2010)。这些数字是在PyMOL(PyMOL分子图形系统，版本2.0，薛定谔有限责任公司(

LLC))中生成的。

实例17-h5D8对LIF具有高特异性

目标是测试h5D8与其他LIF家族成员的结合，以确定结合特异性。当在大肠杆菌中生产两种蛋白质时，使用Octet96分析，h5D8与人LIF的结合比与LIF最高同源性IL-6家族成员制瘤素M(OSM)的结合大约100倍。当两种蛋白都在哺乳动物系统中产生时，h5D8不展现出与OSM的结合。数据汇总于表8中。

方法

Octet结合实验：按照制造商提供的手册使用和制备了试剂。基本动力学实验是使用如下的Octet数据采集软件版本9.0.0.26进行的：传感器/程序的设置：i)平衡(60秒)；ii)加载(15秒)；iii)基线(60秒)；iv)缔合(180秒)；以及v)解离(600秒)

h5D8对细胞因子的Octet亲和力：基本动力学实验是使用如下的Octet数据采集软件版本9.0.0.26进行的：将胺反应性第二代生物传感器(AR2G)在水中水合最低15分钟。h5D8与生物传感器的缀合是根据ForteBio技术说明26(请参阅参考文献)使用胺偶联第二代试剂盒进行的。浸入步骤如下所述在30℃1000rpm下进行：i)水中平衡60秒；ii)在水中20mM ECD，10mM磺基-NHS中活化300秒；iii)将10μg/ml h5D8在pH 6.0的10mM乙酸钠中固定600秒；iv)在1M乙醇胺中(pH 8.5)淬灭300秒；v)在水中基线120秒。然后在30℃，1000rpm下通过以下浸入和读取步骤进行动力学实验：vi)1X动力学缓冲液中基线60秒；vii)在1X动力学缓冲液中缔合适当的细胞因子系列稀释液180秒；viii)在1X动力学缓冲液中解离300秒；ix)三个再生/中和循环分别在10mM甘氨酸pH 2.0和1X动力学缓冲液之间交替(每个5秒，3个循环)。再生后，将生物传感器重新用于随后的结合分析。

由哺乳动物细胞产生的人重组LIF来自ACRO生物系统公司(LIF-H521b)；在哺乳动物细胞中产生的人重组OSM来自R&D(8475-OM/CF)；以及大肠杆菌细胞中生产的人重组OSM来自R&D(295-OM-050/CF)。

实例18-h5D8fab的晶体结构

确定了h5D8 Fab在宽谱化学条件下的五个晶体结构。这些结构的高分辨率指示CDR残基的构象与较小的柔韧性相关，并且在不同的化学环境中高度相似。该抗体的独特特征是在可变重区的第100位存在非典型的半胱氨酸。结构分析表明，半胱氨酸是未配对的，并且在很大程度上是溶剂不可及的。

H5D8 Fab是通过木瓜蛋白酶消化其IgG，随后使用标准亲和力、离子交换和尺寸层析技术进行纯化而获得的。使用气相扩散方法获得晶体，并确定分辨率在

至

之间变动的五个晶体结构。尽管结晶条件跨越五个不同的pH水平变动：5.6、6.0、6.5、7.5和8.5，所有结构均在相同的晶体学空间群中解析，并且具有相似的晶胞尺寸(P212121，

)。这样，这些晶体结构允许比较不受晶体堆积伪像阻碍和跨越宽谱化学条件的h5D8 Fab三维布置。

观察所有互补决定区(CDR)残基的电子密度，随后对其进行建模。值得注意的是，LCDR1和HCDR2采用了细长的构型，与浅LCDR3和HCDR3区域一起在互补位的中心形成了一个结合槽(图14A)。这五个结构在所有残基上都非常相似，所有原子的均方根偏差在

与

之间变动(图14A)。这些结果指示，CDR残基的构象在各种化学环境中均得到保持，包括pH水平在5.6与8.5之间变动以及离子强度在150mM与1M之间变动。对h5D8互补位的静电表面的分析揭示，带正电和带负电区同样有助于亲水性，没有普遍的疏水性斑块。h5D8在HCDR3(Cys100)的碱基上具有非典型的半胱氨酸的罕见特征。在所有五个结构中，该游离半胱氨酸是有序的，不会形成任何二硫键错配。另外地，它不被Cys(半胱氨酸化)或谷胱甘肽(谷胱甘肽化)的加入而修饰，并与重链的Leu4、Phe27、Trp33、Met34、Glu102和Leu105的主链和侧链原子发生范德华相互作用(

距离)(图14B)。最后，Cys100是一个主要被掩埋的结构残基，显现参与介导CDR1和HCDR3的构象。因此，正如五个晶体结构中该区的均匀分布所观察到的，它不太可能与其他半胱氨酸具有反应性。

方法

H5D8-1 IgG获自康泰伦特生物制剂公司(Catalent Biologics)，并在25mM组氨酸、6％蔗糖、0.01％聚山梨酯80(在pH 6.0)中配制。使用10K MWCO浓缩器(密理博公司)将配制的IgG广泛地缓冲液交换为PBS，之后在37℃下于PBS、1.25mM EDTA、10mM半胱氨酸中以1∶100微克木瓜蛋白酶(西格玛公司)消化1小时。使用AKTA Start层析系统(GE医疗集团)将木瓜蛋白酶消化的IgG流经蛋白A柱(GE医疗集团)。回收包含h5D8 Fab的蛋白A流通液，并使用10K MWCO浓缩器(密理博公司)将其缓冲液交换为pH 5.6的20mM乙酸钠。使用AKTA Pure层析系统(GE医疗集团)将所得样品上样到Mono S阳离子交换柱(GE医疗集团)上。用1M氯化钾梯度洗脱产生了一个主要的h5D8 Fab峰，该峰在20mM Tris-HCl、150mM氯化钠(pH 8.0)中用Superdex 200 Increase凝胶过滤柱(GE医疗集团)回收、浓缩并纯化至大小均一。通过在还原和非还原条件下的SDS-PAGE证实了h5D8 Fab的高纯度。

使用10K MWCO浓缩器(密理博公司)将纯化的h5D8 Fab浓缩至25mg/mL。使用Oryx4分配器(道格拉斯仪器公司(Douglas Instruments))在20℃下使用稀疏矩阵96条件商业筛JCSG TOP96(Rigaku试剂)和MCSG-1(阿纳塔斯公司(Anatrace))设置气相扩散结晶实验。在以下五个结晶条件下四天后，获得并收获晶体：1)0.085M柠檬酸钠，25.5％(w/v)PEG4000，0.17M乙酸铵，15％(v/v)甘油，pH 5.6；2)0.1M MES，20％(w/v)PEG 6000，1M氯化锂，pH 6.0；3)0.1M MES，20％(w/v)PEG 4000，0.6M氯化钠，pH 6.5；4)0.085M HEPES钠，17％(w/v)PEG 4000，8.5％(v/v)2-丙醇，15％(v/v)甘油，pH 7.5；5)0.08M Tris，24％(w/v)PEG4000，0.16M氯化镁，20％(v/v)甘油，pH 8.5。在液氮中快速冷冻之前，根据需要，向含有晶体的母液中补充5％-15％(v/v)甘油或10％(v/v)乙二醇。以高级光子源光束线23-ID-D(芝加哥，伊利诺伊州)对晶体进行X射线同步加速器辐射，并在Pilatus3 6M检测器上记录衍射图。使用XDS处理数据，并使用移相器通过分子置换确定结构。在PHENIX中进行了完善，在Coot中建立了迭代模型。在PyMOL中生成图片。所有软件都通过SBGrid访问。

实例19-h5D8在半胱氨酸100处的突变保持结合

对h5D8的分析揭示，在重链可变区的100位(C100)处有一个游离的半胱氨酸残基。H5D8变体是通过用每个天然存在的氨基酸取代C100而生成的，以表征与人和小鼠LIF的结合以及对人和小鼠LIF的亲和力。使用ELISA和Octet测定表征结合。结果汇总在表9中。ELISA EC50曲线显示在图15中(图15A人LIF和图15B小鼠LIF)。

方法

ELISA：通过ELISA确定h5D8 C100变体与人和小鼠LIF的结合。将重组的人或小鼠LIF蛋白以1ug/mL涂在Maxisorp 384孔板上，在4℃下过夜。在室温下将板用1x阻断缓冲液阻断2小时。加入每种h5D8 C100变体的滴定并在室温下结合1小时。将板用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次。加入缀合有HRP的抗人IgG，并在室温下结合30分钟。将板用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次，并使用1x TMB底物显影。用1M HCl终止反应，并测量在450nm的吸光度。使用Graphpad Prism进行图形生成和非线性回归分析。

Octet RED96：使用Octet RED96系统，通过BLI确定了h5D8 C100变体对人和小鼠LIF的亲和力。在1x动力学缓冲液中经过30秒的基线后，将h5D8 C100变体以7.5ug/mL加载到抗人Fc生物传感器上。将人或小鼠LIF蛋白的滴定与加载的生物传感器关联90秒，并在1x动力学缓冲液中解离300秒。通过数据分析软件使用1∶1全局拟合模型计算KD。

实例20-h5D8在体外阻断LIF与gp130的结合

为了确定h5D8是否阻止LIF与LIFR结合，使用Octet RED 96平台进行了分子结合测定。通过抗人Fc捕获将H5D8加载到AHC生物传感器上。然后，将生物传感器浸入LIF中，并按预期观察到缔合(图16A，中间三分之一)。随后，将生物传感器浸入不同浓度的LIFR中。观察到剂量依赖性的缔合(图16A，右三分之一)。对照实验证明这种缔合是LIF特异性的(未显示)，而不是由于LIFR与h5D8或与生物传感器的非特异性相互作用。

为了进一步表征h5D8和LIF的结合，进行了一系列ELISA结合实验。预孵育H5D8和LIF，然后将其引到涂有重组人LIFR(hLIFR)或gp130的板上。h5D8/LIF复合物与涂覆的底物之间缺乏结合，这指示h5D8以某种方式破坏了LIF与受体的结合。另外地，也使用了不结合LIF(同种型对照，由(-)指示)或在已知结合位点结合LIF的对照抗体(B09不与gp130或LIFR竞争LIF结合；r5D8是h5D8的大鼠亲本版本)。ELISA结果证明，h5D8/LIF复合物能够结合hLIFR(r5D8/LIF复合物也是如此)，指示这些抗体不能阻止LIF/LIFR缔合(图16A)。相反，h5D8/LIF复合物(和r5D8/LIF复合物)不能结合重组人gp130(图16B)。这指示当LIF与h5D8结合时，LIF的gp130结合位点受到影响。

实例21-人组织中的LIF和LIFR表达

为了确定LIF和LIFR的表达水平，对许多不同类型的人体组织进行了实时定量PCR。图17A和17B中所示的平均表达水平以每100ng总RNA的拷贝数给出。大多数组织每100ng总RNA表达至少100个拷贝。在人脂肪组织(肠系膜回肠[1])、血管组织(脉络丛[6]和肠系膜[8])和脐带[68]组织中，LIF mRNA表达最高，而在脑组织(皮质[20]和黑质[28])中最低。在人脂肪组织(肠系膜回肠[1])、血管组织(肺[9])、脑组织[11-28]和甲状腺[66]组织中，LIFR mRNA表达最高；而在PBMC[31]中最低。食蟹猴组织中的LIF和LIFR mRNA表达水平与人组织中观察到的相似，其中在脂肪组织中LIF表达高，在脂肪组织中LIFR表达高而在PBMC中低(数据未显示)。

图17A和图17B的组织编号为：1-脂肪(肠系膜回肠)；2-肾上腺；3-膀胱；4-膀胱(膀胱三角)；5-血管(大脑：大脑中动脉)；6-血管(脉络丛)；7-血管(冠状动脉)；8-血管(肠系膜(结肠))；9-血管(肺)；10-血管(肾脏)；11-脑(杏仁核)；12-脑(尾核)；13-脑(小脑)；14脑-(皮质：扣带前区)；15-脑(皮质：扣带后区)；16-脑(皮质：额叶外侧)；17-脑(皮质：额叶内侧)；18-脑(皮质：枕骨)；19-脑(皮质：顶叶)；20-脑(皮质：颞叶)；21-脑(背缝核(dorsal-raphe-nucleus))；22-脑(海马)；23-脑(下丘脑：前区)；24-脑(下丘脑：后区)；25-脑(蓝斑)；26-脑(延髓)；27-脑(伏核)；28-脑(黑质)；29-乳腺；30-盲肠；31-外周血单核细胞(PBMC)；32-结肠；33-背根节(DRG)；34-十二指肠；35-输卵管；36-胆囊；37-心脏(左心房)；38-心脏(左心室)；39-回肠；40-空肠；41-肾脏(皮质)；42-肾脏(延髓)；43-肾脏(骨盆)；44-肝脏(实质)；45-肝脏(支气管：一级)；46-肝脏(支气管：三级)；47-肺(实质)；48-淋巴腺(扁桃体)；49-肌肉(骨骼)；50-食道；51-卵巢；52-胰腺；53-松果体；54-垂体腺；55-胎盘；56-前列腺；57-直肠；58-皮肤(包皮)；69-脊髓；60-脾(薄壁组织)；61-胃(胃窦)；62-胃(胃体)；63-胃(胃底)；64-胃(幽门管)；65-睾丸；66-甲状腺；67-气管；68-脐带；69-输尿管；70-子宫(子宫颈)；71-子宫(子宫肌层)；以及72-输精管。

实例22-剂量选择、剂量增量和平剂量

抗LIF抗体的剂量选择、剂量增量和平剂量如下所述。将小鼠和食蟹猴用于h5D8的安全性评估。

在每周接受高达100mg/kg的IV给药的小鼠和猴的4周GLP毒性研究中，未观察到与治疗相关的副作用。因此，在研究条件下，这两种物种的最高非严重毒性剂量(HNSTD)＞100mg/kg，并且将未观察到的不良作用水平(NOAEL)设置为100mg/kg IV。按比例缩放剂量以建立人等效剂量(HED)。采用基于体表面积(BSA)的缩放方法进行HED的估算。根据这些GLP毒理学研究，如下所示进行最大推荐起始剂量(MRSD)的估算：

·来自小鼠NOAEL的0.81mg/kg IV HED，安全性系数为10倍

·＞10mg/kg IV，基于小鼠的严重毒性剂量的1/10

·来自食蟹猴NOAEL的3.2mg/kg IV HED，安全性系数为10倍

·＞16.7mg/kg IV，基于HNSTD的1/6

根据毒理学研究，并在1期研究中针对晚期癌症患者群体采取保守方法，数据支持1mg/kg(或75mg平剂量)IV的MRSD。

在设定MRSD时也已考虑了药理活性剂量(PAD)。根据迄今为止可用的小鼠药理模型中的药理学、PK和LIF稳定化数据，采用以下方法估算PAD。根据U251小鼠异种移植模型中的剂量反应，最佳有效剂量被认为是每周两次约300μg IP；该剂量水平与约230μg/mL的最后一次剂量之前的血清水平谷值相关。有证据表明，在此模型中，在此300μg剂量下，血清LIF水平已达到最大稳定化，这也得到了小鼠GLP毒性研究中10、30和100mg/kg剂量下血清LIF稳定化数据的支持。使用基于与猴PK数据拟合并针对人按比例缩放的2房室模型的PK模型，每3周1500mg的临床剂量将提供约500μg/mL的C_谷。类似地，在该U251小鼠异种移植模型中，每周两次的最低有效剂量20μg与约20μg/mL的最后一次剂量之前的血清水平谷值相关；在小鼠PK耐受性研究中，有证据表明在该20-μg剂量下仅达到了最大血清LIF稳定化的约50％，这得到在0.5mg/kg IV剂量下最小LIF稳定化的证据的支持。每3周75mg的临床剂量将提供约25μg/mL的C_谷。小鼠同系模型提供的其他PK-PD(LIF稳定化)数据支持源自U251小鼠异种移植模型的PAD。

因此，根据小鼠和猴的毒理学数据以及小鼠异种移植模型中的最小有效剂量，开始剂量为75mg i.v.被认为是合适的。毒理学数据支持1500至2000mg的最大临床剂量。基于在动物模型中观察到线性PK结合不存在与测试物品相关的不良发现，可以采用平剂量方法。

实例23-在不同癌症中的LIF表达

如果在不同癌症类型中LIF表达存在异质性，则无论癌症类型如何，都基于LIF水平设置治疗是可行的方法。图18示出了某些癌症具有较高的高LIF mRNA水平频率。即使低LIF表达频率相对较高的癌症也有将从抗LIF治疗中受益的个体子集。

方法

RNA测序数据是从癌症基因组图谱库中获得的，针对22个适应症的7,769个样品。根据在所有样品中计算的LIF表达的上、上中、下中和下四分位数，将LIF转录物表达定阈值为高、中-高、中-低和低。

实例24-在不同癌症中LIF表达与T调节性趋化因子的相关性

如前所述，LIF抑制具有减少小鼠和人离体模型中免疫抑制巨噬细胞群(例如M2巨噬细胞)的作用(图10A-10D)，以及减少NSCLC小鼠模型中调节性CD4+T细胞(图11C)和浸润的作用。因此，同时具有高水平的LIF和T调节性趋化因子的或者由骨髓细胞或M2巨噬细胞分泌的癌症可以定义有较高可能性对抗LIF治疗产生反应的个体子集。T调节细胞是免疫抑制CD4+细胞，并且M2巨噬细胞是支持组织中抗炎免疫抑制环境的巨噬细胞，完全不同的是，M1巨噬细胞则支持促炎环境。图19A至19D示出了LIF mRNA的表达与不同T调节趋化因子CCL7(图19A)、CCL2(图19B)、CCL3(图19A)和CCL22(图19A)的mRNA的表达的相关性。同样，图20A示出了LIF mRNA与定义M2巨噬细胞特征的mRNA的表达相关性。如果存在免疫抑制特征(例如，基于M2标记物、T调节趋化因子或T调节细胞的表达)，这些可为将具有LIF表达的个体(甚至是具有低或中-低LIF的那些个体)的群体作为抗LIF治疗性抗体的潜在应答者进行细分提供依据。

在人GBM和卵巢癌的TCGA数据集的分析中，都发现LIF与CCL2、CD163和CD206之间存在显著正相关(图20B)。在LIF和CXCL9之间未观察到相关性(数据未显示)，但在各个肿瘤中观察到相对较低水平的CXCL9mRNA。通过分析一个20名GBM患者的队列并进行肿瘤的LIF、CXCL9、CCL2、CD163和CD206 IHC，在蛋白水平上验证了这些结果。观察到LIF与CCL2、CD163和CD206之间的强正相关(图20C)。CXCL9在分离的细胞簇中表达，解释了肿瘤中存在的低水平CXCL9mRNA。值得注意的是，CXCL9与人GBM中的LIF显示负相关(图20C)。

CXCL9和CCL2分别突出为CD8⁺T细胞肿瘤浸润以及TAM和Treg募集的关键趋化因子。证实了通过中和TAM中的LIF(CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^-)对CXCL9和CCL2的调节(图20D)。TAM的免疫染色和分离显示CXCL9、CCL2、CD206和CD163主要在TAM中表达(图20E)，并且用抗LIF(h5D8)处理可调节其表达(图20D、20E)。CXCR3(CXCL9受体)、CCR2(CCL2受体)和LIFR在TAM和CD8⁺T细胞中表达(图20F)。

使用CXCL9和CCL2基因敲除(CXCL9^-/-，CCL2^-/-)小鼠模型来测试CXCL9和CCL2调节在LIF致癌功能中的相关性。这些小鼠模型中的肿瘤用针对CXCL9和CCL2的阻断抗体治疗。有趣的是，在CXCL9^-/-小鼠中对LIF抑制的抗肿瘤反应减弱了，但在CCL2^-/-小鼠中却没有减弱(图20G)。类似地，该CXCL9中和抗体而非CCL2抗体削弱了对抗LIF(h5D8)的抗癌反应(图20G)。这些结果指示抗LIF(h5D8)反应的主要介质是CXCL9。如所预期的，CXCL9的阻断降低了响应于抗LIF(h5D8)的CD8⁺T细胞肿瘤浸润(图20H)。

为了证实LIF通过阻遏实际癌症患者肿瘤中的CXCL9来调节免疫细胞肿瘤浸润，从患者新鲜获得的GBM样本中产生器官型组织培养物。这些器官型模型允许短期培养维持患者肿瘤组织结构和基质(包括免疫细胞)的肿瘤切片。来自3名肿瘤细胞表达高水平LIF的患者的器官型组织培养物(图20I)。通过Iba1标记物检测到，在所有3种培养物中均存在大量TAM浸润，大多数TAM表达CCL2、CD163和CD206。有趣的是，用针对LIF的中和抗体对器官型培养物进行3天的治疗促进了CCL2、CD163和CD206的减少以及CVCL9表达的增加(图20I)。

与上述在抗LIF(h5D8)治疗的人巨噬细胞中的观察结果相似，观察到抗LIF(h5D8)治疗诱导CT26肿瘤中M2标记物CD206和CD163的下调(图20J)。相反，抗LIF(h5D8)治疗诱导免疫刺激M1标记物(包括CXCL9、CXCL10和PD-L1)的表达增加(图20J)。通过还检查抗LIF(h5D8)治疗的MC38肿瘤中的TAM表型，进一步扩展了这些发现。然而，观察到经治疗的肿瘤在总骨髓或TAM群体的总体频率上没有差异，抗LIF(h5D8)治疗诱导表达MHCII的TAM比例以及MHCII的总体表达水平均增加(图20K)。由于MC38TAM不表达CD206(用于CT26模型中M2巨噬细胞表型的关键标记物)，因此无法在CT26和MC38模型之间进行M1/M2倾斜的平行比较。总之，这些数据证明抗LIF治疗在两个独立的临床前肿瘤模型中抑制肿瘤的生长。分析证明，抗LIF治疗影响TAM表型，但不会影响TAM或总骨髓细胞的总数，这表明观察到的功效可能部分地通过对TAM进行重新编程以利于抗肿瘤免疫而发生。

方法

RNA测序数据是从癌症基因组图谱库中获得的。根据皮尔逊相关性，计算膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和子宫癌样品的LIF表达与各种T调节细胞趋化因子(CCL7、CCL2、CCL3和CCL22)之间的关联。根据皮尔逊相关性，计算膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和子宫癌样品的LIF表达与代表M2巨噬细胞的转录特征之间的关联。

裂解细胞以进行mRNA提取(RNeasy Mini或Micro试剂盒，凯杰公司(Qiagen))，逆转录(来自伯乐公司(BioRad)的iScript ReverseSupermix，用于mRNA)，并根据制造商的建议使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的Taqman探针进行qRT-PCR。对于石蜡包埋的切片，通过使用High Pure FFPET RNA分离试剂盒(罗氏公司(Roche))并按照制造商的说明获得RNA。反应在CFX384 TouchTM实时PCR检测系统(伯乐公司(Bio-Rad))中进行，结果表示为通过Ct方法计算的相对于对照样品的倍数变化。将鼠或人ACTB或GAPDH用作内部归一化对照。

在Affymetrix微阵列平台上使用小鼠Gene 2.1 ST测定RNA。接下来，基于稳健微阵列平均值(Robust-Microarray Average，RMA)将其归一化。考虑到成对的样品，使用limma Bioconductor软件包通过贝叶斯线性回归确定基因在抗LIF治疗的小鼠中差异表达。

在小鼠实验中，将核用DAPI复染色，并使用激光扫描共聚焦NIKON Eclipse Ti显微镜捕获图像。用ImageJ进行免疫荧光的定量，对3-5个小鼠/组的每只小鼠的2-3个不同视野的CD11b、Iba1或CD3阳性的全部或多达100个细胞进行计数，并计算这些细胞对Iba1(对于GL261N型)或CD68/CD11b(对于ID8型)阳性群体内的CCL2、CD206和CD163阳性的百分比。对于CXCL9，计算了在总细胞群内被该细胞因子信号包围的细胞的百分比。对于器官型切片，每位患者的3-4个视野(n＝3)被定量。对于器官型组织免疫荧光，每个条件用Fiji-Image J软件处理五张不同的Z-栈图像。对于CD8⁺T细胞，计算了CD8⁺T细胞在总群体中所占的百分比。图中数据表示为平均值±SEM。

免疫荧光抗体：人/鼠CCL2(诺伟司生物制剂公司，1∶200)、人/鼠CD11b(艾博抗公司；1∶2000)、人/鼠Iba1(和光公司(Wako)；1∶1000)、鼠CD68(艾博抗公司；1∶200)、人/鼠CD206(艾博抗公司；1∶500)、鼠CD163(艾博抗公司；1∶200)、CXCL9(鼠，诺伟司生物制剂公司，1∶200；人，赛默飞世尔科技公司1∶200)和人CD8(DAKO；1∶200)。

人GBM样本是从瓦尔德希伯隆大学医院和诊所医院获得的。该临床方案已获得瓦尔德希伯隆机构审查委员会和诊所医院(CEIC)的批准，征得了所有受试者的知情同意。

GBM器官型切片培养物如下产生。切除后，用手术刀将手术样本切成5-10mm长和1-2mm宽的矩形块，并分别转移到6孔板内的0.4μm膜培养插入物(密理博公司)中。在将插入物放入6孔板之前，将补充有B27(生命技术公司)、青霉素/链霉素(生命技术公司)和生长因子(20ng/ml EGF和20ng/ml FGF-2)(PeproTech)的1.2ml神经元基础培养基(生命技术公司)放入每个孔中。将培养物保持在37℃，恒定湿度，95％空气和5％CO²下。一天后，将切片用大鼠抗小鼠/人LIF阻断抗体(h5D8)(称为抗LIF)(内部开发)或其相应的正常IgG(10μg/ml)处理3天。为了进行阻断CXCL9研究，将针对人CXCL9(R&D系统公司)的中和小鼠单克隆抗体以1.5μg/ml加入培养物中。在一些情况下，添加0.1ng/ml人rIFNγ(R&D系统公司)24h。平行地，通过使用Lymphosep(Biowest)的离心密度分离从同一患者的全血中获得外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC冷冻保存在补充有10％灭活FBS和10％DMSO的RPMI培养基中直至使用。对于免疫细胞浸润测定，将对照或抗LIF切片包埋入基质胶(Matrigel)(康宁公司(Corning))中，随后将1x10⁶个PBMC加入24孔板中的完全RPMI培养基中。另外，收集上清液并从基质胶回收器官型切片，并进一步处理以用于IF和流式细胞术。在一些条件下，用浓度为10⁶个细胞/ml的PBS重悬PBMC，并与5μM细胞追踪CFSE(英杰公司)一起孵育20分钟。孵育后，将细胞用RPMI洗涤并添加到包埋入基质胶的切片中。24h后，通过在每种条件下计数五个不同区域中的迁移细胞，在显微镜下评估侵入基质胶的荧光PBMC。

将玻片脱蜡并水合。在室温下，使用pH 6或pH 9柠檬酸盐抗原提取溶液(DAKO)，10分钟10％过氧化物酶(H2O2)和阻断溶液(2％BSA)进行抗原提取1h。根据制造商的说明，使用EnVision FLEX+(DAKO)作为检测系统，随后用苏木精复染、脱水并固定(DPX)。患者GBM肿瘤中LIF、CCL2、CD163、CD206和CXCL9染色的定量表示为H评分(3×强染色百分比+2×中度染色百分比+弱染色百分比)，范围为0到300。用ImageJ进行p-STAT3、Ki67、CC3和CD8的定量，对每只小鼠三个不同视野的细胞总数进行计数，五只小鼠/组，并计算阳性细胞的百分比。图中数据呈现为平均值±SEM。

免疫组化抗体：人LIF(阿特拉斯(Atlas)；1∶200)、鼠LIF(艾博抗公司(AbCam)；1∶200)、鼠p-STAT3(细胞信号传导公司；1∶50)、鼠Ki67(艾博抗公司；1∶200)、鼠裂解的半胱天冬酶3(CC3)(细胞信号传导公司；1∶500)、鼠CD8(百奥斯公司(Bioss)；1∶200)、人/鼠CCL2(诺伟司生物制剂公司，1∶200)、人CXCL9(赛默飞世尔科技公司；1∶100)和人CD163(莱卡诺瓦卡斯特拉公司(Leica Novacastra)；1∶200)。

实例25-LIF诱导II型(M2)巨噬细胞极化

双重LIF免疫抑制特征分层可能是鉴定尤其易于对抗LIF治疗性治疗产生反应的个体的稳健方法。在图21A和21B、22和23中示出了关于此的进一步证据。图21A和21B示出了人原代巨噬细胞在用50ng/ml M-CSF培养单核细胞7天后上调LIF受体。示出了来自三个不同个体的细胞。图22和23还示出了在用LIF培养72小时后，人原代巨噬细胞上调了巨噬细胞表面标记物CD206和CD163(图22)和CCL22分泌(图23)。有趣的是，在M2极化的巨噬细胞中，CCL22分泌更为稳健(图23，右下)。该数据提供了LIF表达与免疫抑制特征的存在之间的机理联系，表明用于选择患者治疗的双重LIF-免疫抑制特征可能适用于所有类型的癌症和所有组织。

方法

通过在含10％热灭活的FBS、青霉素/链霉素和50ng/ml M-CSF的RPMI-1640培养基中培养7天，将巨噬细胞与CD14⁺人外周单核细胞区分开。在一些实验中，这之后在添加了20nM LIF或PBS(用于对照)、100ng/ml LPS和25ng/ml IFNγ(用于M1极化)或20ng/ml的IL-4、IL-10和TGFβ中每种(用于M2极化)的相同培养基中培养指示的额外时间。

实例26-来自不同癌症的骨髓细胞上的LIF受体表达

对于肿瘤生长和癌症生存重要的双重LIF免疫抑制特征的前景的其他支持是，与人类肿瘤相关的巨噬细胞实际上确实表达LIF受体。图24和25示出，从4分之3的解离肿瘤细胞(卵巢癌和肺癌)中分离的巨噬细胞表达LIF受体(图24)。另外地，在肿瘤相关髓源性抑制细胞(单核髓源性抑制细胞(M-MDSC)和多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSC))的细胞表面上表达LIF受体(图25)。

虽然在本文示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域技术人员显而易见的是此类实施例仅以示例性的方式提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现在能想到众多变化、改变和取代。应当理解，在实施本发明时，可以采用本文描述的本发明的实施例的各种替代方案。

本说明书中提到的所有公开、专利申请、授权专利以及其他文献均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文献被具体和单独地指示通过引用以其整体并入。在与本披露中的定义相矛盾的程度上，通过引用并入的文本中所含的定义被排除。

除非另有定义，本文所使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文明确地指示其他的情况。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。

如本文所用，除非另有指示，术语“约”是指在所述量附近变化至少10％的量。

序列

Claims (28)

1.一种用治疗性抗白血病抑制因子(LIF)抗体治疗患有癌症的个体的方法，其包括确定超过来自该个体的生物学样品中的参考水平的LIF水平，并在该LIF水平大于该LIF参考水平时，向该个体施用治疗量的该抗LIF抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其中该治疗性抗LIF抗体包括：

a)免疫球蛋白重链互补决定区1(VH-CDR1)，其包括SEQ ID NO：1-3中任一项所阐述的氨基酸序列；

b)免疫球蛋白重链互补决定区2(VH-CDR2)，其包括SEQ ID NO：4或5中任一项所阐述的氨基酸序列；

c)免疫球蛋白重链互补决定区3(VH-CDR3)，其包括SEQ ID NO：6-8中任一项所阐述的氨基酸序列；

d)免疫球蛋白轻链互补决定区1(VL-CDR1)，其包括SEQ ID NO：9或10中任一项所阐述的氨基酸序列；

e)免疫球蛋白轻链互补决定区2(VL-CDR2)，其包括SEQ ID NO：11或12中任一项所阐述的氨基酸序列；以及

f)免疫球蛋白轻链互补决定区3(VL-CDR3)，其包括SEQ ID NO：13所阐述的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的方法，其中该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：14、15、17或38具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链可变区以及与SEQ ID NO：18-21具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链可变区。

4.如权利要求3所述的方法，其中该治疗性抗LIF抗体包括与SEQ ID NO：30-33或39具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白重链区以及与SEQID NO：34-37具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的免疫球蛋白轻链区。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该治疗性抗LIF抗体是包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的IgG抗体。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该治疗性抗LIF抗体是人源化的。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该LIF水平是LIF蛋白水平，并且确定该水平包括进行至少一种检测LIF蛋白的测定，或接收至少一种检测LIF蛋白的测定的结果。

8.如权利要求7所述的方法，其中该至少一种测定包括免疫组织化学。

9.如权利要求8所述的方法，其中该参考水平为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％或35％的抗LIF抗体阳性染色细胞。

10.如权利要求8所述的方法，其中该参考水平是或超过约10至约100的IHC评分。

11.如权利要求7所述的方法，其中该至少一种测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。

12.如权利要求11所述的方法，其中该ELISA检测电化学发光。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中在未稀释的来自该个体的生物学样品中，该参考水平为约4pg/mL的LIF。

14.如权利要求7至13中任一项所述的方法，其中该LIF参考水平对应于相同类型的LIF阳性人类癌症中LIF蛋白表达的第5百分位数、第10百分位数、第25百分位数或第50百分位数。

15.如权利要求7至13中任一项所述的方法，其中该LIF参考水平对应于人类癌症中LIF蛋白表达的第5百分位数、第10百分位数、第25百分位数或第50百分位数。

16.如权利要求15所述的方法，其中该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、泌尿系统癌、妇科癌症、胃肠癌、内分泌系统癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌及其组合。

17.如权利要求16所述的方法，其中该人类癌症选自以下清单，该清单由以下组成：非小细胞肺癌、多形性胶质母细胞瘤、上皮性卵巢癌、胰腺腺癌及其组合。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该生物学样品包括血液样品。

19.如权利要求18所述的方法，其中该血液样品是血浆。

20.如权利要求18所述的方法，其中该血液样品是血清。

21.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该生物学样品包括组织样品。

22.如权利要求21所述的方法，其中该生物学样品是肿瘤活检。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括确定免疫调节分子的超过该免疫调节分子的参考水平的蛋白水平。

24.如权利要求23所述的方法，其中该免疫调节分子选自CCL7、CCL2、CCL3和CCL22。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括确定免疫调节分子的低于该免疫调节分子的参考水平的蛋白水平。

26.如权利要求25所述的方法，其中该免疫调节分子选自MHCII、CXCL9、CXCL10、CXCR3和PD-L1。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括确定II型巨噬细胞(M2)标记物的超过该II型巨噬细胞(M2)标记物的蛋白参考水平的水平。

28.如权利要求27所述的方法，其中该M2标记物选自以下清单，该清单由以下组成：CD206、CD163、PF4、CTSK和ARG1。

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