JP7370997B2 - 抗ｒｓｐｏ３抗体 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１２月７日に出願の米国仮特許出願第６２／５９５８４５号の優先権を主張し、その内容全体がここでの参照によりここに取り込まれる。

Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）は、トロンボスポンジンタイプ１リピート（ＴＳＲ－１）含有タンパク質のスーパーファミリーに属する、４つの異なる分泌タンパク質（ＲＳＰＯ１、２、３及び４）のグループである。例えば、Ｊｉｎ ａｎｄ Ｙｏｏｎ（２０１２）、Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（４４）：２２７８－２２８７参照。すべてのヒトＲＳＰＯは４０％～６０％のアミノ酸（ａ．ａ．）配列類似性を共有し、これらのタンパク質は以下の要素：（ｉ）ＲＳＰＯの分泌を促進するＮ端末疎水性シグナルペプチド、（ｉｉ）２個のフリン様システインリッチドメイン（ＦＵ－ＣＲＤ）、（ｉｉｉ）ＴＳＲ－１ドメイン及び（ｉｖ）正の荷電残基を有する塩基性アミノ酸リッチドメインのＣ末端テール、を含む２３４～２７２個のアミノ酸を含有する。２個のＦＵ－ＣＲＤは、ＲＳＰＯの生物学的機能に関するＷｎｔ／β－カテニン依存性シグナル伝達を促進するのに必要かつ十分であることが示された。例えば、ｄｅ Ｌａｕ他（２０１２）、Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ（１３）：２４２及びＫｉｍ他（２００８）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ（１９）：２５８８－２５９６参照。対照的に、ＴＳＲ－１ドメインは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）／平面内細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節において機構的な役割を果たす。

ＲＳＰＯは、脊椎動物の成長及び幹細胞の増殖に多面的な機能を有する。２つの可能なモデルによって説明されるように、いくつかの研究は、ＲＳＰＯがＷｎｔ経路シグナル伝達を大きく増強してＷＮＴリガンドによるβ－カテニンの活性化をもたらし得ることを示唆した。例えば、Ｊｉｎ ａｎｄ Ｙｏｏｎ（２０１２）、ｄｅ Ｌａｕ他（２０１４）、Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２８）：３０５－３１６及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．（２０１２）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ（５２６）：１９４－２０５参照。一方のモデルは、ＲＳＰＯは、ＷＮＴ及びＦＺＤを有する受容体のクラスター上で活性化リガンドとしてＬＲＰ５／６及びＬＧＲ４／５／６受容体に直接結合し、癌におけるＷｎｔ／ｂ－カテニンシグナル伝達を活性化することを提案した。例えば、Ｗａｎｇ他（２０１３）、Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２７）：１３３９－１３４４参照。あるいは、ＲＳＰＯは、ＤＫＫ１媒介性ＬＲＰ６及びクレメンの結合を妨害することによって、ＤＫＫ１媒介性エンドサイトーシスにも拮抗し得る。他のモデルにおいて、ＲＳＰＯは、ＺＮＦＲ３及びその相同体ＲＮＦ４３に負のフィードバック調節因子として結合して細胞表面のＦＺＤ及びＬＲＰ６受容体の代謝回転を加速する。例えば、Ｊｉｎ ａｎｄ Ｙｏｏｎ（２０１２）参照。

ＷＮＴシグナル伝達は、細胞の増殖、分化、転移及び生存の調節に関与される。例えば、Ｎｉｅｈｒｓ（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（１３）：７６７－７７９参照。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、癌療法の潜在的な標的として調査されている。例えば、Ｍａｄａｎ ａｎｄ Ｖｉｒｓｈｕｐ（２０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１４）：１０８７－１０９４参照。ヒト遺伝学研究及び遺伝子ターゲティングアプローチは、ＲＳＰＯは標準的及び非標準的なＷＮＴ調節因子となる能力を有することを示した。ＭａｃＤｏｎａｌｄ他（２００９）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ（１７）：９－２６。ＲＳＰＯ３遺伝子融合の機能獲得は、ＦＺＤ及びＬＲＰ５／６の細胞表面の存在度を増強し、同様に、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する。Ｍａｄａｎ他（２０１５）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（３５）：２１９７－２２０７。治療が困難な癌の患者の一部は、ＲＳＰＯ融合遺伝子を保有することが示された。例えば、Ｍａｄａｎ他（２０１５）参照。例えば、結腸癌の５～１０％において、プロテインチロシンホスファターゼ受容体タイプＫは、ＲＳＰＯ３と融合して（ＰＴＰＲＫ）－ＲＳＰＯ３融合物を形成することが見いだされた。例えば、Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ他（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ（４８８）：６６０－６６４参照。活性化されたＷｎｔシグナル伝達は、ＡＰＣ^{ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ}結腸癌の１０％、並びに、卵巣、食道、肺及び頭頸部の癌の１～１１％で見いだされた。例えば、Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ他（２０１２）参照。３２４名のＮＳＣＬＣコホートのおよそ１～２％が、ＥＩＦ３Ｅ（ｅ１）－ＲＳＰＯ２（ｅ１）、ＰＴＰＲＫ（ｅ１）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）及びＰＴＰＲＫ（ｅ７）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）と診断された。例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ他（２００１）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２６）：２８４及びＰａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２０１３）、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ（３２）：５９４－６０３参照。２つの最近の研究は、抗ＲＳＰＯ３抗体は、ＲＳＰＯ－融合遺伝子又はＲＳＰＯ３－刺激β－カテニンシグナル伝達を伴う腫瘍に対して拮抗活性を有することを示している。例えば、Ｓｔｏｒｍ他（２０１６）、Ｎａｔｕｒｅ（５２９）：９７－１００及びＣｈａｒｔｉｅｒ他（２０１６）、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ（７６）：７１３－７２３参照。したがって、増強されたＲＳＰＯ－Ｗｎｔシグナル伝達によって動作する癌の一部が存在しそうである。抗ＲＳＰＯ３抗体は、結腸、肺及び卵巣の癌を含む様々な癌における抗癌療法に大きな影響を与える可能性がある。

ある態様では、単離された抗体がここで説明される。単離された抗体は、配列番号２、６、１０及び１４から選択された重鎖可変領域配列に由来する重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに、配列番号４、８、１２及び１６から選択された軽鎖可変領域配列に由来する軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有し、抗体はＲＳＰＯ３タンパク質と特異的に結合する。

ある実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２に由来し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号４に由来する。

ある実施形態では、抗体は、配列番号２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域及び配列番号４の配列と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域を含む。

ある実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号６に由来し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号８に由来する。抗体は、配列番号６の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域、及び、配列番号８の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である軽鎖可変領域を含み得る。

ある実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１０に由来し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１２に由来する。抗体は、配列番号１０の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域、及び、配列番号１２の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である軽鎖可変領域を含み得る。

ある実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１４に由来し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１６に由来する。抗体は、配列番号１４の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である重鎖可変領域、及び、配列番号１６の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一である軽鎖可変領域を含み得る。

ここで記載される抗体は、ＲＳＰＯ３タンパク質において立体構造的に特定の（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）又は直鎖のエピトープに結合し得る。それは、ＩｇＧ抗体、Ｆｃ領域を含有する抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦＶマルチマー、一価抗体、多価抗体又はキメラ抗体であり得る。

ある実施形態では、抗体はヒト化される。ある実施形態では、抗体は、他の分子（例えば、低分子薬、細胞標的部分、細胞毒性剤、免疫調節剤、ポリペプチド、核酸分子、検出可能な標識又はポリマー）に複合されて、免疫複合体を生成する。

ここに開示される抗体のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子も、ここに記載される。

他の態様では、単離された核酸を含有する宿主細胞が、ここに提供される。

ある態様では、ここに記載される抗体を含有する組成物が記載される。組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／又は他の治療剤（例えば、他の抗がん剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤）をさらに含み得る。

ここに記載される抗体のいずれも、抗体の有効量を細胞に接触させることにより、細胞におけるＲＳＰＯ３又はＷｎｔシグナル伝達を阻害するように使用され得る。

抗体は、抗体の有効量を細胞に接触させることにより、癌細胞増殖又は癌細胞転移を阻害するようにも使用され得る。

さらに他の態様では、ここに開示される抗体のいずれかの有効量を被検体に投与するステップを含む、被検体における癌を治療する方法がここで記載される。

ある実施形態では、癌は、ＲＳＰＯ３陽性癌、ＲＳＰＯ３融合陽性癌、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）突然変異を有する癌、β－カテニン突然変異を有する癌又はＷｎｔシグナル伝達の活性化過剰を有する癌である。ある実施形態では、方法は、抗体を被検体に投与する前に、被検体における癌が上記の突然変異又は異常の１つを有するか否かを判定するステップをさらに含む。癌は、結腸癌、白血病、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、膠芽腫又は頭頸部癌であり得る。ある実施形態では、方法は、被検体に他の治療剤を投与するステップをさらに含む。

サンプルにおいてＲＳＰＯ３タンパク質又はそのフラグメントを検出する方法も、ここに提供される。方法は、ここに記載される抗体のいずれかをサンプルに接触させるステップ及び抗体とＲＳＰＯ３タンパク質又はそのフラグメントとの間の特異的な結合のためのアッセイをするステップを含む。ある実施形態では、ＲＳＰＯ３タンパク質は、ヒトＲＳＰＯ３である。

ＲＳＰＯ３タンパク質に特異的に結合する抗体変異体を同定する方法がここに記載される。方法は、ここに記載される抗体の１以上の相補性決定領域に１以上の変性を導入して抗体変異体を生成するステップ及びＲＳＰＯ３タンパク質に特異的に結合する抗体変異体を同定するステップを含む。

１以上の実施形態の詳細を、以下の添付図面及び説明において説明する。実施形態の他の特徴、目的及び効果は、説明及び図面から、並びに、特許請求の範囲から明らかとなる。

図１は、単一細胞株をスクリーニングするモデルとしてのＲＳＰＯ３ハイブリドーマＢ１の使用を示す一組の概略図及び画像である。（Ａ）概略図は、単一コロニー選択手順を示す。（Ｂ）単一クローンを限界希釈及び増大により同定した。（Ｃ）クローンを移し、Ａｂ発現に対して評価した。（Ｄ）高いＡｂ発現レベルを示す細胞をＴ２５－ｃｍ^２組織培養フラスコで増大させた。 図２は、抗ＲＳＰＯ３ハイブリドーマ抗体反応性を示す一組のウエスタンブロットである。これらのハイブリドーマ抗体をＲＳＰＯ１～４抗原免疫ブロットにより反応させた。マーカーのＭ．Ｗ．を示す。（Ａ）Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６及びＡ９クローン、並びに、（Ｂ）Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ８及びＢ９クローン。 図３は、ＥＬＩＳＡによって測定された抗ＲＳＰＯ３ハイブリドーマ抗体反応性を示す一組のグラフである。これらのハイブリドーマ抗体をＲＳＰＯ１～４抗原免疫ブロットにより反応させ、それはＲＳＰＯ３抗原とともに示す。（Ａ）Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６及びＡ９クローン、並びに、（Ｂ）Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ８及びＢ９クローン。 図４は、標準的Ｗｎｔシグナル伝達を標的とするＲＳＰＯ３のＡｂ及びβ－カテニン活性の阻害についての生体外試験を示す一組のグラフである。（Ａ）Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６及びＡ９クローン、（Ｂ）Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ８及びＢ９クローン、並びに、（Ｃ）ＲＳＰＯ－Ｗｎｔシグナル伝達に対する、亢進したＡ４及びＡ６クローンの用量反応性効果。ＭＤＡ－ＭＢ４３６ＴＣＦ／ＬＥＦ－Ｌｕｃ細胞を、２０μｇ／ｍＬの抗ＲＳＰＯ３抗体クローンＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ９又は１３１Ｒ００２の存在下で、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びＲＳＰＯ３（５０ｎｇ／ｍＬ）の組合せと共にインキュベートした。コントロールとして、細胞をＷｎｔ３ａ及びＲＳＰＯ３の併用とともに、Ｗｎｔ３ａのみで、ＲＳＰＯ３のみで、又は添加なしで、インキュベートした。細胞を１６時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性のアッセイをＯｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。 図５は、ｈＲＳＰＯ３及びｍＲＳＰＯ３のアミノ酸配列のアライメントである。 図６は、抗ＲＳＰＯ３のＡｂが、Ｗｎｔ３ａ及びＲＳＰＯ３の併用によって刺激されたＷＮＴレポーター活性を阻害することを示す一組のグラフである。（Ａ）Ｗｎｔ３ａ及びヒトＲＳＰＯ３（ｈ）又はマウスＲＳＰＯ３（ｍ）によって刺激された、ＲＳＰＯ－Ｗｎｔシグナル伝達の、ｈＢ１又は１３１Ｒ０１０による用量反応性阻害。（Ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ４３６ＴＣＦ／ＬＥＦ－Ｌｕｃ細胞を、２０μｇ／ｍＬの抗ＲＳＰＯ３抗体クローンｈＢ１又は１３１Ｒ０１０の存在下で、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びｈＲＳＰＯ３（５０ｎｇ／ｍＬ）の併用によりインキュベートした。細胞を１６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性のアッセイを、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。 図７は、α－ＲＳＰＯ３抗体－抗原相互作用の結合反応速度を測定するＢｉａｃｏｒｅの使用を示すグラフである。結合センサーグラムを、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用して生成し、次に、単純な１：１相互作用モデルに適合させた。一連の濃度（０．３９～６．２５ｎＭ）のｈＢ１を、注入の間で表面を再生させることなくシングルサイクルで注入した。結合は２分間モニタリングされ、最終的な離散時間は１５分であった。ｈＲＳＰＯ３を２７．５ＲＵでＣＭ５チップに固定化した。 図８は、Ｐｅｐ－ｓｅｔによるＲＳＰＯ３タンパク質上のα－ＲＳＰＯ３のＡｂエピトープのマッピングを示す一組のグラフである。図に示すように、これらのヒストグラムは、各１０量体のオリゴペプチドがＲＳＰＯ３のＡｂの１３１Ｒ０１０（Ａ）、１３１Ｒ００２（Ｂ）及びハイブリドーマＡ６（Ｃ）を結合する能力を表す。ＱＮＡＳＲＧＲＲＱＲ（配列番号７４）、ＡＳＲＧＲＲＱＲＲＭ（配列番号７５）、ＲＧＲＲＱＲＲＭＨＰ（配列番号７６）、ＲＲＱＲＲＭＨＰＮＶ（配列番号７７）、ＣＬＳＣＫＰＲＬＦＦ（配列番号７８）、ＳＣＫＰＲＬＦＦＡＬ（配列番号７９）、ＥＲＧＫＫＧＲＥＲＫ（配列番号８０）、ＧＫＫＧＲＥＲＫＲＫ（配列番号８１）、ＫＧＲＥＲＫＲＫＫＰ（配列番号８２）、ＲＥＲＫＲＫＫＰＮＫ（配列番号８３）、ＲＥＮＫＱＱＱＫＫＲ（配列番号８４）。 図９は、いくつかのα－ＲＳＰＯ３抗体のエピトープ研究を示す概略図及びグラフのセットである。（Ａ）種々の切断ＲＳＰＯ３フラグメントをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、続いてビオチン化ｈＢ１、α－ＲＳＰＯ３抗体を各ウェルに添加した。次に結合したビオチン化抗体の検出のためにストレプトアビジン－ＨＲＰを添加した。（Ｂ）１μｇ／ｍｌのビオチン化環状ペプチド及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化組換えヒトＲＳＰＯ３をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでプレコーティングしたプレートに付加した。次に、異なる環状ペプチドとｈＢ１との間の結合を試験するために、２μｇ／ｍｌのｈＢ１をプレートの各ウェルに添加した。次に、結合した抗ＲＳＰＯ３抗体を検出するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＰＲ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をプレートに付加した。 図１０は、異なるα－ＲＳＰＯ３抗体によって、ＬＧＲ５又はＲＮＦ４３に対するＲＳＰＯ３の競合的結合を示す一組のグラフである。異なるα－ＲＳＰＯ３抗体がＲＳＰＯ３のＬＧＲ５又はＲＮＦ４３に対する結合と競合し得るか否かを試験するために、組換えｈＲＳＰＯ３をプレートにコーティングした。（Ａ）組換えＬＧＲ５（２２－５６０）－Ｆｃをビオチンと複合し検出しやすくした。次にビオチン化ＬＧＲ５を、種々の濃度のα－ＲＳＰＯ３抗体又はアイソタイプコントロールＡｂのいずれかとそれぞれ混合し、ＲＳＰＯ３－コーティングウェルに付加した。次に、結合したビオチン化ＬＧＲ５を検出するためにストレプトアビジン－ＨＲＰを添加した。（Ｂ）組換えＨｉｓタグ化ＲＮＦ４３及び異なるα－ＲＳＰＯ３抗体の混合物を、それぞれ各ＲＳＰＯ３－コーティングウェルに付加した。次に、結合したＲＮＦ４３の検出のために、マウス抗Ｈｉｓタグ抗体－ＨＲＰを添加した。１×ＰＢＳＴでプレートを洗浄することにより余分な検出抗体を除去した後、ＴＭＢ基質溶液を１０分間各ウェルに添加した。２ＮのＨＣＬによって比色反応を停止し、各ウェルの４５０ｎｍでの光学密度を直ちに測定した。 図１１は、ＤＬＤ－１細胞モデルにおける創傷治癒に対する異なるα－ＲＳＰＯ３抗体の効果を示すグラフである。創傷閉鎖の割合を計算し、棒グラフに示す。 図１２は、特定の抗ＲＳＰＯ３モノクローナル抗体を用いた、生体内での大腸癌ＰＤＸモデルＣＲ３１５０腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。マウスをｈＢ１、１３１Ｒ０１０又はコントロール（ビヒクル（ＰＢＳ））で週２回、４．５週間処置した。処置の５日目に、ビヒクル及びｈＢ１グループの各々から３匹のマウスを屠殺し、２回目の投薬後２４時間での腫瘍を回収した。それ以降は、５日目から５８日目まで、コントロール、ｈＢ１又は１３１Ｒ０１０グループに、それぞれ、５匹、３匹及び３匹のマウスが残存した。データは平均値±ＳＥＭとして表される。腫瘍体積が人道的エンドポイントに達することにより、ビヒクルグループのマウス１匹及び無処置のグループのマウス１匹をそれぞれ３９日目及び４６日目に安楽死させ、腫瘍体積の最終値を研究の終了まで持ち越した。 図１３は、ＣＲ３１５０ＰＤＸモデルにおけるｈＢ１の分子応答の評価を示すグラフのセットである。腸幹細胞マーカー（Ａｘｉｎ２及びＬＧＲ５）、下流マーカー（ＴＣＦ７）、癌幹細胞マーカー（ＣＤ１３３及びＣＤ４４）及び分化マーカー（ＣＥＡＣＡＭ７及びＫＲＴ２０）の発現を、２回投薬後２日以内又は最終投薬後２９日以内にＱ－ＰＣＲを使用して行った。 図１４は、ＲＳＰＯ^ｈｉｇｈＮＣＩ－Ｈ２０３０肺癌ＣＤＸモデルにおけるｈＢ１の有効性を示すグラフである。マウスを２５ｍｇ／ＫｇのｈＢ１若しくは１３１Ｒ０１０又はコントロール（ビヒクル）で週１回４週間処置した。処置２８日目に、ビヒクル、１３１Ｒ０１０及びｈＢ１グループの各々から７匹のマウスを屠殺し、５回目の投薬後２４時間での腫瘍を回収した。データは平均値±ＳＥＭとして表される。処置５１日目に、カルボプラチン、ｈＢ１、１３１Ｒ０１０及びカルボプラチン併用グループの各々から７匹のマウスを屠殺し、腫瘍を回収した。データは平均値±ＳＥＭとして表される。 図１５は、ＰＴＰＲＫ（ｅ１３）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）融合転写産物を保有するヒトＳＮＵ－１４１１結腸異種移植腫瘍における抗腫瘍有効性を示すグラフのセットである。腫瘍細胞をマウスに注入し、腫瘍が２００ｍｍ^３に達したときに処置を開始した。２５ｍｇ／ｋｇの抗体を隔週に１回（Ｑ２Ｗ）与え、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを毎週１回（Ｑ１Ｗ）与えた。両抗体及びカルボプラチンを静脈内注入によって投与した。パクリタキセルを１日目から３２日目まで与え、併用グループには１日目から４６日目まで与えた。両抗体及びパクリタキセルを静脈内注入によって投与した。各処置サイクルについて、抗体を１日目に与え、パクリタキセルを３日目に与えた。腫瘍及び体重の測定を、指定された日に行った。平均値±ＳＥＭ。＊は、一元ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの検査後の比較により、コントロールのｍＡｂに対してｐ＜０．０５である。 図１６は、膵臓癌組織におけるＲＳＰＯ３の発現を示すグラフである。８０名の患者サンプルからなる膵臓癌組織マイクロアレイを抗ＲＳＰＯ３のｍＡｂのｈＢ１で染色した。切片全体の画像を３ＤＨＩＳＴＥＣＨデジタルスライドスキャナーでスキャンした。グラフは、癌組織アレイ及び正常組織アレイにおいてＲＳＰＯ３を発現する場合の割合を示す。 図１７は、肺癌組織におけるＲＳＰＯ３の発現を示すグラフである。５０名の患者サンプルからなる肺癌組織マイクロアレイを抗ＲＳＰＯ３のｍＡｂのｈＢ１で染色した。切片全体の画像を３ＤＨＩＳＴＥＣＨデジタルスライドスキャナーでスキャンした。グラフは、癌組織アレイ及び正常組織アレイにおいてＲＳＰＯ３を発現する場合の割合を示す。 図１８は、乳癌組織におけるＲＳＰＯ３の発現を示すグラフである。７５名の患者サンプルからなる乳癌組織マイクロアレイを抗ＲＳＰＯ３のｍＡｂのｈＢ１で染色した。切片全体の画像を３ＤＨＩＳＴＥＣＨデジタルスライドスキャナーでスキャンした。グラフは、乳房浸潤性乳管癌腫組織アレイにおいてＲＳＰＯ３を発現する場合の割合を示す。 図１９は、結腸癌組織におけるＲＳＰＯ３の発現を示すグラフである。６４名の患者サンプルからなる結腸癌組織マイクロアレイを抗ＲＳＰＯ３のｍＡｂのｈＢ１で染色した。切片全体の画像を３ＤＨＩＳＴＥＣＨデジタルスライドスキャナーでスキャンした。グラフは、大腸癌腫組織アレイにおいてＲＳＰＯ３を発現する場合の割合を示す。

ここで、新規の抗ＲＳＰＯ３抗体を説明する。特に、ヒト化抗体ｈＢ１は、ＲＳＰＯ３融合遺伝子又はＲＳＰＯ３過剰発現を伴う癌において、生体外及び生体内での抗癌有効性を示した。後述のデータは、（１）ｈＢ１のＲＳＰＯ３に対する結合親和性は、ｐＭの範囲にあり、（２）β－カテニンＴＣＦ／ＬＥＦ－Ｌｕｃレポーターシステムにおいて、ｈＢ１及びロスマンツズマブ（ｒｏｓｍａｎｔｕｚｕｍａｂ）は、同等の効力を示し、（３）ｈＢ１及びロスマンツズマブは、ＣＲ３１５０大腸癌ＰＤＸモデルにおいて同等の抗癌有効性を示し、（４）ｈＢ１はＮＣＩ－Ｈ２０３０及びＳＮＵ－１４１１癌異種移植モデルにおいて抗癌効果を示し、（５）ｈＢ１は、サンプルにおけるＲＳＰＯ３レベルを測定するために使用し得るものであり、さらに（６）ｈＢ１及びロスマンツズマブは、異なるエピトープに結合する、ことを示す。

抗体Ａ４、Ａ６、Ｂ１及びｈＢ１の重鎖可変領域（Hｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）の配列を以下の表に示す。４つの異なる方法（ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫＡＢＡＴ及びＨｏｎｅｇｇｅｒ）によって予測された相補性決定領域（ＣＤＲ）も表に示す。

ここに開示される抗ＲＳＰＯ３抗体は、配列番号２、６、１０及び１４から選択された重鎖可変領域配列からの重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに、配列番号４、８、１２及び１６から選択された軽鎖可変領域配列からの軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。領域の各々における３つのＣＤＲを上に示す。当業者は、当技術分野で公知の様々な方法を使用してＣＤＲを同定し得ることになる。

抗体は、ＲＳＰＯ３と特異的に結合することができ、すなわち、他の非ＲＳＰＯ３タンパク質よりも高い親和性でＲＳＰＯ３に結合し、ＲＳＰＯ３とそのリガンドの間の相互作用を妨害し得る。抗体が結合し得るＲＳＰＯ３タンパク質は、ヒトＲＳＰＯ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１１６１７３）、マウスＲＳＰＯ３又は他の哺乳類の相同体を含む。ある実施形態では、抗体は、抗体Ａ４、Ａ６、Ｂ１又はｈＢ１と同じエピトープに結合する。

ここで使用される用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、完全長抗体又はそのフラグメント、Ｆｃ領域を含有する抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦＶマルチマー、一価抗体、多価抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含むが、これに限定されない、抗原結合活性を有する種々の抗体構造物を含む。

ここに開示される抗体配列及びそれらのＣＤＲに基づいて、当業者はここに記載される方法又は当技術分野で公知の方法、例えば組換え法を使用して種々の形態の抗ＲＳＰＯ３抗体を生成し得ることになる。

ここに記載される抗ＲＳＰＯ３抗体又はその構成要素をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子（例えば、発現ベクター）もここでは考慮される。例えば、核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４若しくは１６又はこれらの配列から１以上のＣＤＲを含有するポリペプチドをコードし得る。核酸分子を含有する宿主細胞もまたここに提供される。核酸分子及び宿主細胞は、抗ＲＳＰＯ３抗体を生成するために使用され得る。

ここに記載される抗体のいずれも、ＲＳＰＯ３とそのリガンドの間の結合を阻害すること、ＲＳＰＯ３機能を阻害すること、（例えば、免疫アッセイにおいて）サンプルにおけるＲＳＰＯ３タンパク質若しくはそのフラグメントを検出すること、ＲＳＰＯ３を発現する組織若しくは細胞に結合すること（例えば、細胞の同定又はＲＳＰＯ３発現細胞の単離）、癌細胞の増殖若しくは転移を阻害すること、被検体における癌を治療すること、又は抗ＲＳＰＯ３抗体変異体を生成することに使用され得る。

用語「サンプル」は、任意の生物学的サンプル、例えば、体液サンプル、血液サンプル、細胞サンプル、尿サンプル、唾液サンプル又は組織サンプルのことをいうものとする。

ここに記載される抗ＲＳＰＯ３抗体のいずれも、種々の投与経路、例えば、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、くも膜下腔内又は皮下の投与経路に適した薬学的組成物として処方され得る。薬学的組成物は、水溶液又は凍結乾燥製剤であり得る。それは、薬学的に許容可能な担体、例えば、緩衝液、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含有し得る。薬学的組成物は、抗ＲＳＰＯ３抗体と共に作用する他の活性成分、例えば他の治療剤を含み得る。薬学的組成物は、被検体における癌又は腫瘍を治療するために使用され得る。

抗ＲＳＰＯ３抗体は、他の分子又は部分、例えば、タンパク質若しくはペプチド、薬物（例えば、細胞毒性薬）、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）又は固体支持体（例えば、ビーズ又はプレート）とも複合し得る。そのような抗体複合体は、癌の治療又はサンプルにおけるＲＳＰＯ３の検出など種々の目的のために使用され得る。

抗ＲＳＰＯ３抗体のいずれかで処置され得る癌又は腫瘍は、これに限定されないが、結腸癌、白血病、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、膠芽腫及び頭頸部癌を含む。処置は、単独で、又は他の薬若しくは療法との併用で行われてもよい。ある実施形態では、癌又は腫瘍は、コントロール（例えば、他の癌、正常組織又は正常細胞）と比較して高い発現レベルのＲＳＰＯ３を有し、又はＲＳＰＯ融合遺伝子若しくはＲＳＰＯ３転座を保有する。ある実施形態では、癌又は腫瘍は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）突然変異、β－カテニン突然変異又はＷｎｔシグナル伝達の活性化過剰を有する。選択的に、被検体に抗ＲＳＰＯ３抗体を投与する前に、当該分野で公知の方法を使用して、被検体における癌又は腫瘍がＲＳＰＯ３のより高い発現レベルを呈するか否か、又はＲＳＰＯ融合遺伝子若しくはＲＳＰＯ３転座、ＡＰＣ突然変異、β－カテニン突然変異若しくはＷｎｔシグナル伝達の活性化過剰を有するか否かを判定し得る。

「被検体」は、ヒト又は非ヒト動物のことをいう。「治療／処置する」又は「治療／処置」は、障害、障害の症状、障害に続発する病状又は障害に対する素因を治癒し、緩和し、軽減し、療治し、その発症を遅らせ、又は改善する目的で、障害を有する被検体に化合物又は組成物を投与することをいう。「有効量」は、治療される被検体において医学的に望ましい結果を生成可能な化合物又は組成物の量のことをいう。

ここに記載される抗ＲＳＰＯ３抗体は、所望の特性、例えば、改善された安定性、結合特異性又は生体内での有効性を有する抗ＲＳＰＯ３抗体を生成するように変性され得る。抗体変異体は、抗体をエンコードするヌクレオチド配列に１以上の変性を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。変性は、ＣＤＲの１以上に、又はＣＤＲの外部の部位に導入されてもよい。変性は、例えば、欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。当技術分野で公知の方法を使用して、抗体変異体を生成し得る。変性は、無作為に、又は部位特異的に導入され得る。抗体の抗原結合活性及び特異性を消失させることなく変性され得る残基を同定するのに、アラニンスキャニング突然変異導入技術が使用され得る。

以下の具体例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる形においても以下の開示を限定するものではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて、本開示をその最大の範囲で利用すると考えられる。ここに引用されるすべての刊行物は、その全体において参照によってここに取り込まれる。

実施例１：材料及び方法
１．細胞株
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得たＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を除き、細胞株はＡＴＣＣから購入された。ＤＬＤ－１及びＮＣＩ－Ｈ２０３０細胞株を１０％ＦＢＳが補足されたＲＰＭＩで、２９３Ｔ細胞株を１０％ＦＢＳ補足ＤＭＥＭで、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳをＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）において増殖させた。ヒトＳＮＵ－１４１１結腸腫瘍細胞を韓国の細胞株バンクから入手し、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）補足ＲＰＭＩ培地で培養した。培養物は、５％ＣＯ_２／９５％空気中、３７℃の加湿インキュベーターで維持された。

２．レポーターアッセイ
Ｗｎｔシグナル伝達は、β－カテニン／ＴＣＦ依存性転写反応をもたらす。Ｋｅｌｖｉｎ Ｋｕｎ－Ｃｈｉｈ Ｔｓａｉ博士からの恩恵によるＭＤＡ－ＭＢ４３６－ＴＣＦ／ＬＥＦ－Ｌｕｃ細胞を使用して、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性をモニタリングした。例えば、Ｗａｎｇ他（２０１３）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１４５）：１１１０－１１２０参照。略言すれば、ＭＤＡ－ＭＢ４３６－ＴＣＦ／ＬＥＦ－Ｌｕｃ細胞を、１０％ＦＢＳ補足ＲＳＰＯ培地の黒平底９６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。インキュベーション後２４時間で、必要に応じて、細胞を抗ＲＳＰＯ３のａｂ、２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）及びＲＳＰＯリガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処置し、さらに１６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。

３．ハイブリドーマの生成及びＲＳＰＯ３抗体の精製
ＲＳＰＯ３に対するマウスモノクローナル抗体は、ＬＴＫ ＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（台湾）によって生成された。簡単に説明すると、約０．５～１．５ｍｇのＲＳＰＯ３をマウスの免疫化に使用した。次に、免疫脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を生成し、１１個のハイブリドーマクローンを単離した。ハイブリドーマを、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ）及び不活化２０％ＦＢＳにより９６ウェル組織培養プレートで培養した。次に、後述のように、標準的なＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングを用いて、ＲＳＰＯ３に対する結合能力について細胞上清をスクリーニングして、陽性クローンを選択した。陽性クローンからの細胞を９６ウェルプレートにサブクローニングし、単一クローンを回収して、不活化２０％ＦＢＳ補足無血清培地（ＳＦＭ、ＨｙＣｌｏｎｅ）における増殖に徐々に適応させた。図１参照。ハイブリドーマ細胞をこれらのマウスに腹腔内注射して、腹水腫瘍の形成及び腹水液の産生を誘発させた。標準プロトコルに従って、腹水液をプロテインＡ－セファロースにロードした。精製ＲＳＰＯ３のＡｂを、アジド無添加ＰＢＳバッファーに対して透析した。

４．ハイブリドーマからのＲＳＰＯ３抗体の配列決定及びクローニング
ハイブリドーマにおけるＩｇＧ重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡ配列を測定するために、ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いてランダムヘキサマーによってｃＤＮＡを調製した。可変ドメインを測定するために、マウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、６９８３１－３）及びＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ（表１に示す）をＰＣＲ増幅に使用した。ＤＮＡ配列解析のために、ＰＣＲ産物をｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔクローニングベクター（ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ）にクローニングした。ＲＳＰＯ３抗体の対応する遺伝子コード及びエンコードアミノ酸配列を上記に開示する。

５．ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞からのＢ１、ｈＢ１及び参照抗体１３１Ｒ０１０の構築、発現及び精製
ハイブリドーマを生成する抗体からのＶＨ及びＶＬ領域のｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＤｉｒｅＸ、Ｉｎｃ．によって合成した。ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ１及びｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、それぞれ重鎖（ＣＨ）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域の前に合成された可変領域を導入された。ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ１クローニングのために、アミノ酸配列をフレーム内に作成するために、重鎖の可変領域がｈＩＬ２シグナル配列のもとにＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ切断部位で挿入された。それぞれ、軽鎖の可変領域がｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋにＥｃｏＲＩとＢｓｉＷＩによって挿入された。ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を抗体発現ベクターとして使用するために、重鎖及び軽鎖の全長抗体をｈＩｇＨＧ－Ｆ／ｈＩｇＨＧ－Ｒ及びＣＬＩｇ－Ｆ／ＣＬＩｇ－Ｒプライマーを用いて以前に構築したｐＦＵＳＥｓｓプラスミドから増幅し、次に標準プロトコルとして記載されるＴＡ ＴＯＰＯクローニング（Ｔｈｅｒｍｏ）を行った。
ｈＩｇＨＧ－Ｆ；５’－ＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣ－３’（配列番号５２）
ｈＩｇＨＧ－Ｒ：５’－ＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ－３’（配列番号５３）
ＣＬＩｇ－Ｆ：５’－ＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣ－３’（配列番号５４）
ＣＬＩｇ－Ｒ：５’－ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ－３’（配列番号５５）

組換え抗体生成のために、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ^ＴＭ細胞に、重鎖及び軽鎖をコードする組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．４（例えば、ｐｃＤＮＡ３．４－ｈＢ１Ｈ及びｐｃＤＮＡ３．４－ｈＢ１Ｌ）を２：３の比率でコトランスフェクションした。ＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ発現培地を、標準プロトコルを用いて８～１０日後に収穫した。得られた抗体を、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ^ＴＭＸＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィーを用いて上清から精製した。

６．ＲＳＰＯ３結合に対するハイブリドーマ抗体の反応性
抗体のＲＳＰＯ結合能力を評価するために、精製した抗体を免疫ブロットでＲＳＰＯ１、２、３及び４と反応させた。抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイを行うために、９６ウェル高結合ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、４℃で一晩インキュベートすることにより、キャプチャーバッファー中の２μｇ／ｍｌの組換えＲＳＰＯ３調製物でコーティングした。コーティングしたプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０補足ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で２回洗浄した。プレートをＰＢＳＴ－１０％ＢＳＡでブロッキングし、ＥＬＩＳＡ標準プロトコルにより室温で１時間アッセイした。

７．抗体のアイソタイピング
抗体をアイソタイピングするために、上記のようにマイクロタイタープレートをＲＳＰＯ３でコーティングし、次にＺｙｍｅｄ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによるＭｏｕｓｅ ＭｏｎｏＡｂ ＩＤ Ｋｉｔ（ＨＲＰ）で製造者の指示に従ってアッセイした。

８．抗体工学：Ａｂのヒト化
ヒト化され、完全に機能するＲＳＰＯ３抗体を生成するために、この研究において抗体のヒト化技術が使用され、そのサービスは産業技術研究所（ＩＴＲＩ）（Ｈｓｉｕｃｈｕ、台湾）によって提供された。理想的なアミノ酸配列を有するヒト化抗体を上記に示す。ただし、抗体の表面再形成法は通常、親和性及び安定性にはほとんど変化がみられない。例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ他（１９９６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ（９）：８９５－９０４及びＲｏｇｕｓｋａ他（１９９４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（９１）：９６９－９７３参照。

９．ＲＳＰＯ３のＡｂの結合スクリーニング
ＦｏｒｔｅＢｉｏハンドブックに記載されるように、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサーを１０μｇ／ｍｌのビオチン化ＲＳＰＯ３でコーティングした。抗体濃度は、０．７５～９３．８ｎＭの範囲であった。０．５％ＢＳＡを有するｐＨ調整ＰＢＳにより、定量的反応速度結合分析を行った。すべてのステップを、１０００ｒｐｍの連続振とう速度で３０℃において実行した。

１０．ＲＳＰＯ３のＡｂの結合分析
α－ＲＳＰＯ３のＡｂと組換えヒトＲＳＰＯ３タンパク質（ｈＲＳＰＯ３）の間の結合反応速度を、ＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーを使用して２５℃で実行した。泳動用バッファーは、最終ｐＨ７．４のＨＢＳ－ＥＰバッファー（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）であった。ｈＲＳＰＯ３タンパク質を、約２７．５反応単位（ＲＵ）のコーティング密度でＣＭ５センサーチップに固定化した。α－ＲＳＰＯ３のＡｂを、ＨＢＳ－ＥＰで６．２５ｎＭから０．３９ｎＭに２倍の段階希釈をし、チップ表面に１２０ｓ毎に３０μＬ／ｍｉｎの流量で注入し、続いて最後の９００ｓで相を解離した。得られたセンサーグラムを、基準面で得られた信号及び泳動用バッファーの信号を二重に減算することにより補正した。センサーグラムを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．０で１：１結合モデルを使用してグローバルフィッティングして、α－ＲＳＰＯ３のＡｂの親和定数（ＫＤ値）を得た。個別に調製したα－ＲＳＰＯ３のＡｂの希釈系列及びｈｕＲＳＰＯ３コーティングチップ表面を使用して、別個の実験において繰返し測定を行った。

１１．ＰｅｐＳｅｔＥＬＩＳＡにおける抗体結合エピトープマッピング
ＰｅｐＳｅｔライブラリー用のＥＬＩＳＡを採用して、α－ＲＳＰＯ３ｈＢ１抗体及びＲＳＰＯ３の結合エピトープを測定した。ＲＳＰＯ３の推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１１６１７３）を参照配列として使用して、ＲＳＰＯ３の成熟ドメインをカバーするビオチン化直鎖ペプチドのＰｅｐＳｅｔライブラリーを設計した。Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ、 オーストラリア）によって合成された１２１個のペプチドは１０アミノ酸長であり、これらの２つのフォーマット、Ｎ末端ペプチド用のビオチン－ＳＧＳＧ－ペプチド－ＮＨ２及びＣ末端ペプチド用のビオチン－ＳＧＳＧ－ペプチド－ＯＨにおいて、２残基ずつオフセットした。ペプチド（１～３ｍｇ）を、２００マイクロリットルの８０／２０ＤＭＳＯ／水混合物に溶解し、さらに希釈標準溶液としての０．１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳで１：２００に希釈した。プレートの各ウェルに異なるビオチン化ペプチドを付着させるために、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングされ、ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でブロッキングされたプレートを使用した。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を有する１×ＰＢＳで３回洗浄した後、１００ｍｌのビオチン化ペプチド溶液をプレートの各ウェルに付加した。室温での１時間のインキュベーションの後、プレートを１×ＰＢＳＴで再度３回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍｌのα－ＲＳＰＯ３抗体をプレートの各ウェルに添加し、プレートを撹拌しながら１時間インキュベートした。プレートを再度３回洗浄し、ペプチドに結合しなかった抗体を除去した。そして、結合した抗ＲＳＰＯ３抗体を検出するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＰＲをプレートに１時間付加した。プレートを１×ＰＢＳＴで洗浄することによって余分な検出抗体を除去した後、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を各ウェルに２０分間添加した。次に、比色反応を２ＮのＨＣＬによって停止し、各ウェルの４５０ｎｍでの光学密度を直ちに測定した。

１２．鎖内ジスルフィド結合を有する合成環状ペプチドを用いた抗体結合エピトープマッピング
プレートに異なるビオチン化ペプチド又はタンパク質を付着するために、１μｇ／ｍｌのビオチン化環状ペプチド及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化組換えヒトＲＳＰＯ３をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎプレコーティングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）に付加した。最初に、環状ペプチドを０．１ＭのＤＴＴで処置し、還元型の環状ペプチドを生成した。ｈＢ１と異なる環状ペプチドの間の結合を試験するために、２μｇ／ｍｌのｈＢ１をプレートの各ウェルに添加した。インキュベーション及び洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＰＲ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をプレートに付加した。プレートを１×ＰＢＳＴで洗浄することによって余分な検出抗体を除去した後、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を各ウェルに１０分間付加した。次に、比色反応を２ＮのＨＣＬによって停止し、各ウェルの４５０ｎｍでの光学密度を直ちに測定した。

１３．Ａｂ／受容体／リガンド結合の競合ＥＬＩＳＡ
ＲＳＰＯ３の結合に対して、異なるα－ＲＳＰＯ３抗体がＬＧＲ５又はＲＮＦ４３と競合するか否かを試験するために、組換えヒトＲＳＰＯ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）５００ｎｇ／ｍｌをプレートにコーティングした。検出目的のために、組換えＬＧＲ５（２２－５６０）－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）をビオチンと複合した。次に、ビオチン化ＬＧＲ５を３０ｎｇ／ｍｌで、種々の濃度のα－ＲＳＰＯ３抗体又はアイソタイプコントロール抗体のいずれかとそれぞれ混合して、ＲＳＰＯ３コーティングウェルに付加した。次に、抗ストレプトアビジン－ＨＲＰ抗体を添加し、結合したビオチン化ＬＧＲ５を検出した。５００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＲＳＰＯ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をプレートにコーティングした。

異なるα－ＲＳＰＯ３抗体がＲＳＰＯ３のＲＮＦ４３への結合と競合し得るか否かを試験するために、異なるα－ＲＳＰＯ３抗体の２００ｎｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌそれぞれの組換えＨｉｓタグ化ＲＮＦ４３（ＲＮＦ４３－Ｈｉｓ１６１０８－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の混合物を各ウェルに付加した。次に、結合したＲＮＦ４３－Ｈｉｓの検出のために、マウス抗Ｈｉｓタグ抗体－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加した。インキュベーションの後、プレートを１×ＰＢＳＴで洗浄することにより過剰な検出抗体を除去し、続いて１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の基質溶液を各ウェルに添加した。次に、比色反応を２ＮのＨＣＬによって停止し、各ウェルの４５０ｎｍでの光学密度を直ちに測定した。

１４．ヒト大腸腺癌ＤＬＤ１細胞の「創傷治癒」能力におけるα－ＲＳＰＯ３のＡｂの効果
ＤＬＤ－１細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で１６時間、Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔ２Ｗｅｌｌ（ｉｂｉｄｉ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）に１ウェルあたり４００００個の細胞で播種した。カルチャーインサートを除去した後、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ及び５０ｎｇ／ｍｌのＲＳＰＯ３の存在下で、低血清（０．５％）培地中の１００μｇ／ｍｌのコントロールのヒトＩｇＧ１抗体又は１００μｇ／ｍｌの抗ＲＳＰＯ３抗体のいずれかで細胞を処置した。次にサンプルを生細胞画像経時的顕微検査システム（Ｌｅｉｃａ ＡＦ６０００ ＬＸ）に供し、ＤＬＤ－１細胞の転移を観察した。最初に、１０×対物レンズ下で各ウェルの３つの位置を選択し、これらの位置の位相画像をＺｙｌａ４．２ｓＣＭＯＳカメラで３０分毎に最大６０時間取得した。

１５．ＣＲ３１５０のＲＳＰＯ高ＰＤＸモデルにおけるｈＢ１有効性の評価
前臨床の生体内の有効性を評価するために、この研究では大腸癌患者由来の異種移植（ＰＤＸ）モデルＣＲ３１５０を使用し、そのサービスはＣｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｔａｉｃａｎｇ、中国）によって提供された。腫瘍成長のために、雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは右側腹部に原発性ＣＲ３１５０腫瘍（直径２～３ｍｍ）の１フラグメントを皮下接種された。平均腫瘍サイズが約１９０ｍｍ^３に達したとき、担腫瘍マウスを無作為にグループに割当て、２５ｍｇ／ｋｇの試験物質又はビヒクル（ＰＢＳ）を週２回４．５週間腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入した。腫瘍の体積をキャリパーで週２回、ａ及びｂをそれぞれ腫瘍の長径及び短径として、式：ＴＶ＝０．５×ａ×ｂ^２を用いて測定した。腫瘍サイズが人道的エンドポイントに達することにより動物を屠殺し、腫瘍体積の最終値を研究の終了まで持ち越した。

腫瘍体積について、平均値及び標準誤差を含む統計分析が提供された。２つの処置レジメンが独立しているため、コントロールに対する各処置間の比較のために、独立標本ｔ検定を行った。すべてのデータを、ＳＰＳＳ１８．０を用いて分析した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると見なした。

１６．ＣＲ３１５０のＰＤＸモデルにおけるｈＢ１の分子応答の評価
ＲＳＰＯ３融合ＰＤＸモデルからの腫瘍サンプルをＱ－ＰＣＲによって分析した。ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５５９６－０１８）によって抽出し、ｃＤＮＡをＭ－ＭＬＶ ＲＴ、ＲＮａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｍ３６８２）によって合成した。マウス異種移植片において増殖した抗体処置ヒト腫瘍のコピー数を、リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、＃ＫＫ４６０４）を使用して測定した。２μｌのｃＤＮＡを１８μｌのＰＣＲ混合液に添加し、９５°Ｃで１分の開始ステップによって反応を開始し、続いて９５°Ｃで２秒及び６０°Ｃで３０秒を含む４０サイクルで増幅させた。リアルタイムＰＣＲ反応及びデータ分析をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ１．０システム（Ｒｏｃｈｅ）により行った。ＧＡＰＤＨを正規化用のハウスキーピング遺伝子として使用した。ＰＣＲ分析に使用されたプライマーセットを表２に示す。

１７．ＲＳＰＯ^ｈｉｇｈＮＣＩ－Ｈ２０３０肺癌細胞由来異種移植（ＣＤＸ）モデルにおけるｈＢ１の有効性の評価
前臨床の生体内の有効性を評価するために、この研究ではＲＳＰＯ^ｈｉｇｈＮＣＩ－Ｈ２０３０肺癌細胞由来異種移植（ＣＤＸ）モデルを使用した。腫瘍成長のために、メスのヌードマウスは、右側腹部にＮＣＩ－Ｈ２０３０（５×１０^６）の１フラグメントを皮下接種された。平均腫瘍サイズが約２５０ｍｍ^３に達したとき、担腫瘍マウスを無作為にグループに割当て、２５ｍｇ／ｋｇの試験物質、５０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン又はビヒクル（アイソタイプＩｇＧ）を週１回で４週間静脈内（ｉｖ）に注入した。腫瘍の体積をキャリパーで３日ごとに（１日の投薬及び２日の休薬）、ａ及びｂをそれぞれ腫瘍の長径及び短径として、式：ＴＶ＝０．５×ａ×ｂ^２を用いて測定した。腫瘍サイズが人道的エンドポイントに達することにより、動物を屠殺し、腫瘍体積の最終値を研究の終了まで持ち越した。

統計分析は、平均値及び標準誤差を含み、腫瘍体積に対して提供された。２つの処置レジメンが独立しているため、コントロールに対する各処置間の比較のために、独立標本を行った。すべてのデータを、Ｐｒｉｓｍによる二元ＡＮＯＶＡ多重比較を用いて分析した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると見なした。

１８．ＰＴＰＲＫ（ｅ１３）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）融合転写産物を保有するＳＮＵ－１４１１結腸異種移植腫瘍の増殖に対する抗ＲＳＰＯ３抗体のカルボプラチンとの併用における効果
ＳＮＵ－１４１１異種移植腫瘍に対する抗体の効果を測定するために、担腫瘍動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５０～２００ｍｍ^３に達したときに処置を開始した。抗体は隔週に１回（Ｑ２Ｗ）与えられ、パクリタキセルは週１回（Ｑ１Ｗ）投与された。抗体及びパクリタキセルの双方は、静脈内投与された。腫瘍の増殖を電子キャリパーで週２回測定した。Ｌを腫瘍の最長軸、Ｗを最短軸として、腫瘍体積を式（Ｌ×Ｗ^２）／２で計算した。動物の体重を週１回記録した。マウスを、薬物関連の有害な副作用の明白な兆候について頻繁に検査した。研究の終了時に、すべてのマウスを安楽死させた。

１９．統計分析
データを、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。グループ間の平均値の相違をノンパラメトリックｔ検定で分析した。多重比較は、一元ＡＮＯＶＡテスト及びそれに続くＴｕｋｅｙの検査後の比較を使用した。ｐ＜０．０５の相違を、有意に差があると見なした。統計分析用のソフトウェアは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ）によるものであった。

２０．組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）ベースの免疫組織化学法
ｈＢ１による組織スライドにおけるＲＳＰＯ３タンパク質のＩＨＣ標識強度をスコア化して分析した。すべての組織マイクロアレイスライドを、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘから入手した。３５例の腺癌、１例ずつのカルチノイド、腺房細胞癌腫、腺扁平上皮癌腫、膵島細胞腫瘍及び扁平上皮癌腫、２７例の癌隣接膵臓組織及び１３例の正常膵臓組織を、１症例につき単一コアで含有する膵臓腺癌組織マイクロアレイスライド（ＰＡ８０７）を、ｈＢ１でＲＳＰＯ３に対して染色した（１：１００）。４５例の対応する癌隣接肺組織を有する非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）（２６例の扁平上皮癌腫、１８例の腺癌及び１例の腺扁平上皮癌腫）及び５例の正常肺組織を、１症例につき二重コアで含有するＮＳＣＬＣ組織マイクロアレイスライド（ＬＣ１００１２ｂ）を、ｈＢ１でＲＳＢ３のレベルに対して染色した（１：１００）。７５例の乳房浸潤性乳管癌腫を１症例につき二重コアで含有する乳房浸潤性乳管癌腫組織マイクロアレイスライド（ＢＲ１５０５ｃ）を、ｈＢ１によってＲＳＰＯ３に対して染色した（１：１００）。３６例の大腸腺癌及び対応する隣接正常組織、９例ずつのリンパ節転移癌腫及び正常なリンパ節組織、並びに、１０例の正常な大腸組織を含有する、リンパ節転移癌腫を有する大腸癌腫及び対応隣接正常組織マイクロアレイスライド（ＣＯ１００１２ｂ）を、ｈＢ１によってＲＳＰＯ３に対して染色した（１：４０）。

スライドのシグナル強度は、２名の有資格の病理学者によって評価された。免疫染色スコア（範囲：０、２－８）を、以前のレポートに従って比率スコア＋強度スコアとして定義した（比率スコア：０＝０／１００、１＝１／１００～１／１０、２＝１／１０～１／３、３＝１／３～２／３、４＝２／３～１及び５＝１００／１００；強度スコア：０＝負、１＝弱、２＝中間、３＝強）。

実施例２：ＲＳＰＯ１～４結合に対するα－ＲＳＰＯ３ハイブリドーマ抗体の反応性
抗体のＲＳＰＯ－結合能力を評価するために、最初のバッチＡクローン（Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ９）及びバッチＢクローン（Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ８及びＢ９）から生じるいくつかのクローンハイブリドーマの培養上清から精製されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、免疫ブロット上のＲＳＰＯ１、２、３及び４と反応させた。最初のバッチＡクローンからのｍＡｂはすべて、ＲＳＰＯ３と強い反応性を示した。図２（Ａ）参照。Ｂ４及びＢ９ｍＡｂのみが、ＲＳＰＯ３と反応性を示した。図２（Ｂ）参照。次に、ＲＳＰＯ３と反応したｍＡｂのすべてを、それらの結合における選択性について、４つの異なるＲＳＰＯ、ＲＳＰＯ１～４の間で評価した。結果は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、クローンＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ６、Ｂ１及びＢ８に由来するｍＡｂは、ＲＳＰＯ３とのみ反応することを示した。図３参照。

抗体のＲＳＰＯ３結合親和性を評価するために、Ｏｃｔｅｔｓｙｓｔｅｍｓによって反応速度アッセイを行った。参照Ａｂ－１３１Ｒ００２とともに、バッチＡクローン（Ａ１、Ａ４、Ａ６、Ａ９）から精製されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、ＲＳＰＯ－３との結合について試験した。表３参照。バッチＡクローンからのそれらすべての抗ＲＳＰＯ３抗体は、１．０４×１０^－８から７．８×１０^－８Ｍの範囲で標的に対する高い結合親和性を示した。

実施例３：ＲＳＰＯ３－Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害
ＯｎｃｏＭｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．は、いくつかのＲＳＰＯ３結合抗体（ロスマンツズマブ（１３１Ｒ０１０）及び１３１Ｒ００２）を開発した。我々の研究に関する参照コントロールとして作用させるために、抗体ロスマンツズマブ及び１３１Ｒ００２を、刊行物（ＵＳ２２０１４／００１７２５３Ａ１）に公開されたアミノ酸配列に従って構築及び発現した。その後、６つの社内開発のマウスｍＡｂ（Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ６、Ｂ１、Ｂ８）及び１３１Ｒ００２参照ｍＡｂを多数のバイオアッセイにおいて特徴付けた。これらのα－ＲＳＰＯ３のマウスｍＡｂは、ＲＳＰＯ－ＬＧＲシグナル伝達経路に対して実質的な阻害活性を示した。図４（Ａ）及び（Ｂ）参照。ＲＳＰＯ３－Ｗｎｔ下流シグナル伝達経路ＴＣＦ／ＬＥＦ－Ｌｕｃレポーターシステムを擁するＭＤＡ－ＭＢ４３６レポーター細胞株において、クローンＡ４、Ａ６及びＢ１のみが阻害効果を有意に用量依存的に示すことが見いだされた。図４（Ｃ）参照。次に、抗体のアイソタイピングを行い、クラス及びサブクラスを同定した。表４に示すように、クローンＡ４、Ａ６及びＢ１は、それぞれアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１のものあることが見いだされた。

実施例４：α－ＲＳＰＯ３のヒト化
ハイブリドーマからのｍＡｂのｍＲＮＡ配列を配列決定し、続いてｃＤＮＡ合成及びＣＨＯ細胞における発現を行った。Ａ４、Ａ６及びＢ１ハイブリドーマに対応する組換えＩｇＧの発現及び精製後、これらのＩｇＧをＲＳＰＯ３結合及び中和について確認した。ヒト化のためにクローンＢ１を選択した。分子モデリングを活用して、可変領域リサーフェシング法によりマウスｍＡｂをヒト化した。例えば、Ｓａｆｄａｒｉ他（２０１３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ（２９）：１７５－１８６参照。患者において潜在的な免疫原性を低減させるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を回避するために、ヒト化技術は、マウスからヒトＩｇＧバックボーンへの相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植及び抗体の可変領域配列におけるＴ細胞エピトープの除去も含む。次に、ヒト化α－ＲＳＰＯ３のｍＡｂをＣＨＯ細胞で発現させ、精製された抗体を結合親和性、並びに、種々の生体外及び生体内試験について分析した。例えば、Ｌｉｕ他（２００８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２２２）：９－２７参照。以下の節による結果は、マウスクローンＢ１に由来するヒト化α－ＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１を生成する抗体工学の成功を確認した。

実施例４：ｈＢ１及びロスマンツズマブは、ＲＳＰＯ－ＷＮＴ中和アッセイ及び抗原結合反応速度アッセイにおいて同等の効力を示した
最有力候補であるｈＢ１の生体外及び生体内抗癌活性を特徴付け、フェーズ１ａ／１ｂ臨床試験が実施されているロスマンツズマブと比較した。ｈＢ１のｍＡｂは、抗原としてヒトＲＳＰＯ３（ｈＲＳＰＯ３）に基づいて生成された。ほとんどの前臨床の生体内研究はマウスにおいて実施されるため、ｈＢ１がマウスＲＳＰＯ３（ｍＲＳＰＯ３）を認識及び中和することもできるか否かを知ることが重要であった。ｈＲＳＰＯ３とｍＲＳＰＯ３の間のアミノ酸配列アライメントを図５に示す。ｈＢ１は、ｈＲＳＰＯ３又はｍＲＳＰＯ３のいずれかによって刺激されるにつれ、ＷＮＴレポーター活性を阻害することができた。図６（Ａ）参照。ＷＮＴレポーターアッセイにおいて示されるように、５０％阻害阻害に必要なｈＢ１及びロスマンツズマブの濃度（ＩＣ_５０）は、それぞれ５８．０ｎＭ及び５８．７ｎＭであった。図６（Ｂ）参照。

ｈＢ１のｈＲＳＰＯ３への結合特性を測定するために、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用して反応速度アッセイを行った。ｈＲＳＰＯ３タンパク質を、約２７．５応答単位（ＲＵ）のコーティング密度でＣＭ５センサーチップに固定化した。図７に示すように、ｈＢ１のｈＲＳＰＯ３との結合親和性は、ロスマンツズマブのｈＲＳＰＯ３との結合親和性と類似している。平衡解離定数ＫＤは、両者ともピコモル（ｐＭ）レベルであった。表５参照。

実施例５：結合エピトープのマッピング
α－ＲＳＰＯ３のＡｂの結合エピトープを同定するために、ｈＲＳＰＯ３アミノ配列に由来するオーバーラップするペプチドライブラリ（各ペプチドについて１０量体、オフセット：２アミノ酸残基、成熟ｈＲＳＰＯ３をカバーするペプチドの総数：１２２）を、Ｍｉｍｏｔｏｐｅ，Ｉｎｃ．によって調製した。ｈＲＳＰＯ３に由来するオーバーラップするペプチドへのα－ＲＳＰＯ３のｍＡｂの結合を測定した。推定結合エピトープとして同定されたアミノ酸配列を表６に示す。１３１Ｒ００２及びロスマンツズマブを含む参照抗体は、ＲＳＰＯ３フラグメントからのアミノ酸（ａ．ａ．）７～１１及びａ．ａ．３５～４２と反応した。ハイブリドーマＡ６α－ＲＳＰＯ３のｍＡｂは、ＲＳＰＯ３配列のａ．ａ．５～１１、３５～４２及び１９５～１９８と反応した。しかし、Ａ４もｈＢ１のｍＡｂも、検出可能な結合シグナルを示さなかった。結果は、ｈＢ１及びロスマンツズマブは、ｈＲＳＰＯ３上の異なる結合エピトープを認識することを示唆する。直鎖ペプチドを用いたエピトープマッピングの結果により（図８及び表６）、ｈＢ１は、ｈｕＲＳＰＯ３上の立体構造的に特定されるエピトープに結合しやすいと結論付けられた。この観察は、ｈＢ１とロスマンツズマブの間の異なる結合様式を示すために重要であった。

α－ＲＳＰＯ３のＡｂのさらなる立体構造エピトープ研究を、組換えＲＳＰＯ３の切断タンパク質及び環状ペプチドスキャニングを用いて行い、それらの標的配列を絞り込んだ。結果は、ｈＢ１がＲＳＰＯ３タンパク質におけるＣ末端の切断領域を認識することを示した。ＲＳＰＯ３におけるｈＢ１の結合エピトープは、ａ．ａ．３３～８６に絞り込まれた。図９（Ａ）参照。ＲＳＰＯ３は、フリン様システインリッチ領域を含む。これまでに、ＲＳＰＯ３の三次元構造は報告されていない。さらに、４つの環状ペプチド（ａ．ａ．４０～４７、４４～５３、５６～７５及び７９～９４）を設計し、ｈＲＳＰＯ３に由来する環状ペプチドとのα－ＲＳＰＯ３のｍＡｂの結合を測定した。結果は、ｈＢ１は、ＲＳＰＯ３のＦＲ１領域（残基５６～７５を含む）におけるドメインを含む選択されたエピトープを認識することを示した。図９（Ｂ）参照。ｈＢ１は、ＲＳＰＯ３フリン領域（残基５６～７５を含む）における新規エピトープを標的とし、ＲＳＰＯ－ＷＮＴ経路を中和し得る。

実施例６：ｈＢ１は、ＬＧＲ５と競合してＲＳＰＯ３に結合した。
ＲＳＰＯ３の結合に対して、異なるα－ＲＳＰＯ３抗体がＬＧＲ５又はＲＮＦ４３と競合するか否かを試験するために、Ａｂ／受容体／リガンド結合競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。１３１Ｒ０１０及び５Ｄ６は、α－ＲＳＰＯ３参照抗体としてＯｎｃｏｍｅｄ及びＧｅｎｅｔｅｃｈによるものである。受容体結合部位でＲＳＰＯ３と競合する、異なるα－ＲＳＰＯ３抗体とＬＧＲ５表面受容体の間の相互作用のＥＬＩＳＡによる分析を示す。

結果は、コントロールのＡｂグループと比較して、これらのα－ＲＳＰＯ３抗体は、ＬＧＲ５と競合してＲＳＰＯ３に結合したことを示した。図１０（Ａ）参照。

さらに、補助受容体ＲＮＦ４３のそれらの受容体結合部位での結合能力を測定するために、競合受容体／リガンド競合アッセイを設計した。我々の結果は、ｈＢ１及び１３１Ｒ０１０は、ＲＮＦ４３とＲＳＰＯ３の間の結合に干渉しなかったことを示した。５Ｄ６は、ＬＧＲ５及びＲＮＦ４３と競合し、ｈｕＲＳＰＯ３に結合した。図１０（Ｂ）参照。我々の結果は、ｈＢ１によるＲＳＰＯ３の中和は、ＬＧＲ５依存性経路からのＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達経路活性化の寄与を著しく低減させたことを示した。

実施例７：α－ＲＳＰＯ３のＡｂは、ヒト大腸腺癌ＤＬＤ－１細胞の細胞転移能を阻害した
ＲＳＰＯ３－Ｗｎｔシグナルカスケードは細胞浸潤だけでなく細胞転移も調節するため、創傷治癒アッセイを行い、α－ＲＳＰＯ３のｍＡｂが転移能にどのように影響し得るかを試験した。Ｗｎｔ３ａ及びＲＳＰＯ３の処置は、（大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子に欠失を擁する）ＤＬＤ細胞の移動活性を増強した。Ｗｎｔ３ａ及びＲＳＰＯ３処置の存在下におけるＤＬＤ－１の移動活性に対するアイソタイプコントロールのＡｂ及びｈＢ１の効果を比較した。Ｗｎｔ３ａ及びＲＳＰＯ３の存在下において、ｈＢ１及び１３１Ｒ０１０のα－ＲＳＰＯ３のｍＡｂの双方は、ＤＬＤ－１細胞の創傷治癒活性を阻害できることが見いだされた。図１１参照。

実施例８：ｈＢ１はＣＲ３１５０ＰＤＸ腫瘍増殖を阻害した
ＣＲ３１５０結腸腫瘍は、３５歳のアジア人女性患者に由来した。ＣＲ３１５０腫瘍は、ＰＴＰＲＫ－ＲＳＰＯ３融合遺伝子を擁する中分化型の管状腺癌である。始めに、担腫瘍マウスを４つの実験グループ、すなわち、ビヒクル（ＰＢＳ）、ｈＢ１、１３１Ｒ０１０及び未処置グループに割当てた。試験物質又はビヒクルをマウスに１日目から２９日目まで週２回腹腔内注入した。図１２に示すように、コントロールのグループの平均腫瘍体積は、処置終了後５８日目の試験終了時では１８６７．６±４７５．７ｍｍ^３に達した。２５ｍｇ／ｋｇのｈＢ１で処置されたグループは、８７１．２±２２７．７ｍｍ^３の最終的な平均腫瘍体積を有する明白な腫瘍増殖阻害を誘発した（ＴＧＩ＝６０．８％、ｐ＝０．１７９）。図１２参照。２５ｍｇ／ｋｇの１３１Ｒ０１０で処置したグループも、６８０．２±３８．２ｍｍ^３の最終的な平均腫瘍体積を有する抗腫瘍活性を生成した（ＴＧＩ＝７１．０％、ｐ＝０．０６７）。図１２参照。４６日目に、相対腫瘍体積を用いて処置とコントロールの間の相違を比較すると、統計的に有意な抗腫瘍活性は、ｈＢ１の処置に対してＴＧＩ＝６８．４％、ｐ＝０．０４１、１３１Ｒ０１０の処置に対してＴＧＩ＝６９．８％、ｐ＝０．０３９と記録された。したがって、この研究では、ｈＢ１及び１３１Ｒ０１０は治療的有用性を有すると考えられた。また、この研究では重度の体重減少はなかった。まとめると、単剤として投薬されたｈＢ１及び１３１Ｒ０１０は、ＣＲ３１５０患者由来の大腸癌モデルに対して有意な抗腫瘍活性を示した。

実施例９：α－ＲＳＰＯ３のＡｂはＣＲ３１５０のＰＤＸモデルにおける分子応答を低減した
ＣＲ３１５０のＰＤＸモデルにおけるｈＢ１の分子応答を評価するために、腸幹細胞マーカー（Ａｘｉｎ２及びＬＧＲ５）、Ｗｎｔ下流マーカー（ＴＣＦ７）、癌幹細胞マーカー（ＣＤ１３３及びＣＤ４４）及び分化マーカー（ＣＥＡＣＡＭ７及びＫＲＴ２０）の発現レベルを測定した。結果は、初期段階で、ｈＢ１処置のグループにおける腸幹細胞マーカー（Ａｘｉｎ２及びＬＧＲ５）及びＷｎｔ下流マーカー（ＴＣＦ７）の発現は、コントロールのグループよりも有意に低かったことを示した。図１３参照。社内のＲＳＰＯ３のＡｂグループの最後の投薬後２９日以内に分析された癌幹細胞マーカー（ＣＤ１３３及びＣＤ４４）、並びに、分化マーカー（ＣＥＡＣＡＭ７及びＫＲＴ２０）の発現は、コントロールのグループと比較して有意に低減された。図１３参照。

実施例１０：α－ＲＳＰＯ３のＡｂはＮＣＩ－Ｈ２０３０ＲＳＰＯ^ｈｉｇｈのＣＤＸモデルの腫瘍増殖を阻害した
ＮＣＩ－Ｈ２０３０肺癌細胞は、肺癌患者のリンパ節に由来した。ＮＣＩ－Ｈ２０３０細胞は、ＲＳＰＯ３の過剰発現を有することが示された。始めに、担腫瘍マウスを、１）ビヒクル、２）ｈＢ１、３）１３１Ｒ０１０、４）カルボプラチン＋ビヒクル、５）カルボプラチン＋ｈＢ１及び６）カルボプラチン＋１３１Ｒ０１０を受ける６つの実験グループに割当てた。図１４参照。１日目から２９日目まで、試験物質又はビヒクルをマウスに週１回静脈内投与した。処置後２９日目に、コントロールのグループの平均腫瘍体積は１７０２±２９８．１ｍｍ^３に達した。２５ｍｇ／ｋｇのｈＢ１での処置は、１１２４±４７１．８ｍｍ^３の最終的な平均腫瘍体積を有する明白な腫瘍増殖阻害を誘発した。同じ投薬量での１３１Ｒ０１０の処置もまた、１３２７．４±１９４．３ｍｍ^３の最終的な平均腫瘍体積を有する抗腫瘍活性を生成した。ｈＢ１は、この研究において治療的有用性を示した。また、この研究では重度の体重減少はなかった。まとめると、単剤として、又はカルボプラチンとの併用で投薬されたｈＢ１は、Ｈ２０３０肺癌ＣＤＸモデルに対して有意な抗腫瘍活性を示した。さらに、ｈＢ１は、ＮＣＩ－Ｈ２０３０癌異種移植モデルにおいてロスマンツズマブよりも優れた抗癌有効性を示した。

実施例１１：α－ＲＳＰＯ３のＡｂは、ＰＴＰＲＫ（ｅ１３）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）融合転写産物を保有するヒトＳＮＵ－１４１１結腸異種移植腫瘍を阻害した
抗ＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１の活性を、ＰＴＰＲＫ（ｅ１３）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）融合転写産物を保有するヒトＳＮＵ－１４１１結腸異種移植腫瘍において、単独及びパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）との併用で、参照の抗ＲＳＰＯ３抗体ＯＭＰ－１３１Ｒ１０と比較した。処置開始後の研究経過中の異なるグループにおける平均腫瘍サイズの結果を図１５に示す。コントロールのｍＡｂグループの平均腫瘍サイズは、１８日目に１０７１ｍｍ^３に達した。１３１Ｒ１０及びｈＢ１は、単独で使用した場合、コントロール処置グループと比較して、ＳＮＵ－１４１１腫瘍増殖に対する抗腫瘍活性を有さなかった（どちらの場合も、一元ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの検査後の比較により、コントロールのｍＡｂ処置グループに対してｐ＞０．０５）。図１５上部参照。１８日目に、平均腫瘍体積は、１３１Ｒ１０について１２６５ｍｍ^３、ＨＢ１について１１７７ｍｍ^３であった。パクリタキセル単独は、１８日目に、コントロールのｍＡｂ処置グループに対して６９％の腫瘍体積減少を生じた（一元ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの検査後の比較により、コントロールのｍＡｂに対してｐ＜０．０５）。図１５上部参照。１８日目に、コントロールのｍＡｂ処置グループと比較して、１３１Ｒ１０及びパクリタキセルの併用、並びに、ｈＢ１及びパクリタキセルの併用は、腫瘍体積をそれぞれ７８％及び８６％減少させた（双方の場合において一元ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの検査後の比較により、コントロールｍＡｂグループに対してｐ＜０．０５）。図１５上部参照。２つの併用グループとパクリタキセル単独の間に統計的有意性はなかった（双方の場合において一元ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙ一対比較により、パクリタキセルのグループに対してｐ＞０．０５）。図１５上部参照。表７に、１８日目のｈＢ１、１３１Ｒ１０、パクリタキセル及びそれらの併用の抗腫瘍有効性をまとめる。概略として、抗体処置は、単剤及びパクリタキセルとの併用で十分に許容された。

１８日目の最終投薬の２４時間後、コントロールのｍＡｂ及び抗ＲＳＰＯ３単剤グループを終了した。処置奏効持続時間を測定するために、パクリタキセル及び併用グループにおける動物に対して処置を継続した。パクリタキセルの抗腫瘍有効性は処置後３週間で喪失し、３２日目（治療後３１日）に９５０ｍｍ^３の平均腫瘍体積に達した。図１５参照。一方、腫瘍増殖抑制は併用グループの双方によって持続され、３２日目のパクリタキセル単独に対して、１３１Ｒ１０及びパクリタキセルによって８２％、ｈＢ１及びパクリタキセルによって７５％の腫瘍体積の減少をもたらした（一元ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙ一対比較により、パクリタキセルに対してｐ＜０．０５）。図１５下部参照。表８に、３２日目（治療後３１日）のパクリタキセル及び併用グループの抗腫瘍活性をまとめた。併用の抗腫瘍有効性は、３６日目以降低減した。４６日目の研究の結論時の平均腫瘍体積は、ｈＢ１及びパクリタキセルについて８７４±２４７ｍｍ^３、１３１Ｒ１０及びパクリタキセルについて３９９±１３８ｍｍ^３であった。

まとめると、本研究は、ＰＴＰＲＫ（ｅ１３）－ＲＳＰＯ３（ｅ２）融合転写産物を保有するヒトＳＮＵ１４１１結腸異種移植腫瘍に対して、ｈＢ１又は１３１Ｒ１０単独での２週間の処置は抗腫瘍効果を有さないが、パクリタキセルとの併用においてはパクリタキセル処置グループと比較して同様の抗腫瘍活性により有効性があることを示した。パクリタキセル媒介性の増殖阻害は処置後３週間で喪失するが、ｈＢ１又は１３１Ｒ１０のいずれかのパクリタキセルとの併用は処置後４週間でも有効性を保つ。腫瘍増殖は、双方の併用について処置後３５日に再開し、１３１Ｒ１０及びパクリタキセルの方がｈＢ１及びパクリタキセルよりも遅い速度であった。

実施例１２：α－ＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１による乳房、結腸、膵臓及び肺の癌組織マイクロアレイにおけるＲＳＰＯ３の免疫組織化学的発現
正常及び病状癌組織におけるＲＳＰＯ３の差異的発現を評価するために、乳癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌の患者における病理学的特徴とのその関連を、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）ベースの免疫組織化学（ＩＨＣ）で評価した。８０例の膵臓腺癌及び正常症例の組織アレイにおけるＲＳＰＯ３の発現をＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１によって評価した。結果は、腫瘍の９１％（２１／２３）が低度から強度のＲＳＰＯ３陽性染色を示すことを示した。対照的に、膵管腺癌の症例において、８．７％（２／２３）のみが陰性染色を示した。結果は、正常又は癌隣接膵臓組織と比較して、後期ＴＮＭ病期分類の膵管腺癌において、より高いＲＳＰＯ３の発現がより頻繁に観察されたことを示した。図１６参照。

５０例の非小細胞肺癌及び正常症例の組織アレイにおけるＲＳＰＯ３の発現を、ＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１によって評価した。結果は、９２．３％（２４／２６）の腫瘍が低度から強度のＲＳＰＯ３陽性染色を示すが、扁平上皮癌腫の症例においては７．７％（２／２６）のみが陰性染色を示すことを示した。図１７参照。

ＲＳＰＯ３の発現について、乳房浸潤性乳管癌腫組織アレイをＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１によって評価した。結果は、腫瘍サンプルの７２％（５４／７５）が低度から強度のＲＳＰＯ３陽性染色を示すが、乳房浸潤性乳管癌腫の症例においては２８％（２１／７５）のみが陰性染色を示すことを示した。図１８参照。

６４例の大腸癌腫及び対応する隣接正常組織のマイクロアレイにおけるＲＳＰＯ３の発現を、ＲＳＰＯ３抗体ｈＢ１によって評価した。結果は、腫瘍の９１．７％（３３／３６）が強度のＲＳＰＯ３陽性染色を示すが、大腸腺癌の症例においては８．３％（３／３６）のみが低染色を示すことを示した。図１９参照。

ｈＢ１によって検出された高ＲＳＰＯ３染色は、膵臓癌、肺癌又は乳癌の患者における遠隔転移と有意に関連していることが見いだされた。

他の実施形態
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同一の、同等の又は類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。したがって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、同等又は類似の特徴の一般的な一連の例にすぎない。

上記の説明から、当業者は、記述された実施形態の本質的な特性を容易に確認することができ、その要旨及び範囲から逸脱することなく、実施形態の種々の変更及び変形を行い、種々の使用法及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。

Claims (22)

1. 抗体であって、
   重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２によるものであり、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号４によるものであり、
   重鎖ＣＤＲ１は、ＡＳＧＨＴＬＴＹＹＷの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ２は、ＹＩＤＰＳＴＧＹＳＥＹＮＱＲＦＥＧＫの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ３は、ＡＲＮＧＰＦＡＹの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＶＲの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＳＳＰＬＴの配列を有し、
   ＲＳＰＯ３タンパク質と特異的に結合する、抗体。
2. 抗体であって、
   重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号６によるものであり、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号８によるものであり、
   重鎖ＣＤＲ１は、ＡＳＧＦＳＩＴＥＹＹの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ２は、ＭＩＤＰＥＮＧＤＴＤＹＡＰＫＦＱＧＫの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ３は、ＨＧＰＧＰＬＥＹの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ２は、ＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ３は、ＦＱＡＳＨＶＰＹＴの配列を有し、
   ＲＳＰＯ３タンパク質と特異的に結合する、抗体。
3. 抗体であって、
   重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１０によるものであり、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１２によるものであり、
   重鎖ＣＤＲ１は、ＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＹＷＮの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ２は、ＹＩＳＹＤＧＴＮＰＳＬＫＤＲの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ３は、ＳＶＬＬＩＱＹＦＮＩの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＴＳＥＳＶＮＮＦＬＡの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ２は、ＨＡＫＴＬＡＤＧＶＳＳＲの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ３は、ＱＨＦＷＳＩＰＷの配列を有し、
   ＲＳＰＯ３タンパク質と特異的に結合する、抗体。
4. 抗体であって、
   重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１４によるものであり、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１６によるものであり、
   重鎖ＣＤＲ１は、ＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＹＷＮの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ２は、ＹＩＳＹＤＧＴＮＮＹＮＰＳＬＫＤの配列を有し、
   重鎖ＣＤＲ３は、ＳＶＬＬＩＱＹＦＮＩの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ１は、ＣＲＴＳＥＳＶＮＮＦＬＡの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ２は、ＨＡＫＴＬＡＤの配列を有し、
   軽鎖ＣＤＲ３は、ＱＨＦＷＳＩＰＷＴの配列を有し、
   ＲＳＰＯ３タンパク質と特異的に結合する、抗体。
5. 前記抗体が、ＩｇＧ抗体、Ｆｃ領域を含有する抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、一本鎖抗体又はｓｃＦＶマルチマーである、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体。
6. 前記抗体が、ヒト化される、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体。
7. 前記抗体が、他の分子に結合される、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体。
8. 請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸配列を具備する単離された核酸分子。
9. 請求項８に記載の単離された核酸を具備する宿主細胞。
10. 請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体を具備する組成物。
11. 薬学的に許容可能な担体をさらに具備する請求項１０に記載の組成物。
12. 他の治療剤をさらに具備する請求項１０又は１１に記載の組成物。
13. ＲＳＰＯ３を阻害するための薬学的組成物の製造における請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
14. Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するための薬学的組成物の製造における請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
15. 癌細胞増殖又は癌細胞転移を阻害するための薬学的組成物の製造における請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
16. 被検体における癌を治療するための薬学的組成物の製造における請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
17. 前記癌が、ＲＳＰＯ３陽性癌、ＲＳＰＯ３融合陽性癌、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）突然変異を有する癌、β－カテニン突然変異を有する癌又はＷｎｔシグナル伝達の活性化過剰を有する癌である、請求項１６に記載の使用。
18. 前記癌が、結腸癌、白血病、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、膠芽腫又は頭頸部癌である、請求項１７に記載の使用。
19. 前記抗体が他の治療剤と共に使用される、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の使用。
20. サンプルにおいてＲＳＰＯ３タンパク質又はそのフラグメントを検出する方法であって、
    請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体を前記サンプルに接触させるステップと、
    前記抗体とＲＳＰＯ３タンパク質又はそのフラグメントとの間の特異的な結合のためのアッセイをするステップと、
    を具備する方法。
21. 前記ＲＳＰＯ３タンパク質がヒトＲＳＰＯ３である、請求項２０に記載の方法。
22. ＲＳＰＯ３タンパク質に特異的に結合する抗体変異体を同定する方法であって、
    請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体の１以上の相補性決定領域に１以上の変異を導入して抗体変異体を産生するステップと、
    ＲＳＰＯ３タンパク質に特異的に結合する抗体変異体を同定するステップと、
    を具備する方法。

Images