KR20150036603A - Rspo3 결합제 및 그의 용도 - Google Patents

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오스틴 엘. 거니
크리스토퍼 제이. 본드
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온코메드 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

본 발명은 RSPO-결합제, 특히 RSPO3-결합제, 및 암과 같은 질환을 치료하기 위해 이러한 결합제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간 RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하고 β-카테닌 활성을 조절하는 항체를 제공한다. 본 발명은 RSPO3 단백질의 활성을 조절하고 종양 성장을 억제하는 작용제를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 치료 유효량의 본 발명의 작용제 또는 항체를 종양 또는 암을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

RSPO3 결합제 및 그의 용도{RSPO3 BINDING AGENTS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 7월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 61/671,421, 2013년 1월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 61/753,184, 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 61/789,156, 및 2013년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 61/826,747을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
일반적으로 본 발명의 분야는 R-스폰딘(Spondin) 단백질 (RSPO), 특히 인간 R-스폰딘 단백질 RSPO3에 결합하는 항체 및 기타 작용제, 뿐만 아니라 암과 같은 질환의 치료를 위해 이러한 항체 또는 기타 작용제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
R-스폰딘 (RSPO) 패밀리의 단백질은 척추동물 간에 보존되고, RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4의 4개의 구성원을 포함한다. 이러한 단백질들은 천장판(roof plate)-특이적 스폰딘, hPWTSR (hRSPO3), THS2D (RSPO3), 크리스틴(Cristin) 1-4, 및 푸트린(Futrin) 1-4를 비롯한 다양한 명칭으로 지칭되었다. RSPO는 전체적으로 약 40-60%의 서열 상동성 및 도메인 구성을 공유하는 소형 분비형 단백질이다. 모든 RSPO 단백질은 N-말단의 2개의 푸린-유사 시스테인-풍부 도메인에 이어지는 트롬보스폰딘 도메인 및 염기성 전하를 띠는 C-말단 꼬리를 함유한다 (문헌 [Kim et al., 2006, Cell Cycle, 5:23-26]).
척추동물의 발생 과정 (Kamata et al., 2004, Biochim. Biophys Acta, 1676:51-62), 및 크세노푸스(Xenopus) 근발생에서 (Kazanskaya et al., 2004, Dev. Cell, 7:525-534), RSPO 단백질이 역할을 한다는 것이 연구에서 나타났다. RSPO1은 위장 상피 세포에 대한 강력한 미토겐으로서 기능하는 것으로 또한 나타났다 (Kim et al., 2005, Science, 309:1256-1259). RSPO3이 크세노푸스 및 마우스에서의 내피 세포 및 그의 세포 전구체에서 우세하게 발현되거나 또는 그에 근접함이 보고되었다. 또한, RSPO3이 배아발생에서 혈관신생 인자로서 작용할 수 있다는 것이 시사되었다 (Kazanskaya et al., 2008, Development, 135:3655-3664). RSPO 단백질은 Wnt 신호전달과 유사한 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 것으로 공지되었지만, RSPO 단백질과 Wnt 신호전달 사이의 관계는 여전히 연구 중이다. RSPO 단백질이 Wnt 리간드에 대한 양성 조절 활성을 지닌다는 것이 보고되었다 (Nam et al., 2006, JBC 281:13247-57). 상기 연구는 RSPO 단백질이 프리즐드(Frizzled)8 및 LRP6 수용체 리간드로서 기능할 수 있고 β-카테닌 신호전달을 유도할 수 있다는 것을 또한 보고하였다 (Nam et al., 2006, JBC 281:13247-57). 최근의 연구에서 RSPO 단백질과 LGR (류신-풍부 반복부 함유, G 단백질-커플러 수용체) 단백질, 예컨대 LGR5 사이의 상호작용이 확인되었고 (미국 특허 공개 번호 2009/0074782 및 2009/0191205), 이러한 데이터는 β-카테닌 신호전달의 활성화를 위한 대안적인 경로를 나타낸다.
Wnt 신호전달 경로가 암 요법을 위한 잠재적인 표적으로서 확인되었다. Wnt 신호전달 경로는 배아 패턴 형성, 배아-후 조직 유지, 및 줄기 세포 생물학의 여러 결정적인 조절인자 중 하나이다. 보다 구체적으로, Wnt 신호전달은 세포 극성의 생성 및 세포 운명 지정 (줄기 세포 집단에 의한 자가 재생 포함)에서 중요한 역할을 한다. Wnt 경로의 조절되지 않은 활성화는 수많은 인간 암과 연관되고, 이때 이러한 활성화가 세포의 발생적 운명을 변경시킬 수 있는 것으로 여겨진다. Wnt 경로의 활성화는 종양 세포를 미분화 상태에서 유지시킬 수 있고/있거나 제어되지 않은 증식에 이를 수 있다. 따라서, 정상적인 발생 및 조직 복구를 제어하는 항상성 메카니즘을 압도함으로써 발암이 진행될 수 있다 (문헌 [Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50]; [Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31]에서 고찰됨).
Wnt 신호전달 경로는 날개가 없는 드로소필라(Drosophila) 발생적 돌연변이체 (wg)에서, 그리고 뮤린 원종양유전자 int-1 (현재 Wnt1)로부터 최초로 해명되었다 (Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109; Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40; Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63; Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57). Wnt 유전자는 19개가 포유동물에서 확인되어 있는 분비형 지질-변형 당단백질을 코딩한다. 이러한 분비형 리간드는 프리즐드 (FZD) 수용체 패밀리 구성원 및 저밀도 지단백질 (LDL) 수용체-관련 단백질 5 또는 6 (LRP5/6)으로 이루어진 수용체 복합체를 활성화시킨다. FZD 수용체는 G-단백질이 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 7개의 막횡단 도메인 단백질이고, 시스테인-풍부 도메인 (CRD) 또는 Fri 도메인으로 공지된, 10개의 시스테인이 보존되어 있는 대형 세포외 N-말단 리간드 결합 도메인을 함유한다. FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, 및 FZD10의 10개의 인간 FZD 수용체가 있다. 상이한 FZD CRD는 특정 Wnt 단백질에 대한 결합 친화도가 상이하고 (Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9), FZD 수용체는 정규 β-카테닌 경로를 활성화시키는 것과 비-정규 경로를 활성화시키는 것으로 분류되었다 (Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72).
Wnt1 (원래는 int1)가 뮤린 바이러스의 인근 삽입에 의해 형질전환된 유방 종양에서 종양유전자로서 확인되는 것으로 암에서의 Wnt 신호전달의 역할이 최초로 밝혀졌다 (문헌 [Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109]). 이후에, 유방암에서의 Wnt 신호전달의 역할에 대한 추가적인 증가가 축적되었다. 예를 들어, 유선에서의 β-카테닌의 트랜스제닉 과발현은 증식증 및 선암종을 초래하는 반면 (Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153:555-68; Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9), Wnt 신호전달 상실은 정상적인 유선 발달을 파괴한다 (Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49; Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58). 인간 유방암에서, 50%를 초과하는 암종에서 β-카테닌 축적이 활성화된 Wnt 신호전달을 함축하고, 특정 돌연변이가 확인되지는 않았지만, 프리즐드 수용체 발현의 상향조절이 관찰되었다 (Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-31; Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol., 25:1337-42).
Wnt 경로의 활성화는 결장직장암과 또한 연관된다. 모든 결장직장암의 약 5-10%는 유전성이고, 주요 형태 중 하나는 병에 걸린 개체의 약 80%가 선종성 결장 폴립증 (APC) 유전자에서의 생식계열 돌연변이를 함유하는 상염색체 우성 질환인 가족성 선종 폴립증 (FAP)이다. 액신 및 β-카테닌이 포함되는 다른 Wnt 경로 성분에서 돌연변이가 또한 확인되었다. 개별적인 선종은 제2의 불활성화된 대립유전자를 함유하는 상피 세포의 클론성 증식물이고, 다수의 FAP 선종은 종양유전자 및/또는 종양 억제 유전자에서의 추가적인 돌연변이를 통한 선암종의 발달을 필연적으로 초래한다. 또한, APC에서의 기능 상실 돌연변이 및 β-카테닌에서의 안정화 돌연변이가 포함되는 Wnt 신호전달 경로의 활성화는 마우스 모델에서 과형성 발달 및 종양 성장을 유도할 수 있다 (Oshima et al., 1997, Cancer Res., 57:1644-9]; [Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42).
유방암 및 결장암과 유사하게, β-카테닌의 핵 축적에 의해 지시되는 바와 같이, 흑색종에는 종종 Wnt 경로의 구성적 활성화가 있다. 일부 흑색종 종양 및 세포주에서의 Wnt/β-카테닌 경로의 활성화는 APC, ICAT, LEF1 및 β-카테닌과 같은 경로 성분에서의 변형에 기인한다 (예를 들어, 문헌 [Larue et al. 2006, Frontiers Biosci., 11:733-742] 참조). 그러나, 이러한 문헌에는 흑색종에서의 Wnt/β-카테닌 신호전달의 정확한 역할에 관한 상반되는 보고가 있다. 예를 들어, 상승된 수준의 핵 β-카테닌이 흑색종으로부터의 생존 개선과 상관된다는 것과 활성화된 Wnt/β-카테닌 신호전달이 감소된 세포 증식과 연관되었다는 것이 한 연구에서 발견되었다 (Chien et al., 2009, PNAS, 106:1193-1198).
인간 암에 관여하는 유전자, 단백질 및 경로를 목표로 하는 표적화 요법을 향해 암 약물 연구의 초점이 이동하고 있다. 암 환자에게 치료 이익을 제공할 수 있는, 신호전달 경로를 표적으로 하는 새로운 작용제 및 다중 경로를 표적으로 하는 작용제들의 새로운 조합물이 요구된다. 따라서, β-카테닌 신호전달을 파괴하는 생체분자 (예를 들어, 항-RSPO3 항체)는 암, 뿐만 아니라 기타 β-카테닌-연관 질환에 대한 새로운 치료제의 잠재적인 공급원이다.
발명의 간단한 개요
본 발명은 RSPO3 단백질에 결합하는 결합제, 예컨대 항체, 뿐만 아니라 이러한 결합제를 포함하는 조성물, 예컨대 제약 조성물을 제공한다. RSPO3 뿐만 아니라 적어도 하나의 추가의 항원 또는 표적에 결합하는 결합제, 및 이러한 결합제의 제약 조성물이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 신규 폴리펩티드, 예컨대 항체, 항체 단편, 및 이같은 항체에 관련된 다른 폴리펩티드이다. 본 발명은 RSPO3-결합제를 종양이 있는 대상체에게 투여함으로써 종양 성장을 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 RSPO3-결합제를 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하거나 종양 성장을 억제하는 방법은 암 줄기 세포를 RSPO3-결합제로 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 β-카테닌 신호전달을 파괴하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 혈관신생을 조절 (예를 들어, 억제)하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 종양 내의 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 것, 종양 내의 암 줄기 세포의 개수를 감소시키는 것, 종양의 종양발생성을 감소시키는 것 및/또는 종양 내의 암 줄기 세포의 개수 또는 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양발생성을 감소시키는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 결합제, 예컨대 항체를 제공한다. 인간 RSPO3의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 서열 3으로서 본원에 포함된다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 22-272 내에서 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 22-207 내에서 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 35-135 내에서 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 35-86 내에서 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 92-135 내에서 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO1, RSPO2, 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기타 인간 RSPO에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 β-카테닌 활성을 조절하고/하거나, β-카테닌 신호전달의 길항제이고/이거나, β-카테닌 신호전달을 억제하고/하거나, β-카테닌의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 하나 이상의 LGR 단백질 (예를 들어, LGR4, LGR5, 및/또는 LGR6)에 결합하는 것을 억제하거나 또는 방해하고/거나 파괴한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR5에 결합하는 것을 억제한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34), DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) IYPSNGDS (서열 10), YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (c) ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35), TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (d) QSVDYDGDSYM (서열 12), KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (e) AAS (서열 13), AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 (f) QQSNEDPLT (서열 14), QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 치환은 배선 인간화 과정의 일부로서 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 IgG2 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모노클로날 항체 131R002 또는 모노클로날 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모노클로날 항체 131R002 또는 모노클로날 항체 131R003의 친화도-성숙 변이체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002 또는 항체 131R003으로부터의 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002 또는 항체 131R003의 인간화 형태이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하는 결합제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 결합제 (예를 들어, 항체)는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제가 경쟁하는 항체는 항체 131R002 또는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제가 경쟁하는 항체는 항체 131R002 또는 항체 131R003의 인간화 형태이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제가 경쟁하는 항체는 항체 h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 시험관내 경쟁 결합 검정에서 본 발명의 항체와 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 결합제는 본 발명의 항체 (예를 들어, 131R002, 131R003, 또는 그의 인간화 형태/변이체)와 동일하거나, 또는 본질적으로 동일한 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합제는 항체 h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011과 동일하거나, 또는 본질적으로 동일한 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다.
또 다른 측면에서, 결합제는 본 발명의 항체 (예를 들어, 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 형태/변이체)에 의해 결합된 RSPO3 상의 에피토프와 중복되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체 h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011에 의해 결합된 RSPO3 상의 에피토프와 중복되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다.
각각의 상기 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 다른 측면의 특정 실시양태 및/또는 본원에 달리 기재된 실시양태에서, 결합제는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 특히 인간 RSPO3 및 제2 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 특히 인간 RSPO3 및 인간 RSPO1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 특히 인간 RSPO3 및 인간 RSPO2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 특히 인간 RSPO3 및 인간 RSPO4에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 β-카테닌 활성을 조절한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 β-카테닌 활성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 β-카테닌의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2개의 동일한 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG1 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG2 항체이다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 RSPO1에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 RSPO2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. RSPO1에 대한 항체 또는 RSPO2에 대한 항체의 비제한적 예는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/012747에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 부위는 공통 (예를 들어, 동일한) 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 b) 인간 RSPO1에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 부위는 a) KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 a) 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 b) 인간 RSPO2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 부위는 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하고, 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하고, 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 결합 부위를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 결합 부위는 공통 (예를 들어, 동일한) 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
각각의 상기 언급된 측면, 뿐만 아니라 본원에 달리 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 단리된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 실질적으로 순수하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는: 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 41, 서열 42, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 68, 서열 69, 서열 72, 서열 73, 서열 74, 서열 86, 서열 87, 및 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 15 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 16 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 36 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 37 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 44 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 45 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 62 및/또는 서열 17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 44 및/또는 서열 72를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 45 및/또는 서열 72를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 62 및/또는 서열 72를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 44 및/또는 서열 86을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 45 및/또는 서열 86을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 62 및/또는 서열 86을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 21 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 22 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 38 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 41 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 46 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 47 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 63 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 68 및/또는 서열 23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 46 및/또는 서열 73을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 47 및/또는 서열 73을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 63 및/또는 서열 73을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 68 및/또는 서열 73을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 46 및/또는 서열 87을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 47 및/또는 서열 87을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 63 및/또는 서열 87을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 68 및/또는 서열 87을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 28 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 39 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 42 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69 및/또는 서열 29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48 및/또는 서열 74를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49 및/또는 서열 74를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64 및/또는 서열 74를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69 및/또는 서열 74를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48 및/또는 서열 88을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49 및/또는 서열 88을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64 및/또는 서열 88을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69 및/또는 서열 88을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 임의의 항체의 부분, 예컨대 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 각각의 상기 언급된 측면, 뿐만 아니라 본원에 달리 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 항체 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 40, 서열 43, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 70, 서열 71, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 84, 서열 85, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94와 서열 95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 41, 서열 42, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 68, 서열 69, 서열 72, 서열 73, 서열 74, 서열 86, 서열 87, 및 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 뿐만 아니라 이러한 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 하이브리도마 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포는 모노클로날 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다.
다른 측면에서, 본 발명은 종양을 유효량의 각각의 본원에 기재된 것들이 포함되는 RSPO3-결합제 또는 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 각각의 본원에 기재된 것들이 포함되는 RSPO3-결합제 또는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 유효량의 각각의 본원에 기재된 것들이 포함되는 RSPO3-결합제 또는 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 β-카테닌 신호전달을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 유방 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 하나 이상의 RSPO 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 RSPO1을 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 RSPO2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 RSPO3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 높은 수준의 적어도 하나의 RSPO 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 높은 수준의 RSPO1을 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 높은 수준의 RSPO2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 높은 수준의 RSPO3을 발현한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는, 예를 들어 종양 내의 암 줄기 세포의 개수 및/또는 빈도를 감소시키는 것에 의해, 종양 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO 유전자 융합체를 함유한다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO2 유전자 융합체를 함유한다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3 유전자 융합체를 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에게 치료 유효량의 상기 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에서 기재된 것들 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 선종성 결장 폴립증 (APC) 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 APC 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 야생형 APC 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 RSPO 유전자 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 RSPO2 유전자 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 RSPO3 유전자 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 난소암이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 적어도 하나의 RSPO 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 RSPO3을 발현하는 난소암이다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 RSPO3을 발현하는 폐암이다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 RSPO3을 발현하는 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 RSPO3을 발현하는 췌장암이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 각각의 본원에 기재된 것들이 포함되는 RSPO3-결합제 또는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 β-카테닌의 활성화, 증가된 β-카테닌 신호전달 및/또는 비정상적인 β-카테닌 신호전달과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
각각의 상기 언급된 측면, 뿐만 아니라 본원에 달리 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 치료 방법은 종양 또는 암에서의 적어도 하나의 RSPO 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 각각의 본원에 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 RSPO3-결합제 또는 항체를 이용한 치료를 위해 인간 대상체를 확인하거나 또는 인간 대상체를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에 정상 조직에서의 동일한 RSPO 단백질의 발현 또는 동일한 RPSO 단백질의 미리 결정된 수준과 비교하여 특정 RSPO (예를 들어, RSPO3)의 발현 수준이 상승된 종양이 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 종양에서 RSPO 발현 수준이 상승된 경우에 치료를 위해 대상체가 확인되거나 또는 치료를 위해 대상체가 선택되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에 APC 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함하는 종양이 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 종양이 APC 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함하는 경우에 치료를 위해 대상체가 확인되거나 또는 치료를 위해 대상체가 선택되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체가 RSPO 유전자 융합체 (예를 들어, RSPO3 유전자 융합체)를 포함하는 종양을 갖는 지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양이 RSPO 유전자 융합체 (예를 들어, RSPO3 유전자 융합체)를 포함하는 경우에 치료를 위해 대상체가 확인되거나 또는 치료를 위해 대상체를 선택하는 것을 포함한다.
각각의 상기 언급된 측면, 뿐만 아니라 본원에 달리 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 치료 방법은 대상체에게 RSPO3-결합제 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 추가로 제공되고, RSPO3-결합제를 생산하는 세포주도 추가로 제공된다. 대상체에게 RSPO3-결합제를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체 (예를 들어, 인간)에서 암을 치료하고/하거나 종양 성장을 억제하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬(Markush) 군 또는 다른 대안적인 군의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 총괄적으로 열거된 전체 군을 포함할 뿐만 아니라, 개별적인 각각의 구성원, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 및 또한 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 그룹을 또한 포함한다. 본 발명은 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상이 명확하게 배제되는 것도 또한 구상한다.
도 1. 종양 및 정상 조직에서의 RSPO 발현. 인간의 정상, 양성 및 악성 조직 샘플로부터의 마이크로어레이 데이터의 요약이 제시된다. 개별적인 틱(tick) 마크는 RSPO mRNA의 발현 수준을 가리킨다. a) RSPO1 b) RSPO2 c) RSPO3
도 2. RSPO 단백질 및 LGR5의 결합 연구. LGR5를 발현하는 HEK-293 세포의 FACS 분석. HEK-293 세포를 FLAG-LGR5-CD4TM-GFP를 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 후, 이어서 가용성 RSPO1-Fc, RSPO2-Fc, RSPO3-Fc, 또는 RSPO4-Fc 융합 단백질과 혼합하였다. 항-FLAG 항체가 양성 대조군으로 사용되었고, 가용성 FZD8-Fc가 음성 대조군으로 사용되었다. 각각의 FACS 플롯 상의 진한 선 상자 오버레이 내의 신호의 존재에 의해 특이적 결합이 지시된다.
도 3. 항-RSPO3 항체는 RSPO3 및 WNT3A에 의해 유도되는 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 탑플래시(TOPflash) 루시페라제 리포터 검정을 사용하여, 증가되는 농도의 항-RSPO3 항체 (131R002 또는 131R003)의 존재 하에 WNT3a (5 ng/ml) 및 RSPO3 (10 ng/ml)의 조합물에 노출시킨 후의 HEK-293 세포에서의 β-카테닌 신호전달을 측정하였다. 20 μg/ml에서 0.02 μg/ml로의 4배 희석물로서 항체가 사용되었다. 대조군은 대조군 배지 (WNT3a 없음 및 RSPO 없음), WNT3a 단독, 또는 항체 부재 하의 WNT3a 및 RSPO3의 조합물에 대한 노출을 포함하였다.
도 4. 친화도-성숙 131R003 항체 변이체는 RSPO3 및 WNT3A에 의해 유도된 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 탑플래시 루시페라제 리포터 검정을 사용하여, 증가되는 농도의 항-RSPO3 항체 (131R003 (-▲-), 131R003 CDR1 변이체 (-■-) 또는 131R003 CDR3 변이체 (-●-))의 존재 하에 WNT3a 및 RSPO3의 조합물에 노출시킨 후의 HEK-293 세포에서의 β-카테닌 신호전달을 측정하였다. 20 μg/ml에서 0.006 μg/ml로의 5배 희석물로서 항체가 사용되었다. 대조군은 대조군 배지 (WNT3a 없음 및 RSPO 없음)/세포 단독 (-△-), 대조군 항체 (-▼-), WNT3a 단독 (-◆-), 또는 항체 부재 하의 WNT3a 및 RSPO3의 조합물 (-□-)에 대한 노출을 포함하였다.
도 5. 항-RSPO 항체로의 종양 성장의 억제. OV38 난소 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO1 항체 89M5 및 항-RSPO3 항체 131R003의 조합물 (-●-), 탁솔 (-▲-), 항-RSPO1 항체 89M5, 항-RSPO3 항체 131R003 및 탁솔의 조합물 (-▼-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다.
도 6. 항-RSPO 항체로의 종양 성장의 억제. OV38 난소 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO1 항체 89M5 및 항-RSPO3 항체 131R002의 조합물 (-▲-), 항-RSPO1 항체 89M5 및 탁솔의 조합물 (-○-), 항-RSPO3 항체 131R002 및 탁솔의 조합물 (-□-), 항-RSPO1 항체 89M5, 항-RSPO3 항체 131R002 및 탁솔의 조합물 (-△-), 탁솔 단독 (-▼-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다.
도 7. 항-RSPO3 항체로의 종양 성장의 억제. (A) LU45 폐 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002 (-○-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. (B) LU25 폐 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002 (-○-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다.
도 8. 친화도-성숙 항체 변이체는 RSPO3 및 WNT3A에 의해 유도된 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 탑플래쉬 루시페라제 리포터 검정은 WNT3a 및 인간 RSPO3의 조합물에 노출시킨 후의 HEK-293T 세포에서 증가되는 농도의 항-RSPO3 항체 131R002 (-▲-), 131R006 (-●-) 또는 131R007 (-■-)의 존재 하에 β-카테닌 신호전달을 측정하는데 사용되었다. 항체는 20μg/ml에서 0.0064μg/ml로의 5배 연속 희석물로서 사용되었다. 대조군은 대조군 배지 (WNT3a 없음 및 RSPO 없음/세포 (-○-)), WNT3a 단독 (-▼-) 또는 항체의 부재 하에 WNT3a 및 인간 RSPO3의 조합물 (-◆-)에 노출시키는 것을 포함하였다.
도 9. 항-RSPO3 항체에 의한 RSPO3과 LGR5의 상호작용의 억제. LGR5를 발현하는 HEK-293T 세포의 FACS 분석. HEK-293T 세포를 인간 LGR5 (FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)의 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시키고, 후속적으로 항-RSPO3 항체 131R006 또는 131R007과 조합된 RSPO3-비오틴 융합 단백질과 혼합하였다. PE-접합 스트렙타비딘으로 결합을 검출하였다. 상대적인 RSPO3-비오틴 결합을 y축에 나타내고, FLAG-LGR5-CD4TM-GFP 융합 단백질의 발현을 x축에 나타낸다. 각각의 FACS 플롯 상의 진한 선 상자 오버레이 내의 신호의 존재에 의해 양성 결합이 지시된다.
도 10. 항-RSPO 항체로의 종양 성장의 억제. NCI-H2030 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002 (-●-), 카르보플라틴 단독 (-△-), 항-RSPO3 항체 131R002 및 카르보플라틴의 조합물 (-○-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다.
도 11. 항-RSPO 항체로의 종양 성장의 억제. LU102 폐 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002 (-●-), 카르보플라틴 단독 (-△-), 항-RSPO3 항체 131R002 및 카르보플라틴의 조합물 (-○-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. (A) 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다. (B) 유전자 세트 풍부화 분석 결과.
도 12. 항-RSPO 항체로의 종양 성장의 억제. PN35 췌장 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002 (-●-), 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 (아브락산(ABRAXANE))의 조합물 (-△-), 항-RSPO3 항체 131R002 및 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 (아브락산)의 조합물 (-○-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다. (A) 모든 4개의 처리군; (B) 확대된 눈금의 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 처리군 및 항-RSPO3 항체, 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 처리.
도 13. RSPO3 및 WNT3A에 의해 유도된 β-카테닌 신호전달의 억제. 탑플래쉬 루시페라제 리포터 검정은 WNT3a 및 인간 RSPO3의 조합에 노출시킨 후의 HEK-293T 세포에서 증가되는 농도의 항-RSPO3 항체 131R007 (-□-) 또는 131R010 (-●-)의 존재 하에 β-카테닌 신호전달을 측정하는데 사용되었다. 항체는 20μg/ml에서 0.0064μg/ml로의 5배 연속 희석물로서 사용되었다. 대조군은 대조군 배지 (WNT3a 없음 및 RSPO 없음/세포 (-▲-)), WNT3a 단독 (-▼-) 또는 항체의 부재 하에 WNT3a 및 인간 RSPO3의 조합물 (-◆-)을 노출시키는 것을 포함하였다.
도 14. 항-RSPO 항체로의 종양 성장의 억제. LU25 NSCLC 폐 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스를 항-RSPO3 항체 131R008 (-▲-), 파클리탁셀 단독 (-○-), 항-RSPO3 항체 131R008 및 파클리탁셀의 조합물 (-●-) 또는 대조군 항체 (-■-)로 처리하였다. 데이터는 처리 후 일수에 걸친 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다.
본 발명은 RSPO 단백질, 특히 인간 RSPO3에 결합하는 폴리펩티드, 예컨대 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신규 작용제를 제공한다. RSPO3-결합제는 β-카테닌 신호전달의 길항제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. RSPO3-결합제는 RSPO3과 LGR 단백질 상호작용의 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 관련된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, RSPO3-결합제를 포함하는 조성물, 및 RSPO3-결합제를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 신규 RSPO3-결합제를 사용하는 방법, 예컨대 종양 성장을 억제하는 방법, 암을 치료하는 방법, 혈관신생을 조절하는 방법, 종양 내의 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법, β-카테닌 신호전달을 억제하는 방법, 및/또는 치료를 위해 대상체를 확인 및/또는 선택하는 방법이 추가로 제공된다.
인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 확인되었다 - 모노클로날 항체 131R002 및 131R003 (실시예 3). 항-RSPO3 항체 131R002 및 131R003은 10 nM 미만의 인간 RSPO3에 대한 결합 친화도를 갖는다 (실시예 3). 항-RSPO3 항체 131R002 및 131R003은 RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 억제한다 (실시예 4, 도 3). 131R003의 친화도-성숙 변이체는 RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 억제하고, 모 131R003보다 큰 활성을 갖는다 (실시예 5, 도 4). 항-RSPO3 항체는 단일 작용제로서, 항-RSPO1 항체와 조합하여, 및 1종 이상의 화학요법제와 조합하여 종양 성장을 억제한다 (실시예 6, 7, 11 12 및 14; 도 5-7, 10-12 및 14). 인간화 항-RSPO3 항체 h131R006 및 h131R007은 항체 131R002의 β-카테닌 활성보다 더 강한 억제제이다 (실시예 8, 도 8). 항-RSPO3 항체 h131R006 및 h131R007은 LGR5에 대한 RSPO3의 결합을 차단한다 (실시예 9, 도 9). 인간화 항-RSPO3 항체 h131R010 이소형 IgG1은 IgG2 이소형 항체 h131R007와 유사하게 β-카테닌 활성을 억제한다 (실시예 13, 도 13).
I. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "길항제" 및 "길항성"은 표적 및/또는 신호전달 경로 (예를 들어, β-카테닌 신호전달)의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화하는 임의의 분자를 지칭한다. 용어 "길항제"는 단백질 (예를 들어, RSPO 단백질)의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화하는 임의의 분자를 포함하도록 본원에서 사용된다. 적절한 길항제 분자는 특히 길항제 항체 또는 항체 단편이 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절" 및 "조절하다"는 생물학적 활성의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조절은 활성을 자극하거나 억제하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 조절은 활성의 증가 또는 감소 (예를 들어, RSPO 신호전달의 감소; β-카테닌 신호전달의 감소), 결합 특성의 변화, 또는 단백질, 경로 또는 다른 생물학적 관심 지점의 활성과 연관된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 특성의 임의의 다른 변화일 수 있다.
본원에 사용된 경우의 "항체"라는 용어는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역(들) 내의 하나 이상의 항원-결합 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합물을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 경우, 이러한 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 단일 쇄 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 항체, 이중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위 (즉, 항원-결합 부위)를 포함하는 다른 임의의 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이의 중쇄 불변 도메인의 신원을 기초로 5가지 주요 이뮤노글로불린 부류 중 임의의 것일 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 서브부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 상이한 이뮤노글로불린 부류는 상이하고 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 배위를 갖는다. 항체는 네이키드일 수 있거나 또는 독소 및 방사성동위원소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 분자에 접합될 수 있다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부분을 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "항체 단편"은 항원-결합 부위 또는 에피토프 결합 부위를 포함한다.
항체의 "가변 영역"이라는 용어는 단독이거나 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 "초가변 영역"으로 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하게 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지의 기술이 존재한다: (1) 종-교차 서열 가변성을 기초로 하는 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda MD.]), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 하는 접근법 (문헌 [Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948]). 또한, 이러한 2가지 접근법의 조합이 CDR을 결정하기 위해 때때로 관련 기술분야에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에서 수반되는 균질한 항체 집단을 지칭한다. 이는 상이한 항원 결정기들에 대해 지시된 상이한 항체들의 혼합물을 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 다, 뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 항체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위 (항원-결합 부위)를 포함하는 다른 임의의 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체"는 하이브리도마 생산, 파지 선별, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 기술에 의해 제조된 이러한 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화 항체"는 최소량의 비-인간 서열을 함유하는 특이적 이뮤노글로불린 쇄, 키메라 이뮤노글로불린 또는 그의 단편인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 지니는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린이다 (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 구조 및/또는 결합 능력을 지니는 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 항체 특이성, 친화도, 구조 및/또는 결합 능력을 정련하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 내 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가적인 잔기의 치환에 의해 인간화 항체가 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하는 적어도 1개, 전형적으로는 2개 또는 3개의 실질적으로 모든 CDR을 실질적으로 모두 포함할 것인 한편, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 또한 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성시키는데 사용되는 방법의 예는, 예를 들어 미국 특허 5,225,539에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체, 또는 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열의 항체를 지칭한다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 CDR을 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항체"는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 서열이 2가지 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력이 있는 한가지 종의 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편, 불변 영역은 또 다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "친화도-성숙 항체"는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 초래하는 하나 이상의 변경이 하나 이상의 CDR 내에 있는 항체를 지칭한다. 정의는 또한 CDR 잔기에 대한 변경과 관련하여 생산된 비-CDR 잔기에 변경을 포함한다. 바람직한 친화도-성숙 항체는 표적 항원에 대한 친화도이 나노몰 또는 심지어 피코몰일 것이다. 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 친화도-성숙 항체가 생산된다. 예를 들어, VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도-성숙이 문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783]에 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 문헌 [Barbas et al., 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154:3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896]에 기재되어 있다. 부위-지정 돌연변이유발은 또한 친화도-성숙 항체를 획득하는데 사용될 수 있다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 특정 항체가 인식하고 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 인접 아미노산 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접하지 않은 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성 시에 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체형태적 에피토프로도 지칭됨)은 전형적으로 단백질 변성 시 상실된다. 전형적으로 에피토프는 독특한 공간 입체형태의 적어도 3개, 보다 일반적으로는 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
본원에 상호교환적으로 사용된 용어 "이종다량체 분자" 또는 "이종다량체" 또는 "이종다량체 복합체" 또는 "이종다량체 폴리펩티드"는 적어도 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하고, 여기서 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열과 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이하다. 이종다량체 분자는 제1 및 제2 폴리펩티드에 의해 형성되는 "이종이량체"를 포함할 수 있거나, 또는 추가의 폴리펩티드가 존재하는 고차의 3차 구조를 형성할 수 있다.
"선택적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 결합제 또는 항체가 관련되지 않은 단백질이 포함되는 대안적인 물질보다 더욱 빈번하게, 더욱 신속하게, 더 긴 기간 동안, 더 큰 친화도으로, 또는 상기의 것들의 일부 조합으로 에피토프, 단백질 또는 표적 분자와 반응하거나 회합된다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는, 예를 들어 항체가 약 0.1 mM 이하, 더욱 일반적으로는 약 1 μM 미만의 KD로 단백질과 결합한다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는 항체가 때로는 적어도 약 0.1 μM 이하, 때로는 적어도 약 0.01 μM 이하, 때로는 적어도 약 1 nM 이하의 KD로 표적과 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서의 상동성 단백질 간의 서열 동일성으로 인해, 특이적 결합은 1가지를 초과하는 종에서의 단백질 (예를 들어, 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3)을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상이한 단백질들의 폴리펩티드 서열의 특정 영역에서의 상동성으로 인해, 특이적 결합은 1가지를 초과하는 단백질 (예를 들어, 인간 RSPO3 및 인간 RSPO1)을 인식하는 항체 (또는 기타 폴리펩티드 또는 결합제)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 표적을 특이적으로 인식하는 항체 또는 결합 모이어티가 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 그러므로, "특이적 결합"은 배타적인 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있지만) 필수적으로 요구하지 않는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 항체는 1가지를 초과하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다중 표적에 항체 상의 동일한 항원-결합 부위가 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체가 2개의 동일한 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 이들 각각은 2개 이상의 단백질 (예를 들어, RSPO3 및 RSPO1) 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정의 대안적인 실시양태에서, 항체는 다중특이적일 수 있고, 특이성이 상이한 2개 이상의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 이중특이적 항체는 1개의 단백질 (예를 들어, 인간 RSPO3) 상의 에피토프를 인식하는 1개의 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 제2 단백질 (예를 들어, 인간 RSPO2) 상의 상이한 에피토프를 인식하는 제2의 상이한 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 일반적으로, 필수적이지는 않지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이러한 용어는 천연적으로 또는 개입, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 이러한 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산이 포함됨), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기초로 하기 때문에, 특정 실시양태에서 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
"고 엄격성 조건"은 (1) 세척용으로 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 15 mM NaCl/1.5 mM 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트, 50℃를 사용하는 것; (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 50% (v/v) 포름아미드 + 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제, pH 6.5, 5× SSC (0.75 M NaCl, 75 mM 시트르산나트륨), 42℃를 사용하는 것; 또는 (3) 혼성화 동안 50% 포름아미드, 5× SSC, 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5× 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트, 42℃를 사용하고, 42℃, 0.2× SSC 및 50% 포름아미드에서 세척한 후, EDTA를 함유하는 0.1× SSC, 55℃로 이루어진 고-엄격성 세척에 의해 확인될 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서의 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이라는 용어는 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되었을 때 (필요하다면 갭(gap)이 도입됨), 동일하거나 또는 상술된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 지니는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭하고, 이때 임의의 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 또는 육안 검사로 동일성 백분율을 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 여기에는 BLAST, ALIGN, 메갈라인(Megalign), 베스트핏(BestFit), GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package), 및 이의 변형이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 2개의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사로 측정된 바와 같이 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되었을 때 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시양태에서는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성이 있다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 길이가 적어도 약 10개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40-60개의 잔기, 적어도 약 60-80개의 잔기 또는 이들 사이의 임의의 정수 값인 서열의 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다. 일부 실시양태에서, 60-80개의 잔기보다 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-100개의 잔기에 걸쳐 동일성이 존재하고, 일부 실시양태에서, 비교되는 서열들의 전장, 예컨대 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역에 걸쳐 서열들이 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 1개의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄가 있는 또 다른 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 포함되는 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기들의 패밀리가 관련 기술분야에 규정되어 있다. 예를 들어, 페닐알라닌이 티로신을 치환하는 것은 보존적 치환이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 서열 내에서의 보존적 치환은 이러한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체가 항원(들), 즉 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 하나 이상의 RSPO 단백질(들)에 결합하는 것을 폐지하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포 내에 전달할 수 있고, 일반적으로는 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 천연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물에는 더 이상 천연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들이 포함된다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수하거나 (즉, 오염물질이 없음), 적어도 90% 순수하거나, 적어도 95% 순수하거나, 적어도 98% 순수하거나, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 모세포종, 육종, 및 혈액암 예컨대 림프종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양" 및 "신생물"은 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 초래되는, 전암성 병변이 포함되는 악성 (암성) 또는 양성 (비-암성)의 임의의 조직 덩어리를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전이"는 새로운 위치에서 유사한 암성 병변이 발달되면서 암이 원래 부위에서 신체의 다른 영역으로 확산되거나 이전되는 프로세스를 지칭한다. "전이성" 또는 "전이" 세포는 이웃 세포와의 부착성 접촉을 상실하고 혈류 또는 림프를 통해 1차 질환 부위로부터 이동하여 이웃 신체 구조를 침습하는 것이다.
"암 줄기 세포" 및 "CSC" 및 "종양 줄기 세포" 및 "종양 개시 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, (1) 광범위한 증식성 능력이 있고; 2) 하나 이상의 유형의 분화 세포 자손이 생성되도록 비대칭 세포 분열을 할 수 있고, 이때 분화 세포는 증식성 또는 발달 잠재력이 감소되며; (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위해 대칭 세포 분열을 할 수 있는 암 또는 종양으로부터의 세포를 지칭한다. 이러한 특성은 종양을 형성하는데 실패하는 대다수의 종양 세포와 비교하여 면역손상 숙주 (예를 들어, 마우스) 내로의 연속 이식 시 종양 또는 암을 형성하거나 확립하는 능력을 암 줄기 세포에 부여한다. 암 줄기 세포에서 무질서한 방식으로 자가-재생 대 분화가 진행되어, 돌연변이가 발생함에 따라 경시적으로 변화할 수 있는 비정상 세포 유형의 종양이 형성된다.
용어 "암 세포" 및 "종양 세포"는 대부분의 암 세포 집단을 포함하는 비-종양발생 세포, 및 종양발생 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 다를 포함하여, 암 또는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 전체 세포 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 경우, 재생 및 분화 능력이 없는 세포만 지칭하여 이러한 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별할 때 용어 "비-종양발생"은 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"를 수식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양발생"은 자가-재생 (추가의 종양발생 암 줄기 세포가 초래됨) 및 모든 다른 종양 세포가 생성되는 증식 (분화되고, 따라서 비-종양발생 종양 세포가 초래됨)의 특성이 포함되는 암 줄기 세포의 기능적인 특성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양발생성"은 면역손상 숙주 (예를 들어, 마우스) 내로의 연속 이식 시 촉지성 종양을 형성하는 종양으로부터의 세포의 무작위 샘플의 능력을 지칭한다. 상기 정의는 또한 면역손상 숙주 (예를 들어, 마우스)로의 연속 이식 시에 촉지성 종양을 형성하는 암 줄기 세포의 풍부화 및/또는 단리된 집단을 포함한다.
용어 "대상체"는 특정 치료의 수용자가 될, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "제약상 허용되는"은 인간이 포함되는 동물에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인되었거나 (또는 승인가능하거나), 또는 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 생성물 또는 화합물을 지칭한다.
"제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 아주반트" 또는 "허용되는 제약 담체"는 하나 이상의 본 개시내용의 결합제 (예를 들어, 항체)와 함께 대상체에게 투여될 수 있고, 결합제의 활성을 파괴하지 않는 부형제, 담체 또는 아주반트를 지칭한다. 부형제, 담체 또는 아주반트는 결합제와 함께 치료 효과를 전달하는데 충분한 용량으로 투여되었을 때 비독성이어야 한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량" 또는 "치료 효과"는 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 결합제, 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 소분자, 또는 기타 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물 (예를 들어, 항체)은 치료 효과가 있고, 따라서 암 세포의 개수를 감소시킬 수 있거나; 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력을 감소시킬 수 있거나; 암 줄기 세포의 개수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 암 세포 집단을 감소시킬 수 있거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤 (예를 들어, 연부 조직 및 골 내로의 암 확산이 포함됨)을 억제하고/거나 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 전이를 억제하고/거나 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 성장을 억제하고/거나 정지시킬 수 있거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도로 완화시킬 수 있거나; 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선할 수 있거나; 또는 이같은 효과들의 조합이 가능하다. 작용제, 예를 들어 항체가 기존의 암 세포의 성장을 방지하고/하거나 이를 사망시킨다는 점에서, 이는 세포증식억제 및/또는 세포독성으로 지칭될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료한다", 또는 "경감시키는" 또는 "경감시킨다"는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 이의 증상을 줄이고/줄이거나 이의 진행을 중단시키는 치료적 수단, 및 2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 방지하거나 느리게 하는 예방적 또는 방지적 수단 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 이에는 이미 장애에 걸린 이; 장애에 걸리기 쉬운 이; 및 장애가 방지되어야 하는 이가 포함된다. 일부 실시양태에서, 환자가 하기의 것들 중 하나 이상을 나타내면 대상체가 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된다: 암 세포 개수의 감소 또는 암 세포의 완전한 부재; 종양 크기 감소; 연부 조직 및 골 내로의 암 세포 확산이 포함되는 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이의 억제 또는 부재; 암 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 이환율 및 사망률 감소; 삶의 질 개선; 종양발생성 감소; 암 줄기 세포의 개수 또는 빈도 감소; 또는 효과들의 일부 조합
본 개시내용 및 청구항에서 사용되는 경우, 단수 형태의 관사 ("a", "an" 및 "the")는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다.
실시양태가 본원에 "포함하는"이라는 술어와 함께 기재되는 어떠한 경우에든, "~로 이루어진" 및/또는 "본질적으로 ~로 이루어진"의 표현으로 기재된, 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 또한, 실시양태가 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 표현으로 본원에 기재되는 어떠한 경우에든, "~로 이루어진"의 표현으로 기재된 달리 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 경우의 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A (단독); 및 B (단독)을 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구절에서 사용되는 경우의 용어 "및/또는"은 하기의 실시양태 각각을 포함하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
II. RSPO-결합제
본 발명은 인간 RSPO 단백질에 특이적으로 결합하는 작용제를 제공한다. 이들 작용제는 본원에서 "RSPO-결합제"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3 ("RSPO3-결합제")에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 적어도 하나의 다른 인간 RSPO에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제에 의해 결합된 적어도 하나의 다른 인간 RSPO는 RSPO1, RSPO2 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO1, RSPO2 및/또는 RSPO4 상의 공통 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 상의 제1 에피토프에 결합하고, RSPO1, RSPO2 및/또는 RSPO4 상의 상이한 제2 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체이다. 인간 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4에 대한 전장 아미노산 (aa) 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 서열 1 (RSPO1), 서열 2 (RSPO2), 서열 3 (RSPO3) 및 서열 4 (RSPO4)로서 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO-결합제 (예를 들어, 항체 또는 이중특이적 항체)의 항원-결합 부위는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 RSPO에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO-결합제 (예를 들어, 항체 또는 이중특이적 항체)의 항원-결합 부위는 RSPO3 뿐만 아니라 1개, 2개 또는 3개의 다른 RSPO에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 예를 들어, 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제의 항원-결합 부위는 RSPO3 뿐만 아니라 RSPO1, RSPO2 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 RSPO에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 및 RSPO1에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 및 RSPO2에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 및 RSPO4에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3, RSPO1 및 RSPO2에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3, RSPO1 및 RSPO4에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3, RSPO2 및 RSPO4에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3 둘 다에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 작용제-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 22-272 내에서 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 22-207 내에서 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항원-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 35-135 내에서 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항원-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 35-86 내에서 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항원-결합제는 인간 RSPO3의 아미노산 92-135 내에서 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 5 내에서 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3의 푸린-유사 시스테인-풍부 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 RSPO3의 푸린-유사 시스테인-풍부 도메인 내에서 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 서열 6 또는 서열 7 내에서 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 서열 6 및 서열 7의 서열 내에서 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3의 트롬보스폰딘 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3의 트롬보스폰딘 도메인 내에서 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 서열 8 내에서 결합한다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 또는 항체는 하나 이상의 RSPO 단백질에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3에 약 20nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3에 약 10nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3에 약 1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3에 약 0.5nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3에 약 0.1nM 이하의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체는 적어도 하나의 다른 RSPO에 결합한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 다른 RSPO에 결합하는 본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO에 약 100nM 이하, 약 20nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하, 약 0.1nM 이하의 KD로 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 또한 RSPO1, RSPO2 및/또는 RSPO4에 약 10nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 인간 RSPO 및 마우스 RSPO 둘 다에 약 10nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3 둘 다에 약 1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3 둘 다에 약 0.1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3 단백질에 대한 결합제 (예를 들어, 항체)의 해리 상수는 비아코어(Biacore) 칩 상에 고정된 RSPO3 단백질의 적어도 일부를 포함하는 RSPO3 융합 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다. 일부 실시양태에서, RSPO3 단백질에 대한 결합제 (예를 들어, 항체)의 해리 상수는 비아코어 칩 및 RSPO3 단백질 상에 항-인간 IgG 항체에 의해 포획된 결합제를 사용하여 결정된 해리 상수이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3 및 제2 표적 둘 다에 약 100nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3 및 제2 표적 둘 다에 약 50nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3 및 제2 표적 둘 다에 약 20nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3 및 제2 표적 둘 다에 약 10nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 RSPO3 및 제2 표적 둘 다에 약 1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 부위 중 하나의 친화도는 다른 항원-결합 부위의 친화도에 비하여 약화될 수 있다. 예를 들어, 한 항원 결합 부위의 KD는 약 1 nM이고, 제2 항원-결합 부위의 KD는 약 10 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 두 항원-결합 부위 사이의 친화도의 차이는 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 약 8배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상, 또는 약 100배 이상일 수 있다. 두 항원-결합 부위의 친화도의 조절은 이중특이적 항체의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, RSPO3 또는 제2 표적에 대한 항원-결합 부위의 친화도의 감소는 목적한 효과, 예를 들어 결합제의 감소된 독성 및/또는 증가된 치료 지수를 가질 수 있다.
비제한적인 예로서, 이중특이적 항체는 (a) 인간 RSPO3에 약 0.1nM 내지 약 10nM의 KD로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 (b) 제2 표적 (예를 들어, 인간 RSPO2)에 약 0.1 nM 내지 약 20nM, 약 0.5nM 내지 약 20nM, 또는 약 1.0nM 내지 10nM의 KD로 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 절반 최대 유효 농도 (EC50)로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 인간 RSPO3에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 절반 최대 유효 농도 (EC50)로 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 또한 인간 RSPO1, RSPO2, 및/또는 RSPO4에 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하 또는 약 0.1 nM 이하의 EC50으로 결합한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 재조합 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 1가 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 2가 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포독성 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 단리된다. 일부 실시양태에서, 항체는 실질적으로 순수하다.
본 발명의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대해 검정할 수 있다. 사용될 수 있는 면역검정은 비아코어 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블롯 분석, 방사성면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체 고정 검정, 면역방사능측정 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 검정은 일상적이고, 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조).
예를 들어, 인간 RSPO3에 대한 항체의 특이적 결합을 ELISA를 사용하여 결정할 수 있다. ELISA 검정법은 항원을 제조하는 단계, 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하는 단계, 검출가능한 화합물 예컨대 효소 기질 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합된 RSPO3-결합 항체 또는 다른 RSPO3-결합제를 웰에 첨가하는 단계, 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계, 및 항원에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합 작용제 또는 항체가 검출가능한 화합물에 접합되지 않고, 대신 RSPO3-결합제 또는 항체 (예를 들어, 항-Fc 항체)를 인식하고 검출가능한 화합물에 접합되는 제2의 접합된 항체가 웰에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 웰을 항원으로 코팅하는 대신, RSPO3-결합 작용제 또는 항체를 웰에 코팅할 수 있고, 코팅된 웰에 항원을 첨가한 후에 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체를 첨가할 수 있다. 통상의 기술자는 검출되는 신호를 증가시키도록 변형될 수 있는 파라미터, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 ELISA의 다른 변형에 관하여 인지하고 있을 것이다.
또 다른 예에서, 인간 RSPO3에 대한 항체의 특이적 결합을 FACS를 사용하여 결정할 수 있다. FACS 스크리닝 검정법은 항원을 융합 단백질 (예를 들어, RSPO3-Fc 또는 RSPO3-CD4TM)로서 발현하는 cDNA 구축물을 생성시키는 단계, 구축물을 세포 내로 형질감염시키는 단계, 항원을 세포 표면에서 발현시키는 단계, RSPO3-결합제를 형질감염된 세포와 혼합하는 단계, 및 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 검출가능한 화합물에 접합된 이차 항체 (예를 들어, PE-접합 항-Fc 항체) 및 유동 세포측정기를 사용하여 RSPO3-결합제에 결합된 세포를 확인할 수 있다. 통상의 기술자는 검출되는 신호를 최적화하도록 변형될 수 있는 파라미터, 뿐만 아니라 스크리닝 (예를 들어, 차단 항체에 대한 스크리닝)을 강화할 수 있는 FACS의 다른 변형에 관하여 인지하고 있을 것이다.
항원 (예를 들어, RSPO3)에 대한 항체 또는 기타 결합제의 결합 친화도, 및 항체-항원 상호작용의 오프(off)-속도를 경쟁적 결합 검정에 의해 결정할 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는 표지된 항원 (예를 들어, 3H 또는 125I), 또는 이의 단편 또는 변이체를 증가되는 양의 비표지된 항원의 존재 하에 관심 항체와 함께 인큐베이션한 후, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사성면역검정이다. 항원에 대한 항체의 친화도 및 결합 오프-속도를 스캐차드(Scatchard) 플롯 분석에 의해 데이터로부터 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비아코어 동역학적 분석이 항원 (예를 들어, RSPO3)에 결합하는 항체 또는 작용제의 결합 온(on) 및 오프 속도를 결정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 비아코어 동역학적 분석은 칩 표면 상에 항원 (예를 들어, RSPO3)이 고정되어 있는 칩으로부터의 항체의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비아코어 동역학적 분석은 칩 표면 상에 항체 (예를 들어, 항-RSPO3 항체)이 고정되어 있는 칩으로부터의 항원 (예를 들어, RSPO3)의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R008, h131R010 또는 h131R011 (표 1 참조)의 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및/또는 6개를 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R008, h131R010 또는 h131R011의 CDR 중 1개 이상; 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R008, h131R010 또는 h131R011의 CDR 중 2개 이상; 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R008, h131R010 또는 h131R011의 CDR 중 3개 이상; 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R008, h131R010 또는 h131R011의 CDR 중 4개 이상; 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 131R005/131R007, h131R006A, h131R006B 또는 h131R008, h131R010 또는 h131R011의 CDR 중 5개 이상; 또는 131R002, 131R003 또는 그의 인간화 변이체, 예컨대 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R008, h131R010 또는 h131R011의 CDR 6개 모두를 포함한다.
표 1
Figure pct00001
특정 실시양태에서, 본 발명은 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) QSVDYDGDSYM (서열 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) QSVDYDGDSYM (서열 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34), DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) IYPSNGDS (서열 10), YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (c) ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35), TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (d) QSVDYDGDSYM (서열 12), KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (e) AAS (서열 13), AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 (f) QQSNEDPLT (서열 14), QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체 또는 이중특이적 항체)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일부 실시양태에서, 치환은 배선 인간화 과정의 일부로서 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, RSPO3에 특이적으로 결합하는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 16과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 36과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 37과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 에게의 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 17과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 72와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 86와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62와 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 17, 서열 72 또는 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 44로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 17로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 45로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 17로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 17로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 17로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 17로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 17로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 44로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 72로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 45로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 72로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 72로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 72로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 72로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 72로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 44로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 45로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 본질적으로 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 86으로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄; 및/또는 (b) 서열 29, 서열 74 또는 서열 88과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는, RSPO3에 특이적으로 결합하는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄; 및/또는 (b) 서열 29, 서열 74 또는 서열 88과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 27을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 28을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 39를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 42를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄; 및 본질적으로 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 28, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 28, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 27을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 28을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 39를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 42를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및/또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄; 및 본질적으로 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄; 및 본질적으로 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 48로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 49로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 64로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 69로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48로 이루어진 중쇄 및 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49로 이루어진 중쇄 및 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64로 이루어진 중쇄 및 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 29로 이루어진 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및 서열 74를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및 서열 74를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및 서열 74를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 48로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 49로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 64로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 69로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48로 이루어진 중쇄 및 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49로 이루어진 중쇄 및 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64로 이루어진 중쇄 및 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 74로 이루어진 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48을 포함하는 중쇄 및 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49를 포함하는 중쇄 및 서열 88을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64를 포함하는 중쇄 및 서열 88을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69를 포함하는 중쇄 및 서열 88을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 48로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 49로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 64로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본질적으로 서열 69로 이루어진 중쇄 및 본질적으로 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 48로 이루어진 중쇄 및 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 49로 이루어진 중쇄 및 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 64로 이루어진 중쇄 및 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 69로 이루어진 중쇄 및 서열 88로 이루어진 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R002 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R002 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열과 함께 또는 리더 서열 없이). 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R002 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 키메라 형태로 131R002 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R002 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R002 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 131R002의 인간화 버전은 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 131R002의 인간화 버전은 IgG2 항체이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002를 포함하거나, 항체 131R002로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R002로 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R003 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R003으로부터의 중쇄 가변 영역이 친화도-성숙된 131R003 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 중쇄 가변 영역이 모 131R003 항체와 비교하여 적어도 하나의 변형되거나 또는 변경된 CDR을 포함하는 131R003 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 중쇄 가변 영역이 모 131R003 항체와 비교하여 변형된 CDR1을 포함하는 131R003 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 중쇄 가변 영역이 모 131R003 항체와 비교하여 변형된 CDR2를 포함하는 131R003 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 중쇄 가변 영역이 모 131R003 항체와 비교하여 변형된 CDR3을 포함하는 131R003 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 중쇄 가변 영역이 모 131R003 항체와 비교하여 변형된 CDR1 및 CDR3을 포함하는 131R003 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R003 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열과 함께 또는 리더 서열 없이). 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R003 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모 131R003 항체와 비교하여 상이한 중쇄 CDR1을 포함하는 131R003 항체의 변이체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모 131R003 항체와 비교하여 상이한 중쇄 CDR3을 포함하는 131R003 항체의 변이체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모 131R003 항체와 비교하여 상이한 중쇄 CDR1 및 상이한 중쇄 CDR3을 포함하는 131R003 항체의 변이체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 키메라 형태로 131R003 항체 또는 131R003의 임의의 변이체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R003 항체 또는 131R003의 임의의 변이체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R003 항체 또는 131R003의 임의의 변이체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 131R003 또는 131R003 변이체의 인간화 버전은 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 131R003 또는 131R003 변이체의 인간화 버전은 IgG2 항체이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003을 포함하거나, 항체 131R003으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R003로 이루어진다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체를 포함하거나, 항체 131R003의 변이체로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R003의 변이체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R006B 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R006B 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열과 함께 또는 리더 서열 없이). 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R006B 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 키메라 형태로 131R006B 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R006B 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R006B 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 131R006B의 인간화 버전은 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 131R006B의 인간화 버전은 IgG2 항체이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R006B를 포함하거나, 항체 131R006B로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R006B로 이루어진다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R006B의 변이체를 포함하거나, 항체 131R006B의 변이체로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R006B의 변이체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R005/131R007 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R005/131R007 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열과 함께 또는 리더 서열 없이). 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 131R005/131R007 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 키메라 형태로 131R005/131R007 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R005/131R007 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 인간화 형태로 131R005/131R007 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 131R005/131R007의 인간화 버전은 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 131R005/131R007의 인간화 버전은 IgG2 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 131R008이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R005/131R007을 포함하거나, 항체 131R005/131R007로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R005/131R007로 이루어진다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R005/131R007의 변이체를 포함하거나, 항체 131R005/131R007의 변이체로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R005/131R007의 변이체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R008을 포함하거나, 항체 131R008로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R008로 이루어진다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R008의 변이체를 포함하거나, 항체 131R008의 변이체로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 131R008의 변이체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 h131R010 또는 h131R011 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 h131R010 또는 131R011 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열과 함께 또는 리더 서열 없이). 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 h131R010 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 h131R011 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체의 키메라 형태로 h131R010 또는 h131R011 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 h131R010 또는 h131R011 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 h131R011이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 ATCC에 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 ATCC에 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 중쇄 가변 영역, 및 ATCC에 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 ATCC에 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 ATCC에 의해 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 ATCC에 의해 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 중쇄, 및 ATCC에 기탁되고 PTA-_____ 지정된 플라스미드에 의해 코딩된 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010을 포함하거나, 항체 h131R010으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 h131R010로 이루어진다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010의 변이체를 포함하거나, 항체 h131R010의 변이체로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 h131R010 의 변이체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011을 포함하거나, 항체 h131R011으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 h131R011로 이루어진다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011의 변이체를 포함하거나, 항체 h131R011의 변이체로 본질적으로 이루어지거나, 또는 항체 h131R011의 변이체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체인 RSPO3-결합제를 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 제2 표적에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 DYSIH (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 DYSIH (서열 80) 또는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 항원-결합 부위가 (a) KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 제1 항원-결합 부위 및 제2 항원-결합 부위는 공통의 (즉, 동일한) 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 제1 항원-결합 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 17을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 72를 포함하는 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 86을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열 60 또는 서열 61을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 44를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열 60 또는 서열 61을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 45를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열 60 또는 서열 61을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 62를 포함하는 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열 60 또는 서열 61을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 및 제2 인간 RSPO에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3, 및 RSPO1, RSPO2 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 인간 RSPO에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 인간 RSPO에 대한 항체의 비제한적 예는, 예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO 2013/012747에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 및 인간 RSPO1에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 a) 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 b) 인간 RSPO1에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 부위는 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고; 제1 및 제2 항원-결합 부위 둘 다는 공통의 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 및 인간 RSPO2에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 a) 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위, 및 b) 인간 RSPO2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 부위는 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고; 제1 및 제2 항원-결합 부위 둘 다는 공통의 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체 131R003으로부터 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체 131R003의 변이체로부터 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체 131R006B로부터 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체 h131R005/131R007로부터 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체 h131R010 또는 h131R011로부터 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인을 포함하고, 이들 각각은 변형되어 이종다량체의 형성을 촉진하는 것인 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 노브-인투-홀(knobs-into-holes) 기술을 사용하여 변형된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 변경된 정전기 상호작용을 유발하는 아미노산의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 변경된 소수성/친수성 상호작용을 유발하는 아미노산의 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 (a) IgG1 (서열 56)의 위치 253 및 292에 상응하는 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG1 불변 영역, 및 IgG1 (서열 56)의 위치 240 및 282에 상응하는 아미노산이 리신으로 대체된 제2 인간 IgG1 불변 영역; (b) IgG2 (서열 57)의 위치 249 및 288에 상응하는 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG2 불변 영역, IgG2 (서열 57)의 위치 236 및 278에 상응하는 아미노산이 리신으로 대체된 제2 인간 IgG2 불변 영역; (c) IgG3 (서열 58)의 위치 300 및 339에 상응하는 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG3 불변 영역, 및 IgG3 (서열 58)의 위치 287 및 329에 상응하는 아미노산이 리신으로 대체된 제2 인간 IgG3 불변 영역; 및 (d) IgG4 (서열 59)의 위치 250 및 289에 상응하는 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체된 제1 인간 IgG4 불변 영역, 및 IgG4 (서열 59)의 위치 237 및 279에 상응하는 아미노산이 리신으로 대체된 제2 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 IgG1 (서열 56)의 위치 253 및 292에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG1 (서열 56)의 위치 253 및 292에 상응하는 위치에서의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG1 불변 영역, 및 IgG1 (서열 56)의 위치 240 및 282에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG1 (서열 56)의 위치 240 및 282에 상응하는 위치에서의 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 IgG2 (서열 57)의 위치 249 및 288에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG2 (서열 57)의 위치 249 및 288에 상응하는 위치에서의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG2 불변 영역, 및 IgG2 (서열 57)의 위치 236 및 278에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG2 (서열 57)의 위치 236 및 278에 상응하는 위치에서의 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG2 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 IgG3 (서열 58)의 위치 300 및 339에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG3 (서열 58)의 위치 300 및 339에 상응하는 위치에서의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG3 불변 영역, 및 IgG3 (서열 58)의 위치 287 및 329에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG3 (서열 58)의 위치 287 및 329에 상응하는 위치에서의 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG3 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 IgG4 (서열 59)의 위치 250 및 289에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG4 (서열 59)의 위치 250 및 289에 상응하는 위치에서의 아미노산이 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG4 불변 영역, 및 IgG4 (서열 59)의 위치 237 및 279에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, IgG4 (서열 59)의 위치 237 및 279에 상응하는 위치에서의 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는, IgG1 (서열 56)의 위치 253 및 292에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 글루타메이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG1 불변 영역, 및 IgG1 (서열 56)의 위치 240 및 282에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 IgG1 (서열 56)의 위치 253 및 292에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 아스파르테이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG1 불변 영역, 및 IgG1 (서열 56)의 위치 240 및 282에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는, IgG2 (서열 57)의 위치 249 및 288에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 글루타메이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG2 불변 영역, 및 IgG2 (서열 57)의 위치 236 및 278에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG2 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는, IgG2 (서열 57)의 위치 249 및 288에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 아스파르테이트로 대체됨)을 갖는 제1 인간 IgG2 불변 영역, 및 IgG2 (서열 57)의 위치 236 및 278에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (여기서, 아미노산이 리신으로 대체됨)을 갖는 제2 인간 IgG2 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 60의 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 서열 61의 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 60의 제1 중쇄 불변 영역 및 서열 61의 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 약 50nM 이하, 약 25nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하 또는 약 0.1nM 이하의 KD로 RSPO3에 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 약 50nM 이하, 약 25nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하 또는 약 0.1nM 이하의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 약 50nM 이하의 KD로 RSPO3에 결합하고, 약 50nM 이하의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 약 25nM 이하의 KD로 RSPO3에 결합하고, 약 25nM 이하의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 약 10nM 이하의 KD로 RSPO3에 결합하고, 약 10nM 이하의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 약 1nM 이하의 KD로 RSPO3에 결합하고, 약 1nM 이하의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제2 항원-결합 부위의 결합 친화도보다 약한 결합 친화도를 갖는 하나의 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 약 0.1nM 내지 1nM 범위의 KD로 RSPO3에 결합할 수 있고, 약 1nM 내지 10nM 범위의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합할 수 있다. 또는 이중특이적 항체는 약 1nM 내지 10nM 범위의 KD로 RSPO3에 결합할 수 있고, 약 0.1nM 내지 1nM 범위의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 약 0.1nM 내지 1nM 범위의 KD로 RSPO3에 결합할 수 있고, 약 1nM 내지 10nM 범위의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합할 수 있다. 또는 이중특이적 항체는 약 1nM 내지 10nM 범위의 KD로 RSPO3에 결합할 수 있고, 약 0.1nM 내지 1nM 범위의 KD로 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 항원-결합 부위 사이의 친화도의 차이는 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 약 8배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상 또는 약 100배 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 대한 항원-결합 부위의 적어도 하나의 CDR에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산으로 치환되어 RSPO3-결합 부위의 친화도가 변경된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합 부위의 친화도는 증가된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합 부위의 친화도는 감소된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 (예를 들어, RSPO2)에 대한 항원-결합 부위의 적어도 하나의 CDR에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산으로 치환되어 제2 항원-결합 부위의 친화도가 변경된다. 일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위의 친화도는 증가된다. 일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위의 친화도는 감소된다. 일부 실시양태에서, RSPO3 및 제2 항원-결합 부위 둘 다의 친화도는 변경된다.
본 발명은 인간 RSPO 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 RSPO3에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 RSPO3, 및 RSPO1, RSPO2 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 인간 RSPO에 결합한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 h131R005/131R007, h131R006A, h131R006B, h131R010 및 h131R011을 비롯한 항체 131R002, 131R003의 CDR, 또는 131R003의 변이체의 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개를 포함한다 (본원의 표 1 참조). 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR 당 4개 이하 (즉, 0, 1, 2, 3 또는 4개)의 아미노산 치환을 갖는 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 CDR(들)은 중쇄 가변 영역 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 경쇄 CDR(들)은 경쇄 가변 영역 내에 함유된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 17, 서열 72 또는 서열 86에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 15를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 16을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 36을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 37을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 44를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 45를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 62를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 15를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 16을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 36을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 37을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 44를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 45를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 62를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 44를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 86을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 45를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 86을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 62를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 서열 86을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 21, 서열 22, 서열 38, 서열 41, 서열 46, 서열 47, 서열 63 또는 서열 68에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 23, 서열 73 또는 서열 87에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 21, 서열 22, 서열 38, 서열 41, 서열 46, 서열 47, 서열 63 또는 서열 68에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 23, 서열 73 또는 서열 87에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 21, 서열 22, 서열 38, 서열 41, 서열 46, 서열 47, 서열 63 또는 서열 68에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 23, 서열 73 또는 서열 87에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 21, 서열 22, 서열 38, 서열 41, 서열 46, 서열 47, 서열 63 또는 서열 68을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 23, 서열 73 또는 서열 87을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 21, 서열 22, 서열 38, 서열 41, 서열 46, 서열 47, 서열 63 또는 서열 68 및/또는 서열 23, 서열 73 또는 서열 87로 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29, 서열 74 또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 29, 서열 74, 서열 88로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 RSPO3에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29, 서열 74 또는 서열 88에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 29, 서열 74 또는 서열 88에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29, 서열 74, 서열 88에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29, 서열 74 또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 28 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69 및/또는 서열 29로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 74를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 27 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 28 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69 및/또는 서열 74로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48을 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 서열 88을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 48 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 49 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 64 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 69 및/또는 서열 88로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 41, 서열 42, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 68, 서열 69, 서열 72, 서열 73, 서열 74, 서열 86, 서열 87, 및 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
항체를 비롯한 많은 단백질은 다양한 위치로의 단백질 수송을 지시하는 신호 서열을 함유한다. 신호 서열 (신호 펩티드 또는 리더 서열로도 지칭됨)은 신생 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 이는 폴리펩티드를 세포질 세망으로 표적화하고, 단백질이 그의 목적지, 예를 들어 소기관의 내부 공간으로, 내부 막으로, 세포의 외부 막으로, 또는 분비를 통해 세포 외부로 분류된다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 세포질 세망으로 수송된 후에 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩티드로부터의 신호 서열의 절단은 일반적으로 아미노산 서열 내의 특정 부위에서 발생하고, 신호 서열 내의 아미노산 잔기에 좌우된다. 일반적으로 하나의 특이적 절단 부위가 존재하지만, 하나 초과의 절단 부위가 신호 펩티다제에 의해 인지될 수 있고/거나 사용될 수 있으며, 폴리펩티드의 비균질한 N-말단을 생성한다. 예를 들어, 신호 서열 내의 상이한 절단 부위의 사용은 상이한 N-말단 아미노산으로 발현된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 상이한 N-말단을 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산만큼 길이가 상이하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 실질적으로 균질하며, 즉 폴리펩티드는 동일한 N-말단을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 "천연" 또는 "모" 신호 서열과 비교하여 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 하나의 절단 부위가 우세하도록 허용하는 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하고, 그에 따라 하나의 N-말단을 갖는 실질적으로 균질한 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 폴리펩티드의 발현 수준, 예를 들어 증가된 발현 또는 감소된 발현에 영향을 미친다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 44, 서열 45 또는 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 27, 서열 28, 서열 39, 서열 42, 서열 48, 서열 49, 서열 64 또는 서열 69를 포함하는 중쇄, 및 서열 29, 서열 74 또는 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 48을 포함하는 중쇄, 및 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 49를 포함하는 중쇄, 및 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 64를 포함하는 중쇄, 및 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 69를 포함하는 중쇄, 및 서열 29를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 48을 포함하는 중쇄, 및 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 49를 포함하는 중쇄, 및 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 64를 포함하는 중쇄, 및 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 69를 포함하는 중쇄, 및 서열 74를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 48을 포함하는 중쇄, 및 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 49를 포함하는 중쇄, 및 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 64를 포함하는 중쇄, 및 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 69를 포함하는 중쇄, 및 서열 88을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 131R002 또는 항체 131R003과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 131R003의 변이체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 131R003의 인간화 버전과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 h131R005/131R007과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 h131R008과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 h131R010과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 항체 h131R011과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시양태에서, RSPO3은 인간 RSPO3이다. 일부 실시양태에서, RSPO3은 마우스 RSPO3이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 본 발명의 항체와 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 131R002 또는 항체 131R003과 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 131R003의 변이체와 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 131R003의 인간화 버전과 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B와 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 h131R005/131R007과 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 h131R008과 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 h131R010과 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3상의, 항체 h131R011과 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, RSPO3-결합제는 본 발명의 항체가 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002 또는 항체 131R003이 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체가 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 인간화 버전이 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B가 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011이 결합하는 RSPO3 상의 에피토프와 중첩되는 RSPO3 상의 에피토프에 결합하는 항체이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질에 결합하고 RSPO 활성을 조절한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO 길항제이고 RSPO 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO 길항제이고 β-카테닌 활성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 인간 RSPO3에 결합하고 RSPO3 활성을 조절한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 길항제이고 RSPO3 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 길항제이고 β-카테닌 활성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질의 길항제이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 적어도 하나의 RSPO의 길항제이고, RSPO 활성을 억제한다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 RSPO 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 RSPO 단백질의 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 인간 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3 활성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 활성을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질의 길항제이다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 RSPO 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 RSPO 단백질에 의한 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 인간 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 RSPO3 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 특정 실시양태에서, RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 β-카테닌 신호전달의 길항제이다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO-결합제는 RSPO3-결합제다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 적어도 하나의 RSPO 단백질이 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 인간 RSPO 단백질이 그의 수용체 중 하나 이상에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO 단백질이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO 단백질이 LGR4, LGR5 및/또는 LGR6에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR4에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR5에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR6에 결합하는 것을 억제한다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제가 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것의 억제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 RSPO가 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO-결합제는 β-카테닌 신호전달을 추가로 억제한다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 적어도 하나의 RSPO가 수용체에 결합하는 것을 차단한다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 인간 RSPO 단백질이 그의 수용체 중의 하나 이상에 결합하는 것을 차단한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO가 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 적어도 하나의 RSPO 단백질이 LGR4, LGR5 및/또는 LGR6에 결합하는 것을 차단한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR4에 결합하는 것을 차단한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR5에 결합하는 것을 차단한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3이 LGR6에 결합하는 것을 차단한다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제가 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것의 차단은 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 RSPO 단백질이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO-결합제는 β-카테닌 신호전달을 추가로 억제한다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3이 적어도 하나의 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 β-카테닌 신호전달을 억제한다. β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO-결합제는, 특정 실시양태에서, β-카테닌 신호전달 경로 내의 하나 이상의 수용체에 의한 신호전달을 억제할 수 있지만, 필수적으로 모든 수용체에 의한 신호전달을 억제하지는 않는 것으로 이해된다. 특정의 대안적 실시양태에서, 모든 인간 수용체에 의한 β-카테닌 신호 전달이 억제될 수 있다. 특정 실시양태에서, LGR4, LGR5 및 LGR6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체에 의한 β-카테닌 신호 전달이 억제된다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제에 의한 β-카테닌 신호전달의 억제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 β-카테닌 신호전달 수준의 감소이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌 신호전달을 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, RSPO-결합제 (예를 들어, 항체)는 β-카테닌의 활성화를 억제한다. β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO-결합제는, 특정 실시양태에서, 하나 이상의 수용체에 의한 β-카테닌의 활성화를 억제할 수 있지만, 필수적으로 모든 수용체에 의한 β-카테닌의 활성화를 억제하지는 않는 것으로 이해된다. 특정의 대안적 실시양태에서, 모든 인간 수용체에 의한 β-카테닌의 활성화가 억제될 수 있다. 특정 실시양태에서, LGR4, LGR5 및 LGR6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체에 의한 β-카테닌의 활성화가 억제된다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제에 의한 β-카테닌의 활성화의 억제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 β-카테닌의 활성화 수준의 감소이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, β-카테닌의 활성화를 억제하는 RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
RSPO-결합제 (또는 후보 RSPO-결합제)가 β-카테닌 신호전달을 억제하는지 여부를 결정하기 위한 생체내 및 시험관내 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 상류에 TCF-결합 도메인의 다중 카피를 함유하는 TCF/Luc 리포터 벡터를 이용하는 세포-기반, 루시페라제 리포터 검정을 사용하여 시험관내에서 β-카테닌 신호전달 수준을 측정할 수 있다 (Gazit et al., 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA). RSPO-결합제가 존재하는 경우의 RSPO 단백질 또는 RSPO-컨디셔닝 배지와 함께 또는 없이 하나 이상의 Wnt (예를 들어, 형질감염된 세포에 의해 발현되거나 또는 Wnt-컨디셔닝 배지에 의해 제공되는 Wnt(들))가 존재할 때의 β-카테닌 신호전달의 수준을 RSPO-결합제가 존재하지 않는 경우의 신호전달 수준과 비교한다. TCF/Luc 리포터 검정 뿐만 아니라, β-카테닌-조절된 유전자, 예컨대 c-myc (He et al., 1998, Science, 281:1509-12), 시클린 D1 (Tetsu et al., 1999, Nature, 398:422-6) 및/또는 피브로넥틴 (Gradl et al. 1999, Mol. Cell Biol., 19:5576-87)의 발현 수준에 대한 작용제의 효과를 측정함으로써 β-카테닌 신호전달에 대한 RSPO-결합제 (또는 후보 작용제)의 효과를 시험관내에서 또는 생체내에서 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 디쉐블드(Dishevelled)-1, 디쉐블드-2, 디쉐블드-3, LRP5, LRP6 및/또는 β-카테닌의 인산화 상태에 대한 작용제의 효과를 측정함으로써 β-카테닌 신호전달에 대한 RSPO-결합제의 효과를 또한 평가할 수 있다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 하기 효과 중 하나 이상을 갖는다: 종양 세포의 증식을 억제함, 종양 성장을 억제함, 종양의 종양발생성을 감소시킴, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양발생성을 감소시킴, 종양 성장을 억제함, 종양 세포의 세포 사멸을 유발함, 종양 내 세포를 분화되도록 유도함, 종양발생성 세포를 비-종양발생성인 상태로 분화시킴, 종양 세포 내의 분화 마커의 발현을 유도함, 종양 세포의 전이를 방지함, 종양 세포의 생존을 감소시킴, 또는 혈관신생을 조절함.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 생체내에서 (예를 들어, 이종이식편 마우스 모델에서 및/또는 암에 걸린 인간에서) 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 성장은 비처리된 종양과 비교하여 적어도 약 2배, 약 3배, 약 5배, 약 10배, 약 50배, 약 100배 또는 약 1000배 억제된다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식편 모델에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 내의 암 줄기 세포의 수 또는 빈도는 적어도 약 2배, 약 3배, 약 5배, 약 10배, 약 50배, 약 100배 또는 약 1000배만큼 감소한다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소는 동물 모델을 사용하는 한계 희석 검정에 의해 결정된다. 종양 내의 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소를 결정하기 위한 한계 희석 검정의 사용에 관하여 추가적 예 및 지침은, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 2008/042236, 미국 특허 공개 번호 2008/0064049 및 미국 특허 공개 번호 2008/0178305에서 발견할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO3-결합제는 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간에서 적어도 약 2시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주 또는 적어도 약 2주의 순환 반감기를 갖는다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간에서 적어도 약 2시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주 또는 적어도 약 2주의 순환 반감기를 갖는 IgG (예를 들어, IgG1 또는 IgG2) 항체이다. 작용제, 예컨대 폴리펩티드 및 항체의 반감기를 증가시키는 (또는 감소시키는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 항체의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법은 pH 6.0에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 항체의 pH-의존성 결합을 증가시키는 Fc 영역에서의 돌연변이의 도입을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2005/0276799, 2007/0148164 및 2007/0122403 참조). Fc 영역이 결여된 항체 단편의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법은 PEG화와 같은 기술을 포함한다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 임의의 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 관심 항원 (예를 들어, 정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질 또는 융합 단백질)의 다중 피하 또는 복강내 주사를 사용하여 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 염소, 당나귀)를 면역화시킴으로써 생산된다. 항원은 담체, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 혈청 알부민에 임의로 접합될 수 있다. 항원 (운반 단백질이 있거나 또는 없음)을 멸균 염수 중에 희석하고, 통상적으로 아주반트 (예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트)와 조합하여 안정한 에멀젼을 형성한다. 충분한 기간 후에, 통상적으로 면역화 동물 혈액 또는 복수로부터 폴리클로날 항체를 회수한다. 폴리클로날 항체를 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 투석을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 관련 기술분야의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 통상의 기술자에게 공지된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497] 참조). 일부 실시양태에서, 하이브리도마 방법을 사용하여 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜 림프구로부터 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도한다. 일부 실시양태에서, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역화 항원은 인간 단백질 또는 그의 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역화 항원은 마우스 단백질 또는 그의 부분일 수 있다.
면역화 후에, 림프구를 단리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 하이브리도마 세포는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 특별한 배지를 사용하여 선택되고, 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포는 선택 과정에서 살아남지 않는다. 선택된 항원에 대해 특이적으로 지시된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 면역침전, 이뮤노블롯팅 및 시험관내 결합 검정 (예를 들어, 유동 세포측정법, FACS, ELISA 및 방사성면역검정)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 하이브리도마는 표준 방법을 사용하여 시험관내 배양으로 증식시키거나 (J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA) 또는 생체내에서 동물의 복수 종양으로서 증식시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 투석을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 관련 기술분야의 표준 방법에 따라 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제할 수 있다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리하고, 그의 서열을 표준 기술을 사용하여 결정한다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시키는 경우에 모노클로날 항체를 생산하는 적합한 발현 벡터 내로 클로닝한다.
특정의 다른 실시양태에서, 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편은 가변 도메인을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 목적하는 종의 CDR로부터 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597] 참조).
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를, 예를 들어 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형시켜 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을, 예를 들어 인간 항체의 이들 영역에 대해 치환하여 키메라 항체를 생성하거나, 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대해 치환하여 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 불변 영역을 말단절단 또는 제거하여 목적하는 모노클로날 항체의 항체 단편을 생성한다. 가변 영역의 부위-지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 사용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 RSPO3에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로 인간화 항체는, CDR로부터의 잔기가 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린이다. 일부 실시양태에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체에서의 상응하는 잔기로 대체된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 내 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 함유하는 적어도 1개, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인 영역을 실질적으로 모두 포함할 수 있지만, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것인 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 이러한 인간화 항체는 인간 대상체에 투여되는 경우에 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시킬 수 있기 때문에 치료적으로 사용된다. 통상의 기술자는 공지된 기술에 따라 감소된 면역원성을 갖는 기능적 인간화 항체를 수득할 수 있을 것이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 및 5,693,762 참조).
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 직접 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내에서 면역화된 불멸화 인간 B 림프구로부터, 또는 면역화된 개체로부터 단리된 림프구로부터 인간 항체가 생성될 수 있다. 각각의 경우에 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 세포가 생성되고 단리된다 (문헌 [Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147:86-95]; 및 미국 특허 번호 5,750,373; 5,567,610 및 5,229,275 참조). 일부 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다 (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). 대안적으로, 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산할 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용에 대한 기술은 또한 미국 특허 번호 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484 및 7,264,963; 및 문헌 [Rothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376:1182-1200]에 기재되어 있다. 항체가 확인되면, 관련 기술분야에 공지된, 쇄 셔플링 (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783) 및 부위-지정 돌연변이유발을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 친화도 성숙 전략을 사용하여 고친화도 인간 항체를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 생산될 수 있다. 면역화 시에, 이들 마우스는 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 및 5,661,016에 기재되어 있다.
본 발명은 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질을 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체를 또한 포함한다. 이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원 또는 에피토프를 특이적으로 인지하고 이에 결합할 수 있다. 상이한 에피토프는 또한 동일한 분자 내에 (예를 들어, 인간 RSPO3 상의 2개의 에피토프) 또는 상이한 분자 상에 (예를 들어, RSPO3 상의 1개의 에피토프 및 RSPO2 상의 1개의 에피토프)에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 개별 항체와 비교하여, 또는 1개 초과의 항체의 조합과 비교하여 증진된 효력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 개별 항체와 비교하여, 또는 1개 초과의 항체의 조합과 비교하여 감소된 독성을 갖는다. 임의의 결합제 (예를 들어, 항체)가 특징적인 약동학 (PK) (예를 들어, 순환 반감기)을 가질 수 있음은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2종의 활성 결합제의 PK를 동시에 발생시키는 능력을 가지며, 여기서 2종의 개별 결합제는 상이한 PK 프로파일을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 공통의 영역 (예를 들어, 종양 및/또는 종양 미세환경)에서 2종의 결합제 (예를 들어, 항체)의 작용을 농축시키는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 공통의 표적 (예를 들어, 종양 또는 종양 세포)에 대한 2종의 결합제 (예를 들어, 항체)의 작용을 농축시키는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나 초과의 생물학적 경로 또는 기능에 대한 2종의 결합제 (예를 들어, 항체)의 작용을 표적화시키는 능력을 갖는다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 RSPO3 및 제2 표적에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 RSPO3 및 제2 인간 RSPO (예를 들어, RSPO1, RSPO2 또는 RSPO4)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 RSPO3 및 RSPO2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG2 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 감소된 독성 및/또는 부작용을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2종의 개별 항체의 혼합물 또는 단일 작용제로서의 항체와 비교하여 감소된 독성 및/또는 부작용을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 증가된 치료 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2종의 개별 항체의 혼합물 또는 단일 작용제로서의 항체와 비교하여 증가된 치료 지수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체는 제1 항원 표적 (예를 들어, RSPO3) 뿐만 아니라 제2 항원 표적, 예컨대 백혈구 상의 이펙터 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28, CTLA-4, CD80 또는 CD86) 또는 Fc 수용체 (예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16)를 특이적으로 인식하고 그에 결합하여 제1 항원 표적을 발현하고/하거나 생산하는 세포에 세포 방어 메커니즘을 집중시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체를 사용하여 세포 독성제를 특정한 표적 항원을 발현하는 세포에 지시할 수 있다. 이러한 항체는 항원-결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이트화제, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에 결합하는 아암을 보유한다.
이중특이적 항체를 제조하는 기술은 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229:81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol., 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol., 152:5368]; 미국 특허 번호 5,731,168; 국제 공개 번호 WO 2009/089004; 및 미국 특허 공개 번호 2011/0123532를 참조한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2개의 중쇄 사이 경계의 일부인 아미노산이 변형된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 "노브-인투-홀" 전략을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168; 문헌 [Ridgway et. al., 1996, Prot. Engin., 9:617-621] 참조). 일부 경우에서, 용어 "노브" 및 "홀"은 용어 "돌기" 및 "공동"으로 대체된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 중쇄들 사이에 디술피드 연결을 형성할 수 없는 변이체 힌지 영역을 포함할 수 있다 (예를 들어, WO 2006/028936 참조). 일부 실시양태에서, 변형은 변경된 정전기 상호작용을 유발하는 아미노산의 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 변경된 소수성/친수성 상호작용을 유발하는 아미노산의 변화를 포함할 수 있다.
이중특이적 항체는 항원-결합 부위를 포함하는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60). 따라서, 특정 실시양태에서 RSPO3에 대한 항체는 다중특이적이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 (또는 다른 폴리펩티드)는 단일특이적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체가 함유하는 하나 이상의 항원-결합 부위 각각은 RSPO 단백질 상의 상동성 에피토프에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 단일특이적 항체의 항원-결합 부위는, 예를 들어 RSPO3 및 RSPO2에 결합할 수 있다 (또는 결합한다) (즉, 동일한 에피토프가 RSPO3 및 RSPO2 단백질 둘 다에서 발견됨).
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 단편이다. 항체 단편은 무손상 항체와는 상이한 기능 또는 능력을 가질 수 있으며; 예를 들어, 항체 단편은 증가된 종양 침투를 가질 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술, 예컨대 비제한적으로 무손상 항체의 단백질분해적 소화가 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산된 F(ab')2 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 감소시킴으로써 생성된 Fab 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 단편은 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 생성된 Fab 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv) 단편을 포함한다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 이들 단편의 다량 생산을 허용하는 이.콜라이 또는 다른 숙주 세포로부터 발현되고, 이로부터 분비될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 본원에 논의된 바와 같은 항체 파지 라이브러리로부터 단리된다. 예를 들어, Fab 발현 라이브러리의 구축을 위한 방법을 사용하여 (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281), RSPO 단백질 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 바람직한 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인하도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 선형 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 scFv이다. 하나 이상의 인간 RSPO에 특이적인 단일-쇄 항체의 생산을 위한 다양한 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,946,778 참조).
특히 항체 단편의 경우에는 혈청 반감기를 변형 (증가 또는 감소)시키도록 항체를 변형시키는 것이 추가로 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한 샐비지 수용체 결합 에피토프의 항체 단편 내로의 혼입, 또는 상기 에피토프의 펩티드 태그 내로의 혼입, 및 이어서 말단 또는 중간에서의 항체 단편과의 융합 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함)에 의해 달성될 수 있다.
이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화하도록 제안되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980 참조). 또한, 이종접합체 항체는 합성 단백질 화학에서 공지된 방법, 예컨대 가교제를 포함하는 것을 사용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적의 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체는 항체와 표적 (즉, 인간 RSPO3)의 회합을 제공하는 임의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있음을 알아야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은, 체액 반응 개시 및 목적하는 항원에 대한 이뮤노글로불린 생성을 유도할 수 있는 임의 유형의 포유동물의 것을 포함하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 이에 따라 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 토끼 기원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 이뮤노글로불린의 가변 및 불변 영역은 둘 다 인간이다. 다른 실시양태에서, 적합성 항체의 가변 영역 (통상적으로는 비-인간 공급원으로부터 유래됨)은 분자의 결합 특성을 개선하거나 또는 면역원성을 감소시키도록 조작되거나 또는 특이적으로 조정될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 유용한 가변 영역은 인간화될 수 있거나, 또는 다르게는 개입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다에서의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해, 필요한 경우에는 부분 프레임워크 영역 대체 및 서열 변형 및/또는 변경에 의해 변경된다. CDR은, 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 상이한 부류의 항체로부터, 종종 상이한 종의 항체로부터 유래될 것으로 예상된다. 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 전달하기 위해 모든 CDR을 공여자 가변 영역으로부터의 모든 CDR로 대체할 필요는 없을 수도 있다. 그보다는, 항원-결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 통상의 기술자는 본 발명의 변형된 항체가, 원하는 생화학적 특징, 예컨대 천연 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성을 갖는 항체와 비교하여 증가된 종양 국재화 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하도록 적어도 1개 이상의 불변 영역 도메인의 분획이 결실되거나 또는 달리 변경된 항체 (예를 들어, 전장 항체 또는 그의 면역반응성 단편)를 포함할 것임을 알 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 상용성인 불변 영역에 대한 변형은 1개 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 본원에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 1개 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역으로부터의 1개 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개 아미노산 잔기)에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 변형된 항체는 CH3 도메인이 항체의 힌지 영역에 직접 융합되도록 조작된다. 다른 실시양태에서는, 펩티드 스페이서가 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고 나머지 CH3 도메인 (변형되거나 또는 변형되지 않음)이 5-20개 아미노산 스페이서에 의해 힌지 영역에 결합된 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 불변 도메인의 조절 요소가 유리되고 접근가능하게 유지되거나, 또는 힌지 영역이 가요성으로 유지되도록 보장할 수 있다. 그러나, 일부 경우에는 아미노산 스페이서가 면역원성이어서 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있음에 주목해야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 구축물에 첨가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 목적하는 생물학적 질을 유지하도록 비교적 비-면역원성일 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 항체는 불변 도메인의 부분 결실, 또는 수 개 또는 심지어 단일 아미노산의 치환만을 가질 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시켜 암 세포 국재화 및/또는 종양 침투를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 조절하고자 하는 특이적 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 C1q 결합)을 제어하는 1개 이상의 불변 영역 도메인의 일부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상 불변 영역 도메인 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능은 남기면서 항체의 선택된 특징 (혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성된 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 구성 및 면역원성 프로파일은 실질적으로 유지시키면서, 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 항체는 목적하는 특징, 예컨대 이펙터 기능의 감소 또는 증가를 증진시키거나 또는 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착 부위를 제공하도록 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가를 포함한다.
불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 또는 IgM 항체 (항원에 결합함)의 Fc 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 또한, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. 다양한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체, 예컨대 IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)이 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응, 예컨대 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 클리어런스, 항체-코팅된 표적 세포의 킬러 세포에 의한 용해 (항체-의존성 세포 세포독성 또는 ADCC로 불림), 염증 매개물의 방출, 태반 전달 및 이뮤노글로불린 생산의 제어를 유발한다.
특정 실시양태에서, 변형된 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하며, 이는 결과적으로 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 불변 영역 도메인의 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜, 암 세포 국재화 및/또는 종양 침투를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 혈청 반감기를 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 혈청 반감기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 디술피드 연결 또는 올리고사카라이드 모이어티가 제거되도록 변형된다. 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 널리 공지된 생화학적 또는 분자적 공학 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체인 RSPO3-결합제는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 ADCC 활성 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 이펙터 기능을 갖지 않는다.
본 발명은 본원에 제시된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 그의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 공통 부류 내의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 RSPO3 및 제2 표적 (예를 들어, 인간 RSPO) 둘 다에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 비롯한, RSPO3에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 결합하는 항체를 생산하는 방법은 하이브리도마 기술을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 RSPO3에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 인간 RSPO3의 아미노산 22-272를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 서열 3의 아미노산 22-272를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 결합하는 항체를 생성하는 방법은 인간 파지 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 발명은 RSPO3에 결합하는 항체를 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3 또는 그의 부분에 결합하는 것에 대해 FACS 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 제2 RSPO 또는 그의 부분에 결합하는 것에 대해 FACS 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 RSPO2 둘 다 또는 그의 부분에 결합하는 것에 대해 FACS 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3에 결합하는 것에 대해 ELISA를 사용하여 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 제2 RSPO에 결합하는 것에 대해 ELISA를 사용하여 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 RSPO2 둘 다에 결합하는 것에 대해 ELISA를 사용하여 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3이 인간 LGR 단백질에 결합하는 것을 차단하는 것에 대해 FACS에 의해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 β-카테닌 신호전달의 억제 또는 차단에 대해 스크리닝함으로써 확인된다.
일부 실시양태에서, 인간 RSPO3 단백질에 대한 항체를 생성하는 방법은 인간 RSPO3의 아미노산 22-272를 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 RSPO3 단백질에 대한 항체를 생성하는 방법은 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 포유동물로부터 항체 또는 항체-생산 세포를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3 단백질에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 방법은 (a) 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것; (b) 면역화된 포유동물로부터 항체 생산 세포를 단리하는 것; (c) 항체-생산 세포를 골수종 세포주의 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (d) RSPO3 단백질에 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마 세포를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부는 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부는 서열 5이다. 일부 실시양태에서, 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부는 서열 6 또는 서열 7이다. 일부 실시양태에서, 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부는 서열 6 및 서열 7이다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 마우스이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 선택된다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부를 포함하는 선택에 사용된 폴리펩티드는 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 적어도 하나의 다른 RSPO 단백질에 결합한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 다른 RSPO 단백질은 RSPO1, RSPO2 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 RSPO1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 RSPO2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 RSPO3 및 RSPO4에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 RSPO3, RSPO1 및 RSPO2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 RSPO3, RSPO1 및 RSPO4에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 RSPO3, RSPO2 및 RSPO4에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3 둘 다에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 RSPO 길항제, 특히 RSPO3 길항제이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 β-카테닌 신호전달을 억제한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질에 항체를 생산하는 방법은 단일 항원-결합 부위를 포함하는 막-경계 이종이량체 분자를 사용하여 항체를 확인하는 것을 포함한다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 항체는 국제 공개 WO 2011/100566에 기재된 방법 및 폴리펩티드를 사용하여 확인된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질에 대한 항체를 생산하는 방법은 인간 RSPO 단백질에 결합하는 항체에 대해 항체-발현 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 파지 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 스크리닝은 패닝을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 파지 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 포유동물 세포 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부를 사용하여 스크리닝된다. 일부 실시양태에서, 제1 스크리닝에서 확인된 항체를 상이한 RSPO 단백질을 사용하여 다시 스크리닝함으로써, RSPO3 및 제2 RSPO 단백질에 결합하는 항체를 확인한다. 특정 실시양태에서, 인간 RSPO3의 아미노산 22-272의 적어도 일부를 포함하는 스크리닝을 위해 사용된 폴리펩티드는 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 RSPO3 및 적어도 하나의 다른 RSPO 단백질에 결합한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 다른 RSPO 단백질은 RSPO1, RSPO2 및 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 RSPO3 및 RSPO1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 RSPO3 및 RSPO2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 RSPO3 및 RSPO4에 결합한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 인간 RSPO3 및 마우스 RSPO3 둘 다에 결합한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 RSPO3 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스크리닝에서 확인된 항체는 RSPO3에 의해 유도된 β-카테닌 신호전달을 억제한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 단리된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 실질적으로 순수하다.
본 발명의 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 RSPO3에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열은 해당 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 미치지 않으면서 달라질 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적 활성을 나타내거나, 또는 인간 RSPO3에 대한 항체 또는 그의 단편의 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형은 결실, 삽입, 반전, 반복 및/또는 다른 유형의 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다.
폴리펩티드, 그의 유사체 및 변이체는 통상적으로 폴리펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 변형될 수 있다. 유도체화 모이어티는 폴리펩티드의 용해도, 생물학적 반감기 및/또는 흡수를 개선시키거나 또는 달리 변형시킬 수 있다. 모이어티는 또한 폴리펩티드 및 변이체의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 화학적 모이어티에 대한 개관은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에서 발견할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법에서부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열의 구축 및 이들 서열을 적합한 숙주에서 발현시키는 것까지의 범위에 이른다. 일부 실시양태에서, 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 재조합 기술을 사용하여 단리 또는 합성함으로써 DNA 서열을 구축한다. 임의로는, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 이 서열에 돌연변이를 일으킴으로써, 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-5066] 및 미국 특허 번호 4,588,585를 참조한다.
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 구축할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로, 관심 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에서 유리한 해당 코돈을 선택함으로써 설계될 수 있다. 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는데 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 또한, 특정의 단리된 폴리펩티드를 코딩하기 위한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 이들을 라이게이션할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립체를 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
조립 (합성, 부위-지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의함)된 후에, 특정한 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내에 삽입되고, 목적하는 숙주에서의 단백질의 발현을 위해 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적당한 조립체는 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열분석, 제한 효소 맵핑 및/또는 발현에 의해 확인될 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 숙주에서의 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터를 사용하여, 인간 RSPO3에 대한 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시킨다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된, RSPO-결합제, 예컨대 항-RSPO 항체 또는 그의 단편의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물일 수 있다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전 요소, 또는 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 요소, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 조절 요소는 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자를 추가로 혼입할 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로 기능적으로 관련된 경우에 "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터는 코딩 서열의 전사를 제어하는 경우에 상기 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 허용되도록 위치된 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일부 실시양태에서, 효모 발현 시스템에 사용하기 위한 구조적 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 상황에서, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로는 후속적으로, 발현된 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 따라 달라진다. 광범위하게 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR1, pBR322, pMB9를 비롯한 이. 콜라이로부터의 플라스미드 및 그의 유도체, 및 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 다른 필라멘트형 단일-가닥 DNA 파지를 포함한다.
본 발명의 RSPO-결합제 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 항체)는 하나 이상의 벡터로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1개의 중쇄 폴리펩티드는 제1 벡터에 의해 발현되고, 제2 중쇄 폴리펩티드는 제2 벡터에 의해 발현되고, 경쇄 폴리펩티드는 제3 벡터에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드는 제1 벡터에 의해 발현되고, 제2 중쇄 폴리펩티드는 제2 벡터에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 2개의 중쇄 폴리펩티드는 제1 벡터에 의해 발현되고, 경쇄 폴리펩티드는 제2 벡터에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 3개의 폴리펩티드는 제1 벡터로부터 발현된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 폴리펩티드, 제2 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드는 단일 벡터에 의해 발현된다.
RSPO3-결합 폴리펩티드 또는 항체 (또는 항원으로 사용하기 위한 RSPO 단백질)의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하의 원핵생물, 효모 세포, 곤충 세포 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 하기 기재된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 세포-무함유 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY]에 기재되어 있다. 항체 생산을 비롯한 단백질 생산 방법에 대한 추가의 정보는, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0187954, 미국 특허 번호 6,413,746, 6,660,501; 및 국제 특허 공개 번호 WO 04/009823에서 발견할 수 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 바람직할 수 있는데, 이는 이들 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절하게 변형되며, 생물학적으로 기능성이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 COS-7 (원숭이 신장-유래), L-929 (뮤린 섬유모세포-유래), C127 (뮤린 유방 종양-유래), 3T3 (뮤린 섬유모세포-유래), CHO (차이니즈 햄스터 난소-유래), HeLa (인간 자궁경부암-유래), BHK (햄스터 신장 섬유모세포-유래), HEK-293 (인간 배아 신장-유래) 세포주, 및 이들의 변이체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사 요소, 예컨대 복제 기점, 적합한 프로모터 및 발현될 유전자에 연결된 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
곤충 세포 배양 시스템 (예를 들어, 바큘로바이러스)의 재조합 단백질의 발현은 정확하게 폴딩되고 생물학적으로 기능성인 단백질을 제조하는 강력한 방법을 또한 제공한다. 곤충 세포에서의 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47] 참조).
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항체를 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 RSPO3에 결합하는 항체를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항체 131R002를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항체 131R003을 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항체 131R003의 변이체를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체 131R002, 항체 131R003, 또는 항체 131R003의 변이체의 키메라 버전을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B를 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체 h131R005/131R007을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체 h131R008을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체 h131R010을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 항체 h131R011을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 RSPO3에 결합하는 이중특이적 항체를 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 RSPO3 및 RSPO2에 결합하는 이중특이적 항체를 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 하이브리도마 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질을 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 크기 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 것을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대 헥사-히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착시켜 적절한 친화도 칼럼 상의 통과에 의한 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. 이뮤노글로불린의 정제에 사용되는 친화성 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 단리된 단백질은 단백질분해, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 질량 분광측정법 (MS), 핵 자기 공명 (NMR), 등전 포커싱 (IEF), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 X선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특성화할 수 있다. 단리된 단백질의 순도는 SDS-PAGE, SEC, 모세관 겔 전기영동, IEF 및 모세관 등전 포커싱 (cIEF)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 배양 배지 내에 재조합 단백질을 분비하는 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축할 수 있다. 농축 단계 후에, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 음이온 교환 수지, 예를 들어 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기재를 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 유형일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 비제한적으로 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT)를 비롯한 히드록시아파타이트 배지를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 사용하는 1개 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 재조합 단백질 (예를 들어, RSPO3-결합제)을 추가로 정제할 수 있다. 균질한 재조합 단백질을 제공하기 위해 상기 정제 단계의 일부 또는 전부의 다양한 조합을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 정제된다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO 이중특이적 항체는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 사용하여 단리되고/되거나 정제된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리되고/되거나 정제된 항체 생성물은 적어도 90%의 이종이량체 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리되고/되거나 정제된 항체 생성물은 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 이종이량체 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리되고/되거나 정제된 항체 생성물은 약 100%의 이종이량체 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 박테리아 배양물에서 생산된 재조합 단백질은, 예를 들어 세포 펠릿으로부터의 초기 추출에 이어서 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. HPLC가 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 동결-해동 순환, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
항체 및 다른 단백질을 정제하기 위한 관련 기술분야에 공지된 방법은 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048 및 2009/0187005에 기재된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체가 아닌 폴리펩티드이다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드를 확인 및 생산하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; 및 Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83]을 참조한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합 폴리펩티드를 생산 및/또는 확인하는데 파지 또는 포유동물 디스플레이 기술이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 G, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 컨센서스 반복 도메인 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 항체는 다수의 접합 형태 (즉, 면역접합체 또는 방사성접합체) 또는 비-접합 형태 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 악성 또는 암 세포를 제거하기 위한 보체-의존성 세포독성 및 항체-의존성 세포 독성을 포함하는 대상체의 천연 방어 메카니즘을 이용하기 위해 비-접합 형태로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩티드)는 세포독성제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 메토트렉세이트, 아드리아미신, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편, 예컨대 비제한적으로 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 방사성접합체 또는 방사성접합된 항체를 생성하기 위한 방사성동위원소이다. 다양한 방사성핵종, 예컨대 비제한적으로 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re 및 212Bi가 방사성접합된 항체의 생성에 이용가능하다. 항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 사용될 수 있다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다.
III. 폴리뉴클레오티드
특정 실시양태에서, 본 발명은 RSPO3에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 (또는 폴리펩티드의 단편)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 RSPO3에 대한 항체를 코딩하거나 또는 이러한 항체의 단편 (예를 들어, 항원-결합 부위를 포함하는 단편)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하고; 이는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우에는 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 41, 서열 42, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 68, 서열 69, 서열 72, 서열 73, 서열 74, 서열 86, 서열 87 및 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 40, 서열 43, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 70, 서열 71, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 84, 서열 85, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94 및 서열 95로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 18을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 19를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 24를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 25를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 30을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 31을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 40을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 43을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 50을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 51을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 52를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 53을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 54를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 55를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 65를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 66을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 67을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 70을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 71을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 75를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 84를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 85를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 89를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 90을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 91을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 92를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 93을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 94를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 서열 95를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 40, 서열 43, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 70, 서열 71, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 84, 서열 85, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94 및 서열 95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 일부 실시양태에서는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 32, 서열 40, 서열 43, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 70, 서열 71, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 84, 서열 85, 서열 89, 서열 990, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94 또는 서열 95에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 32, 서열 40, 서열 43, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 70, 서열 71, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 84, 서열 85, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94 또는 서열 95의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 혼성화는 고 염격성 조건 하에 일어난다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 18 및 서열 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 19 및 서열 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 50 및 서열 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 51 및 서열 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 65 및 서열 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 18 및 서열 75를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 19 및 서열 75를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 50 및 서열 75를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 51 및 서열 75를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 65 및 서열 75를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 95 및 서열 89를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 92 및 서열 89를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 24 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 25 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 40 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 43 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 52 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 53 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 66 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 70 및 서열 26을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 24 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 25 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 40 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 43 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 52 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 53 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 66 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 70 및 서열 76을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 84 및 서열 90을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 93 및 서열 90을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 30 및 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 31 및 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 54 및 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 55 및 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 67 및 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 71 및 서열 32를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 30 및 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 31 및 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 54 및 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 55 및 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 67 및 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 71 및 서열 77을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 85 및 서열 91을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 94 및 서열 91을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열)에 대해 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 전구단백질이며, 리더 서열이 숙주 세포에 의해 절단되도록 하여 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 전구단백질을 코딩할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙 단백질은 전구단백질이며, 이는 불활성 형태의 단백질이다. 프로서열이 절단되면, 활성의 성숙 단백질이 남는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 대해 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에는 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주 (예를 들어, COS-7 세포)가 사용된 경우에는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 서열은 다른 친화성 태그와 함께 사용될 수 있는 서열 DYKDDDDK (서열 33)의 펩티드인 FLAG-태그이다.
추가로 본 발명은, 예를 들어 단편, 유사체 및/또는 유도체를 코딩하는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체) 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 일부 실시양태에서는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원에 사용된, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드라는 어구는, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미하도록 의도된다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해서는, 참조 서열 내 뉴클레오티드의 5% 이하를 결실시키거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환할 수 있거나, 또는 참조 서열 내 전체 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드를 참조 서열 내로 삽입할 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는, 참조 서열 내 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 군에 배치된, 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 이들 말단 위치 사이의 임의의 부위에서 발생할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 다에서의 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 일으키는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경시키지는 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변화를 일으키지 않는 침묵 치환 (유전자 코드의 축중성으로 인함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 변이체는 전사 수준에서의 발현 차이 (예를 들어, 증가 또는 감소된 발현)를 일으키는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어 특정한 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 (즉, 인간 mRNA에서의 코돈을 박테리아 숙주, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)가 선호하는 것으로 변화시키기 위해) 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열의 비-코딩 또는 코딩 영역에서의 적어도 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 발현 (또는 발현 수준)을 조절 또는 변경하도록 생성된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 생성된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 발현을 감소시키도록 생성된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 모 폴리뉴클레오티드 서열과 비교할 때 코딩된 폴리펩티드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 모 폴리뉴클레오티드 서열과 비교할 때 코딩된 폴리펩티드의 감소된 발현을 갖는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변이체가 (코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않고) 이종다량체 분자의 생산을 증가시키도록 생성된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변이체가 (코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않고) 이중특이적 항체의 생산을 증가시키도록 생성된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
IV. 사용 방법 및 제약 조성물
본 발명의 RSPO3-결합제 (폴리펩티드 및 항체 포함)는 비제한적으로 암의 치료와 같은 치유적 치료 방법을 비롯한 다양한 적용에 유용하다. 특정 실시양태에서, 상기 작용제는 β-카테닌 신호전달을 억제하고/거나, 종양 성장을 억제하고/거나, 혈관신생을 조절하고/거나, 혈관신생을 억제하고/거나, 분화를 유도하고/거나, 종양 부피를 감소시키고/거나, 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키고/거나, 종양의 종양발생성을 감소시키는데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 또는 폴리펩티드 또는 항체는 인간 RSPO3의 길항제이다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 β-카테닌의 활성화, 증가된 β-카테닌 신호전달 및/또는 비정상 β-카테닌 신호전달과 연관된 질환의 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, 질환은 β-카테닌 신호전달에 의존성인 질환이다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 증가된 혈관신생을 특징으로 하는 장애의 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 수준을 특징으로 하는 장애의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체를 사용하여 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 세포를 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)와 시험관내 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 불멸화 세포주 또는 암 세포주를 배지에서 배양하고, 여기에 항-RSPO3 항체 또는 다른 작용제를 첨가하여 종양 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포를 환자 샘플, 예컨대 예를 들어 조직 생검, 흉막 삼출 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 이를 배지에서 배양하고, 여기에 RSPO3-결합제를 첨가하여 종양 성장을 억제한다.
일부 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 종양 또는 종양 세포를 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)와 생체내 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 또는 종양 세포를 RSPO3-결합제와 접촉시키는 것은 동물 모델에서 실행된다. 예를 들어, RSPO3-결합제는 이종이식편을 갖는 면역손상 마우스 (예를 들어, NOD/SCID 마우스)에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 세포 또는 암 줄기 세포를 환자 샘플, 예컨대 예를 들어 조직 생검, 흉막 삼출 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 이를 면역손상 마우스 내로 주사한 다음, RSPO3-결합제를 투여하여 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 동물에 투여된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 종양 성장을 예방하기 위해 종양발생 세포를 동물 내로 도입하는 것과 동시에 또는 그 직후에 투여된다 ("예방 모델"). 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 종양이 특정한 크기로 성장한 후에 치료제로서 투여된다 ("치료 모델"). 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 ATYFANYFDY (서열 11)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양을 앓고 있거나 또는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 하나의 RSPO 단백질 (예를 들어, RSPO1, RSPO2, RSPO3 또는 RSPO4)의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 하나의 RSPO 단백질 (예를 들어, RSPO1, RSPO2, RSPO3 또는 RSPO4)의 높은 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R01이다.
특정 실시양태에서, 종양은 β-카테닌 신호전달이 활성인 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 β-카테닌 신호전달이 비정상적인 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 APC 종양 억제 유전자에서의 불활성화 돌연변이 (예를 들어, 말단절단 돌연변이)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양은 APC 종양 억제 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 종양은 야생형 APC 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 β-카테닌 유전자에서의 활성화 돌연변이를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 대상체가 치료받고자 하는 암은 이러한 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양은 RSPO 유전자 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO2 유전자 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3 유전자 융합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 종양은 RSPO3-결합제 또는 항체가 결합하는 RSPO3을 발현한다. 특정 실시양태에서, 종양은 RSPO1의 상승된 발현 수준을 갖거나 또는 RSPO1을 과다-발현한다. 특정 실시양태에서, 종양은 RSPO2의 상승된 발현 수준을 갖거나 또는 RSPO2를 과다-발현한다. 특정 실시양태에서, 종양은 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖거나 또는 RSPO3을 과다-발현한다. "상승된 발현 수준을 갖는 종양"이라는 어구는 단백질의 발현 수준 또는 핵산의 발현 수준을 지칭할 수 있다. 일반적으로, 단백질 또는 유전자의 "상승된 발현 수준을 갖는 종양"이라는 어구 (또는 유사한 어구)는 참조 샘플에서의 동일한 단백질 또는 동일한 유전자의 발현 수준 또는 미리 결정된 발현 수준과 비교하였을 때의, 종양에서의 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 조직 유형의 정상 조직이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 한 군의 조직 유형의 정상 조직이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 조직 유형의 종양 또는 종양 군이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플은 상이한 조직 유형의 종양 또는 종양 군이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 종양에서의 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 한 군의 조직 유형에서의 단백질 또는 유전자의 평균 발현 수준과 비교할 때 "상승"되거나 또는 "높다". 일부 실시양태에서, 종양에서의 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 동일한 조직 유형 또는 상이한 조직 유형의 다른 종양에서의 단백질 또는 유전자의 발현 수준과 비교할 때 "상승"되거나 또는 "높다". 일부 실시양태에서, 종양은 동일한 조직 유형의 정상 조직에서 발현되는 RSPO 수준과 비교할 때 "상승된" 또는 "높은" 수준의 RSPO1, RSPO2 RSPO3 및/또는 RSPO4를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 미리 결정된 수준과 비교할 때 "상승된" 또는 "높은" 수준의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4를 발현한다.
또한, 본 발명은 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 내에서의 암 줄기 세포의 빈도는 RSPO3-결합제의 투여에 의해 감소된다. 본 발명은 또한 종양을 유효량의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항-RSPO3 항체)와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 치료 유효량의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항-RSPO3 항체)를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 131R002이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양이다. 본원에 사용된 "폐암"은 소세포 폐 암종 및 비소세포 폐 암종 (NSCLC)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 APC 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함하는 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 APC 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함하지 않는 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO 유전자 융합체를 함유하는 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO2 유전자 융합체를 함유하는 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3 유전자 융합체를 함유하는 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO1의 상승된 발현 수준을 갖는 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO2의 상승된 발현 수준을 갖는 췌장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO2의 상승된 발현 수준을 갖는 결장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO2의 상승된 발현 수준을 갖는 폐 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 폐 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 유방 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 결장직장 종양이다.
추가로, 본 발명은 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암은 참조 샘플에서의 동일한 RSPO 단백질의 발현 수준과 비교할 때 상승된 수준의 적어도 하나의 RSPO 단백질을 발현하는 세포를 특징으로 한다. 본원에 사용된 "참조 샘플"은 정상 조직, 동일한 조직 유형의 비-암성 조직, 동일한 조직 유형의 종양 조직 및 상이한 조직 유형의 종양 조직을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 암은 동일한 RSPO 단백질의 미리 결정된 수준과 비교할 때 상승된 수준의 적어도 하나의 RSPO 단백질을 발현하는 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 RSPO의 발현 수준을 결정하는 것은 치료 전에 수행된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 RSPO의 발현 수준을 결정하는 것은 면역조직화학에 의한 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 동일한 RSPO 단백질의 발현 수준과 비교할 때 상승된 수준의 적어도 하나의 RSPO 단백질을 발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 RSPO1을 과다-발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 RSPO2를 과다-발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 RSPO3을 과다-발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 RSPO 단백질을 과다-발현한다. 특정 실시양태에서, 암은 β-카테닌을 발현하는 세포를 특징으로 하며, 여기서 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달 및/또는 활성화를 방해한다.
일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3에 결합하고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3에 결합하고, RSPO3/LGR 상호작용을 방해하고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3에 결합하고, β-카테닌 활성화를 억제하고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3에 결합하고, 암 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 항-RSPO3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO 항체는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
본 발명은 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 대상체 (예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 대상체에게 KASGYTFTDYS (서열 9), KASGYTFTSYTF (서열 34) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10) 또는 YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11), ATYFANNFDY (서열 35) 또는 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 QSVDYDGDSYM (서열 12) 또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13) 또는 AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 ATYFANYFDY (서열 11)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및/또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암성 종양을 앓고 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 참조 샘플 또는 미리 결정된 수준과 비교할 때 적어도 하나의 RSPO 단백질의 상승된 발현을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 RSPO3의 상승된 발현을 갖는 폐 종양을 앓고 있고, 항-RSPO3 항체를 투여받는다.
또한, 본 발명은 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항체인 RSPO3-결합제를 제공한다. 또한, 본 방법은 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)의 용도를 제공한다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다.
또한, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 종양발생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 종양발생성은 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 것에 의해 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 내에서의 암 줄기 세포의 빈도는 RSPO3-결합제의 투여에 의해 감소된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암에서의 적어도 하나의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 RSPO의 발현 수준을 결정하는 단계는 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준을 참조 샘플에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준을 정상 조직에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준을 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 미리 결정된 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준을 정상 조직에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 미리 결정된 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO1의 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 RSPO3의 높은 발현 수준을 갖는다. 일반적으로, RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 수준을 동일한 조직 유형의 정상 조직에서의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 수준과 비교한다. 그러나, 일부 실시양태에서는, RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 수준을 한 군의 조직 유형의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 평균 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양에서의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 수준을 동일한 조직 유형 또는 상이한 조직 유형의 다른 종양에서의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 수준과 비교한다.
일부 실시양태에서, RSPO 발현 수준을 결정하는 것은 치료 전에 수행된다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암이 참조 샘플 (예를 들어, 정상 조직)에서의 동일한 RSPO의 발현 수준 또는 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체는 본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체를 투여받는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 종양 또는 암이 정상 또는 대조 조직에서의 RSPO3의 발현 수준과 비교할 때 RSPO3 (즉, 단백질 또는 핵산)의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항-RSPO3 항체)를 투여받는다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암이 APC 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 갖는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암이 β-카테닌 유전자에서의 활성화 돌연변이를 갖는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관신생을 조절하는 것은 혈관신생을 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3에 결합하고, 혈관신생을 억제하거나 또는 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 혈관신생의 억제 및/또는 감소는 종양 또는 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3에 결합하고, 비정상 혈관신생을 촉진한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 RSPO3에 결합하고, 비증식성 혈관신생을 촉진한다. 특정 실시양태에서, 비정상 혈관신생 또는 비증식성 혈관신생은 종양 또는 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다.
또한, 본 발명은 대상체가 정상 조직, 참조 샘플에서의 동일한 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 발현 또는 RSPO 단백질의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, RSPO-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법은 대상체가 참조 샘플 또는 RSPO3의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법은 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, 종양이 참조 샘플 또는 RSPO3의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양이 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체는 RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료에 대해 선택된 경우에, 대상체는 본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 종양이 하나 초과의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체는 가장 높은 발현 수준을 갖는 RSPO에 결합하는 RSPO-결합제를 투여받는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 종양에서의 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및/또는 RSPO4의 발현 수준이 결정되고, 종양이 정상 조직에서의 RSPO3의 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체는 RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 치료에 대해 선택된 경우에, 대상체는 본원에 기재된 항-RSPO3 항체를 투여받는다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 인간화 형태이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체의 인간화 형태이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
본 발명은 대상체가 정상 조직에서의 동일한 RSPO의 발현과 비교하거나 또는 미리 결정된 수준과 비교할 때 적어도 하나의 RSPO (즉, 단백질 또는 핵산)의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 적어도 하나의 RSPO의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체는 상승된 발현 수준을 갖는 RSPO에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료에 대해 선택되는 것인, RSPO-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법을 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료에 대해 선택된 경우에, 대상체는 본원에 기재된 RSPO-결합제 또는 항체를 투여받는다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체가 참조 샘플 또는 RSPO3의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, 종양이 참조 샘플 또는 RSPO3의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체가 참조 샘플 또는 RSPO3의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에 대상체는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, 종양이 참조 샘플 또는 RSPO3의 미리 결정된 수준과 비교할 때 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO3의 상승된 발현 수준을 갖는 경우에 대상체는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
또한, 본 발명은 (a) 대상체가 상승된 수준의 RSPO를 갖는 암을 앓고 있는 것에 적어도 부분적으로 기반하여 치료를 위한 대상체를 선택하고, (b) 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
세포, 종양 또는 암에서의 RSPO 발현 수준을 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 핵산 발현에 대해서, 이들 방법은 PCR-기반 검정, 마이크로어레이 분석 및 뉴클레오티드 서열분석 (예를 들어, 넥스트젠(NextGen) 서열분석)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 단백질 발현에 대해서, 이들 방법은 웨스턴 블롯 분석, 단백질 어레이, ELISA, 면역조직화학 (IHC) 검정 및 FACS를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 것을 포함하는, RSPO3-결합제로의 치료에 대해 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법은 대상체가 RSPO 유전자 융합체를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는 경우에, 대상체는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법은 (a) 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, (b) 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는 경우에, 대상체는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체가 RSPO 유전자 융합체를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 대상체가 RSPO 유전자 융합체를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는 경우에, 대상체는 RSPO 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료에 대해 선택되는 것인, RSPO-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체가 RSPO 유전자 융합체를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체가 RSPO 유전자 융합체를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는 경우에 대상체는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, RSPO3에 특이적으로 결합하는 항체로의 치료를 위한 인간 대상체를 선택하는 방법은 대상체로부터의 종양 샘플을 획득하고, 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는 경우에 대상체는 항체로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, RSPO 유전자 융합체는 RSPO2 유전자 융합체이다. 일부 실시양태에서, RSPO 유전자 융합체는 RSPO3 유전자 융합체이다. 일부 실시양태에서, 치료에 대해 선택된 경우에, 대상체는 본원에 기재된 RSPO-결합제 또는 항체를 투여받는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항-RSPO3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
또한, 본 발명은 (a) 대상체가 RSPO 유전자 융합체를 갖는 암을 앓고 있는 것에 적어도 부분적으로 기반하여 치료를 위한 대상체를 선택하고, (b) 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R006A 또는 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, 항-RSPO3 항체는 항체 h131R011이다.
종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 방법은 PCR-기반 검정, 마이크로어레이 분석 및 뉴클레오티드 서열분석 (예를 들어, 넥스트젠 서열분석, 전체-게놈 서열분석 (WGS))을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
종양 또는 암이 상승된 수준의 RSPO 발현을 갖거나 또는 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 방법은 다양한 샘플을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 종양 또는 암을 앓고 있는 대상체로부터 취해진다. 일부 실시양태에서, 샘플은 신선 종양/암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양/암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 포르말린-고정된 파라핀-포매 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 용해물로 가공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 DNA 또는 RNA로 가공된다.
비정상 (예를 들어, 증가된 수준)의 β-카테닌 신호전달과 연관된 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 증가된 수준의 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 특징으로 하는 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 치료 유효량의 RSPO-결합제, 폴리펩티드 또는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
또한, 본 발명은 세포를 유효량의 RSPO-결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서의 β-카테닌 신호전달을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포를 RSPO3-결합제와 접촉시키는 단계가 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 생체내 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 β-카테닌 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 β-카테닌의 활성화를 억제한다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO/LGR 상호작용을 방해한다. 특정 실시양태에서, LGR은 LGR4, LGR5 및/또는 LGR6이다. 특정 실시양태에서, LGR은 LGR4이다. 특정 실시양태에서, LGR은 LGR5이다. 특정 실시양태에서, LGR은 LGR6이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
비제한적으로 종양 세포를 비롯한 세포의 분화를 유도하기 위한, 본원에 기재된 RSPO-결합제, 폴리펩티드 또는 항체의 용도가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포가 분화하도록 유도하는 방법은 세포를 유효량의 본원에 기재된 RSPO-결합제 (예를 들어, 항 RSPO 항체)와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서의 종양 내의 세포가 분화하도록 유도하는 방법은 치료 유효량의 RSPO-결합제, 폴리펩티드 또는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포 상의 분화 마커를 유도하는 방법은 치료 유효량의 RSPO-결합제, 폴리펩티드 또는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 특정의 다른 실시양태에서, 종양은 결장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 생체내 방법이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
추가로, 본 발명은 종양발생 세포를 RSPO-결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양발생 세포를 비-종양발생 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 종양발생 세포를 포함하는 종양을 앓고 있거나 또는 제거된 이러한 종양을 앓았던 대상체에게 RSPO-결합제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양발생 세포는 난소 종양 세포이다. 특정 실시양태에서, 종양발생 세포는 결장 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양발생 세포는 폐 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, RSPO-결합제는 RSPO3-결합제이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R002의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 131R003의 변이체의 인간화 버전이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R006A 또는 항체 h131R006B이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R005/131R007이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R008이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R010이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 항체 h131R011이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 RSPO3-결합제로 치료되는 질환은 암이 아니다. 예를 들어, 질환은 대사 장애, 예컨대 비만 또는 당뇨병 (예를 들어, 제II형 당뇨병)일 수 있다 (Jin T., 2008, Diabetologia, 51:1771-80). 대안적으로, 질환은 골 장애, 예컨대 골다공증, 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다 (Corr M., 2008, Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 4:550-6; Day et al., 2008, Bone Joint Surg. Am., 90 Suppl 1:19-24). 질환은 또한 신장 장애, 예컨대 다낭성 신장 질환일 수 있다 (Harris et al., 2009, Ann. Rev. Med., 60:321-337; Schmidt-Ott et al., 2008, Kidney Int., 74:1004-8; Benzing et al., 2007, J. Am. Soc. Nephrol., 18:1389-98). 대안적으로, 비제한적으로 황반 변성 및 가족성 삼출성 유리체망막병증을 비롯한 눈 장애가 치료될 수 있다 (Lad et al., 2009, Stem Cells Dev., 18:7-16). 심근경색, 아테롬성동맥경화증 및 판막 장애를 비롯한 심혈관 장애가 또한 치료될 수 있다 (Al-Aly Z., 2008, Transl. Res., 151:233-9; Kobayashi et al., 2009, Nat. Cell Biol., 11:46-55; van Gijn et al., 2002, Cardiovasc. Res., 55:16-24; Christman et al., 2008, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 294:H2864-70). 일부 실시양태에서, 질환은 폐 장애, 예컨대 특발성 폐동맥 고혈압 또는 폐 섬유증이다 (Laumanns et al., 2008, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2009, 40:683-691; Koenigshoff et al., 2008, PLoS ONE, 3:e2142). 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제로 치료되는 질환은 간 질환, 예컨대 간경변증 또는 간 섬유증이다 (Cheng et al., 2008, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 294:G39-49).
본 발명은 본원에 기재된 RSPO3-결합제를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하고, 암을 치료하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 제제는 본 발명의 정제된 항체 또는 작용제를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 적합한 제약상 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.)
본 발명의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위해 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적물, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소 투여; 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입 (네뷸라이저에 의한 것 포함)에 의한 폐 투여, 기관내 투여 및 비강내 투여; 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복막내, 근육내 (예를 들어, 주사 또는 주입) 또는 두개내 (예를 들어, 척수강내 또는 뇌실내)를 포함하는 비경구 투여일 수 있다.
치료 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제제는 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 포함한다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주요 활성 성분은 제약 담체와 혼합된다. 통상의 정제화 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 희석제 (예를 들어, 물)를 포함한다. 이들은 본 발명의 화합물 또는 비-독성의 그의 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비-제제 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다. 이어서, 고체 예비-제제 조성물은 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 제제 또는 조성물의 정제, 환제 등은 코팅되거나 또는 달리 배합되어 지속 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 두 성분은, 붕해에 저항성이 있어 내부 성분이 손상 없이 위를 통과하게 하거나 또는 방출을 지연시키는 역할을 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
본원에 기재된 RSPO3-결합제 또는 항체는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐은, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조되며, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중의 또는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에 기재된 바와 같은 마크로에멀젼 중의 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐이다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 리폼솜과 복합체를 형성한 본 발명의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 포함한다. 리포솜을 제조하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 규정된 기공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 원하는 직경을 갖는 리포솜을 수득할 수 있다.
특정 실시양태에서, 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형품 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐) 형태로 존재한다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락티드, L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
특정 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 투여하는 것 이외에도, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 치료제는 RSPO3-결합제의 투여 이전에, 그와 동시에, 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. RSPO3-결합제 및 추가의 치료제(들)를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 1, 2, 3종 또는 그 초과의 추가의 치료제를 포함한다.
2종 이상의 치료제와의 조합 요법은 상이한 작용 메카니즘에 의해 작동하는 작용제들을 종종 사용하지만, 이것이 요구되는 것은 아니다. 상이한 작용 메카니즘을 갖는 작용제를 사용하는 조합 요법은 상가적 또는 상승작용적 효과를 유발할 수 있다. 조합 요법은 단독요법에서 사용되는 것보다 낮은 용량의 각각의 작용제를 허용하여, 독성 부작용을 감소시키고/거나 작용제(들)의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암 세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 비-종양발생 세포에 영향을 미치는 (예를 들어, 이를 억제하거나 또는 사멸시키는) 치료제 및 종양발생 CSC에 영향을 미치는 (예를 들어, 이를 억제하거나 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 및 적어도 하나의 추가의 치료제의 조합은 상가적 또는 상승작용적 효과를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 RSPO3-결합제의 치료 지수의 증가를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 작용제(들)의 치료 지수의 증가를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 RSPO3-결합제의 독성 및/또는 부작용의 감소를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 작용제(들)의 독성 및/또는 부작용의 감소를 유발한다.
유용한 치료제 부류는, 예를 들어 항튜불린 작용제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 삼핵 백금 착물 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴레이트제, 항대사물, 화학요법 증감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오린화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항대사물, 항유사분열, 토포이소머라제 억제제 또는 혈관신생 억제제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 백금 착물, 예컨대 카르보플라틴 또는 시스플라틴이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 탁산과 조합된 백금 착물이다.
RSPO3-결합제와 조합하여 투여될 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 본 발명의 RSPO3-결합제 또는 항체를 화학요법제 또는 다수의 다양한 화학요법제의 칵테일과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)로의 치료는 화학요법제의 투여 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 수행할 수 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 개별 제제를 사용하는 공-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제들이 그의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정하는 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제제 및 투여 스케줄은 또한 문헌 [The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플로오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 화학요법제는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐, 예컨대 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)); 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 카르보플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 파클리탁셀 (탁솔)이다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R006A, 131R006B, 131R005/131R007, 또는 131R008을 시스플라틴과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 이리노테칸이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 토포이소머라제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 이리노테칸과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물이다. 항대사물은, 정상적인 생화학적 반응에 요구되는 대사물과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분하게 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물은 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 소듐, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 겜시타빈이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 항대사물과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 겜시타빈과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 페메트렉세드와 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소테레), 알부민-결합 파클리탁셀 (nab-파클리탁셀; 아브락산(ABRAXANE)), DHA-파클리탁셀 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈데신, 또는 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제 또는 유사분열 키나제, 예컨대 오로라 A 또는 Plk1의 억제제이다. 특정 실시양태에서, RSPO-결합제와 조합하여 투여되는 화학요법제가 항유사분열제인 경우에, 치료되는 암 또는 종양은 유방암 또는 유방 종양이다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 파클리탁셀과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 nab-파클리탁셀 (아브락산)과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 (아브락산)과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예를 들어, 치료는 본 발명의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)와 종양-연관 항원, 예컨대 비제한적으로 EGFR, ErbB2, HER2 및/또는 VEGF에 대한 억제제로서 작용하는 소분자의 조합 투여를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 β-카테닌 신호전달을 억제하는 분자이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 생물학적 분자, 예컨대 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 본 발명의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)와 종양-연관 항원에 대한 다른 항체, 예컨대 비제한적으로 EGFR, ErbB2, HER2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체의 조합 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 제2의 RSPO, 예를 들어 RSPO1, RSPO2 및/또는 RSPO4에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-RSPO2 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-RSPO1 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 항암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 β-카테닌 신호전달을 억제하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 혈관신생 억제제 (예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)인 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)), 파니투무맙 (벡티빅스(VECTIBIX)) 또는 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX))이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 치료 유효량의 RSPO3-결합제를 Wnt 경로 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt 경로 억제제는 프리즐드 (FZD) 단백질 결합제인 "FZD-결합제"이다. FZD-결합제의 비제한적 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,982,013에서 찾을 수 있다. FZD-결합제는 항-FZD 항체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO-결합제를 항-FZD 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO-결합제를 항-FZD 항체 18R5와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt 경로 억제제는 Wnt 단백질 결합제인 "Wnt-결합제"이다. Wnt-결합제의 비제한적 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,723,477 및 7,947,277; 및 국제 공개공보 WO 2011/088127 및 WO 2011/088123에서 찾을 수 있다. Wnt-결합제는 항-Wnt 항체 및 FZD-Fc 가용성 수용체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 FZD-Fc 가용성 수용체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 FZD8-Fc 가용성 수용체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 항-FZD 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 항-FZD 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 항-FZD 항체 18R5와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 FZD-Fc 가용성 수용체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 FZD8-Fc 가용성 수용체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 치료 유효량의 RSPO-결합제를 하나 초과의 추가의 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO-결합제를 화학요법제 및 Wnt 경로 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 화학요법제 및 Wnt 경로 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 화학요법제 및 항-FZD 항체 18R5와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 화학요법제 및 FZD8-Fc 가용성 수용체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSPO3-결합제를 겜시타빈 및 Wnt 경로 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 겜시타빈 및 항-FZD 항체 18R5와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003의 변이체, 131R003의 인간화 버전, h131R006A, h131R006B, h131R005/131R007, h131R008, h131R010 또는 h131R011을 겜시타빈 및 FZD8-Fc 가용성 수용체와 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 RSPO3-결합제로의 치료는 다른 생물학적 분자, 예컨대 하나 이상의 시토카인 (예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)과의 조합 치료를 포함할 수 있거나 또는 종양, 암 세포의 외과적 제거, 또는 치료 의사에 의해 필요해 보이는 임의의 다른 요법을 수반할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료는 방사선 요법과 조합된 본 발명의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)의 투여를 포함한다. RSPO3-결합제로의 치료는 방사선 요법 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 수행할 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대한 투여 스케줄은 숙련된 진료의에 의해 결정될 수 있다.
조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 개별 제제를 사용하는 공-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
RSPO3-결합제 및 적어도 하나의 추가의 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다는 것을 알 것이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 이전에 제2 치료제로의 치료를 겪은 환자에게 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, RSPO3-결합제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 공동으로 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제로의 치료 과정 (예를 들어, 화학요법)을 겪는 동안 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제2 치료제로의 치료 후 1년 이내에 투여될 것이다. 특정의 대안적 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 4, 3, 2 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 또한, 2종 (또는 그 초과)의 작용제 또는 치료는 대상체에게 몇 시간 또는 몇 분 이내에 (즉, 실질적으로 동시에) 투여될 수 있음을 알 것이다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, RSPO3-결합제 또는 항체가 치료 목적으로 투여되는지 아니면 예방 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 이력 등에 따라 달라질 수 있으며, 이들 모두는 치료의의 판단에 따른다. RSPO3-결합제 또는 항체는 한 번에 또는 수 일에서 수 개월까지 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 이루어지거나 또는 질환 상태의 축소 (예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케쥴은 환자의 체내 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있고, 개별 항체 또는 작용제의 상대적 효력에 따라 달라질 것이다. 투여하는 의사는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 0.01μg 내지 100mg/체중 kg, 0.1μg 내지 100mg/체중 kg, 1μg 내지 100mg/체중 kg, 1mg 내지 100mg/체중 kg, 1mg 내지 80mg/체중 kg, 10mg 내지 100mg/체중 kg, 10mg 내지 75mg/체중 kg, 또는 10mg 내지 50mg/체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 다른 RSPO3-결합제의 투여량은 약 0.1mg 내지 약 20mg/체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 1일, 1주, 1개월 또는 1년에 1회 이상으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 다른 RSPO3-결합제는 매주 1회, 2주마다 1회 또는 3주마다 1회 제공된다.
일부 실시양태에서, RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)는 초기의 보다 높은 "부하" 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도도 또한 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 초기 용량을 투여하고, 이어서 추가의 용량 (또는 "유지" 용량)을 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 1개월마다 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투여 요법은 초기 부하 용량에 이어서, 예를 들어 초기 용량의 1/2의 유지 용량을 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 초기 부하 용량에 이어서, 예를 들어 초기 용량의 1/2의 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 3주 동안 3개의 초기 용량에 이어서, 예를 들어 동일량의 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성은 매우 심각하여 특정한 작용제를 치료 유효 용량으로 투여하는 것을 배제시킨다. 일부 경우에, 약물 요법은 중단되어야만 하고, 다른 작용제가 시도될 수 있다. 그러나, 동일한 치료 부류 내의 다수의 작용제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내고, 이는 환자가 요법을 중단해야만 하거나, 또는 가능한 경우에, 치료제와 연관된 불쾌한 부작용을 겪어야만 함을 의미한다.
따라서, 본 발명은 RSPO3-결합제, 화학요법제 등의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는, 하나 이상의 작용제를 투여하기 위한 간헐적 투여 전략을 사용하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효 용량의 RSPO3-결합제를 치료 유효 용량의 화학요법제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 작용제 중 하나 또는 둘 다는 간헐적 투여 전략에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 RSPO3-결합제를 약 2주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 RSPO3-결합제를 약 3주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 RSPO3-결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 RSPO3-결합제를 약 4주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSPO3-결합제는 간헐적 투여 전략을 사용하여 투여되고, 화학요법제는 매주 투여된다.
V. RSPO-결합제를 포함하는 키트
본 발명은 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는, 본원에 기재된 RSPO3-결합제 (예를 들어, 항체)를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 적어도 하나의 인간 RSPO 단백질에 대한 적어도 하나의 정제된 항체를 하나 이상의 용기에 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출 검정을 수행하는데 필요하고/거나 충분한 성분, 예컨대 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침서, 및 분석 및 결과 표시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어 모두를 함유한다. 통상의 기술자는 개시된 본 발명의 RSPO3-결합제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 확립된 키트 포맷 중 하나에 용이하게 혼입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
RSPO3-결합제 (예를 들어, 항-RSPO3 항체) 뿐만 아니라 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 화학요법제이다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 Wnt 경로 억제제이다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 혈관신생 억제제이다.
본 개시내용의 실시양태는, 본 개시내용의 특정 항체의 제조 및 본 개시내용의 항체를 사용하는 방법을 상술하는 하기의 비제한적 실시예를 참고하여 추가로 정의될 수 있다. 물질 및 방법 둘 다에 대한 다수의 변형이 본 개시내용의 범위로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있음은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1
인간 종양에서의 RSPO 및 LGR의 발현
다수의 인간 환자의 정상 조직, 양성 종양 및 악성 종양 샘플로부터의 mRNA를 마이크로어레이 분석 (진로직 바이오익스프레스 데이터스위트(Genelogic BioExpress Datasuite))에 의해 분석하였다. 이러한 데이터는 신장, 자궁내막 및 난소를 비롯한 몇몇 종양 유형에서 정상 조직에 비해 악성 조직에서의 RSPO1의 상승된 발현 수준을 나타내었다. 난소암에서 RSPO1이 빈번하게 과다-발현되는 것으로 주목되었다 (도 1a). 또한, 이러한 데이터는 난소, 췌장 및 폐를 비롯한 몇몇 종양 유형에서 정상 조직에 비해 악성 조직에서의 RSPO3의 상승된 발현 수준을 제시하였다 (도 1c). 또한, LGR5 및 LGR6이 정상 조직에 비해 악성 유방 종양, 결장 종양, 폐 종양 및 난소 종양에서 과다-발현된 한편, LGR4는 폐 종양에서 과다-발현되는 것으로 밝혀졌다. LGR5 및 LGR6 과다-발현은 다른 유방 종양 하위유형에 비해 삼중-음성 (ERnegPRnegHER2neg) 유방 종양에 제한되는 것으로 보였다.
뮤린 이종이식편에서 성장시킨 일련의 인간 종양으로부터 RNA를 단리하였다. 표지된 cRNA의 생성을 위한 확립된 아피메트릭스(Affymetrix) 프로토콜을 사용하여 RNA 샘플을 제조하고 처리하였다. 처리된 RNA를 제조업체의 기술 매뉴얼에 개략화된 바와 같이 아피메트릭스 HG-U133 플러스 2.0 마이크로어레이 (아피메트릭스, 캘리포니아주 산타 클라라)에 혼성화하였다. 혼성화 후에, 마이크로어레이를 세척하고, 스캐닝하고, 분석하였다. GCRMA 알고리즘 (바이오컨덕터(Bioconductor), www.bioconductor.org)을 사용하여, 스캐닝된 어레이 배경 조정 및 신호 강도 정규화를 수행하였다.
특정한 인간 RSPO 및 인간 LGR을 평가하였다 - RSPO1 (241450_at), RSPO2 (1554012_at), RSPO3 (228186_s_at), RSPO4 (237423_at), LGR4 (218326_s_at), LGR5 (210393_at) 및 LGR6 (227819_at). 마이크로어레이 분석은, LGR4 및 LGR6은 거의 모든 종양에서 광범위하게 발현되는 한편, 다수의 종양이 특정한 RSPO 패밀리 구성원 및 LGR5만 크게 과다-발현하는 것으로 밝혀졌음을 나타내었지만 (표 2), 이러한 발현 수준은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교되지는 않았다. 일반적으로, 주어진 종양에서 단일 RSPO 패밀리 구성원만이 고도로 발현되는데, 이는 이러한 RSPO 패밀리 내에 기능적인 중복성이 존재할 수 있음을 시사한다.
<표 2>
Figure pct00002
실시예 2
LGR5에 대한 RSPO 단백질의 결합
표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간 LGR5의 아미노산 22-564를 N-말단 FLAG 태그 및 CD4의 막횡단 도메인 및 C-말단 GFP 단백질 태그에 라이게이션함으로써 세포 표면 LGR5 단백질을 생성하였다 (FLAG-LGR5-CD4TM-GFP). 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 RSPO-Fc 구축물을 생성하였다. 구체적으로, 전장 인간 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4를 인간 Fc 영역에 인-프레임으로 라이게이션하고, 바큘로바이러스를 사용하여 재조합 RSPO-Fc 단백질을 곤충 세포에서 발현시켰다. 융합 단백질을 곤충 배지로부터 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
HEK-293 세포를 FLAG-LGR5-CD4TM-GFP 구축물로 일시적으로 형질감염시켰다. 48시간 후에, 형질감염된 세포를 2% FBS 및 헤파린을 함유하는 빙냉 PBS 중에 현탁시키고, 빙상에서 10μg/ml RSPO1-Fc, RSPO2-Fc, RSPO3-Fc, RSPO4-Fc 또는 FZD8-Fc 융합 단백질의 존재 하에 15분 동안 인큐베이션하였다. 100μl PE-접합 항-인간 Fc 이차 항체와의 제2 인큐베이션을 수행하여, Fc 융합 단백질에 의해 결합된 세포를 검출하였다. 세포를 양성 대조군으로서의 항-FLAG 항체 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스) 및 음성 대조군으로서의 항-PE 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 팩스칼리버(FACSCalibur) 기기 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세) 상에서 분석하고, 플루우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하였다.
도 2에 제시된 바와 같이, RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4 모두가 HEK-293 세포의 표면 상에서 발현된 LGR5에 결합한 반면, 음성 대조군인 FZD8은 LGR5에 결합하지 않았다.
RSPO 단백질과 LGR5 사이의 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석하였다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 가용성 LGR5-Fc 구축물을 생성하였다. 구체적으로, 인간 LGR5의 아미노산 1-564를 인간 Fc에 인 프레임으로 라이게이션하고, 바큘로바이러스를 사용하여 재조합 LGR5-Fc 융합 단백질을 곤충 세포에서 발현시켰다. LGR5-Fc 융합 단백질을 곤충 배지로부터 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. LGR5 신호 서열의 절단으로 LGR5의 아미노산 22-564를 함유하는 성숙형 LGR5-Fc 융합 단백질이 생성되었다. 재조합 RSPO1-Fc, RSPO2-Fc, RSPO3-Fc 및 RSPO4-Fc 융합 단백질을 표준 아민-기반 화학 (NHS/EDC)을 사용하여 CM5 칩 상에 고정시켰다. 가용성 LGR5-Fc의 2배 희석물을 칩 표면 상에 주입하였다 (100nM → 0.78nM). 동역학적 데이터를 비아코어 라이프 사이언시스(Biacore Life Sciences) (지이 헬스케어(GE Healthcare))로부터의 비아코어 2000 시스템을 사용하여 소정 시간에 걸쳐 수집하고, 동시적 글로벌 피트 식을 사용하여 데이터를 피팅함으로써 각각의 RSPO 단백질에 대한 친화도 상수 (KD 값)를 산출하였다 (표 3).
<표 3>
Figure pct00003
인간 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4 모두가 LGR5에 결합하였고, 이는 RSPO 단백질이 LGR 단백질에 대한 리간드일 수 있음을 입증한다.
실시예 3
항-RSPO3 항체의 확인
포유동물 세포 항체 라이브러리를 스크리닝하고, 2개의 항-RSPO3 항체 131R002 및 131R003을 확인하였다. 후속적으로, 서열 데이터는 항체 131R002 및 131R003이 동일한 경쇄 서열을 갖지만, 상이한 중쇄 서열을 가짐을 입증하였다.
비아코어 라이프사이언시스 (지이 헬스케어)로부터의 비아코어 2000 시스템을 사용하여 항체 131R002 및 131R003의 KD를 결정하였다. 재조합 인간 RSPO3 단백질을 비오티닐화하고, 400-700ru의 코팅 밀도를 갖는 스트렙타비딘-코팅된 칩 (GE 헬스케어) 상에 포획하였다. 항체를 HBS-P (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% v/v 계면활성제 P20) 중에서 100nM에서 0.78nM으로 2배 연속 희석하고, 칩 표면 상에 주입하였다. 동역학적 데이터를 소정 시간에 걸쳐 수집하고, 동시적 글로벌 피트 식을 사용하여 피팅함으로써 각각의 항체에 대한 친화도 상수 (KD 값)를 산출하였다.
항체 131R002는 8.2nM의 인간 RSPO3에 대한 친화도 상수 (KD)를 가졌고, 항체 131R003은 7.3nM의 인간 RSPO3에 대한 KD를 가졌다.
실시예 4
항-RSPO3 항체에 의한 β-카테닌 활성의 억제에 대한 시험관내 시험
HEK-293 세포를 6xTCF-루시페라제 리포터 벡터 (탑플래쉬(TOPflash), 메사추세츠주 빌러리카 밀리포어)로 형질감염시켰다. 24-48시간 후에, 형질감염된 HEK-293 세포를 항-RSPO3 항체 131R002 및 131R003의 존재 하에 WNT3a (5ng/ml) 및 인간 RSPO3 (10ng/ml, 알앤디 바이오시스템즈(R&D BioSystems), 미네소타주 미네아폴리스)의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 항체 131R002 및 131R003을 20μg/ml에서 0.02μg/ml로의 4배 연속 희석물 중 세포에 첨가하였다. 대조군으로서, 세포를 WNT3a 및 RSPO3의 조합, 단독의 WNT3a, 단독의 RSPO3과 함께 또는 첨가물 없이 인큐베이션하였다. 세포를 16시간 동안 인큐베이션하고, 제조업체의 지침에 따라 스테디-글로(Steady-Glo)® 루시페라제 검정 시스템 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, 항-RSPO3 항체 131R002 및 131R003 각각은 RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 용량-의존적 방식으로 감소시켰다. 이러한 결과는 항체 131R002 및 131R003이 RSPO3의 특이적 억제제이고, RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 감소시키고/거나 차단할 수 있음을 입증하였다.
실시예 5
RSPO3 항체의 친화도 성숙 및 인간화
항-RSPO3 항체 131R003을 친화도 성숙시키고, 몇몇 변이체를 확인하였다. 하나의 131R003 변이체는 모 131R003 항체와 비교할 때 변경된 중쇄 CDR1 (서열 34)을 가졌다. 제2 변이체는 모 131R003과 비교할 때 변경된 중쇄 CDR3 (서열 35)을 가졌다. 모 131R003과 비교할 때 상기 변경된 중쇄 CDR1 및 CDR3 둘 다를 포함하는 추가의 변이체를 생성하였다.
HEK-293 세포를 6xTCF-루시페라제 리포터 벡터 (탑플래쉬, 메사추세츠주 빌러리카 밀리포어)로 형질감염시켰다. 24-48시간 후에, 형질감염된 HEK-293 세포를 항-RSPO3 항체 131R003, 131R003 CDR1 변이체 및 131R003 CDR3 변이체의 존재 하에 WNT3a 및 인간 RSPO3의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 131R003, 131R003 CDR1 변이체 및 131R003 CDR3 변이체를 20μg/ml에서 0.006μg/ml로의 5배 연속 희석물 중 세포에 첨가하였다. 대조군으로서, 세포를 WNT3a 및 RSPO3의 조합, 단독의 WNT3a, 단독의 RSPO3, 대조 항체와 함께 또는 첨가물 없이 인큐베이션하였다. 세포를 16시간 동안 인큐베이션하고, 제조업체의 지침에 따라 스테디-글로® 루시페라제 검정 시스템 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.
도 4에 제시된 바와 같이, 항-RSPO3 항체 131R003 CDR1 변이체 및 131R003 CDR3 변이체 각각은 RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 모 131R003보다 낮은 농도에서 용량-의존적 방식으로 감소시켰다. 이러한 결과는 131R003 변이체가 모 131R003의 특성을 보유하였음을, 즉 이들은 RSPO3의 특이적 억제제이고, RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 감소시키고/거나 차단할 수 있음을 입증하였다. 또한, 이러한 결과는 131R003 변이체가 모 131R003보다 우수한 활성을 가짐을 입증하였다.
표준 기술을 사용하여 131R003 변이체의 인간화 형태를 생성하였다. 인간화 항체 h131R005, h131R007, h131R008, h131R010, h131R011은 모 131R003 항체와 비교할 때 변경된 중쇄 CDR3을 포함한다. 인간화 131R006B는 모 131R003 항체와 비교할 때 변경된 중쇄 CDR3을 포함한다. 항체 h131R005/131R007, h131R010 및 h131R011은 항체 131R006B와 비교할 때 프레임워크 영역 3에 몇몇 아미노산 치환을 포함한다. 항체 h131R005/131R007, h131R006 및 h131R011은 IgG2 항체이다. 항체 h131R008 및 h131R010은 IgG1 항체이다. 항체 h131R005/131R007, h131R010 및 h131R011은 동일한 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 h131R010 및 h131R011은 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는데, 이는 h131R005/131R007의 경쇄 가변 영역과는 상이하다.
131R010 항체의 중쇄를 코딩하는 플라스미드는 2013년 6월 18일에 부다페스트 조약의 조건 하에 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었고, ATCC 기탁 지정 번호 PTA-_____가 이에 할당되었다. 131R010 항체의 경쇄를 코딩하는 플라스미드는 2013년 6월 18일에 부다페스트 조약의 조건 하에 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 ATCC에 기탁되었고, ATCC 기탁 지정 번호 PTA-_____가 이에 할당되었다.
실시예 6
항-RSPO 항체에 의한 생체내 난소 종양 성장의 억제
해리된 OMP-OV38 난소 종양 세포 (1x105개의 세포)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스에 주사하였다. 150 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 39일 동안 성장시켰다. 마우스를 무작위화하고 (n = 군당 8마리), 항-RSPO1 항체 89M5와 항-RSPO3 항체 131R003의 조합, 항-RSPO1 항체 89M5와 항-RSPO3 항체 131R003과 탁솔의 조합, 단일 작용제로서의 탁솔, 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 20 mg/kg으로 투여하였고, 탁솔은 1주일에 1회 15 mg/ml로 투여하였다. 항체 및 탁솔의 투여는 복강내로의 주사를 통해 수행하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 시점에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표현된다.
도 5에 제시된 바와 같이, 항-RSPO1과 항-RSPO3 항체의 조합은 OMP-OV38 난소 종양 성장을 억제하였다. 놀랍게도, 항-RSPO1 항체 89M5와 항-RSPO3 항체 131R002와 탁솔의 조합은 탁솔 단독 또는 항체 조합 단독보다 유의하게 높은 수준으로 종양 성장을 억제하였다.
해리된 OMP-OV38 난소 종양 세포 (1 x 105개의 세포)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스에 주사하였다. 140 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 35일 동안 성장시켰다. 마우스를 무작위화하고 (n = 군당 10마리), 항-RSPO3 항체 131R002, 항-RSPO1 항체 89M5, 탁솔, 89M5와 탁솔의 조합, 131R002와 탁솔의 조합, 89M5와 131R002의 조합, 89M5와 131R002와 탁솔의 조합, 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 20 mg/kg으로 투여하였고, 탁솔은 46일 동안 1주일에 1회 15 mg/ml으로 투여한 다음 7.5 mg/kg으로 투여하였다. 항체 및 탁솔의 투여는 복강내로의 주사를 통해 수행하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 시점에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표현된다.
도 6에 제시된 바와 같이, 항-RSPO1 항체 89M5와 항-RSPO3 항체 131R002의 조합은 대조군 항체와 비교할 때 OMP-OV38 난소 종양 성장을 억제하였다. 항-RSPO1 항체 89M5와 탁솔의 조합 또는 항-RSPO3 항체 131R002와 탁솔의 조합은 탁솔 단독에 비해 효과를 갖지 않았다. 그러나, 놀랍게도 항-RSPO1 89M5와 항-RSPO3 항체 131R002와 탁솔의 조합은 탁솔 단독보다 높은 활성을 나타내었다.
실시예 7
항-RSPO3 항체에 의한 생체내 폐 종양 성장의 억제
OMP-LU45 비소세포 폐 종양에서, CD201+ 세포는 CD201- 세포보다 종양발생적인 것으로 관찰된 바 있다. 또한, RSPO3은 CD201+ 세포 집단에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 해리 및 분류된 OMP-LU45 CD44+CD201+ 폐 종양 세포 (5 x 104개의 세포)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스에 주사하였다. 140 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 38일 동안 성장시켰다. 마우스를 무작위화하고 (n = 군당 10마리), 항-RSPO3 항체 131R002 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 25 mg/kg으로 투여하였고, 항체의 투여는 복강내로의 주사를 통해 수행하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 시점에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표현된다.
제2 폐 종양을 이용한 연구에서는, 해리된 OMP-LU25 폐 종양 세포 (5 x 104개의 세포)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스에 주사하였다. 110 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 48일 동안 성장시켰다. 마우스를 무작위화하고 (n = 군당 9마리), 항-RSPO3 항체 131R002 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 25 mg/kg으로 투여하였고, 항체의 투여는 복강내로의 주사를 통해 수행하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 시점에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표현된다.
도 7a 및 7b에 제시된 바와 같이, 항-RSPO 항체 131R002는 대조군 항체와 비교할 때 폐 종양 OMP-LU45 및 OMP-LU25 둘 다의 성장을 억제하였다.
실시예 8
항-RSPO3 항체에 의한 β-카테닌 활성의 억제
HEK-293 세포를 6xTCF-루시페라제 리포터 벡터 (탑플래시, 밀리포어, 매사추세츠주 빌러리카)로 형질감염시켰다. 24-48시간 후, 형질감염된 HEK-293 세포를 항-RSPO3 항체 131R002, 131R006B 또는 131R007의 존재 하에 WNT3a 조건화 배지 (5ng/ml) 및 인간 RSPO3 (10ng/ml, 알앤디 바이오시스템즈)의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 항체 131R002, 131R006 또는 131R007은 20μg/ml → 0.0064μg/ml의 5배 연속 희석물로 세포에 첨가하였다. 대조군으로서, 세포를 WNT3a 조건화 배지 단독, WNT3a 조건화 배지와 인간 RSPO3의 조합과 함께 인큐베이션하거나, 또는 세포에 아무것도 첨가하지 않고 인큐베이션하였다. 세포를 16시간 동안 인큐베이션하고, 스테디-글로® 루시페라제 검정 시스템을 제조업체 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)의 지침서에 따라 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.
도 8에 제시된 바와 같이, 3종의 모든 항-RSPO3 항체는 WNT3a/RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 용량-의존적 방식으로 감소시켰다. 인간화 항체 131R006B 및 131R007은 항체 131R002보다 큰 β-카테닌 활성 억제 능력을 갖는 것으로 보였다. 이러한 결과는 인간화 항체 131R006B 및 131R007이 131R002보다 강한 RSPO3의 억제제이고, WNT3a/RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 감소시키고/거나 차단할 수 있음을 입증하였다.
실시예 9
LGR5에 대한 RSPO3 결합의 억제
HEK-293T 세포를 인간 LGR5의 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA 발현 벡터 (FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 항-RSPO3 항체 131R006B 또는 131R007의 존재 하에 재조합 RSPO3-비오틴 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 세포를 항체 없이 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에서 세척하고, PE-접합 스트렙타비딘의 첨가 및 유동 세포측정법에 의한 분석에 의해 LGR5-발현 형질감염 세포에 대한 RSPO3의 결합을 결정하였다.
도 9에 제시된 바와 같이, 항-RSPO3 항체 131R006B 및 131R007은 LGR5-발현 세포에 대한 RSPO3의 결합을 차단하는데 매우 효과적이었다.
실시예 10
RSPO3 항체의 결합 친화도
비아코어 라이프사이언시스 (지이 헬스케어)로부터 비아코어 2000 시스템을 사용하여 RSPO3 항체 131R002, 131R003, 131R003 CDR3 변이체, h131R007, h131R008 및 h131R011의 KD를 결정하였다. 사용된 방법은 실시예 3에 기재된 것과 상이하였다. 염소 항-인간 IgG 항체를 표준 아민-기반 화학 (NHS/EDC)을 사용하여 카르복시메틸-덱스트란 (CM5) SPR 칩에 커플링시키고, 에탄올아민으로 차단시켰다. 항체 (정제된 항체 또는 배양 상청액)를 HBS-P-BSA (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005% v/v 폴리소르베이트 20, 100ug/ml BSA) 중 10μg/ml의 농도로 희석하고, 항-인간 IgG 항체를 통해 칩 상에 포획시켰다. 인간 RSPO3 (알앤디 시스템즈)을 HBS-P-BSA 중에 300nM → 37.5nM로 2배 연속 희석하고, 포획된 항-RSPO3 항체 상에 순차적으로 주입하였다. RSPO3 회합 및 해리를 각각의 농도에서 측정하였다. 각각의 항원 주입 후, 5μl의 100mM H3PO4를 주입하여 항원-항체 복합체를 제거하고, 후속적 주입을 수행하였다. 동역학적 데이터를 시간의 경과에 따라 수집하고, 동시적 글로벌 피트 방정식을 사용하여 피팅함으로써 각각의 항체에 대한 친화도 상수 (KD 값)를 산출하였다 (표 4).
<표 4>
Figure pct00004
추가의 실험에서, 항체 h131R008은 인간 RSPO3에 대해 448pM만큼 낮은 KD를 갖고, 인간 RSPO1 또는 RSPO2에 대한 검출가능한 결합을 갖지 않고, 인간 RSPO4에 대한 약한 결합을 갖는 것으로 나타났다. 항체 h131R008은 뮤린 RSPO3에 대해 248pM의 KD를 갖고, 뮤린 RSPO1 또는 RSPO2에 대한 검출가능한 결합을 갖지 않고, 뮤린 RSPO4에 대한 약한 결합을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 11
항-RSPO3 항체에 의한 생체내 폐 종양 성장의 억제
비소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 NCI-H2030을 마이크로어레이 데이터에서의 높은 수준의 RPSO3 발현에 기반하여 시험용으로 선택하였다. NCI-H2030 세포 (1x106개)를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 100 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 대략 60일 동안 성장시켰다. 종양-보유 마우스를 4개 군으로 무작위화하였다 (n = 군당 7-9마리). 종양-보유 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002, 카르보플라틴, 항-RSPO3 항체 131R002와 카르보플라틴의 조합, 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 25 mg/kg으로 투여하였다. 카르보플라틴은 1주일에 1회 50 mg/kg으로 투여하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 처리 후 일자에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다.
도 10에 제시된 바와 같이, 카르보플라틴과 조합한 항-RSPO3 항체로의 처리는 카르보플라틴 단독 또는 항체 단독보다 우수하게 NCI-H2030 종양 성장을 억제하였다.
OMP-LU102는 마이크로어레이 데이터에서의 높은 수준의 RPSO3 발현에 기반하여 시험용으로 선택된 환자-유래 비소세포 폐암 (NSCLC) 이종이식편이다. OMP-LU102 폐 종양 세포 (1x105개)를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 90 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 22일 동안 성장시켰다. 종양-보유 마우스를 4개 군으로 무작위화하였다 (n = 군당 10마리). 종양-보유 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002, 카르보플라틴, 항-RSPO3 항체 131R002와 카르보플라틴의 조합, 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 25 mg/kg으로 투여하였다. 카르보플라틴은 1주일에 1회 50 mg/kg으로 투여하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 처리 후 일자에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다.
도 11a에 제시된 바와 같이, 항-RSPO3 항체로의 처리는 단일 작용제로서 OMP-LU102 폐 종양 성장을 억제하였지만, 카르보플라틴과 조합 시 훨씬 더 큰 효과를 가졌다.
처리 후에 4개 실험군 각각으로부터의 종양으로부터 RNA를 제조하였다. 유전자 발현을 마이크로어레이 분석에 의해 특성화하였다. 유전자 세트 풍부화 분석은 (단일 작용제로서의 또는 카르보플라틴과 조합한) 항-RSPO3 항체 처리가 도 11b에 제시된 바와 같이 정상 줄기 세포 또는 암 줄기 세포 특유의 다양한 유전자 세트의 발현을 억제하였음을 나타내었다. 카르보플라틴 단독으로의 처리는 유전자 발현에 대해 이러한 효과를 갖지 않았다.
실시예 12
항-RSPO3 항체에 의한 생체내 췌장 종양 성장의 억제
OMP-PN35는 마이크로어레이 데이터에서의 높은 수준의 RPSO3 발현에 기반하여 시험용으로 선택된 환자-유래 췌장관 선암종 (PDAC) 이종이식편이다. OMP-PN35 (1x105개)를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 90 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 30일 동안 성장시켰다. 종양-보유 마우스를 4개 군으로 무작위화하였다 (n = 군당 10마리). 종양-보유 마우스를 항-RSPO3 항체 131R002, 겜시타빈 플러스 nab-파클리탁셀 (아브락산), 항-RSPO3 항체와 겜시타빈과 nab-파클리탁셀 (아브락산)의 조합으로 처리하였다. 항체는 1주일에 1회 25 mg/kg으로 투여하였다. 겜시타빈은 1주일에 1회 20 mg/kg으로 투여하였고, nab-파클리탁셀 (아브락산)은 1주일에 1회 30 mg/kg으로 투여하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 처리 후 일자에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다.
도 12a에는 4개 처리군 모두로부터의 결과가 제시되고, 도 12b에는 조합 처리만이 확대 눈금으로 제시된다. 도 12a 및 12b는 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 (아브락산)과 조합한 항-RSPO3 항체가 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀 (아브락산) 단독보다 우수하게 OMP-PN35 췌장 종양 성장을 억제하였음을 제시한다.
실시예 13
항-RSPO3 항체에 의한 β-카테닌 활성의 억제
HEK-293 세포를 6xTCF-루시페라제 리포터 벡터 (탑플래시, 밀리포어, 매사추세츠주 빌러리카)로 형질감염시켰다. 24-48시간 후, 형질감염된 HEK-293 세포를 항-RSPO3 항체 h131R007 또는 h131R010의 존재 하에 WNT3a 조건화 배지 (5ng/ml) 및 인간 RSPO3 (2ng/ml, 알앤디 바이오시스템즈)의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 항체 h131R007 또는 h131R010은 20μg/ml → 0.0064μg/ml의 5배 연속 희석물로 세포에 첨가하였다. 대조군으로서, 세포를 WNT3a 조건화 배지 단독, WNT3a 조건화 배지와 인간 RSPO3의 조합과 함께 인큐베이션하거나, 또는 세포에 아무것도 첨가하지 않고 인큐베이션하였다. 세포를 16시간 동안 인큐베이션하고, 스테디-글로® 루시페라제 검정 시스템을 제조업체 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)의 지침서에 따라 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.
도 13에 제시된 바와 같이, 항체 h131R010은 WNT3a/RSPO3-유도 β-카테닌 신호전달을 용량-의존적 방식 및 h131R007과 유사한 정도로 감소시켰다. h131R010이 β-카테닌 신호전달을 h131R007과 동일한 정도로 억제하였기 때문에, 항-RSPO3 항체의 활성은 IgG1 이소형으로의 전환에 의해 영향을 받지 않았음이 명백하다.
실시예 14
항-RSPO3 항체에 의한 생체내 폐 종양 성장의 억제
OMP-LU25는 마이크로어레이 데이터에서의 높은 수준의 RPSO3 발현에 기반하여 시험용으로 선택된 환자-유래 비소세포 폐암 (NSCLC) 이종이식편이다. OMP-LU25 종양 세포 (5x104개)를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 120 mm3의 평균 부피에 도달할 때까지 종양을 33일 동안 성장시켰다. 종양-보유 마우스를 4개 군으로 무작위화하였다 (n = 군당 9마리). 종양-보유 마우스를 대조군 항체, 항-RSPO3 항체 131R008, 파클리탁셀, 또는 항-RSPO3 항체 131R008과 파클리탁셀의 조합으로 처리하였다. 항체는 매주 20 mg/kg으로 투여하였다. 파클리탁셀은 매주 15 mg/kg으로 투여하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 지시된 처리 후 일자에 전자 캘리퍼로 종양 부피를 측정하였다.
도 14에 제시된 바와 같이, 항-RSPO3 항체 131R008은 단일 작용제로서 및 화학요법과 조합하여 OMP-LU25 종양 성장을 억제하였다. 또한, 파클리탁셀과 항-RSPO3 항체 131R008의 조합은 종양 퇴행을 유발하였다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 오직 예시적 목적을 위한 것이고, 그에 관한 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제시될 것이며 이들도 본원의 취지 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
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본원에 개시된 서열은 다음과 같다:
Figure pct00005
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
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Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
ATCC PTA-120420 20130618 ATCC PTA-120421 20130618
SEQUENCE LISTING <110> ONCOMED PHARMACEUTICALS, INC. GURNEY, Austin L. BOND, Christopher J. <120> RSPO3 BINDING AGENTS AND USES THEREOF <130> 2293.093PC04/PAC/KBK <140> To be assigned <141> Herewith <150> US 61/826,747 <151> 2013-05-23 <150> US 61/789,156 <151> 2013-03-15 <150> US 61/753,184 <151> 2013-01-16 <150> US 61/671,421 <151> 2012-07-13 <160> 95 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile 20 25 30 Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser 35 40 45 Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu 50 55 60 Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro 65 70 75 80 Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys 85 90 95 Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser 130 135 140 Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser 145 150 155 160 Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr 165 170 175 Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp 180 185 190 Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu 195 200 205 Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn 210 215 220 Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg 225 230 235 240 Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro 245 250 255 Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala 260 <210> 2 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Phe Arg Leu Phe Ser Phe Ala Leu Ile Ile Leu Asn Cys Met 1 5 10 15 Asp Tyr Ser His Cys Gln Gly Asn Arg Trp Arg Arg Ser Lys Arg Ala 20 25 30 Ser Tyr Val Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys 35 40 45 Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg 50 55 60 Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser 65 70 75 80 Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys 85 90 95 Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys 100 105 110 Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys 115 120 125 Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly 130 135 140 Cys Glu Val Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn 145 150 155 160 Arg Thr Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile 165 170 175 Val Lys Lys Pro Val Lys Asp Thr Ile Pro Cys Pro Thr Ile Ala Glu 180 185 190 Ser Arg Arg Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg 195 200 205 Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu 210 215 220 Ile Glu Arg Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg 225 230 235 240 Ala Asn Gln <210> 3 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys 35 40 45 Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala 50 55 60 Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys 65 70 75 80 Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr 85 90 95 Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser 130 135 140 Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr 145 150 155 160 Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val 165 170 175 Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro 180 185 190 Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys 195 200 205 Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn 210 215 220 Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser 225 230 235 240 Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys 245 250 255 Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His 260 265 270 <210> 4 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys 35 40 45 Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala 50 55 60 Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys 65 70 75 80 Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr 85 90 95 Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser 130 135 140 Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr 145 150 155 160 Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly 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His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn Cys Pro Glu Gly Leu 100 105 110 Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser Ile Val His Cys Glu 115 120 125 Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr Lys Lys Gly Lys Thr 130 135 140 Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val Arg Glu Ile Ile Gln 145 150 155 160 His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro Thr Asn Glu Thr Arg 165 170 175 Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys Gly Glu Arg Gly Lys 180 185 190 Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn Lys Gly Glu Ser Lys 195 200 205 Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser Ser Lys Glu Ile Pro 210 215 220 Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys Arg Lys Val Gln Asp 225 230 235 240 Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His 245 250 <210> 6 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ser Asp 1 5 10 15 Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala Leu Glu 20 25 30 Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys Pro Ser 35 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gctggccctt ctgtgttcct gttccctcct 780 aagcctaagg acaccctgat gatctcccgg acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggac 840 gtgtcccacg aggaccctga ggtgcagttc aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900 aacgccaaga ccaagcctcg ggaggaacag ttcaactcca ccttccgggt ggtgtctgtg 960 ctgaccgtgg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac 1020 aagggcctgc ctgcccctat cgaaaagacc atctctaaga ccaagggcca gcctcgcgag 1080 cctcaggtct acaccctgcc tcctagccgg gaggaaatga ccaagaacca ggtgtccctg 1140 acctgtctgg tgaagggctt ctacccttcc gatatcgccg tggagtggga gtctaacggc 1200 cagcctgaga acaactacaa gaccacccct cctatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctgtactcca agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1320 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgtctcct 1380 ggcaagtga 1389 <210> 25 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 131R003 Heavy chain nucleotide sequence <400> 25 atgaagcatc tttggttctt cctgctcttg gtggctgcgc cgaggtgggt gctcagccag 60 gtgcaactta aacagtcggg gcctgagttg gtcaaaccag gagcctcagt aaagattagc 120 tgcaaagcat caggttatac ctttacggat tactcgatcc actgggtgaa gcagaaccac 180 ggaaagtcac tggattggat cgggtacatc tacccctcga atggagattc ggggtataac 240 caaaagttca aaaaccgggc cacgctgact gtggacacgt cgtattccac cgcatatttg 300 gaagtccgca gactcacgtt cgaggactcc gcggtatact attgtgccac atactttgcg 360 aattactttg actactgggg tcagggcaca acgcttactg tctccagcgc gtcaacaaag 420 ggcccctccg tgttccctct ggccccttgc tcccggtcca cctctgagtc taccgccgct 480 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 540 gccctgacct ctggcgtgca caccttccct gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 600 ctgtcctccg tggtgaccgt gccttcctcc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtggaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagaccg tggagcggaa gtgctgcgtg 720 gagtgccctc cttgtcctgc tcctcctgtg gctggccctt ctgtgttcct gttccctcct 780 aagcctaagg acaccctgat gatctcccgg acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggac 840 gtgtcccacg aggaccctga ggtgcagttc aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900 aacgccaaga ccaagcctcg ggaggaacag ttcaactcca ccttccgggt ggtgtctgtg 960 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acaaggaacc acgctcactg tcagctcagc cagcaccaag 420 ggcccctccg tgttccctct ggccccttgc tcccggtcca cctctgagtc taccgccgct 480 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 540 gccctgacct ctggcgtgca caccttccct gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 600 ctgtcctccg tggtgaccgt gccttcctcc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtggaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagaccg tggagcggaa gtgctgcgtg 720 gagtgccctc cttgtcctgc tcctcctgtg gctggccctt ctgtgttcct gttccctcct 780 aagcctaagg acaccctgat gatctcccgg acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggac 840 gtgtcccacg aggaccctga ggtgcagttc aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900 aacgccaaga ccaagcctcg ggaggaacag ttcaactcca ccttccgggt ggtgtctgtg 960 ctgaccgtgg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac 1020 aagggcctgc ctgcccctat cgaaaagacc atctctaaga ccaagggcca gcctcgcgag 1080 cctcaggtct acaccctgcc tcctagccgg gaggaaatga ccaagaacca ggtgtccctg 1140 acctgtctgg tgaagggctt ctacccttcc gatatcgccg tggagtggga gtctaacggc 1200 cagcctgaga acaactacaa gaccacccct cctatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctgtactcca agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1320 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgtctcct 1380 ggcaagtgat aa 1392 <210> 94 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized 131R011 Heavy chain (IgG2) <400> 94 caagtgcaat tggtgcagtc cggagcggaa gtgaagaagc ctggtgcctc ggtcaaagtc 60 tcatgcaagg ccagcggata cactttcacc gactactcca tccattgggt gaggcaggct 120 ccgggccagg gcctggagtg gattgggtac atctacccgt cgaacggaga ttcggggtac 180 aatcagaagt tcaagaaccg cgtgaccatg actcgggaca cctcaacttc cacggcttat 240 atggaactga gccgcctgag atccgaggac actgcggtgt actactgtgc cacctacttt 300 gcgaacaatt tcgattactg gggacaagga accacgctca ctgtcagctc agccagcacc 360 aagggcccct ccgtgttccc tctggcccct tgctcccggt ccacctctga gtctaccgcc 420 gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480 ggcgccctga cctctggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540 tccctgtcct ccgtggtgac cgtgccttcc tccaacttcg gcacccagac ctacacctgc 600 aacgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaaga ccgtggagcg gaagtgctgc 660 gtggagtgcc ctccttgtcc tgctcctcct gtggctggcc cttctgtgtt cctgttccct 720 cctaagccta aggacaccct gatgatctcc cggacccctg aagtgacctg cgtggtggtg 780 gacgtgtccc acgaggaccc tgaggtgcag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaggtg 840 cacaacgcca agaccaagcc tcgggaggaa cagttcaact ccaccttccg ggtggtgtct 900 gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg aacggcaaag aatacaagtg caaggtgtcc 960 aacaagggcc tgcctgcccc tatcgaaaag accatctcta agaccaaggg ccagcctcgc 1020 gagcctcagg tctacaccct gcctcctagc cgggaggaaa tgaccaagaa ccaggtgtcc 1080 ctgacctgtc tggtgaaggg cttctaccct tccgatatcg ccgtggagtg ggagtctaac 1140 ggccagcctg agaacaacta caagaccacc cctcctatgc tggactccga cggctccttc 1200 ttcctgtact ccaagctgac agtggacaag tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1260 tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gtccctgtct 1320 cctggcaagt gataa 1335 <210> 95 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized 131R010 Heavy chain variable region <400> 95 caagtgcaat tggtgcagtc cggagcggaa gtgaagaagc ctggtgcctc ggtcaaagtc 60 tcatgcaagg ccagcggata cactttcacc gactactcca tccattgggt gaggcaggct 120 ccgggccagg gcctggagtg gattgggtac atctacccgt cgaacggaga ttcggggtac 180 aatcagaagt tcaagaaccg cgtgaccatg actcgggaca cctcaacttc cacggcttat 240 atggaactga gccgcctgag atccgaggac actgcggtgt actactgtgc cacctacttt 300 gcgaacaatt tcgattactg gggacaagga accacgctca ctgtcagctc 350

Claims (30)

  1. (a) DYSIH (서열 78), KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79) 또는 IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80), ATYFANYFDY (서열 11) 또는 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및
    (b) KASQSVDYDGDSYMN (서열 81) 또는 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82) 또는 AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14) 또는 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 R-스폰딘 3 (RSP03)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) DYSIH (서열 78) 또는 KASGYTFTDYS (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR1, YIYPSNGDSGYNQKFK (서열 79)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 KASQSVDYDGDSYMN (서열 81)을 포함하는 경쇄 CDR1, AASNLES (서열 82)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLTF (서열 83)를 포함하는 경쇄 CDR3;
    (b) KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 KASGYTFTSYTF (서열 34)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 ATYFANYFDY (서열 11) 또는 ATYFANNFDY (서열 35)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
    (c) KASGYTFTDYS (서열 9) 또는 DYSIH (서열 78)를 포함하는 중쇄 CDR1, IYPSNGDS (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 TYFANNFD (서열 80)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 QSVDYDGDSYM (서열 12)을 포함하는 경쇄 CDR1, AAS (서열 13)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQSNEDPLT (서열 14)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 44, 서열 15, 서열 16, 서열 36, 서열 37, 서열 45 또는 서열 62에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 86, 서열 17 또는 서열 72에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    (a) 서열 44를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열 15를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17 또는 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 16을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17 또는 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열 36을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17 또는 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열 37을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17 또는 서열 72를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (f) 서열 45를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (g) 서열 62를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 17, 서열 72 또는 서열 86을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  5. RSPO3에 대한 특이적 결합에 대해 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체, 인간 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, 또는 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편인 항체.
  7. ATCC에 PTA-120420으로서 기탁된 플라스미드에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 ATCC에 PTA-120421로서 기탁된 플라스미드에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 류신-풍부 반복부 함유 G 단백질 커플링된 수용체 (LGR)에 대한 RSP03의 결합을 억제하는 항체.
  9. 제8항에 있어서, LGR이 LGR5, LGR4 및 LGR6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) RSP03 신호전달을 억제하거나;
    (b) β-카테닌의 활성화를 억제하거나;
    (c) β-카테닌 신호전달을 억제하거나;
    (d) 종양 성장을 억제하거나;
    (e) 종양 내에서 분화 마커의 발현을 유도하거나;
    (f) 종양 내의 세포가 분화하도록 유도하거나; 또는
    (g) 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는
    항체.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  13. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체; 또는
    (b) 제12항의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 세포.
  14. 종양 성장을 억제하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  15. 종양 세포의 분화를 유도하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  16. 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  17. 세포 내에서 β-카테닌 신호전달을 억제하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  18. 제17항에 있어서, 세포가 종양 세포인 항체의 용도.
  19. 제14항 내지 제16항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 췌장 종양, 폐 종양, 결장직장 종양 또는 난소 종양인 항체의 용도.
  20. 암을 치료하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 암이 결장직장암, 췌장암, 폐암 또는 난소암인 항체의 용도.
  22. 제14항 내지 제16항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 암이 RSPO 유전자 융합체를 갖는 것인 항체의 용도.
  23. 제14항 내지 제16항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 암이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 항체의 용도.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, RSPO 유전자 융합체가 RSP02 유전자 융합체 또는 RSP03 유전자 융합체인 항체의 용도.
  25. β-카테닌의 활성화와 연관된 질환을 치료하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  26. 제14항 내지 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함하는 항체의 용도.
  27. 제26항에 있어서, 추가의 치료제가 화학요법제, 혈관신생 억제제, 추가의 항체인 항체의 용도.
  28. 종양이 RSPO 유전자 융합체를 갖는지를 결정하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체로 치료하기 위한 종양을 확인하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, RSPO 유전자 융합체가 RSP02 유전자 융합체 또는 RSP03 유전자 융합체인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, RSPO 유전자 융합체를 PCR-기반 검정, 마이크로어레이 분석 또는 뉴클레오티드 서열분석에 의해 결정하는 것인 방법.
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