WO2008075796A1

WO2008075796A1 - 血球回復促進剤

Info

Publication number: WO2008075796A1
Application number: PCT/JP2007/075347
Authority: WO
Inventors: Yoshimasa Inagaki; Wakako Yamada; Kazuma Tomizuka
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2008-06-26

Abstract

本発明は、血球回復促進に有用な手段及び方法の提供を課題とする。　本発明によれば、（ａ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２又は３タンパク質、（ｂ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２又は３タンパク質をコードする核酸、（ｃ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２又は３タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、あるいは（ｄ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２又は３タンパク質をコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むことを特徴とする血球回復促進剤が提供される。

Description

血球回復促進剤技術分野

本発明は、血球回復促進剤及び血球回復促進方法に関する。また本発明は、血球減少関連疾患又は障害の治療剤又は予防剤、及び血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防方法に関する。

明

本発明はまた、血球減少の低減又は回復を促進する表現型を示す R— s p o n d i nノックインマウス及びその作製方法に関する。

書背景技術

C h e nら（非特許文献 1 ) 及び K ama t aら（非特許文献 2 ) は、トロンボスポンジンタイプ 1 リピート（非特許文献 3) を 1つ、及びシスティンに富むフューリン様ドメインを 2つ含むことを構造的特徴とする、 4種の異なる遺伝子からなるマウス及びヒト遺伝子ファミリ一について報告している。さらに K a m a t aら（非特許文献 2) は、上記 4種のうちの 1種、 265アミノ酸からなるタンパク質をコードするマウス遺伝子（G e n B a n kァクセッション番号： A

B 0 1 6 768) についてマウス胚における発現部位の解析を行い、この遺伝子が胚発生過程で形成される神経管の背側にある蓋板（roof-plate) において特異的に発現していることを見出した。一方、神経管の腹側にある床板（floor plate) において特異的に発現し、かつトロンボスポンジンタイプ 1 リピートを含むタンパク質として F— s p o n d i n (非特許文献 4) が既に知られていたため、こ . の遺伝子は r o o f p l a t e (R)- s p o n d i nと名付けられた。その後、

Ka z a n s k a y aら（非特許文献 5) の報告において 4種のヒト R— s p o n d i nファミリー遺伝子産物がそれぞれ R_ s p o n d i n 1 , 2， 3， 4として示されているが、本明細書における R— s p o n d i n遺伝子ファミリ一の表記はこの報告に従っている。また Kama t aら（非特許文献 2) が報告したマウス遺伝子（G e nB a n kァクセッション番号： AB 0 1 6 768) はヒト R— s p o n d i n lのマウスオノレソログに相当する。以上の通り、 R— s p o n d i nフアミリーに属する遺伝子の塩基配列、及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は明らかとなっていたにもかかわらず、各 R_ s p o n d i nタンパク質の生体内における生理的機能に関する情報は最近まで非常に乏しいままであった。

2004年に K a z a n s k a y aら（非特許文献 5 ) は、ヒト R— s p o n d i n 2及びそのアフリカッメガエルオルソログについて解析を行い、この遺伝子産物が Wn tZ)3カテニンシグナルに対する促進的作用を持つことを示した。 Wn tノ) 3カテニンシグナルはヒトからショウジョゥバエまで保存された細胞内シグナル伝達系であり、発生、形態形成、細胞の増殖 ·分化など様々な生命現象において重要な役割を果たしている（非特許文献 6)。また、このシグナル伝達系は、癌をはじめとした様々な疾病の発症と進展に深く関わっていることも明らかになっている（非特許文献 7)。 Wn tは 20種以上の大きなファミリーを形成している細胞外に分泌されるリガンドで、その受容体は 7回膜貫通型の膜タンパク質 F r i z z l e d (ヒトでは 1 0種類存在する）である。 Wn tと F r i z z 1 e dの相互作用は、細胞質での J3カテニンリン酸化抑制を引き起こし、安定化した非リン酸化型 (Sカテニンの核移行、 /3カテニンと結合した転写因子 TC Fノ L E Fによるターゲット遺伝子の発現誘導、というカスケ一ド反応のきっかけとなる。

Ka z a n s k a y aら（非特許文献 5 ) は、 HEK 29 3 T細胞を用いた i3 カテニンシグナル活性評価のためのィンビトロ系において、マウス R— s p o n d i n l、 R— s p o n d i n 2、 R— s p o n d i n 3、及ひ卜 R— s p o n d i n 2、 R— s p o n d i n 3が ]3カテニンシグナルを活性化する作用を持つことを報告している。さらにこの活性は 2つのフューリン様ドメインのみを含む変異体でも維持されていること、 R_ s p o n d i n 2はアフリカッメガエル胚の筋形成に必須の因子であること、及び H e 1 a細胞において R— s p o n d i n 2及び R— s p o n d i n 3の発現を同時に抑制すると、 Wn tによる ]3力テニンシグナル活性化も抑制されることを示している。また K a z a n s k a y aら（非特許文献 5) の報告においては、アフリカッメガエル R_ s p o n d i ！！？のじ型（C末端の電荷に富むアミノ酸が多い領域を欠損する）変異体タンパク質は、全長型タンパク質と比較して、動物培養細胞上清における発現量が高いことが記されている。しかしながらこの研究において行われた R— s p o n d i nファミリー遺伝子の生理的な機能についての検討は、アフリカッメガエル胚での検討に留まっており、 R— s p o n d i nフアミリー遺伝子とその産物が哺乳動物の生体内でどのような機能を持つかについては依然として不明のままであつた。

最近、 K i mら（非特許文献 8) により R— s p o n d i n l遺伝子産物の生体内機能に関する重要な報告がなされた。彼らは、ヒト R— s p o n d i n lタンパク質がマウス成体の腸管（小腸、大腸）クリブト細胞増殖促進活性を持つことを見出し、その作用は腸管上皮細胞の増殖と維持に必須のシグナル伝達系として知られる ]3カテニンシグナル（非特許文献 9) の活性化を伴うことを示した。さらに抗癌剤である 5 FU投与により誘導されたマウスの腸（小腸、大腸）上皮粘膜炎及び舌上皮粘膜炎が R— s p o n d i n 1タンパク質の投与により緩和されることを報告した。すなわち、 R— s p o n d i n 1タンパク質は消化管粘膜上皮の傷害を伴う様々な疾病（癌の放射線療法、化学療法、あるいは造血幹細胞移植法に伴う口腔 ·消化管粘膜炎、潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患、外科的手術により腸の大部分を切除することによる短腸症など）に対する治療薬として有効である可能性が示された。

R— s p o n d i nファミリ一に属する遺伝子産物の哺乳動物における作用を示唆する他の報告としては.、ヒト R_ s p o n d n 2及び R— s p o n d i n

3が造血幹/前駆細胞の増幅や生存を支持する活性促進作用を持つことについて記した特許文献 1及び 2が挙げられる。しカゝし、これらの特許文献は、 R_s p o n d i n 2又は 3を強制発現したストローマ細胞上で共培養した造血幹前駆細胞の解析を実施したものであり、抗癌剤投与等による骨髄抑制状態に起因する血球減少症に対する R— s p o n d i n 2又は 3の作用について記載しておらず、まだ示唆するものでもない。また、ヒト R— s p o n d i n 2、 R_ s p o n d i n 3及び R— s p o n d i n 4が R— S p o n d i n lと同様に腸管上皮細胞の増殖活性を有すること（非特許文献 1 0)、さらには R— s p o n d i n 2及び R- s p o n d i n 4は同作用により、消化管障害に対する治療薬として有効であることが開示されている（特許文献 3)。また、つい最近、 P a r maち（非特許文献 1 1) は、 R— S p o n d i n lは発生期における性別の決定に重要な機能を有することを示した。すなわち、 Y—染色体を持たない染色体の構造としては女性（XX) において、 R— s p o n d i n 1遺伝子に 1塩基の挿入が起こることにより、女性生殖器官ではなく男性生殖器官が発達している家系が存在すること（完全 XX—男性性転換）が報告された。また、 B l a y d o nら（非特許文献 1 2) は、先天性無爪症の原因遺伝子が R— s p o n d i n 4であることを報告した。しかしながら、 R— s p o n d i n 2及び 3の他の生体内機能については解明されておらず、その有用性についても依然として不明であった。

一方、放射線照射や細胞毒性を持つ化学療法剤による癌治療は、癌細胞のみならず正常細胞にも影響を及ぼす。特に、細胞分裂の活発な組織が影響を受けやすく、骨髄はその代表である。その結果、造血機能に障害のある骨髄抑制状態となり、白血球（顆粒球）、血小板、赤血球の減少が起こる。特に、顆粒球減少は感染のリスクを、血小板減少は出血のリスクを高め、これらの合併症が発症した場合には、患者に苦痛を与えるばかりか生命の危険に曝すことにもなり、癌治療の継続にも影響することとなる。したがって、これらの血球減少に対しては慎重かつ迅速な治療が求められる。現在、顆粒球（好中球）減少を早期に回復させる薬剤として、顆粒球コロニー刺激因子（G— C S F) が開発され、癌化学療法による好中球減少症を速やかに回復させ、感染の危険を減らし、効率的な癌化学療法を可能にしている。しかしながら、血小板減少症に対する有効な回復促進薬は開発されておらず、血小板輸血に頼っているのが現状である。血小板輸血は、ドナー確保、ウィルス感染、医療費増大等の問題があり、それに代わる有効な治療法が強く求められている。

また、造血幹細胞（骨髄）移植法は、放射線照射、化学療法等により造血機能が低下した患者に自家あるいはドナーより採取した健康な造血幹細胞（骨髄）を移植する医療処置であり、白血病、再生不良性貧血、リンパ腫、多発性骨髄腫、免疫不全症、その他の固形癌（乳癌や卵巣癌など）の治療に用いられている。近年、造血幹細胞の供与源として臍帯血が注目され、広く臨床適応されてぎたが、臍帯血移植は、骨髄移植や末梢血幹細胞移植と比較し、血小板の生着が遅いという欠点があり、臍帯血移植時の血小板の早期生着を可能とする薬剤の治療法に関しても強く望まれている。

すなわち、以上のような血球減少を伴う疾病に対して予防的又は治療的に効果のある新規な因子又は手法を同定することが求められている。

(特許文献 1) WOO 3Z9 1 280号パンフレット

(特許文献 2) WO 0 1/77 1 69号パンフレツト

(特許文献 3) US 06 0 1 60738A

(非特許文献 1 ) Chenら、 Mol. Biol. Rep. , vol. 29： 287-292， 2002 (非特許文献 2) Kamataら、 Biochem. Biophys. Acta, vol. 1676： 51-62, 2004 (非特許文献 3) Adamsら、 Dev. Dyn. , 218： 280-299， 2000

(非特許文献 4) Tessier - Lavigneら、 Science 274: 1123-1133, 1996 (非特許文献 5) Kazanskayaら、 Dev. Cell, vol. 7： 525-534, 2004

(非特許文献 6)加藤茂明編集、わかる実験医学シリーズ、「受容体がわかる」、羊土社、 2003年

(非特許文献 7) Moonら、 Nat. Rev. Genet. 5： 691-701， 2004

(非特許文献 8) Kimら、 Science, 309： 1256-1259， 2005

(非特許文献 9) Radtkeら、 Science, 307： 1904-1909， 2005

(非特許文献 1 0) Kimら、. Cell Cycle 5： 23 - 26, 2006

(非特許文献 1 1 ) Parmaら、 ature Genetics 38： 1304-1309， 2006

(非特許文献 1 2) Blaydonら、 Nature Genetics 38 ： 1245-1247, 2006 発明の開示

本発明は、血球回復促進に有用な手段及び方法を提供することを目的とする。また本発明は、血球減少に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための手段及び方法を提供することを目的とする。

本発明者は哺乳動物において機能が不明であった R— s p o n d i n 2及び 3 遺伝子産物の生理的作用について鋭意研究を行った結果.、 R_ s p o n d i n 2 及び 3が血球回復促進活性を持つことを見出した。この血球回復促進活性は、既に報告されている R— s p o n d i nファミリ一遺伝子産物の腸管上皮増殖活性 (特許文献 5) の活性から推測することは困難であることを考慮すると、この結果は予想外であった。本発明者はこのような知見に基づいて、 R_ s p o n d i n 2又は 3を用いて血球回復を促進し、さらには血球減少関連疾患の治療又は予防を行うことができると考え、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の [1] 〜 [8] である。

[1] 以下の（a) 〜（d) の少なくとも 1つを含むことを特徴とする血球回復促進剤。

(a) R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質、

(b) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコ一ドする核酸、

(c) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸を含む発現べクター、

(d) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸又は該核酸を含む発現べクターで形質転換された細胞

上記 R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質は、ヒト又はマウス由来であることが好ましい。

また R— s p o n d i n 2タンパク質としては、 F L型 R— s p o n d i n 2、又は d C型 R— s p o n d i n 2を用いることができる。具体的には、限定されるものではないが、 R— s p o n d i n 2タンパク質が、 1じ型1 — 5 0 11 ₍1 i n 2のアミノ酸配列に相当する配列番号 56における 22〜206番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有するものを用いることができる。また、 R— s p o n d i n 2タンパク質をコードする核酸としては、限定されるものではないが、 <1〇型1 — 3 o n d i n 2をコードする配列番号 55における 64〜6 2 1番の塩基からなる塩基配列を有する、又は該塩基配列に相補的な配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジヱン小な条件下でハイブリダィズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパグ質をコードするものを用いることができる。

また R_ s p o n d i n 3タンパク質としては、 F L型 R— s p o n d i n 3 を用いることができる。具体的には、限定されるものではないが、 R— s p o n d i n 3タンパク質が、 F L型 R— s p o n d i n 3のアミノ酸配列に相当する配列番号 76における 22〜2 72番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有するものを用いることができる。また、 R— s p o n d i n 3タンパク質をコードする核酸としては、限定されるものではないが、 F L型 R— s p o n d i n 3をコードする配列番号 75における 64〜8 1 9番の塩基からなる塩基配列を有する、又は該塩基配列に相補的な配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードするものを用いることができる。

上記血球回復促進剤において、血球は、白血球、血小板及び赤血球から選択される少なくとも 1つである。

上記血球回復促進剤は、例えば医薬品又は食品において使用されるものである。

[ 2 ] 上記いずれかの血球回復促進剤を被験体又は被験細胞に投与することを含む、血球の回復促進方法。

上記被験体としては、限定されるものではないが、血球減少状態に陥っている被験体（例えば血球減少症を発症している被験体）、放射線療法又は化学療法を受けた、受けている又は受ける予定である被験体などが含まれる。また、被験体又は被験細胞は、ヒト又はヒト由来細胞であることが好ましい。

[3] 以下の（a) 〜（d) の少なくとも 1つ、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする血球減少関連疾患又は障害の治療剤又は予防剤。

(a) R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質、

(b) R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸、

(c) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸を含む発現べクター、

(d) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞

また R— s p o n d i n 2タンパク質としては、 F L型 R— s p o n d i n 2 又は d C型 R— s.p o n d i n 2を用いることができる。具体的には、限定されるものではないが、 R— s p o n d i n 2タンパク質が、 1〇型1 — 3 0 11 (1 i n 2のアミノ酸配列に相当する配列番号 56における 22〜206番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は該ァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有するものを用いることができる。また、 R— s p o n d i n 2タンパク質をコードする核酸としては、限定されるものではないが、（1じ型1 — 3 o n d i n 2をコードする配列番号 55における 64〜 62 1番の塩基からなる塩基配列を有する、又は該塩基配列に相補的な配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードするものを用いることができる。

また R_ s p o n d i n 3タンパク質としては、 F L型 R_ s p o n d i n 3 を用いることができる。具体的には、限定されるものではないが、 R_ s p o n d i n 3タンパク質が、 F L型 R— s p o n d i n 3のァミノ酸配列に相当する配列番号 76における 22〜272番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は醇アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有するものを用いることができる。また、 R_ s p o n d i n 3タンパク質をコードする核酸としては、限定されるものではないが、 F L型 R— s p o n d i n 3をコードする配列黉号 75における 64〜8 1 9番の塩基からなる塩基配列を有する、又は該塩基配列に相補的な配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードするものを用いることができる。

上記治療剤又は予防剤において、血球としては、限定されるものではないが、白血球、血小板、赤血球からなる群より選択される少なくとも 1つが含まれる。また、血球減少関連疾患又は障害は、血球に関連する疾患又は障害であれば特に限定されるものではないが、例えば、顆粒球減少症、血小板減少症、赤血球減少症（貧血）などが挙げられる。かかる血.球減少関連疾患又は障害は、化学療法及びノ又は放射線療法によって引き起こされるものであってもよい。

[4] 上記いずれかの治療剤又は予防剤の有効量を、血球減少関連疾患若しくは障害に罹患した又は血球減少関連疾患若しくは障害に罹患するリスクのある被験体に投与することを含む、血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防方法。

上記治療又は予防方法において、治療又は予防対象となる血球減少症は、血球の減少に関連する疾患又は障害であれば特に限定されるものではないが、例えば、顆粒球減少症、血小板減少症、赤血球減少症（貧血）などが挙げられる。かかる血球減少関連疾患又は障害は、化学療法及び又は放射線療法によって引き起こされるものであってもよい。

また、治療又は予防対象となる被験体は、特に限定されるものではないが、ヒトであることが好ましい。

[5] 以下の（a) 〜（c) のいずれかの工程：

(a) R - s p o n d i n 2又は 3タンパク質に対する抗体と被験組織又は細胞とを接触させ、該抗体と該被験組織又は細胞との反応を測定する工程、

(b) R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全体又は一部からなるプローブを、被験組織又は細胞に由来する DNA又は mRNAと接触させ、該プローブと該 D N A又は m R N Aとの反応を測定する工程、

( c ) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、被験組織又は細胞に由来する DN A又は mRN Aを铸型とした増幅反応を行い、増幅産物を分析する工程、

を含む、組織又は細胞の血球回復促進活性の評価方法。

上記方法において、（a) の工程は、例えば免疫組織化学解析、ウェスタンプロット解析又は酵素結合性免疫吸着アツセィ（EL I SA) により行うことができる。

[6] ヒト R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質を B細胞において発現し、かつ血球減少（例えば化学療法剤投与後の骨髄抑制に伴う血球減少）の低減又は回復を促進する表現型を示すことを特徴とするヒト R— s p o n d i n 2又は 3ノックインマウス。

[7] ヒト R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質の分泌シグナル配列をマウス免疫グロブリン（ I g) κ遺伝子の分泌シグナル配列と置換されている改変型ヒト R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸をマウス E S細胞に導入するステップ、該マウス E S細胞をマウス宿主胚に注入するステップ、得られた胚を発育させるステップを含む、血球減少の低減又は回復を促進する表現型を示すヒト R— s p o n d i n 2又は 3ノックインマウスの作製方法。

上記方法において、使用するマウス宿主胚は機能的な B細胞及び抗体産生能を欠損するマウス系統に由来することが好ましい。

[8] 血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防のための薬物候補をスクリー二ングする方法であって、

(a) ヒト R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質を B細胞において発現し、かっ該タンパク質を発現しないマウスと比較して血球細胞の回復能が亢進されているトランスジヱニックマウスに対して被験化合物を投与するステップ、及び b) 血球細胞の回復能に対する上記被験化合物の効果を測定するステップを含み、血球細胞の回復能の亢進は、上記被験化合物が血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防のための薬物候補となることを示す、上記方法。本発明により、血球の回復を促進するための組成物及び方法が提供される。かかる血球回復促進剤及び血球回復促進方法は、被験体又は被験細胞に悪影響を及ぼすことなく効率的に血球回復を促進することができる。従って、血球減少に関連する様々な疾患又は障害を、副作用を引き起こすことなく、治療又は予防することが可能となる。図面の簡単な説明

図 1は、 pPSs hR2dC HVベクターの構造を示す。

図 2は、 pPSs hR2dC HV ベクタ一を導入したミエ口一マ細胞培養上清のウェスタンブロット解析結果を示す写真である。

図 3 は、マウス RS エレメントターゲティング用ベクター pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3 ' K0- 5' K0の構造を示す。

図 4 (A) はマウス RSエレメン卜の代わりにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたアレル構造及びサザン解析用プローブの位置を示し、図 4 ( B ) は予想されるサザン解析の結果を示す。

図 5は、 pUS hR2dC KI ベクターの構造を示す。

図 6は、 dC型ヒト R - spondin2ノックインキメラマウス回腸由来 mRNAを用いた RT - PCRの結果を示す写真である。

図 7は、 dC型ヒト R- spondin2ノックインキメラマウスにおける 5-FU投与後の血球算定値測定結果を示すグラフである（図 7 A :白血球数、図 7 B：赤血球数、図 7 C ：血小板数）。

図 8は、 dC型ヒト R-spondin2組換え体精製品の SDS-PAGE分析（CBB染色）の結果を示す写真である。

図 9は、 dC型ヒト R- spondin2組換え体精製品の血球回復促進活性評価の結果を示すグラフである（図 9 A :白血球数、図 9 B：赤血球数、図 9 C：血小板数）。図 1 0は、 pPSs hR3FL HV ベクタ一の構造を示す。

図 1 1は、 pPSs hR3FL HV ベクターを導入したミエローマ細胞培養上清のゥェスタンプロット解析結果を示す写真である。

図 1 2は、 pUS hR3FL KIベクターの構造を示す。

図 1 3は、 FL型 R- spondin3 ノックインキメラマウス回腸由来 mRNA を用いた RT-PCRの結果を示す写真である。

図 1 4は、 FL型ヒト R-spondin3ノックインキメラマウスにおける 5- FU投与後の血球算定値測定結果を示すグラフである（図 1 4 A ：白血球数、図 1 4 B ：赤血球数、図 1 4 C ：血小板数）。本願は、 2006年 12月 21 日に出願された日本国特許出願 2006-344500号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。 1. 血球の回復促進

本発明に係る血球回復促進剤及び血球の回復促進方法は、 R— s p ₀ n d i n 2及び 3 (以下、総称して「R— s p o n d i n」ともいう）が血球回復促進活性を有することに基づいている。本発明において、「血球の回復促進」とは、被験体又は被験組織における血球減少の回復が促進されること、すなわち血球減少の低減又は消失の回復が促進されることを意味する。血球としては、限定されるものではないが、白血球、血小板、赤血球が含まれる。

従って、本発明においては、血球の回復促進のために R_ s p o n d i n 2又は 3の存在量又は活性を増大することを目的とする。具体的には、本発明に係る血球回復促進剤及び血球の回復促進方法においては、以下の（a) 〜（d) の少なくとも 1つを用いる：

(a) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質、

(b) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸、

(d) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞。

R— s p o n d i n 2、及び 3は公知であり、ヒト、マウス、アフリカッメガエルなどから単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、 R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質又はこれをコードする核酸は、特に限定されるものではないが、ヒト又はマウス由来であることが好ましい。ヒト又はマウス由来の R— s p o n d i n 2又は 3の配列情報は、例えばヒト R_ s p o n d i n 2はァクセッション番号 B C 036 554、 BC 027938、 NM— 1 7 8 56 5等として、マウス R— s p o n d i n 2はァクセッション番号 NM— 1 728 1 5等として、ヒト R— s p o n d i n 3はァクセッション番号 NM— 0 32784、 BC 02236 7等として、マウス R_ s p o n d i n 3はァクセッション番号 B C 1 03 794等として、 G e n B a n kに登録されている。また R— s p o n d i n 2タンパク質としては、 F L型 R— s p o n d i n 2、 d C型 R— s p o n d i n 2、 d T C型 R— s p o n d i n 2、 dT型 R— s p o n d i n 2が挙げられる。 d C型 R— s p o n d i n 2は、配列番号 56における 22〜206番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する 1 85アミノ酸からなり、 C末端の電荷に富むアミノ酸が多い領域を欠損するものであり、配列番号 55における 64〜62 1番の塩基からなる塩基配列によりコードされる（G e nB a n kァクセッション番号 NM— 1 7856 5 (全長 244アミノ酸）におけるアミノ酸 22〜206番に相当する）。なお、配列番号 56における 1〜2

1番のアミノ酸は、置換されたシグナル配列である。？型尺一 3 0 11 ₍1 1 11

2は、 G e n B a n kァクセッション番号 B C 036 554、BC 027938、

NM— 1 7856 5等に登録されている配列を有する。 d T型 R— s p o n d i n 2は、配列番号 56に示されるアミノ酸配列から例えば 143番目のグルタミン酸から 205番目のダリシンが欠失した 1 80アミノ酸からなる、トロンボスポンジンタイプ 1 リピートを欠損する変異体である。 d T型 R_ s p o n d i n

2をコードする c DNAは例えば、ト口ンボスポンジンタイプ 1 リピートをコ一ドする塩基配列を含むェクソンを欠失した、天然に存在するスプライスバリアントとしてもクローニングし得る。

また R— s p o n d i n 3タンパク質としては、 F L型 R— s p o n d i n 3、 d C型 R— s p o n d i n 3、 d T C型 R _ s p o n d i n 3、 dT型 R— s p o n d i n 3が挙げられる。 F L型 R_ s p o n d i n 3は、配列番号 76における 22〜272番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する 25 1アミノ酸からなる全長ヒト R— s p o n d i n 3であり、配列番号 75における 64〜 8 1

9番の塩基からなる塩基配列によりコードされる（G e nB a n kァクセッション番号 NM— 03 2784におけるアミノ酸 22〜272番に相当する）。なお、配列番号 76における 1〜 21番のァミノ酸は、置換されたシグナル配列である。また、 d TC型 R— s p o n d i n 3は、例えば配列番号 76に示されたァミノ酸配列のうち 14 1番目のグルタミン酸以降のアミノ酸を欠失するフューリン様ドメインのみを含むタンパク質である（K a z a n s k a y aら、非特許文献 5)。

(1〇型1 ー 3 p o n d i n 3は、例えば配列番号 76に示されたアミノ酸配列のうちフューリン様ドメイン及びト.ロンボスボンジンタイプ 1 リピートを含み、 C 末端領域の電荷に富むアミノ酸が多い領域のみを欠損するタンパグ質である。 d T型 R— s p o n d i n 3は、配列番号 76に示されるアミノ酸配列から例えば 1 46番目のバリンから 2 1 1番目のアルギニンが欠失した 206アミノ酸からなる、トロンボスボンジンタイプ 1 リピートを欠損する変異体である。（1丁型1 — s p o n d i n 3をコードする c DN Aは例えば、ト口ンボスポンジンタイプ 1 リピートをコードする塩基配列を含むェクソンを欠失した、天然に存在するスプライスバリアントとしてもクローニングし得る。

本発明においては、 R_ s p o n d i n 2及び 3タンパク質であれば、その変異型（例えばスプライスバリアントなど）も用いることができ、特に限定されるものではない。また、目的の機能、すなわち血球回復促進活性を示す限り、公開されている R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質のアミノ酸配列において、複数個、好ましくは 1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよレ、。例えば、ヒト R— s p o n d i n 2又は 3として、配列番号 56若しくは 76に示されるアミノ酸配列、又は配列番号 56における 22〜20.6番のアミノ酸若しくは配列番号 76における 22〜272番のアミノ酸からなるアミノ酸配列の 1〜1 0個、好ましくは 1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、該ァミノ酸配列に 1〜 1 0個、好ましくは 1〜 5個のァミノ酸が付加してもよく、あるいは、該アミノ酸配列の：!〜 1 0個、好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が他のァミノ酸に置換したものも、本発明において用いることができる。 Ch e.nら（非特許文献 1) 及び Kama t aら（非特許文献 2) が示した通り、 R— s p o n d i nタンパク質は 2つのシスティンに富むフューリン様ドメイン、及び 1つのトロンボスボンジンタイプ 1 リピートを含むことを構造的特徴とする。さらに R - s P o n d i nタンパク質の特徴としては、 C末端領域が、塩基性アミノ酸に富んでいることがあげられる。これまでの文献によれば、 11— 3 0 11 ₍1 1 ₁1タンパク質が含むドメインの中では、 2つのフユ一リン様ドメインが腸管上皮増殖促進活性に最も重要なものであると推測されている。

Ka z a n s k a y aら（前記）は、 2つのフューリン様ドメインのみを持つァフリカツメガエル R— s p o n d i n 2の変異体が] 3カテニンシグナルを活性化能を維持していることを報告している。また W02005/0 724 1 9号には、上記同様にフューリン様ドメインのみを持つ d TC型ヒト R— s p o n d i n 1変異体も ]3カテニンシグナルを活性化能を維持していることを報告されている。 WO 2005/0724 1 9号にはさらに、前記ヒト R— s p o n d i n l 変異体を発現するノックインキメラマウスにおいて腸管上皮の過増殖が観察され、該変異体に腸管上皮増殖促進活性があることが記載されている。さらに本明細書においては、 R— s p o n d i n 2又は 3を発現するノックインキメラマウスにおいて抗癌剤投与後の血球減少状態からの血球の回復促進が観察された。よってトロンボスボンジンタイプ 1 リピート領域、及び/又は C末端の塩基性アミノ酸に富む領域のアミノ酸残基が別のアミノ酸に置換されている、又は欠失しているアミノ酸配列を有する R— s p o n d i nタンパク質も同様に用いることができる。

また例えば、 R_ s p o n d i nのアミノ酸配列に対し、少なくとも 70%、好ましくは 80 %、特に好ましくは 90 %の配列相同性又は同一性を示すァミノ酸配列を含むタンパク質もまた、血球回復促進活性を有すると考えられるため、本発明において用いることができる。なお、アミノ酸配列の相同性又は同一性は、当技術分野で公知の方法により、例えば配列比較ソフトを用いて容易に求めることができる。

ここで、血球回復促進活性は、例えば、精製された組換え R— s p o n d 1 n タンパク質の投与、 R— s p o n d i nタンパク質をコードする c DNAが動物個体で機能的な発現ュニッ卜に挿入されているプラスミドベクター又はウィルスベクターの投与、さらには K a k i t a n i ら（Nucleic Acids Res. 33： e85, 2005) が報告した方法を含む、既知の方法により作製された該 c DNAを発現する動物を用いて確認することができる。具体的には、例えば、 R_ s p o n d i n 2又は 3を発現するマウスに化学療法剤を投与し、その投与前後の血球数を測定することによって（後述の実施例 25及び 43参照）、あるいはマウスに化学療法剤を投与し、その投与前又は後に R— s p o n d i n 2又は 3を投与して、マウスの血球数の変化をモニターすることによって（後述の実施例 30参照）、血球回復促進活性を確認することができる。

上記の R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質は、マウス又はヒト細胞などから単離 ·精製して入手してもよいし、あるいはそれぞれ対応する R_ s p o n d i n 2又は 3をコードする核酸を用いて宿主を形質転換し、該宿主において発現されるタンパク質を回収することにより生成することができる。

R— s p o n d i n 2又は 3をコードする核酸は、精巣、胃、肺、大腸、小腸、前立腺、卵巣、脖臓、子宮、腎臓、皮膚などの組織又は細胞より抽出した RN A から精製した mRNAを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT— PCR) 又は c DNAライブラリーからのスクリーユングにより得ることができる。

組織又は細胞からの mRN Aの抽出及び c DNAライブラリ一の作製は常法に従って行うことができる。例えば、上記供給源から、グァニジゥムチオシァネート一トリフルォロ酢酸セシウム法などにより全 RN Aを抽出した後、オリゴ d T —セルロースやポリ U—セファロース等を用いたァフィ二ティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（A) +RNA (mRNA) を得ることができる。このようにして得られた mRN Aを鏵型として、オリゴ d Tプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖 c DN Aを合成した後、該一本鎖 c 01^ からニ本鎖。 DNAを合成する。次に、得られた二本鎖 c DNAを適当なクローニングベクタ一に組み込んで発現ベクターを作製する。そしてこの発現ベクターを用いて大腸菌、ファージ等を形質転換し、形質転換体を選択することにより、 c DNAのラィブラリーを得ることができる。

上記のようにして得られる形質転換体から目的の DNAを有する株を選択するには、例えば、 R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を行い、得られた断片をプローブとして、 c DNAライブラリーからスクリーニングする方法.を採用することができる。具体的には、例えば d C 型ヒト R— s p o n d i n 2をクローニングするためのプライマーとしては、配列番号 9及び 1 0に示される塩基配列を有するプライマーセットが挙げられる。また、 F L型ヒト R— s p o n d i n 3をクローニングするためのプライマーとしては、配列番号 73及び 74に示される塩基配列を有するプライマーセットが挙げられる。

このようにして得られた DNA増幅断片を、標識してプローブとし、これを形質転換体の DN Aを固定した二トロセルロースフィルターとハイプリダイズさせ、得られた陽性クローンを検索することによりスクリーニングすることができる。次に、得られたクローンから全長の c DNAをクローニングする。 c DNAのクローニングには、例えば R AC E法が用いられる。

また、 R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質を発現する細胞又は組織から調製した DN Aを铸型として、 R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計したプライマーセットを用いて核酸増幅反応 (例えば P C Rなど）を行うことにより、所望の核酸を得ることができる。

得られた c DNAが目的の配列を含む核酸であるか否かは、塩基配列を決定することにより確認することができる。塩基配列の決定は、通常は自動塩基配列決定装置（例えば Applied Biosystems社製 ABI Prism 310 Genetic Analyzer等）を用いて行われる。

また、部位特異的突然変異誘発法等によって R— s p o n d i n 2又は 3の機能（血球回復促進活性）を保持するが、変異を有するタンパク質をコードする核酸を合成することもできる。例えば、限定されるものではないが、配列番号 5 6 若しくは 7 6に示ざれるアミノ酸配列、又は配列番号 5 6における 2 2〜2 0 6 番のアミノ酸若しくは配列番号 7 6における 2 2〜2 7 2番のアミノ酸からなるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードする核酸を用いることができる。なお、核酸に変異を導入するには公知の任意の手法を採用することができる。変異した核酸により作製される組換えタンパク質が目的の血球回復促進活性を有するか否かは、上述と同様、例えば、精製された組換え R— s p o n d i nタンパク質の投与、 R— s p o n d i nタンパク質をコ一ドする c DNAが動物個体で機能的な発現ユニットに揷入されているプラスミドベクター又はウィルスベクターの投与、さらには K a k i t a n i ら（Nucleic Acids Res. 33： e85， 2005) が報告した方法を含む、既知の方法により作製された該 c DNAを発現するトランスジエニックマウスを用いて確認することができる。.

さらに、本発明においては、公開されている塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、血球回復促進活性を有するタンパク質をコードする核酸も用いることができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が 70% 以上、好ましくは 80%以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダィズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が 0. 3〜1. 5 M、好ましくは 0. 7〜0. 9Mであり、温度が 50〜80°C、好ましくは 68°Cでの条件をいまた本発明において「核酸」とは、 DNA又は RNAのいずれであってもよいし、 DNA及び RNAのハイブリッド核酸であってもよい。

本発明において、 R_ s p o n d i nを発現させるための発現ベクターは、上記核酸を適当なベクターに連結することにより得ることができる。また本発明において用いる形質転換体は、上記核酸又は発現ベクターを、目的の R_ s p o n d i nが発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウィルスに基づくベクター、人工染色体などの公知のべクタ一であれば任意のものを用いることができる。プラスミド DNAとしては、細菌由来のプラスミド（例えば p B 1 u e s c r i p t系等）、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージミド DN Aとしてはえファージ

(λ g t 1 0 λ ΖΑΡ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス、アデノウィルス及びワクシニアウィルスなどの動物ウィルスベクター、バキュ口ウィルスなどの昆虫ウィルスベクター、細菌人工染色体（BAC)、酵母人工染色体（YA

C)、ヒト人工染色体（H AC)などを用いて形質転換体を作製することができる。ベクターに目的の核酸を挿入するには、まず、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに揷入してベクターに連結する方法などが採用される。

ベクターが宿主細胞において自律複製されて、又はベクター上の目的の核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主細胞において R— s p o n d i nタンパク質が発現されるようにベクターを構築する必要がある。そこで、ベクターには、プロモーター、核酸のほか、所望によりェンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（S D配列）、相同配列などを連結することが好ましい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

また、組織特異的発現や時期特異的発現を達成することができるように、プロモーターやシグナル配列を選択してもよい。例えば、 B細胞において特異的に発現させるために、 B細胞特異的プロモーター（マウス免疫グロプリン（ I g ) κ 鎖の P Sプロモーターなど）を使用したり、又は B細胞において発現する免疫グロブリン（ I g) のシグナル配列を使用することができる。

発現ベクターを被験体に投与する場合、又は発現ベクターで形質転換した細胞を被験体に投与する場合には、被験体の種類、投与方法などに応じて適切なターゲティングベクターを構築す必要がある。本発明においては、被験体における R- s p o n d i nの発現を増大させるため、 R— s p o n d i nをコードする核酸を被験体（宿主）において機能可能なプロモーターと連結させ、これをウイルスベクターなどのベクターに組み^むことにより、ターゲティングベクターを構築することができる。哺乳動物被験体において機能可能なプロモーターとしては、例えば、マウス免疫グロブリン（ I g) κ鎖の P Sプロモーター、 P 2プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（R S V) プロモーター、サイトメガロウィルス

(CMV) プロモーター、シミアンウィルス（S V 4 0) の初期又は後期プロモ一ター、マウス乳頭腫ウィルス（MMTV) プロモーター、 CAGプロモーター等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、使用し得るベクターには、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ゥイノレスベクター、へノレぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベクター、レトロウィルスベクター、ヒト人工染色体ベクター（Kakeda ら、 Gene Ther. , 12：

852 - 856， 2005) などのベクター系が含まれるが、これらに限定されるものではなレヽ。

上記の各種配列とベクター DNAとを連結させるには、公知の DNAリガーゼを用いる。そして、上記各種配列とベクター DNAとをアニーリングさせた後に連結させ、発現べクタ一を作製する。

形質転換に使用する宿主としては、導入される核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、酵母、動物細胞（NC I H 2 9 2細胞、 COS細胞、 CHO細胞等）、昆虫細胞、ミエローマ細胞が挙げられる。また、形質転換体をそのまま被験体に投与する場合（e x V i V o法）には、投与対象の生物種と同じ種に由来する細胞（例えばヒト、マウスなどに由来する細胞）を形質転換することが好ましい。特に、投与対象の被験体から細胞（例えば B細胞）を単離し、その自己由来の細胞を形質転換した後、当該細胞を用いることが好ましい。

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス 'セレピシェ（Saccharomyces cerevisiae) > シゾサッカロ；セス · ポンへ (Schizosaccharomyces pombe) どが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母へのポリヌクレオチド又は発現ベクターの導入方法は、酵母に DN Aを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

動物細胞を宿主とする場合は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）等が用いられる。プロモーターとしては、 S V4 0プロモーター、 LTRプロモ一ター、 CMVプロモーター等が用いられる。動物細胞へのポリヌクレオチド又は発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リボフヱクション法等が挙げられる。

昆虫細胞を宿主とする場合は、 S f 9細胞などが用いられる。昆虫細胞へのポリヌクレオチド又は発現ベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法などが挙げられる。

形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、 G 4 1 8薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。

本発明において、 R— s p o n d i nタンパク質は、該タンパク質をコードする核酸が導入された前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞又は細胞破砕物のいず '· れをも意味するものである。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約 20〜 40 °Cで約 1〜 24時間行う。培養期間中、 p Hは中性付近に保持する。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている RPMI 1 640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、 5容積％C0₂存在下、約 3 7°Cで約 1〜 7日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

培養後、 R— s p ό n d i nタンパク質が細胞内に生産される場合には、細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、 R_ s p o n d i nタンパク質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニゥム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から R— s p o n d i nタンパク質を単離精製することがきる。

R- s p o n d i nタンパク質が得られたか否かは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は硫酸ドデシルナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SD S— PAGE) 等により確認することができる。

上述のように得られる、 R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質； R- s p o n d i n 2、若しくは 3タンパク質をコードする核酸； R_ s p o n d i n

2若しくは 3タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター；あるいは、 R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質をコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞は、いずれも血球回復促進活性を示すため、本発明に係る血球回復促進剤及び血球の回復促進方法にぉレ、て用いることができる。本発明に係る血球回復促進剤は、有効成分として、 1種の R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質又はそれをコードする核酸などを含有するものであってもよいし、あるいは 2種以上の R _ s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質又はそれをコードする核酸などを組み合わせて含有するものであってもよい。

本血球回復促進剤は、有効成分の他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、アルギン酸ナトリゥム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリェチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。

本血球回復促進剤の被験細胞への投与方法は特に限定されるものではなく、例えば、被験細胞を含む懸濁液又は培地に血球回復促進剤を添加したり、本血球回復促進剤を含有する溶液に被験細胞を浸漬したりするなど、当業者に公知の方法で投与を行うことができる。また本血球回復促進剤を被験体に投与する場合にもその投与方法は特に限定されるものではなく、経口投与、又は非経口投与、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、直腸投与若しくは経鼻投与などにより行うことができる。

本血球回復促進剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセルなど）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などのいずれの剤形であってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本血球回復促進剤を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤（特に眼軟膏剤）、クリーム剤、座剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤などの外用剤などの製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、 p H調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、常法により製造することができる。

本血球回復促進剤に配合する有効成分の量は、有効成分の種類（タンパク質、核酸など）、その用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えばタンパク質の場合には、総重量を基準として 1〜 9 9重量％、好ましくは 5〜9 0 %としうる。また、血球回復促進剤が R— s p o n d i nタンパク質をコードする核酸、発現ベクター又は形質転換体であって、投与対象が被験体である場合には、遺伝子治療の分野で用いられている種々の投与方法で被験体に R— s p o n d i nを送達することができる。このような遺伝子治療が有効であることが、例えば肝細胞増殖因子（H G F ； Dai ら、 J. Am. Soc. Nephrol. 15： 2637-2647, 2004)、エリスロポェチン（E P O ; Rivera ら、 Blood, 105 : 1424 - 1430， 2004) などについて報告されている。例えば、核酸又は発現ベクターを被験体に直接投与（ i n V i V o法）してもよいし、あるいは被験体から採取した細胞（好ましくは B細胞）に導入して、目的の R _ s p o n d i nを発現する形質転換細胞を選択してからその細胞を被験体に投与してもよい（e x V i V o法）。目的の組織又は細胞に発現ベクターを投与するために使用し得る遺伝子送達機構には、コロイド分散系、リボソーム誘導系、人工ウィルスエンベロープなどが含まれる。例えば、送達系は巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフエア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リボソーム等を利用することができる。核酸又は発現べクタ一の直接投与は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより行うことができる。また、発現ベクターの細胞導入（形質転換）は、例えば、リン酸カルシウム法、 D E A Eデキストラン法、エレクト口ポレーシヨン法、又はリポフエクション法等の一般的な遺伝子導入法を用いて行うことができる。核酸、発現ベクター又は形質転換体の使用量は、投与経路、投与回数、被験体の種類によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。

また、本血球回復促進剤の投与量及び投与間隔は、該組成物に含まれる有効成分の種類（タンパク質、核酸など）、投与対象（細胞又は被験体）、被験体の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変更することができる。本血球回復促進剤は、使用する対象（細胞又は被験体）を特に限定するものではなレ、。例えば、細胞の場合には、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、ゥマ、ヒッジ、ブタなどに由来する細胞、又は人工的に確立された細胞系統などに投与することができる。また、被験体としては、哺乳動物、例えばヒト、家畜（ゥシ、ブタなど）、愛玩動物（ィヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、サルなど）などが挙げられる。特に、血球の回復促進が望まれる被験体、例えば血球減少状態に陥っている被験体、放射線療法又は化学療法を受けた被験体、該療法を受けている被験体、該療法を受ける予定の被験体に使用することが好ましい。本血球回復促進剤は、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品又は飼料などに配合されてもよい。本血球回復促進剤が配合された食品又は飼料は、血球の減少状態を改善するための健康補助製品として有用である。本血球回復促進剤を配合する食品の形態及び種類は特に限定されるものではない。例えば、固体状食品、ゼリー状食品、液状食品、カプセル状食品など様々な形態の食品に配合することができる。

R - s p o n d i n 2又は 3を被験体又は被験細胞に投与することにより、血球の回復が促進される。また、投与量を増大しても被験体又は被験細胞に対する悪影響はほとんどなく、副作用を回避することが可能である。

2 . 血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防

本発明者らは、 R— s p o n d i h 2又は 3が血球の回復促進作用を有するという知見を得た。そして、血球の回復を促進することによって、血球減少関連疾患又は障害を治療又は予防することができる。従って、上述の R _ s p o n d i n 2又は 3の存在量又は活性を増大する手段（例えば R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質など）を有効成分として含有する組成物は、血球減少関連疾患又は障害の治療剤又は予防剤としても使用することができる。

本発明において「血球減少関連疾患又は障害」とは、血球減少に関連する疾患又は障害を意味し、特に限定されるものではないが、例えば顆粒球減少症、血小板減少症、赤血球減少症（貧血）などが含まれる。このような血球減少関連疾患又は障害は、化学療法及び又は放射線療法によって引き起こされることがある。

R- s p o n d i n 2又は 3の血球減少関連疾患又は障害に対する作用又は効果は、例えば、 5フルォロウラシル（FU) (K i mら、前記）、塩酸イリノテカン（CPT— 1 1) (Zhao ら、 Clin. Cancer Res. , 10: 2851-2859, 2004) などの化学療法剤投与、又は放射線照射 (Boothら、 Cell Prolif. , 37: 385-400, 2004) により骨髄抑制状態を惹起した動物、例えばマウスを用いて評価することができる。具体的には、例えば、化学療法剤の投与又は放射線の照射の前又は後に R— s p o n d i η 2又は 3の存在量又は活性を増大する手段（R— s p o n d i η 2又は 3タンパク質など）をマウスに投与し、該マウスの血球減少関連疾患又は障害の症状の変化をモニターすることにより、あるいは R_ s p o n d i η 2又は 3遺伝子を導入したマウスに化学療法剤を投与又は放射線を照射し、血球減少疾患又は障害の症状の変化をモニターすることにより、評価することができる。本治療剤又は予防剤により治療又は予防の対象となる疾患又は障害は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであつてもよい。

また、本治療剤又は予防剤の投与対象となる被験体は、血球減少関連疾患若しくは障害に罹患した被験体、又は血球減少関連疾患若しくは障害に罹患するリスクのある被験体であれば特に限定されるものではない。例えば、哺乳動物、例えばヒト、家畜（ゥシ、ブタなど）、愛玩動物（ィヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、サルなど）などが挙げられる。

本発明に係る治療剤又は予防剤は、前項「1. 血球の回復促進」に記載される本血球回復促進剤と同様に、有効成分として、 1種の R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質又はそれをコードする核酸などを含有するものであってもよいし、あるいは 2種以上の R_ s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質又はそれをコードする核酸などを組み合わせて含有するものであってもよい。

さらに、他の増殖因子及び又はサイトカインを組み合わせて含有してもよレ、。かかる増殖因子としては、幹細胞因子（S CF)、白血病抑制因子（L I F)、ィンターロイキン、トロンボポェチン（TPO)、血小板因子 4 (PF— 4)、血小板由来増殖因子（P D G F ) などが挙げられるが、これに限定されるものではなレ、。

本治療剤又は予防剤は、有効成分の他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。薬学的に許容される担体又は添加物の種類、本治療剤又は予防剤の投与方法及び投与剤形、投与量、投与対象（被験体）などは、前項「1 . 血球の回復促進」に記載される本血球回復促進剤と同様に、当業者であれば容易に理解することができる。

3 . R— s p o n d i nノックインマウスの作製

本発明はまた、血球減少の低減又は回復を促進する表現型を示す R— s p o n d i n 2又は 3の B細胞特異的発現ノックインキメラマウス及びその作製法を提供することを目的とする。

機能不明の分泌タンパク質の生体内機能を効率的に解析する手法として K a k i t a n i ら（Nucleic Acids Res. 33： e85， 2005) は以下（ i ) 〜（ i i i ) の工程からなる遺伝子改変マウス作製方法を報告している。（ i ) I g _Kプロモーターに連結した外来 c D N Aの発現ュニットを、相同組換えにより免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流域に揷入（ノックイン）したマウス E S細胞を作製する。（ i i ) 遺伝子改変されたマウス E S細胞を機能的な B細胞及び抗体産生能を欠損する免疫グロプリン重鎖ノックァゥトマウスの胚に注入することによりキメラ々ウス作製する。（ i i i ) 得られたキメラマウスの B細胞は、毛色のキメラ率に関わらず全て注入した遺伝子改変 E S細胞に由来するものである。ノックインされた外来 c D N Aがコードするタンパク質はノックイン（K I ) キメラマウス B細胞から分泌されるが、上記の理由によりその発現量はキメラ率に依存しない。 + 発現個体を得るために多数の遺伝子挿入個体を解析する必要があり、かつ子孫伝達が必要であった従来のトランスジヱニックマウス作製法と比較して、 B細胞特異的な発現が保証され、かつキメラマウスでの機能解析が可能なこの方法は、多数の機能未知遺伝子の機能を網羅的に解析するために有用である。

本発明における R— s p o n d i n 2又は 3ノックインキメラマウスの作製法は、 K a k i t a n i ら（前記）に報告された方法にさらに改変を加えたものである。例えば、マウス B細胞におけるより効率的な分泌発現を可能にするため、 R- s p o n d i n 2又は 3の分泌シグナル配列をマウス I g κ遺伝子の分泌シグナル配列と置換する。ヒト R_ s p o n d i nノックインキメラマウス及び外来 c DNA発現ュニットを挿入していない E S細胞を用いて作製されたコント口一ルキメラマウスについて K a k i t a n i ら（前記）の報告に記載された通り、各組織の病理解析、免疫組織化学解析、血清生化学検査、血球成分測定等を実施して、ヒト R— s p o n d i nの発現に起因する変化を特定できる。本明細書の実施例 25 (d C型 R— s p o n d i n 2) 及び実施例 43 (F L型 R— s p o n d i n 3) においては、 R— s p o n d i nノックィンキメラマウス特異的な表現型として、血球減少の低減又は消失、あるいは血球減少状態からの早期回復が観察された。すなわち、ヒト R— s p o n d i n 2又は 3を B細胞において発現するマウスは、該タンパク質を発現しないマウスと比較して、血球細胞の回復能が亢進されている。

上記 R— s p o n d i nノックィンマウスの作製においては、 R— s p o n d i n 2又は 3をマウスの B細胞において特異的に発現させるためのノックインべクタ一（核酸構築物）を使用することが好ましレ、。かかるノックインベクター（核酸構築物）は、 R— s p o _n d i n 2又は 3をコードする核酸と、 B細胞における発現を指令する転写調節配列を含む。 B細胞における発現を指令する転写調節配列としては、当業者に公知の任意の配列を用いることができるが、例えば、 B 細胞特異的プロモーター、免疫グロブリン（ I g) 遺伝子（_K鎖遺伝子）の分泌シグナル配列が含まれる。

R- s p o n d i nノックインマウスは、例えば確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲティング、羊土社、 1995) に従つて作製することができる。具体的には、 R_ s p o n d i nノックインべクタ一（核酸^ t築物）をマウス胚性幹（E S) 細胞に導入し、これを宿主胚（好ましくは B細胞欠損系統の胚）の胚胎盤胞又は 8細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞又は 8細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。仔動物における E S細胞の貢献率は、その毛色により大まかに判定することができる。ここで宿主胚として B細胞欠損系統の胚を使用した場合には、宿主胚由来の欠損する B細胞は存在せず、ノックイン E S細胞由来のもののみ存在する。また、ノックイン E S細胞由来の細胞において挿入した核酸（R— s p o n d i n 2又は 3) が発現するかどうかは、当該細胞由来の RN Aを用いた RT_ PC R法又はノーザンブロット法など、 R_ s p o n d i n 2又は 3に対する抗体を用いた酵素免疫測定法（E L I SA) 又はウェスタンプロット法などを利用して検出できる。

また本発明を利用して、 R— s p o n d i nタンパク質がマウス B細胞から分泌され得るかを評価することができる。前述した R— s p o n d i nノックインマウスにおいては、導入した外来遺伝子が B細胞において特異的に発現及び分泌される。しかし外来遺伝子がコードするタンパク質の構造や性質によっては、 B 細胞からの分泌が困難なケスも予想される。すなわちノックインマウスを作製する前に、目的とする外来遺伝子が B細胞から分泌されるかどうかを簡便に判定できるシステムを構築することが望まれていた。本発明においては、 B細胞特異的プロモーターノエンハンサ一により駆動される外来遺伝子を含む発現ベクターをマウスミエローマ細胞に一過性導入し、その培養上清中に分泌された目的タンパク質を検出する方法を利用して、目的とする R_ s p o n d i nが B細胞から分泌されるか否かを簡便に確認することができる。また、実施例 3及び 32においては、タグを付加した、 d C型ヒト R— s p o n d i n 2タンパク質及び F L 型ヒト R_ s p o n d i n 3タンパク質がそれぞれ培養上清中に検出されたことにより、該タンパク質がマウス B細胞より分泌され得ることが示された。

4. 血球回復促進活性の評価方法

R- s p o n d i n 2又は 3の存在は、血球回復促進を示すといえるため、被験組織又は細胞における R— s p o n d i n 2又は 3の量又は活性を測定することにより、該被験組織又は細胞の血球回復促進活性を評価することができる。具体的には、かかる方法は、以下の（a) 〜（c) のいずれかの工程を含む：

(a) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質に対する抗体と被験組織又は細胞とを接触させ、該抗体と該被験組織又は細胞との反応を測定する工程、 (b) R— s p o n d i n 2若しくは 3タンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全体又は一部からなるプローブを、被験組織又は細胞に由来する DNA又は mRNAと接触させ、該プローブと該 D N A又は m R N Aとの反応を測定する工程、

(c) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、被験組織又は細胞に由来する DN A又は mRN Aを铸型とした増幅反応を行い、増幅産物を分析する工程。

上記方法において、工程（a) において使用する R— s p o n d i n 2又は 3 タンパク質に対する抗体は、当技術分野で公知の方法により作製することができる任意の抗体とすることができる。例えば、ポリクローナル抗体（抗血清）又はモノクローナル抗体であってもよいし、あるいは抗体フラグメント（F a b等）、一本鎖抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体などであってもよい。抗体の作製方法は当技術分野で周知である。また（a) の工程は、例えば免疫組織化学解析、ゥェスタンプロット解析又は酵素結合性免疫吸着アツセィ（EL I SA) により行うことができる。

上記方法において、工程（b) 及び（c) は、当技術分野で公知の方法により被験組織又は細胞に由来する DNA又は mRNAを単離し、当技術分野で公知のハイブリダィゼーシヨン及び増幅反応を利用して、当業者であれば容易に実施することが可能である。

5. 血球減少関連疾患又は障害のための薬物候補スクリーニング

本発明は、血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防のための薬物候補をスクリ一ニングする方法を提供する。かかるスクリ一ユング方法は、以下のステップ：

(a) ヒト R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質を B細胞において発現し、かっ該タンパク質を発現しないマウスと比較して血球細胞の回復能が亢進されているトランスジエニックマウスに対して被験化合物を投与するステップ、及び

(b) 血球細胞の回復能に対する上記被験化合物の効果を測定するステップを含む。ここで、ステップ（b) において血球細胞の回復能の亢進が確認された場合には、上記被験化合物が血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防のための薬物候補となりうる。

被験化合物は、特に限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、炭水化物（糖など）、並びに無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリーなどを用いることができる。また、血球細胞としては、例えば白血球、赤血球又は血小板を選択し、その減少の回復能に対する被験化合物の効果を測定することができる。以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例 1〜3 0は d C型ヒト R - s p o n d i n 2に関する実験を、実施例 3 1〜4 3は F L型ヒト R— s p o n d i n 3に関する実験を説明する。

(実施例 1 ) .

pPSs hR2dC HV in vitro用ベクターの構築

( 1 ) pBluescript II SK (-)の Sail- Hindlll間に Pacl- Fsel- Nhelサイトが導入された pBS + PFNベクターの構築

pBluescript II SK (-) (米国 STRATAGENE) を制限酵素 Sail及び Hindlll (スィス Roche)で消化し、以下の合成オリゴ DNAをァニールさせて l igation kit ver. 2 (日本国タカラバイオ）を使用したライゲーシヨン反応により導入した（pBS + PFN) ₀ それを大腸菌 DH5 aに導入して得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った。

S/PFN/Hd-S： TCGACTTAATTAAGGCCGGCCCTAGCTAGCA (配列番号 1 )

S/PFN/Hd-AS： AGCTTGCTAGCTAGGGCCGGCCTTAATTAAG (配列番号 2 )

( 2 ) プロモーター及びシグナル配列を持つ小ベクター、 pPSs3. 8の構築

GenBank より取得した MUSIGKVR1 (ァクセッション番号 K02159) をもとに、その上流のゲノム配列を UCSCマウスゲノムデータベースより取得した。プロモータ一領域と、イントロンを含むシグナル配列を増幅する以下の PCRプライマーを設計した：

PsecSP FW1： CCTTAATTAAAGTTATGTGTCCTAGAGGGCTGCAAACTCAAGATC (配列番号 3、 Padサイト含む）

PsecSP RV： TTGGCCGGCCTTGGCGCCAGTGGAACCTGGAATGATAAACACAAAGATTATTG (配列番号 4、 Sfol及び Fselサイト含む）

KOD-p lus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反液を調製し、 50 W 1反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、 1. 6mM MgS0₄、铸型としてマウス ES細胞由来の DNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 15秒及び 68°C 1分を 1 サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた 0. 8Kbの増幅断片を 0. 8 %ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAqui ck Gel Extract ion Ki t (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片（PSプロモーター断片）を回収した。回収された PCR増幅断片を Fsel及び Pacl (NEB) で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲノレで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extract ion Ki t (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。

上記（1 ) の pBS + PFNベクターを Fsel及び Pacl (NEB) で消化した後、反応液をフエノール/クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収された DNA断片を挿入し（pPSs3. 8)、それを大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った。 PCRに起因する変異が無いクローンを選択した。

( 3 ) κ 5，イントロンェンハンサー領域 DNA断片の取得

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス Ig κ遺伝子近傍ゲノム DNA配列より以下の DNA (プライマー）を合成した：

5' enhancerFW Kp： GGGGTACCAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTA (配列番号 5、 Kpnlサィト付加）

5' enhancerRV Xh： CCGCTCGAGAGCTAAACCTACTGTATGGACAGGG (配列番号 6、 Xhol サイト付加）

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmo l、铸型として BAC クローン

RP23-435I4 (GenBankァクセッション番号： AC090291 ) 由来の DNAを添加し、 94°C

3分保温した後、 94°C 15秒及び 68°C40秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 0. 48kbの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Kpnl及び Xholで酵素消化し、 0.8% ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。

pBluescript II SK (-) (米国 STRATAGENE) を Kpnl及び Xholで消化し、 0.8% ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リホスファタ一ゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収された DNA断片を挿入し、それを大腸菌 DH5aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った。 PCRによる変異の無いクローンを選択し、 Kpnl及び Xholで消化じた後、 0.8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel' Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片（5' ェンハンサー断片）を回収した。

(4) κ 3' ェンハンサー領域 DNA断片の取得

3' enhancerFW Hd： CCCAAGCTTAGCTCAAACCAGCTTAGGCTACACA (配列番号 7、 Hindi II サイト付）

3' enhancerRV Bm- 2： CGGGATCCCTAGAACGTGTCTGGGCCCCATGAA (配列番号 8、 BamHI サイト付）

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、铸型として BAC クローン RP23-435I4 (GenBankァクセッション番号： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C 3分保温した後、 94°C15秒及び 68°C40秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 0.8kbの増幅断片を 0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Hindlll及び BamHIで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。 pBluescript II SK (-) (米国 STRATAGENE)を Hindlll及び BamHIで消化し、 0.8% ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リホスファタ一ゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収された DNA断片を揷入し、それを大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った。 PCRによる変異の無いクローンを選択し、 Hindlll及び BamHIで消化した後、 0.8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquickGel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片（3' ェンハンサー断片）を回収した。

( 5) κ polyA断片の取得 ' CkP2 KIベクター（W003/041495号）を EcoRI及ぴ Hindlllで酵素消化し、約

440bp の断片を 0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、 Blunting high (東洋紡）を用いて末端平滑を行い、 κ polyA 断片を取得した。

(6 ) κ 5'ェンハンサーを含むベクター、 pPSsElの構築

上記（2) の pPSs3.8ベクターを Xhol及び Kpnlで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記（3 ) で回収された/ c 5' イントロンェンハンサー断片を挿入し（_PPSsEl)、それを大腸菌 DH5ctに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の配列決定を行った。

( 7) κ 5，と / c 3' ェンハンサーを含むベクター、 pPSsE2の構築

上記（6 ) の pPSsElベクターを BamHI及び Hindlllで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記（4) で回収された/ c 3' ェンハンサー断片を揷入し（pPSsE2)、それを大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNA を調製し、連結部分の配列決定を行った。

( 8) ?5型 ¥：11：]：0用べクター、？535, 5の構築

上記（7) の pPSsE2ベクターを Hindlllで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルより分離精製した後、 Blunting high (東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。大腸菌 C75由来アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記 ( 5 ) で回収された κ polyA断片を挿入し、それを大腸菌 DH5 _aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の配列決定を行って、順方向に挿入されているクローン（_PPSs5. 5) を選択した。

( 9 ) hR2dC DNA断片（シグナル配列無し · ストップコドンなし）の作製

Rspo2 (-SP) FW： CAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTA (5，リン付き配列、配列番号 9) R2dC (-SP) tagRV： TTGGCCGGCCCCCTCC (Fselサイト含む、配列番号 10)

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpraol、铸型として W003/91280号に記載の方法により取得された FL型ヒト R- spondin2 cDNAを添加し、 94°C 3分保温した後、 98°C15秒、 63°C 15秒、 68°C1. 5分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 560bp の増幅断片を 2 %ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Fsel (NEB)で酵素消化し、 QIAquick PCR Purificat ion Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を精製した。

( 1 0 ) pPSsHVベクターの構築

TagFW： AGGCGCCAATGGCCGGCCAAAGGGCAATTCTGCAGAT (配列番号 11、 Sfolサイト含む）

TagRV： TAGGCGCCTCAATGGTGATGGTGATGATGACC (配列番号 12、 Sfolサイト含む）

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50

IX 1 反応液中に上記 2 種のプライマー各 lOpmol 、铸型として pcDNA3. l/V5-His-T0P0ベクター（インビトロジェン） 100ngを添加し、 94°C 3分保温した後、 94°C15秒、 68°C15秒を 1サイクルとして 35サイクル増幅し、得られた約 140bp の増幅断片を 2 %ゲルで分離回収した。回収されたゲルから

QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を SfoI (NEB)で酵素消化し、 QIAquick

PCR Purificat ion Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を精製し、 HVタグ断片を得た。上記（8 ) の pPSs5. 5ベクターを Sfol及び Fsel . で消化後、 Blunting high (TOYOBO) で末端を平滑化し、大腸菌由来アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに上記 HVタグ断片を挿入し、 pPSsHV ベクターを取得した。

( 1 1 ) pPSs hR2dC HV in vitro用ベクター（pPSs hR2dC HV) の構築

上記（1 0) の pPSsHVベクタ一を Sfol及び Fselで消化後、大腸菌由来アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記（9) で作製した DNA 断片を挿入した後、 DH5c に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片及び連結部分の塩基配列の確認して、 pPSs hR2dC HV in vitro用ベクターを取得した（図 1)。図 1に示されるベクター中の要素は以下の通りである：

5，ェンハンサー：マウス Ig κの 5，ェンハンサー領域

PSプロモーター：マウス IgKプロモーター領域 PS

シグナルぺプチドコード領域： PSプロモーター下流のマウス Ig/cシグナルぺプチドコ一ド領域

イントロン：マウス I_{g K}シグナルぺプチドコード領域にはさまれたィントロン領域

hR2dC (-SP) ：固有のシグナルペプチドコード領域を持たなレ、 dC 型ヒト R-spondin2遺伝ナ

HV Tag： His- V5 Tag

polyA：マウス Ig κ polyAシグナノレ領域

3' ェンハンサー：マウス IgKの 3' ェンハンサー領域

Amp：アンピシリン耐性遺伝芋。

(実施例 2)

ミエローマ細胞への pPSs hR2dC HV in vitro用ベクター導入

( 1 ) ミエローマ細胞の調製

37°C、 6.5%C0₂下で RPMI164010%FBS培地を用いて 4回から 5回継代し、 I X

10⁶細胞程度まで培養した P3-X63. Ag653細胞 (Riken Gene bank, RCB0146) を一度 PBSで洗浄したのち、無血清 RPMI1640培地で 6 X10⁵細胞/ mlに懸濁した。

, (2) ミエローマ細胞へめベクター導入 12 wel lプレートの 3 wel lに l wellあたり 200 1の OPTI MEM (GIBCO) と 3· 2 1の DIMRIE-C Reagent (米国 Invitrogen) を入れておき、さらに上記実施例 1 の（ 1 1 ) で作製した in vitro用ベクター pPSs hR2dC HV (200ng/ ^ 1) 4 1を 196 / 1の OPTI MEM で希釈したものを加え、室温で 45分インキュベートして DNA と DIMRIE-C Reagentの複合体を形成した。ここへ上記（1 ) で調製した細胞懸濁液 80 /x l を各 wel l に加え、 37°C、 6. 5%C0₂下で 4時間培養した後、 RPMI1640 、 20%FBSを 800 μ 1加えた。トランスフエクションから 48時間後の培養上清を回収した。

(実施例 3 )

培養上清中への hR2dC HV分泌確認

上記実施例 2の（ 2 ) の培養上清 8 1を SDS + 2ME存在条件下で 5分間煮沸処理後、 10〜20%グラジェント SDS- PAGEにアプライし、 40mAにて 1時間の電気泳動を行った。泳動終了後、 PVDF膜にエレクトロブロッティングした。 PVDF膜を 2 % ECL Advance Blocking Agent (Amarsham) (TTBS 中）で 1時間かけて振とうしながらブロッキング処理し、その後 TTBSで洗浄した。 Can Get Signal solution 1

(TOYOBO) で 1/20000 に希釈された抗 V5 Tag マウスピオチン化抗体（英国 Serotec)で 1時間ィンキュベートした。 TTBSでの洗浄を十分に行った後、 Can Get Signal solution 2 (TOYOBO) で 1/20000に希釈された StreptAvidin/HRP (米国 DAK0) で 1時間インキュベートした。 TTBSで 30分間メンブレンを洗浄した後、 ECL Advance solution A及び B (共に Amersham) を等量混合した検出試薬をメンブレンに添加した。メンブレンはラップに包み、イメージアナライザー LAS - 3000

(FUJIFILM) に 16分露光した結果、 V5 Tagを持つ hR2dC 由来のシグナルが検出された。得られた結果から、 hR2dC HVがミエローマ培養上清中に分泌されることが示された（図 2 )。図 2に示されるウェスタン解析において、レーン 1は pPSs HV

(陰性コントロール）を、レーン 2は pPSs hR2dC #1を、レーン 3は pPSs hR2dC

#2を、レーン 4は pPSs hR2dC #3を用いて得られた結果を示す。図中、アミノ酸配列から予測される dC型 R- spondin2分子量（約 26. 5kD) と比較して、より大きな分子量（約 3.2kD) の特異的バンドが検出されるが、これは dC型 R- spondin2が糖鎖修飾を受けたことによると考えられる。

(実施例 4 )

マウス RSエレメントターゲティング用べクタ一の構築

( 1 ) K0基本ベクター（pBlueLAB- LoxP - Neo-DT-A) の構築

W0 00/10383号パンフレツト（前記）に記載された pLoxP- STneoプラスミドを Xhol消化し、両端に LoxP配列を持つ Neo耐性遺伝子（LoxP- Neo) を取得した。 LoxP-Neoの両末端を T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、 LoxP- Neo-Βを取得した。

pBluescript I I SK (-) (日本国東洋紡）に新たな制限酵素サイトを付加するため以下の DNAを合成した：

LinkAl： TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC (配列番号 13)

LinkA2： TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC (配列番号 14)

LinkBl： GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG (配列番号 15)

LinkB2 : AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC (配列番号 16)

pBluescript I I SK (-)を制限酵素 Sai l及び Xholで処理した反応液をフエノール /クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイト Nrul、 SgrAI及び Asclを付加するため、上記 LinkAl及び LinkA2を合成した。この 2つのオリゴ DNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌 DH5 ctに導入した。得られた形質転換体より DNA を調製し、プラスミド pBlueLAを取得した。

続いて、 pBlueLAを制限酵素 Notl及ぴ EcoRIで処理した反応液をフノール/ クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイト

Pad , Fsel及び Sai lを付加するため、上記 LinkBl及ぴ LinkB2を合成した。この 2つのオリゴ DNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに揷入し、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNA を調製し、プラスミド pBlueLABを取得した。 BlueLABを EcoRV消化後、反応液をフエノール /ク口口ホルム抽出、ェタノール沈殿し、 LoxP-Neo-Bを挿入した後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、プラスミド pBlueLAB-LoxP- Neoを取得し †:。

pMClDT-A (日本国ライフテックオリエンタル株式会社）を Xhol及び Sail消化後、 0. 8%ァガロースゲルにアプライし、約 1 Kbのバンドを分離回収し、 QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって DT- Aフラグメントを回収した。

pBlueLAB-LoxP-Neoを Xhol消化後、反応液をフエノール/グ.ロロホルム抽出、エタノール沈殿し、 DT - Aフラグメントを挿入した後、大腸菌 DH5 o;に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、 K0基本ベクター pBlueLAB-LoxP- Neo - DT-A を取得した。

( 2 ) マウス RSエレメント 5 ' 上流ゲノム領域断片の取得

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス RSエレメント遺伝子近傍ゲノム DNA 配列より以下の DNA (プライマー）を合成した：

RS5 ' FW3 ： ATAAGAATGCGGCCGCAAAGCTGGTGGGTTAAGACTATCTCGTGAAGTG (配列番号 17)

RS5 ' RV3： ACGCGTCGACTCACAGGTTGGTCCCTCTCTGTGTGTGGTTGCTGT (配列番号 18)

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 10praol、铸型として BAC クローン

RP23-435I4 (GenBankァクセッション番号： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C

2分保温した後、 94°C15秒及び 68°C 5分を 1サイクルとして 33サイクル増幅し、得られた 5 kb の増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから

QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Notl及び Sailで酵素消化し、 0. 8% ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction

Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。プラスミド pBlueLABを Notl及び Sailで消化した後、反応液をフエノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収された DNA断片を挿入し、それを大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、揷入断片の配列決定を行った。 PCR に起因する変異が無いクローンを選択し、 Notl 及び Sail で消化して得られる 5 kb の断片を、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。

( 3 ) マウス RSエレメント 3 ' 下流ゲノム領域断片の取得

RS3 ' FW2 ： TTGGCGCGCCCTCCCTAGGACTGCAGTTGAGCTCAGATTTGA (配列番号 19) RS3 ' RV3 ： CCGCTCGAGTCTTACTGTCTCAGCAACAATAATATAAACAGGGG (配列番号.20) KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 IX 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、铸型として BAC クローン RP23-435I4 (GenBankァクセッション番号： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 15秒及び 68°C 2分を 1サイクルとして 33サイクル増幅し、得られた 2 kb の増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Ascl及び Xholで酵素消化し、 0. 8% ァガロースゲ /レで分離回収した。回収されたゲノレから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。プラスミド pBlueLABを Ascl及び Xholで消化した後、反応液をフエノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収された DNA断片を挿入し、それを大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った。 PCR に起因する変異が無いクローンを選択し、 Ascl 及び Xhol で消化して得られる 2 kb の断片を、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。

( 4 ) K0基本ベクターへのマウス RSエレメント 3，下流ゲノム領域断片の揷入上記（ 1 ) の pBlueLAB- LoxP_Neo-DT_Aベクターを Ascl及び Xholで消化後、得られる約 7. 6 Kbの DNA断片を 0. 8%ァガロースゲルより分離精製したものに、上記（3 ) で作製したゲノム断片を挿入した後、大腸菌 XL10- Gold Ultracorapetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認を行った。 ( 5 ) マウス RSエレメント 3，下流ゲノム領域断片を持つ K0基本べクタ一へのマウス RS領域 5 ' 上流ゲノム領域断片の挿入

上記（4 ) で得られたプラスミドを Notl及び Sailで消化後、得られる 9. 6kb の DNA断片を 0. 8%ァガロースゲルより分離精製したものに、上記（2 ) で作製したゲノム断片を挿入した後、大腸菌 XL10- Gold Ultracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認して、マウス RS エレメントターゲティング用ベクター pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3 ' K0- 5 ' K0 (図 3 ) を取得した。図 3に示されるベクタ —における各要素は以下の通りである：

5， K0：マウス RSエレメント 5，上流領域、

Neo^r： ΙοχΡ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子 .

3， K0：マウス RSエレメント 3，下流領域

DT- A：ジフテリアトキシン A鎖遺伝子

pBluescript : クローニングベクター。

(実施例 5 )

Electroporation用マウス RSエレメントターゲティングベクターの調製

上記実施例 4の（5 ) で得られた pBlueRS- LoxP - Neo- DT- A - 3' K0- 5 ' Κ0ベクタ ― 60 /z gを、スペルミジン添カ卩（ 1 mM pH7. 0米国シグマ）バッファー（日本国口シュ ·ダイァグノスティックス、制限酵素用 Hバッファー）を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、及び 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリゥムを加え、 — 20°Cで 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間風乾させた。 0. 5 ;i g/ μ Lの DNA溶液となるように HBS溶液（HEPES緩衝生理食塩水）を加え、 1時間室温で保存し、 Electroporation用マウス RSエレメントターゲティング用ベクター pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3 ' K0- 5 ' K0- Notlの調製を行なった。

(実施例 6 ) ゲノムサザン解析用プローブの調製

BACクローン RP23- 43514 (GenBankァクセッション番号： AC090291) を用いた塩基配列情報を基に、 5 ' K0の上流域 573merを含むオリゴ DNAを取得するため以下の DNAを合成した：

RS5 ' Southern FW1： CATACAAACAGATACACACATATAC (配列番号 21)

RS5 ' Southern RV2： GTCATTAATGGAAGGAAGCTCTCTA (配列番号 22)

Takara Z Taq (日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 l 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmoU 铸型としてクローン番号 RP23- 4341の BAC由来 DNAを添加し、 94°C 2分保温したのち、 94°C30秒、 60°C20 秒、及び 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、得られた 573merの増幅断片を 0. 8 %ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAqui ck Ge 1 Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 5'側ゲノムサザン用プローブ、 5' K0- probを回収した。 '

BACクローン RP23-435I4 (GenBankァクセッション番号： AC090291) を用いた塩基配列情報を基に、 3 ' K0の下流域 600merを含むオリゴ DNAを取得するため以下の DNAを合成した：

RS3 ' Southern FW1： TCTTACTAGAGTTCTCACTAGCTCT (配列番号 23)

RS3 ' Southern RV2： GGAACCAAAGAATGAGGAAGCTGTT (配列番号 24)

Takara Z Taq (日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 / L 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、铸型としてクローン番号 RP23-434Iの BAC由来 DNAを添加し、 94°C 2分保温したのち、 94°C30秒、 60°C20 秒、及び 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、得られた 600merの增幅断片を 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 3'側ゲノムサザン用プローブ、 3' K0_probを回収した。

(実施例 7 )

RSエレメント · ターグティング 'マウス ES細胞の取得

マウス ES細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウスを交配することにより得られる受精後 2. 5 日の胚を採取し、 ES細胞用培地中でインビトロ培養する。該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そしてこの胚を、フィーダ一細胞培地中に播種して培養する。該培養胚から ES様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有する ES 細胞用培地を用いて分散処理し、そしてフィーダー細胞培地を用レ、て培養し、更には ES細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。

相同組換えにより、 RSエレメント ' ターゲティング 'マウス ES細胞の取得のため、実施例 5に記載された方法で pBlueRS-LoxP- Neo- DT-A- 3 ' K0-5 ' K0ベクタ一を制限酵素 Notl (日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターグティング、羊土社、 1995) に従ってマウス ES細胞 TT2F (Yagi ら、 Analytical Biochem. , 214 : 70, 1993)へ導入した。

TT2F細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシン C (米国シグマ）処理した G418耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させた TT2F細胞をトリプシン処理し、 3 X 10⁷個 ml となるように HBSに懸濁した。その後、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 μ gのベクター DNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離： 0. 4cm、米国バイオラッド）にてエレクト口ポレーシヨンを行った（容量： 960 ju F、電圧： 240V、室温）。エレクトロポレーシヨンした細胞を 10mlの ES培地に懸濁し、あらかじめフィーダ一細胞を播種した lOOram組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国べクトン.ディッキンソン） 1枚に播種した。 24時間後に 200 /z g/ml のネオマイシン（米国シグマ）を含む ES培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10%DMS0、米国シグマ）に懸濁し、 _80。Cにて保存した。残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 10⁶〜10⁷個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation ists (米国 Gentra System社）により調製した。

これらネオマイシン耐性 TT2F細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造）で消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター 3'相同領域の下流に位置する DNA断片（3' K0- prob、実施例 6参照）をプローブとして相同組換え体を検出した。予想される結果を図 4の（B ) に示す。また、図 4の（A) は、マウス RSエレメントの代わりにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたァレル構造及びサザン解析用プローブの位置を示しており、各要素は以下の通りである：

5' ゲノム：マウス RSエレメント 5' 上流領域

3 ' ゲノム：マウス RSエレメント 3 ' 下流領域

5 ' プローブ：ターゲテイングベクターの 5 ' 側揷入確認用サザン解析プローブ

3 ' プローブ：ターゲティングベクターの 3 ' 側揷入確認用サザン解析プローブ loxP-Neo-loxP： ΙοχΡ配列をその両端に持つネオマイシン f性遺伝子。

- 実際の検出結果においては、野生型 TT2F細胞では EcoRI消化により、 1本のバンド（約 5. 7 Kb)が検出された。相同組換え体においては、 2本のバンド（約 5. 7Kb と約 7. 4Kb) が検出されることが予想されたが（図 4の（B ) )、ネオマイシン耐性株において約 7. 4Kb の新たなバンド確認された（図 4の（B ) )。更に、 3 '

ΚΟ-probによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノム DNAを制限酵素 Pstl (日本国宝酒造）で消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンプロットを行い、ターゲテイングベクター 5'相同領域の上流に位置する DNA断片（5' K0-prob、実施例 6参照）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型 TT2F細胞では Pstl消化により、 1本のバンド（約 6. 1 Kb) が検出された。相同組換え体においては、 2本のバンド（約 6. 7Kb と約 6. 1Kb) が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約 6. 7Kbの新たなバンドが確認された（図 4の（B ) )。すなわち、これらのクローンはマウス RS エレメントを含む近傍染色体領域を欠失し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子（両端にはターゲテイングベクター由来の制限酵素サイト部位を含む）が揷入されたものである。 3 ，及び 5 ， ΚΟ-prob によるサザン解析の結果、

_PBlueRS-LoxP-^rNeo-DT-A-3 ' K0- 5' K0ベクターを制限酵素 Notlで線状化した場合には 72株中 9株（12. 5%) が相同組換え体であるという結果を得た。

取得された RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞の核型解析を記載

(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターグティング、羊土社、 1995) の方法に従い実施し、取得された ES細胞に異常核型が検出されないことを確認した。

(実施例 8 )

RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞株及び Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製

免疫グロプリン /鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、機能的な B リンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426， 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用しだ。この場合、キメラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した ES細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7， 2000) に記載された免疫グロブリン μ鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日本国日本クレア社）系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。

上記実施例 7で得られたネオマイシン耐性マウス ES細胞株（#32) を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリン鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入した。 ES培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲティング、羊土社、 1995) で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のインジヱクション胚を移植した。実施例 7の #32を用いて作製されたィンジヱクシヨン胚を計 480個移植した結果、 80匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中に ES 細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判定される。誕生した 80匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち ES細胞の貢献の認められる個体は 48匹であった。なお、下記実施例 1 7、 2 3、 2 5、 3 9、 4 2及ぴ 4 3において、本実施例 8で得られたキメラマウスはコントロール個体として用いられた。 (実施例 9 )

pC cP2 KIベクターの作製

( 1 ) クローニング部位上流断片の調製

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgG/c遺伝子配列より以下の DNAを合成した：

lgkcl： atctcgaggaaccactttcctgaggacacagtgatagg (酉己タ -U¾ " 25)

igkc2： atgaattcctaacactcattcctgttgaagctcttgac (酉己タ ·ΙΙ¾· 26)

5' 側プライマーである igkclの末端には Xhol認識配列を、 3' 側プライマーである igkc2には EcoRI認識配列を付加した。 TakaRa LA- Taq (日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、 50_WL反応液中にプライマー各 lOpmol及び铸型として Ig 軽鎖 C K- J_Kを含むえクローン由来 DNA 断片を pBluescript SK II(+) '(日本国東洋紡）クローニングしたもの（W000/10383号パンフレツト） 25ng を添加し、 94°Cで 1分保温したのち、 94°C30秒及び 68°C3分を 1サイクルとして 25サイクル増幅した。得られた反応液をフエノールクロ口ホルム抽出し、エタノール沈殿した後、 EcoRI及び Xholで消化し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 piolOl) を用いて目的の断片を回収して増幅断片 Aを得た。 EcoRI及び Xholで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript2 KS-ベクター（米国ストラタジーン）に該増幅断片 Aを挿入し、それを大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミド pIgC_KAを取得した。

(2) クローニング部位下流の断片の調製

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgG κ遺伝子配列より以下の DNAを合成した：

igkc3： atgaattcagacaaaggtcctgagacgccacc (酉己列畨号 27)

igkc4： atggatcctcgagtcgactggatttcagggcaactaaacatt (sc^'i¾-"^" 28)

5' 側プライマーである igkc3の末端には EcoRI認識配列を、 3' 側プライマーである igkc4にはプライマーの 5' 側から BamHI、 Xhol, 及び Sail認識配列を付加した。 TakaRa LA-Taq (日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、

50/| 反応液中にプラィマー各10 11101及び铸型として Ig軽鎖 C K -J Kを含む; Iクローン由来 DNA断片を pBluescript SK II (+) (日本国東洋紡）クローユングしたもの（W0 00/10383号パンフレット） 25ngを添加し、 94°Cで 1分保温したのち、 94°C30秒、 55°C30秒及び 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅した。得られた反応液をフエノールノクロ口ホルム抽出し、エタノール沈殿した後、 EcoRI 及ぴ BamHIで消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて目的の断片を回収して増幅断片 Bを得た。 EcoRI及び BamHIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した plgC c Aベクターに得られた増幅断片 Bを揷入し、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミド plgC c ABを取得した。

( 3 ) ピューロマイシン耐性遺伝子の導入

Lox-P Puroプラスミド（W0 00/10383号パンフレット）を EcoRI及び Xholで消化し、 T4 DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて ΙοχΡ- ピューロマイシン耐性遺伝子を含む DNA 断片を回収した。プラスミド plgC /c AB. を Sailで消化して末端平滑化したプラスミドに、得られた ΙοχΡ-ピュー口マイシン耐性遺伝子断片を挿入し、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミド pIgC _K ABPを取得した。

( 4 ) IRES遺伝子の導入

GenBank (米国 NCBI) より取得した脳心筋炎ウィルス（encephalomyocarditis virus) 由来の IRES遺伝子配列より以下の DNAを合成した：

e丄 RESFW： atgaattcgcccctctccctccccccccccta (酉 c列 29)

esIRESRV： atgaattcgtcgacttgtggcaagcttatcatcgtgtt (酉 C歹 (J番^" 30)

5' 側プライマーである eIRESFWの末端には EcoRI認識配列を、 3 ' 側プライマ一である esIRESRVにはプライマーの 5 ' 側から EcoRI及び Sail認識配列を付加した。 TakaRa LA-Taq (日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、

50 し反応液中にプライマ一各 lOpmol及び铸型として pIREShygプラスミド（米国クロンテック） 150ngを添加し、 94°Cで 1分保温したのち、 94°C30秒、 55°C30 秒及び 72°C 1分を 1サイクルとして 25 サイクル増幅した。得られた反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動にかけて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて目的の断片を回収した。 pGEM-Tベクター（米国プロメガ）に得られた DNA断片を挿入し、大腸菌 DH5aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミド IRES- Salん pGEMを取得した。このプラスミドを EcoRIで消化し、0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて目的の断片を回収した。上記（3) のプラスミド plgCKABPを EcoRIで消化したプラスミドに、得られた IRES遺伝子を揷入し、大腸菌 DH5aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミド plgC/cABPIRESを取得した。

(5) pAC_KSalプラスミドの作製

W0 00/10383 号パンフレットに記載されている免疫グロブリン遺伝子軽鎖/ ターゲティング用ターゲティングベクタ一プラスミドを SacIIで消化した後、 EcoRI を用いて部分消化した。 0.8 %ァガロースゲル電気泳動にて LoxP-PGKPuro部分を切り出した残りの 14.6Kbの DNAを分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて回収した。得られた DNAに以下の合成 DNAを挿入することにより、 Sail認識配列を導入した：

Sallplus： agtcgaca (配列番号 31)

Sallminus： aatttgtcgactgc (目 G列番号 32)

得られたプラスミドを大腸菌 DH5aに導入し、得られた形質転換体より DNAを調製し、プラスミド pAC/c Salを取得した。

(6) pKI /cプラスミドの作製

上記（4) で得られた plgC/c ABPIRESプラスミドを Xholで消化し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて C/C-IRES- ΙοχΡ-ピュー口マイシン耐性遺伝子を含む DNA断片を回収した。上記（5) で作製されたプラスミド pAC_KSalを Sailで消化した後、大腸菌アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記 DNA断片を挿入し、それを大腸菌 DH5aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、プラスミド ρΚΙκを取得した。

(7) plgC/c AIRES断片の作製 - 上記（4) で得られた plgC/c ABPIRESプラスミドを EcoRI と Bglllで部分消化 .し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて IRES部分を削除した DNA断片（plgC κ Δ IRES断片）を回収した。

(8) P2プロモーター断片の調製

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス Ig κプロモーター領域遺伝子配列より以下の DNAを合成した：

P2F： CCCAAGCTTTGGTGATTATTCAGAGTAGTTTTAGATGAGTGCAT (配列番号 33)

P2R： ACGCGTCGACTTTGTCTTTGAACTTTGGTCCCTAGCTAATTACTA (配列番号 34) 5' 側プライマーである P2Fには Hind III認識配列を、 3' 側プライマーである P2Rには Sail認識配列を付加した。マウスゲノム DNAを铸型として、 KODplus (日本国東洋紡）により増幅された DNA断片をフエノール/クロ口ホルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。

回収された DNA断片を Hind III及び Sailで消化し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl)を用いて回収した。 Hind III及び Sailで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript II KS_ベクター（米国 Stratagene社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌 DH5aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、 Ig/cプロモーター領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドを Hind III及び Sailで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて P2プロモーター断片を回収した。

( 9) 部分長 C_KpolyA断片の作製

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgC κ polyA領域遺伝子配列より以下の DNAを合成した：

PPF： ACGCGTCGACGCGGCCGGCCGCGCTAGCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC (配列番号 35)

PPR： GAAGATCTCAAGTGCAAAGACTCACTTTATTGAATATTTTCTG (配列番号 36)

5' 側プライマーである PPFには Sall、 Fsel、及び Nhel認識配列を、 3' 側プライマーである PPRには Bglll認識配列を付加した。マウスゲノム DNAを铸型として、 KOD plus (日本国東洋紡）により増幅された DNA断片をフエノール/クロ口ホルム抽出後、ェタノール沈殿で回収した。回収された DNA断片を Sail及び Bglll で消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて回収した。 Sail及び Bglllで消化した後、大腸菌アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した PSP72ベクター（米国 Proraega 社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌 DH5 oiに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、部分長 C _K polyA領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドを Sail及び Bglllで消化した後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて部分長 C _K polyA断片を回収した。

( 1 0 ) 完全長 C _{K P}olyA断片の作製

TPF: GGAATTCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC (配列番号 37)

TPR : CCCAAGCTTGCCTCCTCAAACCTACCATGGCCCAGAGAAATAAG (配列番号 38)

5 '側プライマーである TPFには EcoRI認識配列を、 3'側プライマーである TPR には Hindlll認識配列を付加した。マウスゲノム DNAを铸型として、 KOD plus (日本国東洋紡）により増幅された DNA断片をフノール/クロロホルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収された DNA断片を EcoRI及び Hindlllで消化し、 0. 8% ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン Π (米国 BiolOl) を用いて回収した。 EcoRI及び Hindlllで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript II KS-ベクター（米国 Stratagene社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌 DH5 _αに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、完全長 C _K polyA領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドを EcoRI及び Hindlll で消化した後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて完全長 C _{K P}olyA断片を回収した。

( 1 1 ) 完全長 C /c polyA断片、 P2プロモーター断片、及び部分長 C κ polyA断片から構成される DNA断片 Aの作製

EcoRI及び Bglllで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript II KS_ベクター（米国 Stratagene社）に完全長 C /c polyA断片、 P2プロモーター断片、及び部分長 C _K polyA断片を挿入し、大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、完全長 C/cpolyA断片、 P2プロモーター断片、及び部分長 C_KpolyA断片の順番に DNA断片が揷入されていることを塩基配列のレベルで確認し、 DNA 断片 A遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドを EcoRI と Bglllで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて DNA断片 Aを回収した。

( 1 2 ) plgC κ Δ IRES ProAプラスミドの作製

大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pIgC_K AIRES 断片（上記（7) 参照）に上記（1 1 ) の DNA断片 Aを挿入し、大腸菌 DH5c に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、 DNA断片 Aが挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、 DNA断片 A遺伝子配列を含む plgC κ Δ IRES ProA プラスミドを取得した。

( 1 3 ) C K P2Hプラスミドの作製

plgCfc AIRES ProAプラスミドを Xholで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) ^用いて IgC_K 上流ゲノム領域、 IgC/c、 DNA断片 A、及び Lox-P Puro断片より構成される DNA 断片を回収した。 Sailで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した p AC κ Sailに回収した DNA断片を揷入し、大腸菌 XL10-G0LD (米国 Stratagene社）に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、 IgC κ上流ゲノム領域、 IgC_K、 DNA断片 A、及び Lox-P Puro断片より構成される DNA断片が挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、 C/cP2Hプラスミドを取得した。

( 1 4) C _K 5' ゲノムプラスミドの作製

GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgC _K及び上流ゲノム領域遺伝子配列より以下の DNAを合成した： 5GF： ATAAGAATGCGGCCGCCTCAGAGCAAATGGGTTCTACAGGCCTAACAACCT (配列番号 39) 5GR: CCGGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG (配列番号 40)

5' 側プライマーである 5GFには Notl認識配列を、 3' 側プライマーである 5GR には EcoRI認識配列を付加した。マウスゲノム DNAを铸型として、 KOD plus (日本国東洋紡）により増幅された DNA断片をフエノール/クロロホルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収された DNA断片を Notl及び EcoRIで消化し、 0.8% ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン 11(米国 BiolOl) を用いて回収した。 Notl及び EcoRIで消化した後、大腸菌アルカリホスファタ一ゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript II KS-ベクター（米国 Stratagene 社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌 DH5aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、 C K 5' ゲノム領域遺伝子配列を含む C K 5' ゲノムプラスミドを取得した。

( 1 5 ) C K P2KI A DTプラスミドの作製

上記（1 3) の C_KP2Hプラスミドを EcoRI及び Xholで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて 11Kb の DNA 断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて 5' 末端に EcoRIサイトを 3' 末端に Xholサイトを持つ DNA断片を回収した。 EcoRI及び Xholで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した C K 5' ゲノムプラスミド（上記（1 4 ) 参照）に回収した DNA断片を挿入し、大腸菌 XL10-G0LD (米国 Stratagene社）に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、回収された断片が C_K 5，ゲノムプラスミドに挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、 C cP2KIADT プラスミドを取得した。

( 1 6 ) DT- A断片の調製

上記（6 ) の pKI /cプラスミドを Xhol及び Kpnlで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて約 1 Kbの DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて DT- A断片を取得した。

( 1 7) pC/cP2 KIベクターの作製

Xhol及び Kpnlで消化した後、大腸菌アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した C κ P2KIADTプラスミド（上言己 ( 1 5 ) 参照）に上記（ 1 6 ) の DT- A 断片を挿入し、大腸菌 XL10- GOLD (米国 Stratagene社）に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、 DT-A断片が C c P2KI A DTプラスミドに挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、 pC _K P2 KIベクターを取得した。

(実施例 1 0 )

pCk loxPV KIベクターの構築

LoxP配列の一部に変異が導入（34bpで構成される ΙοχΡ配列の 5 ' 側から 15番目の Tが Aに、 20番目の Gが Cに置換。 Leeら、 Gene, 216 : 55 - 65， 1998) された loxPVを薬剤耐性遺伝子（Puro の両端に持つ pCkP2 KIベクターである pCk loxPV KIベクターの構築を行った。

( 1 ) PGK- Puro断片の調製

Lox-P Puroプラスミド（W0 00/10383号パンフレツト）を制限酵素 BamHIで消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動によって分離した。 1. 7kbの断片を含むゲルより QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがつて PGK-Pur o断片を回収した。

( 2 ) Ck polyA partial断片の調製

上記実施例 9の _PC K P2 KIベクターを元に、以下の DNA (プライマー）を設計した：

Ck pA Nhel F : CCTAGCTAGCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCAC (配列番号 41)

Ck pA Pad R : CCTTAATTAATGGATTTCAGGGCAACTAAAC (配列番号 42)

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製した。 50 μ 1尽応液中に上記 2種のプライマー各 7. 5pmol、铸型として TT2Fマウス ESゲノムを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15秒、 58°C30秒、 68°C30秒を 1サイクルとして 32サイクル増幅した。得られた約 300bpの増幅断片を 2 %ゲルで分離回収した。回収したゲルから QIAquick Gel Extraction Kitを用い、添付文書.にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を制限酵素 Nhel及び Pacl で消化し、 2 %ァガロースゲルでサイズ分画した。 QIAquick Gel Extraction Kit を用い添付文書にしたがって、ゲルから酵素処理断片を回収した。この断片を上記実施例 1の（1 ) における pBS + PFNベクターの Nhel/Paclサイトにサブクローニングし、大腸菌 Competent high DH5 (日本国東洋紡）に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、配列を確認した。 CkP2KIベクターの Total CkpolyA 配列と比較して、増幅エラーの見られなかった pCk poly A partialを Pacl及び Nhelで消化した。 2%ゲルで 303bpの断片を分離し、 QIAquick Gel Extraction Kit を用い添付文書にしたがって Ck polyA partial断片を回収した。

(3) pC/cP2KIベクターに一本鎖化サイト Asclを加えたベクター（pC/cP2 + As KI) の構築

以下の合成オリゴ DNAをァニールさせて、 Ascl リンカーを合成した：

Ascl top linker： GGCCAGGCGCGCCTTGC (配列番号 43)

Ascl bottom linker： GGCCGCAAGGCGCGCCT (配列番号 44)

上記実施例 9の pC_KP2KIベクターを制限酵素 Notl (Roche) で消化し、 0.8% ァガロースゲルより分離精製した後に ligation kit ver.2 (タカラバイオ）を使用したライゲーシヨン反応により Ascl リンカ一を導入した。それを大腸菌 XLIO-Gold Ultracorapetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入して得られた形質転換体より DNA (ベクター pC_KP2 + AsKI) を調製し、揷入断片の塩基配列を確認した。

(4) Ck 3，ゲノム断片の調製

上記（3) の pC/cP2 + As KIベクターを制限酵素 Hpy99Iで消化し、 0.8%ァガロースゲルで 8820bp の断片を分離した。この目的断片を含むゲルを切り出し、 QIAquick Gel Extraction Kit を用い添付文書にしたがって DNAを回収した。回収した DNAは Blunting high (日本国東洋紡）を用いて、添付文書にしたがって末端の平滑化を行った。フエノール抽出によって DNA精製後、制限酵素 Xholで消化した。 0.8%ァガロースゲルで 8280bpの断片を分離し、この目的断片を含むゲルを切り出して、 QIAquick Gel Extraction Kitを用い添付文書にしたがって Ck3' ゲノム断片を回収した。

(5) loxPV Nhel/Xhol断片の調製

上記実施例 1の（1) の pBS + PFNベクターを制限酵素 Sailで消化し、仔牛小腸由来アル力リホスファターゼを用いて末端の脱リン酸化を行った後に、以下のオリゴ DNAより合成した loxP- Bglll-Pmel-Hpal リンカーを挿入した。 mutant loxP F : TCGATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTATAGATCTATAACTTCGTATAA AGTATCCTATACGAAGTTATGTTTAAACGTTAACG (配列番号 45)

mutant loxP R： TCGACGTTAACGTTTAAACATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTATAGATC TATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTA (配列番号 46)

大腸菌 Co即 etent high DH5 aに導入し、得られた形質転換体より DNAを調製した。連結部分の塩基配列を確認し、リンカ一が目的の方向に挿入されていた PBS2272を取得した。

PBS2272 を制限酵素 Bglll消化し、仔牛小腸由来アル力リホスファタ一ゼを用いて末端脱リン酸化した後、上記（1 ) で調製した PGK-Puro断片を連結した。大腸菌 Competent high DH5 aに導入し、得られた形質転換体より DNAを調製した。連結部分の塩基配列を確認し、 PGK-Puro断片が目的の方向にクローニングされていたプラスミド ploxPV- puroを得た。

このプラスミドを制限酵素 Nhel及び Paclで消化し、末端を仔牛小腸由来アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した。ここに上記（2 ) で調製した Ck polyA patrital 断片を挿入した。 XL10 - Gold Ultracompetent Cel ls (米国 STRATAGENE) に形質転換し、得られたクローンよりプラスミド DNAを調製して塩基配列の確認を行った。つなぎ目及び内部の配列を確認し、エラーの無いプラスミド ploxPV-Puro- poly Aを取得した。

得られたプラスミドを制限酵素 Hpal及ぴ Xholで消化し、末端を仔牛小腸由来アル力リホスファターゼを用いて脱リン酸化した後に上記（4 ) で調製した Ck 3 ' ゲノム断片を導入した。 XLIO-Gold Ultracompetent Cel lsに形質転換し、得られたクローンよりプラスミド DNAを調製して塩基配列の確認を行った。つなぎ目の塩基配列を確認して、予定通りの連結が確認されたプラスミド ploxPV Nhel/XhoI を得た。このプラスミドを制限酵素 Nhel及び Xhol消化し、約 10. 5kb の loxPV Nhel/Xhol断片を回収した。

( 6 ) pCk loxPV KIベクターの構築

上記（3 ) の pC fc P2 + As KIを Nhel及び Xholで消化し、 9968bpの断片を 0. 8% ァガロースゲル分画によって回収した。末端を仔牛小腸由来アル力リホスファターゼを用いて脱リン酸化し、上記（5 ) で調製した loxPV Nhel/Xhol断片と連結した。連結部分の塩基配列を確認し、 pCk loxPV KIベクターを得た。 (実施例 1 1 )

pCkpAMCSベクターの構築

( 1 ) pBlueLABベクターの Pacl-Fsel間に Nhelサイトを導入した pBlueLAB + Nh の構築

上記実施例 4の（ 1 ) のプラスミド pBlueLABを制限酵素 Pacl (NEB)で消化後、核酸) If製用マイクロスピンカラム S-200HR (アマシャム）を用いてバッファー置換し、続いて制限酵素 Fsel (NEB) で消化した。 0. 8%ァガロースゲルより分離精製した後に以下の合成オリゴ DNAをァニールさせて、 l igation kit ver. 2 (タカラバイオ）を使用したライゲーシヨン反応により導入した。それを大腸菌 DH5 c に導入して得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った：

Pac-Nhe-Fse S： TAAGGGCTAGCTAGGGCCGG (配列番号 47)

Pac-Nhe-Fse AS： CCCTAGCTAGCCCTTAAT (配列番号 48)

( 2 ) pBlueLAB + Nhの Sail- Hindlll間に Hpalサイトを導入した pBlueLAB + NhHp の構築

上記（ 1 ) の _PBlueLAB + Nhを制限酵素 Sail及び Hindlll (Roche) で消化し、 0. 8%ァガロースゲルより分離精製した後に以下の合成オリゴ DNA をァニールさせて、 l igation kit ver. 2 (タカラバイオ）を使用したライゲーシヨン反応により導入した。それを大腸菌 DH5ひに導入して得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片の配列決定を行った：

S/Hpal/Hd-S： TCGAGTTAAC (配列番号 49)

S/Hpal/Hd-AS： AGCTGTTAAC (配列番号 50)

( 3 ) pC /c P2 + As KI より Ck- polyAを含む P2プロモーター部分除いたベクター (_PCkpAP2) の構築 '

上記実施例 1 0の（ 3 )の pC κ P2 + As KIを制限酵素 Hpal-Nhel (スイス Roche) で消化して生じる 952bpの断片を 0. 8%ァガロースゲルより分離精製し回収した。上記（ 2 ) の pBlueLAB + NhHpを制限酵素 Hpal及び Nhel (Roche) で消化し、 0. 8% ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リホスファターゼ（日本国タカラバイオ）を用いて末端脱リン酸化した。上記 952bpの断片を l igation kit ver. 2 (日本国タカラバイオ）を使用したライゲーシヨン反応により導入した（pCk_PAP2ベクター）。それを大腸菌 DH5ひに導入して得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の配列決定を行った。

( 4 ) P2プロモーターを除去してマルチクローニングサイド (Sail, Fsel、 Pad) を導入したベクター（pCkpAMCS) の構築

上記（3 ) の _PCkpAP2ベクターを制限酵素 Hindlll及び Nhel (スイス Roche) で消化した。 0. 8%ァガロースゲルより約 4 kb の断片を回 1|Xした。以下の合成ォリゴ DNAをァニールさせて、 l igationkit ver. 2 (日本国タカラバイオ）を使用したライゲーシヨン反応により導入して、 pCkpAMCSベクターを得た：

SPFNl inker-S： AGCTGTCGACTTAATTAAGGCCGGCCG (配列番号 51)

SPFN1 inker- AS： CTAGCGGCCGGCCTTAATTAAGTCGAC (配列番号 52)

(実施例 1 2 )

pCk loxPV A Pベクターの構築 (mutant ΙοχΡ 大ベクター）

( 1 ) CkP2 ver. 3· 1べクターの構築

上記実施例 1 0で構築された pCk loxPV KIベクターに含まれる Pacl認識サイト削除のため、 Pacl消化を行い、 Blunting highを用いて平滑化処理を行った。次に自己環状化反応を行った。配列決定により Pacl認識サイトがなくなつたことを確認し、 CkP2 ver. 3. 1ベクターを得た。

( 2 ) pCk ΙοχΡν Δ Ρベクターの構築

上記（ 1 ) の CkP2 ver. 3. 1ベクターを制限酵素 Hpal及び Nhelで消化し、約 19. 5kbの断片を 0. 8%ァガロースゲル分画によって回収した。末端は仔牛小腸由来アル力リホスファタ一ゼを用いて脱リン酸化した。このベクターに上記実施例 1 1の pCkpAMCSベクターを制限酵素 Hpal、 Nhel (スイス Roche)で消化し、 0. 8% ァガロースゲルより回収した Ck-polyA-MCSを含む約 700bpの断片を導入した。連結部分及び内部の塩基配列を確認し、 pCk ΙοχΡΥ Δ Ρベクターを得た。

(実施例 1 3 ) pUS hR2dC KIベクターの構築

( 1 ) hR2dC (-SP：シグナル配列無し） DNA断片の作製

Rspo2 (-SP) FW： CAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTA (5，リン付き、配列番号 53) R2dC (-SP) RV： TTGGCCGGCCTTACCCTCCTGGACAATGCCTCATT (Fselサイト含む、配列番号 54)

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、铸型として W003/91280号に記載の方法により取得された FL型 R-spondin2 cDNAを添加し、 94°C 3分保温した後、 98°C15秒、 63°C 15秒、 68°C 1. 5分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 560bp の増幅断片を 2 %ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Fsel (NEB)で酵素消化し、 QIAquick PCR Purification Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を精製した。

( 2 ) 小ベクターに hR2dC (-SP)を揷入した pPSs3. 8 R2dCベクターの構築上記実施例 1の（2 ) の pPSs3. 8ベクターを制限酵素 Sfol及び Fsel (NEB) で消化した後、大腸菌由来アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに上記（1 ) で回収した DNA断片を揷入し、 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、揷入断片の配列決定を行った。 PCRに起因する配列変異が含まれていないクローン（pPSs3. 8 R2dCベクター）を選択した。

( 3 ) 大ベクターへのヒト dC型 R- spondin2遺伝子導入による pUS hR2dC KIべクターの構築

上記（2 ) の pPSs3. 8 R2dCベクターを制限酵素 Pacl及び Fsel (NEB) で消化した後、 2 %ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel

Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって約 1. 5kbの酵素処理断片を回収した。上記実施例 1 2の pCk loxPV A Pベクターを制限酵素 Pacl及び Fsel (NEB) で消化した後、大腸菌由来アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに上記の約 1. 4kb 断片を挿入し、大腸菌 XL10- Gold

Ultracompetent Cel ls (米国 STRATAGENE) に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認して、 pUS hR2dC KIベクター（図 5 ) を取得した。図 5に示されるベクターの各要素は以下の通りである：

PSプロモーター：マウス Ig Kプロモーター領域 PS

シグナルぺプチドコード領域： PSプロモータ一下流のマウス Ig /cシグナルぺプチドコード領域

MCS：マルチクローニングサイト

hR2dC (-SP) ：固有のシグナルペプチドコード領域を持たない dC 型ヒト R-spondin2退ィ子

Ck：マウス Ig /C遺伝子定常領域

Total Ck polyA： C /c終止コドン下流 436bpからなるマウス Ig K polyAシグナル領域

Ck polyA part ial： C κ終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig κ polyAシグナル領域

loxPV-Puro： loxP配列の一部変異配列である loxPV配列をその両端に持つピュ一口マイシン耐性遺伝子

DT-A：ジフテリァトキシン A鎖遺伝子

pBluescript ：クローユングベクター。

また、天然の分泌シグナルが Ig κシグナル配列に置換された dC 型ヒト

R- spondin2遺伝子コード領域、及びそのアミノ酸配列を以下に記す。

dC型ヒト R- spondin2遺伝子コード領域の塩基配列（621bp、配列番号 55)

ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT

GACCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGC

AAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTC

TTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCC

GGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAAC

TGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCAT

AGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAA

TGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAAT

CGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCA GTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATG AGGCATTGTCCAGGAGGGTAA

dC型ヒト R-spondin2タンパク質のアミノ酸配列（206アミノ酸、配列番号 56)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLF

FFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLH

RGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKP

VKDTI LCPT I AESRRCKMTMRHCPGG

(実施例 1 4 )

Electroporat ion用 pUS hR2dC KI ベクターの調製

pUS hR2dC KIベクター 60 ju gを、スペルミジン添加（ 1 mM pH7. 0米国シグマ）バッファ一（日本国ロシュ ·ダイァグノスティックス、制限酵素用 Hバッファー）を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、及び 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリゥムを加え、一 20°C で 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間風乾させた。 0. 5 /z g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で保存し、 Electroporation用 pUS hR2dC KIベクターの調製を行なった。

(実施例 1 5 )

pUS hR2dC KIベクターと RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞株を用いた US hR2dC GP +マウス ES細胞株の取得

ヒト R2dC-cDNAが相同組換えにより免疫グロブリン c軽鎖遺伝子下流に挿入された US hR2dC GP +マウス ES細胞株取得のため、実施例 1 4に記載された方法で pUS hR2dC KIベクターを制限酵素 Notl (日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲテイング、羊土社、 1995) に従って RSエレメント .ターゲティング（RS- K0)マウス ES細胞（実施例 7 ) へ導入した。 RSエレメント ' ターゲティング .マウス ES細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシン C (米国シグマ）処理したマウス胎児初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入) を用いた。

まず、増殖させた RSエレメント · タ一ゲティング ·マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 10⁷個/ /ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 gのベクター DNAと混和し、ジーンパルサーキュべット（電極距離： 0. 4cm、米国バイオラッド f にてエレクトロポレーションを行った（容量： 960 ju F、電圧： 250V、室温）。エレクトロポレーシヨンした細胞を 10mlの ES培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100匪組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国べクトン .ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間後に 0. 8 g/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含む ES培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10% DMS0、米国シグマ）に懸濁し、一 80°Cにて保存した。

残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 10⁶〜10⁷ 個の細胞力らゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Ki ts (米国 Gentra System 社）により調製しだ。これらのピューロマイシン耐性 RSエレメント 'ターゲティング ·マウス ES細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造）で消化し、了ガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンプロットを行い、 W0 00/10383 号パンフレットに記載の方法で使用された、 Ig軽鎖 J K -C /Cゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片（Xhol：〜 EcoRI、約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレット、図 5参照）をプローブ（Ck 3' probe) として相同組換え体を検出した。

解析の結果、野生型 RSエレメント 'ターゲティング 'マウス ES細胞では EcoRI 消化により、 1本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想され、ピュー口マイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。すなわち、これらのクローン（US hR2dC GP + ) は一方のアレルの免疫グロブリン / c鎖遺伝子下流に dC 型ヒト R-spondin2 cDNAが挿入されたものである。

(実施例 1 6 ) US hR2dC GP +マウス ES細胞株及び Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた US hR2dC GP+キメラマウスの作製

免疫グロプリン/ 鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、機能的な B リンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426， 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した ES細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97： 722-7, 2000) に記載された免疫グロプリン//鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日本国日本クレア社）系統への戻し交配を 3回以上行つた個体を宿主胚調製用として用いた。上記実施例 1 5で得られ、免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流にヒト R2dC-cDNAが挿入されていることが確認された US hR2dC GP +マウス ES細胞株（#3) を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入した。 ES培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターグティング、羊土社、 1995)で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のインジェクション胚を移植した。 ·

実施例 1 5の US hR2dC GP +マウス ES細胞株（#3)を用いて作製されたインジヱクシヨン胚を移植した結果、計 6匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められ. るかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち ES細胞の貢献の認められる個体が得られた。これらの結果より、免疫グロプリン c鎖遺伝子下流に dC型ヒト R- spondin2 cDNAが挿入されている US hR2dC GP +マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。

(実施例 1 7 )

US hR2dC GP +キメラマウス各臓器由来の Total RNA調製実施例 1 6で作製した 4週齢の US hR2dC GP +マウス ES細胞株 #3由来のキメラマウス計 2匹（キメラ率 100% ：雌、 50%：雄）と、コントロールとして実施例 8でネオマイシン耐性マウス ES細胞（#32)を用いて作製されたコントロールキメラマウス（4週齢、 3匹）より回腸を摘出し、直後に液体窒素で凍結保存した。得られた各凍結サンプルから、 RNeasy mini kit (QIAGEN) を用いて添付書類にしたがって、 Total RNA調製を行った。

(実施例 1 8 )

hR2dC遺伝子転写の確認

Superscript III (Invitrogen) を用い、上記実施例 1 7で調製された各精製 RNAサンプル 500ngより cDNAを合成した。その後、 37° (：、 20分間 RNaseH処理を行い、滅菌水による 10倍希釈液 2. 0 1をその後の PCRの铸型に用いた。

hR2dC遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した： hR2dC RT F2 : GAGCGAATGGGGAACTTGTAGC (配列番号 57)

CkpolyAR2 : CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 58)

dC型ヒト R-spondin2遺伝子転写を確認するための PCRを以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 /x 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 5分保温した後、 94°C30秒、 62°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 40サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。

結果を図 6に示す。図 6においては、コントロール群（C ) では全ての臓器で増幅バンドが検出されなかったが、ヒト R2dC遺伝子が導入された（US hR2dC GP + ) マウス ES細胞を用いて作製されたキメラマウス（図 6中、 R ) では増幅が見られ、 hR2dC遺伝子の転写が起きていることが確認された。

、

(実施例 1 9 )

Axin2遺伝子転写の確認

マウス Axin2 (raAxin2) 遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNA を合成した： Axin2 F： CAGGAGCCTCACCCTTCG (配列番号 59)

Axin2 R： ACGCCGAGGTGCTTGCCC (配列番号 60)

mAxin2 遺伝子発現を確認するための PCR を以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ ΐ反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、鑄型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 30秒、 60°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果、各個体とも増幅が見られたが、ヒト R2dC 遺伝子が導入されたマウス ES細胞を用いて作製されたキメラマウス（R ) では、より強い増幅が確認された（図 6 )。

また、各サンプル群で用いられている mRNA量に偏りが生じていないかを確認するため、マウスグリセルアルデヒドー 3—リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH) 遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した：

mGAPDH5： CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (配列番号 61)

mGAPDH3： ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (配列番号 62)

マウス GAPDH遺伝子発現を確認するため PCRを以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 /z 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、鎳型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C30'秒、 65で 30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果、コントロールの 1個体でやや多く検出したものの、他のサンプルではマウス GAPDHの発現がほぼ等しいレベルで検出された。上記の結果から hR2dCの遺伝子発現が確認できた個体では Axin2遺伝子の転写量も増加していることが確認された（図 6 )。

(実施例 2 0 )

US hR2dC GP+マウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した US hR2dCマウス ES細胞株の取得

実施例 1 5で得られた US hR2dC GP +マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子（Neo^f，Puror) を除去した ES細胞株取得のため、 pCAGGS- Creベクター（Sunaga ら、 Mol Reprod Dev. , 46 : 109-113， 1997) を確立されている方法（相沢慎一、バィォマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲティング、羊土社、 1995) に従って US hR2dC GP +マウス ES細胞へ導入した。

US hR2dC GP +マウス ES細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシン C (米国シグマ）処理した G418耐性初代培養細胞 (日本国インビトロジヱン社より購入）を用いた。まず、増殖させた US hR2dC GP +マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 10⁷個 ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 μ _§のベクター DNAと混禾卩し、ジーンパルサーキュべット（電極距離： 0. 4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量： 960 F、電圧： 250V、室温）。エレクト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの ES培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより 2· 5ml分を、あらかじめフィーダ一細胞を播種した 60mra組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国べクトン .ディッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじめフィーダ一細胞を播種した 100mm 組織培養用プラスチックシャーレ (ファルコン、米国べクトン .ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10%DMS0、米国シグマ）に懸濁し、一 80°Cにて保存した。

残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 10⁶〜10⁷ 個の細胞力らゲノム醒を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System 社）により調製した。これらマウス ES細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンプロットを行い、 W0 00/10383号パンフレットの実施例 48に記載の方法で使用された、 Ig 軽鎖 J /C -C Kゲノム DNAの 3 '端の DNA断片（XhoI〜EcoRI、約 1. 4kb、 W0 00/10383 号パンフレット、図 5参照）をプローブ（Ck 3' probe) として LoxP配列で挟まれた Puro¹"遺伝子が除去された ES細胞株を検出した。 Puro³"遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド（15. 1 Kbと 12. 55Kb) が検出され、 Puro^r 遺伝子が除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド（15. 1 Kbと

9. 75 Kb) が検出される。また、上記と同様の操作で得られたサザンプロット膜を用い、実施例 7で用いられた RS 3' probeをプローブとして LoxP配列で挟まれた Neo¹"遺伝子が除去された ES細胞株を検出した。 Neo^f遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド（7. 4 Kbと 5. 7 Kb) が検出され、 Neo¹"遺伝子が除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド（5. 7 Kbと 4. 4 Kb) が検出される。以上の実験から、 US hR2dC GP +マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子（Neo Puro^r) が同時に除去された ES細胞株（US hR2dCマウス ES細胞株）が得られた。

(実施例 2 1 )

US hR2dC マウス ES細胞株及び Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた US hR2dCキメラマウスの作製

免疫グロブリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、機能的な Β リンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Kitamura ら， Nature, 350： 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した ES細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7, 2000) に記載された免疫グロブリン/ i鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日本国日本クレア社）系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。上記実施例 2 0で得られ、免疫グロブリン / c鎖遺伝子下流にヒト R2dC-cDNAが揷入されていることが確認された 2種の US hR2dCマウス ES細胞株 (#26、 #30) を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリン//鎖ノックァゥトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入した。 ES培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲティング、羊土社、 1995) でー晚培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宫あたりそれぞれ約 10個のインジクション胚を移植した。

US hR2dCマウス ES細胞株（#26、 #30) を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、計 39匹（#26： 21匹、 #30： 18匹）の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色 (濃茶）が認められるかどうかによつて判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち ES細胞の貢献の認められる個体が得られた。これらの結果より、免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流に dT 型ヒト R-spondin2 cDNAが挿入されている US hR2dCマウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。

(実施例 2 2 )

US hR2dCキメラマウス各臓器由来の Total RNA調製

実施例 2 1で作製した US hR2dCマウス ES細胞株（#26、 #30) 由来のキメラマウス（4週齢）より回腸の組織を摘出し、直後に液体窒素で凍結保存した。得られた凍結サンプルから、 RNeasy mini kit (QIAGEN) を用いて添付書類にしたがつて、 Total RNA調製を行った。

(実施例 2 3 )

hR2dC遺伝子転写の確認

SuperScriptlll (Invitrogen) を用い、実施例 2 2 (US hR2dC キメラマウス）、及び実施例 8でネオマイ、:/ン耐性マウス ES細胞（#32) を用いて作製されたコントロールキメラマウス（4週令、 3個体）の回腸より調製された各精製 RNAサンプル 500ngより cDNAを合成した。その後、 37°C、 20分間 RNaseH処理を行い、滅菌水による 10倍希釈液 2. Ο μ ΐをその後の PCRの铸型に用いた。

hR2dC遺伝子転写確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した： hR2dC RT F2 : GAGCGAATGGGGAACTTGTAGC (配列番号 63)

CkpolyAR2 : CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 58)

dC型ヒト R-spondin2遺伝子転写を確認するための PCRは以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 5分保温した後、 94°C30秒、 62°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 40サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。

その結果、コントロール群では増幅バンドが検出されないが、ヒト R2dT遺伝子が導入された US hR2dCマウス ES細胞由来のキメラマウスの回腸においては増幅バンドが検出された。

(実施例 2 4 )

Axin2遺伝子転写の確認

マウス Axin2 (niAxin2) 遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNA を合成した：

Axin2 F： CAGGAGCCTCACCCTTCG (配列番号 59)

Axin2 R： ACGCCGAGGTGCTTGCCC (配列番号 60)

実施例 2 2で調製した RNAサンプルについて mAxin2遺伝子発現を確認するための PCRを以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C30秒、 60°C30秒、 72°C30秒を 1サィクルとして 30サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果、各個体とも増幅が見られたが、ヒト R2dC遺伝子が導入された US R2dCマウス ES 細胞由来のキメラマウスの回腸ではコントロール群に比べて明らかに強い増幅が確認できた。

また、各サンプル群で用いられている mRNA量に偏りが生じていないかを確認するため、マウスグリセルアルデヒド一 3—リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH) 遺伝子発現確認用プライマーとして、以卞のオリゴ DNAを合成した：

mGAPDHS： CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (配列番号 61)

mGAPDH3： ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (配列番号 62)

マウス GAPDH遺伝子発現を確認するため PCRを以下のような条件で実施した。

LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、

94°C30秒、 65°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。全てのサンプルでマウス GAPDHの発現がほぼ等しいレベルで検出された。上記の結果から hR2dCの遺伝子転写が確認された個体では Axin2遺伝子の転写量増加が確認された。

(実施例 2 5 )

5週齢 US hR2dCキメラマウスの 5- FU投与後の血球算定値測定

実施例 2 1で作製した US hR2dC マウス ES細胞株（#26、 #30) 由来のキメラマウス（5週齢）を使用して、同キメラマウスに抗癌剤（5-FU) を投与した場合の各種血球系細胞数の変動を測定した。 5週齢 US hR2dCキメラマウス 12個体、及び実施例 8においてネオマイシン耐性マウス ES細胞（#32) を用いて作製されたコントロールキメラマウス 10個体に、 5- FU注 250協和（日本、協和発酵工業）を 150mg/kgで尾静脈内に投与した。経時的に眼窩静脈叢より採血を行い、末梢血中の血球数を自動血球計数装置 KX-21 (日本、シスメックス社）で測定した。 5-FU 投与前の各血球の血球算定値を 100%とした場合の血球算定値（白血球、赤血球、血小板）の経時変化を図 7に示す（図 7 A : 白血球数、図 7 B ：赤血球数、図 7 C ：血小板数)。 5-FU の核酸合成阻害作用によって分裂増殖の早い骨髄造血が抑制される結果、末梢血中の白血球、赤血球及び血小板の数が減少することは既に公知であり、コントロールキメラマウスでは、いずれの血球系においても減少が観察された（図 7 A〜じ）。一方、 US hR2dC キメラマウスではいずれの血球系においても血球回復が著明に促進されており、特に血小板においては、 5-FU投与による減少がほとんど起こらなかった（図 7 C )。以上から、 US hR2dC キメラマウスにおいては、導入した dC型ヒト R- spondin2遺伝子発現の影響により、 5- FUによる血球減少が緩和され、血球回復が促進されていることが示された。

(実施例 2 6 )

dC型ヒト R-spondin2組換体発現ベクターの構築

C末端欠失型ヒト R- spondin2タンパク質の発現ベクターを構築した。下記プライマ一を合成し、铸型を用いず KOD plus DNA Polymerase (日本国東洋紡）により、 96°C20秒、 50°C20秒、 68°C20秒からなる工程を 1サイクルとする 2 5サイクルの PCRを実施した： FlagHisFw: attgcggccgcagtactGACTACAAGGACGACGATGACAAGcgtaccggtcatcatcacc (配列番号 64)

FlagHisRv : ccgctcgagCTAatggtgatggtgatgatgaccggtacgCTTGTCATCGTCGTCCTTGTA (配列番号 65)

増幅断片を制限酵素 Notl及び Xholで消化し、 JET Sorb (独国 Genomed社）を用いて DNA 断片の精製を行った。精製 DNA断片を、 Notl 及び Xhol で消化した pENTRIAベクター（米国 Invitrogen社）と連結した。得られた組換えベクターを用いて大腸菌 DB3. 1 (米国 Invitrogen社）を形質転換し、 25 μ g/mlカナマイシンを含む LB寒天培地に蒔き、単一コロニーを形成させた。単離したコロニーを 25 / g/mlカナマイシンを含む LB培地 2 mlで培養後、 RPM Kit (米国 Q-BIOgene社）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入遺伝子の配列を常法にしたがって決定し、下記の配列番号 66の配列と一致するクローンを選抜し、 pENTRlA FlagHisベタタ一とした： ag (配列番号 66)

さらに下記プライマーを合成し、 W003/91280号記載の方法により取得した全長型ヒト R- spondin2 cDNAを铸型として、 KOD plus DNA Polymerase (日本国東洋紡）を用いて、 96°C20秒、 55°C20秒、 68°C 1分からなる工程を 1サイクルとする 30サイクルの PCRを実施した：

hRspo2FwEco： ggaattccaccATGCAGTTTCGCCTTTTCTC (配列番号 67)

hRspo2RvBlu： CCCTCCTGGACAATGCCTCA (配列番号 68)

増幅断片を制限酵素 EcoRIで消化し、電気泳動の後、 JET Sorb (独国 Genomed 社）を用いて DNA断片の精製を行った。精製 DNA断片を、制限酵素 EcoRI及び Seal で消化した pENTRIA FlagHi sベクターと連結した。得られた組換えベクターを用いて大腸菌 DB3. 1 (米国 Invitrogen社）を形質転換し、 25 μ g/mlカナマイシンを含む LB寒天培地に蒔き、単一コロニーを形成させた。単離したコロニーを 25 μ g/mlカナマイシンを含む LB培地 2 mlで培養後、 RPM Kit (米国 Q-BIOgene社）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入遺伝子の配列を常法にしたがって決定し、下記の配列番号 69の配列（配列番号 70のアミノ酸配列をコードする）と一致す o

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つ ¾靈¾ 一 n 2 ■WSん 0請 Zdf/IDd 96Λ5.0/800Ζ ΟΛ\ X 10⁶個の CHO ras clonel細胞を播種し、 37°C、 5 %C0₂、湿度 100%下、 10%FCS 入り ΜΕΜ α培地で 12〜18時間培養を行った。

前記の p Tracer- CMV/Bsd hRspondin2 Δ C FlagHi s約 5 μ gを制限酵素 Sealで消化した後、フエノールクロ口ホルムイソアミルアルコール処理を行い、エタノール沈殿を行った。得られた DNAの沈殿を TE緩衝液（ρΗ8. 0) 4 _μ 1に溶解し、そのうちの 2 μ 1 を、 OPTI MEM 培地（米国 Invitrogen 社） 100 // 1 で希釈した Fugene6 (Rocheダイァグノステイクス社） 6 μ 1に加え、 15分間室温に静置した。この間に上記で用意した CHO ras clonel細胞を PBS緩衝液で一回洗浄し、新たに 10%FCS入り MEM α培地を添加した。調製した DNA溶液を CH0 ras clonel細胞培養液中に添加し、 37°C、 5 %C0₂、湿度 100%で培養を行った。

上記プラスミドは、蛍光タンパク質である GFP (Green Fluorescence Protein) と Blasticidin耐性遺伝子産物の融合タンパク質をコードする配列が揷入されており、 GFPの発現状況を FACSで検出することによって、ヒト R- spondin2の遺伝子導入をモニターすることができる。約 48時間の培養後に細胞を継代する際に、培地に終濃度 20 £ g/mlの Blasticidinを添加し、さらに 3日間培養を行った。 GFP の発現を指標に、生細胞をセルソーター（FACSAria、 Becton Dickinson社）を用いて選別した後、 7日間培養を行った。 GFP の発現を指標として、生細胞をセルソ一ターを用いて選別する操作を繰り返すことにより、 GFP発現 CH0 ras clonel 細胞の濃縮を行った。さらに、セルソーターを用いて、濃縮した GFP発現 CHO ras clonel細胞の単一細胞ソートを行い、安定発現細胞株を取得した。これらの細胞株の培養上清を用いて SDS- PAGEを行ったのち、ペルォキシダーゼ標識抗 His抗体、及び抗 FLAG 抗体を用いてウェスタンブロットを行い、培養上清中に dC 型ヒト R-spondin2組換体を高発現する CH0細胞クローンを選択した。

(実施例 2 8 )

dC型ヒト R- spondin2高発現 CH0細胞の大量培養

実施例 2 7において取得した dC型ヒト R- spondin2高発現 CH0細胞クローンの大量培養を以下の様にして実施した。ヒト R-spondin2高発現 CH0細胞クローンを

10%FCS含有 DMEM/F- 12培地（GIBC0社）を用いて培養及び増殖後、トリプシン溶液にて剥離したのち、 100ml の同培地を含む Falcon 社製ローラーボトル (Falcon3000)、 200本に 1本当たり 1000万個の細胞を接種し、 37°Cで 1 rpmの回転速度で 3日間培養した。 3日後、培養液を吸引除去し、 100ml の PBSで細胞培養表面をリンスしたのち、 10%FCSを含まない DMEM/F-12培地（GIBC0社）を 200ml 加え、 37°C、 1 rpmの回転速度で 7日間培養し、 7日後、その培養上清合計 40 L を取得した。取得した培養上清は 10000力ット限外濾過膜（ペリコン 2カセット、ミリポア社製）にて濃縮を行い、 10倍濃縮培養上清 4 Lを取得した。

(実施例 2 9 )

dC型ヒト R- spondin2組換体精製品の取得

実施例 2 8で取得した 10倍濃縮培養上清から、 dC型ヒト R-_Sp_0ndin2組換え体

(配列番号 70) の精製を実施した。この dC型ヒト R_spondin2組換え体は、 C末端部に Hisタグ配列を有するため、金属イオン固定化カラムに対するァフィニティーを利用して精製することが可能である。そこで、第 1ステップとして、 Ni-NTA ァガロース樹脂（invitrogen社）による精製を実施した。実施例 2 8で取得した

10倍濃縮培養上清 1 Lを PBS で 5倍希釈後（総液量 5 L )、 PBS にて平衡化した

Ni- NTAァガロースカラム（<i) 3cra X 10cm) に流速 2. 5ml/rainで添加した。添加終了後、流速 5. Oml/minにて、 25mMイミダゾール含有 PBSによる洗浄を 10分間行なった後、 250mMイミダゾール含有 PBSによる直線濃度勾配により、吸着画分を溶出した。溶出液は、 25ml ごとにチューブ中に分画した。各溶出液を SDS-PAGE 後の銀染色及び抗 Hisタグ抗体（anti-His (C- term) - AP, invitorogen社製）によるウェスタンブロッテイングにて分析したところ、 130mM-180mM のイミダゾール濃度に相当するフラクション 13， 14， 15, 16， 17 (計 25mL) に、 SDS- PAGE上の分子量約 30kDaの目的タンパク質が検出された。さらに純度を上げるため、第 2 ステップとして、ゲルろ過クロマトグラフィ一による精製を実施した。 Ni- NTA力ラム精製液、計 25mlを 10Kカツト限外ろ過膜（アミコンウルトラフリー 15、ミリポア社製）にて 5 mlまで濃縮後、 PBSにて平衡化した Superdex 200pg 16/60カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速 0. 5ml にて添加し、 PBSによる溶出を行なった。溶出液は、 1. 0ml ごとにチューブ中に分画した。各溶出液を SDS-PAGE 後の銀染色及び抗 His タグ抗体 (anti_His (C- term) - AP, invitorogen 社製）によるウェスタンブロッテイングにて分析したところ、約 30〜40kDaタンパク質の溶出位置に相当するフラクション 15〜30 (計 16ml) に目的タンパク質が SDS- PAGE上、単一バンドとして精製されていることが確認された。そこで、フラクシヨン 15〜30 (計 16ral)を 10Kカツト限外ろ過膜（アミコンウルトラフリー 4、ミリポア社製）にて 2 nilまで濃縮し、最終精製品とした。最終精製品の SDS- PAGE 後の CBB染色による染色後ゲルの写真を図 8に示す。図 8において、レーン 1及びレーン 2は還元条件下で泳動した場合の dC型ヒト R- spondin2精製タンパク質の泳動像、レーン 3及びレーン 4は非還元条件下で泳動した場合の dC 型ヒト R-spondin2精製タンパク質の泳動像を表す。本精製タンパク貪の N末端アミノ酸配列分析をプロテインシークェンサ一（アプライドバイオシ^テムズ社製、 Model492) にて実施したところ、シグナル配列を含む dC型ヒト R- spondin2の配列上、 32残基目の Alaからの配列： ASYVSNPIX (C) KGX (C) LSX (C)の配列が検出された。また、本精製タンパク質を 6N HC1 による 150°C、 1時間の酸加水分解後に Acc-Tag 法（ウォーターズ社製）にてアミノ酸組成分析（ウォーターズ社製）を実施したところ、各ァミノ酸の組成値は理論値と良く合致していることが確認された。これらの結果より、本精製タンパク質が目的の dC型ヒト R- spondin2組換体であることが確認された。本 dC型ヒト R-_Spondin2組換体精製品を用い、以下の実施例において抗癌剤投与による骨髄抑制時の血球回復促進効果の検討を実施した。

(実施例 3 0 )

dC型ヒト R- spondin2組換え体の血球回復促進活性評価

8週齢の C57BL/6マウス（日本、日本クレア社）計 10匹を用いて、 5匹には組換体投与群として実施例 2 9で作製した dC型ヒト R- spondin2組換体を 100 gZ 匹/日で尾静脈内に 7日間連続で投与を行った。投与した組換体の重量は、実施例 2 9において実施したァミノ酸組成分析値より換算した値を使用した。また、残り 5匹には対照群として媒体のみを同様に 7日間連続で投与を行った。組換体又は媒体の投与開始日から 4日目に、 5-FU注 250協和を 150ragZkgで尾静脈内に投与し、経時的に眼窩静脈叢より採血した末梢血中の血球数を総合血液学検査装置 ADVIA120 (ドイツ、 Bayer社）で測定した。結果を図 9に示す（図 9 A：白血球数、図 9 B ：赤血球数、図 9 C ：血小板数）。組換体投与群では、末梢血中のいずれの血球系においても対照群に比して 5-FUによる血球減少が緩和され、血球回復が促進された（図 9 A〜C )。本結果より、 dC型ヒト R- spondin2組換え体は、 5-FU 等の抗癌剤投与に由来する血球減少症に対する有効な治療薬となることが示された。

(実施例 3 1 )

FL型ヒト R-spondin3の作製

( 1 ) hR3FL DNA断片（シグナル配列無し · ストップコドンなし）の作製

Rspo3 (-SP) FW： CAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCC (5 ' リン付き、配列番号 7 1 ) Rspo3 (-SP) tagRV： TTGGCCGGCCGTGTACAGTGCTGACTGATACCGAT (Fsel サイト含む、配列番号 7 2 )

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 IX 1反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、铸型としてマウス胎盤由来 mRNA より W0 01/77169号（実施例 13) に記載の方法により合成された cDNA lOOngを添カ卩し、 94°C 3分保温した後、 98°C15秒、 63°C 15秒、 68°C 1. 5分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 760bpの増幅断片を 2 %ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Fsel (NEB) で酵素消化し、 QIAquick PCR Purification Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を精製した。

( 2 ) pPSs hR3FL HV in vitro用ベクター（pPSs hR3FL HV) の構築

実施例 1の（1 0 ) の pPSsHVベクターを Sfol及び Fselで消化後、大腸菌由来アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記（1 ) で作製した DNA断片を挿入した後、 DH5 ctに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、挿入断片 ·連結部分の塩基配列を確認して、 pPSs hR3FL HV in vitro用べクタ一（図 1 0 ) を取得した。図 1 0に示されるベクター中の要素は以下の通りである：

5，ェンハンサー：マウス Ig Kの 5，ェンハンサー領域

PSプロモーター：マウス Ig cプロモーター領域 PS

シグナルぺプチドコード領域： PSプロモーター下流のマウス Ig Kシグナルぺプチドコ一ド領域

hR3FL (-SP) ：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないヒト R3FL遺伝子 HV Tag： His- V5 Tag

polyA：マウス Ig ic polyAシグナノレ領域

3 ' ェンハンサー：マウス Ig κの 3，ェンハンサー領域

Amp：アンピシリン耐性遺伝子。

(実施例 3 2 )

ミエ口一マ細胞 P3-X63. Ag653における hR3FL HV分泌確認

実施例 2に示した方法で pPSs hR3FL HV in vitro用ベクターをトランスフエクトしたミエローマ細胞 P3- X63. Ag653の培養上清 16 1 とサンプルバッファー（+

2ME) 4 μ 1 を混合し、 5分間沸騰して熱変性した。 SDS- PAGEは 10〜20%グラジェントのポリァクリルァミドゲルに変性したサンプル.10 / 1をアプライし、 40mA で 1時間の電気泳動で行った。泳動終了後、平衡化しておいた PVDF膜にセミドラィで 150mAにて 1. 5時間のエレクドロブロッテイングを行い、培養上清中のタンパク質をトランスファーした。 TTBS 中の 2 % ECL Advance Blocking Agent

(Amarsham) で 1時間、振とうしながらブロッキングし、 TTBSで洗浄した。抗 V5

Tagマウスピオチン化抗体（英国 Serotec)を Can Get Signal solution 1 (T0Y0B0) で 1/20000に希釈し、振とうしながらメンブレンを 1時間ィンキュベートした。

TTBS での洗浄を十分に行った後、 Can Get Signal solution 2 ( T0Y0B0) で

StreptAvidin/HRP (米国 DAKO) を 1/20000に希釈し、振とうしながらメンブレンを 1時間インキュベートした。 TTBSで 30分間、時々液を交換しながら振とうしてメンブレンを洗浄した後、 ECL Advance solution A及び B (共に Amersham) を等量混合した検出試薬をメンブレンに添加した。メンブレンはラップに包み、ィメージアナライザー LAS - 3000 (FUJIFILM) に 16分露光した結果、 hR3FLのシグナルを検出した（図 1 1 )。図 1 1に示されるウェスタン解析において、レーン 1は pPSs HV (陰性コントロール）を、レーン 2は pPSs hR3FL #lを、レーン 3は pPSs hR3FL #2を、レーン 4は pPSs hR3FL #3を用いて得られた結果であり、それぞれ独立した 3回のトランスフエクトの結果を示す。図中、アミノ酸配列から予測される FL型 R- spondin3分子量（約 33. 5kD)と比較して、より大きな分子量（約 42kD) の特異的バンドが検出されるが、これは FL型 R_spondin3が糖鎖修飾を受けたことによると考えられる。

(実施例 3 3 )

pUS hR3FL KIベクターの構築

( 1 ) hR3FL (-SP：シグナル配列無し） DNA断片の作製

Rspo3 (-SP) FW： CAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCC (5' リン付き、配列番号 7 3 ) Rspo3 (-SP) RV： TTGGCCGGCCCTAGTGTACAGTGCTGACTGATACC (Fsel サイト含む、配列番号 7 4 )

KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 H 1反応液中に上記 2種のプライマー各 10pm_Ol、铸型としてマウス胎盤由来 mRNA より W0 01/77169号（実施例 13) に記載の方法により合成された cDNA lOOngを添加し、 94°C 3分保温した後、 98°C 15秒、 63°C 15秒、 68°C1. 5分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 760bpの増幅断片を 2 %ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Fsel (NEB) で酵素消化し、 QIAquick PCR Purification Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を精製した。

( 2 ) hR3FL (- SP) が挿入された pPSs3. 8 R3FLベクターの構築

実施例 1の（2 ) の pPSs3. 8ベクターを制限酵素 Sfol及び Fsel (NEB) で消化した後、大腸菌由来アル力リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに上記（1 ) で回収した DNA断片を挿入し、 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、揷入断片のシーケンスを行った。 PCRに起因する変異が無いクローンを選択し、 _pPSs3.8 R3FLベクターを得た。

( 3) ヒト FL型 R - spondin3遺伝子導入が挿入された pUS hR3FLKIベクターの構築

上記（ 2) の pPSs3.8 R3FLベクターを制限酵素 Pacl及び Fsel (NEB) で消化した後、 2 %ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquickGel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって約 1.6kbの酵素処理断片を回収した。 pCk loxPVAPベクター（実施例 1 2) を制限酵素 Pacl及び Fsel (NEB) で消化した後、大腸菌由来アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに上記の約 1.6kb 断片を挿入し、大腸菌 XL10_Gold Ultracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、 pUS hR3FLKIベクター（図 1 2) を取得した。図 1 2に示されるベクターの各要素は以下の通りである：

PSプロモーター：マウス Ig_Kプロモーター領域 PS

シグナルぺプチドコード領域： PSプロモーター下流のマウス Ig_Kシグナルぺプチドコード領域

MCS：マルチクローニングサイト

hR3FL(-SP) ：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たない FL 型ヒト R-spondinj laizs十

Ck：マウス Ig c遺伝子定常領域

Total Ck polyA： C κ終止コドン下流 436bpからなるマウス Ig c polyAシグナル領域

Ck polyA partial ： C κ終止コドン下流 309bp力らなるマウス Ig κ polyAシグナル領域

DT - A：ジフテリアトキシン A鎖遺伝子

pBluescript ：クローニングべクター。

天然の分泌シグナルが Ig/cシグナル配列に置換された FL型ヒト R- spondin3遺伝子コード領域、及びそのアミノ酸配列を以下に記す。

FL型ヒト R_spondin3遺伝子コード領域の塩基配列（819bp、配列番号 7 5 )

ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT

GACCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGC

TGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGA

CTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGT

CCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCT

GACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTA

CACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATG

GAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACG

AAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATA

CAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTATGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACA

GTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGA

AAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCC

AGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAA

GATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG

FL型ヒト R-spondin3タンパク質のァミノ酸配列（272アミノ酸、配列番号 7 6 )

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPR

LFFALER I G KQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYL

HLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVS IVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREI I

QHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQ

QQKKRKVQDKQKSVSVSTVH

(実施例 3 4 )

Electroporation用 pUS hR3FL KI ベクターの調製

実施例 3 3で作製された pUS hR3FL KIベクタ一 60 /z gを、スペルミジン添加（ 1 mM pH7. 0、米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ · ダイァグソスティックス、制限酵素用 Hバッファー）を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、フエノール /クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、及び 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリウムを加え、一 20°Cで 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクタ一を遠心して回収後、 70%エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で 70% エタノールを除き、 1時間風乾させた。 0. の DNA溶液となるように HBS 溶液を加え、 1時間室温で保存し、 Electroporation用 pUS hR3FL KIベクターの調製を行なった。

(実施例 3 5 )

pUS hR3FL KIベクターと RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞株を用いた US hR3FL GP+マウス ES細胞株の取得

ヒト R3FL- cDNAが相同組換えにより免疫グロブリン/ c軽鎖遺伝子下流に挿入された US hR3FL GP+マウス ES細胞株取得のため、実施例 1 4に記載された方法で pUS hR3FL KIベクターを制限酵素 Notl (日本国宝酒造）で線状化し、実施例 1 5 と同様な方法で RSエレメント ·ターゲティング（RS- K0) マウス ES細胞（実施例 7参照）へ導入した。得られたピューロマイシン耐性 RS-K0マウス ES細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、 W0 00/10383 号パンフレツ卜に記載の方法で使用された、 Ig軽鎖 J /C -C Kゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片（XhoI〜EcoRI、約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレット、図 5参照）をプローブ（Ck 3' probe) として相同組換え体を検出した（実施例 1 5参照）。野生 RS-K0 マウス ES 細胞では EcoRI 消化により、 1本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想され、 12株中 12株のピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらの ES細胞クローン（US hR3FL GP + ) は一方のアレルの免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流に FL型ヒト R - spondin3 cDNAが挿入されたものである。

(実施例 3 6 )

US hR3FL GP+マウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した US hR3Fしマウス ES細胞株の取得

実施例 3 5で得られた US hR3FL GP +マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子（Ne_Or, Puro を除去した ES 細胞株取得のため、実施例 2 0と同様な方法で pCAGGS-Creベクターを US hR3FL GP+マウス ES細胞へ導入した。得られたマウス ES細胞クローン由来ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、 W0 00/10383 号パンフレットに記載の方法で使用された、 Ig軽鎖 J K - C Kゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片（XhoI〜EcoRI、約 1· 4kb、 W0 00/10383号パンフレット、図 5参照）をプローブ（Ck 3' probe) として LoxP配列で挟まれた Puro^T遺伝子が除去された ES細胞株を検出した。 Pui 遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2 本のバンド（15. 1kbと 12. 75kb) が検出され、 Puror遺伝子が除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド（15. lkbと 9. 95kb)が検出される。また、上記と同様の操作で得られたサザンプロット膜を用い、実施例 7で用いられた RS 3' probeをプローブとして LoxP配列で挟まれた Neor遺伝子が除去された ES細胞株を検出した。 NeoT遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド（7. 4kb と 5. 7kb) が検出され、 Neo^r遺伝子が除去された ES細胞株では EcoRI 消化により、 2本のバンド（5. 7kbと 4. 4kb) が検出される。以上の実験から、 US hR3FL GP +マウス ES 細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子（Neo¹", Puro^r) が同時に除去された ES細胞株（US hR3FL マウス ES細胞株）が得られた。

(実施例 3 7 )

US hR3FL GP+マウス ES細胞株及び Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた US hR3FL GP +キメラマウスの作製

実施例 1 6と同様な方法を用いて、 US hR3FL GP +マウス ES細胞株及ぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた US hR3FL GP +キメラマウスの作製を実施した。上記実施例 3 6で得られ、免疫グロブリン / c鎖遺伝子下流にヒト

R3FL-CDNAが挿入されていることが確認された 2種の US hR3FL GP +マウス ES細胞株（#9、 #11、 #12) を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリン μ鎖ノックァゥトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入した。 ES培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲティング、羊土社、 1995) でー晚培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のインジヱクション胚を移植した。 US hR3FL GP +マウス ES細胞株（#9、 #11、 #12) を用いて作製されたィンジェクション胚を移植した結果、計 17匹（#9： 8匹、 #11 : 1匹、 #12： 8 匹）の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち ES細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロプリン κ鎖遺伝子下流に FL型ヒト R - spondin3 cDNAが挿入されている US hR3FL GP + マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。

(実施例 3 8 )

US hR3FL GP+キメラマウス各臓器由来の Total RNA調製

実施例 3 7で作製した US hR3FL GP +マウス ES細胞株 #9、 #12由来のキメラマウス 3匹（キメラ率 20〜50%、 4週齢）より回腸を摘出し、直後に液体窒素で凍結保存した。得られた各凍結サンプルから、 RNeasy mini kit (QIAGEN) を用いて添付書類にしたがって、 Total RNA調製を行った。

(実施例 3 9 )

hR3FL及び Axin2の転写量の確認

Superscript III (Invitrogen) を用い、実施例 3 7 (US hR3FL GP+キメラマウス）、及び実施例 8でネオマイシン耐性マウス ES細胞（#32) を用いて作製されたコントロールキメラマウス（4週令、 3個体）回腸より調製された精製 RNAサンプル 500ngより cDNAを合成した。その後、 37°C、 20分間 RNaseH処理を行い、滅菌水による 10倍希釈液 2. 0 μ 1をその後の PCRの铸型に用いた。

hR3FL遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した： hRspo3F : AGGGACTGAAACACGGGTC (配列番号 7 7 )

CkpolyAR2 : CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 5 8 ) hR3FL遺伝子発現を確認するための PCRを以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 5分保温した後、 94°C30 秒、 62°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 40サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果、コントロール群（図 1 3中、 C ) では増幅バンドが検出されなかったが、ヒト R3FL遺伝子が導入されたマウス ES細胞を用いて作製されたキメラマウス（図 1 3中、 R ) では増幅が見られ、 hR3FL 遺伝子の転写が起きていることが確認された。

次に Axin2の遺伝子発現の確認を行った。 mAxin2遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した：

Axin2 F： CAGGAGCCTCACCCTTCG (配列番号 5 9 )

Axin2 R： ACGCCGAGGTGCTTGCCC (配列番号 6 0 )

mAxin2 遺伝子発現を確認するための PCR を以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ ΐ反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 30秒、 60°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果、各個体とも増幅が見られたが、 hR3FL 遺伝子が導入されたマウス ES細胞を用いて作製されたキメラマウス（R ) ではより強い増幅が確認された（図 1 3 )。

また、各サンプル群で用いられている mRNA量に偏りが生じていないかを確認するため、マウスダリセルアルデヒド一 3 _リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH) 遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した：

raGAPDH5： CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (配列番号 6 1 )

raGAPDH3： ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (配列番号 6 2 )

LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 ptnol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、

94°C30秒、 65°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果コントロールの 1個体でやや多く検出したものの、他のサンプルではマウス GAPDHの発現がほぼ等しいレベルで検出され、 hR3FLの遺伝子発現が確認できた個体では Axin2の転写量も増加していることが確認された（図 1 3 )。

(実施例 4 0 )

US hR3FLマウス ES細胞株及び Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた US hR3FLキメラマウスの作製

実施例 1 6と同様な方法を用いて、 US hR3FLマウス ES細胞株及び Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた US hR3FLキメラマウスの作製を実施した。上記実施例 3 6で得られ、免疫グロブリン鎖遺伝子下流にヒト R3FL-CDNAが挿入されていることが確認された US hR3FLマウス ES細胞株（#26) を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリン μ鎖ソックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10 個注入した。 ES培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲテイング、羊土社、 1995) で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のィンジヱクション胚を移植した。 US hR3FLマウス ES細胞株（#26) を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、計 4匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち ES細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロブリン/ c鎖遺伝子下流に FL型ヒト R_spondin3 cDNAが挿入されている US hR3FLマウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。

(実施例 4 1 )

US hR3FLキメラマウス各臓器由来の Total RNA調製

実施例 4 0で作製した US hR3FLマウス ES細胞株（#26) 由来のキメラマウス . ( 4週齢）より回腸を摘出し、直後に液体窒素で凍結保存する。得られた各凍結サンプルから、 RNeas mini kit (QIAGEN) を用いて添付書類に従って、 Total RNA 調製を行う。

(実施例 4 2 )

hR3FL及び Axin2の転写量の確認

Superscript III (Invitrogen) を用い、実施例 4 0 (US hR3FLキメラマウス）、及び実施例 8でネオマイシン耐性マウス ES細胞（#32) を用いて作製されたコントロールキメラマウス（4週令、 3個体）回腸より調製された精製 RNAサンプル 500ngより cDNAを合成した。その後、 37°C、 20分間 RNaseH処理を行い、滅菌水による 10倍希釈液 2. 0 /z lをその後の PCRの铸型に用いた。

CkpolyAR2 : CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 5 8 )

hR3FL遺伝子発現を確認するための PCRを以下のような条件で実施する。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 / l 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 5分保温した後、 94°C30 秒、 62°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 40サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出する。その結果、コントロール群では増幅バンドが検出されないが、ヒト R3FL遺伝子が導入されたマウス ES細胞を用いて作製されたキメラマウスでは増幅が見られ、 hR3FL遺伝子の転写が起きていることが確認される。次に Axin2の遺伝子発現の確認を行った。 niAxin2遺伝子発現確認用プライマーとして、

以下のオリゴ DNAを合成した：

Axin2 F： CAGGAGCCTCACCCTTCG (配列番号 5 9 )

Axin2 R： ACGCCGAGGTGCTTGCCC (配列番号 6 0 )

raAxin2 遺伝子発現を確認するための PCR を以下のような条件で実施する。 LA

Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ 1反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmol、铸型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 30秒、 60°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出する。その結果、各個体とも増幅が見られるが、ヒト R3FL 遺伝子が導入されたマウス ES 細胞を用いて作製されたキメラマウスではより強い増幅が確認される。

また、各サンプル群で用いられている mRNA量に偏りが生じていないかを確認するため、マウスグリセルアルデヒド一 3—リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH) 遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴ DNAを合成した：

raGAPDH5 : CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (配列番号 6 1 )

mGAPDH3： ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (配列番号 6 2 )

マウス GAPDH遺伝子発現を確認するため PCRを以下のような条件で実施した。 LA Taq (TaKaRa) を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 25 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 5 pmo.l、铸型の cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C30秒、 65°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、 2 %ァガロースゲルでバンドを検出した。その結果コントロールを含む全てのサンプルでマウス GAPDHの発現がほぼ等しいレベルで検出され、 hR3FLの遺伝子発現が確認できた個体では Axin2の転写量も増加していることが確認された。

(実施例 4 3 )

5週齢 US hR3FLキメラマウスの 5-FU投与後の血球算定値測定

実施例 4 0で作製した US hR3FLマウス ES細胞株（#26)由来のキメラマウス（5 週齢）を使用して、同キメラマウスに抗癌剤（5-FU) を投与した場合の各種血球系細胞数の変動を測定した。 5週齢 US hR3dCキメラマウス 3個体、及び実施例 8 においてネオマイシン耐性マウス ES細胞（#32) を用いて作製されたコントロールキメラマウス 10個体に、 5-ra注 250協和（日本、協和発酵工業）を 150mg/kg で尾静脈内に投与した。経時的に眼窩静脈叢より採血を行い、末梢血中の血球数を自動血球計数装置 KX-21 (日本、シスメックス社）で測定した。 5-FU投与前の各血球の血球算定値を 100%とした場合の血球算定値（白血球、赤血球、血小板）の経時変化を図 1 4に示す（図 1 4 A ：白血球数、図 1 4 B ：赤血球数、図 1 4

C ：血小板数）。実施例 2 5で示した US hR2dCキメラマウスの場合と同様に、 US hR3FL キメラマウスにおいては、いずれの血球系においても血球回復が著明に促進されており、特に血小板においては、 5-FU投与による減少がほとんど起こらなかった（図 1 4 A〜C )。以上から、 US hR3FL キメラマウスにおいては、導入した全長型ヒト R- s_Pondin3遺伝子発現の影響により、 5-FUによる血球減少が緩和され、血球回復が促進されていることが示された。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。産業上の利用可能性

本発明により、血球減少の回復を促進するための組成物及び方法が提供される。かかる血球回復促進剤及び血球回復促進方法は、被験体又は被験細胞に悪影響を及ぼすことなく効率的に血球回復を促進することができる。従って、血球減少に関連する様々な疾患又は障害を、副作用を引き起こすことなく、治療又は予防することが可能となる。配列表フリーテキスト

配列番号：！〜 5 4、 5 7〜6 8 7 1〜 7 4及び 7 7 ：合成ォリゴヌクレオチド、

Claims

求の範

1. 以下の（a) 〜（d) の少なくとも 1つを含むことを特徴とする血球回復促進剤。

(a) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質、

(b) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸、

( c ) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸を含む発現べクター、

2. R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質がヒト又はマウス由来である、請求項 1記載の血球回復促進剤。

3. R- s p o n d i n 2タンパク質が F L型 R— s p o n d i n 2又は d C 型 R— s p o n d i n 2である、請求項 1又は 2記載の血球回復促進剤。

4. R_ s p o n d i n 2タンパグ質が、

(a) 配列番号 56における 22〜206番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は

(b) 配列番号 56における 22〜206番のアミノ酸からなるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有する

ものである、請求項 1、 2又は 3記載の血球回復促進剤。

5. R— s p o n d i n 2タンパク質をコードする核酸が、

(a) 配列番号 5 5における 64〜62 1番の塩基からなる塩基配列を有する、又は

(b) 配列番号 55における 64〜62 1番の塩基からなる塩基配列に相補的な '配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードする

ものである、請求項 1、 2又は 3記載の血球回復促進剤。

6. R— s p o n d i n 3タンパク質が F L型 R— s p o n d i n 3である、請求項 1又は 2記載の血球回復促進剤。

7. R— s p o n d i n 3タンパク質が、

( a ) 配列番号 76における 22〜 272番のァミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は

(b) 配列番号 76における 22〜272番のアミノ酸からなるアミノ酸配列にいて、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有する

ものである、請求項 1、 2又は 6記載の血球回復促進剤。

8. R_ s p o n d i n 3タンパク質をコードする核酸が、

(a) 配列番号 75における 64〜8 1 9番の塩基からなる塩基配列を有する、又は

(b) 配列番号 75における 64〜8 1 9番の塩基からなる塩基配列に相補的な配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードする

ものである、請求項 1、 2又は 6記載の血球回復促進剤。

9. 血球が白血球、赤血球及び血小板から選択される少なくとも 1つである、請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の血球回復促進剤。

1 0. 医薬品又は食品において使用される、請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の血球回復促進剤。

1 1. 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の血球回復促進剤を被験体又は被験細胞に投与することを含む、血球の回復促進方法。 -

1 2. 被験体が血球減少状態に陥っている、請求項 1 1記載の方法。

1 3. 被験体が放射線療法又は化学療法を受けた、受けている又は受ける予定である、請求項 1 1記載の方法。

14. 被験体又は被験細胞がヒト又はヒト由来細胞である、請求項 1 1〜1 3 のいずれか 1項に記載の方法。 '

1 5. 以下の（a) 〜（d) の少なくとも 1つ、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする血球減少関連疾患又は障害の治療剤又は予防剤。 (a) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質、

(b) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸、

(d) R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞

1 6. R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質がヒト又はマウス由来である、請求項 1 5記載の治療剤又は予防剤。

1 7. R— s p o n d i n 2タンパク質が F L型 R— s p o n d i n 2、又は d C型 R— s p o n d i n 2である、請求項 1 5又は 1 6記載の治療剤又は予防剤。

1 8. R— s p o n d i n 2タンパク質が、

( a ) 配列番号 56における 22〜 206番のァミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は

ものである、請求項 1 5、 1 6又は 1 7記載の治療剤又は予防剤。

1 9. R— s p o n d i n 2タンパク質をコードする核酸が、

(a) 配列番号 55における 64〜6 2 1番の塩基からなる塩基配列を有する、又は .

(b) 配列番号 55における 64〜 62 1番の塩基からなる塩基配列に相補的な配列の一部若しぐは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードする

20. R- s p o n d i n 3タンパク質が F L型 R— s p o n d i n 3である、請求項 1 5又は 1 6記載の治療剤又は予防剤。

2 1. R— s p o n d i n 3タンパク質が、

(a) 配列番号 76における 22〜272番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する、又は

(b) 配列番号 7 6における 2 2〜2 7 2番のアミノ酸からなるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かっ血球回復促進活性を有する

ものである、請求項 1 5、 1 6又は 2 0記載の治療剤又は予防剤。

2 2. R_ s p o n d i n 3タンパク質をコードする核酸が、

(a ) 配列番号 7 5における 6 4〜8 1 9番の塩基からなる塩基配列を有する、又は

(b) 配列番号 7 5における 6 4〜8 1 9番の塩基からなる塩基配列に相補的な配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、かっ血球回復促進活性を有するタンパク質をコードする

ものである、請求項 1 5、 1 6又は 20記載の治療剤又は予防剤。

2 3. 血球が白血球、赤血球及び血小板から選択される少なくとも 1つである、請求項 1 5〜 2 2のいずれか 1項に記載の治療剤又は予防剤。

24. 血球減少関連疾患又は障害が、顆粒球減少症、血小板減少症及び赤血球減少症（貧血）からなる群より選択される、請求項 1 5〜2 3のいずれか 1項に記載の治療剤又は予防剤。

2 5. 血球減少関連疾患又は障害が化学療法及びノ又は放射線療法によって引き起こされるものである、請求項 1 5〜 24のいずれか 1項に記載の治療剤又は予防剤。

2 6. 請求項 1 5〜 2 5のいずれか 1項に記載の治療剤又は予防剤の有効量を、血球減少関連疾患若しくは障害に罹患した又は血球減少関連疾患若しくは障害に罹患するリスクのある被験体に投与することを含む、血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防方法。

2 7. 血球減少関連疾患又は障害が、顆粒球減少症、血小板減少症及び赤血球減少症（貧血）からなる群より選択される、請求項 2 6記載の方法。

2 8.. 血球減少関連疾患又は障害が化学療法及び又は放射線療法によって引き起こされるものである、請求項 2 6又は 2 7記載の方法。

2 9. 被験体がヒトである、請求項 2 6〜 2 8のいずれか 1項に記載の方法。

30. 以下の（a) 〜（c) のいずれかの工程：

(a) R- s p o n d i n 2又は 3タンパク質に対する抗体と被験組織又は細胞とを接触.させ、該抗体と該被験組織又は細胞との反応を測定する工程、

( c ) R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、被験組織又は細胞に由来する DNA又は niRN Aを铸型とした増幅反応を行い、増幅産物を分析する工程、

を含む、組織又は細胞の血球回復促進活性の評価方法。

3 1. (a) の工程が、免疫組織化学解析、ウェスタンプロット解析又は酵素結合性免疫吸着アツセィ（E L I S A)により行われる、請求項 30記載の方法。

32. ヒト R_ s p o n d i n 2又は 3タンパク質を B細胞において発現し、かっ血球減少の低減又は回復を促進する表現型を示すことを特徴とするヒト R— s p o n d i n 2又は 3ノックインマウス。

33. ヒト R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質の分泌シグナル配列をマゥス免疫グロブリン（ I g) κ遺伝子の分泌シグナル配列と置換されている改変型ヒト R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質をコードする核酸をマウス E S細胞に導入するステップ、該マウス E S細胞をマウス宿主胚に注入するステップ、得られた胚を発育させるステップを含む、血球減少の低減又は回復を促進する表現型を示すヒト R_ s p o n d i n 2又は 3ノックインマウスの作製方法。

34. マウス宿主胚が機能的な B細胞及び抗体産生能を欠損するマウス系統に由来するものである、請求項 33記載の方法。

35. 血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防のための薬物候補をスクリーニングする方法であって、

(a) ヒト R— s p o n d i n 2又は 3タンパク質を B細胞において発現し、かっ該タンパク質を発現しないマウスと比較して血球細胞の回復能が亢進されているトランスジエニックマウスに対して被験化合物を投与するステップ、及び ( b ) 血球細胞の回復能に対する上記被験化合物の効果を測定するステップを含み、血球細胞の回復能の亢進は、上記被験化合物が血球減少関連疾患又は障害の治療又は予防のための薬物候補となることを示す、上記方法。