JP2006506045A - 造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るポリペプチドおよびそれをコードするdna - Google Patents
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Abstract
Description
球、血小板産生細胞の分化を促進することが知られている。しかしながら、造血幹細胞が分化多能性を保持したまま自己複製するに際し、どのような因子が必要とされるかは分かっていない。造血幹細胞の増殖因子として、SCF/MGF(Williams, D. E., Cell, 63:167-174, 1990; Zsebo, K. M., Cell, 63:213-224, 1990)や、SCGF(WO98/08869)などいくつかの報告があるが、いずれも造血幹細胞の分化多能性を十分に維持する作用を有していない。また、既知のサイトカインを複数組み合わせて添加することにより造血幹細胞を培養する試みがなされているが、造血幹細胞を効率的に増幅させる系の確立はされていない(Miller CL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:13648-13653, 1997; Yagi M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 8126-8131, 1999; Shih C. C. Blood, 94:5 1623-1636 1999)。
る因子がマウス由来ストローマ細胞により生産されていることを予想した。そして、ストローマ細胞の中には、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する能力(以下、「造血幹細胞支持活性」ということがある)を持つストローマ細胞と造血幹細胞支持活性をもたないストローマ細胞が存在することに注目した。本発明者らは、このような能力の違いは、造血幹細胞支持活性を担う因子をコードする遺伝子の発現が造血幹細胞支持活性を持つストローマ細胞では亢進し、造血幹細胞支持活性を持たないストローマ細胞では低いことによると推測し、造血幹細胞支持活性を有する細胞において発現の高い遺伝子の中から造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する因子を同定することが可能であると考えた。その結果、造血幹細胞支持活性を有するAGM-s3-A9細胞で発現
が高く、造血幹細胞支持活性を有さないAGM-s3-A7細胞で発現が低い、あるいは発現して
いない遺伝子を同定し、これらの遺伝子群を強発現させた細胞の造血幹細胞支持活性がを評価することにより、本発明を完成するに至った。
(1) 以下の(A)または(B)のポリペプチドをコードするDNA。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。
(a)配列番号47において塩基番号18〜746からなる塩基配列を少なくとも有するDNA。
(b)(a)に記載の塩基配列を有するDNAまたは同DNAから調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
ン、1% Ficoll 400)または6×SSC、5×Denhardt、0.5% SDS、50% ホルムアミド、42℃である(2)記載のDNA。
シドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールのいずれか、またはそれらの2種以上の組合わせによって修飾された(6)または(7)に記載のポリペプチド。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。
(a)配列番号47において塩基番号18〜746からなる塩基配列を少なくとも有するDNA。
(b)(a)に記載の塩基配列を有するDNAまたは同DNAから調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。
造血幹細胞とは、血球の全ての分化系列に分化し得る多分化能を有する細胞であり、かつ、その多分化能を維持したまま自己複製することが可能な細胞である。造血前駆細胞とは、単一の血液細胞分化系列あるいは、全てではない複数の分化系列に分化できる細胞を称する。ストローマ細胞とは、生体内の造血環境を模してインビトロで造血環境を再現させようとするときに使用できる造血幹細胞と共培養に供すことが可能な細胞を指す。インビトロで造血細胞と共培養できる細胞であればその由来を問わない。
、CFU-E、CFU-Emix)が維持、増殖されているかを指標とすることで造血幹細胞あるいは
未分化な造血前駆細胞が増殖していることを確認することができる。
造血幹細胞支持活性を有するAGM-s3-A9細胞で発現が高く、造血幹細胞支持活性を有さ
ないAGM-s3-A7細胞で発現が低い、あるいは発現していない遺伝子として同定され、それ
を強発現させた細胞において造血幹細胞支持活性が増強または付与されたことが確認された遺伝子は以下のものである。なお、遺伝子の番号は便宜のために本発明者らにより付与されたものである。
GenBank登録番号AF185613のマウス遺伝子Mus musculus glypican-1 (GPC-1) と同一の
遺伝子である。
号AX020122で登録されている。ヒトの遺伝子でも同様の活性が検出されると考えてよい。
結合領域、グリコシルフォスファチジルイノシトール膜結合領域の特徴的な構造を有している。これまでにグリピカン-1からグリピカン-6までの6種類のファミリー遺伝子が発見されている。(J Biol Chem 1999 Sep 17;274(38):26968-77、Glypican-6, a new member
of the glypican family of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Veugelers
M, De Cat B, Ceulemans H, Bruystens AM, Coomans C, Durr J, Vermeesch J, Marynen
P, David G)
子(fibroblast growth factor 2 (FGF2) 、heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF))の増殖刺激活性を調節し、これらの増殖因子の刺激によるオートクライン増殖
するガン細胞の増殖を促進する。(J Clin Invest 1998 Nov 1;102(9):1662-73、The cell-surface heparan sulfate proteoglycan glypican-1 regulates growth factor action
in pancreatic carcinoma cells and is overexpressed in human pancreatic cancer.
、Kleeff J, Ishiwata T, Kumbasar A, Friess H, Buchler MW, Lander AD, Korc M)。HGF(hepatocyte groth factor)と結合し、抗原特異的なB細胞のサイトカインに対する
反応性を促進する。細胞と接着分子との会合に関与し細胞の浸潤性に関与する(J Biol Chem 1998 Aug 28;273(35):22825-32、Heparan sulfate proteoglycans as adhesive and anti-invasive molecules. Syndecans and glypican have distinct functions.、Liu W,
Litwack ED, Stanley MJ, Langford JK, Lander AD, Sanderson RD)。これらの知見は
、GPC-1が種々の細胞刺激因子の活性発現に関与することを示している。また、グリピカ
ンファミリー遺伝子の骨髄での発現を確認した報告もある( Biochem J 1999 Nov 1;343 Pt 3:663-8、Expression of proteoglycan core proteins in human bone marrow stroma.、Schofield KP, Gallagher JT, David G)。しかし、これらの報告では、造血幹細胞あるいは造血前駆細胞へのGPC-1の作用について記載されていない。
GenBank登録番号U15209、Mus musculus chemokine MMRP2 mRNA,、U19482、Mus musculus C10-like chemokine mRNA、U49513、Mouse macrophage inflammatory protein-1gamma mRNAのマウス遺伝子と同一の遺伝子である。
マウス由来のものの塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号14に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号15に示す。
高い相同性が確認され、AF131820のマウスオーソログと判断される。また、この配列はWO
00/66784に記載されている。
マウス由来のものの塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号18に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号19に示す。
マウス由来のものの塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号22に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号23に示す。
マウス由来のものの塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号24に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号25に示す。
GenBank登録番号AB009673 Mus musculus mRNA for ADAM23、と同一の遺伝子である。
8に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号29に示す。
×SSC、5×Denhardt、0.5% SDS、50% ホルムアミド、42℃などが挙げられる。
ク質A(ompA)等の原核細胞に適したリーダー配列に置換するか、成熟型タンパク質のN末端部位にメチオニン残基を付加した状態で発現させると良い。
のDNAを発現させるためのプロモーターなどの発現調節配列は、上記遺伝子固有のものであっても、他の遺伝子由来のもの、例えばサイトメガロウイルスプロモーター、エロンゲーションファクター1プロモーター等であってもよい。
イルスベクター(Dilloo, D., Blood, 89:119, 1997)、HIVベクターなどが挙げられる。
貫通領域を欠失した可溶性タンパク質であっても造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有することが予測される。膜貫通領域は、アミノ酸配列に基づいて公知のプログラムにより予測できる。例えば、PSORT IIと呼ばれるプログラム(インターネットにより入手可能、URL: http://psort.nibb.ac.jp/index.html)により予測し
た場合、膜貫通領域は配列番号29において790〜806位のアミノ酸であり、789位までのフラグメントでも造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有することが予測される。
を準備する。標的遺伝子の中にプローブと一致する配列が存在すれば、そのプローブは遺伝子とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズしたことはプローブをRIあるいは蛍光色素でラベルしておくことで、容易に確認できる。ライブラリーのクローンを一つずつピックアップしてメンブランにブロットする。そして、上記のプローブと繰り返しハイブリダイゼーションを行い、各クローンがどのプローブとハイブリダイズしたかを検出する。遺伝子ごとにハイブリダイズするプローブの組み合わせは決まっているので、同一の遺伝子にハイブリダイズするプローブの組み合わせは一定である。すなわち、ハイブリダイズするプローブの組み合わせから同一の遺伝子を一つのグループ(クラスター)として同定することができる。cDNAライブラリーの個々のクローンを、ハイブリダイズするプローブのパターンにより分類、計数することにより、個々の遺伝子のクローンがライブラリー中に何個含まれるか知ることができる。このようにして、各遺伝子のライブラリー中の発現頻度を同定することが可能である。
をストローマ細胞にレトロウィルスベクターを用いて遺伝子導入し、同細胞の造血幹細胞造支持活性の変化を検討した。実際には、遺伝子を導入していないストローマ細胞またはコントロールベクターを導入したストローマ細胞と遺伝子を導入したストローマ細胞のそれぞれと、マウス造血幹細胞を共培養したのち、放射線照射マウスに造血細胞を移植した。移植したマウスでの共培養した造血細胞の生着について検討した。その結果、遺伝子を導入した細胞で共培養した造血幹細胞を移植したマウスでは、遺伝子を導入していない細胞と比較して、移植後のキメリズムが上昇していた。この結果は、遺伝子を発現させたストローマ細胞では、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持する活性が増強されたまたは付与されたことを示す。この結果から、上記の遺伝子の発現は、ストローマ細胞において上記活性を増強または付与する作用を持つことが明らかとなった。したがい、上記の遺伝子の産物は造血幹細胞または造血前駆細胞に作用し、その生存あるいは増殖を支持する活性を有する、あるいは、ストローマ細胞に作用し造血幹細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかになった。
の生体外での増殖または生存の支持に利用することができる。末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植などの造血幹細胞移植療法では、移植する造血幹細胞数が十分量取得できず移植が実施できないときがある。十分量の幹細胞が取得できない場合でも、該ポリペプチドを利用することで造血幹細胞数を試験管内で増幅し、必要量の造血幹細胞を取得し移植することが可能である。すなわち、該ポリペプチドを培養液に含む様な培地で造血幹細胞を培養することで、造血幹細胞を分化させずに増幅することが可能である。その際に、種々のサイトカインを添加し、造血幹細胞をより効率的に増幅することも可能と考えられる。
エチン)、G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor))、TGF-b(トランスフォーミング成長因子-b)、MIP-1a(Davatelis, G., J. Exp. Med.
167:1939, 1988)、などのサイトカインに代表される増殖因子、EPO(エリスロポエチン)のような造血ホルモン、ケモカイン、Wnt遺伝子産物、ノッチリガンドのような分化増
殖調節因子、発生調節因子などがあげられる。
せることで、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を維持することが可能である。この際使用される細胞刺激因子としては、上記に記載してある細胞刺激因子などが挙げられる。
しいものとして挙げられる。培養温度は、通常25〜39℃、好ましくは33〜39℃である。また、培地に添加する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸が挙げられる。CO2は、通常、4〜6%であり、5%が好ましい。
して赤血球を主成分とする造血細胞を人為的に産生することが可能である。
素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Gaucher病、ムコ多糖症等のリ
ソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。
療に用いることができる。造血幹細胞に対する遺伝子治療は、幹細胞が静止期にあり染色体との組換え率が低いこと、また、培養中に幹細胞が分化してしまうこと等から困難であったが、本発明を利用することによって、幹細胞を分化させずに増幅でき、遺伝子導入効率に大幅な改善が見込める。この遺伝子治療は、造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子(治療用遺伝子)を導入し、得られる遺伝子導入細胞を用いて行われる。導入される外来遺伝子は、疾患によって適宜選択される。血液細胞を標的細胞とする遺伝子治療の対象となる疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Wiskott-Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群(AIDS)等の免疫不全症候群、サラセミ
ア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Gaucher病、ムコ多糖症
等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。
イルスベクター、HIVベクター等のウイルス由来の遺伝子治療に用いられる動物細胞用ベ
クター(遺伝子治療用ベクターについては、Verma, I.M., Nature, 389:239, 1997 参照
)を用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーシ
ョン法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。これらの中では、標的細胞の染色体DNAに組み込まれて恒久的に遺伝子の発
現が期待できるという点から、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはHIVベクターが好ましい。
る。まず、野生型アデノ随伴ウイルスDNAの両端のITR(inverted terminal repeat)の間に治療用遺伝子を挿入したベクタープラスミドと、ウイルスタンパク質を補うためのヘルパープラスミドを293細胞にトランスフェクションする。続いてヘルパーウイルスのアデ
ノウイルスを感染させると、AAVベクターを含むウイルス粒子が産生される。あるいは、
アデノウイルスの代わりに、ヘルパー機能を担うアデノウイルス遺伝子を発現するプラスミドをトランスフェクションしてもよい。次に、得られるウイルス粒子を造血幹細胞または造血前駆細胞に感染させる。ベクターDNA中において、目的遺伝子の上流には、適当な
プロモーター、エンハンサー、インシュレーター等を挿入し、これらによって遺伝子の発現を調節することが好ましい。さらに、治療用遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いると、治療用遺伝子が導入された細胞の選択が容易となる。治療用遺伝子は、センス遺伝子であってもアンチセンス遺伝子であってもよい。
を移入することで、造血幹細胞支持能を付与または上昇させることが可能である。
である。上記抗体については後述する。
プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポ
リマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール等が挙げられる。PEGに
よるタンパク質の修飾は、例えば、PEGの活性エステル誘導体とタンパク質を反応させる
方法、あるいは、PEGの末端アルデヒド誘導体とタンパク質とを還元剤の存在下で反応さ
せる方法等によって行うことができる。このようなタンパク質の修飾については、特表平10-510980号に詳細に開示されている。
。
免疫細胞を分離して適当な培養系で感作させる生体外(in vitro)の方法のいずれかの方法によって調製し得る。本発明の抗体を産生し得る免疫細胞としては、例えば脾細胞、扁桃腺細胞、リンパ節細胞などがあげられる。
265,1992 )と共有結合させて用いる。
を動物腹腔内接種して得られる腹水から精製して調製することができる。親細胞としては、例えばX63、NS-1、P3U1、X63.653、SP2/0、Y3、SKO-007、GM1500、UC729-6、HM2.0、NP4-1細胞などがあげられる。また、in vitroで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞にEBウイルスなどの適当なウイルスを感染させ、得られる不死化抗体産生細胞を培養することにより調製することもできる。
(I)マウスAGM由来ストローマ細胞株の取得
(1)マウス胎児のAGM領域の分離
C3H/HeNSLcマウス(日本エスエルシー株式会社より購入)の雌雄をSPF(specific pathogen-free)の環境のもとで飼育した。1ないし2匹の雌を1匹の雄と一晩、同じケージにいれ、翌朝、膣栓の存在が確認された雌マウスを新しいケージに移して飼育した。膣栓の確認された日を懐胎0.5日とした。懐胎10.5日目のマウスを頚椎脱臼により死に至らしめた後、胎児を摘出した。AGMの分離は、Godin等(Godin, I., Proc. Natl. Aacd. Sci. U.S.A., 92:773-777, 1995)、 Medvinsky等(Medvinsky, A.L., Blood, 87:557-565,1996)の方法に準拠して実施した。胎児が浸る程度にPBS(−)(リン酸緩衝生理食塩水)(日水製薬製)を入れた培養皿に胎児を入れ、実体顕微鏡下で、AGM領域を他の領域を含まないように慎重に切除し、新たな24ウェルの培養皿(Nunc社)に移した。
24ウェルの培養皿(Nunc社)に移したAGM領域に、10% FCS(Hyclone社)を含むMEM培地(Sigma社)を一滴加え、一晩、培養器中で培養した。培養は、10% FCS(Hyclone社)を含むMEM培地(Sigma社)、37℃、5% CO2、湿度100%の条件下で行った。一晩の培養で、AGM領域の細胞が培養皿に付着したところで、さらに、2mlの10% FCSを含むMEM培地を添加した。その後、培養を継続することにより、AGM領域組織片の周辺には次第にス
トローマ細胞が出現した。さらに1週間培養を継続した後、接着細胞をトリプシン処理(0.05% トリプシン, 0.53mM EDTA(Gibco BRL社)を含むPBS中、37℃、3〜5分)によって
剥がした後、培地で2回洗浄し、6ウェル培養皿(Nunc社)に播種した。翌日、培養皿に付着しなかった細胞を培地とともに除去し、新たに新鮮な培地を添加した。6ウェル培養皿に移してから2週間後に、内在する造血細胞を除去するため900 Radのγ線を照射した
。この培養系から限界希釈法で直接細胞のクローニングを行ったが、細胞の増殖は認められず、クローニングすることはできなかった。そこで、一つのウェルに播種する細胞数を増やし、少ない細胞からの増殖に耐えられるように細胞を馴化してから限界希釈法によるクローニングを実施することとした。
C57BL/6-Ly5.1 pep(8〜10週齢、雄)(筑波大学 中内啓光教授より供与)の大腿骨内
の骨髄を採取し、PBSに懸濁した。定法に従い(高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社1995)、マウス骨髄単核球細胞画分を比重遠心法により濃縮した後、染色バッファー(5% FCS, 0.05% NaN3を含むPBS)に懸濁し、以下の方法で造血幹細胞分画を取得した(Osawa,
M. et al., Science 273:242-245, 1996)。
化抗原特異的な抗体、CD45R, CD4, CD8, Gr-1, Ter119, CD11c(全てPharmingen社製)を、骨髄単核球細胞懸濁液に添加し、氷中で20分間放置し反応させた。染色バッファーで2回洗浄した後に、セルソーター(FACS Vantage, Becton Dickinson社)により、CD34陰性、Sca-1陽性、c-Kit陽性、Lin陰性細胞を分取した。
持活性の評価
(1)マウスストローマ細胞株のサブクローニング
1)AGM-s3サブクローンの分離
非働化10%FCS(ウシ胎児血清、Hyclone社)を含むMEMα培地(GIBCO BRL社)で継代培
養をしているAGM由来ストローマ細胞株AGM-s3を5% FCS含有PBS(PBS-FCS)に懸濁し、セ
ルソーター(FACS Vantage; Becton Dickinson)を用いて1細胞/ウェルで96ウェル培養皿
(Falcon社)にクローンソーティングを行なった。96ウェル中、細胞が増殖してきたウェルについて拡大培養し、13種のAGM-s3のサブクローンを得た。これらのAGM-s3サブクローンについて造血細胞の支持能を検討した。
ヒト臍帯血は、キリンビール医薬探索研究所倫理委員会の基準に準拠し、正常分娩時に採取した。臍帯血は凝固しないようにヘパリンを添加したシリンジを用いて採取した。ヘパリン処理臍帯血をLymphoprep(NYCOMED PHARMA )に重層し、比重遠心(400G、室温、30
分間)により単核細胞を分離した。単核細胞に混入した赤血球は、塩化アンモニウム緩衝液(0.83% NH4Cl-Tris HCl 20mM, pH6.8)で室温2分間処理して溶血させた。PBS-FCSで
単核細胞を洗浄後、10mgのヒトIgGを添加し、氷冷下、10分間放置した後、さらに細胞をPBS-FCSで洗浄し、ヒト分化血球に特異的な抗原に対するビオチン化抗体すなわち、CD2、CD11c(ATCCハイブリドーマを入手し精製)、CD19(Pharmingen社)、CD15、CD41(Leinco Technologies, Inc.社)、Glycophorin A(コスモバイオ社)に対する抗体を添加し氷冷下、20分間放置した。細胞をPBS-FCSで洗浄後、5% FCS、10mM EDTA、0.05% NaN3を含むPBS(PBS-FCS-EDTA-NaN3)1mlに懸濁し、ストレプトアビジン結合磁性体ビーズ(BioMag, PerSeptive Diagnostics社)を添加して氷冷下、40分間放置した。分化抗原を発現した分化血球をマグネチックセパレーター(Dynal MPC-1, Dynal社)を用いて除去し、残りの分化血球抗原陰性分画にFITC標識抗CD34抗体(Immunotech S.A., Marseilles, France)を添加
し、氷冷下、20分間のインキュベーションの後、セルソーターによりCD34陽性分画を回収した。この細胞集団をヒト臍帯血由来造血幹細胞集団とした。
13種のAGM-s3のサブクローンおよびマウス骨髄由来ストローマ細胞株MS-5のそれぞれを、1x104/ウェルで24ウェル培養皿(Falcon社)に播種し、10% FCSを含むMEMα培地1mlで培養し、細胞がウェルの底一面を覆うまで増殖させた。上記ストローマ細胞上にCD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞を500個/ウェルで重層し、1mlの10% FCSを含むMEMα培地に
て共培養した。共培養開始1週間後に同様の培地1mlをさらに添加した。共培養開始2週間
目にトリプシン処理(0.05% トリプシン、0.5mM EDTAを含むPBS(GIBCO BRL社)で37℃、2〜5分間放置)によりストローマ細胞とヒト血液細胞を同時に培養皿より剥がし、造血幹細胞支持活性をコロニーアッセイにより評価した。
上記共培養系にて増殖した細胞は、適宜稀釈して1mlメチルセルロース培養系に付し、
解析を行なった。メチルセルロース培養系は、MethoCult H4230(Stem Cell Technologies Inc.社)に10ng/ml ヒトSCF、ヒトIL-3、ヒトIL-6、ヒトG-CSF、ヒトTPO、2 IU/ml EPOを添加し、6ウェル培養皿(Falcon社)にて実施した。上記で用いた各種造血因子は、い
ずれもリコンビナント体であり、純粋なものである。2週間の培養の後、出現してきたコ
ロニーを顕微鏡下で観察し、CFU-GM(granulocyte-macrophage colony-forming unit)、BFU-E(erythroid burst forming unit)、および、CFU-E mix(erythrocyte mixed colony-forming unit)の数を計測した。
よび、CFU-E mixのすべての分化系列の細胞の増殖を支持した。特に赤血球系の前駆細胞
であるBFU-E、および、CFU-E mix を維持することは通常困難であるが、A9またはD11細胞との共培養系ではその増殖が認められた。この結果は、A9またはD11細胞との共培養によ
り造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が増殖あるいは維持されることにより、常に赤血球系の前駆細胞が出現してきていることを示している。一方、A7は、その細胞の形態がA9に似ているが、CFU-GM、BFU-E、および、CFU-E mixを支持しなかった。
上記手法を用いて、さらに、AGM-s3サブクローンA9、A7とマウス胎仔由来ストローマ細胞株OP9(RCB1124、理化学研究所 細胞開発銀行)のCD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞
に対する幹細胞支持能の比較をCFU-GM、BFU-E、CFU-E、および、CFU-E mixを指標に、上
記の評価系を用いて実施した。図2に2週間共培養の結果を示す。A7細胞培養系では、CFU-GM、BFU-E、および、CFU-Eの有意な減少が確認され、CFU-E mixは完全に消失していた。一方、OP9細胞ではA9には劣るが、CFU-E mixを含む各種血球前駆細胞が維持されており、造血幹細胞支持能を有することが明らかとなった。
前記の各ストローマ細胞株(AGM-s3-A9、AGM-s3-A7、AGM-s3-G1)、3T3Swiss(ATCC)
、OP9およびNIH3T3(ATCC)を5×104個ずつ24ウエルの培養皿(Falcon社)に播種し、非働化10% FCS(ウシ胎児血清、Hyclone社製)を含むMEMα培地(GIBCO BRL社製)にて1日培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。その後、1mlの新たな培地に交換
し、上記(II)で得たマウス造血幹細胞(C57BL/6-Ly5.1由来)30個をこれらの細胞上
に重層し、培養を開始した。
リバー社)と共に、8.5GyのX線を照射したC57BL/6-Ly5.2(チャールスリバー社、8週齢
、雄)マウスに尾静注より移植した。移植後、経時的に眼窩より末梢血を回収し、FACSによりC57BL/6-Ly5.1 pepマウス由来の細胞数の割合を算定した。定法に従い(高津聖志、
免疫研究の基礎技術、羊土社1995)、末梢血の解析を行った。末梢血50μlに蒸留水を350μl加え、30秒間放置し、赤血球を溶血させた後に、2倍濃度のPBSを加え遠心し、白血球を回収した。細胞を染色バッファー(5% FCS、0.05% NaN3を含むPBS)で1回洗浄した後に、抗CD16抗体、FITC結合抗Ly5.1(CD45.1)抗体、フィコエリスリン結合抗Gr-1抗体お
よびCD11c抗体、ならびに、アロフィコシアニン結合CD90 (Thy1)抗体およびCD45R (B220)抗体(全て、Pharmingen社より購入)を添加し、氷中で30分放置して反応させた後に、染色バッファーで洗浄後、FACS解析を行った。
AGM-s3-A9細胞、AGM-s3-A7細胞、および、OP9細胞のそれぞれをISOGEN(日本国ニッポ
ンジーン)20 mlに溶解し、添付文書に従ってトータルRNAを調製した。トータルRNA 1mg
を用いて、mRNA purification kit(米国Amersham Pharmacia社)のプロトコルに従い、
メッセンジャーRNAを調製した。本メッセンジャーRNAを用いて定法によりcDNAを合成し、pSPORT1(米国GIBO Lifetech社)を用いてcDNAライブラリー(以下、それぞれAGM-s3-A9 cDNA、AGM-s3-A7 cDNAおよびOP9 cDNAともいう)を構築した。本ライブラリーを用いて、
SBH法(米国Hyseq社)により、AGM-s3-A7細胞と比べた場合にAGM-s3-A9細胞あるいはOP9
細胞に特異的に高発現するcDNA断片を有するクローンを取得した。取得したクローンについて、ABI377 DNAシーケンサー(米国Perkin Elmer社)を用いて塩基配列を決定した。
を、それぞれ、SCR-2、SCR-3、SCR-4、SCR-5、SCR-6、SCR-7、および、SCR-8と命名した
。
配列番号1の塩基配列に関し、GenBankデータベースをBLASTを用いて検索することで、SCR-2は、登録番号AF185613のマウス遺伝子Mus musculus glypican-1 (GPC-1)と同一の遺伝子であることが判明した。SCR-2のORF(Open Reading Frame)の塩基配列および同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号8に示す。アミノ酸配列のみを配列番号9に示す。
に示す。アミノ酸配列のみを配列番号11に示す。
SCR-2のORFの塩基配列に基づいてレトロウィルスベクタークローニング用に、下記の塩基配列を有するSCR-2FsalおよびSCR-2Recoプライマーを作製し、OP9 cDNAをテンプレートに用いてPCRを実施した。
CCGGTCGACCACCatggaactccggacccgaggctgg (配列番号30)
SCR-2Reco
CCGAATTCttaccgccacctgggcctggctgc (配列番号31)
を用いてDNA断片の精製を行った。精製DNA断片を、同様にEcoRIおよびXhoIで消化したpMX-IRES-GFPベクター(東大医科研、北村俊雄教授より分与)と連結した。pMX-IRES-GFPベ
クターは、レトロウイルスベクターpMXにIRES(Internal Ribosome Entry Site)、およ
び、GFP(Green Fluorescence Protein)をコードする配列を挿入したプラスミドである
。IRESは、mRNAの途中からリボゾームがアクセスできる。したがい、発現ベクターを構築するときに一つの転写単位の中にIRESを挟んで上流、下流に遺伝子を繋げることで、一つのmRNAから二つの遺伝子を発現させることが可能となる。上記プラスミドでは、上流にSCR-2のcDNAが挿入され、下流に蛍光蛋白質であるGFP(Green Fluorescence Protein)をコードする配列が挿入されており、GFPの発現状況をFACSで検出することによって、SCR-2の発現をモニターすることができる。
むLB寒天培地に蒔き、単一コロニーを形成させた。単離したコロニーを100 μg/mlアンピシリンを含むLB培地100mlで培養後、QIAGENtip100(米国QIAGEN社)を用いてプラスミド
の精製を行った。挿入遺伝子の配列を常法にしたがって決定し、SCR-2のORFの塩基配列と
一致していることを確認した。
コラーゲンタイプIコート60mm dish(旭テクノグラス社)に2×106個のBOSC23細胞を
蒔き、37℃、5% CO2、湿度100%の条件下、10% FCSを含むDMEM培地(GIBCO BRL社)で培養を開始し、12〜18時間後に前記培地をOPTI MEM培地(GIBCO BRL社)2mlで置換した。
釈したLIPOFECTAMINE Reagent(GIBCO BRL社)18μlに加え、30分室温に静置した。調製
したDNA溶液を上記で用意したBOSC23細胞培養液中に添加した。約5時間後に2mlの20% FCSを含むDMEM培地(GIBCO BRL社)を添加した。
した。さらにPOLYBRENE(シグマ、SEQUA-BRENE)を10μg/mlになるように添加し、培養皿を700gで45分遠心後、37℃、5% CO2、湿度100%の条件下で培養した。48時間後、培
地を10% FCSを含むMEMα培地1mlに置換し、さらに24時間後、6wellプレート(FALCON社)に継代し10% FCSを含むMEMα培地3mlで培養した。継代48時間後、セルソーター(FACSVantage、Becton Dickinson社)にてストローマ細胞のGFP発現を確認し、80%以上の細胞
がSCR-2を発現していることを間接的に確認した。
用いて同様の操作を行い、コントロールベクターを導入したストローマ細胞を調製した。
ッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
実施例1の(III)(1)3)〜4)に記載のようにして、レトロウイルスによりSCR-2を強発現させたAGM-s3-A9細胞もしくはAGM-s3-A7細胞、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A9細胞もしくはAGM-s3-A7細胞、または、AGM-s3-A9細胞もしくはAGM-s3-A7細胞を、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞と共培養し、コロニーアッセイにより造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況を評価した。
したときの結果を示す。また、図5にSCR-2を強発現するAGM-s3-A7、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A7またはAGM-s3-A7とを2週間共培養したときの結果を示す。この結
果、SCR-2強発現AGM-s3-A9またはSCR-2強発現AGM-s3-A7で共培養により、BFU-EおよびCFU-Cの増加が認められた。従い、SCR-2を強発現することにより、AGM-s3-A9あるいはAGM-s3-A7の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の支持活性が増強されることが示された。この結
果から、SCR-2の遺伝子産物は、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持する
活性を有するあるいはストローマ細胞に作用し造血細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかとなった。
配列番号2の塩基配列に関し、GenBankデータベースをBLASTを用いて検索することで、SCR-3は、登録番号U15209、Mus musculus chemokine MMRP2 mRNA,、U19482、Mus musculus C10-like chemokine mRNA、および、U49513、Mouse macrophage inflammatory protein-1gamma mRNAのマウス遺伝子と同一の遺伝子であることが判明した。SCR-3のORFの塩基配列および同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号12に示す。アミノ酸配列のみを配列番号13に示す。
SCR-3のORFの塩基配列に基づいてレトロウィルスベクタークローニング用に、下記の塩基配列を有するSCR-3FxhoIおよびSCR-3Reco配列のプライマーを作製し、AGM-s3-A9 cDNA
をテンプレートに用いてPCRを実施した。増幅断片を、実施例2の(1)と同様の方法に
よりレトロウィルスベクターpMX-IRES-GFPに挿入した。
ccgCTCGAGccaccATGAAGCCTTTTCATACTGCC (配列番号32)
SCR-3Reco
tccGAATTCttattgtttgtaggtccgtgg (配列番号33)
上記のレトロウィルスベクターを用いて、実施例2の(2)と同様にしてSCR-3強発現AGM-s3-A7細胞を作製した。
AGM-s3-A7細胞、レトロウイルスによりSCR-3を強発現させたAGM-s3-A7細胞、ならびに
、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A7細胞を、それぞれ、1×105個ずつ24ウエルの培養皿に播種することの他は、実施例1の(III)(2)と同様にして造血幹細胞支持
活性の評価を行った。
判明した。この結果から、SCR-3の強発現により、ストローマ細胞の造血幹細胞または造
血前駆細胞の生存、増殖支持能が増強されることが示された。したがい、SCR-3の発現産
物は造血幹細胞または造血前駆細胞に作用し、その生存あるいは増殖を支持する活性を有する、あるいは、ストローマ細胞に作用し造血幹細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかになった。
配列番号3の塩基配列に関し、GenBankデータベースをBLASTを用いて検索したところ、SCR-4は、登録番号AF131820 Homo sapiens clone 25077 mRNAと高い相同性が確認され、SCR-4はAF131820のマウスオーソログと判明した。また、この配列はWO 00/66784に記載さ
れている。
6に示す。アミノ酸配列のみを配列番号17に示す。
ミノ酸配列を配列番号14に示す。アミノ酸配列のみを配列番号15に示す。
胎児肝臓由来メッセンジャーRNA(米国CLONTECH社)3μgより、オリゴdTプライマー
、逆転写酵素(SuperscriptII、GIBCO-BRL社)を用いてcDNAを合成した。本cDNAを鋳型として、ヒトSCR-4のORF領域を下記の塩基配列を有するプライマーHSCR-4FxhoIおよびHSCR-4RecoRVでPCR増幅し、XhoIで消化した後に、実施例2(1)と同様の方法によりレトロウィルスベクターpMX-IRES-GFPに挿入した。その際、pMX-IRES-GFPは制限酵素EcoRIで消化
の後、KOD DNA合成酵素(東洋紡日本国)を用いて平滑化した後に制限酵素XhoIで消化し
た。
CCGCTCGAGCCACCatgttggctgcaaggctggtgt (配列番号34)
HSCR-4RecoRV
CCGGATATCtcatttctttctgttgcctcca (配列番号35)
上記のレトロウィルスベクターを用いて、実施例2の(2)と同様にしてヒトSCR-4強
発現AGM-s3-A9細胞を作製した。
ーアッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
実施例1の(III)(1)3)〜4)に記載のようにして、レトロウイルスによりSCR-4を強発現させたAGM-s3-A9細胞、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A9細胞、または、AGM-s3-A9細胞細胞を、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞と共培養し、コロニーアッ
セイにより造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況を評価した。
。この結果、ヒトSCR-4強発現AGM-s3-A9との共培養により、BFU-E、ならびにCFU-Cの増加が認められた。従い、ヒトSCR-4を強発現することにより、AGM-s3-A9の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の支持活性が増強されることが示された。この結果から、ヒトSCR-4は、
造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持する活性を有するあるいはストローマ細胞に作用し造血幹細胞支持活性を付与する活性を有することが明らかとなった。
SBH解析で得られた配列番号4の塩基配列には、ORFの存在が推測された。ORFの塩基配
列および同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号18に示す。アミノ酸配列のみを配列番号19に示す。
mRNAと高い相同性が確認され、SCR-5はAF325503のマウスオーソログと判明した。
0に示す。アミノ酸配列のみを配列番号21に示す。
SCR-5のORFの配列に基づいてレトロウィルスベクタークローニング用に、下記の塩基配列を有するSCR-5FxhoIおよびSCR-5Rbluntプライマーを作製し、配列番号23の塩基配列
を有するDNAをテンプレートに用いてPCRを実施し、増幅断片を制限酵素XhoIで消化後、実施例2の(1)と同様の方法によりレトロウィルスベクターpMX-IRES-GFPに挿入した。その際、pMX-IRES-GFPは制限酵素EcoRIで消化の後、KOD DNA合成酵素(東洋紡日本国)を用いて平滑化した後に制限酵素XhoIで消化した。
ccgCTCGAGccaccatgagcacctcgtctgcgcg (配列番号36)
SCR-5Rblunt
tccGTTAACttaatagtcatcatagttca (配列番号37)
上記のレトロウィルスベクターを用いて、実施例2の(2)と同様にしてSCR-5強発現AGM-s3-A7細胞を作製した。
実施例3の(3)と同様にして造血幹細胞支持活性の評価を行った。
した。この結果から、SCR-5の強発現により、ストローマ細胞の造血幹細胞あるいは造血
前駆細胞の生存、増殖支持能が増強されることが示された。したがい、SCR-5の遺伝子産
物は造血幹細胞または造血前駆細胞に作用し、その生存あるいは増殖を支持する活性を有する、あるいは、ストローマ細胞に作用し造血幹細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかになった。
配列番号5の塩基配列をもとにプローブを作製し、AGM-s3-A9 cDNAをハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることで、マウスSCR-6のORFを含む遺伝子を取得した。
に従ってトータルRNAを調製した。トータルRNA 1mgを用いて、mRNA purification kit(
米国Amersham Pharmacia社)のプロトコルに従い、メッセンジャーRNAを調製した。調製
したメッセンジャーRNA 2μgより、SMART cDNAライブラリー作製キット(米国CLONTECH)を用いて、添付文書に従ってcDNAライブラリーを15画分に分けて作製した。本ライブラリーは、独立なクローンを合計で約40万種類含んでいた。各画分について以下の条件にてPCRを実施し、SCR-6 cDNAを含む画分を同定した。
からなる工程を1サイクルとして35サイクルのPCRを実施した。
AGCTCATTACTGTATATTTA (配列番号22:1971-1990) (配列番号38)
SCR-6R
GCTATATTTCATAAGTCATC (配列番号22:2330-2349) (配列番号39)
各1枚ずつプラークを写しとった。転写したナイロンフィルターに対し添付文書に従ってDNAの固定処理を行い、32P標識したDNAプローブにてスクリーニングを実施した。
遺伝子断片を含むプラスミドを鋳型として、94℃、30秒、55℃、30秒、72℃、1分からなる工程を1サイクルとして35サイクルのPCRを実施した。PCR産物を2%アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片をJETSORBを用いて精製した。得られたPCR断片25ngを鋳型として、Megaprime labeling kit(米国Amersham Pharmacia社)を用いて、32P標識したDNAプローブを調製した。
22に示す。アミノ酸配列のみを配列番号23に示す。
cDNAデータベースより相同性を持つヒト遺伝子配列HJ08186Rを見出した。HJ08186Rは、
マウスSCR-6の319番目のグアニンから917番目のアデニンまでの部分と高い相同性を有し
ているがORF全長をコードしていないと予測された。
(配列番号49)を調製した。DNAポリメラーゼおよび酵素反応系にKOD-PLUS- (東洋紡 #KOD201)を用い、添付のプロトコールに従って3’-RACEを行った。5’側プライマーにKF30
5Xを、3’側プライマーにMarathon Ready cDNA(CLONTECH社)添付のAP1プライマーを用い
た(終濃度各0.2 μM)。鋳型DNAには、 Marathon Ready cDNA Human Fetal Liver (CLONTECH社#7403-1) を用いた。PCRはGeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems社)で行った。増幅反応は、94℃・5分、(94℃・10秒、72℃・4分)を5サイクル、(94℃・10秒
、70℃・4分)を5サイクル、(94℃・10秒、68℃・4分)を20サイクル、72℃・7分、4℃
の条件で行った後、この増幅産物の1/50量(1 μL)を鋳型DNAとして、5’側プライマー
にKF305Xを、3’側プライマーにAP2プライマーを用いて(終濃度各0.2 μM)更に2次増幅を行った。増幅反応は、94℃・5分、(94℃・10秒、72℃・4分)を5サイクル、(94℃・10秒、70℃・4分)を5サイクル、(94℃・10秒、68℃・4分)を35サイクル、72℃・7分、4℃の条件で行った。この結果、約2 kbの増幅バンドを得た。
。このDNA断片をpGEM-T Easyベクター(Promega社)へ常法によりクローニングした。
れる塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号47に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号48に示す。この配列は、732bpのORF(配列番号47の塩基番号18-749)が存在し、マウスSCR-6コード領域と塩基配列で92.3%、アミノ酸配列で95.9%の相同性が認
められ、ヒトSCR-6と判断された。なお、ホモロジー解析は、DNASIS version 3.7(日立
ソフトウェアエンジニアリング社)を用いて行った。
SCR-6のORFの塩基配列に基づいてレトロウィルスベクタークローニング用に、下記の塩基配列を有するSCR-6FxhoIおよびSCR-6Recoプライマーを作製し、配列番号22の塩基配
列を有するDNAをテンプレートに用いてPCRを実施し、増幅断片を実施例2の(1)と
同様の方法によりレトロウィルスベクターpMX-IRES-GFPに挿入した。
ccgctcgagccaccATGCGTTTTTGCCTCTTCTC (配列番号41)
SCR-6Reco
cggaattcTTATTGGTTCACTCTGTCTG (配列番号42)
上記のレトロウィルスベクターを用いて、実施例2の(2)と同様にしてSCR-6強発現AGM-s3-A9細胞を作製した。
ッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
実施例1の(III)(1)3)〜4)に記載のようにして、レトロウイルスによりSCR-6を強発現させたAGM-s3-A9細胞、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A9細胞、または、AGM-s3-A9細胞を、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞と共培養し、コロニーアッセイ
により造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況を評価した。
養した結果を示す。この結果、SCR-6発現AGM-s3-A9との共培養により、BFU-E、ならびにCFU-Cの増加が認められた。従い、SCR-6を強発現することにより、AGM-s3-A9の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の支持活性が増強されることが示された。この結果から、SCR-6の
遺伝子産物は、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持する活性を有するあるいはストローマ細胞に作用し造血細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかとなった。
SBH解析で得られた配列番号6の塩基配列には、ORFの存在が推測された。ORFの塩基配
列および同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号24に示す。アミノ酸配列のみを配列番号25に示す。
SCR-7のORFの塩基配列に基づいてレトロウィルスベクタークローニング用に、下記の塩基配列を有するSCR-7FsalIおよびSCR-7Recoのプライマーを作製し、配列番号24の塩基
配列を有するDNAをテンプレートに用いてPCRを実施し、増幅断片を実施例2の(1)
と同様の方法によりレトロウィルスベクターpMX-IRES-GFPに挿入した。
acgcgtcgacccaccATGCCCCGCTACGAGTTG (配列番号43)
SCR-7Reco
attGAATTCTCACTTCTTCCTCCTCTTTG (配列番号44)
上記のレトロウィルスベクターを用いて、実施例2の(2)と同様にしてSCR-7強発現AGM-s3-A9細胞を作製した。
ッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
実施例1の(III)(1)3)〜4)に記載のようにして、レトロウイルスによりSCR-7を強発現させたAGM-s3-A9細胞、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A9細胞、または、AGM-s3-A9細胞を、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞と共培養し、コロニーアッセイ
により造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況を評価した。
培養したときの結果を示す。この結果、SCR-7強発現AGM-s3-A9との共培養により、BFU-E
、ならびにCFU-Cの増加が認められた。従い、SCR-7を強発現することにより、AGM-s3-A9
の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の支持活性が増強されることが示された。この結果から、SCR-7の遺伝子産物は、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖、生存を支持する活性
を有する、あるいはストローマ細胞に作用し造血細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかとなった。
配列番号7の塩基配列に関し、GenBankデータベースをBLASTを用いて検索することで、SCR-8は、登録番号AB009673 Mus musculus mRNA for ADAM23、と同一の遺伝子であること
が判明した。SCR-8のORFの塩基配列および同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号26に示す。アミノ酸配列のみを配列番号27に示す。
SCR-8のORFの塩基配列に基づいてレトロウィルスベクタークローニング用に下記の塩基配列を有するSCR-8FxhoおよびSCR-8Recoプライマーを作製し、AGM-s3-A9 cDNAをテンプレートに用いてPCRを実施し、増幅断片を実施例2の(1)と同様の方法によりレトロウィ
ルスベクターpMX-IRES-GFPに挿入した。
ccgctcgagccaccATGAAGCCGCCCGGCAGCATC (配列番号45)
SCR-8Reco
cggaattcTCAGATGGGGCCTTGCTGAGT (配列番号46)
上記のレトロウィルスベクターを用いて、実施例2の(2)と同様にしてSCR-8強発現AGM-s3-A9細胞を作製した。
ッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
実施例1の(III)(1)3)〜4)に記載のようにして、レトロウイルスによりSCR-8を強発現させたAGM-s3-A9細胞、コントロールベクターを導入したAGM-s3-A9細胞、または、AGM-s3-A9細胞を、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞と共培養し、コロニーアッセイ
により造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況を評価した。
の結果、SCR-8発現AGM-s3-A9との共培養により、BFU-EおよびCFU-Cの増加が認められた。従い、SCR-8を強発現することにより、AGM-s3-A9の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の支持活性が増強されることが示された。この結果から、SCR-8の遺伝子産物は、造血幹細胞
または造血前駆細胞の増殖、生存を支持する活性を有する、あるいはストローマ細胞に作用し造血細胞支持活性を増強または付与する活性を有することが明らかとなった。
Claims (13)
- 以下の(A)または(B)のポリペプチドをコードするDNA。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。 - 以下の(a)または(b)のDNAである請求項1記載のDNA。
(a)配列番号47において塩基番号18〜746からなる塩基配列を少なくとも有するDNA。
(b)(a)に記載の塩基配列を有するDNAまたは同DNAから調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 前記ストリンジェントな条件が、6×SSC、5×Denhardt、0.5% SDS、68℃(SSC;3M NaCl
、0.3M クエン酸ナトリウム)(50×Denhardt;1% BSA、1% ポリビニルピロリドン、1% Ficoll 400)または6×SSC、5×Denhardt、0.5% SDS、50% ホルムアミド、42℃である請
求項2記載のDNA。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAを発現可能な形態で含む発現ベクター。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAが発現可能な形態で導入された細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAの発現産物であり、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。
- 配列番号48のアミノ酸配列、または、このアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有する請求項6記載のポリペプチド。
- ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、ポリ(N-ビニル−ピロリドン)、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコ
ポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールのいずれか、またはそれらの2種以上の組合わせによって修飾された請求項6又は7に記載のポリペプチド。 - 請求項6〜8のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体。
- 以下の(A)または(B)のポリペプチドをコードするDNAが発現したストローマ細胞を造血幹細胞または造血前駆細胞と共培養することを含む、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。 - DNAが以下の(a)または(b)のDNAである請求項10記載の方法。
(a)配列番号47において塩基番号18〜746からなる塩基配列を少なくとも有するDNA。
(b)(a)に記載の塩基配列を有するDNAまたは同DNAから調製され得るプローブ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 以下の(A)または(B)のポリペプチドであって、その存在下で造血幹細胞または造血前駆細胞を培養したときに造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を示すポリペプチドの存在下で造血幹細胞または造血前駆細胞を培養することを含む、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する方法。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。 - 以下の(A)または(B)のポリペプチドであって、その存在下で造血幹細胞または造血前駆細胞を培養したときに、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を示すポリペプチドを有効成分として含む、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得る医薬組成物。
(A)配列番号48のアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチド。
(B)(A)に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持する活性を有するポリペプチド。
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