CN116836227B - 一种合成多肽在维持干细胞干性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞干性研究技术领域，提供了一种合成多肽在维持干细胞干性中的应用，本发明通过实验证明H10多肽能够有效的促进间充质干细胞中OCT4基因、SOX2基因、KLF4基因和NANOG基因的表达，及时经过多次传代，仍可以高水平的表达干性基因，表明H10多肽可以有效的维持间充质干细胞的干性。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞干性研究技术领域，更具体的，涉及一种合成多肽在维持干细胞干性中的应用。
背景技术
干细胞(stem cell，SC)是一类具有自我复制能力、多潜能未分化细胞，是一类比较原始的细胞，在一定条件之下可以分化成具有多种功能的细胞。干细胞按照发育状态，可以分成胚胎干细胞和成体干细胞，按照细胞分化的潜能可以分成全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
干细胞的自我更新和干性(stemness)维持依赖于干性基因的表达，常见的干性基因包括OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、c-Myc等，因此干性基因的表达也是衡量干细胞干性的标志。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等，是组织再生和疾病治疗的理想候选细胞。考虑到骨髓捐献的不足和组织细胞中MSC的比例极低，体外扩增是MSC应用的必要步骤。
然而，许多MSC伴随着长期体外传代其分化能力显著降低，如表现出异常的形态、特异性表面抗原的表达减少、菌落形成和增殖下降、分化潜能降低等，最终导致MSCs失去了组织再生所需的能力(即干性)，导致治疗效果不佳。这已成为阻碍MSCs细胞治疗临床应用的关键问题。如何在连续传代后保持间充质干细胞的干性，是细胞治疗领域亟待解决的一个挑战。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种H10肽。
本发明的第二个目的是提供含有一种H10肽的产品。
本发明的第三个目的是提供一种H10肽的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种H10肽，所述H10肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
该H10肽的氨基酸序列如下：Ac-Lys-Val-Arg-(D)Pro-Ile-Ser-Met-Ser-Thr-Leu，其中第一位的赖氨酸为乙酰化(Ac)修饰，第四位为D型脯氨酸。
优选的，所述H10肽在维持间充质干细胞干性中的应用。
更优选的，H10肽能够维持传代的间充质干细胞的干性；H10肽能够维持传代15代的间充质干细胞的干性。
本发明还提供所述H10肽提高间充质干细胞中干性基因OCT4、SOX2、KLF4和NANOG的表达的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种合成多肽在维持干细胞干性中的应用，属于干细胞技术领域。本发明通过实验证明H10多肽能够有效的促进间充质干细胞中OCT4基因、SOX2基因、KLF4基因和NANOG基因的表达，及时经过多次传代，仍可以高水平的表达干性基因，表明H10多肽可以有效的维持间充质干细胞的干性。
附图说明
图1为不同浓度的H10肽对间充质干细胞的增殖的影响；
图2为H10肽对干细胞干性相关基因表达量的影响；
图3为不同浓度的H10肽对间充质干细胞的增殖的影响；
图4为H10多肽对间充质干细胞的细胞干性相关基因的表达的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1多肽的设计和合成
设计来源于不同种属(人、犬、大鼠、小鼠、马、树鼩)的干细胞因子(SCF)的衍生肽，序列如下表1。
表1
| 命名 | 序列 |
| Peptide A | Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-Asn-Tyr-Ser |
| Peptide B | Ile-Ser-Glu-Met-Val-Val-Gln-Leu-Ser |
| Peptide C | Lys-Glu-Asn-Ser-Ser-Lys-Asp-Leu-Lys-Lys-Ser-Phe |
| Peptide D | Ala-Lys-Asn-Pro-Pro-Gly-Asp-Ser-Ser-Leu-His |
| Peptide E | Glu-Cys-Thr-Glu-Gly-Tyr-Ser-Phe-Glu-Asn-Val |
| Peptide F | Ala-Leu-Pro-Ala-Phe-Phe-Ser-Leu-Val-Ile-Gly-Phe-Ala-Phe-Gly-Ala-Leu-Tyr |
| Peptide G | Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp-Ile-Thr-Lys-Leu-Val-Ala-Asn-Leu |
| Peptide H | Lys-Val-Arg-Pro-Ile-Ser-Met-Ser-Thr-Leu |
| Peptide I | Tyr-Trp-Lys-Lys-Gln-Pro-Asn-Leu-Thr-Arg-Ala-Val-Glu-Asn |
| Peptide J | Lys-Thr-Gln-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn |
采用固相合成法合成上述肽各50mg，纯度＞95％。
实施例2大鼠骨髓间充质干细胞的提取及原代培养
用颈椎脱臼法处死SD大鼠，70％乙醇消毒后，剪开股骨皮肤，分离股骨上的肌肉，从关节两端剪断股骨，放在盛有无菌PBS平皿中，剔除肌肉并用无菌PBS液冲洗3次。将股骨中间剪断，用注射器吸取低糖DMEM培养液(含肝素1mL/L)反复冲洗骨髓腔，以冲出骨髓，用注射器反复冲打骨髓液，依次通过7号和4号针头，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液离心(1500r/min，min)，弃上清。加入含10％FBS的DMEM-F12完全培养基，吹打散细胞。计数细胞并以107个/mL的密度接种在培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。每3d更换培养液，以除去不贴壁的造血细胞。直至细胞长满至80％-90％，进行传代。传代的细胞经胰酶消化后，将细胞转移至离心管，1500r/min、10min离心，去上清，加入间质干细胞的完全培养液重悬细胞。按照10000个细胞/cm2的密度来接种细胞。加足够的间质干细胞的完全培养液培养。
实施例3多肽的活性选择
利用间充质干细胞干性基因OCT4的表达水平对候选多肽进行活性筛选，步骤如下：
一、提取RNA
(1)分别将传代5代(P5)、10代(P10)、15代(P15)的大鼠骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，细胞贴壁之后，分别设立对照组和试验组，对照组用培养基处理96h，试验组用50μg/ml H10多肽处理96h；
(2)处理结束之后，移除培养基，加入1ml Trizol处理细胞，使用移液器反复吹打细胞，静置5min后将细胞转移至无酶EP管中；
(3)加入200μl氯仿，震荡混匀之后，在室温下静置10min；
(4)将EP管置于离心机中，12000r/min，4℃，离心10min；
(5)离心结束后，吸取上清至新的EP管中，加入500μl预冷的异丙醇混匀，放置于冰上静置10min；
(6)将EP管放置于离心机中，12000r/min，4℃，离心10min；
(7)去除上清，保留白色沉淀，加入1ml 75％乙醇溶液将沉淀混匀；
(8)将EP放置于离心机中，8000r/min，4℃，离心5min；
(9)离心结束后，小心的去除上清，室温下静置10min，待RNA干燥之后，加入25μlDEPC水溶解RNA。
二、逆转录
(1)将基因组中的DNA去除
使用RNase-free的DNaseI(Promega)，按表2体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。
表2
| 反应试剂 | 添加量 |
| RNA | 20μl |
| DNase I | 20μl |
| 10×buffer | 10μl |
| RNase inhibitor | 0.5μl |
| H2O(RNase free) | 49.5μl |
| 总体积 | 100μl |
(2)逆转录反应
按表3反应体系配制反应液，进行逆转录，反应条件为：30℃保温10min，42℃保温60min，85℃保温10min。
表3
| Total RNA | 1.0μg |
| Oligo(dT) | 0.5μl |
| Random primer | 0.5μl |
| 10mM dNTP | 2.0μl |
| RNase inhibitor | 0.5μl |
| 5 x buffer | 4.0μl |
| M-MLV | 0.5μl |
| H2O | 12μl |
| 总体积 | 20.0μl |
三、荧光定量PCR
使用表4引物进行OCT4基因的扩增，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因作为内参。
表4引物序列
反应体系如表5。
表5
荧光定量PCR反应条件：预变性95℃200s；然后95℃20s、55℃20s、72℃20s作为一个循环，共40个循环。
四、计算mRNA的相对表达量。
应用2-△△ct法计算分析各个反应样品中OCT4基因的相对表达量。
结果：如图1，可以看出，与生理盐水对照相比，设计的多肽大多数能够促进干细胞基因OCT4的表达，其中Peptide H促进作用最强。因此筛选出Peptide H肽进行后续研究。
实施例4Peptide H肽的修饰及对比肽的合成
对Peptide H肽进行修饰以提高其稳定性，修饰位点为：第一位氨基酸(Lys)进行乙酰化(Ac)修饰，第四位氨基酸(Pro)替换为D型脯氨酸(Pro)，并采用固相合成法合成该修饰肽50mg，纯度＞95％。合成的修饰肽序列为：Ac-Lys-Val-Arg-(D)Pro-Ile-Ser-Met-Ser-Thr-Leu。
对比例1
采用固相合成法合成对比例1肽50mg，纯度＞95％。合成的对比例1肽序列为：Lys-Val-Arg-Pro-Ile-Ser-Met-Ser-Thr-Leu，即不对第一位氨基酸(Lys)进行乙酰化(Ac)修饰，且第四位氨基酸(Pro)也不是D型氨基酸。
对比例2
采用固相合成法合成对比例2肽50mg，纯度＞95％。合成的对比例2肽序列为：Ac-Lys-Val-Arg-Pro-Ile-Ser-Met-Ser-Thr-Leu，即对第一位氨基酸(Lys)进行乙酰化(Ac)修饰，但第四位氨基酸(Pro)不是D型氨基酸。
对比例3
采用固相合成法合成对比例3肽50mg，纯度＞95％。合成的对比例3肽序列为：Lys-Val-Arg-(D)Pro-Ile-Ser-Met-Ser-Thr-Leu，即不对第一位氨基酸(Lys)进行乙酰化(Ac)修饰，但第四位氨基酸(Pro)是D型氨基酸。
实施例5稳定性检测
采用HPLC法测定实施例4和对比例1、对比例2和对比例3制备样品在不同放置时间后的纯度，评价样品的稳定性。
HPLC方法的建立：采用如下色谱系统和色谱条件进行样品的HPLC检测。
仪器：Thermo U3000 HPLC系统，配置LPG-3400SD泵，WPS-3000自动进样器，VWD-3100紫外检测器，TCC-3000柱温箱；
色谱柱：Synergi 4μm Hydro-RP(4.6*150mm，4μm)；
流动相：A，0.1％Trifluoroacetic in 100％water；
B，0.1％Trifluoroacetic in 100％acetonitrile；
柱温：45℃；
检测波长：220nm；
流速：1mL/min；
进样量：15μL；
洗脱程序如表6。
表6
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 98 | 2 |
| 10 | 90 | 10 |
| 15 | 85 | 15 |
| 30 | 60 | 40 |
| 30.1 | 0 | 100 |
将样品各称取5mg，每个样品分装6支EP管，密闭避光保存，置于稳定箱中保存，保存条件为45℃、75％的相对湿度。各样品分别放置0、1、5、10、20、30天后取样分析，以前述建立的HPLC方法进行样品纯度分析，采用面积归一法确定主峰纯度。
各样品均重复进样2次，取2次测定均值作为最终结果。
样品稳定性结果如图2所示，可以看出，实施例4制备的样品在放置30天后，主峰纯度没有明显的下降，而对比例1、2、3制备的样品的主峰纯度均有明显的下降，其中对比例3制备的样品主峰纯度下降最明显，结果表明实施例4进行的修饰能够明显的改善Peptide H多肽的稳定性。
综上，最终选定实施例4的修饰肽用于后续研究，并重修命名为H10肽。
实施例6 H10肽对间充质干细胞增殖的影响
实验过程如下：
(1)将传代3代(P3代)的大鼠骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔接种1000个细胞，每孔100μl，并设置1个不含有细胞的空白孔；
(2)细胞贴壁后，分别使用0(培养基对照)、10、20、50、100μg/ml H10多肽处理细胞，每组设置有3个复孔；
(3)将细胞培养板置于细胞培养箱中继续培养72h；
(4)培养结束后，去除培养基，在避光情况下，每孔加入10μl CCK-8，孵育3h之后，置于450nm下检测各组的吸光度。
结果：各组间充质干细胞的增殖见图3，可以看出不同浓度的H10肽均可促进间充质干细胞的增殖，其中，20-100μg/ml的促进作用具有统计学差异(P＜0.01)，表明H10肽对间充质干细胞的增殖具有显著的作用。
实施例7 H10多肽对间充质干细胞的细胞干性相关基因的调控
一、提取RNA
同实施例3。
二、逆转录
同实施例3.
三、荧光定量PCR
使用表7引物进行OCT4、SOX2、NANOG、KLF4基因的扩增，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因作为内参。
表7引物序列
反应体系如表5。
荧光定量PCR反应条件：预变性95℃200s；然后95℃20s、55℃20s、72℃20s作为一个循环，共40个循环。
四、计算mRNA的相对表达量。
应用2-△△ct法计算分析各个反应样品中OCT4、SOX2、NANOG和KLF4基因的相对表达量。
结果：实验所得到的结果见图4，从图中可以看出，50μg/ml H10多肽处理的大鼠间充质干细胞(实验组)，无论传代5代、10代、15代，其干细胞干性相关基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4基因的相对表达量均显著高于相应的对照组，且有统计学意义(P＜0.01)。上述结果说明，使用H10多肽处理大鼠骨髓间充质干细胞后，细胞高表达干细胞干性相关基因，并且连续传代后，干性相关基因仍然能够高水平表达，因而H10多肽可以有效的维持连续传代的间充质干细胞的干性。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种H10肽，其特征在于，所述H10肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其第一位氨基酸进行乙酰化修饰，第四位氨基酸为D型脯氨酸。
2.权利要求1所述H10肽在促进间充质干细胞增殖方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，H10肽的浓度为20-100μg/ml。
4.权利要求1所述H10肽在维持间充质干细胞干性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，H10肽能够维持传代的间充质干细胞的干性。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，H10肽能够维持传代15代的间充质干细胞的干性。
7.权利要求1所述H10肽提高间充质干细胞中干性基因OCT4、SOX2、KLF4和NANOG的表达的应用。
8.根据权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，H10肽浓度为50μg/ml。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，H10肽浓度为50μg/ml。
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