CN113881707A - 调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品、方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了转录生长因子诱导蛋白(TGFBI)是hUC‑MSCs中高表达的一种免疫相关分子。并发现TGFBI可以调控hUC‑MSCs免疫抑制作用,并且是通过调控T细胞增殖实现。基于此,发明人将TGFBI用于制备调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品,为临床治疗提供理论与应用指导。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品、方法及用途。
背景技术
人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stemcells,hUC-MSCs)是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞,具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的多向分化潜能和强大的免疫调节作用。hUC-MSCs因其取材方便,无道德伦理争议,可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大,分泌细胞生长因子种类多,便于扩增和传代,同时无配型、排异等优点,成为临床研究和应用的理想MSCs来源。经典的骨髓来源MSCs存在年龄的差异和传代的老化等现象,脂肪组织来源的MSCs的成骨分化能力较弱并且可以体外促进肿瘤的生长。hUC-MSCs与其他来源的MSCs具有相似的生物学特性,可以自我更新并保持多能性,且hUC-MSCs不存在年龄的差异,另外脐带组织属于正常分娩的废弃物,也不存在伦理的问题,因此脐带组织来源的MSCs应该是细胞治疗的良好来源,具有更广阔的临床应用前景。
免疫抑制功能是MSCs独特的生物学特性和被应用与研究的基础。MSCs强大的免疫调节作用体现在:1)MSCs具有低免疫原性,其表面低表达MHC I类分子,不表达MHC II类分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86,可诱导免疫耐受,不引起自身反应性T细胞增殖,保证了移植后不引起宿主免疫排斥反应,可在宿主内存活并发挥功能。2)MSCs具有较强的免疫调节功能,它可通过细胞间接触和分泌细胞因子抑制免疫细胞,如T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的增殖和功能,抑制Th1的分化,促进Tregs分化,调控巨噬细胞由M1型向M2型极化,并在体内和体外调节抗原提呈细胞的活性,从而抑制机体的炎症反应,达到治疗自身免疫型糖尿病即I型糖尿病(Type I diabetes mellitus,T1DM)、急性移植物抗宿主病(acutegraft versus host disease,aGvHD)等炎性疾病的目的。
然而,目前对MSCs的免疫调控机制的研究并不十分深入,在临床转化中其疗效亦不如预期。为了进一步探究MSCs的免疫调控机制及其对T1DM的疗效的影响,目前国内外均未见TGFBI调控MSCs发挥免疫抑制作用及其分子机制的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新的免疫调节分子TGFBI介导人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)调控T细胞增殖作用;并提供TGFBI在制备调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品中的应用。
为实现上述目的,本发明具体技术方案如下:
本发明发现TGFBI在脐带MSC中高表达;通过将敲低TGFBI基因表达的hUC-MSCs与T细胞共培养实验发现,TGFBI可以调控人脐带间充质干细胞抑制T细胞增殖作用。
基于此,本发明第一方面提供了TGFBI在制备调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品中的应用。
进一步地,所述TGFBI敲低后脐带间充质干细胞免疫抑制作用显著降低。
进一步地,所述脐带间充质干细胞免疫抑制作用包括脐带间充质干细胞对T细胞增殖抑制作用。
在本发明中,所述TGFBI敲低的脐带间充质干细胞对T细胞增殖的抑制作用显著减弱。所述hUC-MSCs中的TGFBI可以通过调节T细胞中的CyclinD2的表达而抑制T细胞增殖。
第二方面,本发明提供了一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的制剂,所述制剂包括能够抑制或促进间充质干细胞中TGFBI表达的制剂。
进一步地,所述抑制间充质干细胞中TGFBI表达的技术包括小分子抑制剂,RNA干扰和CRISPR/Cas系统。
优选地,RNA干扰技术。
进一步地,所述RNA干扰包括采用TGFBI的shRNA或siRNA抑制TGFBI表达。
进一步地,所述TGFBI的shRNA或siRNA的干扰靶序列包括如SEQ ID NO:5~7所示的核苷酸序列,优选地,SEQ ID NO:6。
第三方面,本发明提供了一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)构建慢病毒sh-TGFBI载体构建,并转染脐带间充质干细胞;
(2)将转染慢病毒sh-TGFBI载体的间充质干细胞与T淋巴细胞共培养。
进一步地,所述步骤(2)中T淋巴细胞同时用anti-CD3抗体刺激活化。
优选地,使用1μg/ml anti-CD3抗体刺激活化T细胞。
在一具体的实施方案中,anti-CD3抗体用PBS稀释为1μg/ml,加入到96孔板(50μl/孔),转移至37℃孵育2h;弃掉96孔板的包被液,分别用PBS洗涤2次,按照MSC:T=1:5的比例分别加入经CFSE染色的T淋巴细胞和sh-TGFBI-hUC-MSCs,共培养72h;
基于上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
本发明发现转录生长因子诱导蛋白(TGFBI)在hUC-MSCs中持续稳定高表达,并发现TGFBI可以调控hUC-MSCs免疫抑制作用,并且是通过调控T细胞增殖实现。证实了TGFBI可以作为脐带MSC新的免疫抑制分子,为临床使用脐带MSC治疗系统性红斑狼疮、I型糖尿病、自身免疫性脑脊髓炎、骨关节炎等自身免疫性疾病提供了理论基础和治疗靶点。
附图说明
图1q-PCR检测TGFBI在连续传代的hUC-MSCs中表达情况。
图2A:流式细胞术检测3中shRNA转染效率;B:q-PCR验证3种shRNA对hUC-MSCs的敲低效率;C:荧光显微镜观察转染sh-TGFBI的hUC-MSCs绿色荧光蛋白表达;D:Western Blot检测经慢病毒敲低hUC-MSCs的敲低效率;E:q-PCR检测经慢病毒敲低hUC-MSCs的敲低效率。
图3sh-TGFBI-hUC-MSCs抑制T细胞增殖;A:流式细胞术检测共培养后T细胞增殖比例;B:T细胞增殖比例统计结果。
图4A:q-PCR检测共培养T细胞CyclinD2的mRNA表达差异;B:Western blot检测共培养T细胞CyclinD2的蛋白表达差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1 TGFBI在hUC-MSCs持续稳定高表达
培养hUC-MSCs细胞:首先按照常规方法从人脐带组织分离获取原代人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)培养后,接种于15mlα-MEM+10%胎牛血清(FBS)的完全培养基中培养P1代hUC-MSCs,细胞融合度达80%-90%后,经0.125%胰酶消化传代。对P3代hUC-MSCs进行连续传代至P10代,并采用TRIzol法分别提取不同代数的细胞总mRNA,利用总RNA 1μg、RNAfree water、Oligo dT 1μL、Random 1μL、5×M-MLV Buffer 4μL、DTT 2μL、dNTP 1μL、M-MLV1μL、RNase inhibitor 1μL制备逆转录混合反应液20μL,在PCR扩增仪上进行逆转录反应(70℃,10min;42℃,1h;70℃,10min),反应结束后,逆转录产物cDNA置于冰上或储存于-20℃保存。q-PCR检测检测TGFBI的表达,并与内参GAPDH以及hUC-MSCs经典的免疫负调控分子TGF-β进行基因表达差异分析,其中q-PCR引物序列如SEQ ID NO:1-4所示。反应体系:cDNA1μL,PCR上下游引物(10μM)1μL,PT-PCR Master Mix 10μL和RNA free water 8μL;反应条件:95℃10min,95℃15s,60℃1min,共40个循环;95℃15s,60℃1min,95℃15s。GAPDH作为内参,数据采用法进行分析。
引物序列如下:
TGFBI上游引物:5’-CAGAAGGTTATTGGCACTAATAGG-3’,SEQ ID NO:1;
TGFBI下游引物:5’-CTGATGACTGTTGATTTGCCA-3’,SEQ ID NO:2。
GAPDH上游引物:5’-TCAAGATCATCAGCAATGCC-3’,SEQ ID NO:3;
GAPDH下游引物:5’-CGATACC AAAGTTGTCATGGA-3’,SEQ ID NO:4。
结果如图1所示,q-PCR检测TGFBI在连续传代的hUC-MSCs中表达:hUC-MSCs经过连续传代,以内参GAPDH及hUC-MSCs经典负调控分子TGF-β为参照,说明hUC-MSCs中TGFBI的mRNA含量持续稳定高表达。
实施例2 sh-TGFBI慢病毒载体转染hUC-MSCs
利用慢病毒构建sh-TGFBI载体感染hUC-MSCs,获得稳定表达的sh-TGFBI-hUC-MSCs,所述慢病毒构建载体为GV493(吉凯基因)。所述sh-TGFBI的靶序列包括如下三组:
TGFBI-RNAi(85681-11):5’-CACCACTATCCTAATGGGATT-3’,SEQ ID NO:5;
TGFBI-RNAi(85682-1):5’-TGCCAAGGAACTTGCCAACAT-3’,SEQ ID NO:6;
TGFBI-RNAi(85683-1):5’-GCCCTACCACTCTCAAACCTT-3’,SEQ ID NO:7。
将复苏的hUC-MSCs P2代细胞接种至六孔板中,接种细胞数为1×105。用含有4μl/ml HiTransG P(REVG005,吉凯基因)的10%FBS的α-MEM完全培养基换液,加入病毒悬液,(滴度为MOI=10,转染病毒量为1×107/ml),转染24h后更换培养基为2ml含10%FBS的α-MEM完全培养基,并进行扩增培养,转染48h后加入嘌呤霉素(2μmol/ml)进行药物抗药基因筛选72h,更换新鲜培养基进行细胞扩增,待细胞融合度达80%-90%左右,胰酶消化后传代扩增培养。首先通过流式细胞术及q-PCR验证3种shRNA转录效率及敲低效率。结果如图2A,三种shRNA的转染效率均在90%以上。图2B显示,TGFBI-RNAi(85682-1)对TGFBI的敲低效率最高,故应用于后续实验中。进一步对hUC-MSCs转染空载病毒及敲减TGFBI的慢病毒,使用荧光显微镜观察转染空载病毒的hUC-MSCs(sh-NC-MSCs)以及转染敲减TGFBI慢病毒的hUC-MSCs(sh-TGFBI-MSCs)绿色荧光蛋白表达情况。
结果如图2C所示,通过荧光显微镜观察转染sh-NC-MSCs及sh-TGFBI-MSCs,可见大量绿色荧光蛋白表达,说明慢病毒成功转染进hUC-MSCs。
进一步,使用Western Blot和q-PCR检测经慢病毒敲低hUC-MSCs的敲低效率。结果显示,转染空载慢病毒的hUC-MSCs总蛋白中TGFBI高表达,而转染敲减TGFBI慢病毒的hUC-MSCs总蛋白中TGFBI的表达显著降低,说明成功利用慢病毒载体在蛋白水平敲减hUC-MSCs中的TGFBI(图2D)。转染空载慢病毒的hUC-MSCs总RNA中TGFBI高表达,而转染敲减TGFBI慢病毒的hUC-MSCs总RNA中TGFBI的表达显著降低,说明成功利用慢病毒载体在mRNA水平敲减hUC-MSCs中的TGFBI(图2E)。
所述Western Blot方法:收集细胞,PBS洗2遍,细胞裂解液4℃裂解细胞15min,13000rpm 4℃离心10min,BCA蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量。取30μL蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后,经10%SDS-PAGE分离后,转移到PVDF膜上,含5%脱脂奶粉室温封闭1h。4℃过夜孵育一抗(Cell Signaling Technology#3741),用TBST洗膜3次,加入二抗室温孵育1h,再用TBST洗膜3次,ECL化学发光显影。
所述q-PCR检测方法参照实施例1所述的q-PCR检测方法。
实施例3 sh-TGFBI-hUC-MSCs与T细胞共培养
分别将hUC-MSCs,sh-TGFBI-hUC-MSCs,sh-NC-hUC-MSCs与小鼠T淋巴细胞共培养,同时用anti-CD3刺激T细胞活化,CFSE染料标记两组淋巴细胞,流式细胞术检测T细胞增殖。具体步骤如下:
a)小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离T淋巴细胞;
b)anti-CD3抗体用PBS稀释为1μg/ml,加入到96孔板(50μl/孔),转移至37℃孵育2h;
c)弃掉96孔板的包被液,分别用PBS洗涤2次,分别加入经CFSE染色的T淋巴细胞(2.5×104/孔),同时按照MSC:T=1:5的比例,及5×103/孔分别加入hUC-MSCs,sh-TGFBI-hUC-MSCs,sh-NC-hUC-MSCs,共培养72h;
d)收集共培养的T淋巴细胞,流式细胞术检测T淋巴细胞增殖比例。
结果如图3所示,未与hUC-MSCs共培养(without MSCs)的T细胞增殖比例最高;与hUC-MSCs(+hUC-MSCs)及转染空载慢病毒载体的hUC-MSCs(+sh-NC-MSCs)共培养的T细胞,增殖比例显著降低,说明hUC-MSCs可以抑制T细胞增殖;与敲减TGFBI的hUC-MSCs(+sh-TGFBI-MSCs)共培养后,T细胞的增殖比例相较于与hUC-MSCs及sh-NC-MSCs共培养组显著增高,说明敲减TGFBI的hUC-MSCs对T细胞增殖的抑制作用显著减弱。
综上说明,TGFBI可以作为脐带MSC调控T细胞增殖的重要免疫分子,TGFBI敲低后脐带MSC免疫抑制能力显著降低。
实施例4 TGFBI通过调控周期蛋白CyclinD2抑制T细胞增殖
分别将hUC-MSCs,sh-TGFBI-hUC-MSCs,sh-NC-hUC-MSCs与小鼠T淋巴细胞共培养,同时用anti-CD3刺激T细胞活化,共培养72h,利用q-PCR及Western blot检测T细胞增殖相关CyclinD2基因及蛋白表达差异。
引物序列如下:
CylinD2上游引物:5’-TCCTATTTCAAGTGCGTGC-3’,SEQ ID NO:8;
CylinD2下游引物:5’-CTCACAGACCTCTAGCATCC-3’,SEQ ID NO:9。
GAPDH上游引物:5’-ACTCTTCCACCTTCGATGC-3’,SEQ ID NO:10;
GAPDH上游引物:5’-CCGTATTCATTGTCATACCAGG-3’,SEQ ID NO:11。
q-PCR检测结果如图4A所示,未与hUC-MSCs共培养(without MSCs)的T细胞CyclinD2的mRNA表达最高;与hUC-MSCs(+hUC-MSCs)及转染空载慢病毒载体的hUC-MSCs(+sh-NC-MSCs)共培养的T细胞,CyclinD2的mRNA表达显著降低,说明hUC-MSCs可以抑制T细胞中CyclinD2的表达。与敲减TGFBI的hUC-MSCs(+sh-TGFBI-MSCs)共培养后,T细胞中CyclinD2的表达相较于与hUC-MSCs及sh-NC-MSCs共培养组显著增高,说明hUC-MSCs中的TGFBI可以通过调节T细胞中的CyclinD2的表达而抑制T细胞增殖。
Western blot检测结果如图4B所示,在蛋白水平验证hUC-MSCs中的TGFBI通过调节T细胞中的CyclinD2的表达而抑制T细胞增殖。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品、方法及用途
<130> P210240
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Claims (10)
1.TGFBI在制备调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述TGFBI敲低后脐带间充质干细胞免疫抑制作用显著降低。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述脐带间充质干细胞免疫抑制作用包括脐带间充质干细胞对T细胞增殖抑制作用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述TGFBI敲低的脐带间充质干细胞对T细胞增殖的抑制作用显著减弱。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述hUC-MSCs中的TGFBI通过调节T细胞中的CyclinD2的表达而抑制T细胞增殖。
6.一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的制剂,其特征在于,所述制剂包括能够抑制或促进间充质干细胞中TGFBI表达的制剂。
7.根据权利要求6所述的制剂,其特征在于,所述抑制间充质干细胞中TGFBI表达的技术包括小分子抑制剂,RNA干扰和CRISPR/Cas系统;优选地,RNA干扰技术。
8.根据权利要求7所述的制剂,其特征在于,所述RNA干扰包括采用TGFBI的shRNA抑制TGFBI表达。
9.根据权利要求8所述的制剂,其特征在于,所述TGFBI的shRNA的干扰靶序列包括如SEQ ID NO:5~7所示的核苷酸序列;优选的,SEQ ID NO:6。
10.一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)构建慢病毒sh-TGFBI载体构建,并转染脐带间充质干细胞;
(2)将转染慢病毒sh-TGFBI载体的间充质干细胞与T淋巴细胞共培养。
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