CN102482667A - 人的产生il-17的辅助性t细胞的检测用标记物及试剂、以及人的产生il-17的辅助性t细胞的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可特异性地检测人的产生IL-17的辅助性T细胞(人Th17细胞)的标记物、特异性地检测人Th17细胞的方法及人Th17细胞检测用试剂。
Description
【技术领域】
本发明涉及用于检测人的产生IL-17的辅助性T细胞(以下,也称为“Th17细胞”)的标记物及试剂、以及检测人Th17细胞的方法。
【背景技术】
慢性类风湿性关节炎(以下,称为“RA”)是以关节炎作为主要的临床症状的全身性的炎症性自身免疫疾病。RA基于如关节的疼痛一样的自觉症状及肿胀的程度、由骨X线的见解等,通过视觉的方法判断其病势,但未确立定量的指标。从而,目前也未确立继续监控治疗效果的定量的方法。
RA的发症原因的详细虽不明了,但认为,细菌感染等成为诱因,经免疫细胞群及细胞因子组的复杂的网络,发生关节组织的炎症。
担负免疫反应之中心的是辅助性T细胞群。未成熟的辅助性T细胞(幼稚T细胞)一旦从抗原呈递细胞被呈递抗原,则分化成辅助性T细胞,但此时由特定的细胞因子存在,幼稚T细胞分化诱导成4种的细胞种。4种的细胞种是:产生干扰素(IFN)-γ的辅助性T细胞(Th1细胞)、产生白细胞介素(IL)-4的辅助性T细胞(Th2细胞)、产生IL-17的辅助性T细胞(Th17细胞)及有免疫抑制效果的控制性T细胞(Treg细胞)。
在这些的辅助性T细胞之中,越来越明了Th17细胞可与RA的发症相关。
例如,在特开2000-186046号公报(专利文献1)中示,在RA患者的关节滑液中,相比变形关节炎的患者的关节滑液,IL-17的量更显著地高,RA患者来源的滑液组织中的T细胞中存在IL-17阳性细胞,因此示IL-17与RA的病态形成、特别是关节-骨破坏深深相关。再者,专利文献1记载,可将IL-17作为RA的诊断标记物来使用。
另外,在特开2007-506100号公报(专利文献2)记载,当分析自RA患者的末梢血血清中的细胞因子时,IFN-γ、IL-1β、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、IL-5及IL-7的水平在RA患者中是显著地高的值,IL-2、CXCL8/IL-8、IL-12及CCL2/MCP-1是不算高的值。
另一方面,对于Th17细胞而言,通过Ivanov等(Cell,2006,126,p.1121-1133:非专利文献1)、Stumhofer等(Nature Immunology,2006,vol.7,p.937-945:非专利文献2)、Wilson等(NatureImmunology,2007,vol.8,p.950-957:非专利文献3)等的研究,明白了以下的事实。
●被称为RORγt的核内受体在Th17细胞的分化中发挥重要的作用。
●由IL-6、IL-23及TGF-β诱导从未成熟的辅助性T细胞(幼稚T细胞)向Th17细胞的分化。
●表达IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-26、TNF、IFN-γ、CCL20。
●在Th17细胞的表面存在IL-23受体或IL-12受体β。
专利文献1:特开2000-186046号公报
专利文献2:特开2007-506100号公报
非专利文献1:Ivanov等,″The Orphan Nuclear Receptor RORγtDirects the Differentiation Program of Proinflammatory IL-17+THelper Cells″,Cell,2006,126,p.1121-1133
非专利文献2:Stumhofer等,″Interleukin 27negatively regulatesthe development of interleukin 17-producing T helper cells duringchronic inflammation of the central nervous system″NatureImmunology,2006,vol.7,p.937-945
非专利文献3:Wilson等,″Development,cytokine profile andfunction of human interleukin 17-producing helper T cells″NatureImmunology,2007,vol.8,p.950-957
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
在上述的非专利文献1~3中,使用利用对于IL-17特异性的抗体的酶联免疫吸附法(ELISA法)来测定IL-17的量。
但是认为,通过确立不仅测定IL-17的量,还检测Th17细胞自体的方法,可更深理解自身免疫疾病、优选是RA和Th17细胞的关联。
本发明人以发现可特异性地检测人Th17细胞的分子标记物作为目的。
【解决课题的技术方案】
本发明人通过从健康的成人的末梢血分离Th17细胞,鉴定在得到的Th17细胞中特异性地表达的基因而完成本发明。
从而,本发明是人Th17细胞检测用多核苷酸标记物,其为有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸、其变异型及片段:
由下列组成的编码膜蛋白质的基因:ADAM12(ADAM金属肽酶域12)、ANKS1B(锚蛋白重复子及不育α基序域含1B)、ATP6V0A4(ATP酶,H+运输,溶酶体V0亚基a4)、ATP9A(ATP酶,II类,9A型)、BVES(血管心外膜物质)、C5orf40(第5染色体开放阅读框40)、CDH4(钙粘蛋白4,1型,R-钙粘蛋白(视网膜))、DIO2(脱碘酶,碘甲状腺原氨酸,II型)、DMD(肌营养不良蛋白)、GPR34(G蛋白-偶联的受体34)、IRS2(胰岛素受体底物2)、KCNE3(钾电压-选通的通道,Isk-相关的家族,成员3)、L1CAM(L1细胞粘着分子)、MCAM(黑色素瘤细胞粘着分子)、MFAP3L(微原纤维-相关的蛋白3-样)、MYO7A(肌球蛋白VIIA)、PTPRM(蛋白酪氨酸磷酸酶,受体类型,M)、SHROOM2(shroom家族成员2)、SLC16A4(溶质载体家族16,成员4(一元羧酸转运蛋白5))、SLCO2B1(溶质载体有机阴离子转运蛋白家族,成员2B1)、TANC2(三十四肽重复子,锚蛋白重复子及卷曲螺旋含2)、TJP1(紧密连接蛋白1(闭锁小带1))、TMEM163(跨膜蛋白163)、TNS3(张力蛋白3)、UPK1B(尿路血小板溶素1B)、WDFY3(WD重复子及FYVE域含3)、DRD2(多巴胺受体D2)、GJC1(缝隙连接蛋白,γ1,45kDa)、PGBD5(LOC100134440)(piggyBac可转座元件来源的5(类似于PGBD5蛋白))、MS4A7(跨膜4-域,亚家族A,成员7)、ODZ4(odz,odd Oz/ten-m同系物4)、PHKA1(磷酸化酶激酶,α1)、RGS1(G-蛋白信号转导调节物1)、SHB(Src同源性2域含衔接子蛋白B)、SLC44A3(溶质载体家族44,成员3)、SLC6A15(溶质载体家族6(中性氨基酸转运蛋白),成员15)、SYNGR3(突触循环蛋白3)、AKAP12(A激酶(PRKA)锚蛋白12)、C9orf125(第9染色体开放阅读框125)、DPY19L2(dpy-19-样2)、HRH4(组胺受体H4)、MUC20(粘蛋白20,细胞表面相关的)、POPDC3(popeye域含3)、SORBS1(山梨糖及SH3域含1)、TANC1(三十四肽重复子,锚蛋白重复子及卷曲螺旋含1)、TMEM44(跨膜蛋白44)及UNC13C(unc-13同系物C);
由下列组成的编码分泌蛋白质的基因:CXCL13(趋化因子(C-X-C基序)配体13)、PCOLCE2(原胶原C-内肽酶增强子2)、PNOC(前原痛敏肽)、SMPDL3A(鞘磷脂磷酸二酯酶,酸-样3A)、TGFBI(转化生长因子,β-诱导型)、C17orf99(第17染色体开放阅读框99)、EBI3(Epstein-Barr病毒诱导型3)、IL1A(白细胞介素1,α)及WNT3(无翅-M型MTV整合位点家族,成员3);
由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因:BCAT1(支链氨基转移酶1,细胞溶质)、BHLHE22(碱性螺旋-环-螺旋家族,成员e22)、C13orf18(LOC728970)(第13染色体开放阅读框18(假定LOC728970))、CA2(碳酸酐酶II)、CCDC3(卷曲螺旋域含3)、CDS1(CDP-二酰甘油合酶(磷脂酸胞苷酰转移酶)1)、CHN1(嵌合素(嵌合素)1)、CLIC5(LOC100131610)(氯细胞内通道5(类似于氯细胞内通道5))、CTSH(组织蛋白酶H)、CYP7B1(细胞色素P450,家族7,亚家族B,多肽1)、DAPK2(死亡-相关的蛋白激酶2)、DMRT1(双性及mab-3相关的转录因子1)、DSE(硫酸皮肤素表异构酶)、FBXL17(F-盒及亮氨酸-富含的重复子蛋白17)、FBXL21(F-盒及亮氨酸-富含的重复子蛋白21)、FHOD3(成蛋白同源性2域含3)、H2AFY2(H2A组蛋白家族,成员Y2)、HLX(H2.0-样同源异形盒)、IRAK3(白细胞介素-1受体-相关的激酶3)、MACC1(转移相关的in结肠癌1)、MAML3(策划者-样3)、MYO10(肌球蛋白X)、OTUB2(OTU域,泛素醛结合2)、PAPSS2(3′-磷酸腺苷5′-磷酰硫酸合酶2)、PCBP3(Poly(rC)结合蛋白3(PCBP3),转录物变体2)、PDE4DIP(磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)、PLD1(磷脂酶D1,磷脂酰胆碱-特异性)、PPARG(过氧化物酶体增殖子-活化的受体γ)、PTPN13(蛋白酪氨酸磷酸酶,非-受体13型(APO-1/CD95(Fas)-相关的磷酸酶))、RGS18(G-蛋白信号转导调节物18)、SIM1(single-minded同系物1)、SNAI2(snail同系物2)、SOX2(SRY(性别决定区Y)-盒2)、SPIRE1(spire同系物1)、TBC1D12(TBC1域家族,成员12)、TGM5(转谷氨酰胺酶5)、TMOD1(原肌球调节蛋白1)、TUBB6(微管蛋白,β6)、DDIT4L(DNA-损伤-诱导型转录物4-样)、DHRS9(脱氢酶/还原酶(SDR家族)成员9)、ERC2(ELKS/RAB6-相互作用/CAST家族成员2)、FERMT2(fermitin家族同系物2)、HHEX(造血性地表达的同源异形盒)、HS3ST1(硫酸乙酰肝素(葡萄糖胺)3-O-磺基转移酶1)、NR5A2(核受体亚家族5,组A,成员2)、PHLDA1(组同源性-样域,家族A,成员1)、RBM20(RNA结合基序蛋白20)、NINL(ninein-样)、RTN2(reticulon2)、SH3RF2(SH3域含环指2)、TSHZ2(teashirt锌指同源异形盒2)、EML1(棘皮动物微管相关的蛋白样1)、HIST1H2BC(组蛋白簇1,H2bc)、MAP3K4(丝裂原-活化的蛋白激酶激酶激酶4)、PDK4(丙酮酸脱氢酶激酶,同工酶4)、RGS2(G-蛋白信号转导调节物2)及RGS20(G-蛋白信号转导调节物20);
由下列组成的基因:C1orf106(第1染色体开放阅读框106)、C6orf145(第6染色体开放阅读框145)、LOC401097(类似于LOC166075)、MAMLD1(策划者-样域含1)、ZC3H12C(锌指CCCH-类型含12C)、C12orf64(第1染色体2开放阅读框64)、C6orf168(第6染色体开放阅读框168)、CAMSAP1L1(钙调素调节的血影蛋白-相关的蛋白1-样1)及MAGED4(MAGED4B)(黑色素瘤抗原家族D,4,(黑色素瘤抗原家族D,4B))、以及
包含选自SEQ ID NO:147~151、157~162及167~174的至少一个碱基序列的基因。
本发明也提供人Th17细胞检测用蛋白质标记物,其为由至少1种上述的基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段。
再者,本发明提供检测人Th17细胞的方法,包括:在包含人来源的细胞的样品中,检测至少1种人Th17细胞检测用多核苷酸标记物或至少1种人Th17细胞检测用蛋白质标记物的存在。
另外,本发明提供人Th17细胞检测用试剂,其包含选自下列的至少1种:与上述的多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针;及与上述的蛋白质标记物特异性地结合的,核酸适体、抗体、配体或受体。
【发明效果】
通过检测至少1种本发明的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物或蛋白质标记物,可特异性地检测人Th17细胞。另外认为,可检测该患者罹患被认为Th17细胞相关的疾病、例如RA等的自身免疫疾病的可能性。
【附图说明】
【图1】是示在Th1、Th2、Treg及Th17的各细胞中,已知的Th17细胞特异性表达基因(IL23R、IL17A、IL17F、IL22、IL26及RORC)的表达量的坐标图。
【图2】是示从MCAM测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图3】是示从PTPRM测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图4】是示从GPR34测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图5】是示从CCR6测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图6】是示从IL-17A测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图7】是示从IFN-γ测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图8】是示从IL-4测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【图9】是示从FOXP3测定用样品的解析得到的荧光强度的直方图。
【实施方式】
本发明的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物是有选自上述的基因的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸、其变异型及片段。
优选是,上述的多核苷酸是有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸:
由下列组成的编码膜蛋白质的基因:ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5(LOC100134440)、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3及UNC13C;
由下列组成的编码分泌蛋白质的基因:PCOLCE2、PNOC、TGFBI及IL1A;以及
由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因:BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
本发明的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物是发现相比人末梢血来源的其他辅助性T细胞(Th1、Th2及Treg细胞),在Th17细胞中特异性地存在的多核苷酸、其变异型或片段。
从而,通过检测至少1种上述的多核苷酸标记物,可将Th17细胞与Th1、Th2及Treg细胞区别而特异性地检测,及检查被认为Th17细胞相关的疾病的在活体中的活动性指标。
在本说明书中,基因与所述技术中一般地使用的用语具有同等的含义,是转录成mRNA而翻译成蛋白质的基因组上之一部分。
在本说明书中,包括选自SEQ ID NO:147~151、157~162及167~174的至少1个碱基序列的基因是包括各序列编号所示的至少1个碱基序列或与其碱基序列互补的碱基序列的转录成mRNA的基因。即,在包含选自SEQ ID NO:147~151、157~162及167~174的至少1个碱基序列的基因中包括包含与选自SEQ ID NO:147~151、157~162及167~174的至少1个碱基序列互补的碱基序列的基因。
在本说明书中,膜蛋白质是指存在于细胞膜,包括在细胞的膜级分的蛋白质。分泌蛋白质是指在细胞内合成,向细胞质膜外分泌的蛋白质。细胞内蛋白质是指其所在位置主要在细胞内的蛋白质。
在本说明书中,某多核苷酸在Th17细胞中“特异性地表达的”是指相比在Th17细胞以外的细胞的该多核苷酸的表达,在Th17细胞内的该多核苷酸的表达显著地高。
具体而言是指,在Th17细胞内该多核苷酸的表达是在Th17细胞以外的细胞的该多核苷酸的表达的约2倍以上。优选是,在Th17细胞内的该多核苷酸的表达是在Th17细胞以外的辅助性T细胞(Th1细胞、Th2细胞、Th22细胞及Treg细胞)的该多核苷酸的表达的约2倍以上。
本发明的多核苷酸标记物的碱基序列已经公知。这些可知,例如Unigene(由美国国立医学图书馆的国立生物信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information:NCBI)提供的数据库)。本发明的多核苷酸标记物的碱基序列的Unigene编码示于表9。
在本说明书中,多核苷酸的“变异型”是指导入了不变化由上述的基因编码的蛋白质的性质的变异的多核苷酸。这样的变异包括在上述的基因的碱基序列中的1或多个核苷酸的缺失或取代、或者1或多个核苷酸的附加。
在本说明书中,多核苷酸的“片段”是指连续具有上述的基因的碱基序列之一部分,可与后述的人Th17细胞检测用核酸探针特异性地杂交的长度的多核苷酸。
作为本发明的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物的多核苷酸的变异型与上述的各基因的碱基序列有通常至少80%、优选是至少85%、更优选是至少90%、特别更优选是至少95%的序列相同性。
在本说明书中,碱基序列及氨基酸序列的序列相同性是将BLASTN、BLASTP、BLASTX或TBLASTN(例如,可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov利用)用标准设定使用而算出。
上述的多核苷酸标记物是DNA或RNA之任何也可,是上述的基因本身(DNA)、mRNA、cDNA或cRNA之任何也可。
通过检测至少1种由上述的基因编码的蛋白质,也可检测人Th17细胞。从而,作为由至少1种上述的基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段的人Th17细胞检测用蛋白质标记物也是本发明之一。
优选是,上述的蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的蛋白质:
由下列组成的编码膜蛋白质的基因:ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5(LOC100134440)、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3及UNC13C;
由下列组成的编码分泌蛋白质的基因:PCOLCE2、PNOC、TGFBI及IL1A;以及
由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因:BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
更优选是,上述的蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的膜蛋白质:GPR34、MCAM及PTPRM。
这样的蛋白质标记物的氨基酸序列可基于从上述的Unigene等得到的多核苷酸标记物的碱基序列知。另外,也可从由如上所述的NCBI提供的数据库知。对于本发明的人Th17细胞检测用蛋白质标记物的氨基酸序列的NCBI的编码编号示于表9。
上述的人Th17细胞检测用蛋白质标记物是由至少1种上述的基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段。
在本说明书中,蛋白质的“功能上同等的变异型”是指导入了不变化蛋白质的功能的变异的蛋白质。这样的变异包括在公知的蛋白质的氨基酸序列中1或多个氨基酸的缺失或取代、或者1或多个氨基酸的附加。
在本说明书中,蛋白质的“片段”是指连续具有由上述的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型的氨基酸序列之一部分,可与后述的人Th17细胞检测用的核酸适体、抗体、配体或受体特异性地结合的蛋白质。
作为本发明的人Th17细胞检测用蛋白质标记物的蛋白质的功能上同等的变异型与由上述的基因编码的蛋白质的公知的氨基酸序列有通常至少80%、优选是至少85%、更优选是至少90%、特别更优选是至少95%的序列相同性。
可与本发明的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物特异性地杂交的分子由于可为了检测该标记物而使用,所以作为人Th17细胞检测用探针有用。该探针是可与上述的多核苷酸标记物特异性地杂交的DNA、RNA等的核酸探针、肽探针之任何也可。人Th17细胞检测用探针而言,优选为用于检测多核苷酸标记物的核酸探针、特别是DNA探针。
在本说明书中,“可特异性地杂交”是指在严格的条件下可与目标核酸分子(上述的多核苷酸标记物)杂交。
在本说明书中,严格的条件是指人Th17细胞检测用探针可与目标多核苷酸标记物,以相比该目标多核苷酸标记物以外的多核苷酸更可检测的大的程度(例如,超背景的至少2倍)杂交的条件。
再有,严格的条件通常是序列依赖性的,然后在各种的环境中不同。一般而言,严格的条件选择为相比在规定的离子强度及pH的特定的序列的热的熔点(thermal melting point)更低约5℃。此Tm是(以规定的离子强度、pH及核酸组成之下)与上述的目标序列互补的探针的50%平衡而杂交的温度。
这样的条件是以往公知的多核苷酸的杂交法、例如PCR法、微阵列法、DNA印迹法等中,在多核苷酸的杂交中使用的条件也可。
具体而言,pH 7.0~9.0而,盐浓度相比约1.5M Na离子更低,更具体而言,可例举是约0.01~1.0MNa离子浓度(或者其他盐),至少约30℃的条件。例如,在微阵列法中的严格的条件包括:于37℃在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中的杂交、及在60~65℃的在0.1×SSC中的清洗。
另外,在PCR法中的严格的条件可例举pH7~9、0.01~0.1M的Tris HCl、0.05~0.15MK离子浓度(或者其他盐)、至少约55℃的条件。
上述的人Th17细胞检测用核酸探针的序列可由本领域技术人员适宜确定为,基于所述技术常识及上述的多核苷酸标记物的序列,可与上述的多核苷酸标记物特异性地杂交。
上述的人Th17细胞检测用核酸探针可使用例如,从一般而言利用可能的引物设计软件(例如,可利用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)或DNASIS Pro(日立软件工程股份公司))来确定。
上述的人Th17细胞检测用核酸探针可通过所述技术中公知的多核苷酸的合成方法来制备。
上述的人Th17细胞检测用核酸探针用所述技术中通常使用的标记物质标记也可。通过使用标记的该探针,可简便地进行人Th17细胞检测用多核苷酸标记物的检测、即人Th17细胞的检测。
上述的标记物质可为32P等的放射性同位素、荧光素等的荧光物质、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等的酶、生物素等的所述技术中通常使用的标记物质。
上述的人Th17细胞检测用核酸探针可通过使用仅1种,或者将多种组合使用而特异性地检测人Th17细胞。例如,通过使用所述技术中公知的方法将该探针1种以上固定化到基板上,可制备用于检测人Th17细胞检测用多核苷酸标记物的DNA芯片或微阵列。
上述的人Th17细胞检测用核酸探针可为用于通过例如PCR法等的核酸扩增法扩增上述的多核苷酸标记物的2种以上的引物的组。
可与本发明的人Th17细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的分子由于可为了检测该标记物而使用,所以在检测人Th17细胞中有用。这样的分子也可为可与人Th17细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的DNA、RNA等的核酸适体、抗体、配体或受体等之任何,但优选是抗体。
另外,在人Th17细胞检测用蛋白质标记物是酶时,通过使该酶与底物作用而发色、发光、发生荧光等而可检测该标记物。
上述的人Th17细胞检测用抗体可例如,通过如下所述的以往公知的顺序来制备。基于上述的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物的碱基序列或蛋白质标记物的氨基酸序列,将编码有蛋白质标记物的氨基酸序列的蛋白质的DNA分子导入适宜的表达载体。将得到的表达载体导入适宜的宿主细胞,培养得到的转化细胞,得到目的的蛋白质。将得到的蛋白质纯化而作为免疫原,使用免疫原和根据需要佐剂,免疫适宜的哺乳动物、例如大鼠、小鼠等。从免疫的动物的脾脏细胞等,通过筛选选择产生针对目的的免疫原的抗体的抗体产生细胞。将得到的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合而得杂交瘤,通过将其筛选,可得产生与由上述的基因编码的蛋白质有特异性结合性的抗体的产生抗体的杂交瘤。通过培养得到的抗体产生杂交瘤,可得目的的抗体。
可为了检测上述的人Th17细胞而使用的核酸适体可通过例如,如下所述的以往公知的顺序来制备。通过公知的方法制成有随机的核酸的碱基序列的核酸库,通过试管内进化法(SELEX法)等可选择可与目标的蛋白质(上述的蛋白质标记物)特异性地结合的适体。
可与上述的人Th17细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的分子也可通过所述技术中通常使用的标记物质来标记。通过使用标记的人Th17细胞检测用抗体,可简便地进行人Th17细胞检测用蛋白质标记物的检测、即人Th17细胞的检测。
上述的标记物质可为32P等的放射性同位素、荧光素等的荧光物质、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等的酶、生物素等的所述技术中通常使用的标记物质。
通过在包含人来源的细胞的样品中,检测至少1种人Th17细胞检测用多核苷酸标记物或至少1种人Th17细胞检测用蛋白质标记物的存在而检测人Th17细胞的方法也包括在本发明的范围内。
在此方法中,从提高检测灵敏度的观点,优选为检测多种人Th17细胞检测用多核苷酸标记物或人Th17细胞检测用蛋白质标记物的存在。
在本发明的检测人Th17细胞的方法中,包含人来源的细胞的样品而言,可例举包括从人采集的活体样品或人工地培养的人细胞的样品。活体样品而言,可例举血液、组织、关节液、脑脊髓液、胸水、腹水等。
对检测人Th17细胞检测用多核苷酸标记物的存在的方法某实施方式进行说明。
首先,从包含人来源的细胞的样品,通过使用苯酚提取及乙醇沉淀、市售的DNA提取试剂盒等的所述技术中公知的方法来提取核酸(DNA或RNA)。
接下来,检测得到的核酸样品中的上述的多核苷酸标记物的存在。在此检测中,优选为使用上述的人Th17细胞检测用核酸探针。特别是,通过PCR法、RT-PCR法、实时PCR法、LAMP(环-介导的等温扩增)法等的核酸扩增法检测上述的多核苷酸标记物的存在时,人Th17细胞检测用核酸探针而言,优选为使用用于通过核酸扩增法扩增该多核苷酸标记物的引物组。
另外,人Th17细胞检测用多核苷酸标记物的存在也可通过如Southern杂交、Northern杂交、FISH(荧光原位杂交)一样的杂交法、DNA芯片或微阵列法等的所述技术中公知的方法来检测。这些的方法在上述的严格的条件下进行,通过检测上述的标记物质等检测上述的人Th17细胞检测用核酸探针形成杂交体,从而可检测多核苷酸标记物的存在。
接下来,对检测人Th17细胞检测用蛋白质标记物的存在的方法的某实施方式进行说明。
例如,当作为检测对象的人Th17细胞检测用蛋白质标记物是在细胞内存在的蛋白质时,使用所述技术中公知的方法,从包含人来源细胞的样品提取蛋白质。从该样品的蛋白质的提取可通过超声波的细胞的破碎、使用细胞可溶化液的可溶化等的公知的方法来进行。然后,使用与该蛋白质标记物特异性地结合的分子,可检测得到的蛋白质提取液中的上述的蛋白质标记物。具体而言,人Th17细胞检测用蛋白质标记物可通过ELISA法、蛋白印记法等的所述技术中公知的方法来检测。在检测中,与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子优选为上述的核酸适体、抗体、配体或受体、优选是使用上述的人Th17细胞检测用抗体。
例如,当作为检测对象的人Th17细胞检测用蛋白质标记物是分泌蛋白质时,使用与该蛋白质标记物特异性地结合的分子,可检测分泌到包含上述细胞的样品中的蛋白质标记物。
另外,从包含人来源的细胞的样品采集细胞(淋巴细胞),使用抗CD3抗体、抗CD28抗体、伴刀豆球蛋白A、PHA(植物凝血素)、PMA(肉豆蔻酰乙酸佛波酯)、离子霉素等刺激采集的细胞之后,使用与蛋白质标记物特异性地结合的分子,可检测分泌的蛋白质标记物。
具体而言,人Th17细胞检测用蛋白质标记物可通过ELISA法、蛋白印记法等的所述技术中公知的方法来检测。在检测中,与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子优选为上述的核酸适体、抗体、配体或受体、优选是使用上述的人Th17细胞检测用抗体。
例如,当作为检测对象的人Th17细胞检测用蛋白质标记物是在细胞的表面存在的蛋白质时,使用与该蛋白质标记物特异性地结合的分子,可检测在包含人来源的细胞的样品中的细胞的表面存在的蛋白质标记物。
另外,从包含人来源的细胞的样品采集细胞的膜级分,使用与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子,可检测得到的膜级分中的该蛋白质标记物。具体而言,可通过基于ELISA法、蛋白印记法、流式细胞术(FCM)的方法等的所述技术中公知的方法来检测。在检测中,与上述的蛋白质标记物特异性地结合的分子优选为上述的核酸适体、抗体、配体或受体、优选是使用上述的人Th17细胞检测用抗体。
例如,通过FCM检测人Th17细胞检测用蛋白质标记物时,可通过如下所述的顺序进行检测。
首先,使包含人来源的细胞的样品与用适宜的标记物质标记的上述的人Th17细胞检测用抗体接触。只要存在,人Th17细胞与此标记的抗体在细胞表面结合。从而,通过使包含与标记物质结合的细胞的样品通过流式细胞仪,可检测人Th17细胞。另外,根据需要,也可将与标记物质结合的人Th17细胞使用细胞分选仪来瓣别-分离。
这样的基于FCM的方法被本领域技术人员公知,反应的条件可由本领域技术人员适宜确定。
可在上述的本发明的检测人Th17细胞的方法中使用的,人Th17细胞检测用试剂也是本发明之一。
那样的试剂包含选自下列的至少1种:与上述的人Th17细胞检测用多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针、以及与上述的人Th17细胞检测用蛋白质标记物特异性地结合的核酸适体、抗体、配体及受体。
【实施例】
以下通过实施例详细地说明本发明,但本发明不受这些实施例的限制。
【实施例1:在人末梢血来源培养Th17细胞中的高表达基因的解析】
1.从人末梢血的Th1、Th2、Treg及Th17细胞的单离
(1)从人末梢血的Th1、Th2及Th17细胞的单离
从健康的成人的末梢血得到的血沉棕黄层覆盖到Ficoll-paqueplus溶液(GE HEALTHCARE Bioscience股份公司)上,通过将其离心分离,得到单核细胞级分。接下来,使用结合抗CD4抗体的磁珠(Miltenyi Biotec公司),从上述的级分粗纯化CD4阳性细胞。
将如此得到的CD4阳性细胞使用表1所示的荧光标记抗体染色之后,使用细胞分选仪(FACS Aria:Becton Dickinson公司),分离Th1、Th2及Th17的各细胞。另外,分离的选通如表2所示进行。
【表1】
抗原 | 荧光标记物质 | 克隆 | 厂商 |
CD4 | APC-Cy7 | RPA-T4 | BD Biosciences公司 |
CD25 | PE-Cy7 | BC96 | eBioscience公司 |
CXCR3 | Alexa Fluor(商标)488 | 1C6/CXCR3 | BD Biosciences公司 |
CCR4 | APC | FAB1567A | R&D systems公司 |
CCR6 | PE | 11A9 | BD Biosciences公司 |
【表2】
细胞 | 选通 |
Th1 | CD4高CD25低-阴性CXCR3+CCR6-CCR4- |
Th2 | CD4高CD25低-阴性CXCR3-CCR6-CCR4+ |
Th17 | CD4高CD25低-阴性CXCR3-CCR6+CCR4+ |
再有,上述的筛选的操作的详细请参照由Acosta-Rodriguez EV等的文献(Surface phenotype and antigenic specificity of humaninterleukin 17-producing T helper memory cells.,Nat Immunol.,2007,vol.8,p.639-646)。
(2)从人末梢血的Treg细胞的单离
将如同上述的步骤(1)得到的CD4阳性细胞使用表3所示的荧光标记抗体染色之后,使用上述的细胞分选仪,将CD4高CD25高CD127内部-阴性细胞作为Treg细胞纯化。
【表3】
抗原 | 荧光标记物质 | 克隆 | 厂商 |
CD4 | FITC | OKT4 | eBioscience公司 |
CD25 | PE-Cy7 | BC96 | eBioscience公司 |
CD45RO | PE | UCHL1 | BioLegend公司 |
CD127 | Alexa Fluor(商标)647 | HIL-7R-M21 | BD Biosciences公司 |
再有,上述的筛选的操作的详细请参照由Weihong Liu等的文献(CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressivefunction of human CD4+T reg cells.,J Exp Med.2006,vol.203,p.1701-1711)。
2.细胞的培养
(1)Th1、Th2及Th17细胞的培养
将从上述的步骤1.(1)得到的成人末梢血来源的Th1、Th2及Th17细胞各自以1.5×105细胞/0.3ml/孔的密度接种到96孔板。培养基使用Yssel培养基(IMDM,1%人AB型血清,0.25%BSA,1.8mg/l2-氨基甲醇,40mg/l转铁蛋白,5mg/l胰岛素,2mg/l亚油酸,2mg/l油酸,2mg/l棕榈酸,1%青霉素/链霉素)。
另外,为了上述的细胞的活化及增殖,向各孔添加各0.75×105个由抗CD2/3/28抗体包被的磁珠(Miltenyi Biotec公司)(以下,也称为“抗体珠”)。然后,添加适宜于Th1、Th2及Th17细胞的各自的分化培养的细胞因子及中和抗体,将细胞在37℃、5%CO2气氛的温育器内培养。表4示使用的细胞因子及中和抗体。
【表4】
上述的细胞因子的浓度是,将IL-6作为50ng/ml,将IL-6以外作为10ng/ml。另外,上述的抗体的浓度是,将抗IFN-γ抗体作为10μg/ml,将抗IL-4抗体作为2.5μg/ml。
再有,细胞因子及中和抗体各自获自R&D systems公司及eBioscience公司。
从培养开始3天后,在包括上述的细胞因子及抗体的培养基中将细胞稀释3倍,再培养7天(合计10天)。
从培养开始10天后,将得到的Th1、Th2及Th17细胞各自二等分,将这些之一方使用Yssel培养基及PBS清洗之后,通过离心分离回收细胞,于-80℃冷冻保存至之后的RNA提取步骤。将这些各自作为“无活化刺激”的Th1、Th2及Th17细胞。然后,在另一方的各细胞添加上述的抗体珠,通过再培养3小时来再度活化之后,通过离心分离回收细胞,同样地于-80℃冷冻保存。将这些各自作为“有活化刺激”的Th1、Th2及Th17细胞。
(2)Treg细胞的培养
将在上述的步骤1.(2)得到的Treg细胞如同上述的步骤2.(1)在Yssel培养基中培养,然后使用抗体珠来活化。再者,在培养基,作为细胞因子,添加IL-2及TGF-β1(R&D systems公司)、以及作为中和抗体,添加抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体(eBioscience公司)及抗IL-6抗体(BD bioscience公司)。
再有,将这些的细胞因子及中和抗体各自以10ng/ml及5μg/ml的浓度使用。
从培养开始3天后,添加与培养开始时同量的细胞因子及中和抗体。再培养3天之后,将细胞二等分,向一方不添加用于活化的抗体珠,向另一方添加抗体珠,再培养3小时,各自作为“无活化刺激”及“活性有刺激”的Treg细胞。其后,将各细胞通过离心分离回收,于-80℃冷冻保存至之后的RNA提取步骤。
3.总RNA的提取
为了从上述的步骤2.得到的各细胞提取总RNA,分别使用RNeasyPlus Mini试剂盒及RNeasy micro试剂盒(QIAGEN公司)。再有,具体性的操作根据各试剂盒的附带文书的记载进行。
4.微阵列表达解析
使用Two-Cycle Target标记及Control Reagents(Affymetrix公司),将从上述的步骤3.提取的各细胞的总RNA(10~100ng)逆转录为cDNA,再进行向生物素化cRNA的转录反应。接下来,将扩增的生物素化cRNA(20μg)片段化。再有,具体性的操作根据试剂盒附带的说明书的记载进行。
将在上述得到的各细胞来源的生物素化cRNA(15μg)作为待测样品,各自添加到GeneChip Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array(Affymetrix公司),移到GeneChip Hybridization Oven 640(Affymetrix公司),在45℃、60rpm的条件下进行16小时杂交。
杂交结束后,将上述的微阵列使用GeneChip Fluidic Station 450(Affymetrix公司)清洗及进行荧光标记,将该微阵列使用GeneChip扫描仪30007G(Affymetrix公司)扫描,取得荧光强度数据。
5.在人Th17细胞中特异性地表达的基因的选择
基于在上述的步骤4.得到的荧光强度的数据,使用表达解析软件GeneSpringVer.10(Agilent Technologies公司),通过MAS5算法将该数据标准化。然后,将Th17细胞的各基因的相对荧光强度与Th1、Th2及Treg细胞的相对荧光强度比较。
在Th17细胞的相对荧光强度相比Th1、Th2及Treg细胞之任何更高3倍以上,并且将显著地表达的基因(通过相对荧光强度的Th1、Th2、Treg及Th17细胞的4组间的ANOVA统计解析示“p值<0.05”的基因)鉴定为在Th17细胞中特异性地表达的基因。
再有,上述的基因的选择步骤中使用的各待测样品的数示于表5。
【表5】
Th1 | Th2 | Th17 | Treg | |
无活化刺激 | 5 | 5 | 5 | 4 |
有活化刺激 | 5 | 5 | 5 | 3 |
在表6及表7中分别示在“无活化刺激”及“有活化刺激”的Th17细胞的特异性表达基因。
【表6-1】无活化刺激
【表6-2】无活化刺激
【表6-3】无活化刺激
【表6-4】无活化刺激
【表6-5】无活化刺激
【表6-6】无活化刺激
【表6-7】无活化刺激
【表6-8】无活化刺激
【表7-1】有活化刺激
【表7-2】有活化刺激
【表7-3】有活化刺激
【表7-4】有活化刺激
【表7-5】有活化刺激
【表7-6】有活化刺激
【表7-7】有活化刺激
【表7-8】有活化刺激
【表7-9】有活化刺激
上述的基因之中,以下的表8所示的是已知在Th17细胞中特异性地表达的基因。
【表8】
对于这些的已知基因,当将在上述的步骤2.得到的Th1、Th2、Treg及Th17的各细胞中的表达量使用上述的微阵列解析时,Th17细胞将这些的已知基因以相比Th1、Th2及Treg细胞4~950倍更多表达。结果示于图1。由此结果示,上述的各细胞适宜于Th17细胞检测用标记物的探索。
本发明人在从上述得到的基因除去表8所示的基因,新鉴定了Th17细胞检测用多核苷酸标记物。表9示这些的新颖多核苷酸标记物。
再有,表中的“条件”意味着细胞的活化刺激的有无。另外,“条件”的栏被记载为“共通”的基因是在进行该刺激的Th17细胞和未进行该刺激的Th17细胞中共通特异性地表达的基因,被记载为“有刺激”及“无刺激”的基因是仅在各自进行该刺激的Th17细胞及未进行该刺激的Th17细胞中特异性表达的基因。
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【表9-5】
【表9-6】
【表9-7】
【表9-8】
【表9-9】
【表9-10】
通过将表9所示的各多核苷酸标记物使用PCR法等的所述技术中公知的方法来检测,另外,通过将由这些的多核苷酸标记物编码的蛋白质使用ELISA法或使用流式细胞仪的方法等的所述技术中公知的方法来检测,认为可特异性地检测人Th17细胞。
【实施例2:人Th17细胞检测用蛋白质标记物的表达解析】
1.测定用样品的制备
(1)MCAM测定用样品的制备
向在实施例1的“2.细胞的培养”中制备的“无活化刺激”的Th17细胞(5×106细胞/ml)添加藻红蛋白(PE)标记抗MCAM抗体(Biolegend公司)至终浓度达到1.25μg/ml,使于4℃反应20分钟。
反应后,添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水(PBS),通过离心分离回收Th17细胞来进行清洗。将清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5μg/ml 7-氨基-放线菌素D(7-AAD)及0.5%BSA的PBS来制备Th17细胞的MCAM测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替“无活化刺激”的Th17细胞而使用“无活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞、及Treg细胞,进行同样的操作来分别制备Th1细胞的MCAM测定用样品(5×106细胞/ml)、Th2细胞的MCAM测定用样品(5×106细胞/ml)及Treg细胞的MCAM测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替PE标记MCAM抗体而添加PE标记小鼠IgG2a同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品(5×106细胞/ml)。
(2)PTPRM测定用样品的制备
向实施例1的“2.细胞的培养”中制备的“无活化刺激”的Th17细胞(5×106细胞/ml)添加抗PTPRM抗体(Abcam公司)至终浓度达到2.0μg/ml,使于4℃反应20分钟。
反应后,添加含有0.5%BSA的PBS,通过离心分离回收Th17细胞。将回收的Th17细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS。向此悬浮液添PE标记抗小鼠IgG抗体(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟。
使与PE标记抗小鼠IgG抗体反应之后,添加含有0.5%BSA的PBS,通过离心分离回收Th17细胞来进行清洗。将清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5μg/ml 7-氨基-放线菌素D(7-AAD)及0.5%BSA的PBS而制备Th17细胞的PTPRM测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替“无活化刺激”的Th17细胞而使用“无活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞、及Treg细胞,进行同样的操作来分别制备Th1细胞的PTPRM测定用样品(5×106细胞/ml)、Th2细胞的PTPRM测定用样品(5×106细胞/ml)及Treg细胞的PTPRM测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替抗PTPRM抗体而添加小鼠IgG2a同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品(5×106细胞/ml)。
(3)CCR6测定用样品的制备
在上述的“(1)MCAM测定用样品的制备”中,代替PE标记抗MCAM抗体而使用终浓度1.0μg/ml的PE标记抗CCR6抗体(BDBioscience公司)进行同样的操作来制备Th17细胞的CCR6测定用样品(5×106细胞/ml)、Th1细胞的CCR6测定用样品(5×106细胞/ml)、Th2细胞的CCR6测定用样品(5×106细胞/ml)及Treg细胞的CCR6测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替上述的PE标记抗CCR6抗体而添PE标记小鼠IgG1同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品(5×106细胞/ml)。
(4)FOXP3测定用样品的制备
将在实施例1的“2.细胞的培养”中制备的,“无活化刺激”的Th17细胞(5×106细胞/ml)用FOXP3染色缓冲液组(eBioscience公司)固定及进行膜透过处理之后,添PE标记抗FOXP3抗体(Biolegend公司)至终浓度达到3.125μg/ml而使于4℃反应20分钟。
反应后,添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水(PBS),通过离心分离回收Th17细胞来进行清洗。将清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS而制备Th17细胞的FOXP3测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替“无活化刺激”的Th17细胞而使用“无活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞、及Treg细胞,进行同样的操作来分别制备Th1细胞的FOXP3测定用样品(5×106细胞/ml)、Th2细胞的FOXP3测定用样品(5×106细胞/ml)及Treg细胞的FOXP3测定用样品(5×106细胞/ml)。
代替上述的PE标记FOXP3抗体而添加PE标记小鼠IgG1同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品(5×106细胞/ml)。
(5)GRP34测定用样品的制备
将在实施例1的“2.细胞的培养”中制备的,“无活化刺激”的Th17细胞用5%FBS/RPMI制备成达到2.5×105细胞/ml。接下来,添加肉豆蔻酰乙酸佛波酯至终浓度达到50ng/ml及添加离子霉素至终浓度达到1μM,于37℃温育4小时来刺激Th17细胞。接下来,添加布雷菲德菌素A至终浓度达到10μg/ml,于37℃温育2小时。
培养后,添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水(PBS),通过离心分离回收Th17细胞来进行2次清洗。向清洗的Th17细胞添加2%多聚甲醛而固定。固定后,添加皂苷缓冲液(0.5%皂苷、0.5%牛血清白蛋白(BSA)、1mM叠氮化钠(PBS中))来增进Th17细胞的细胞膜的透过性。
向皂苷缓冲液处理后的样品添加抗GPR34抗体(LifespanBiosciences公司)至终浓度达到25.0μg/ml,使于4℃反应20分钟。反应后,添加皂苷缓冲液,通过离心分离回收Th17细胞。将回收的Th17细胞悬浮于皂苷缓冲液。向此悬浮液添加PE标记抗小鼠IgG抗体(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟。
使与PE标记抗小鼠IgG抗体反应之后,添加皂苷缓冲液,通过离心分离回收Th17细胞来进行2次清洗。将清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS而制备Th17细胞的GRP34测定用样品(2.5×105细胞/ml)。
代替“无活化刺激”的Th17细胞而使用“无活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞、及Treg细胞进行同样的操作来分别制备Th1细胞的GRP34测定用样品、Th2细胞的GRP34测定用样品及Treg细胞的GRP34测定用样品。
代替上述的,抗GPR34抗体而添加小鼠IgG2a同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟来制备阴性对照用样品(2.5×106细胞/ml)。
(6)IL-17A测定用样品的制备
将在实施例1的“2.细胞的培养”中制备的“无活化刺激”的Th17细胞用5%FBS/RPMI制备成2.5×105细胞/ml。接下来,添加肉豆蔻酰乙酸佛波酯至终浓度达到50ng/ml及添加离子霉素至终浓度达到1μM,于37℃温育4小时来刺激Th17细胞。接下来,添加布雷菲德菌素A至终浓度达到10μg/ml,于37℃温育2小时。
培养后,添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水(PBS),通过离心分离回收Th17细胞来进行清洗。向清洗的Th17细胞添加2%多聚甲醛而固定。固定后,添加皂苷缓冲液(0.5%皂苷、0.5%牛血清白蛋白(BSA)、1mM叠氮化钠(PBS中))而增进Th17细胞的细胞膜的透过性。
向皂苷缓冲液处理后的样品添加PerCP-Cy5.5标记抗IL-17A抗体(eBioscience公司)至终浓度达到0.15μg/ml,使于4℃反应20分钟。
反应后,添加皂苷缓冲液,通过离心分离回收Th17细胞来进行清洗。将清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS而制备Th17细胞的IL-17A测定用样品(2.5×105细胞/ml)。
代替上述的PerCP-Cy5.5标记抗IL-17A抗体而添加PerCP-Cy5.5标记小鼠IgG1同种型对照(eBioscience公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟来制备阴性对照用样品(2.5×106细胞/ml)。
(7)IFN-γ测定用样品的制备
在上述的“(6)IL-17A测定用样品的制备”中,代替PerCP-Cy5.5标记抗IL-17A抗体而使用终浓度1.0μg/ml的Alexa488标记抗IFN-γ抗体(Biolegend公司),进行同样的操作来制备Th17细胞的IFN-γ测定用样品(2.5×105细胞/ml)、Th1细胞的IFN-γ测定用样品(2.5×105细胞/ml)、Th2细胞的IFN-γ测定用样品(2.5×105细胞/ml)及Treg细胞的IFN-γ测定用样品(2.5×105细胞/ml)。
代替上述的Alexa488标记抗IFN-γ抗体而添加Ale×488标记小鼠IgG1同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟来制备阴性对照用样品(2.5×106细胞/ml)。
(8)IL-4测定用样品的制备
在上述的“(6)IL-17A测定用样品的制备”中,代替PerCP-Cy5.5标记抗IL-17A抗体而使用终浓度0.2μg/ml的APC标记抗IL-4抗体(eBioscience公司),进行同样的操作来制备Th17细胞的IL-4测定用样品(2.5×105细胞/ml)、Th1细胞的IL-4测定用样品(2.5×105细胞/ml)、Th2细胞的IL-4测定用样品(2.5×105细胞/ml)及Treg细胞的IL-4测定用样品(2.5×105细胞/ml)。
代替上述的APC标记抗IL-4抗体而添加APC标记大鼠IgG1同种型对照(Biolegend公司)至终浓度达到1.0μg/ml,使于4℃反应20分钟来制备阴性对照用样品(2.5×106细胞/ml)。
2.在使用流式细胞仪的各测定用样品中的蛋白质标记物的表达解析
将制备的各测定用样品使用FACSCanto II(BD Bioscience公司)及FACS DIVA软件(BD Bioscience公司)来解析。通过解析得到的荧光强度的直方图(粒度分布)示于图2~图9。图2~图9分别示从MCAM测定用样品、PTPRM测定用样品、GPR34测定用样品、CCR6测定用样品、IL-17A测定用样品、IFN-γ测定用样品、IL-4测定用样品、及FOXP3测定用样品得到的直方图。再有,图2~图9的直方图的纵轴示细胞数,横轴示荧光强度。另外,直方图右上的数值示,在各测定用样品中,相对于全细胞数的标记物阳性细胞数的比率(%)。其中,阳性细胞和阴性细胞的判断是以在阴性对照中的最大的荧光强度作为基准而进行。即,将示相比在阴性对照中的最大的荧光强度更高的荧光强度的细胞判断为阳性细胞。相反,将示在阴性对照的最大的荧光强度以下的荧光强度的细胞判断阴性细胞。阳性细胞比率作为相对于全细胞数的阳性细胞数的比而算出。
CCR6及IL-17A是Th17细胞的已知标记物。从图5及图6知,在Th17细胞中,CCR6及IL-17A的蛋白质的表达量高。IFN-γ是Th1细胞的已知标记物。从图7知,在Th1细胞中,IFN-γ的蛋白质的表达量高。IL-4是Th2细胞的已知标记物。从图8知,在Th2细胞中,IL-4的蛋白质的表达量高。FOXP3是Treg细胞的已知标记物。从图9知,在Treg细胞中,FOXP3的蛋白质的表达量高。因此知,各测定用样品是适宜于蛋白质标记物的表达解析的样品。
从图2~图4知,在Th17细胞中,MCAM、PTPRM及GPR34的蛋白质的表达量高。另外知,MCAM测定用样品、PTPRM测定用样品及GPR34测定用样品的Th17细胞的阳性细胞率是与CCR6测定用样品及IL-17A测定用样品的阳性细胞率同等以上。因此明了,在实施例1中,作为Th17细胞检测用多核苷酸标记物鉴定的基因的MCAM、PTPRM及GPR34,连它们编码的蛋白质也作为Th17细胞检测用蛋白质标记物利用可能。
【实施例3:通过实时PCR法的Th17细胞检测用多核苷酸标记物的表达解析】
1.cDNA的制备
(1)“无活化刺激”的细胞的cDNA的制备
将在实施例1的“3.总RNA的提取”中提取的,“无活化刺激”的Th17细胞的总RNA(0.1μg)使用poly dT引物(北海道System Science股份公司)、随机引物(北海道System Science股份公司)及SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen公司)来逆转录,得到“无活化刺激”的Th17细胞的cDNA。再有,逆转录根据附带文书的记载进行。
代替“无活化刺激”的Th17细胞的总RNA(0.1μg)而使用“无活化刺激”的Th1细胞的总RNA(0.1μg)、Th2细胞的总RNA(0.1μg)及Treg细胞的总RNA(0.1μg),进行同样的操作来分别得到“无活化刺激”的Th1细胞的cDNA、“无活化刺激”的Th2细胞的cDNA及“无活化刺激”的Treg细胞的cDNA。
cDNA的取得中使用的,“无活化刺激”的各细胞的待测样品数示于表10。
【表10】
Th1细胞 | Th2细胞 | Th17细胞 | Treg细胞 | |
无活化刺激 | 5 | 5 | 5 | 4 |
(2)“有活化刺激”的细胞的cDNA的制备
将在实施例1的“2.细胞的培养”中制备的“无活化刺激”的Th17细胞用5%FBS/RPMI制备成2.5×105细胞/ml,使用T细胞活化/扩展试剂盒(Miltenyi Biotec公司)于37℃温育3小时来刺激Th17细胞。从活化刺激的“有活化刺激”的Th17细胞,通过与实施例1的“3.总RNA的提取”同样的操作,提取Th17细胞的总RNA。将提取的“有活化刺激”的Th17细胞的总RNA(0.1μg)使用poly dT引物(北海道System Science股份公司)、随机引物(北海道System Science股份公司)及SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen公司)来逆转录,得到“有活化刺激”的Th17细胞的cDNA。再有,逆转录根据附带文书的记载进行。
代替“有活化刺激”的Th17细胞的总RNA(0.1μg),使用“有活化刺激”的Th1细胞的总RNA(0.1μg)、Th2细胞的总RNA(0.1μg)、及Treg细胞的总RNA(0.1μg),进行同样的操作来分别得到“有活化刺激”的Th1细胞的cDNA、“有活化刺激”的Th2细胞的cDNA及“有活化刺激”的Treg细胞的cDNA。
cDNA的取得中使用的“有活化刺激”的各细胞的待测样品数示于表11。
【表11】
Th1细胞 | Th2细胞 | Th17细胞 | Treg细胞 | |
有活化刺激 | 5 | 5 | 5 | 3 |
2.引物组的设计
使用Primer3软件设计以下的引物组。
(1)Th17细胞的检测用引物组
在实施例1中,设计作为被鉴定为Th17细胞检测用多核苷酸标记物的基因的ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、L1CAM、MCAM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5(LOC100134440)、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IL1A、BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2的各引物组。
(2)Th17细胞的已知的基因标记物的引物组
设计作为Th17细胞的已知的基因标记物的CCR6、RORC及IL-17A的各引物组。
(3)Th1细胞的已知的基因标记物的引物组
设计作为Th1细胞的已知的基因标记物的TBX21及IFN-γ的各引物组。
(4)Th2细胞的已知的基因标记物的引物组
设计作为Th2细胞的已知的基因标记物的GATA3及IL-4的各引物组。
(5)Treg细胞的已知的基因标记物的引物组
设计作为Treg细胞的已知的基因标记物的FOXP3的引物组。
(6)内部标准基因的引物组
设计作为内部标准基因的Gapdh、ACTB、B2M及UBC的各引物组。
设计的各引物组示于表12。
【表12】
3.通过实时PCR法的基因标记物的表达解析
(1)以“无活化刺激”的细胞的cDNA作为模板的实时PCR
在上述的“1.cDNA的制备”中,将从5个待测样品取得的“无活化刺激”的Th17细胞的cDNA各自作为模板使用。引物组使用在“2.引物组的设计”中设计的,ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、L1CAM、MCAM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IL1A、BHLHE22、PPARG、SIM1、SNAI2、TBX21、GATA3、FOXP3、CCR6、RORC、GAPDH、ACTB、B2M及UBC的引物组。将模板和引物组,使用Power SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems公司),用7300 Real TimePCR System(Applied Biosystems公司)进行实时PCR来测定各基因的Ct值。再有,PCR条件是于50℃2分钟、于95℃10分钟的反应之后,重复45次于95℃15秒钟和于60℃1分钟,重复2次于95℃15秒钟和于60℃1分钟。另外,Ct值通过使用7300 Fast SDS software(Applied Biosystems公司)的自动计算来测定。
代替“无活化刺激”的Th17细胞的cDNA,将从5个待测样品制备的“无活化刺激”的Th1细胞的cDNA、从5个待测样品制备的“无活化刺激”的Th2细胞的cDNA、从4个待测样品制备的“无活化刺激”的Treg细胞cDNA各自作为模板使用,与上述同样地进行实时PCR,测定各基因的Ct值。
(2)“有活化刺激”的细胞的cDNA作为模板的实时PCR
在上述的“1.cDNA的制备”中,将从5个待测样品取得的“有活化刺激”的Th17细胞的cDNA作为模板使用。引物组使用在“2.引物组的设计”中设计的,AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IFNG、IL4、IL17A、GAPDH、ACTB、B2M及UBC的引物组。将模板和引物组,使用Power SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems公司),用7300 Real Time PCRSystem(Applied Biosystems公司)进行实时PCR,测定各基因的Ct值。再有,PCR条件是于50℃2分钟、于95℃10分钟的反应之后,重复45次于95℃15秒钟和于60℃1分钟,重复2次于95℃15秒钟和于60℃1分钟。另外,Ct值通过使用7300 Fast SDS software(AppliedBiosystems公司)的自动计算来测定。
代替“有活化刺激”的Th17细胞的cDNA,将从5个待测样品制备的“有活化刺激”的Th1细胞的cDNA、从5个待测样品制备的“有活化刺激”的Th2细胞的cDNA、及从3个待测样品制备的“有活化刺激”的Treg细胞的cDNA各自作为模板使用,与上述同样地进行实时PCR,测定各基因的Ct值。
(3)表达量的解析
基于在实时PCR中得到的Ct值,从式(I)求出各基因标记物的表达量。
(各基因的表达量)=100000×2-x ...(I)
(但是,x=(各基因Ct值)-((Gapdh基因Ct值+ACTB基因Ct值+B2M基因Ct值+UBC基因Ct值)/4))
再有,“无活化刺激”的Th17细胞的各基因标记物的表达量将从作为模板使用的5种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。“有活化刺激”的Th17细胞的各基因标记物的表达量也将从作为模板使用的5种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。
同样地,“无活化刺激”或“有活化刺激”的Th1细胞及Th2细胞的各基因标记物的表达量是将各自从作为模板使用的5种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。另外,“无活化刺激”的Treg细胞的各基因标记物的表达量是将各自从作为模板使用的4种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。另外,“有活化刺激”的Treg细胞的各基因标记物的表达量是将各自从作为模板使用的3种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。
各基因标记物的表达量示于表13及表14。其中,表13示在“无活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞及Th17细胞中各基因标记物的表达量。表14示在“有活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞及Th17细胞中各基因标记物的表达量。
在“无活化刺激”的细胞中各基因标记物的表达量
【表13】
在“有活化刺激”的细胞中各基因标记物的表达量
【表14】
表15及表16示Th17细胞的各基因标记物的表达量和Th1细胞、Th2细胞及Treg细胞的各基因标记物的表达量的比。其中,表15示在“无活化刺激”的Th17细胞中各基因标记物的表达量和在“无活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞及Treg细胞中各基因标记物的表达量的比。表16示在“有活化刺激”的Th17细胞中各基因标记物的表达量和在“有活化刺激”的Th1细胞、Th2细胞及Treg细胞中各基因标记物的表达量的比。再有,在表15及表16中,Th17/Th1、Th17/Th2及Th17/Treg所示的值通过以下的式算出。
Th17/Th1=(在Th17细胞中的表达量)/(在Th1细胞中的表达量)
Th17/Th2=(在Th17细胞中的表达量)/(在Th2细胞中的表达量)
Th17/Treg=(在Th17细胞中的表达量)/(在Treg细胞中的表达量)
【表15】
【表16】
从表15知,ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、L1CAM、MCAM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、IL1A、BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2的表达量在“无活化刺激”的Th17细胞中,相比“无活化刺激”的Th1细胞、“无活化刺激”的Th2细胞及“无活化刺激”的Treg细胞,更高2倍以上。
另外,从表16知,AKAP12、C9orf125、POPDC3、UNC13C、PCOLCE2、PNOC及TGFBI的表达量,在“有活化刺激”的Th17细胞中,相比“有活化刺激”的Th1细胞、“有活化刺激”的Th2细胞及“有活化刺激”的Treg细胞,更高2倍以上。
从而示,这些的基因作为用于Th17细胞的检测的多核苷酸标记物有用。
【实施例4:健康人及类风湿性关节炎患者的多核苷酸标记物的表达解析】
1.从健康人及类风湿性关节炎患者的末梢血的CD4阳性细胞的单离
用采血管NP-HE0557(NIPRO公司)采集健康的成人(健康人)及类风湿性关节炎患者的末梢血,使用结合抗CD4抗体的磁珠(Miltenyi Biotec公司),单离末梢血CD4阳性细胞。再有,使用抗CD4抗体珠的CD4阳性细胞的单离根据附带文书的记载进行。
2.末梢血CD4阳性细胞的cDNA的制备
从单离的末梢血CD4阳性细胞,通过与实施例1的“3.总RNA的提取”同样的操作提取总RNA。将提取的,末梢血CD4阳性细胞的总RNA(0.1μg)使用poly dT引物(北海道System Science股份公司)、随机引物(北海道System Science股份公司)及SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen公司)逆转录,得到末梢血CD4阳性细胞的cDNA。再有,逆转录根据附带文书的记载进行。
表17示cDNA的取得中使用的,末梢血CD4阳性细胞的待测样品数。
【表17】
健康人 | 类风湿性关节炎患者 | |
无活化刺激 | 9 | 9 |
3.通过实时PCR法的基因标记物的表达解析
(1)末梢血CD4阳性细胞的cDNA作为模板的实时PCR
将在上述的“2.末梢血CD4阳性细胞的cDNA的制备”中制备的,9个待测样品的健康人及9个待测样品的类风湿性关节炎患者的末梢血CD4阳性细胞的cDNA各自作为模板使用。引物组使用“2.引物组的设计”中设计的,ATP6V0A4、BVES、C5orf40、UPK1B、DRD2、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、BHLHE22、SIM1、CCR6、RORC、GAPDH、ACTB、B2M、及UBC的引物组。将模板和引物组,使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司),用7300 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司)进行实时PCR,测定各基因的Ct值。再有,PCR条件是于50℃2分钟、于95℃10分钟的反应之后,重复45次于95℃15秒钟和于60℃1分钟,重复2次于95℃15秒钟和于60℃1分钟。另外,Ct值通过使用7300 Fast SDSsoftware(Applied Biosystems公司)的自动计算来测定。
(2)表达量的解析
根据上述的式(I)求出各基因标记物的表达量。再有,类风湿性关节炎患者的末梢血CD4阳性细胞的各基因标记物的表达量是将从作为模板使用的9种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。同样地,健康人的末梢血CD4阳性细胞的各基因标记物的表达量也是将从作为模板使用的9种cDNA得到的对象的基因标记物的表达量的平均值作为其基因标记物的表达量。
表18示健康人及类风湿性关节炎患者的末梢血CD4阳性细胞的各基因标记物的表达量,以及健康人和类风湿性关节炎患者的末梢血CD4阳性细胞的各基因标记物的表达比。表18中,“RA”示类风湿性关节炎患者,“HC”示健康者。再有,在表18中,RA组/HC组所示的值通过以下的式算出。
RA组/HC组=(在类风湿性关节炎患者的末梢血CD4阳性细胞中的表达量)/(在健康人的末梢血CD4阳性细胞中的表达量)
【表18】
从表18知,ATP6V0A4、BVES、C5orf40、UPK1B、DRD2、PCOLCE2、PNOC、TGFBI、BHLHE22、及SIM1的表达量是在RA组中,相比HC组更高3倍以上。因此示,这些的基因作为用于类风湿性关节炎患者的筛选的多核苷酸标记物而有用。
【实施例5:在人末梢血来源培养的Th17细胞及Th22细胞中各多核苷酸标记物的表达量比的解析】
1.从人末梢血的Th17及Th22细胞的单离
将从健康的成人的末梢血得到的血沉棕黄层覆盖于Ficoll-paqueplus溶液(GE HEALTHCARE Bioscience股份公司)上,通过将其离心分离得到单核细胞级分。使用结合抗CD4抗体的磁珠(MiltenyiBiotec公司),从上述的级分粗纯化CD4阳性细胞。
将如此得到的CD4阳性细胞使用表19所示的荧光标记抗体染色之后,使用细胞分选仪(FACS Aria:Becton Dickinson公司)分离Th17及Th22的各细胞。再有,分离的选通如表20所示进行。
【表19】
抗原 | 荧光标记物质 | 克隆 | 厂商 |
CD4 | APC-Cy7 | RPA-T4 | BD Biosciences公司 |
CD25 | PE-Cy7 | BC96 | eBioscience公司 |
CXCR3 | Alexa Fluor(商标)488 | 1C6/CXCR3 | BD Biosciences公司 |
CCR4 | APC | FAB1567A | R&D systems公司 |
CCR6 | PE | 11A9 | BD Biosciences公司 |
CD45RA | APC | HI100 | BioLegend公司 |
CCR10 | PE | 6588-5 | BioLegend公司 |
【表20】
细胞 | 选通 |
Th17 | CD4高CD25低-阴性CXCR3-CCR6+CCR4+ |
Th22 | CD4高CD25低-阴性CD45RA-CXCR3-CCR10+ |
再有,对于上述的筛选的操作的详细,请参照由Acosta-RodriguezEV.等的文献(Surface phenotype and antigenic specificity of humaninterleukin 17-producing T helper memory cells.,Nat Immunol.,vol.8,p.639-646(2007))及由TrifariS.的文献(非专利文献2)。
2.Th17及Th22细胞的培养
将在上述的步骤1.单离的成人末梢血来源的Th17及Th22细胞各自以1.5×105细胞/0.3ml/孔的密度接种到96孔板。培养基使用Yssel培养基(IMDM、1%人AB型血清、0.25%BSA、1.8mg/l 2-氨基甲醇、40mg/l转铁蛋白、5mg/l胰岛素、2mg/l亚油酸、2mg/l油酸、2mg/l棕榈酸、1%青霉素/链霉素)。
另外,为了上述的细胞的活化及增殖,向各孔各添加0.75×105个由抗CD2/3/28抗体包被的磁珠(Miltenyi Biotec公司)(以下,也称为“抗体珠”)。然后,添加适宜于Th17及Th22细胞的各自的分化培养的细胞因子及中和抗体,将细胞在37℃、5%CO2的温育器内培养。再有,使用的细胞因子及中和抗体示于表21。
【表21】
上述的细胞因子的浓度是,将IL-6作为50ng/ml,将IL-6以外作为10ng/ml。另外,上述的抗体的浓度是,将抗IFN-γ抗体作为10μg/ml,将抗IL-4抗体及抗TGF-β抗体作为2.5μg/ml。
再有,细胞因子及中和抗体各自获自R&D systems公司及eBioscience公司。
从培养开始3天后,用包括上述的细胞因子及抗体的培养基将细胞3倍稀释,再培养7天(合计10天)。
从培养开始10天后,将得到的Th17及Th22细胞各自二等分,将一方的各细胞用Yssel培养基及PBS清洗之后,将细胞通过离心分离回收,于-80℃冷冻保存至之后的RNA提取步骤。将这些各自作为“无活化刺激”的Th17及Th22细胞。另外,向另一方的各细胞添加上述的抗体珠,通过再培养3小时来再度活化之后,将细胞通过离心分离回收,同样地于-80℃冷冻保存。将这些各自作为“有活化刺激”的Th17及Th22细胞。
3.总RNA的提取
为了从上述的步骤2.得到的各细胞提取总RNA,分别使用RNeasyPlusMini试剂盒及RNeasymicro试剂盒(QIAGEN公司)。再有,具体性的操作根据各试剂盒的附带文书的记载进行。
4.微阵列表达解析
使用Two-Cycle Target标记及Control Reagents(Affymetrix公司),将在上述的步骤3.提取的各细胞的总RNA(10~100ng)逆转录为cDNA,再进行向生物素化cRNA的转录反应。接下来,将扩增的生物素化cRNA(20μg)片段化。再有,具体性的操作根据试剂盒附带的说明书的记载进行。
将在上述得到的各细胞来源的生物素化cRNA(15μg)作为待测样品,各自添加到GeneChip Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array(Affymetrix公司),移到GeneChip Hybridization Oven 640(Affymetrix公司),在45℃、60rpm的条件下进行16小时杂交。
杂交结束后,将上述的微阵列使用GeneChip Fluidic Station450(Affymetrix公司)清洗及进行荧光标记,使用GeneChip扫描仪30007G(Affymetrix公司)扫描,取得荧光强度数据。
将得到的荧光强度的数据使用表达解析软件GeneSp环GXVer.11(Agilent Technologies公司),通过MAS5算法标准化,得到对于在各细胞中基因的相对荧光强度。此相对荧光强度相当于细胞中的基因的表达量。
表22及表23示将对应于在实施例1得到的Th17细胞中的各多核苷酸标记物的基因的相对荧光强度与Th22细胞的相对荧光强度比较的结果。表22示在“无活化刺激”的Th17及Th22细胞中,各多核苷酸标记物的表达量比。表23示在“有活化刺激”的Th17及Th22细胞中,各多核苷酸标记物的表达量比。表中,“Th17/Th22”示对应于在Th17细胞中的多核苷酸标记物的基因的相对荧光强度除以对应于在Th22细胞中的多核苷酸标记物的基因的相对荧光强度的值。
【表22】
【表23】
如从表22及表23明了,在实施例1得到的Th17细胞中的各多核苷酸标记物在Th17细胞中,相比Th22细胞更多表达3倍以上。因此示,表22及表23所示的各多核苷酸标记物在Th17细胞的检测中有用。
本申请与2009年7月29日申请的日本国专利申请特愿2009-176755号相关,将这些的专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部通过引用并入本说明书中。
Claims (10)
1.人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用多核苷酸标记物,其为有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸、其变异型及片段:
由下列组成的编码膜蛋白质的基因:ADAM12、ANKS1B、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、DMD、GPR34、IRS2、KCNE3、L1CAM、MCAM、MFAP3L、MYO7A、PTPRM、SHROOM2、SLC16A4、SLCO2B1、TANC2、TJP1、TMEM163、TNS3、UPK1B、WDFY3、DRD2、GJC1、PGBD5(LOC100134440)、MS4A7、ODZ4、PHKA1、RGS1、SHB、SLC44A3、SLC6A15、SYNGR3、AKAP12、C9orf125、DPY19L2、HRH4、MUC20、POPDC3、SORBS1、TANC1、TMEM44及UNC13C;
由下列组成的编码分泌蛋白质的基因:CXCL13、PCOLCE2、PNOC、SMPDL3A、TGFBI、C17orf99、EBI3、IL1A及WNT3;
由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因:BCAT1、BHLHE22、C13orf18(LOC728970)、CA2、CCDC3、CDS1、CHN1、CLIC5(LOC100131610)、CTSH、CYP7B1、DAPK2、DMRT1、DSE、FBXL17、FBXL21、FHOD3、H2AFY2、HLX、IRAK3、MACC1、MAML3、MYO10、OTUB2、PAPSS2、PCBP3、PDE4DIP、PLD1、PPARG、PTPN13、RGS18、SIM1、SNAI2、SOX2、SPIRE1、TBC1D12、TGM5、TMOD1、TUBB6、DDIT4L、DHRS9、ERC2、FERMT2、HHEX、HS3ST1、NR5A2、PHLDA1、RBM20、NINL、RTN2、SH3RF2、TSHZ2、EML1、HIST1H2BC、MAP3K4、PDK4、RGS2及RGS20;
由下列组成的基因:C1orf106、C6orf145、LOC401097、MAMLD1、ZC3H12C、C12orf64、C6orf168、CAMSAP1L1及MAGED4(MAGED4B)、以及
包含选自SEQ ID NO:147~151、157~162及167~174的至少一个碱基序列的基因。
2.权利要求1所述的人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用多核苷酸标记物,其中上述多核苷酸是有选自下列的至少1种基因的碱基序列的多核苷酸:
由下列组成的编码膜蛋白质的基因:ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5(LOC100134440)、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3及UNC13C;
由下列组成的编码分泌蛋白质的基因:PCOLCE2、PNOC、TGFBI及IL1A;以及
由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因:BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
3.人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用蛋白质标记物,其为由权利要求1所述的至少1种基因编码的蛋白质、其功能上同等的变异型及片段。
4.权利要求3所述的人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用蛋白质标记物,其中上述蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的蛋白质:
由下列组成的编码膜蛋白质的基因:ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、CDH4、DIO2、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHROOM2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5(LOC100134440)、ODZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orf125、POPDC3及UNC13C;
由下列组成的编码分泌蛋白质的基因:PCOLCE2、PNOC、TGFBI及IL1A;以及
由下列组成的编码细胞内蛋白质的基因:BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
5.权利要求4所述的人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用蛋白质标记物,其中上述蛋白质是由选自下列的至少1种基因编码的膜蛋白质:GPR34、MCAM及PTPRM。
6.检测人的产生IL-17的辅助性T细胞的方法,其包括:在包含人来源的细胞的样品中,检测至少1种权利要求1所述的Th17细胞检测用多核苷酸标记物或至少1种权利要求3所述的Th17细胞检测用蛋白质标记物的存在。
7.权利要求6所述的方法,其使用与上述多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针来检测上述多核苷酸标记物。
8.权利要求7所述的方法,其中上述核酸探针是用于将上述多核苷酸标记物通过核酸扩增法扩增的引物组。
9.权利要求6所述的方法,其使用与上述蛋白质标记物特异性地结合的核酸适体、抗体、配体或受体来检测上述多核苷酸标记物。
10.人的产生IL-17的辅助性T细胞的检测用试剂,其包含选自下列的至少1种:
与权利要求1所述的多核苷酸标记物特异性地杂交的核酸探针;及
与权利要求3所述的蛋白质标记物特异性地结合的核酸适体、抗体、配体或受体。
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