CN105764527A

CN105764527A - 新b细胞细胞因子的鉴定

Info

Publication number: CN105764527A
Application number: CN201480063597.2A
Authority: CN
Inventors: 艾伯特·兹洛特尼克; 彼得·海维兹; 万·菲·鲁; 阿曼达·M·伯克哈特; 伊琳娜·奥谢什
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2016-07-13
Also published as: MX2016006586A; EP3071232A2; US20200087368A1; CA2929313A1; EP3071232A4; WO2015077506A2; JP2016540506A; US20160297860A1; AU2014352891A1; WO2015077506A3; AU2014352891B2

Abstract

提供涉及作为一种由活化的B细胞产生的新细胞因子IL40的组合物和方法。所述组合物包括：a)抗IL40抗体、IL40肽和IL40蛋白；b)编码IL40基因和cDNA序列的核酸；以及c)其药物组合物。所述方法包括治疗、诊断和分离技术。

Description

新B细胞细胞因子的鉴定

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明根据国立卫生研究院的资助号AI096278在政府资助下完成。政府享有本发明中的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年11月20日提交的美国临时专利申请号61/906,855的权益，所述美国临时专利申请以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明关于涉及称为IL40的新细胞因子的组合物和方法。

背景技术

细胞因子是调控免疫系统的小分泌蛋白质。它们是调控免疫应答(包括应答的类别和量级)的极其重要介质。实例包括白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子超家族和干扰素。这些中的许多当前正变得作为免疫治疗剂加以探究。它们涉及于自身免疫疾病、癌症和其它病痛中。

发明内容

本发明的实施方案涉及称为白介素40(IL40或IL-40)的本文新细胞因子的鉴定。所述分子是一种由活化的B细胞产生的小分泌蛋白质。因此，它是活化的B细胞的生物标志物。在如全身性红斑狼疮的某些疾病中，它也被上调。因为B细胞与淋巴瘤和自身免疫疾病相关联，所以预期IL40在这些疾病的病理学中起作用，并且将为诊断或预后生物标志物。它也将通过以下方式来影响淋巴瘤的发展：影响这些癌症的发展，或致使它们对凋亡具有抗性，增强它们的生长，或有利于它们的分化。在自身免疫性方面，由病原性B细胞产生的IL40将会影响其它细胞，并且有利于与这些病状相关的炎症性应答。也涵盖使用IL40鉴定它的受体的方法。鉴定它的特异性受体是重要的，因为配体和它的受体的可用性也可被利用来鉴定这个相互作用的可用于上述适应症中的激动剂和拮抗剂。

在一个方面，提供一种针对C17orf99多肽基因产物(IL40)的抗体。抗IL40抗体可为：

a)IgG、IgM、IgA、IgD或IgE；

b)单克隆抗体；

c)Fab'、Fab、F(ab')₂、单结构域抗体(sdAb)、Fv或scFv(单链Fv)；

d)标记的抗体；

e)中和抗体；或

f)a)-e)的任何组合。

在另一方面，提供一种使用抗IL40抗体的方法。在所述方法中，可使用抗IL40抗体，例如：

a)在检测样品中的IL40的方法中。所述方法包括在免疫检测方法中使用抗体作为用于检测IL40的检测剂来免疫检测IL40。在一些实施方案中，免疫检测方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、组织学分析、荧光激活的细胞分选、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、免疫组织化学分析、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、蛋白质印迹或斑点印迹。在ELISA测定中，识别给定蛋白质的两种不同表位的两种不同抗体可用于通过在比色测定中检测连接于一种抗体的底物来检测所述蛋白质。在组织学分析中，标记的抗体可用于检测呈新鲜冷冻组织形式或呈福尔马林固定的石蜡包埋样品形式的组织样品中的蛋白质。在荧光激活的细胞分选中，荧光染料标记的抗体可用于检测表达特定蛋白质的细胞。在分泌蛋白质的情况下，存在允许通过为本领域技术人员所知的程序对所述蛋白质进行细胞内染色的可用技术。在放射免疫测定中，放射性标记的蛋白质可用于通过测量竞争测定中存在的放射性的量(例如通过使用特异性抗体)来测量给定样品中存在的蛋白质的量。这些测定的变化形式涉及通过取决于特异性抗体的亲和力/亲合力的竞争测定，使用抗体/标记化合物测量给定样品中的特定蛋白质的量。在蛋白质印迹中，给定蛋白质可通过在凝胶转移之后使用特异性抗体检测，这是一种也允许技术人员知晓检测的蛋白质的分子量的方法。

b)在治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗IL40抗体以中和IL40。在一些实施方案中，疾病是自身免疫疾病或淋巴瘤。

c)在检测样品中的IL40的方法中。所述方法包括在针对涉及IL40的疾病的诊断或治疗诊断方法中使用抗IL40抗体作为检测剂来免疫检测IL40。存在基于使用抗体检测生理流体中可溶性蛋白质的存在的许多可用方法。在最常见方法之中的是酶联免疫测定，其中使用识别IL40的不同表位的两种不同抗体。它们中的一个被用作其中放置有生理流体的板中的捕集抗体。这个抗体被固着于板，并且“捕集”流体中存在的IL40。第二抗体被连接于酶。最后，使用由酶处理，并且通常导致显现可在专门化ELISA读取器中检测的给定颜色的底物。其它方法包括使用放射性而非酶底物来测量给定流体中存在的IL40的量的放射免疫测定。流体可从患有不同疾病的患者获得。通常，已发现活化的B细胞在各种癌症(淋巴瘤、白血病)或炎症性或自身免疫疾病(类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’ssyndrome)、僵直性脊椎炎、牛皮癣、其它疾病)的发病机理中起作用。在一些实施方案中，疾病是淋巴瘤、白血病、免疫缺陷或自身免疫疾病。在特定实施方案中，自身免疫疾病是全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或牛皮癣，并且免疫缺陷是IgA缺陷综合征。

d)在纯化或分离表达IL40的细胞的亚组的方法中。所述方法包括使用抗IL40抗体作为纯化/分离剂来纯化或分离所述细胞的亚组。抗体可从杂交瘤培养物纯化。通常，上清液首先经0.45mm过滤器过滤以移除细胞碎片。优选方法涉及蛋白A/G色谱法。向A/G蛋白柱施加过滤的杂交瘤培养物将导致抗体分子以可随后通过改变pH以及从柱洗脱纯化抗体来破坏的键结合A/G蛋白。纯化抗体可接着用各种荧光染料标记，接着用于染色可在荧光激活的细胞分选仪中分析的细胞混悬液。这个程序可导致鉴定表达由抗体识别的抗原的细胞亚组。在一些实施方案中，通过荧光激活的细胞分选(FACS)纯化或分离亚组以选择各细胞亚组。

在另一方面，提供一种产生抗IL40抗体的细胞，其中所述细胞是杂交瘤、重组细菌细胞、重组酵母细胞或重组哺乳动物细胞。细胞可产生任何本文所述的抗IL40抗体。此外，提供包含所述细胞的器官、组织或动物。

在另一方面，提供一种包含IL40或成熟形式的IL40的一部分或完整氨基酸序列的肽或分离的蛋白质。IL40肽或蛋白可为：

a)IL40的序列变体、多态性或物种对应物；

b)IL40的取代、插入或缺失变体；

c)IL40的非序列衍生物，其选自由糖基化修饰的IL40、化学修饰的IL40以及IL40的缀合物组成的组；

d)IL40的功能活性变体；

e)IL40的功能活性区段、IL40的保守区域、或IL40的非保守区域；

f)IL40的融合蛋白；或

g)a)-f)的任何组合。

在一些实施方案中，功能性变体是IL40的激动剂或拮抗剂，并且融合蛋白是共价或非共价构建体或标记的构建体。

IL40将会结合它的将通常存在于淋巴细胞和白细胞的某些群体中的特异性受体。为鉴定受体，可利用如本文所述的方法，其中IL40用标记(诸如FLAG或HIS标签)或放射性标记。如果用基于氨基酸的标记(诸如FLAG或HIS标签)所标记，那么可通过使用用荧光染料标记并且在荧光激活的细胞分选仪(FACS)中检测的二级抗FLAG或抗HIS抗体检测IL40与它的受体的成功结合。如果用放射性标记，那么可通过测量结合于表达受体的细胞的放射性计数监测结合。可通过测量其在各种白细胞群体中的表达由IL40调节的基因(参见例如表5中所列的那些)的表达来监测IL40的生物活性。可在IL40存在下体外培养白细胞(例如脾细胞)6小时，随后从细胞制备mRNA，并且用于通过实时PCR测量这些基因的表达。在体内，IL40为最优产生IgA所必需。因此，可通过向小鼠施用IL40拮抗剂以及此后在各种时间间隔下测量血清或血浆中的IgA水平来在体内监测它们的活性。相反，可通过向IL40-/-小鼠施用IL40激动剂以及在各种时间间隔下测量血清或血浆中的IgA水平来在体内测量它们的活性。成功IL40激动剂应能够矫正由IL40-/-突变诱发的IgA缺陷，并且因此IgA水平应升高至正常小鼠的水平。

IL40融合蛋白也可用于体内或体外监测IL40活性，或体内改变天然IL40的药物动力学。融合蛋白的实例包括但不限于连接于免疫球蛋白重链以使融合将产生IL40-Fc融合蛋白的那些。这个融合蛋白在体内可更稳定，或它可由于能够结合许多白细胞群体中存在的Fc受体(此可导致融合蛋白优先定位于淋巴组织)而展现合乎需要的结合特征。或者，IL40可用于与优先结合B细胞的其它细胞因子或趋化因子一起制备融合蛋白。举例来说，可使IL40融合于白介素4(IL4)基因的各部分，所述部分编码IL4细胞因子的那些结合存在于B细胞亚组与T细胞亚组两者中的IL4受体的部分。或者，可使IL40融合于CXCL13，即一种结合CXCR5的趋化因子，所述CXCR5是一种也优先在B细胞中表达的受体。这些融合蛋白可展现可增强或改变B淋巴细胞的生物应答或它们在人体内的归巢模式的合乎需要的生物性质。

IL40可用放射性(氨基酸或原子)或通过向它的序列添加少许氨基酸来标记。已使用的两种常见标记包括HIS标签和FLAG。后者具有以下优势：存在可易于获得的识别它们的表位并且因此在标记连接于IL40时可用于检测标记的IL40的商业单克隆抗体。

在另一方面，提供一种使用IL40肽或蛋白的方法。在所述方法中，可使用肽或蛋白质，例如：

a)在诱导免疫细胞的方法中。所述方法包括使用肽或蛋白质作为活性剂以诱导免疫细胞产生突触回蛋白2(synaptogyrin2)和/或由B细胞产生的其它IL40诱导蛋白，或诱导免疫细胞的分化或成熟。可在体外在组织培养基中使细胞与IL40(在各种浓度下)一起孵育24小时，通常使用补充以胎牛血清、谷氨酰胺和巯基乙醇的RPMI1640或DMEM或类似组织培养基。

b)在治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的肽或蛋白质，其中所述肽或蛋白质是IL40拮抗剂。在一些实施方案中，疾病是自身免疫疾病或淋巴瘤。

c)在治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的IL40或肽或蛋白质，其中所述肽或蛋白质是IL40激动剂。在一些实施方案中，疾病是IgA缺陷综合征、霍奇金(Hodgkin)或非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤或另一淋巴瘤或白血病；类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、桥本甲状腺炎(Hashimotothyroiditis)、硬皮病、格雷夫斯病(Graves’disease)、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自身免疫肝炎、多发性硬化症、牛皮癣、特应性皮炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎或另一自身免疫疾病。

d)在诊断涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括使用肽或蛋白质作为诊断/治疗诊断方法中的靶标或样品对照。存在基于使用抗体检测生理流体中可溶性蛋白质的存在的许多可用方法，所述流体包括唾液、血清、血浆、精液、支气管肺泡灌洗液、尿、泪、淋巴液、汗液、胆汁、脑脊髓液等。在最常见方法之中的是酶联(ELISA)免疫测定，其中使用识别IL40的不同表位的两种不同抗体。它们中的一个被用作其中放置有生理流体的板中的捕集抗体。这个抗体被固着于板，并且“捕集”流体中存在的IL40。第二抗体被连接于酶。最后，使用由酶处理并且通常导致显现可在专门化ELISA读取器中检测的给定颜色的底物。其它方法包括使用放射性而非酶底物来测量给定流体中存在的IL40的量的放射免疫测定。流体可从患有不同疾病的患者获得。通常，已发现活化的B细胞在各种癌症或炎症性或自身免疫疾病的发病机理中起作用。在一些实施方案中，疾病是淋巴瘤、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或牛皮癣。

e)在鉴定IL40的受体的方法中。所述方法包括使用肽或蛋白质作为用于结合IL40受体的配体。可通过使用可用于结合它的受体的标记的IL40来鉴定IL40受体。配体/受体复合物可接着使用抗IL40或抗标记抗体加以免疫沉淀。所述标记的实例包括His标签、Flag标签等。IL40也可被放射性标记以首先通过放射免疫测定检测表达受体的细胞。使不同细胞与放射性标记的IL40一起孵育，并且在孵育之后，洗涤细胞或使细胞穿过根据粘度而分开的梯度，并且相对于结合的放射性标记的IL40离心游离放射性标记的IL40。保留放射性的细胞应表达特异性IL40受体。

在另一方面，提供一种产生IL40肽或蛋白的细胞，其中所述细胞是重组细菌细胞、重组酵母细胞或重组哺乳动物细胞。细胞可产生任何本文所述的IL40肽或蛋白。此外，提供包含所述细胞的器官、组织或动物。

在另一方面，提供一种包含IL40基因或IL40cDNA的一部分或完整核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包括缺乏一个或多个见于天然基因中的内含子或并有非天然核苷酸的序列。核酸可为以下核酸：

a)包含IL40基因或IL40cDNA的一部分或完整核苷酸序列，其中所述核酸编码本文所述的IL40肽或蛋白；

b)缀合于另一核苷酸序列、标记(例如HIS标签或FLAG)或化学衍生物(诸如乙烯基砜衍生染料)、荧光团或通常用于诸如蛋白质组学的其它技术中的其它标签(诸如生物素)；

c)是基于IL40基因或IL40cDNA序列的引物、探针、反义分子或寡核苷酸；

d)是连接于异源性核酸序列的重组构建体；或

e)a)-d)的任何组合。

在一些实施方案中，异源性核酸序列可为启动子、增强子、载体或表达载体。

在另一方面，提供一种使用含有IL40序列的核酸的方法。在所述方法中，可使用核酸，例如：

a)在治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的核酸，其中所述核酸降低IL40表达。在一些实施方案中，疾病是自身免疫疾病或淋巴瘤。

b)在治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的核酸，其中所述核酸增加IL40表达。在一些实施方案中，疾病是IgA缺陷综合征、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤或另一淋巴瘤或白血病；类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、桥本甲状腺炎、硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自身免疫肝炎、多发性硬化症、牛皮癣、特应性皮炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎或另一自身免疫疾病。此外，在一些实施方案中，核酸可为RNAi分子。

c)在诊断涉及IL40的疾病的方法中。所述方法包括使用核酸作为针对疾病的诊断/治疗诊断方法中的探针。在一些实施方案中，疾病是淋巴瘤、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或牛皮癣。

在另一方面，提供一种包含重组形式的含有IL40序列的核酸的细胞，其中所述细胞是重组细菌细胞、重组酵母细胞或重组哺乳动物细胞。细胞可包含任何本文所述的含有IL40序列的核酸。此外，提供包含所述细胞的器官、组织或动物。

在另一方面，提供一种选择表达IL40的细胞的亚组的方法。所述方法包括向包含表达IL40的细胞的细胞群体中添加结合IL40的分子，以及选择被IL40结合分子标记的细胞以提供所选细胞的群体。表达IL40的细胞包括B细胞、可能其它白细胞以及骨髓和胎儿肝细胞。可表达IL40的细胞类型是可包括上皮、内皮、纤维母细胞、其它基质细胞、或具有朝向某一谱系的各种细胞定型类型或水平的造血前体的这些器官。在一些实施方案中：a)表达IL40的细胞可为小鼠、大鼠或人细胞；b)IL40结合分子可为抗IL40抗体或IL40受体；c)所选细胞可选自血液、体液、细胞混悬液或患者样品；d)所选细胞可为用于研究IL40表达性细胞的研究工具；e)此外，当所选细胞是血细胞时，所选细胞可为：i)由所选细胞产生的免疫球蛋白的mRNA的来源；或ii)用于产生完全人源化抗体的新方法的来源；或f)a)-e)的任何组合。

在方法的另一实施方案中，提供一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所选细胞。在一些实施方案中，疾病是IgA缺陷综合征、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤或另一淋巴瘤或白血病；类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、桥本甲状腺炎、硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自身免疫肝炎、多发性硬化症、牛皮癣、特应性皮炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎或另一自身免疫疾病。

在另一方面，提供一种检测受试者中活化的B细胞的方法。所述方法包括测量受试者中IL40的水平，其中相比于对照，IL40的水平增加指示活化的B细胞。在所述方法中，例如：

a)IL40水平可通过免疫检测技术测量；

b)所述方法可进一步包括测量另一生物标志物，诸如但不限于白介素6、白介素10和某些免疫球蛋白；

c)所述方法可诊断需要所述诊断的受试者的自身免疫性或淋巴瘤，其中水平增加指示淋巴瘤或自身免疫性；

d)IL40水平增加可确定淋巴瘤或自身免疫疾病的IL40产生性亚型；或

e)a)-d)的任何组合。

在一些实施方案中，免疫检测技术是ELISA、组织学分析、荧光激活的细胞分选、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、免疫组织化学分析、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、蛋白质印迹或斑点印迹。

在另一方面，提供一种治疗有需要的受试者的淋巴瘤或自身免疫疾病的方法。所述方法包括向受试者或向受试者的肿瘤、组织或细胞施用治疗有效量的抗IL40抗体或含有IL40序列的核酸。在一些实施方案中，抗体可为中和抗IL40抗体，并且核酸可为反义RNA。在一些实施方案中，反义RNA是RNAi分子。

在另一方面，提供一种鉴定受试者中IL40产生性细胞的方法。所述方法包括使用抗IL40抗体或含有IL40序列的核酸作为探针以例如在免疫组织化学分析或原位杂交中鉴定IL40产生性细胞。IL-40抗体可用于通过流式细胞计量术检测IL40产生性细胞，或可用于进行免疫组织化学分析，而含有IL40序列的核酸探针可用于操作从产生IL-40的细胞获得的mRNA的RNA印迹。IL40序列可用于设计引物以对从IL40产生性细胞获得的mRNA进行实时聚合酶链反应(PCR)。IL40序列探针可用于通过原位杂交鉴定产生IL40的细胞。

在另一方面，提供一种鉴定IL40受体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：

a)用IL40、标记的IL40、His标签标记的IL40、生物素标记的IL40或其组合标记IL40应答性细胞，以及分离、纯化和/或分开标记的细胞。可例如通过以下方式来分离被这些标记所标记的细胞：使用荧光染料标记的针对HIS标签的特异性抗体以及使样品通过荧光激活的细胞分选仪，或在生物素标记的IL40的情况下，在类似方法中使用荧光染料标记的抗生蛋白链菌素；或

b)用IL40、标记的IL40、His标签标记的IL40、生物素标记的IL40或其组合标记IL40应答性细胞，以及分离、纯化和/或分开标记的细胞，其中细胞是表达IL40受体的真核或细菌细胞；或

c)在酵母双杂交系统中鉴定结合IL40的蛋白质；或

d)使IL40结合蛋白从来自表达IL40受体的细胞的膜制备物免疫沉淀。举例来说，表达IL40受体的细胞可使用与细胞样品在水性介质中混合的微小玻璃珠、陶瓷珠或钢珠来破坏。通过搅拌和振荡使混合经受高水平搅动。珠粒与细胞碰撞，并且破坏它们以释放细胞间组分。机械剪切(涡旋)在均质化期间是适度的，并且产生可通过离心分离的优异膜或亚细胞制备物。可通过使用针对标记(其可为HIS标签)的抗体实现蛋白质复合物(如标记的IL40结合于它的受体的情况下)的免疫沉淀。对免疫沉淀的分析和测序将会导致对存在于这个复合物中的蛋白质的鉴定。

在另一方面，提供一种使用IL40或其功能活性变体的方法。所述方法包括使免疫细胞暴露于IL40或功能活性变体以便：

a)促进B细胞体外或体内生长和分化；

b)增加杂交瘤培养物的生长；

c)增加由杂交瘤培养物达成的抗体产生；或

d)通过使用来自诸如人、狗、小鼠、猫、母牛、马、猪、山羊或绵羊的不同哺乳动物物种的IL40来确定组织或细胞的物种来源。

举例来说，可通过在补充以各种细胞因子(IL4、IL6)和刺激B细胞受体的抗体(抗免疫球蛋白)或结合CD40受体的分子(CD40配体或针对CD40受体的抗体)的常规组织培养基中培养来使B淋巴细胞体外生长和分化。这些条件导致B淋巴细胞的生长和/或分化。已知有利于B细胞的分化的其它细胞因子包括IFNγ、TGFβ、IL5、IL13和CXCL13。可在补充以有利于杂交瘤的生长的细胞因子(IL6)的选择性培养基(以有利于杂交瘤的生长)中体外培养由正常B细胞与B细胞骨髓瘤或其它肿瘤细胞融合产生的B细胞杂交瘤。

在任何涉及自身免疫性、自身免疫疾病或淋巴瘤的前述组合物或方法中，

自身免疫疾病可为全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、格雷夫斯病、自身免疫肝炎、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎或斯耶格伦氏综合征，并且

淋巴瘤可为霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、MALT淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、蕈样真菌病或多发性骨髓瘤。

在任何涉及治疗的前述组合物或方法中，抗体、肽、蛋白质或核酸可局部或全身递送。

在任何涉及诊断或诊断/治疗诊断方法的前述组合物或方法中，可对诸如血清、血液、体液、肿瘤、组织或细胞，包括活检或组织学样品的样品实施方法。

在任何涉及抗体、肽、蛋白质或核酸分子的前述组合物或方法中，分子可于以下药物制剂中：

a)包含药学上可接受的载体、赋形剂或其组合；

b)被用作无菌制剂；

c)包含用于治疗自身免疫疾病或淋巴瘤的另一治疗剂，诸如但不限于抗TNFa抗体(类克(Remicade)、修美乐(Humira))；抗BAFF(贝利斯塔(Benlysta))；抗CD20(利妥昔单抗(Rituximab))；和抗CD30(阿德曲斯(Adcetris))；

d)呈例如乳液、胶束等的缓慢或持续释放制剂形式；

e)呈例如脂质体、包合复合物、载体的靶向施用形式；或

f)a)-e)的任何组合。

附图说明

为更加完全理解本发明，现参照与附图联合进行的以下描述，其中：

图1是显示C17orf99是一种在胎儿肝、骨髓和活化的B细胞中表达的新细胞因子的图。1A)正常人组织和免疫细胞中的C17orf99表达。数据来自BIGE(身体基因表达指数)数据库(使用Affymetrix基因阵列(U1332.0)的人微阵列数据)，显示C17orf99mRNA的表达谱。X轴根据器官系统加以组织：CNS(中枢神经系统)、Gut(胃肠)、Struct(结构)、Vasc(脉管系统)、Resp(呼吸道)、Endo(内分泌)、Ur(泌尿)、Rep(繁殖)、Imm_T(免疫组织)、Imm_C(免疫细胞)和Dev(发育)。Y轴代表对应于C17orf99的探针组(236981_at)的杂交强度。1B)显示信号肽的C17orf99人氨基酸序列(SEQIDNO.1)。1C)来自pTT5V5H8-C17orf99转染的293HEK细胞的上清液的蛋白质印迹。用pTT5V5H8-C17orf99或空载体转染293HEK细胞。收集上清液并使用GEHisTrap纯化柱纯化，并且依次使用抗HismAb和抗兔HRP二级抗体进行蛋白质印迹。1D)对C17orf99在人胎儿肝和骨髓中表达的RT-PCR确认。1E)10个哺乳动物物种中C17orf99的氨基酸序列的ClustalOmega分析。C17orf99同源物限于胎盘哺乳动物(真兽亚纲)、有袋动物和单孔目动物。

图2是显示IL40在小鼠和人中的表达是类似的一组图。2A)由可商购获得的RNA获得的对人样品的qRT-PCR分析。2B)由可商购获得的RNA获得的对小鼠组织的qRT-PCR分析。

图3是人(SEQIDNO.2)与小鼠(SEQIDNO.3)IL40蛋白之间的氨基酸序列比较。使用BLAST程序进行分析。也显示共有序列(SEQIDNO.4)。

图4是显示IL40在人和小鼠活化的B细胞中表达的一组图。4A)对人静息B细胞和用抗CD40mAb+IL4活化24小时的B细胞的IL40和TSPAN33的qRT-PCR分析。4B)在静息条件或用1ug/mLLPS+IL-4刺激24小时的条件下对小鼠脾细胞的IL40和Tspan33的qRT-PCR分析。4C)对FACS纯化的来自C57BL/6小鼠的脾的用CD40L+IL-4刺激8、24、72和96小时的CD19+B细胞的IL40和Tspan33的qRT-PCR分析。4D)对用2ng/mLIL-4、IL-13、IFNγ或TGFβ刺激3天的脾细胞的qRT-PCR分析。4E)对用抗CD40和细胞因子组合刺激的IL40和Tspan33表达的qRT-PCR分析。

图5是对人和B细胞系中的IL40的qRT-PCR分析的一组图。5A)测量在静息和刺激条件下人2E2B细胞和人JurkatT细胞的IL40表达。5B)测量在静息和刺激条件下鼠类A20-2J小鼠细胞的Il40表达。

图6是显示来自小鼠脾细胞的CD19+B细胞的FACS纯化结果的图。6A)在分选之前小鼠脾细胞中的CD19+细胞。6B)在分选之后小鼠脾细胞中的CD19+细胞。

图7是显示IL40转录由LPS+TGFβ诱导的图。对用IL-4、LPS、或LPS和IL-4、IL-13、IFNγ或TGFβ的组合刺激的小鼠脾细胞的qRT-PCR分析。

图8是显示IL40缺陷小鼠具有改变的B细胞表型的图。8A)用于产生IL40-/-小鼠的靶标构建体。8B)来自WT(左侧)和IL40-/-(右侧)小鼠的脾的照片。8C)WT和IL40-/-小鼠的脾中CD19+(B细胞)相对于CD3e+(T细胞)的比率，通过流式细胞计量术所测量。8D)WT和IL40缺陷小鼠中脾尺寸(左侧)、重量(中间)和总淋巴细胞数(右侧)的测量结果。(n＝每组5只)。8E)从C(左侧)以及WT和IL40缺陷小鼠(n＝5)中T细胞和B细胞的总数获得的比率的图。8F)野生型和IL40-/-小鼠中通过夹心式ELISA测量的血清IgG1(左侧)和IgA(右侧)水平。(n＝5)。各图描绘来自至少3个独立实验的代表性数据。

图9是指示PCR确认来自WT和IL40-/-集落的基因型的照片。观察到在250bp(IL40基因组DNA)和200bp(新霉素构建体)处的突出条带。从WT小鼠获得的DNA仅含有IL40基因组DNA，而具有缺失的小鼠仅携带新霉素构建体。杂合子含有IL40基因组DNA与新霉素构建体两者。

图10是显示IL40-/-小鼠在重量增加方面不具有缺陷的图。测量来自WT和IL40-/-小鼠的小鼠的3-6周重量(g)。n＝5。

图11是显示IL40-/-小鼠在胸腺中T细胞发育方面不具有缺陷的图。11A)测量胸腺细胞，关于CD3e表达加以门控，接着使用流式细胞计量术测量CD4相对于CD8表达。11B)阳性细胞的百分比。所述图描绘从2个独立实验获得的实验，n＝3。

图12是显示IL40-/-小鼠在B1细胞中的IgA产生方面不具有缺陷的图，所述B1细胞来自静息脾的B2细胞的腹膜腔。关于CD5或B220+细胞的子群体来门控脾或腹膜腔细胞以鉴定/门控B1a、B1b或B2细胞的群体，接着通过流式细胞计量术测量它们的IgA表达，(n＝3)。

图13是显示IL40缺陷小鼠在原B细胞、前B细胞或不成熟B细胞群体方面不具有缺陷的图。13A)关于B220+CD19+细胞来门控骨髓渗出物细胞，并且测量IgM相对于CD43表达。13B)对3只单独小鼠测量的细胞的百分比。13C)对3只单独小鼠测量的总细胞数。代表性实验从2个独立实验获得。

图14是显示B细胞的脾细胞群体在静息IL40缺陷小鼠中是正常的图。14A)关于B220+细胞来门控小鼠，接着染色以得到IgM相对于IgD表达。14B)接着测量B220+细胞的IgM相对于IgA表达。14C)B220+细胞用7AAD染色以测量细胞活力。N＝每组3只小鼠。

图15是显示IL40-/-小鼠在派伊尔氏斑中的IgA产生性细胞方面具有缺陷的图。15A)派伊尔氏斑中总生发中心(B220+PNA+)细胞的测量结果，n＝5。15B)关于B220+PNAhi淋巴细胞加以门控的IgA分泌浆细胞的测量结果，n＝5。15C)总IgA转换细胞B220lo-hiPNA+淋巴细胞的测量结果，n＝5。15D)粪粒中总IgA的测量结果，n＝10。15E)在泌乳雌性的乳腺中，IL40转录被上调。由童贞、妊娠和泌乳1周和3周小鼠的乳腺获得的qRT-PCR分析。15A-D代表3个独立实验，其中每组至少3只小鼠。

图16是显示IL40-/-小鼠在体外诱导测定期间在经受CSR的能力方面不具有B细胞固有性的图。刺激4天的小鼠脾细胞的CSR诱导，用：16A)LPS+抗BCR+TGFβ(IgA转换)，16B)LPS+IL-4(IgG1转换)，16C)LPS+IFNγ(IgG3转换)刺激，通过流式细胞计量术所测量。16D)用LPS+IL-4刺激IgG1浆细胞。代表性数据从至少2个独立实验获得，其中每种小鼠至少3组。

图17是显示人突触回蛋白2在活化的B细胞中表达的图。人组织的表达谱从BIGE获得。

图18是显示IL40仅影响B细胞而非T细胞的图。在静息(左侧)和活化(右侧)条件下对来自WT和IL40-/-小鼠脾细胞的“B细胞”和“T细胞”基因的微阵列分析。

图19是显示IL40在MRLFas^lpr/lpr小鼠中升高的图。对取自MRL/faslpr/lpr小鼠的总脾细胞的IL40和Tspan33表达的qRT-PCR，相对于CD19表达加以标准化。比较9周龄(无可检测病变)、24周龄(淋巴腺病伴有或不伴有轻度耳病变)和36周龄(淋巴腺病伴有耳和面部病变)小鼠的Tspan33表达，n＝5。

图20是显示IL40结合B细胞而非T细胞的图。

图21显示编码人IL40蛋白的cDNA的编码区的核苷酸序列(SEQIDNO.5)。

具体实施方式

在各种实施方案中包括与基因C17orf99的基因产物相关的抗体、肽、蛋白质和核酸。来自各种物种的C17orf99基因和C17orf99cDNA的核苷酸序列以及来自各种物种的C17orf99基因产物的氨基酸序列具有以下保藏号(全都以引用的方式并入本文)：人C17ORF99：NM_001163075；小鼠C17ORF99：NM_029964(参见国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)，于万维网上在ncbi.nlm.nih.gov处)。如本文所用，C17orf99基因产物也被称为白介素-40(IL40或IL-40)。

抗体是任何免疫结合剂，诸如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体也可为具有抗原结合区域的任何抗体样分子，并且包括抗体片段，诸如Fab'、Fab、F(ab')₂、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域中是熟知的。用于制备和表征抗体的手段在本领域中也是熟知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies:ALaboratoryManual,”ColdSpringHarborLaboratory,1988)。单克隆抗体(mAb)被认定具有某些优势，例如可重现性和大规模生产。因此，涵盖人、鼠类、猴、大鼠、仓鼠、兔以及甚至鸡来源的单克隆抗体。

可在广泛范围的动物物种中制备针对IL40的多克隆抗体。通常，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。为增加免疫原性，将佐剂和缀合作用用于诸如但不限于钥孔虫戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)或牛血清白蛋白的载体蛋白是熟知程序。

单克隆抗体可易于通过使用熟知技术来制备，所述技术诸如以引用的方式并入本文的美国专利号4,196,265中例示的那些(40-44)。通常，这个技术涉及用所选免疫原组合物，例如纯化或部分纯化蛋白质、肽或结构域使适合动物免疫。以有效刺激抗体产生性细胞的方式施用免疫组合物(45-47)。可分离分泌单克隆抗体的杂交瘤。

必要时，可使用过滤、离心和各种色谱方法，诸如HPLC或亲和色谱法进一步纯化多克隆或单克隆抗体(47)。

人源化单克隆抗体是动物来源的抗体，其已使用遗传工程改造技术修饰以用人序列替换恒定区和/或可变区框架序列，同时保留原始抗原特异性。所述抗体通常源于针对人抗原具有特异性的啮齿动物抗体。所述抗体通常适用于体内治疗应用。这个策略降低宿主对外来抗体的应答，并且允许选择人效应物功能。因此，在本发明的一些实施方案中包括针对IL40的人源化抗体，也包括来自小鼠、大鼠或其它物种，携带人恒定区和/或可变区结构域的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程改造抗体及其片段。用于产生人源化免疫球蛋白的技术为本领域技术人员所熟知(44、47-51)。举例来说，美国专利号5,693,762公开用于产生具有一个或多个互补决定区(CDR)的人源化免疫球蛋白的方法以及所述人源化免疫球蛋白的组合物。当组合成完整抗体时，人源化免疫球蛋白在人中是大致上非免疫原性的，并且保留与供体免疫球蛋白大致上相同的对抗原(诸如含有表位的蛋白质或其它化合物)的亲和力。这个领域中的其它教导的实例包括美国专利号6,054,297；5,861,155和6,020,192，其全都以引用的方式明确并入本文。用于开发针对患者的疾病加以“定制”的抗体的方法同样是已知的，并且也涵盖所述定制抗体。

本发明的一些实施方案包括IL40肽或蛋白。在某些实施方案中，天然存在的IL40蛋白可用诸如取代、缺失和/或插入变体的IL40变体替代。

取代变体含有在蛋白质内一个或多个位点处一种氨基酸与另一氨基酸的交换。取代通常是涉及在形状和/或电荷方面类似的氨基酸的交换的保守性取代。缺失变体缺乏天然蛋白质的一个或多个残基。插入突变体或变体包括在蛋白质中非末端点处添加一个或多个氨基酸。变体与天然存在的IL40蛋白序列可具有约80％或更多同一性、约85％或更多同一性、或约90％或更多同一性、约95％或更多同一性、或约100％同一性。可例如使用ClustalOmega、MUSCLE、MView或MAFFT序列比较程序进行序列比较。在比较序列时，一个蛋白质与另一蛋白质之间的比较区段可为所比较的氨基酸长度的约100％，或所比较的氨基酸长度的约95％、约85％或约80％。比较长度可为至少约20、30、40、50、55、60、65、70或75个氨基酸或更多个氨基酸。变体可如同普遍天然序列一样保持特定物理化学或功能特征，而其它变体可具有结构和功能特征的改进组合。因此，一些实施方案包括功能活性IL40变体，其具有IL40的一些或所有功能，诸如结合IL40受体或涉及于B细胞朝向IgA应答的分化中。此外，一些实施方案包括充当IL40激动剂或IL40拮抗剂的变体。在一些实施方案中，变体不包括与天然存在的人IL40序列或其它物种的天然存在的IL40序列同一的序列。也涵盖IL40肽及其取代、缺失和/或插入变体，包括功能活性IL40肽和IL40肽变体、以及充当IL40激动剂或IL40拮抗剂的IL40肽和IL40肽变体。在一些实施方案中，肽变体不包括与人或其它物种的IL40蛋白中存在的天然存在的氨基酸序列同一的氨基酸序列。

某些实施方案包括IL40蛋白的截短形式，或与其它区段的融合物，其展现如所述的功能。融合蛋白可含有连接于第二蛋白质的全部或一部分的IL40的全部或一部分。举例来说，可使一种蛋白质的C末端连接于另一蛋白质的N末端。或者，可例如使蛋白质非共价连接于整合素、纤维结合蛋白受体或其它膜糖蛋白。IL40蛋白可含有天然存在的IL40氨基酸序列或其变体。

在一些实施方案中，提供不涉及氨基酸变化或除氨基酸变化之外也涉及其它变化的IL40衍生物。所述衍生物的实例包括糖基化修饰的IL40蛋白、化学修饰的IL40蛋白(诸如用聚乙二醇修饰(聚乙二醇化)的蛋白质)和IL40缀合物，诸如¹³¹I标记的IL40、生物素-IL40等。

本发明的一些实施方案包括编码IL40蛋白(包括天然存在的IL40蛋白或其变体)的全部或一部分的核酸。核酸可为DNA或RNA分子。可诸如出于表达目的使核酸缀合于另一核酸序列，出于检测目的使核酸缀合于标记，或出于检测目的使核酸缀合于化学衍生物。举例来说，可使核酸缀合于标记，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，或缀合于化学衍生物，诸如生物素。

核酸可被用作用于扩增或合成IL40核苷酸序列的引物，或用作用于鉴定IL40核苷酸序列的探针。在一些实施方案中，核酸是含有IL40基因或IL40cDNA序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，核酸是反义分子。

反义寡核苷酸是可包括天然存在的核苷酸和/或修饰或取代的寡核苷酸的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。在各种实施方案中，反义寡核苷酸包括杂交于IL40靶标序列，并且可包括例如用作引物结合位点的其它5’和/或3’侧接序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可包括修饰的寡核苷酸骨架，诸如但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(例如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(例如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键联的硼代磷酸酯、以及这些骨架的2'-5'连接类似物和具有倒转极性的那些，其中邻近各对核苷单元以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'方式连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。教导所述修饰的骨架寡核苷酸的制备的参考文献例如提供于美国专利号4,469,863和5,750,666中，所述美国专利全都以引用的方式并入本文。设计和合成反义寡核苷酸在本领域中是熟知的(52)。用于设计反义寡核苷酸序列的计算机程序也是可用的(53)。

可应用用于产生和制备肽、蛋白质和核酸的标准方法。可开发标准重组方法，包括设计编码构建体的重组核酸。参见例如ThompsonD.A.CellandMolecularBiologyManual2011。可设计例如启动子可操作地连接于编码区的表达载体。提供包含载体的细胞，包括重组原核生物细胞和重组真核生物细胞，诸如重组酵母和重组哺乳动物细胞。也可开发可相容的表达方法。

举例来说，编码IL40蛋白或蛋白变体的多核苷酸可被置于在所需宿主细胞中具有功能性的启动子的控制下。极其广泛多种启动子是熟知的，并且视特定应用而定可用于本发明的实施方案的表达载体中。通常，所选启动子取决于启动子在其中将具有活性的细胞。任选也包括其它表达控制序列，诸如增强子、核糖体结合位点、转录终止位点等。包括这些控制序列中的一个或多个的构建体被称为“表达盒”。因此，本发明的实施方案提供编码相关功能性蛋白质的核酸被并入其中以达成在所需原核或真核宿主细胞中高水平表达的表达盒(参见例如ReamW和FieldK.G.MolecularBiologyTechniques.AcademicPress.2012)。

在一些实施方案中包括具有至少约70％、75％、80％、85％或90％均质性的肽或蛋白质的大致上纯净组合物，也包括约92％、95％、98％或99％或更多均质性。纯化肽和蛋白质可例如用作用于抗体产生的免疫原；用于诱导免疫细胞中分化、成熟或蛋白质表达的活性剂；或药物组合物中的治疗剂。

可在核酸或蛋白质水平上测量IL40的水平。举例来说，可测量在细胞中表达的IL40mRNA的量，或可测量活化的B细胞中存在的IL40蛋白的量。可使用诸如但不限于PCR、微阵列技术或RNA印迹的方法进行mRNA定量(54、55)。可使用诸如但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定或蛋白质印迹、用抗蛋白质特异性抗体进行的FACS(针对由细胞达成的产生)的免疫检测方法进行蛋白质定量。对照水平可为来自对照细胞群体或来自一个或多个对照受试者的IL40水平的平均值或均值。

在一些实施方案中，诊断受试者患有涉及IL40的疾病可继之以治疗，诸如本文所述的治疗。举例来说，诊断可继之以涉及向被诊断有自身免疫性或淋巴瘤的受试者施用治疗有效量的IL40拮抗剂的治疗，或通过向受试者施用治疗有效量的含有IL40核苷酸序列的寡核苷酸进行的治疗。

一些实施方案涉及本发明的各种实施方案的治疗用途。在这些实施方案中，可向受试者施用治疗有效量的本发明的各种实施方案的活性剂，其可为抗体、肽、蛋白质或核酸或其任何组合。治疗有效量是就医学治疗受试者的病状而言促进或增强他的/她的健康的量。举例来说，使受试者的生命延长任何时期，减轻对受试者的可归因于受试者的病状的疼痛，减轻疾病的严重性，增加治疗剂的治疗作用，改善病状或疾病的预后，降低治疗剂的施用量或频率，降低治疗的侵袭性的受试者治疗方案改变，以及减轻(降低)由治疗剂所致的副作用的严重性或出现率。就治疗淋巴瘤或白血病而言，治疗益处也包括疾病的赘生发展减退或延迟，过度增殖降低，肿瘤生长降低，转移延迟以及癌细胞或肿瘤细胞增殖速率降低。待向受试者施用的活性物质的量根据熟练从业者可由其确定适合剂量的受试者重量、施用模式、以及疾病征候和严重性而变化。

在一些情况下，含有IL40基因或IL40cDNA序列的反义分子可用作治疗剂以降低患有涉及IL40的疾病的受试者中IL40的表达。举例来说，反义分子可为siRNA。siRNA是用于RNA干扰(RNAi)方法中的小抑制性RNA双链体。RNAi是一种天然存在的基因沉默过程，其中双链RNA被裂解成较小双链区段(siRNA)，其接着与蛋白质-RNA复合物(称为“RISC”)缔合，从而导致靶标mRNA的裂解(56)。在各种实施方案中，siRNA在大小方面可为18-30个碱基对，与它的靶标IL40mRNA具有不同程度的互补性。在一些实施方案中，siRNA可在有义链和反义链中的任一者或两者的5’和/或3’末端包括未配对碱基。在一些实施方案中，siRNA可为两个单独链的双链体，或形成发夹结构以形成双链体区域的单链。设计和合成siRNA在本领域中是熟知的(57)。用于设计siRNA的计算机程序也是可用的(58)。其它RNAi分子包括是基因组编码RNA以及可调控IL40的基因表达的微小RNA。

受试者可为人、狗、小鼠、猫或其它哺乳动物，诸如母牛、马、猪、山羊或绵羊。在一些实施方案中，受试者是被怀疑患有涉及IL40的疾病的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要针对涉及IL40的疾病治疗的受试者或患者。

用于分析、诊断和治疗诊断的样品可来自人、狗、小鼠、猫或其它哺乳动物，诸如母牛、马、猪、山羊或绵羊。

视最优施用途径而定，可使用不同施用制剂(无菌、缓冲、缓慢释放、控制释放、稳定剂、软膏剂等)。参见例如NiaziS.K.HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulationsInformaHealthcare2012。如同抗炎症剂一样，IL40/IL40受体相互作用的激动剂或拮抗剂可与其它确定药物组合用于优化治疗结果。此外，化合物可与其它治疗剂组合用于单制剂策略中。药理学变体可用于获得所需药物动力学结果(分泌、半衰期、溶解性或优化排泄途径)。

精确剂量将取决于治疗目的，并且将可由本领域技术人员使用已知技术确定。参见例如Ansel等,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDelivery；Lieberman(1992)PharmaceuticalDosageForms(第1-3卷),Dekker,ISBN0824770846,082476918X,0824712692,0824716981；Lloyd(1999)TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding；以及Pickar(1999)DosageCalculations。如本领域中所知，针对蛋白质降解、全身性递送相对于局部递送、和新蛋白酶合成速率、以及年龄、体重、总体健康、性别、膳食、施用时间、药物相互作用和病状严重性加以调整可为必要的，并且将可由本领域技术人员以一定实验确定。

各种药学上可接受的赋形剂在本领域中是熟知的。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括在与组合物的活性成分组合时允许所述成分保留生物活性，并且不导致与受试者的免疫系统的破坏性反应的物质。所述赋形剂可包括稳定剂、防腐剂、盐或糖复合物或晶体等。参见例如NiaziS.K.HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulationsInformaHealthcare2012。

示例性药物载体包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。实例包括但不限于标准药物赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液)和各种类型的湿润剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。在其它实施方案中，组合物将被并入固体基质，包括缓慢释放粒子、玻璃珠、绷带、眼插入物和表面形式中。施用途径可包括以下：表面、全身性、呼吸道、口服、眼、植入物、阴道、肛门、栓剂、控制释放装置等。

对于体内施用核酸化合物，核酸可以游离(或“裸露”)核酸形式施用，或可与使核酸向细胞靶标递送增加的递送剂一起配制。递送剂的实例包括但不限于脂质体、阳离子脂质、聚乙二醇化聚阳离子、阳离子嵌段共聚物和聚乙烯胺复合物(59)。

针对在本申请中其它地方所述的适应症的现存治疗剂可与IL40/IL40受体相互作用的激动剂/拮抗剂组合或依序用于优化治疗结果。

本文所述的IL40基因、cDNA、核酸、肽或蛋白可基于人IL40核苷酸或氨基酸序列，或基于来自诸如狗、小鼠、猫、母牛、绵羊、山羊、猪或马的另一哺乳动物的核苷酸和氨基酸序列。类似地，用于制备抗IL40抗体的抗原可基于人IL40抗原，或基于来自诸如狗、小鼠、猫、母牛、马、猪、山羊或绵羊的另一哺乳动物的IL40抗原。

本发明可通过参照随附实施例加以更充分了解，所述实施例意图仅用于说明目的，并且在任何意义上都不应解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

引言

近来表征的细胞因子产生性B细胞亚组，即B调控细胞(Breg/B10)、B效应物1(Be1)和B效应物2(Be2)细胞，提供证据指示B细胞在炎症和自身免疫疾病中的作用超过产生抗体。特定来说，它们表明它们能够产生细胞因子。此处，描述一种由活化的B细胞产生的新细胞因子，其已被命名为白介素-40(IL40)。在小鼠与人两者中，IL40由在胎儿肝和骨髓中表达的未表征基因(C17ORF99)编码。它也在用CD40L(或LPS)刺激的B细胞中表达。它的产生由一些细胞因子(IL-4、IL-13和TGFβ)增强，并且由IFNγ抑制。IL40是一种24kD分泌蛋白质，并且不与其它已知细胞因子相关。Il40缺陷小鼠(Il40^-/-)展现脾肿大以及B细胞表型改变，其中CD19+B细胞数目增加，并且派伊尔氏斑(Peyer’spatch)中IgA产生性细胞的数目降低。IL40转录物在泌乳乳腺中被诱导。另外，在来自SLE患者的PBMC和来自MRLFas^lpr/lpr小鼠的脾细胞中，IL40转录物升高。推断IL40是一种新B细胞源性细胞因子，对B细胞的发育和分化具有多效性作用。

细胞因子是多效性分泌蛋白质的大型和多变化超家族，所述蛋白质具有影响细胞生长、分化、炎症调节和造血的活性(1,2)。鉴定新细胞因子和它们的受体在阐明细胞因子通过其来调节人疾病的机理方面是关键的。这个信息对这些疾病的诊断、治疗和预防至关重要(3)。鉴于它们的重要性，对针对新细胞因子进行搜索，诸如序列预测软件和数据库搜索存在强烈关注(4)。这导致鉴定许多细胞因子，它们中的大多数属于可能通过基因复制而产生的超家族。

A.IL40鉴定为细胞因子

本发明者已关注于搜索新细胞因子。为此，使用人体中基因表达的综合数据库，称为身体基因表达指数(BIGE)，基于AffymetrixU1332.0微阵列(5,6)。这个数据库当前含有来自105种不同人组织/细胞类型的全基因组表达数据，并且包括淋巴组织以及静息B和T淋巴细胞与活化的B和T淋巴细胞两者。为鉴定在免疫系统中具有重要性的新基因，搜索BIGE数据库中在淋巴细胞或髓细胞中或当相较于非免疫组织时在免疫系统的组织(骨髓、脾、淋巴结、胸腺、扁桃腺)中高度表达的基因。这个筛选产生511种与淋巴组织相关的基因和1569种与免疫细胞相关的基因，并且实际上鉴定了已在过去几十年中鉴定和描述的所有免疫系统基因，包括大多数细胞因子和趋化因子基因。重要的是，也鉴定35种新的不充分表征基因，其被预测编码在免疫系统中高度表达的跨膜或分泌蛋白质。本发明者近来公开了这些基因的实例，即四次跨膜蛋白33(TSPAN33)，其是一种由活化的B细胞表达的跨膜蛋白质(7)。

B.IL40是一种由B细胞产生的细胞因子

描述对这些基因中的另一个，即编码在胎儿肝、骨髓和活化的B细胞中表达的新小分泌蛋白质的C17orf99的表征。本发明者已将这个分子命名为白介素-40(IL40)，因为它具有典型细胞因子特征，包括它是由活化的B细胞产生的小分泌蛋白质的事实。尽管IL40由B细胞在活化后产生，但它的产生由Th2细胞因子(IL-4和IL-13)或TGFβ增强。相反，它的产生由Th1细胞因子IFNγ抑制。Il40^-/-小鼠显示脾肿大，其中脾中B细胞的数目增加。另外，在作为IgA产生部位的肠派伊尔氏斑中，Il40-/-小鼠具有较低数目的生发中心和总IgA分泌B细胞。通过观察到Il40在乳腺中开始泌乳后被诱导来进一步表明Il40与IgA之间的关联。最后，我们显示在来自MRLFas^(lpr/lpr)小鼠(一种小鼠SLE模型)的脾细胞中，Il40转录升高，从而表明它可涉及于自身免疫疾病中。

结果

A.鉴定新细胞因子

通过分析BIGE数据库，首先鉴定未注释免疫系统相关基因(C17orf99)。C17orf99mRNA在胎儿肝、骨髓中以及在用抗CD40+IL-4活化30小时的B细胞中高度表达，在其它地方具有少许或不具有表达。所有组织以及平均C17orf99表达强度的完整清单中提供于表1中。人基因含有编码具有265个氨基酸，其中预测N末端信号序列是20个氨基酸的蛋白质的开放阅读框(图1B)，从而预测成熟蛋白质具有245个氨基酸(约27KDa)。BIGE数据库中IL40表达的完整清单提供于表1中。在包括灵长类动物、狗和小鼠(6030468B19Rik，72％蛋白质序列保守性)的哺乳动物中鉴定出同源物，但鸡和斑马鱼中不存在(图2)。基因被命名为IL40(图1)，因为它编码在造血器官中(体内恒定)(9)以及由活化的B淋巴细胞(炎症性)(2)产生的小分泌蛋白质(8)。使用对人组织RNA的qRT-PCR分析来确认BIGE表达谱(图2A)，并且在使用小鼠RNA样品的等效收集物的情况下，显示小鼠同源物也在免疫系统相关的组织中，并且尤其在骨髓中高度和特异性表达(图2B)。Pfam搜索指示IL40不属于任何当前已知细胞因子家族(数据未显示)，从而指示IL40是一种在造血器官和活化的B细胞中产生的新细胞因子。

表1.来自BIGE数据库的平均IL40表达强度值的完整清单

表由BIGE数据库获得，根据组织和器官系统加以组织。列出平均IL40表达强度值(n＝8)。

在这个研究之前，C17orf99在对具有预测信号序列的基因的调查中被鉴定为分泌蛋白质(10)。为验证IL40被分泌，从人2E2B细胞(B细胞活化和分化的伯基特氏淋巴瘤模型(11))克隆人IL40cDNA，并且同框插入pTT5(12)的克隆位点中，从而产生编码具有C末端8xHis标签的融合蛋白的重组基因。接着用pTT5-Il40构建体或作为对照的空载体转染HEK293细胞，并且收集第1天和第3天上清液并分析重组IL40蛋白的存在。使用抗His抗体对亲和纯化上清液的蛋白质印迹分析仅在用pTT5-Il40构建体转染的细胞中检测到约27kD蛋白质(图1C)，从而确认IL40是一种分泌蛋白质。

B.IL40由活化的B细胞产生

因为诸如IL-2、IL-7和IL-15的许多细胞因子在淋巴细胞个体发生与活化两方面均具有功能(13)，所以本发明者假设IL40也可涉及于这些过程中。它在BIGE数据库中的表达模式指示当用CD40L+IL-4刺激B细胞时，IL40表达增加。为确认这个，测量在静息条件或用抗CD40+IL-4活化24小时的条件下IL40在从PBMC纯化的人B细胞中的转录(图4A)，并且与TSPAN33表达(本发明者近来已描述的一种B细胞活化标志物)(7)进行比较。IL40转录连同TSPAN33(p＝0.01)一起上调超过50倍(p＝0.002)，从而指示IL40由活化的人B细胞表达。在静息或活化条件(抗CD40mAb(针对2E2活化)和抗CD3+抗CD28)下，使用人2E2和Jurkat(T细胞系)重复这些实验(图5A)。IL40转录仅在活化的2E2细胞中被诱导。以用LPS+IL-4活化的小鼠脾细胞(图4B)和在相同条件下刺激的A20-2J鼠类B细胞(图5B)获得类似结果。为测量IL40转录的动力学，用CD40L+IL-4刺激来自C57BL/6小鼠的Cd19⁺B细胞(图6)8、24、72和96小时，并且通过qRT-PCR测量Il40和Aicda(编码活化的B细胞中免疫球蛋白类别转换中涉及的酶AID的基因(14))基因表达(图4C)。IL40mRNA在8小时内被上调，并且它的表达历经96小时保持升高。

因为已显示活化的B细胞视刺激物而定会分泌Th1型(来自Be1)或Th2(来自Be2)细胞因子(15)，所以我们设法确定IL40表达是否也由细胞因子调节。

使CD40(图4E)或TLR4(图7)刺激物与IL-4、IL-13、IFNγ组合或者在小鼠脾细胞中组合(图4D)。在Th2细胞因子刺激后，IL40转录被诱导(IL-4和/或IL-13，约8倍)，而IFNγ(Th1细胞因子)仅使它增加3倍。抗CD40刺激使IL40转录增加超过20倍。引起关注的是，Th2细胞因子(IL4或IL13)协同增强IL40的产生比单独抗CD40刺激高几乎2倍，而IFNγ使IL40的表达降低至以单独抗CD40观察的水平的一半。此外，用抗CD40+TGFβ刺激诱导最高水平的IL40产生(图4E)。本发明者推断IL40产生在抗CD40刺激后被诱导，并且由Th2细胞因子和TGFβ协同增强，并且由IFNγ抑制。

C.IL40^-/-小鼠在B细胞体内平衡方面具有缺陷

为进一步表征IL40的生物活性，我们获得IL40(6030468B19Rik)基因被靶向缺失的突变小鼠品系(图8a，对于基因型确认，参见图9)。IL40-/-小鼠可存活并可繁殖，并且在重量增加或身材方面不具有缺陷(图10)。分别比较胸腺、腹膜腔、脾和骨髓中的T细胞亚组(图11)、B1/B2细胞比率(图12)、浆细胞和生发中心细胞的B细胞成熟(图13)以及原/前/不成熟B细胞群体(图14)，并且在Wt与IL40-/-小鼠之间未发现显著差异。然而，截至6周龄，Il40-/-小鼠显现脾肿大，因为在IL40-/-小鼠中，长度(0.0940±0.004比对0.1360±0.0151cm，p＝0.005)、质量(0.1018±0.005比对0.1366±0.0147g，p＝0.0285)和总细胞数目(76.03±6.87比对96.34±2.15*10^6个细胞，p＝0.0224)升高。当比较CD19+B细胞与T细胞(CD3+)的比率时，发现IL40-/-小鼠在相较于Wt小鼠时含有相对于T细胞，较高比例的B细胞，但差异不具有统计显著性(4.4比对3.4，p＝0.086，图8C)。另外，IL40-/-小鼠展现相比于它们的野生型(WT)对应物，血清IgG1和IgA水平升高(图8F)(分别是616比对189ug/mL，p＝0.05，以及10比对21ug/mL，p＝0.03)。这些数据表明Il40-/-小鼠中的B细胞体内平衡可能改变，并且表明Il40可在B细胞分化/存活中起作用。

D.IL40^-/-小鼠具有较少IgA产生性细胞

因为IL40-/-小鼠似乎表达升高水平的血清IgA，所以比较与粘膜免疫性相关的抗体同种型、派伊尔氏斑中浆细胞和生发中心细胞的水平、参与消化道的免疫监视的肠相关淋巴结节(15)。派伊尔氏斑含有天然存在的生发中心和IgA分泌浆细胞(16)。从WT和IL40^-/-小鼠的派伊尔氏斑制备单细胞混悬液，并且染色以通过流式细胞计量术测量生发中心细胞(B220⁺PNA⁺)(图15a)、IgA转换生发中心细胞(PNA⁺B220^hiIgM^loIgA⁺)(图15B)和总IgA转换细胞(B220^lo-hiPNA⁺IgA⁺)(图15C)的存在(17-19)。Il40^-/-小鼠的生发中心细胞降低大于2倍(n＝5，p＝0.0005)，IgA转换生发中心细胞降低2.5倍(n＝5，p＝0.0001)，并且总IgA阳性细胞(PNA⁺生发中心B220^hi和B220^neg-lo浆细胞)降低10倍(n＝5，p＝0.0001)。另外，通过ELISA测量Wt和Il40^-/-小鼠的粪粒中的IgA水平(图15D)以确定IgA阳性细胞中的缺陷是否影响粘膜中IgA分泌水平。相较于Wt小鼠，Il40^-/-小鼠的粪粒中的IgA水平存在2倍降低(n＝10，p＝0.006)。IL40^-/-小鼠中存在的IgA缺陷引导我们探究Il40是否在乳腺中表达。如图15E中所示，在乳腺中泌乳后，IL40表达被诱导。总之，这些观察结果表明IL40在IgA应答中具有作用。

这些变化可归因于在类别转换重组(CSR)机理方面的缺陷(20、21)或在生发中心应答(增殖(22)、存活(23)、活化(24))的成熟方面的缺陷。为阐明第一可能的机理，对WT和Il40^-/-B细胞中的CSR进行体外诱导，并且使用流式细胞计量术监测所得IgG1、IgG2a、IgG2b和IgA类别转换，参见(图16)。在Wt与Il40^-/-IgG1、IgG2a和IgG3转换细胞之间不存在差异，并且Il40^-/-B细胞中的IgA转换仅略微增加(p＝0.03)。因此，本发明者推断Il40^-/-小鼠的派伊尔氏斑中IgA产生性细胞贫乏不归因于经受CSR的能力受损。

鉴定IL40应答基因

本发明者接着设法更详细探究IL40对淋巴细胞的影响。为此，使用基因阵列对从WT或Il40^-/-小鼠的淋巴结获得的静息和LPS+IL-4刺激的淋巴细胞进行整体基因表达分析。

表征两组基因概况，即在静息或活化条件下，相对于IL40^-/-小鼠，在WT小鼠中上调的基因(表2)，以及相对于WT小鼠，在IL40^-/-小鼠中上调的基因(表3)。如所预期，表达差异性最大的基因是IL40。引起关注的是，表达差异性第4大的基因是突触回蛋白2(Syngr2)。突触回蛋白2属于见于中枢神经系统的神经元中的突触回蛋白家族，但不同于它的家族成员，Syngr2不在中枢神经系统中表达。为确定SYNGR2的表达谱，分析BIGE数据库中SYNGR2表达部位(图17，对于BIGE中顶部SYNGR2表达部位，参见表4)。SYNGR2被确定由活化的B细胞、单核细胞和人结肠表达。

表2.相对于IL40^-/-小鼠脾细胞，在WT小鼠脾细胞中上调的前25种基因的清单

表由AffymetrixMOGENE2.0ST阵列获得，关于来自WT(n＝1)和IL-40缺陷小鼠的淋巴结的静息和LPS+IL-4诱导的淋巴细胞。

表3.相对于WT小鼠脾细胞，在IL40^-/-小鼠脾细胞中上调的前25种基因的清单

表4.人中前10个突触回蛋白2表达部位

表由突触回蛋白2表达的BIGE数据库获得

最后，尽管已确定IL40由活化的B细胞产生，但IL40的靶标细胞不是已知的。为确定IL40是否作用于B细胞或T细胞基因表达，在WT与Il40^-/-小鼠样品之间比较50种被视为“B细胞活化/分化中涉及的基因”的基因(诸如CD81、CD86、Ms4a1(CD20)、IL-4和Stat6)和38种被视为“T细胞活化/分化中涉及的基因”的基因(诸如CD3(3种基因)、Cxcr4、Il2α和IFNγ)(表5)。如果IL40作用于T细胞，那么不存在IL40(在Il40^-/-样品中)应影响T细胞而非B细胞；相反，如果IL40作用于B细胞，那么我们将预期在B细胞活化基因方面具有差异(图18)。另外，如果IL40作用于两种细胞类型，那么两个基因集合均应变化。在静息状态下，在WT与Il40^-/-小鼠之间，仅B细胞表达的基因被差异性表达，但这个差异不具有统计显著性(p＝0.09)，(可能归因于相较于T细胞，所用淋巴结样品中的B细胞的数目较小)。然而，在LPS+IL-4刺激的样品中，B细胞而非T细胞基因是仅有的差异性表达基因(p＝0.018)。这些结果强烈表明IL40应答性细胞是B细胞。

表5.野生型和IL40-/-样品中的基因表达。

在全身性红斑狼疮中IL40被上调

因为在自身免疫疾病中，诸如IL-6、IL-21和BLyS的已知B细胞细胞因子的水平常常调控异常(7)，所以测量Il40在来自全身性红斑狼疮(SLE)的MRL/Fas^lpr/lpr小鼠模型的脾细胞中的mRNA表达。在这个模型中，小鼠显示全身性自身免疫性的水平增加，其中产生抗dsDNA(双链DNA)抗体和免疫肾小球性肾炎，其两者均是SLE的标志。幼年小鼠似乎是正常的，并且在9周时不展现可见病变。截至第24周，显现伴有淋巴腺病和一些皮肤病变的中度狼疮症状，并且截至第36周，完全狼疮症状是明显的，此常导致死亡(25)。发现IL40mRNA表达(图19)增加。在小鼠模型中检测的IL40水平的增加表明IL40的调控异常可涉及于SLE病理学中，并且可代表治疗疾病的靶标。

尽管在人基因的功能表征方面已有重大进展，但对于它们中的许多，存在少许或不存在信息。实际上，尽管共有编码序列(CCDS)(26、27)计划列出18,673个基因ID(第14发布版)，但这些基因ID中仅13669个具有描述性名称(HUGO基因命名委员会)(28)。因此，超过5,000个CCDS条目不具有适用名称，并且大多数仍然是不充分表征的。阻止它们的研究的另一困难是缺乏用以研究它们的试剂。此处，本发明者报道称为IL40的由未表征基因C17orf99编码的新细胞因子的鉴定。C17orf99最初被鉴定为通过分析人基因表达的BIGE数据库所鉴定的一组86种基因的一部分(29)，所述基因的表达模式与免疫系统的细胞的任一器官相关，在体内其它地方具有少许或不具有表达，并且被预测编码跨膜或分泌蛋白质。本发明者近来已报道鉴定一种也是使用这个方法鉴定的新B细胞活化分子(TSPAN33)(7)。IL40/C17orf99是本发明者作为这个分析的一部分报道的第二基因。

将由C17orf99编码的蛋白质鉴定为新细胞因子白介素-40(IL40)是基于若干因素。首先，它是表达限于免疫系统的若干组织和细胞的小分泌蛋白质-类似于许多其它已知细胞因子的表达谱。本发明者开始探究IL40在骨髓中的表达，并且发现与其它细胞因子不同，它由淋巴而非骨髓基质细胞表达。在BIGE数据库中，IL40由活化的外周血液B细胞达成的较小但显著的表达进一步表明它是B细胞产物。IL40编码小分泌蛋白质，并且它的表达在于促炎性条件下培养的B细胞中被诱导，并由各种细胞因子调节。总之，本发明者推断C17orf99编码一种新B细胞源性细胞因子。

直至近来，大多数已知细胞因子(甚至近来表征的那些)属于已知细胞因子家族。举例来说，IL37是白介素1家族的成员。这有助于它们的鉴定。相反，IL40不属于任何已知细胞因子家族。本发明者已在哺乳动物中，但未在鸡或斑马鱼中鉴定出同源物。这指示它的功能可能限于哺乳动物免疫系统。

实际上，本发明者已确定在Th2细胞因子(IL-4和IL-13)而非Th1细胞因子IFNγ存在下，在用抗CD40mAb(或CD40L或LPS)活化后，IL40在B细胞中被诱导。然而，IL40由在TGFβ存在下的活化最显著诱导。有可能的是先前归因于TGFβ对B细胞功能的一些作用可由IL40间接介导。TGFβ同时抑制B细胞增殖(30)以及朝向IgG1、IgG2a、IgG3和IgE的CSR，同时诱导朝向IgA和IgG2b的CSR。

当B细胞条件性敲除TGFβ(31)或TGFR(30)(或TGFR的组分，即Smad2^-/-(32))时，小鼠在派伊尔氏斑中的IgA产生方面具有缺陷，但生发中心细胞和朝向所有其它同种型的CSR的出现率和数目增加。尽管Il40^-/-小鼠在派伊尔氏斑中的IgA产生性细胞方面具有缺陷，但它们也具有的降低的生发中心细胞，从而表明这个缺陷的机理不同于TGFβ或TGFR缺陷小鼠。另外，内源性TGFβ为体外脾细胞CSR诱导期间朝向所有同种型的CSR所必需，因为抑制内源性TGFβ使所有同种型的CSR降低(33)，然而来自Il40^-/-小鼠的B细胞在用LPS和Th1或Th2细胞因子体外诱导期间不具有CSR缺陷，但在IgA转换方面存在略微增加。重要的是应注意在GC和IgA产生性细胞方面的缺陷也可由在GC应答方面的缺陷引起，所述应答诸如活化(CD40或B7缺陷小鼠)(34)、增殖(Ccnd3^-/-小鼠)(22)、存活(Pdcd1lg2^-/-、CD274^-/-Pdcd1lg2^-/-和Pdcd1^-/-小鼠)(35)、或向固有层中迁移(由FTY720达成的S1P抑制)(36)。然而，这些缺陷都不类似于脾中B细胞数目增加的但派伊尔氏斑中生发中心和IgA分泌细胞的数目较低的Il40^-/-小鼠的表型。我们也检测到Il40^-/-小鼠的粪便中的IgA较低。TGFβ强烈增强由活化的B细胞产生Il40，并且Il40在乳腺中开始泌乳后被诱导。总之，这些观察结果指示Il40涉及于B细胞朝向IgA应答的分化中。

近来，由B细胞亚组产生的细胞因子已被认定为免疫调节的关键调控剂，因为显示B细胞与T细胞在通过分泌的细胞因子使促炎性或消炎性应答偏斜方面具有互惠性相互作用(37)。对由活化的B细胞产生的新细胞因子的发现是高度重要的，因为定制特异性细胞因子相互作用已作为治疗策略在诸如类风湿性关节炎(RA)和SLE的自身免疫疾病的治疗中得到普及(38,39)。此外，B细胞已被认定涉及于许多人自身免疫疾病中，因此鉴定由B细胞产生的新细胞因子将促进我们了解B细胞介导的病理学。

此处，本发明者描述对仅由外周中的活化的B细胞产生的新细胞因子IL40的首次报道。因为不存在关于IL40的先前报道，所以它的精确路径和信号传导机理是未知的。本发明者相信IL40可在通过活化的B细胞进行的自分泌信号传导中起作用，因为微阵列分析揭示当比较WT和Il40^-/-小鼠淋巴结时，主要是B细胞基因被改变。对B细胞分化中涉及的新细胞因子的发现在了解B细胞细胞因子涉及于调节免疫应答方面也是重要的。另外，在患有SLE的小鼠和人中，IL40^-/-转录升高，从而表明IL40的调控异常可涉及于自身免疫疾病中。

方法：

B细胞、CSR和浆细胞分化

在37℃下在48孔板中，将脾细胞再混悬于具有FBS(10％)、50mMβ-巯基乙醇和1x抗生素-抗霉菌素混合物(15240-062；InvitrogenCorp.)的RPMI中，并且用以下试剂：来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的LPS(5μg/ml)(055:B5；Sigma-Aldrich)加TGF-β(2ng/ml；R&DSystems)和抗IgD右旋糖苷(FinaBiosolutions)刺激以达成向IgA的CSR。另外，LPS与rmIL-4(5ng/ml)组合使用以达成向IgG1的CSR，以及与IFN-γ(50ng/ml；PeproTechInc.)组合使用以达成向IgG3的CSR。在用FITC-抗小鼠IgG1(克隆A85-1)、抗小鼠IgG2a(克隆R19-15)、抗小鼠IgG2b(克隆R12-3)、抗小鼠IgG3(克隆R40-82)或抗小鼠IgA(克隆C10-3)大鼠mAb和PE-抗小鼠CD45R(B220)(克隆RA3-6B2)大鼠mAb(BDBiosciences)染色之后，在第4天收集细胞以进行表面Ig分析。用含1％多聚甲醛的PBS固定细胞，并且通过FACS来分析。

用藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠CD45R(B220)大鼠mAb(RA3-6B2，eBiosciences)和FITC标记的PNA(E-YLaboratories,SanMateo,CA)、7AAD(Biolegend)和APC标记的IgM(Biolegend)染色派伊尔氏斑B细胞，并且在FACScalibur(Becton-Dickinson)和FlowJo软件中分析。

实时PCR可用于测量给定样品中IL40mRNA的量。多种机器可用于这个目的，并且各自需要设计特异性引物以扩增和测量正确mRNA。使用来自Roche的Lightcycler(Indianapolis,Indiana,USA)。

实施例2

鉴定携带IL40受体的细胞

为确定哪种细胞携带IL40受体，收集来自C57BL/6小鼠的脾细胞，均质化并放置至FACS管(每管0.5x10E6个细胞)中。首先，使脾细胞与FACS阻断缓冲液一起在冰上孵育30分钟。接着，细胞用冰冷FACS洗涤缓冲液洗涤一次，并且与重组His标签标记的IL40(10ug/ml)一起在冰上孵育30分钟。之后，洗涤细胞两次，并且与兔抗6xHis标签抗体(1:500稀释度)一起在冰上孵育30分钟。接着洗涤细胞两次，并且与缀合于FITC的山羊抗兔二级抗体(1:200稀释度)、同种型对照或其它细胞表面染色抗体一起孵育。结果显示于图20中。这个实验指示IL40结合B细胞而非T细胞。

用于实验的试剂：

兔抗6xHis标签抗体(Abcam，目录号ab9108)

FITC驴抗兔(Biolegend，目录号406403)

兔IgG同种型对照(SantaCruz，目录号sc-2027)

PE抗小鼠CD45R/B220(Biolegend，目录号103207)

APC抗小鼠CD8b.2抗体(Biolegend，目录号140409)

PE抗小鼠CD3抗体(Biolegend，目录号100307)

APC抗小鼠CD19抗体(Biolegend，目录号115511)

实施例3

受体表达性细胞对细胞因子的功能性应答。为发现应答性细胞中由IL40调节的生物标志物基因，可使来自如脾、淋巴结、胸腺或骨髓的免疫器官的细胞与各种剂量的重组小鼠或人IL40一起孵育(视所用细胞来源而定)，接着孵育数小时(6-8-24)以让细胞转录这些基因的mRNA。接着收集并处理细胞以使用来自Affymetrix的基因阵列进行微阵列分析。使用标准技术制备mRNA，接着产生cDNA以用于与微阵列杂交。读取微阵列，并且用专有Affymetrix软件分析数据。由控制的基因

实施例4

评估IL40序列变体的激动剂或拮抗剂功能。受体表达性细胞的功能性应答可用于监测激动剂或拮抗剂功能。为此，可使受体表达性细胞与激动剂或拮抗剂一起孵育，并且通过qPCR监测IL40应答性基因的表达。这些基因的水平应指示IL40是否能够结合它的受体。应答细胞将与应诱导与这些应答细胞中由IL40诱导的基因相同的基因的IL40激动剂一起孵育。如果使应答细胞与IL40以及各候选拮抗剂一起孵育，那么拮抗剂应阻断对这些生物标志物基因的诱导。

实施例5

鉴定受体结构的预言性实施例。细胞因子的受体可由若干蛋白质链组成。可利用已通过使用如下所述的若干可能方法而良好用于鉴定IL40受体的确定方法。

方法A：种子方法，cDNA文库，以及测试哪些克隆进行结合。可制备已知结合IL40的细胞的cDNA文库。可通过用放射性标签标记IL40，以及进行放射免疫测定来确定哪些细胞结合IL40。或者，His标签标记的IL40可用于结合细胞，并且使用抗His抗体检测细胞因子与表达受体的细胞的结合。可使用其它标签，如FLAG而非His。一旦鉴定表达受体的细胞，即可产生这些细胞的cDNA文库，并且用cDNA文库克隆的汇合物转染细胞，诸如HEK293或BAF3细胞。可如上所述监测这些细胞中的哪些目前结合IL40。荧光标记的细胞可通过流式细胞计量术分选，并且培养以用作mRNA的来源。这个mRNA可用于从被转染至那个给定细胞中的文库克隆cDNA，所述细胞也负责表达IL40受体链。cDNA构建体中的特定序列可用于设计引物以PCR出见于那个细胞中的文库cDNA。这个方法可不依赖于组成IL40受体的链数而使用，唯一差异将是阳性细胞将被鉴定的频率。

方法B：生物化学方法，标记配体以及分离结合复合物。配体可用如His或FLAG(或其它标签)的标签标记，并且与来自表达IL40受体的细胞的膜一起孵育。可添加各种清洁剂以优化配体结合受体的能力，并且能够在用抗His或抗Flag抗体免疫沉淀之后在凝胶中操作复合物。这个方法应在与IL40受体具有的链数无关的情况下起作用。可分离并测序所得免疫沉淀条带，并且生物信息学可用于确定编码各蛋白质的基因的身份。

方法C：遗传方法；双杂交系统。可使用酵母双杂交系统鉴定IL40相互作用蛋白质。IL40将被制备成融合蛋白(例如GALBD)，并且潜在相互作用蛋白质可被制备成用GALAD标记的融合蛋白。在这个情况下，IL40将是‘诱饵’，而相互作用蛋白质将是‘猎物’。所述系统在作为一种其中相互作用蛋白质将导致报道基因(例如LacZ)转录的酵母系统的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中加以测试。开启LacZ基因的酵母将是其中已发生两种蛋白质成功相互作用(互补)的那些。这个系统可鉴定构成IL40受体的若干蛋白质。

实施例6

产生抗体

方法A：小鼠或兔多克隆；免疫选择。可通过用重组人、小鼠或大鼠IL40免疫动物来产生抗体。可使绵羊、山羊、驴或马免疫。可使用若干免疫剂量，并且可通过ELISA监测抗体的产生。一旦实现所需应答，即可通过将免疫的动物放血以及获得血清来收集抗体。

方法B：小鼠或大鼠单克隆抗体。可通过以下方式制备针对人IL40的单克隆抗体：用IL40免疫小鼠，监测小鼠的应答，以及选择显示针对IL40的强烈应答的小鼠。获得脾，并且用聚乙二醇或类似融合试剂使其融合于骨髓瘤细胞以产生杂交瘤。可使所得杂交瘤在体外生长，并且使用HAT培养基选择以使杂交瘤选择性生长。克隆所得杂交瘤，并且可通过ELISA、蛋白质印迹、FACS或免疫组织化学分析筛选产生抗体。

使用噬菌体展示产生抗体。用人IL40免疫小鼠，并且它们的脾用于产生噬菌体展示文库。文库接着被针对它结合重组IL40的能力加以筛选。鉴定成功噬菌体展示克隆，并且获得它们的序列以获得抗体的结合位点的序列信息。所得抗体可使用分子生物学技术工程改造成适当完全人抗体。

实施例7

用于表达细胞因子的核酸构建体

方法1：可使用来自人或小鼠的表达IL40mRNA的细胞，并且可使用锚定寡dT进行RT-PCR。可接着使用针对IL40设计的引物扩增IL40cDNA。可将这个cDNA插入高表达载体，诸如哺乳动物、细菌或昆虫质粒载体中。将含有IL40基因的cDNA插入用于各系统的适当接受体细胞中，并且使其孵育以致细胞可产生IL40蛋白。收集这些细胞的上清液，并且用于使用生物化学方法纯化IL40。人IL40cDNA序列(SEQIDNO.4)显示于图21中。

方法2：与方法1相同，但通过设计对不含于方法1中的外显子/内含子具有特异性的引物来克隆IL40mRNA的剪接变体。

方法3：与方法1相同，例外之处是可插入编码标签标记的基因或报道体基因的序列以产生融合蛋白。融合蛋白可用于检测产生Il40的细胞。标签标记的融合蛋白也可用于蛋白质印迹或亲和纯化。

方法4：与方法1相同，例外之处是启动子可用来自不同基因的高度诱导性或高度活性启动子替换。这可允许我们控制转基因在最终表达系统中的表达。

实施例8

使用以上核酸构建体制备和纯化IL40蛋白

方法1：视将IL40cDNA插入哪个载体中而定，可使用含有IL40cDNA插入物以及阳性或阴性选择剂(新霉素/β半乳糖苷酶/GFP)的质粒载体构建体转染哺乳动物(HEK、HELA等)细胞系、昆虫细胞或细菌。可对表达质粒的转化/转染细胞进行阳性或阴性选择以消除将不产生重组蛋白的细胞。可直接从转染/转化细胞的上清液或溶解产物获得高量重组IL40。

方法2：在不同方法中，可对用含有IL40cDNA插入物的载体转染/转化的细胞的溶解产物进行化学沉淀以获得浓缩量的蛋白质。化学方法包括盐、pH、有机溶剂、金属离子、非离子聚合物、使所有蛋白质非特异性沉淀的方法。使含有重组蛋白的溶解产物与化学沉淀剂混合。可通过低速离心或倾析收集沉淀。接着可通过穿过渗析管进行透析来再混悬沉淀，所述渗析管允许较小沉淀剂穿过膜，同时将蛋白质保持在管中。沉淀将含有浓缩量的包括重组蛋白的总蛋白质。

方法3：在不同方法中，可使用含有连接于磁珠的抗IL40抗体或重组IL40受体的管柱，对用含有IL40cDNA插入物的载体转染/转化的细胞的溶解产物进行亲和纯化。可洗涤管柱以移除蛋白质的非特异性结合，同时维持重组IL40与连接于珠粒的抗体的结合。可接着使用影响rIL40与抗IL40抗体之间的相互作用的pH或盐的变化洗脱管柱。

方法4：在不同方法中，可收集用含有IL40cDNA插入物的载体转染/转化的细胞的溶解产物，并且使用尺寸排阻通过膜来浓缩。可使用含有仅可为小于30KD的蛋白质渗透的膜的离心管柱。可接着收集小于30KD的蛋白质，其应包括由转染/转化细胞产生的高量重组IL40。

方法5：在不同方法中，可收集用含有IL40cDNA插入物的载体转染/转化的细胞的溶解产物，并且通过高效液相色谱法纯化。因为各蛋白质与分析物差异性相互作用，所以可收集含有重组IL40的级分。

实施例9

分离IL40受体表达性细胞(FACS分离)

方法A：分离、纯化。为确定哪种细胞携带IL40受体，收集小鼠脾细胞，均质化并放置至FACS管(每管0.5e6个细胞)中。首先，使脾细胞与FACS阻断缓冲液一起在冰上孵育30分钟。接着，细胞用冰冷FACS洗涤缓冲液洗涤一次，并且与重组His标签标记的IL40(10ug/ml)一起在冰上孵育30分钟。之后，洗涤细胞两次，并且与兔抗His标签抗体(1:500稀释度)一起在冰上孵育30分钟。接着洗涤细胞两次，并且与缀合于FITC的山羊抗兔二级抗体、同种型对照或其它细胞表面染色抗体一起孵育。这个实验指示IL40结合B细胞，其可用作阳性对照。

标记的细胞可通过流式细胞计量术基于它们的FITC表达加以分选。分选的细胞应表达IL40受体。

方法B：从细胞群体消减。用毒素(例如像抗体药物缀合物)标记的IL40可用于破坏表达IL40受体的细胞。针对IL40受体的抗体也可单独或以抗体-药物缀合物形式用于相同目的。

方法C：在动物中；消减细胞。静脉内注射抗IL40受体单克隆抗体可用于消减IL40受体表达性细胞。抗体可为“裸露”抗体或抗体药物缀合物。

实施例10

使用IL40转基因或敲除小鼠发现IL40的作用。IL40^-/-小鼠可用于探究IL40的功能。这个小鼠已被公开(Tang,T.等Amouseknockoutlibraryforsecretedandtrasnmembraneproteins,2010.Nat.Biotechnol.7:749-55)。观察的唯一表型是当小鼠被免疫时，血清中的IgG1升高。可获得来自这个小鼠的免疫组织，并且可用不同试剂(针对T细胞的抗CD3和抗CD28；针对B细胞的脂多糖(LPS)或抗CD40和IL4；针对单核细胞的LPS)活化它们。可接着进行微阵列分析以鉴定在野生型与IL40^-/-组织之间差异性表达的基因。也可使用对各种组织的流式细胞计量术分析小鼠的表型，或进行血液化学分析以及血细胞计数。小鼠可用于各种疾病模型，包括癌症、自身免疫疾病或感染性疾病中；

除IL40^-/-小鼠之外，IL40也可作为转基因在小鼠中过表达。这将放大IL40在体内的作用，并且将允许在小鼠模型中探究这个细胞因子的作用。为此，通过向小鼠胚胎的单细胞中原核注射来引入转基因，并且它被整合于基因组中。基因受控于可被触发以表达基因的启动子。体内过表达IL40将引导我们了解这个细胞因子在体内的作用。分析所得转基因IL40小鼠的表型将允许我们了解它在体内的功能。

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尽管本发明已与优选实施方案关联描述，但应了解可在不脱离本发明的原理和范围下利用修改和变化，如本领域技术人员所将易于了解。因此，所述修改可在本发明和以下权利要求的范围内实施。

Claims

1.一种针对C17orf99多肽基因产物(IL40)的抗体，其中所述抗体是：

a)IgG、IgM、IgA、IgD或IgE；

b)单克隆抗体；

c)Fab'、Fab、F(ab')₂、单结构域抗体(sdAb)、Fv或scFv(单链Fv)；

d)标记的抗体；

e)中和抗体；或

f)a)-e)的任何组合。

2.一种检测样品中的IL40的方法，其包括在免疫检测方法中使用如权利要求1所述的抗体作为检测剂来免疫检测IL40。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述免疫检测方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、组织学分析、荧光激活的细胞分选、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、免疫组织化学分析、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、蛋白质印迹或斑点印迹。

4.一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1所述的抗体以中和IL40。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病或淋巴瘤。

6.一种检测样品中的IL40的方法，其包括在针对涉及IL40的疾病的诊断或治疗诊断方法中使用如权利要求1所述的抗体作为检测剂来免疫检测IL40。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述疾病是淋巴瘤、白血病、免疫缺陷或自身免疫疾病。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述自身免疫疾病是全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或牛皮癣，并且所述免疫缺陷是IgA缺陷综合征。

9.一种肽或分离的蛋白质，其包含IL40或成熟形式的IL40的一部分或完整氨基酸序列。

10.如权利要求9所述的肽或蛋白质，其中所述肽或蛋白质是：

a)IL40的序列变体、多态性或物种对应物；

b)IL40的取代、插入或缺失变体；

d)IL40的功能性变体；

e)IL40的功能性区段、IL40的保守区域、或IL40的非保守区域；

f)IL40的融合蛋白；或

g)a)-f)的任何组合。

11.一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求9或10所述的肽或蛋白质，其中所述肽或蛋白质是IL40拮抗剂。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病或淋巴瘤。

13.一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的IL40、或如权利要求9或10所述的肽或蛋白质，其中所述肽或蛋白质是IL40激动剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述疾病是IgA缺陷综合征、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤或另一淋巴瘤或白血病；类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、桥本甲状腺炎、硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自身免疫肝炎、多发性硬化症、牛皮癣、特应性皮炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎或另一自身免疫疾病。

15.一种诊断涉及IL40的疾病的方法，其包括使用如权利要求9或10所述的肽或蛋白质作为诊断/治疗诊断方法中的靶标或样品对照。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述疾病是淋巴瘤、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或牛皮癣。

17.一种纯化或分离表达IL40的细胞的亚组的方法，其包括使用如权利要求1所述的抗体作为纯化/分离剂来纯化或分离所述细胞的亚组。

18.如权利要求17所述的方法，其中通过荧光激活的细胞分选(FACS)纯化或分离所述亚组以选择所述细胞亚组。

19.一种产生如权利要求1所述的抗体的细胞，其中所述细胞是杂交瘤、重组细菌细胞、重组酵母细胞或重组哺乳动物细胞。

20.一种动物，其包含如权利要求19所述的细胞。

21.如权利要求10所述的肽或蛋白质，其中所述功能性变体是IL40的激动剂或拮抗剂，并且所述融合蛋白是共价或非共价构建体或标记的构建体。

22.一种诱导免疫细胞的方法，其包括使用如权利要求9或10所述的肽或蛋白质作为活性剂以诱导所述免疫细胞产生突触回蛋白2和/或由B细胞产生的其它IL40诱导蛋白，或诱导所述免疫细胞的分化或成熟。

23.一种鉴定IL40的受体的方法，其包括使用如权利要求9或10所述的肽或蛋白质作为用于结合所述IL40受体的配体。

24.一种产生如权利要求9或10所述的肽或蛋白质的细胞，其中所述细胞是重组细菌细胞、重组酵母细胞或重组哺乳动物细胞。

25.一种动物，其包含如权利要求24所述的细胞。

26.一种核酸，其包含IL40基因或IL40cDNA的一部分或完整核苷酸序列。

27.一种包含IL40基因或IL40cDNA的一部分或完整核苷酸序列的核酸，其中所述核酸编码如权利要求9所述的肽或蛋白质。

28.如权利要求26或27所述的核酸，其中所述核酸：

a)缀合于另一核苷酸序列、标记或化学衍生物；

b)基于所述IL40基因或IL40cDNA序列的引物、探针、反义分子或寡核苷酸；

c)连接于异源性核酸序列的重组构建体；或

d)a)-c)的任何组合。

29.如权利要求28所述的核酸，其中所述异源性核酸序列是启动子、增强子、载体或表达载体。

30.一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求26或27所述的核酸，其中所述核酸降低IL40表达。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病或淋巴瘤。

32.一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求26或27所述的核酸，其中所述核酸增加IL40表达。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述疾病是IgA缺陷综合征、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤或另一淋巴瘤或白血病；类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、桥本甲状腺炎、硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自身免疫肝炎、多发性硬化症、牛皮癣、特应性皮炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎或另一自身免疫疾病。

34.如权利要求30所述的方法，其中所述核酸是RNAi分子。

35.一种诊断涉及IL40的疾病的方法，其包括通过使用如权利要求26或27所述的核酸作为针对所述疾病的诊断/治疗诊断方法中的探针来探测样品。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述疾病是淋巴瘤、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或牛皮癣。

37.一种包含重组形式的如权利要求26或27所述的核酸的细胞，其中所述细胞是重组细菌细胞、重组酵母细胞或重组哺乳动物细胞。

38.一种动物，其包含如权利要求37所述的细胞。

39.一种选择表达IL40的细胞的亚组的方法，其包括

向包含表达IL40的细胞的细胞群体中添加结合IL40的分子，以及

选择被所述IL40结合分子标记的细胞以提供所选细胞的群体。

40.如权利要求39所述的方法，其中：

a)表达IL40的所述细胞是小鼠、大鼠或人细胞；

b)所述IL40结合分子是抗IL40抗体或IL40受体；

c)所述所选细胞选自血液、体液、细胞混悬液或患者样品；

d)所述所选细胞是用于研究IL40表达性细胞的研究工具；或

e)所述所选细胞是血细胞，并且是：

i)由所述所选细胞产生的免疫球蛋白的mRNA的来源；

ii)用于产生完全人源化抗体的新方法的来源；或

f)a)-e)的任何组合。

41.一种治疗有需要的受试者的涉及IL40的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求39所述的所选细胞。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述疾病是IgA缺陷综合征、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤或另一淋巴瘤或白血病；类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、桥本甲状腺炎、硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自身免疫肝炎、多发性硬化症、牛皮癣、特应性皮炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎或另一自身免疫疾病。

43.一种检测受试者中活化的B细胞的方法，其包括测量所述受试者中IL40的水平，其中相比于对照，IL40水平的增加指示活化的B细胞。

44.如权利要求43所述的方法，其中：

a)所述IL40水平通过免疫检测技术测量；

b)所述方法进一步包括测量另一生物标志物；

c)所述方法诊断需要所述诊断的所述受试者的自身免疫性或淋巴瘤，其中所述水平增加指示淋巴瘤或自身免疫性；

d)所述IL40水平增加确定淋巴瘤或自身免疫疾病的IL40产生性亚型；或

e)a)-d)的任何组合。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述免疫检测技术是ELISA、组织学分析、荧光激活的细胞分选、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、免疫组织化学分析、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、蛋白质印迹或斑点印迹。

46.一种治疗有需要的受试者的淋巴瘤或自身免疫疾病的方法，其包括向所述受试者，或向所述受试者的肿瘤、组织或细胞施用治疗有效量的如权利要求1所述的抗体或如权利要求26或27所述的核酸。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗体是中和抗体，并且所述核酸是反义RNA。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述反义RNA是RNAi分子。

49.一种鉴定受试者中IL40产生性细胞的方法，其包括使用如权利要求1所述的抗体或如权利要求26或27所述的核酸作为探针以鉴定所述细胞。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述方法包括免疫组织化学分析或原位杂交。

51.一种鉴定IL40受体的方法，其包括

a)用IL40、标记的IL40、His标签标记的IL40或其组合标记IL40应答性细胞，以及分离、纯化和/或分开所述标记的细胞；

b)用IL40、标记的IL40、His标签标记的IL40或其组合标记IL40应答性细胞，以及分离、纯化和/或分开所述标记的细胞，其中所述细胞是表达所述IL40受体的真核或细菌细胞；

c)在酵母双杂交系统中鉴定结合IL40的蛋白质；或

d)使IL40结合蛋白从来自表达所述IL40受体的细胞的膜制备物免疫沉淀。

52.一种使用IL40的方法，其包括使免疫细胞暴露于IL40或其功能活性变体以便：

a)促进B细胞体外或体内生长和分化；

b)增加杂交瘤培养物的生长；

c)增加由杂交瘤培养物达成的抗体产生；或

d)通过使用来自不同哺乳动物物种的IL40来确定组织或细胞的物种来源。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物物种是人、狗、猫、母牛、马、猪、山羊或绵羊。

54.如权利要求1至53中任一项所述的涉及自身免疫性、自身免疫疾病或淋巴瘤的主题，

其中所述自身免疫疾病是全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、格雷夫斯病、自身免疫肝炎、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎或斯耶格伦氏综合征，并且

所述淋巴瘤是霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、MALT淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、蕈样真菌病或多发性骨髓瘤。

55.如权利要求1至53中任一项所述的涉及治疗的主题，

其中所述抗体、肽、蛋白质或核酸是局部或全身递送。

56.如权利要求1至53中任一项所述的涉及诊断或诊断/治疗诊断方法的主题，

其中所述方法是对样品实施。

57.如权利要求56所述的主题，其中所述样品是血清、血液、体液、肿瘤、组织或细胞。

58.如权利要求1至53中任一项所述的涉及抗体、肽、蛋白质或核酸分子的主题，其中所述分子在以下药物制剂中：

a)包含药学上可接受的载体、赋形剂或其组合；

b)被用作无菌制剂；

c)包含用于治疗自身免疫疾病或淋巴瘤的另一治疗剂；

d)呈缓慢或持续释放制剂形式；

e)呈靶向施用形式；或

f)a)-e)的任何组合。

59.如权利要求58所述的主题，其中所述缓慢或持续释放制剂包括乳液或胶束，并且所述靶向施用形式是脂质体、包合复合物或载体。