JP5885926B2 - 関節リウマチの存在の評価方法およびその方法に用いられるバイオマーカーセット - Google Patents
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Description
より客観的な方法としては、リウマトイド因子(rheumatoid factor:以下、「RF」という)および抗環状シトルリン化ペプチド抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody:以下、「抗CCP抗体」という)などの自己抗体についての血清学的検査に基づく方法が挙げられる。これらの検査所見は、米国リウマチ学会(American College of Rheumatology:ACR)および欧州リウマチ学会(European League Against Rheumatism:EULAR)により提唱されたACR/EULAR診断基準にも用いられている。
抗CCP抗体は、環状シトルリン化ペプチドを抗原として用いて測定される自己抗体であり、RAに対する感度および特異度がRFよりも高いとされている。したがって、抗CCP抗体は、RAの早期診断および予後予測因子として注目され、国内外でRAの診断に利用されている。
しかしながら、臨床上有用とされている抗CCP抗体を検査した場合でも、その検査方法や用いた抗原の種類によって感度にばらつきが生じることが報告されている(非特許文献1)。感度が40〜60%であった事例も多くあり、抗CCP抗体の検査も十分に精度が高いとはいえない。
そこで、本発明は、RA患者と健常者とを高精度に区別できる新規バイオマーカーセットを見出し、その新規マーカーセットを用いて関節リウマチの存在を評価する方法を提供することを目的とする。
取得した前記第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの存在を評価する工程と
を含む、関節リウマチの存在の評価方法を提供する。
本発明のRAの存在の評価方法(以下、単に「評価方法」ともいう)では、まず、被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第1バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも1つの第2バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する。
本発明の実施形態において、生体試料は、被験者から採取され、細胞、核酸、タンパク質などの生物学的材料が含まれる試料であれば特に限定されないが、好ましくは細胞を含む試料である。生体試料として具体的には、血液、関節液、脳脊髄液、胸水、腹水、リンパ液、手術または生検により採取した組織および細胞などが挙げられる。それらの中でも、血液中の細胞を含む試料が好ましい。
したがって、第1バイオマーカーは、SLC16A4で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその変異型もしくは断片であるか、あるいはSLC16A4で表される遺伝子によりコードされるタンパク質またはその機能的に同等な変異型もしくは断片である。
また、第2バイオマーカーは、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも1つで表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその変異型もしくは断片であるか、あるいはSLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも1つで表される遺伝子によりコードされるタンパク質またはその機能的に同等な変異型もしくは断片である。
なお、本明細書において、ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAのいずれであってもよく、上記の遺伝子そのもの(DNA)、mRNA、cDNAまたはcRNAのいずれであってもよい。
なお、本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、BLASTN、BLASTP、BLASTXまたはTBLASTN(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.govから利用可能)を標準設定で用いて算出されるものを意味する。
本明細書において、タンパク質の断片とは、上記のバイオマーカーのアミノ酸配列の一部を連続して有し、後述するバイオマーカーの発現量に関する情報を取得するための抗体または核酸アプタマーにより特異的に認識される長さのポリペプチドを意味する。
第1および第2バイオマーカーがポリヌクレオチドマーカーの場合、これらのバイオマーカーの発現量に関する情報は、例えば、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法などの核酸増幅法、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法などの当該技術において公知の方法により取得できる、核酸(DNA、mRNA、cDNAまたはcRNA)の定量値が挙げられる。
第1および第2バイオマーカーがポリペプチドマーカーの場合、これらのバイオマーカーの発現量に関する情報は、後述するバイオマーカーの発現量に関する情報を取得するための抗体または核酸アプタマーを用いて、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロット法、ELISA法、フローサイトメトリー法などの当該技術において公知の方法により取得できる、タンパク質の定量値が挙げられる。
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、上記のプローブが標的ポリヌクレオチドに、該標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドよりも検出可能に大きい程度(例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍を超える)でハイブリダイズできる条件である。
なお、ストリンジェントな条件は、通常、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の熱的融点(thermal melting point:Tm)よりも、約5℃低くなるように選択される。このTmは、(規定されたイオン強度、pHおよび核酸組成の下で)上記の標的核酸分子の塩基配列に相補的なプローブの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。
また、発現量取得用プローブは、当該技術において公知のポリヌクレオチドの合成方法により作製できる。発現量取得用プローブの長さは、通常5〜50ヌクレオチド、好ましくは10〜40ヌクレオチドである。
上記の発現量取得用プローブは、例えば、核酸増幅法により第1および第2バイオマーカーを増幅するための2種以上のプライマーのセットとすることができる。
なお、所定の基準値は、上記のデータの種類に応じて適宜設定することができる。例えば、該データがサイクル数である場合、所定の基準値として、核酸増幅反応が対数増殖を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、取得した第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報(例えばmRNAの定量値)から多変量解析により値を取得する工程をさらに含む。この場合、取得した値に基づいて被験者における関節リウマチの存在を評価する。多変量解析により取得される値としては、例えば、多重ロジスティック回帰分析により得ることができる予測値が挙げられる。
本明細書において、「被験者における関節リウマチの存在を評価する」とは、被験者がRAに罹患しているか否かを判定すること、および、該被験者がRAに罹患している場合はその症状の程度(疾患活動性)を定量化することを意味する。
したがって、本発明の別の実施形態は、RAに対する治療を受けている被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第1バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも1つの第2バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、取得した前記第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、上記の被験者における関節リウマチの治療効果をモニターする工程とを含む、関節リウマチのモニタリング方法である。
例えば、第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報がmRNAまたはタンパク質の定量値である場合、該定量値が大きいときに、被験者がRAに罹患していると判定するか又はRAの疾患活動性が亢進していることをモニターすることができる。反対に、上記の定量値が小さいときに、被験者がRAに罹患していないと判定するか又はRAの疾患活動性が緩和していることをモニターすることができる。さらに、上記の定量値に基づいて、被験者のRAの疾患活動性を示す数値指標(例えば、ロジスティック回帰分析などの多変量解析により取得される、RAの罹患状態と相関を示す数値)を取得して、症状の程度を定量化することもできる。
例えば、第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報がmRNAの定量値である場合、第1および第2バイオマーカーの両方の定量値が所定のカットオフ値以上のときに、取得した第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報がいずれも高発現を示していると決定できる。この場合、本発明の評価方法により、被験者がRAに罹患していると判定するか又はRAの疾患活動性が亢進していることをモニターすることができる。
反対に、第1および第2バイオマーカーの両方の定量値が所定のカットオフ値よりも小さいとき、取得した第1および第2バイオマーカーの発現量に関する情報がいずれも高発現を示していないと決定できる。この場合、本発明の評価方法により、被験者がRAに罹患していないと判定するか又はRAの疾患活動性が緩和していることをモニターすることができる。
なお、この実施形態における所定のカットオフ値は、例えばSTAT Flex ver.6(株式会社アーテック)のような市販のソフトウェアを用いて算出され、Youden indexにより決定できる。
本発明の関節リウマチの存在を評価するためのバイオマーカーセット(以下、単に「バイオマーカーセット」ともいう)は、SLC16A4で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその変異型もしくは断片である第1バイオマーカーと、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも1つで表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその変異型もしくは断片である第2バイオマーカーとを含むことを特徴とする。
1.健常人および関節リウマチ患者の末梢血からのCD4陽性細胞の単離
健常な成人(n=20)およびRA患者(n=33)から末梢血を採血管NP-HE0557(ニプロ社)に採取した。なお、RA患者群の特徴は次のとおりである:女性24検体、男性9検体、年齢30〜80才(平均56.9才)、DAS(Disease Activity Score)28は1.8〜5.2(平均3.2)。
これらの抹消血に抗CD4抗体を結合させた磁気ビーズ(以下、「抗CD4抗体ビーズ」という:Miltenyi Biotec社)を添加して、CD4陽性細胞を単離した。なお、この操作は、抗CD4抗体ビーズの添付文書の記載に従って行った。得られたCD4陽性細胞を、次のトータルRNA抽出工程まで−80℃にて凍結保存した。
RNeasy Plus MiniキットおよびRNeasy microキット(QIAGEN社)を用いて、上記の工程1.で得たCD4陽性細胞からトータルRNAを抽出した。なお、具体的な操作は、各キットの添付文書の記載に従って行った。
Two-Cycle Target Labeling and Control Reagents(Affymetrix社)を用いて、上記の工程2.で抽出した各細胞のトータルRNA(10〜100 ng)をcDNAに逆転写し、さらにビオチン化cRNAへの転写反応を行った。次いで、増幅したビオチン化cRNA(20μg)を断片化した。なお、具体的な操作は、キットに添付の説明書の記載に従って行った。
上記で得られた各細胞由来のビオチン化cRNA(15μg)を検体として、それぞれGeneChip Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array(Affymetrix社)に添加し、GeneChip Hybridization Oven 640(Affymetrix社)に移して、45℃、60 rpmの条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション終了後、上記のマイクロアレイを、GeneChip Fluidic Station 450(Affymetrix社)を用いて洗浄および蛍光標識を行い、該マイクロアレイを、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社)を用いてスキャンし、蛍光強度データを取得した。
上記の工程3.で得られた各遺伝子のmRNA発現量を示す蛍光強度を、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量を示す蛍光強度で除する補正を行って、各遺伝子の発現量に関する情報(以下、「発現レベル」という)を得た。そして、これらの発現レベルのうち、本発明者らがTh17細胞検出用マーカーとしてこれまでに見出した、Th17細胞に特異的に発現する遺伝子(142遺伝子)について、健常者群とRA患者群との間で比較した。なお、Th17細胞に特異的に発現する遺伝子は、他のTh細胞(Th1、Th2、Treg細胞など)での発現量に比べて、約3倍以上発現することが本発明者らにより確認されている(国際出願PCT/JP2010/062807)。
RA患者群の33検体から、コンピュータープログラムを用いた無作為抽出により20検体を選択し、選択された20検体において健常者群20検体よりも発現レベルが有意に増加している遺伝子を抽出した。ここで、発現レベルが有意に増加している遺伝子とは、健常者群とRA患者群についてのMann-Whitney検定により「p値<0.05」を示し、かつ「(RA患者群の発現量レベルの平均)/(健常者群の発現量レベルの平均)」の値が2以上である遺伝子である。なお、無作為抽出およびMann-Whitney検定はSTAT Flex ver.6(株式会社アーテック)を用いて行った。
上記のRA患者群の無作為抽出および発現レベルが有意に増加している遺伝子の抽出をそれぞれ6回繰り返し、6回全ての試行において発現レベルが有意に増加している9遺伝子を健常者群とRA患者群との間で有意に変動するTh17細胞特異的遺伝子として同定した。これらの9遺伝子について、健常者群およびRA患者群での発現レベルを図1に示す。図1において、○は健常者を、●はRA患者を示す。また、各バイオマーカーの名称の下の括弧内に記載される番号は、Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array(Affymetrix社)に搭載されるプローブセットのID番号である。
図1より、上記の9遺伝子はRA患者群において高発現の傾向を示すものの、いずれも単独では健常者と区別できないRA患者の検体が多く見られる。ゆえに、上記の9遺伝子は、いずれも単独では健常者とRA患者とを高精度に区別可能なバイオマーカーとして用いることは困難であることが分かる。
上記の9遺伝子から健常者とRA患者とを高精度に区別可能なバイオマーカーの組み合わせを見出すことを目的として、以下の手順でバイオマーカーセットを選択した。
健常者群(n=20)およびRA患者群(n=33)をあわせた検体群(n=53)から、非復元抽出により無作為に検体数がn=18、n=18、n=17となる3組の検体セットを作成した。次に、3組の検体セットのうち、2組をトレーニングセットとし、残り1組をテストセットとしたトレーニング・テストセットを作成した。これを3回繰り返し、最終的に組み合わせが異なる3組のテスト・トレーニングセットを作成した。
上記の工程4.で得られた9遺伝子から、考えられる全ての遺伝子の組み合わせについて、多重ロジスティック回帰分析を行った。3組のトレーニング・テストセットそれぞれにおいて多重ロジスティック回帰分析を行い、健常人とRA患者とを判別できる5つの回帰モデルを抽出した。抽出された回帰モデルの予測値(p)の算出式(回帰式)と各モデルに含まれる遺伝子の組み合わせを、以下の表2に示す。式中の[SLC16A4]、[SLCO2B1]、[PTPRM]、[ATP9A]、[SHB]は、上記の工程4.で得られた各遺伝子の発現レベルの値である。なお、非復元抽出および多重ロジスティック回帰分析はSTAT Flex ver.6(株式会社アーテック)を用いて行い、回帰式の各係数は、健常者群とRA患者群をあわせた全検体(n=53)のデータを用いて算出した。
RA患者群(n=33)および健常者群(n=20)の各検体の発現レベルから、上記の工程5.の5つの回帰モデルを用いて、各検体の予測値(p)を算出した。なお、予測値は上記表2に記載の式から算出した。
次いで、算出した各検体の予測値に基づいてROC曲線(Receiver Operatorating Characteristic curve:受信者動作特性曲線)を作成し、Youden indexを用いて各回帰モデルにおけるカットオフ値を同定した。算出した予測値がカットオフ値以上の場合は陽性、カットオフ値未満の場合は陰性と判定し、この判定結果に基づいて感度および特異度を算出した。
なお、ROC曲線の作成、カットオフ値の算出ならびに感度および特異度の算出はSTAT Flex ver.6(株式会社アーテック)を用いて行った。
各回帰モデルの感度および特異度ならびにカットオフ値を、表3に示す。また、各回帰モデルについて、健常者群およびRA患者群の各検体の予測値を図2に示す。図2において、○は健常者を、●はRA患者を示す。また、図2の各散布図において、カットオフ値を示した。
図2の各散布図においては、予測値がカットオフ値を下回ったRA患者の検体がいくつか存在した。5つの回帰モデルのいずれかにおいて予測値がカットオフ値を下回った検体(8検体)について、それらのRA患者の疾患活動性(DAS28)を表4に示す。
本発明の評価方法により、RAに罹患しているが抗CCP抗体の検査では陰性とされたRA患者(以下、「抗CCP抗体陰性RA患者」という)を健常者と区別できるか否かを検討した。
健常者群(n=20)および抗CCP抗体陰性RA患者群(n=10)の各検体の発現レベルから、実施例1で同定した回帰モデル(2)(バイオマーカーの組み合わせ:SLC16A4、SLCO2B1)を用いて、各検体それぞれの予測値(p)を算出した。なお、予測値は実施例1の表2に記載の式を用いて算出した。
次いで、ROC曲線を作成し、Youden indexを用いて各回帰モデルにおけるカットオフ値を同定した。算出した予測値がカットオフ値以上の場合は陽性、カットオフ値未満の場合は陰性と判定し、この判定結果に基づいて感度および特異度を算出した。なお、ROC曲線の作成、カットオフ値の算出、ならびに感度および特異度の算出はSTAT Flex ver.6(株式会社アーテック)を用いて行った。
本実施例で得られた感度、特異度およびカットオフ値を、表5に示す。また、本実施例で得られた健常者群および抗CCP抗体陰性RA患者群での予測値を図3に示す。図3において、○は健常者を、●はRA患者を示す。また、図3の各散布図において、カットオフ値を示した。
Claims (11)
- 被験者から得た、Th17細胞を含む生体試料における、SLC16A4の発現量に関する情報と、SLCO2B1の発現量に関する情報を取得する工程と、
取得したSLC16A4の発現量に関する情報およびSLCO2B1の発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの存在を評価する工程と
を含み、
前記SLCO2B1の発現量が、SLCO2B1遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはSLCO2B1遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量であり、
前記評価工程において、前記SLC16A4の発現量に関する情報および前記SLCO2B1の発現量に関する情報が、SLC16A4およびSLCO2B1が高発現であることを示すとき、関節リウマチが存在すると判定する、
関節リウマチの存在の評価を補助する方法。 - 前記評価工程において、前記SLC16A4の発現量に関する情報および前記SLCO2B1の発現量に関する情報と、対応する所定のカットオフ値とを比較して、前記SLC16A4の発現量に関する情報および前記SLCO2B1の発現量に関する情報が前記所定のカットオフ値以上のとき、関節リウマチが存在すると判定する、請求項1に記載の方法。
- 関節リウマチに対する治療を受けている被験者から得た、Th17細胞を含む生体試料における、SLC16A4の発現量に関する情報と、SLCO2B1の発現量に関する情報を取得する工程と、
取得したSLC16A4の発現量に関する情報およびSLCO2B1の発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの治療効果をモニターする工程と
を含み、
前記SLCO2B1の発現量が、SLCO2B1遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはSLCO2B1遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量であり、
前記評価工程において、前記SLC16A4の発現量に関する情報および前記SLCO2B1の発現量に関する情報が、SLC16A4およびSLCO2B1が高発現であることを示すとき、関節リウマチの疾患活動性が亢進していると判定する、
関節リウマチのモニタリング方法。 - 前記モニター工程において、前記SLC16A4の発現量に関する情報および前記SLCO2B1の発現量に関する情報と、対応する所定のカットオフ値とを比較して、前記SLC16A4の発現量に関する情報および前記SLCO2B1の発現量に関する情報が前記所定のカットオフ値以上のとき、関節リウマチの疾患活動性が亢進していると判定する、請求項3に記載の方法。
- 前記SLC16A4の発現量が、SLC16A4遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現量である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- PTPRM遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、SHB遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、およびATP9A遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドから選択される少なくとも1つの発現量に関する情報をさらに取得し、取得した発現量に関する情報を、前記評価工程における判定にさらに用いる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記SLC16A4の発現量が、SLC16A4で表される遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- PTPRM遺伝子によりコードされるタンパク質、SHB遺伝子によりコードされるタンパク質、およびATP9A遺伝子によりコードされるタンパク質から選択される少なくとも1つの発現量に関する情報をさらに取得し、取得した発現量に関する情報を、前記評価工程における判定にさらに用いる、請求項1〜4及び7のいずれか1項に記載の方法。
- 生体試料からCD4陽性細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 被験者から得た、Th17細胞を含む生体試料において、以下:
- SLC16A4の発現量に関する情報、PTPRMの発現量に関する情報およびSHBの発現量に関する情報;
- SLC16A4の発現量に関する情報およびSLCO2B1の発現量に関する情報;
- SLC16A4の発現量に関する情報、SLCO2B1の発現量に関する情報およびATP9Aの発現量に関する情報;
- SLC16A4の発現量に関する情報、SLCO2B1の発現量に関する情報およびPTPRMの発現量に関する情報;および
- SLC16A4の発現量に関する情報、SLCO2B1の発現量に関する情報およびSHBの発現量に関する情報
から選択されるいずれか1つの組み合わせに示されたバイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、
取得した前記バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの存在を評価する工程と
を含み、
前記評価工程において、取得した前記バイオマーカーの発現量に関する情報が、前記バイオマーカーが高発現であることを示すとき、関節リウマチが存在すると判定する、
関節リウマチの存在の評価を補助する方法。 - 関節リウマチに対する治療を受けている被験者から得た、Th17細胞を含む生体試料において、以下:
- SLC16A4の発現量に関する情報、PTPRMの発現量に関する情報およびSHBの発現量に関する情報;
- SLC16A4の発現量に関する情報およびSLCO2B1の発現量に関する情報;
- SLC16A4の発現量に関する情報、SLCO2B1の発現量に関する情報およびATP9Aの発現量に関する情報;
- SLC16A4の発現量に関する情報、SLCO2B1の発現量に関する情報およびPTPRMの発現量に関する情報;または
- SLC16A4の発現量に関する情報、SLCO2B1の発現量に関する情報およびSHBの発現量に関する情報
から選択されるいずれか1つの組み合わせに示されたバイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、
取得した前記バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの治療効果をモニターする工程と
を含み、
前記評価工程において、取得した前記バイオマーカーの発現量に関する情報が、前記バイオマーカーが高発現であることを示すとき、関節リウマチの疾患活動性が亢進していると判定する、
関節リウマチのモニタリングを補助する方法。
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