WO2012102020A1 - 関節リウマチの存在の評価方法およびその方法に用いられるバイオマーカーセット - Google Patents

関節リウマチの存在の評価方法およびその方法に用いられるバイオマーカーセット Download PDF

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WO2012102020A1
WO2012102020A1 PCT/JP2012/000423 JP2012000423W WO2012102020A1 WO 2012102020 A1 WO2012102020 A1 WO 2012102020A1 JP 2012000423 W JP2012000423 W JP 2012000423W WO 2012102020 A1 WO2012102020 A1 WO 2012102020A1
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WO
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biomarker
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rheumatoid arthritis
biomarkers
slco2b1
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PCT/JP2012/000423
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均 宇賀
佳昭 宮本
池田　昌郁
寛一 倉田
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シスメックス株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the presence of rheumatoid arthritis and a biomarker set used in the method.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA causes not only joint pain but also destruction of cartilage and bone.
  • the joint structure changes and the range of motion of the joint is limited, so the quality of life (Quality of Life) of RA patients is significantly reduced.
  • the life prognosis of RA patients is about 10 years shorter than that of healthy individuals.
  • RA has been diagnosed by physical findings based on subjective symptoms such as joint pain, degree of joint swelling, and bone X-ray findings.
  • diagnosis results vary depending on the experience and skill of the doctor who is being examined.
  • More objective methods include rheumatoid factor (hereinafter referred to as “RF”) and anti-cyclic citrullinated peptide antibodies (anti-cyclic). citrullinated peptide antibody (hereinafter referred to as “anti-CCP antibody”), and other methods based on serological tests.
  • RF rheumatoid factor
  • anti-cyclic anti-cyclic citrullinated peptide antibodies
  • anti-CCP antibody citrullinated peptide antibody
  • RF is an autoantibody against IgG and is about 80% positive in RA patients. However, since RF is negative in about 20% of RA patients and may be positive even in healthy individuals, RF alone cannot distinguish between healthy individuals and RA patients with high accuracy.
  • An anti-CCP antibody is an autoantibody measured using a cyclic citrullinated peptide as an antigen, and has a higher sensitivity and specificity for RA than RF. Therefore, anti-CCP antibodies are attracting attention as an early diagnosis and prognostic factor for RA, and are used for diagnosis of RA at home and abroad.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Patent Document 1 discloses 35 genes including SLC16A4 (solute carrier family 16, member 4), which is the least expressed gene in systemic lupus erythematosus (SLE) patients, as biomarkers for detecting autoimmune diseases. It is disclosed.
  • SLC16A4 systemic lupus erythematosus
  • Patent Document 2 as a gene highly expressed in rheumatoid arthritis, SLCO2B1 (solute carrier organic anion transporter About 70 genes including family, member 2B1) have been disclosed.
  • Patent Document 3 as genes whose expression is different between arthritic diseases such as SLE, seronegative arthritis (SA), osteoarthritis (OA), and RA, A 2059 gene containing PTPRM (protein tyrosine phosphatase, receptor type, M) is disclosed.
  • SA seronegative arthritis
  • OA osteoarthritis
  • RA osteoarthritis
  • PTPRM protein tyrosine phosphatase, receptor type, M
  • An object of the present invention is to provide a method for finding a novel biomarker set capable of accurately distinguishing between RA patients and healthy subjects and evaluating the presence of rheumatoid arthritis using the novel marker set.
  • the present inventors focused on IL-17-producing helper T (Th17) cells that are thought to be responsible for autoimmune diseases including RA, and are specific for Th17 cells sorted from peripheral blood of healthy adults. Have been identified so far (international application PCT / JP2010 / 062807). This time, the present inventors extracted 9 genes highly expressed in RA patients from those genes, and found a combination of genes capable of accurately distinguishing healthy individuals from RA patients. Was completed.
  • Th17 helper T
  • the present invention provides information on the expression level of the first biomarker SLC16A4 in a biological sample obtained from a subject, SLCO2B1, PTPRM, SHB (Src homology 2 domain containing adapter protein B) and ATP9A (ATPase, class II).
  • the present invention also provides a biomarker set for evaluating the presence of rheumatoid arthritis in a living body, comprising the first biomarker and the second biomarker.
  • the presence of rheumatoid arthritis in a subject can be evaluated with high accuracy.
  • FIG. 1 is a scatter diagram showing the expression levels of a healthy group and an RA patient group with respect to 9 genes identified as genes that significantly vary between the healthy group and the RA patient group.
  • FIG. 2 is a scatter diagram showing the predicted values of the healthy subject group and the RA patient group for the biomarker set of the present invention.
  • FIG. 3 is a scatter diagram showing predicted values of the healthy subject group and the anti-CCP antibody-negative RA patient group for the biomarker set of the present invention.
  • the subject is not particularly limited, and examples include healthy persons, persons suspected of having RA, and RA patients.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample collected from a subject and containing biological materials such as cells, nucleic acids, and proteins, but is preferably a sample containing cells.
  • Specific examples of the biological sample include blood, joint fluid, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites, lymph, tissue and cells collected by surgery or biopsy. Among them, a sample containing cells in blood is preferable.
  • the first and second biomarkers may be polynucleotide markers or polypeptide markers. Therefore, when acquiring information regarding the expression levels of the first and second biomarkers as polynucleotide markers, nucleic acids are extracted from the biological sample. Extraction of nucleic acid from a biological sample can be performed by a method known in the art. For example, a biological sample and a treatment solution containing a surfactant (eg, sodium cholate, sodium dodecyl sulfate) that solubilizes cells and tissues are mixed, and physical treatment (stirring, homogenization, For example, by subjecting the nucleic acid contained in the biological sample to the liberated mixture.
  • a surfactant eg, sodium cholate, sodium dodecyl sulfate
  • the mixed solution is centrifuged to precipitate cell debris, and then the supernatant containing the nucleic acid is collected and used as a biological sample. Furthermore, the obtained supernatant may be purified by a known method. Extraction and purification of a nucleic acid from a biological sample can also be performed using a commercially available kit.
  • proteins are extracted from the biological sample.
  • Protein extraction from a biological sample can be performed by methods known in the art. For example, cells contained in a biological sample are disrupted by ultrasound, or a biological sample and a cell lysate are mixed, and the resulting mixture is subjected to physical treatment (stirring, homogenization, ultrasonic disruption, etc.). Thus, the protein contained in the biological sample can be released into the mixed solution. In this case, it is preferable that the mixed solution is centrifuged to precipitate cell debris, and then a supernatant containing the protein is collected and used as a biological sample.
  • the base sequence and amino acid sequence of the first and second biomarkers can be obtained from a database provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) such as UniGene.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the accession numbers for each biomarker are shown in Table 1 below. These accession numbers are the latest numbers as of January 19, 2011.
  • the first and second biomarkers may be polynucleotide markers or polypeptide markers. Therefore, the first biomarker is a polynucleotide having the base sequence of the gene represented by SLC16A4, a variant thereof, or a fragment thereof, or a protein encoded by the gene represented by SLC16A4, its function Equivalent variants, or fragments thereof.
  • the second biomarker is a polynucleotide having a base sequence of a gene represented by at least one selected from the group consisting of SLCO2B1, PTPRM, SHB and ATP9A, a mutant thereof, or a fragment thereof.
  • the polynucleotide may be either DNA or RNA, and may be any of the above genes themselves (DNA), mRNA, cDNA, or cRNA.
  • the second biomarker includes a polynucleotide having a nucleotide sequence of at least a gene represented by SLCO2B1, a variant thereof, or a fragment thereof, or at least a gene represented by SLCO2B1 It is preferable to include a protein encoded by, a functionally equivalent variant thereof, or a fragment thereof.
  • the mutant form of a polynucleotide means a polynucleotide into which a mutation that does not change the function of the protein encoded by the above gene is introduced.
  • Such mutations include deletion or substitution of one or more nucleotides in the base sequence of the above gene, or addition of one or more nucleotides.
  • the mutant base sequence has at least 80% or more, preferably at least 85% or more, more preferably at least 90% or more, particularly preferably at least 95% or more of the sequence identity with the original gene base sequence.
  • a functionally equivalent mutant form of a protein means a protein into which a mutation that does not change the function of the protein is introduced. Such mutations include the deletion or substitution of one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein, or the addition of one or more amino acids.
  • the functionally equivalent variant amino acid sequence of the protein is at least 80% or more, preferably at least 85% or more, more preferably at least 90% or more, particularly preferably at least 95% or more of the amino acid sequence of the original protein. Has sequence identity.
  • BLASTN BLASTN
  • BLASTP BLASTP
  • BLASTX BLASTX
  • TBLASTN TBLASTN
  • a polynucleotide fragment continuously has a part of the base sequence of the biomarker described above and specifically hybridizes with a probe for obtaining information on the expression level of the biomarker described later. It means a polynucleotide of a possible length.
  • a protein fragment refers to an antibody or aptamer (for example, a nucleic acid aptamer) that has a part of the amino acid sequence of the biomarker and obtains information on the expression level of the biomarker described later. ) Means a polypeptide whose length is specifically recognized by
  • the information on the expression level of the biomarker is not particularly limited as long as it is data indicating the expression level of each biomarker obtained from a biological sample by a method known in the art.
  • the first and second biomarkers are polynucleotide markers
  • information on the expression levels of these biomarkers is, for example, PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method, etc.
  • examples thereof include quantitative values of nucleic acids (DNA, mRNA, cDNA or cRNA) which can be obtained by methods known in the art such as nucleic acid amplification methods, hybridization methods such as Southern hybridization and Northern hybridization, and microarray methods.
  • the information on the expression level of these biomarkers is obtained by using, for example, immunoprecipitation using an antibody or nucleic acid aptamer for obtaining information on the expression level of the biomarker described later.
  • examples include protein quantitative values that can be obtained by methods known in the art, such as a method, Western blot method, ELISA method, and flow cytometry method.
  • a molecule that can specifically hybridize to the first and second biomarkers as the polynucleotide marker is used as a probe for obtaining information on the expression levels of the first and second biomarkers.
  • this probe is also referred to as “expression level acquisition probe”.
  • the expression level acquisition probe may be either a nucleic acid probe or a peptide probe that can specifically hybridize to the first and second biomarkers as polynucleotide markers.
  • a nucleic acid probe is preferable, and a DNA probe is particularly preferable.
  • “specifically hybridize” means that the probe can hybridize to the first and second biomarkers as the polynucleotide marker under stringent conditions.
  • stringent conditions mean that the above-mentioned probe hybridizes to a target polynucleotide in such a manner that the probe is detectably larger than a polynucleotide other than the target polynucleotide (for example, at least twice the background). It is a condition that allows soybeans.
  • Stringent conditions are usually sequence-dependent and will be different in different circumstances. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the probes complementary to the base sequence of the target nucleic acid molecule equilibrate and hybridize (under defined ionic strength, pH and nucleic acid composition).
  • Such conditions may be those used for hybridization between polynucleotides in a hybridization method between polynucleotides known in the art, such as PCR method, microarray method, Southern blotting method and the like.
  • the pH is 7.0 to 9.0
  • the salt concentration is about 1.5.
  • M Na ion lower more specifically about 0.01-1.0 M
  • Conditions include Na ion concentration (or other salt) and at least about 30 ° C.
  • stringent conditions in the microarray method are: 50% formamide, 1M at 37 ° C. Includes hybridization in NaCl, and 1% SDS, and washing in 0.1 ⁇ SSC at 60-65 ° C.
  • stringent conditions in the PCR method include pH 7.0-9.0, 0.01-0.1 M Tris HCl, 0.05-0.15 M K ion concentration (or other salt), and conditions of at least about 55 ° C.
  • the base sequence of the expression level obtaining probe can be appropriately determined by those skilled in the art so that it can specifically hybridize to the marker based on the common general knowledge and the base sequences of the first and second biomarkers.
  • sequences include, for example, commonly available primer design software (eg, Primer3 (available from http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi) and DNASIS Pro (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)).
  • the expression level obtaining probe can be prepared by a polynucleotide synthesis method known in the art.
  • the length of the expression level acquisition probe is usually 5 to 50 nucleotides, preferably 10 to 40 nucleotides.
  • Only one type of the above-mentioned expression level acquisition probe can be used, or a plurality of types can be used in combination.
  • a microarray for obtaining information on the expression levels of the first and second biomarkers can be produced by immobilizing one or more probes on a substrate using a method known in the art.
  • the expression level acquisition probe can be a set of two or more primers for amplifying the first and second biomarkers by a nucleic acid amplification method, for example.
  • a molecule that can specifically bind to the first and second biomarkers as polypeptide markers can be used to obtain information on the expression level of the biomarker.
  • a molecule may be any of an antibody and an aptamer that can specifically bind to the first and second biomarkers, but is preferably an antibody (hereinafter referred to as “an antibody for obtaining expression level”). Also called).
  • the above-mentioned antibody for obtaining the expression level can be prepared by, for example, a procedure known in the art as follows. Based on the base sequence of the gene that is the first and second biomarkers or the amino acid sequence of the protein, a DNA molecule that encodes a protein having the amino acid sequence of each biomarker is incorporated into an appropriate expression vector. The obtained expression vector is introduced into an appropriate host cell, and the resulting transformed cell is cultured to obtain the target protein. The obtained protein is purified and used as an immunogen, and an appropriate mammal such as a rat or a mouse is immunized using the immunogen and an adjuvant as required.
  • antibody-producing cells that produce antibodies against the target immunogen are selected by screening.
  • the obtained antibody-producing cells are fused with myeloma cells to obtain hybridomas, which are screened to obtain antibody-producing hybridomas that produce antibodies having specific binding properties to the proteins encoded by the above genes. be able to.
  • An antibody for expression level acquisition can be obtained by culturing the obtained antibody-producing hybridoma.
  • Aptamers that can be used to acquire information on the expression levels of the first and second biomarkers are known in the art as follows, for example. It can be produced by the following procedure.
  • a target protein first and second biomarkers as a polypeptide
  • SELEX method an in vitro evolution method
  • the above expression level acquisition probe, antibody and aptamer may be labeled with a labeling substance usually used in the art.
  • labeling substances include radioisotopes such as 32 P, 35 S, 3 H and 125 I, fluorescent substances such as fluorescein and Alexa Fluor®, enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, biotin and avidin Or a labeling substance commonly used in the art, such as streptavidin.
  • the information when information on the expression levels of the first and second biomarkers is obtained by a nucleic acid amplification method, the information includes, for example, optical measurement values (fluorescence intensity, Turbidity, absorbance, etc.).
  • the information on the expression levels of the first and second biomarkers further includes the number of cycles (or time) when the optical measurement value reaches a predetermined reference value in the nucleic acid amplification method, and the change in the optical measurement value.
  • the number of cycles (or time) when the amount reaches a predetermined reference value, the quantitative value of mRNA obtained from the optical measurement value (or number of cycles) and a calibration curve are also included.
  • the predetermined reference value can be appropriately set according to the type of data. For example, when the data is the number of cycles, the amount of change in fluorescence intensity when the nucleic acid amplification reaction shows logarithmic growth can be set as the predetermined reference value.
  • the information includes, for example, nucleic acid probes on the microarray, mRNA of each of the above genes, or nucleic acids derived from the mRNA (cDNA, signal intensity (fluorescence intensity, color intensity, change in current amount, etc.) derived from specific hybridization with cRNA).
  • the information on the expression levels of the first and second biomarkers further includes a quantitative value of mRNA obtained from the signal intensity and the calibration curve.
  • the information on the expression levels of the first and second biomarkers correlates with the disease state of RA obtained by mathematically combining the quantitative values of the mRNAs of the first and second biomarkers.
  • Is a numerical value indicating Examples of numerical values showing a correlation with the diseased state of RA include values obtained by multivariate analysis of the quantitative values of mRNA of the first and second biomarkers.
  • Such multivariate analysis is known in the art, and examples thereof include multiple logistic regression analysis. Multivariate analysis can be executed by a computer using commercially available software such as STAT Flex ver.6 (Artec Co., Ltd.).
  • a preferred embodiment of the present invention further includes a step of obtaining a value by multivariate analysis from the obtained information on the expression levels of the first and second biomarkers (for example, quantitative value of mRNA).
  • the presence of rheumatoid arthritis in the subject is evaluated based on the acquired value.
  • values obtained by multivariate analysis include predicted values that can be obtained by multiple logistic regression analysis.
  • the presence of RA in a subject is evaluated based on information regarding the expression levels of the first and second biomarkers obtained from a biological sample.
  • “assessing the presence of rheumatoid arthritis in a subject” means determining whether or not the subject is affected with RA, and if the subject is affected with RA, Means quantifying the extent (disease activity).
  • another embodiment of the present invention provides information regarding the expression level of the first biomarker that is SLC16A4 in a biological sample obtained from a subject undergoing treatment for RA, and the group consisting of SLCO2B1, PTPRM, SHB, and ATP9A
  • the therapeutic effect of rheumatoid arthritis in the above-mentioned subject based on the step of acquiring information on the expression level of at least one second biomarker selected from the above, and the acquired information on the expression level of the first and second biomarkers And a method for monitoring rheumatoid arthritis.
  • the method may further include a step of acquiring a value by multivariate analysis such as multiple logistic regression analysis from the acquired information on the expression levels of the first and second biomarkers (for example, quantitative value of mRNA). Good. In that case, based on the acquired value, the therapeutic effect of rheumatoid arthritis in the subject is monitored.
  • a value by multivariate analysis such as multiple logistic regression analysis from the acquired information on the expression levels of the first and second biomarkers (for example, quantitative value of mRNA). Good.
  • the therapeutic effect of rheumatoid arthritis in the subject is monitored.
  • the present inventors have found that the first biomarker SLC16A4 and the second biomarker SLCO2B1, PTPRM, SHB and ATP9A are highly expressed in RA patients. . Therefore, the presence of RA in the subject is evaluated by determining whether or not the information related to the expression levels of the first and second biomarkers indicates high expression. For example, when the information regarding the expression levels of the first and second biomarkers is a quantitative value of mRNA or protein, when the quantitative value is large, it is determined that the subject is suffering from RA or disease activity of RA It can be monitored that sex is increasing. Conversely, when the above quantitative value is small, it can be determined that the subject is not suffering from RA or that the disease activity of RA is mitigated.
  • a numerical index indicating the disease activity of the subject's RA (for example, a numerical value obtained by multivariate analysis such as logistic regression analysis and correlated with the disease state of RA) is obtained.
  • the degree of symptoms can be quantified.
  • Such an evaluation of the presence of RA by the measured value itself can be performed empirically by accumulating data. However, in the case of a subject who is determined to be negative in the anti-CCP antibody test but suspected of having RA, a higher accuracy evaluation may be required. In that case, whether or not the information on the expression levels of the first and second biomarkers indicates high expression is determined by comparing the information on the expression levels with the cutoff value according to the type of the information. It is preferable to determine from the comparison result. For example, when the information regarding the expression levels of the first and second biomarkers is a quantitative value of mRNA, the first obtained when the quantitative values of both the first and second biomarkers are equal to or higher than a predetermined cut-off value.
  • both the information regarding the expression level of the second biomarker shows high expression.
  • the quantitative values of both the first and second biomarkers are smaller than the predetermined cut-off value, none of the acquired information regarding the expression levels of the first and second biomarkers indicates high expression.
  • the “predetermined cut-off value” used in the evaluation method of the present invention can be appropriately set according to the type of data relating to the expression level. That is, the cut-off value can be set empirically as a value indicating a specific expression level that can clearly distinguish RA patients from healthy individuals. For example, when the information regarding the expression levels of the first and second biomarkers is the mRNA quantitative value, the mRNA quantitative value is obtained for each of the biological sample obtained from the RA patient and the biological sample obtained from the healthy subject, The amount of mRNA that can clearly distinguish between a patient and a healthy person can be set as a predetermined cutoff value.
  • a predicted value (p) obtained by multiple logistic regression analysis from information on the expression levels of the first and second biomarkers (for example, quantitative values of mRNA) is a predetermined cut-off value or more.
  • the subject is determined to have RA or is monitored for increased disease activity of RA.
  • the predicted value (p) is less than a predetermined cut-off value, it is determined that the subject is not suffering from RA or that the disease activity of RA is mitigated.
  • the predetermined cutoff value in this embodiment is calculated using commercially available software such as STAT Flex ver. 6 (Artec Co., Ltd.) and can be determined by the Youden index.
  • Biomarker set for evaluating the presence of rheumatoid arthritis is a polynucleotide having the base sequence of the gene represented by SLC16A4, a mutant thereof, or a A first biomarker that is a fragment and a polynucleotide having a base sequence of a gene represented by at least one selected from the group consisting of SLCO2B1, PTPRM, SHB, and ATP9A, a variant thereof, or a fragment thereof 2 biomarkers.
  • the biomarker set of the present invention may be a set of polypeptide markers.
  • the biomarker set includes a first biomarker that is a protein encoded by the gene represented by SLC16A4, a functionally equivalent variant thereof, or a fragment thereof, and SLCO2B1.
  • the biomarker set of the present invention is suitably used in the above-described evaluation method of the present invention, and can distinguish between RA patients and healthy individuals with high accuracy.
  • RNA RNeasy Plus Mini kit and RNeasy Using the micro kit (QIAGEN), the above-mentioned step 1. Total RNA was extracted from the CD4 positive cells obtained in (1). In addition, specific operation was performed according to the description of the package insert of each kit.
  • step 3 Microarray expression analysis Using Two-Cycle Target Labeling and Control Reagents (Affymetrix), the above step 2.
  • the total RNA (10-100 ng) of each cell extracted in step 1 was reverse transcribed into cDNA, and further transferred to biotinylated cRNA.
  • the amplified biotinylated cRNA (20 ⁇ g) was then fragmented. The specific operation was performed according to the description in the instructions attached to the kit.
  • Th17-specific gene that varies significantly between the healthy group and the RA patient group .
  • the fluorescence intensity indicating the mRNA expression level of each gene obtained in step 1 above is divided by the fluorescence intensity indicating the mRNA expression level of the GAPDH gene, which is a housekeeping gene. Expression level)).
  • the present inventors found so far as a marker for detection of Th17 cells, the genes specifically expressed in Th17 cells (142 genes), and the group of healthy subjects and RA patients. Compared between. It has been confirmed by the present inventors that genes specifically expressed in Th17 cells are expressed about 3 times or more compared to the expression levels in other Th cells (Th1, Th2, Treg cells, etc.).
  • the ROC curve was created, the cut-off value was calculated, and the sensitivity and specificity were calculated using STAT Flex ver. 6 (Artec Co., Ltd.).
  • the sensitivity and specificity of each regression model and the cutoff value are shown in Table 3.
  • the predicted values of each sample in the healthy subject group and the RA patient group are shown in FIG. In FIG. 2, white circles ( ⁇ ) indicate healthy subjects, and black circles ( ⁇ ) indicate RA patients.
  • the cut-off value is shown.
  • the evaluation method of the present invention using the above biomarker set can distinguish a healthy person and an RA patient with high sensitivity and high specificity.
  • Table 3 that in the evaluation method of the present invention, RA patients can be detected separately from healthy individuals with a sensitivity and specificity of 80% or more using any biomarker set.
  • Table 4 shows the disease activity (DAS28) of RA patients for samples (8 samples) whose predicted values were below the cut-off value in any of the five regression models.
  • DAS28 showed a low value or a remission level value in 7 samples out of 8 samples below the cut-off value. This shows that most RA patients with cut-off values have low disease activity of RA. Since all of these RA patients have been treated, it is considered that the disease activity of RA decreased due to the successful treatment, and the predictive value was also lowered accordingly. Therefore, it was suggested that the evaluation method of the present invention using the biomarker set described above recognizes a patient whose symptoms are alleviated by treatment for RA as being the same level as a healthy person. That is, it was suggested that the evaluation method of the present invention can be applied to the monitoring of therapeutic effect and disease activity.
  • Example 2 Discriminant analysis between healthy subjects and anti-CCP antibody-negative RA patients
  • anti-CCP anti-CCP antibody tests
  • ROC curve creation, cut-off value calculation, and sensitivity and specificity calculation are done with STAT Flex. It was performed using ver.6 (Artec Co., Ltd.). Table 5 shows the sensitivity, specificity, and cut-off value obtained in this example.
  • the predicted value in the healthy subject group and anti-CCP antibody negative RA patient group obtained in the present Example is shown in FIG. In FIG. 3, white circles ( ⁇ ) indicate healthy subjects, and black circles ( ⁇ ) indicate RA patients. Moreover, in each scatter diagram of FIG. 3, the cutoff value was shown.
  • the evaluation method of the present invention can be distinguished from healthy subjects with high sensitivity and high specificity even for RA patients that are determined to be negative by the conventional anti-CCP antibody test. From this, it can be seen that the evaluation method of the present invention can diagnose RA more accurately by using it together with the conventional diagnosis and inspection methods for RA.

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Abstract

新規バイオマーカーセットを用いる、関節リウマチの存在を評価する方法を提供することを課題とする。被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第１バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つの第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、取得した前記第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの存在を評価する工程とを含む関節リウマチの存在の評価方法により、上記の課題を解決する。

Description

関節リウマチの存在の評価方法およびその方法に用いられるバイオマーカーセット
　本発明は、関節リウマチの存在の評価方法およびその方法に用いられるバイオマーカーセットに関する。
　慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis：以下、「RA」という）は、関節炎を主な臨床症状とする全身性の炎症性自己免疫疾患である。RAでは、関節痛のみならず、軟骨および骨の破壊も引き起こされる。これに伴って関節構造が変化して、関節の可動域が制限されるので、RA患者の生活の質（Quality of Life）は著しく低下する。また、RA患者の生命予後は、健常人に比べて約10年短いとの報告もなされている。
　RAにおける関節破壊は、発症後２年以内に急速に進行することが知られている。他方、この時期は、抗リウマチ薬による治療感受性が高いので、寛解導入のために治療を最も必要とする時期（治療機会の窓：window of opportunity）とされている。したがって、RAの診療においては、早期の正確な診断と積極的治療の速やかな実行が重要である。
　従来、RAは、関節痛などの自覚症状、関節の腫脹の程度、骨X線所見などに基づく身体所見により診断されている。しかしながら、このような身体所見による方法では、診察する医師の経験と技量によって診断結果にばらつきが生じる。また、診断に長い時間を要するという課題がある。
　より客観的な方法としては、リウマトイド因子（rheumatoid factor：以下、「RF」という）および抗環状シトルリン化ペプチド抗体（anti-cyclic
citrullinated peptide antibody：以下、「抗CCP抗体」という）などの自己抗体についての血清学的検査に基づく方法が挙げられる。これらの検査所見は、米国リウマチ学会（American College of Rheumatology：ACR）および欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism：EULAR）により提唱されたACR/EULAR診断基準にも用いられている。
　RFはIgGに対する自己抗体であり、RA患者においては約80％で陽性を示す。しかし、RFはRA患者の約20％で陰性を示し、健常人でも陽性を示す場合があるので、RF単独では健常人とRA患者とを高精度に区別することはできない。
　抗CCP抗体は、環状シトルリン化ペプチドを抗原として用いて測定される自己抗体であり、RAに対する感度および特異度がRFよりも高いとされている。したがって、抗CCP抗体は、RAの早期診断および予後予測因子として注目され、国内外でRAの診断に利用されている。
　しかしながら、臨床上有用とされている抗CCP抗体を検査した場合でも、その検査方法および用いた抗原の種類によって感度にばらつきが生じることが報告されている（非特許文献１）。感度が40～60％であった事例も多くあり、抗CCP抗体の検査も十分に精度が高いとはいえない。
　そこで、自己抗体以外のバイオマーカーの発現に基づいて、RAを含む自己免疫疾患を検出する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、自己免疫疾患を検出するためのバイオマーカーとして、全身性エリテマトーデス（SLE）患者において最も低発現の遺伝子であるSLC16A4（solute carrier family 16, member 4）を含む35遺伝子が開示されている。特許文献２には、関節リウマチにおいて高発現する遺伝子として、
SLCO2B1（solute carrier organic anion transporter
family, member 2B1）を含む約70遺伝子が開示されている。特許文献３には、SLE、血清反応陰性関節炎（SA）、骨関節炎（OA）、RAなどの関節炎疾患の間で発現に差が認められた遺伝子として、
PTPRM（protein tyrosine phosphatase, receptor type, M）を含む2059遺伝子が開示されている。
特表２００６－５０３５８７号公報 ＵＳ２００７／０２９２８８１公報 ＵＳ２０１０／０２７３６７１公報
　上記のとおり、RAの診療においては、治療機会の窓（window
of opportunity）を逃さないようにRAを正確に診断することが求められる。そのため、より高精度なRAの診断に有用な新規バイオマーカーセット、および、そのようなマーカーセットを用いたRAの評価方法のさらなる開発が望まれている。
　本発明は、RA患者と健常者とを高精度に区別できる新規バイオマーカーセットを見出し、その新規マーカーセットを用いて関節リウマチの存在を評価する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、RAを含む自己免疫疾患の原因であると考えられているIL-17産生ヘルパーT（Th17）細胞に着目し、健常な成人の末梢血から分取したTh17細胞において特異的に発現する遺伝子をこれまでに同定している（国際出願PCT/JP2010/062807）。今回、本発明者らは、それらの遺伝子の中からRA患者に高発現している９遺伝子を抽出し、健常人とRA患者とを高精度に区別可能な遺伝子の組み合わせを見出して、本発明を完成した。
　よって、本発明は、被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第１バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHB（Src homology 2 domain containing adaptor protein B）およびATP9A（ATPase, class II, type 9A）からなる群より選択される少なくとも１つの第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、
　取得した前記第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、被験者における関節リウマチの存在を評価する工程と、
を含む、関節リウマチの存在の評価方法を提供する。
　また、本発明は、上記の第１バイオマーカーと第２バイオマーカーとを含む、生体における関節リウマチの存在を評価するためのバイオマーカーセットを提供する。
　本発明のバイオマーカーセットおよび関節リウマチの存在を評価する方法によれば、被験者における関節リウマチの存在を高精度に評価することができる。
図１は、健常者群とRA患者群との間で有意に変動する遺伝子として同定された９遺伝子について、健常者群およびRA患者群の発現レベルを示す散布図である。 図２は、本発明のバイオマーカーセットについて、健常者群およびRA患者群の予測値を示す散布図である。 図３は、本発明のバイオマーカーセットについて、健常者群および抗CCP抗体陰性RA患者群の予測値を示す散布図である。
［１．関節リウマチの存在の評価方法］
　本発明のRAの存在の評価方法（以下、単に「評価方法」ともいう）では、まず、被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第１バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つの第２バイオマーカーの発現量に関する情報とを取得する。
　本発明の実施形態において、被験者は特に限定されず、例えば健常者、RAの罹患が疑われる者およびRA患者などが挙げられる。
　本発明の実施形態において、生体試料は、被験者から採取された、細胞、核酸、タンパク質などの生物学的材料が含まれる試料であれば特に限定されないが、好ましくは細胞を含む試料である。生体試料として具体的には、血液、関節液、脳脊髄液、胸水、腹水、リンパ液、手術または生検により採取した組織および細胞などが挙げられる。それらの中でも、血液中の細胞を含む試料が好ましい。
　後述するように、本発明の実施形態において、第１および第２バイオマーカーはポリヌクレオチドマーカーであってもよいし、ポリペプチドマーカーであってもよい。したがって、ポリヌクレオチドマーカーとしての第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する場合は、上記の生体試料から核酸を抽出する。生体試料からの核酸の抽出は、当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、生体試料と、細胞や組織を可溶化する界面活性剤（例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれる核酸を該混合液中に遊離させることによって行うことができる。この場合、該混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させた後、核酸を含む上清を回収し、この上清を生体試料として用いることが好ましい。さらに、得られた上清を、公知の方法により精製してもよい。生体試料からの核酸の抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
　ポリペプチドマーカーとしての第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する場合は、上記の生体試料からタンパク質を抽出する。生体試料からのタンパク質の抽出は、当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、生体試料に含まれる細胞を超音波により破砕するか、または生体試料と細胞可溶化液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれるタンパク質を該混合液中に遊離させることによって行うことができる。この場合、該混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させた後、タンパク質を含む上清を回収し、この上清を生体試料として用いることが好ましい。
　上記の第１および第２バイオマーカーの塩基配列およびアミノ酸配列は、UniGeneなどの米国生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されているデータベースから知ることができる。各バイオマーカーのアクセッション番号を、以下の表１に示す。なお、これらのアクセッション番号は、２０１１年１月１９日時点での最新の番号である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の実施形態においては、第１および第２バイオマーカーはポリヌクレオチドマーカーであってもよいし、ポリペプチドマーカーであってもよい。
　したがって、第１バイオマーカーは、SLC16A4で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、もしくはそれらの断片であるか、または、SLC16A4で表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、もしくはそれらの断片である。
　また、第２バイオマーカーは、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、もしくはそれらの断片であるか、または、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、もしくはそれらの断片である。
　なお、本明細書において、ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAのいずれであってもよく、上記の遺伝子そのもの（DNA）、mRNA、cDNAまたはcRNAのいずれであってもよい。
　本発明の実施形態においては、第２バイオマーカーは、少なくともSLCO2B1で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、もしくはそれらの断片を含むか、または、少なくともSLCO2B1で表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、もしくはそれらの断片を含むことが好ましい。
　本明細書において、ポリヌクレオチドの変異型とは、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質の機能を変化させないような変異が導入されたポリヌクレオチドを意味する。このような変異は、上記の遺伝子の塩基配列における１もしくは複数のヌクレオチドの欠失または置換、または、１もしくは複数のヌクレオチドの付加を含む。変異型の塩基配列は、本来の遺伝子の塩基配列と、少なくとも80％以上、好ましくは少なくとも85％以上、より好ましくは少なくとも90％以上、特に好ましくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する。
　本明細書において、タンパク質の機能的に同等な変異型とは、上記のタンパク質の機能を変化させないような変異が導入されたタンパク質を意味する。このような変異は、上記のタンパク質のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸の欠失または置換、または、１もしくは複数のアミノ酸の付加を含む。タンパク質の機能的に同等な変異型のアミノ酸配列は、本来のタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも80％以上、好ましくは少なくとも85％以上、より好ましくは少なくとも90％以上、特に好ましくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する。
　なお、本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、BLASTN、BLASTP、BLASTXまたはTBLASTN（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.govから利用可能）を標準設定で用いて算出されるものを意味する。
　本明細書において、ポリヌクレオチドの断片とは、上記のバイオマーカーの塩基配列の一部を連続して有し、後述するバイオマーカーの発現量に関する情報を取得するためのプローブと特異的にハイブリダイズできる長さのポリヌクレオチドを意味する。
　本明細書において、タンパク質の断片とは、上記のバイオマーカーのアミノ酸配列の一部を連続して有し、後述するバイオマーカーの発現量に関する情報を取得するための抗体またはアプタマー（例えば、核酸アプタマー）により特異的に認識される長さのポリペプチドを意味する。
　本明細書において、バイオマーカーの発現量に関する情報とは、当該技術において公知の方法により、生体試料から取得される各バイオマーカーの発現量を示すデータであれば特に制限されない。
　第１および第２バイオマーカーがポリヌクレオチドマーカーの場合、これらのバイオマーカーの発現量に関する情報は、例えば、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法などの核酸増幅法、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法などの当該技術において公知の方法により取得できる、核酸（DNA、mRNA、cDNAまたはcRNA）の定量値が挙げられる。
　第１および第２バイオマーカーがポリペプチドマーカーの場合、これらのバイオマーカーの発現量に関する情報は、後述するバイオマーカーの発現量に関する情報を取得するための抗体または核酸アプタマーを用いて、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロット法、ELISA法、フローサイトメトリー法などの当該技術において公知の方法により取得できる、タンパク質の定量値が挙げられる。
　本発明の実施形態においては、ポリヌクレオチドマーカーとしての第１および第２バイオマーカーに特異的にハイブリダイズできる分子を、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得するためのプローブとして用いることができる（以下、該プローブを「発現量取得用プローブ」ともいう）。発現量取得用プローブは、ポリヌクレオチドマーカーとしての第１および第２バイオマーカーに特異的にハイブリダイズできる核酸プローブおよびペプチドプローブのいずれであってもよい。そのようなプローブとしては、核酸プローブが好ましく、特にDNAプローブが好ましい。
　本明細書において、「特異的にハイブリダイズできる」とは、上記のプローブが、ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドマーカーとしての第１および第２バイオマーカーにハイブリダイズできることを意味する。
　本明細書において、ストリンジェントな条件とは、上記のプローブが標的ポリヌクレオチドに、該標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドよりも検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える）でハイブリダイズできる条件である。
　なお、ストリンジェントな条件は、通常、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の熱的融点（thermal melting point：Tm）よりも、約５℃低くなるように選択される。このTmは、（規定されたイオン強度、pHおよび核酸組成の下で）上記の標的核酸分子の塩基配列に相補的なプローブの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。
　このような条件は、当該技術において公知のポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション法、例えばPCR法、マイクロアレイ法、サザンブロット法などにおいて、ポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーションに用いられる条件であってよい。具体的には、pH7.0～9.0であり、塩濃度が約1.5
M Naイオンより低い、より具体的には、約0.01～1.0 M
Naイオン濃度（または他の塩）であり、少なくとも約30℃である条件が挙げられる。例えば、マイクロアレイ法におけるストリンジェントな条件は、37℃で50%ホルムアミド、１M
NaCl、および１% SDS中でのハイブリダイゼーション、ならびに60～65℃での0.1×SSC中での洗浄を含む。また、PCR法におけるストリンジェントな条件は、pH 7.0～9.0、0.01～0.1 MのTris HCl、0.05～0.15 M Kイオン濃度（または他の塩）、および、少なくとも約55℃の条件が挙げられる。
　上記の発現量取得用プローブの塩基配列は、当該技術常識ならびに第１および第２バイオマーカーの塩基配列に基づいて、該マーカーに特異的にハイブリダイズできるように、当業者が適宜決定できる。そのような配列は、例えば、一般に利用可能なプライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgiから利用可能）およびDNASIS Pro（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社））を用いて決定できる。
　発現量取得用プローブは、当該技術において公知のポリヌクレオチドの合成方法により作製できる。発現量取得用プローブの長さは、通常５～50ヌクレオチド、好ましくは10～40ヌクレオチドである。
　上記の発現量取得用プローブは、１種のみを用いるか、または複数種を組み合わせて用いることができる。例えば、当該技術において公知の方法を用いて該プローブ１種以上を基板上に固定化することにより、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得するためのマイクロアレイを作製できる。
　上記の発現量取得用プローブは、例えば、核酸増幅法により第１および第２バイオマーカーを増幅するための２種以上のプライマーのセットとすることができる。
　本発明の実施形態において、ポリペプチドマーカーとしての第１および第２バイオマーカーに特異的に結合できる分子を、該バイオマーカーの発現量に関する情報を取得するために用いることができる。このような分子は、第１および第２バイオマーカーに特異的に結合できる抗体およびアプタマーなどのいずれであってもよいが、好ましくは抗体である（以下、該抗体を「発現量取得用抗体」ともいう）。
　上記の発現量取得用抗体は、例えば、次のような当該技術において公知の手順により作製できる。第１および第２バイオマーカーである遺伝子の塩基配列またはタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、各バイオマーカーのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA分子を適切な発現ベクターに組み込む。得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養して、目的のタンパク質を得る。得られたタンパク質を精製して免疫原とし、該免疫原と所望によりアジュバントとを用いて、適切な哺乳動物、例えばラット、マウスなどを免疫する。免疫された動物の脾臓細胞などから、目的の免疫原に対する抗体を産生する抗体産生細胞をスクリーニングにより選択する。得られた抗体産生細胞を、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得て、これをスクリーニングすることにより、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的結合性を有する抗体を産生する抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。得られた抗体産生ハイブリドーマを培養することにより、発現量取得用抗体を得ることができる。
　第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得するために用いることができアプタマー（以下、該アプタマーを「発現量取得用アプタマー」ともいう）は、例えば、次のような当該技術において公知の手順により作製できる。ランダムな核酸の塩基配列を有する核酸ライブラリーを公知の手法により作製し、これを試験管内進化法（SELEX法）などに付すことより標的のタンパク質（ポリペプチドとしての第１および第２バイオマーカー）に特異的に結合できるアプタマーを選択できる。
　上記の発現量取得用プローブ、抗体およびアプタマーは、当該技術において通常用いられる標識物質により標識されていてもよい。標識されたプローブ、抗体およびアプタマーを用いることにより、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を簡便に取得することができる。そのような標識物質は、32P、35S、3Hおよび125Iなどの放射性同位体、フルオレセイン、Alexa Fluor（登録商標）などの蛍光物質、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどの当該技術において通常用いられる標識物質であり得る。
　本発明の実施形態においては、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報を核酸増幅法によって取得する場合、該情報としては、例えば、増幅後の反応液の光学的測定値（蛍光強度、濁度、吸光度など）が挙げられる。第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報にはさらに、核酸増幅法において上記の光学的測定値が所定の基準値に達したときのサイクル数(または時間)、該光学的測定値の変化量が所定の基準値に達したときのサイクル数(または時間)、該光学的測定値(またはサイクル数)と検量線とから取得されるmRNAの定量値なども含まれる。
　なお、所定の基準値は、上記のデータの種類に応じて適宜設定することができる。例えば、該データがサイクル数である場合、所定の基準値として、核酸増幅反応が対数増殖を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。
　第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報をマイクロアレイ法によって取得する場合、該情報としては、例えば、マイクロアレイ上の核酸プローブと、上記の各遺伝子のmRNAまたは該mRNAに由来する核酸（cDNA、cRNAなど）との特異的ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度（蛍光強度、発色強度、電流量の変化など）が挙げられる。第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報にはさらに、該シグナル強度と検量線とから取得されるmRNAの定量値も含まれる。
　本発明の好ましい実施形態においては、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報は、第１および第２バイオマーカーのmRNAの定量値を数学的に組み合わせて得られる、RAの罹患状態と相関を示す数値である。RAの罹患状態と相関を示す数値としては、例えば、第１および第２バイオマーカーのmRNAの定量値を多変量解析することにより取得される値が挙げられる。なお、このような多変量解析は当該技術において公知であり、例えば多重ロジスティック回帰分析などが挙げられる。また、多変量解析は、STAT Flex ver.6（株式会社アーテック）などの市販のソフトウェアを用いてコンピュータに実行させることができる。
　したがって、本発明の好ましい実施形態は、取得した第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報（例えばmRNAの定量値）から多変量解析により値を取得する工程をさらに含む。この場合、取得した値に基づいて被験者における関節リウマチの存在を評価する。多変量解析により取得される値としては、例えば、多重ロジスティック回帰分析により得ることができる予測値が挙げられる。
　本発明の評価方法では、生体試料から取得した第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、被験者におけるRAの存在を評価する。
　本明細書において、「被験者における関節リウマチの存在を評価する」とは、被験者がRAに罹患しているか否かを判定すること、および、該被験者がRAに罹患している場合はその症状の程度（疾患活動性）を定量化することを意味する。
　また、被験者がRAに対する治療を受けている場合、その疾患活動性が改善されているか又は進行しているかを判定すること、すなわち、該被験者のRA治療効果のモニタリングをすることも本発明の範囲に含まれる。
　したがって、本発明の別の実施形態は、RAに対する治療を受けている被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第１バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つの第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、取得した前記第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、上記の被験者における関節リウマチの治療効果をモニターする工程とを含む、関節リウマチのモニタリング方法である。
　上記の実施形態においては、取得した第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報（例えばmRNAの定量値）から多重ロジスティック回帰分析などの多変量解析により値を取得する工程をさらに含んでいてもよい。その場合、取得した値に基づいて、上記の被験者における関節リウマチの治療効果をモニターする。
　上記のとおり、第１バイオマーカーであるSLC16A4と第２バイオマーカーであるSLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aの各遺伝子は、RA患者に高発現していることが本発明者らにより見出されている。したがって、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がいずれも高発現であることを示しているか否かを判断することにより、被験者におけるRAの存在が評価される。
　例えば、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がmRNAまたはタンパク質の定量値である場合、該定量値が大きいときに、被験者がRAに罹患していると判定するか又はRAの疾患活動性が亢進していることをモニターすることができる。反対に、上記の定量値が小さいときに、被験者がRAに罹患していないと判定するか又はRAの疾患活動性が緩和していることをモニターすることができる。さらに、上記の定量値に基づいて、被験者のRAの疾患活動性を示す数値指標（例えば、ロジスティック回帰分析などの多変量解析により取得される、RAの罹患状態と相関を示す数値）を取得して、症状の程度を定量化することもできる。
　このような測定値自体によるRAの存在の評価は、データの蓄積により経験的に行うことができる。しかし、抗CCP抗体の検査で陰性と判定されたがRAの罹患が疑われる被験者などの場合では、より高い精度の評価が求められることがある。その場合、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がいずれも高発現であることを示しているか否かは、発現量に関する情報とその情報の種類に応じたカットオフ値とを比較し、その比較結果から決定することが好ましい。
　例えば、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がmRNAの定量値である場合、第１および第２バイオマーカーの両方の定量値が所定のカットオフ値以上のときに、取得した第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がいずれも高発現を示していると決定できる。この場合、本発明の評価方法により、被験者がRAに罹患していると判定するか又はRAの疾患活動性が亢進していることをモニターすることができる。
　反対に、第１および第２バイオマーカーの両方の定量値が所定のカットオフ値よりも小さいとき、取得した第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がいずれも高発現を示していないと決定できる。この場合、本発明の評価方法により、被験者がRAに罹患していないと判定するか又はRAの疾患活動性が緩和していることをモニターすることができる。
　本発明の評価方法に用いられる「所定のカットオフ値」は、上記の発現量に関するデータの種類に応じて適宜設定することができる。すなわち、該カットオフ値は、RA患者と健常者とを明確に区別できる、特定の発現量を示す値として経験的に設定することができる。例えば、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報がmRNAの定量値である場合、RA患者から得た生体試料および健常者から得た生体試料のそれぞれについてmRNAの定量値を取得し、RA患者と健常者を明確に区別できるmRNA量を所定のカットオフ値として設定することができる。
　本発明の好ましい実施形態においては、第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報（例えばmRNAの定量値）から多重ロジスティック回帰分析により取得した予測値（p）が所定のカットオフ値以上である場合に、被験者がRAに罹患していると判定するか又はRAの疾患活動性が亢進していることをモニターする。反対に、上記の予測値（p）が所定のカットオフ値より小さい場合に、被験者がRAに罹患していないと判定するか又はRAの疾患活動性が緩和していることをモニターする。
　なお、この実施形態における所定のカットオフ値は、例えばSTAT Flex ver.6（株式会社アーテック）のような市販のソフトウェアを用いて算出され、Youden indexにより決定できる。
［２．関節リウマチの存在を評価するためのバイオマーカーセット］
　本発明の関節リウマチの存在を評価するためのバイオマーカーセット（以下、単に「バイオマーカーセット」ともいう）は、SLC16A4で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、もしくはそれらの断片である第１バイオマーカーと、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、もしくはそれらの断片である第２バイオマーカーとを含むことを特徴とする。
　また、本発明のバイオマーカーセットはポリペプチドマーカーのセットであってもよい。したがって、本発明の別の実施形態において、バイオマーカーセットは、SLC16A4で表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、もしくはそれらの断片である第１バイオマーカーと、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、もしくはそれらの断片である第２バイオマーカーとを含むことを特徴とする。
　本発明のバイオマーカーセットは、上記の本発明の評価方法に好適に用いられ、RA患者と健常者を高精度に区別することができる。
　本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　（実施例１）RAの存在を評価するためのバイオマーカーセットの同定
１．健常人および関節リウマチ患者の末梢血からのCD4陽性細胞の単離
　健常な成人（n=20）およびRA患者（n=33）から末梢血を採血管NP-HE0557（ニプロ社）に採取した。なお、RA患者群の特徴は次のとおりである：女性24検体、男性９検体、年齢30～80才（平均56.9才）、DAS（Disease Activity Score）28は1.8～5.2（平均3.2）。
　これらの抹消血に抗CD4抗体を結合させた磁気ビーズ（以下、「抗CD4抗体ビーズ」という：Miltenyi Biotec社）を添加して、CD4陽性細胞を単離した。なお、この操作は、抗CD4抗体ビーズの添付文書の記載に従って行った。得られたCD4陽性細胞を、次のトータルRNA抽出工程まで－80℃にて凍結保存した。
２．トータルRNAの抽出
　RNeasy Plus MiniキットおよびRNeasy
microキット（QIAGEN社）を用いて、上記の工程１．で得たCD4陽性細胞からトータルRNAを抽出した。なお、具体的な操作は、各キットの添付文書の記載に従って行った。
３．マイクロアレイ発現解析
　Two-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix社）を用いて、上記の工程２．で抽出した各細胞のトータルRNA（10～100 ng）をcDNAに逆転写し、さらにビオチン化cRNAへの転写反応を行った。次いで、増幅したビオチン化cRNA（20μg）を断片化した。なお、具体的な操作は、キットに添付の説明書の記載に従って行った。
　上記で得られた各細胞由来のビオチン化cRNA（15μg）を検体として、それぞれGeneChip Hunman Genome U-133
Plus 2.0 Array（Affymetrix社）に添加し、GeneChip Hybridization Oven 640（Affymetrix社）に移して、45℃、60 rpmの条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行った。
　ハイブリダイゼーション終了後、上記のマイクロアレイを、GeneChip Fluidic Station450（Affymetrix社）を用いて洗浄および蛍光標識を行い、該マイクロアレイを、GeneChip
Scanner 3000 7G（Affymetrix社）を用いてスキャンし、蛍光強度データを取得した。
４．健常者群とRA患者群との間で有意に変動するTh17特異的遺伝子の選択
　上記の工程３．で得られた各遺伝子のmRNA発現量を示す蛍光強度を、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子のmRNA発現量を示す蛍光強度で除する補正を行って、各遺伝子の発現量に関する情報（以下、「発現レベル」という）を得た。そして、これらの発現レベルのうち、本発明者らがTh17細胞検出用マーカーとしてこれまでに見出した、Th17細胞に特異的に発現する遺伝子（142遺伝子）について、健常者群とRA患者群との間で比較した。なお、Th17細胞に特異的に発現する遺伝子は、他のTh細胞（Th1、Th2、Treg細胞など）での発現量に比べて、約３倍以上発現することが本発明者らにより確認されている（国際出願PCT/JP2010/062807）。
　RA患者群の33検体から、コンピュータープログラムを用いた無作為抽出により20検体を選択し、選択された20検体において健常者群20検体よりも発現レベルが有意に増加している遺伝子を抽出した。ここで、発現レベルが有意に増加している遺伝子とは、健常者群とRA患者群についてのMann-Whitney検定により「p値<0.05」を示し、かつ「（RA患者群の発現量レベルの平均）／（健常者群の発現量レベルの平均）」の値が２以上である遺伝子である。なお、無作為抽出およびMann-Whitney検定はSTAT Flex ver.6（株式会社アーテック）を用いて行った。
　上記のRA患者群の無作為抽出および発現レベルが有意に増加している遺伝子の抽出をそれぞれ６回繰り返し、６回全ての試行において発現レベルが有意に増加している９遺伝子を健常者群とRA患者群との間で有意に変動するTh17細胞特異的遺伝子として同定した。これらの９遺伝子について、健常者群およびRA患者群での発現レベルを図１に示す。図１において、白丸（○）は健常者を、黒丸（●）はRA患者をそれぞれ示す。また、各バイオマーカーの名称の下の括弧内に記載される番号は、Hunman Genome U-133 Plus 2.0 Array（Affymetrix社）に搭載されるプローブセットのID番号である。
　図１より、上記の９遺伝子はRA患者群において高発現の傾向を示すものの、いずれも単独では健常者と区別できないRA患者の検体が多く見られる。ゆえに、上記の９遺伝子は、いずれも単独では健常者とRA患者とを高精度に区別可能なバイオマーカーとして用いることは困難であることが分かる。
５．RAの存在を評価するためのバイオマーカーセットの同定
　上記の９遺伝子から健常者とRA患者とを高精度に区別可能なバイオマーカーの組み合わせを見出すことを目的として、以下の手順でバイオマーカーセットを選択した。
　健常者群（ｎ＝２０）およびRA患者群（ｎ＝３３）をあわせた検体群（ｎ＝５３）から、非復元抽出により無作為に検体数がｎ＝１８、ｎ＝１８、ｎ＝１７となる３組の検体セットを作成した。次に、３組の検体セットのうち、２組をトレーニングセットとし、残り１組をテストセットとしたトレーニング・テストセットを作成した。これを３回繰り返し、最終的に組み合わせが異なる３組のテスト・トレーニングセットを作成した。
　上記の工程４．で得られた９遺伝子から、考えられる全ての遺伝子の組み合わせについて、多重ロジスティック回帰分析を行った。３組のトレーニング・テストセットそれぞれにおいて多重ロジスティック回帰分析を行い、健常人とRA患者とを判別できる５つの回帰モデルを抽出した。抽出された回帰モデルの予測値（p）の算出式（回帰式）と各モデルに含まれる遺伝子の組み合わせを、以下の表２に示す。式中の［SLC16A4］、［SLCO2B1］、［PTPRM］、［ATP9A］、［SHB］は、上記の工程４．で得られた各遺伝子の発現レベルの値である。なお、非復元抽出および多重ロジスティック回帰分析はSTAT Flex ver.6（株式会社アーテック）を用いて行い、回帰式の各係数は、健常者群とRA患者群をあわせた全検体（ｎ＝５３）のデータを用いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
６．各バイオマーカーセットにおける健常者とRA患者との判別能の比較
　RA患者群（ｎ＝３３）および健常者群（ｎ＝２０）の各検体の発現レベルから、上記の工程５．の５つの回帰モデルを用いて、各検体の予測値（p）を算出した。なお、予測値は上記表２に記載の式から算出した。
　次いで、算出した各検体の予測値に基づいてROC曲線（Receiver
Operatorating Characteristic curve：受信者動作特性曲線）を作成し、Youden
indexを用いて各回帰モデルにおけるカットオフ値を同定した。算出した予測値がカットオフ値以上の場合は陽性、カットオフ値未満の場合は陰性と判定し、この判定結果に基づいて感度および特異度を算出した。
　なお、ROC曲線の作成、カットオフ値の算出ならびに感度および特異度の算出はSTAT Flex ver.6（株式会社アーテック）を用いて行った。
　各回帰モデルの感度および特異度ならびにカットオフ値を、表３に示す。また、各回帰モデルについて、健常者群およびRA患者群の各検体の予測値を図２に示す。図２において、白丸（○）は健常者を、黒丸（●）はRA患者をそれぞれ示す。また、図２の各散布図において、カットオフ値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図２より、上記のバイオマーカーセットを用いる本発明の評価方法は、健常者とRA患者とを高感度および高特異度で区別できることが分かる。また、表３より、本発明の評価方法においては、いずれのバイオマーカーセットを用いても80％以上の感度および特異度で、RA患者を健常者と区別して検出することができることがわかる。
　図２の各散布図においては、予測値がカットオフ値を下回ったRA患者の検体がいくつか存在した。５つの回帰モデルのいずれかにおいて予測値がカットオフ値を下回った検体（8検体）について、それらのRA患者の疾患活動性（DAS28）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、カットオフ値を下回った8検体のうち7検体で、DAS28が低値または寛解レベルの値を示した。このことから、カットオフ値を下回ったRA患者のほとんどは、RAの疾患活動性が低いことが分かる。これらのRA患者はいずれも治療を受けていることから、治療が奏効したことによりRAの疾患活動性が低下し、それに応じて予測値も低い値を示したと考えられる。よって、上記のバイオマーカーセットを用いる本発明の評価方法は、RAに対する治療により症状が緩和している患者を健常者と同程度として認識することが示唆された。すなわち、本発明の評価方法は、治療効果や疾患活動性のモニタリングに適用できることが示唆された。
（実施例２）健常者と抗CCP抗体陰性RA患者との判別分析
　本発明の評価方法により、RAに罹患しているが抗CCP抗体の検査では陰性とされたRA患者（以下、「抗CCP抗体陰性RA患者」という）を健常者と区別できるか否かを検討した。
　健常者群（ｎ＝２０）および抗CCP抗体陰性RA患者群（ｎ＝１０）の各検体の発現レベルから、実施例１で同定した回帰モデル（２）（バイオマーカーの組み合わせ：SLC16A4、SLCO2B1）を用いて、各検体それぞれの予測値（p）を算出した。なお、予測値は実施例１の表２に記載の式を用いて算出した。
　次いで、ROC曲線を作成し、Youden indexを用いて各回帰モデルにおけるカットオフ値を同定した。算出した予測値がカットオフ値以上の場合は陽性、カットオフ値未満の場合は陰性と判定し、この判定結果に基づいて感度および特異度を算出した。なお、ROC曲線の作成、カットオフ値の算出、ならびに感度および特異度の算出はSTAT Flex
ver.6（株式会社アーテック）を用いて行った。
　本実施例で得られた感度、特異度およびカットオフ値を、表５に示す。また、本実施例で得られた健常者群および抗CCP抗体陰性RA患者群での予測値を図３に示す。図３において、白丸（○）は健常者を、黒丸（●）はRA患者をそれぞれ示す。また、図３の各散布図において、カットオフ値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図３より、本発明の評価方法は、従来の抗CCP抗体での検査では陰性と判定されるRA患者についても高感度および高特異度で健常者と区別できることが分かる。このことから、本発明の評価方法は、従来のRAの診断および検査方法とあわせて用いることにより、より正確にRAを診断できることが分かる。

Claims (12)

  1. 　被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第１バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つの第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、
    　取得した前記第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの存在を評価する工程と
    を含む、関節リウマチの存在の評価方法。
  2. 　前記第１バイオマーカーが、SLC16A4で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、またはそれらの断片である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第２バイオマーカーが、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、またはそれらの断片である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記第２バイオマーカーが、少なくともSLCO2B1で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、またはそれらの断片を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記第１バイオマーカーが、SLC16A4で表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、またはそれらの断片である、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記第２バイオマーカーが、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、またはそれらの断片である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記第２バイオマーカーが、少なくともSLCO2B1で表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、またはそれらの断片を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記生体試料が細胞を含む試料である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記細胞が血液中の細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 　SLC16A4で表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、またはそれらの断片である第１バイオマーカーと、
    　SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、その変異型、またはそれらの断片である第２バイオマーカーと
    を含む、関節リウマチの存在を評価するためのバイオマーカーセット。
  11. 　SLC16A4で表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、またはそれらの断片である第１バイオマーカーと、
    　SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つで表される遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型、またはそれらの断片である第２バイオマーカーとを含む、関節リウマチの存在を評価するためのバイオマーカーセット。
  12. 　関節リウマチに対する治療を受けている被験者から得た生体試料における、SLC16A4である第１バイオマーカーの発現量に関する情報と、SLCO2B1、PTPRM、SHBおよびATP9Aからなる群より選択される少なくとも１つの第２バイオマーカーの発現量に関する情報を取得する工程と、
    　取得した前記第１および第２バイオマーカーの発現量に関する情報に基づいて、前記被験者における関節リウマチの治療効果をモニターする工程と
    を含む、関節リウマチのモニタリング方法。
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