CN105377290A - 用于治疗多种肿瘤(例如包括nsclc在内的肺癌)的新型免疫疗法 - Google Patents

用于治疗多种肿瘤(例如包括nsclc在内的肺癌)的新型免疫疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫疗法所使用的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及肿瘤的免疫疗法，也涉及肿瘤相关性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的肽表位(单用或与其它肿瘤相关性肽联合使用)，以作为疫苗组合物中的活性药物成分激发抗肿瘤免疫应答。本发明涉及超过70个新型肽序列，及其人肿瘤细胞HLA？I类与HLA？II类分子的衍生序列，以用于在疫苗组合物中引发抗肿瘤免疫应答。

Description

用于治疗多种肿瘤(例如包括NSCLC在内的肺癌)的新型免疫疗法
本发明涉及免疫疗法所使用的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及肿瘤相关性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的肽表位(单用或与其它肿瘤相关性肽联合使用)，以作为疫苗组合物中的活性药物成分激发抗肿瘤免疫应答。本发明涉及67个新型肽序列，及其人肿瘤细胞HLAI类与HLAII类分子的衍生序列，以用于在疫苗组合物中引发抗肿瘤免疫应答。
本发明的背景
无论男女，肺癌均为癌症相关死亡的第一诱因。无论就发病率还是死亡率而言，肺癌均是全球最常见的癌症。2008年新增161万肺癌病例以及138万肺癌死亡病例，其中欧洲与北美的比率最高。
自1987年以来，每年死于肺癌的女性人数均高于死于乳腺癌的人数。1991年至2003年，男性死亡率持续显著下降，每年下降约1.9％。女性肺癌死亡率在连续增长数十年后正趋于平稳。以上肺癌死亡率的趋势反映了过去30年中吸烟率的降低。
据美国国立癌症研究所(NCI)数据，预计美国2013年将有约23万新增肺癌病例以及16万肺癌死亡病例。
为便于治疗，肺癌可临床分类为小细胞癌(13％，SCLC)或非小细胞癌(87％，NSCLC)，其预后通常不良。在所有肺癌患者中,15％可在确诊后存活5年。确诊时通常已为晚期。出现病情时30-40％的NSCLC病例为IV期，60％的SCLC病例为IV期。
根据肿瘤的类型(小细胞或非小细胞)和期别选择治疗方案，包括手术、放疗、化疗以及靶向生物疗法，例如贝伐单抗和厄洛替尼对于局限性癌灶，通常选择外科手术治疗。最近的研究表明，手术后化疗改善了早期非小细胞肺癌的生存。由于该肿瘤发现时通常已扩散，因此常使用放疗与化疗，有时与手术联合使用。单一化疗或与放疗联合使用是小细胞肺癌的首选疗法；采用此治疗方案的患者有很大一部分出现缓解，某些患者甚至达到长期缓解。
肺癌的1年生存率略有升高，从1975-1979年的37％升至2002年的42％，这主要归因于手术技术与联合疗法的进步。但所有期别的肺癌一起5年生存率仅为16％。发现时为局限性肿瘤的患者，其生存率为49％；但仅有16％的肺癌可在此早期得到确诊。
尽管如此，仍亟需安全有效的新疗法治疗肺癌，特别是不同表型的非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌和脑癌，以在改善患者的健康状况的同时不过度使用化疗药物或其它可导致严重副作用的药物。
本发明使用可刺激患者免疫系统且以非侵入性方式作为抗肿瘤药物的肽。
发明概述
首先，本发明涉及由从SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92或其变异序列组(与SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92至少80％同源，优选为90％同源(优选为至少80％或至少90％同一))中所选择的氨基酸序列所组成的肽，且上述变异序列可引发T细胞与上述肽(或其药用盐)的交叉反应，其中上述肽为非全长多肽。
此外，本发明还涉及由从SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92或其变异序列组(与SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92至少80％同源，优选为90％同源(优选为至少80％或至少90％相同))中所选择的序列所组成的本发明的肽。其中，上述肽或其变异体的SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.78至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92的总长度为8至100个氨基酸(优选为8至30个，最优选为8至14个)，而SSEQIDNo.76和77的总长度为12至100个氨基酸(优选为12至30个，最优选为12至18个)。
下表为本发明所涉肽及其相应SEQIDNO，以及此类肽的预期源蛋白。表1a、1b和1c中的所有肽均可与HLAA*02等位基因结合，表1d中的肽可与HLA-DR等位基因结合。
表1c中的肽还可用于胃癌和/或成胶质细胞瘤的诊断和/或治疗。
表1d中的II类肽还可用于胃癌和其它过量表达或过量呈递MMP12或POSTN的癌症的诊断和/或治疗。
因此，本发明涉及由SEQIDNo.76序列或其变异序列(与SEQIDNo.76至少80％同源，优选为90％同源(优选为至少80％同源或至少90％相同))所组成的本发明的一种肽。其中上述肽或其变异体的总长度为12至100个氨基酸(优选为12至30个，最优选为12至18个)。本发明涉及由SEQIDNo.76序列所组成的本发明的一种肽。
此外，本发明涉及由SEQIDNo.77序列或其变异序列(与SEQIDNo.77至少80％同源，优选为90％同源(优选为至少80％同源或至少90％相同))所组成的本发明的一种肽。其中，上述肽或其变异体的总长度为12至100个氨基酸(优选为12至30个，最优选为12至18个)。本发明涉及由SEQIDNo.77序列所组成的本发明的一种肽。
表1a：本发明的肽
表1b：本发明的其它肽
表1c：成胶质细胞瘤和/或胃癌中亦有过量表达的其它肽
表1d：本发明的MHCII类肽
表1e：在其它肿瘤中过度表达的其它本发明的优选肽
表1f：在其它肿瘤中过度表达的其它本发明的肽
本发明还涉及根据本发明所述的、可与人主要组织相容性复复合物(MHC)I类或II类分子相结合的肽。
本发明还涉及根据本发明所述的肽，此类肽由或基本由SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92氨基酸序列所组成。
本发明还涉及根据本发明所述的肽，此类肽经过修饰且/或包含非肽键。
本发明还涉及根据本发明所述的肽，此类肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关性不变链(Ii)的N末端氨基酸相融合的蛋白，或与某种抗体(或其序列)(例如树突细胞特异性抗体)相融合的蛋白。
本发明还涉及一种核酸，该核酸可编码根据本发明所述的肽。
本发明还涉及根据本发明所述的核酸，该核酸为DNA、cDNA、PNA、RNA或DNA、cDNA、PNA、RNA的复合物。
本发明还涉及一种表达载体，该载体可表达根据本发明所述的核酸。
本发明还涉及一种根据本发明所述的肽、根据本发明所述的核酸或根据本发明所述的药用表达载体。
本发明还涉及根据本发明所述的抗体及其制备方法。
本发明还涉及根据本发明所述的T细胞受体(TCR)，特别是可溶性TCR(sTCR)，及其制备方法。
本发明还涉及根据本发明所述的、由核酸组成的一种宿主细胞，或上文所述的表达载体。
本发明还涉及根据本发明所述的一种宿主细胞，须为抗原呈递细胞。
本发明还涉及根据本发明所述的一种宿主细胞，其中的抗原呈递细胞为树突细胞。
本发明还涉及根据本发明所述的一种肽的制备方法，该方法包括根据本发明所述的宿主细胞培养，以及将肽从宿主细胞或其培养基中分离。
本发明还涉及活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外制备方法，该方法包括将体外CTL与抗原负载人I类或MHCII类分子(在适当的抗原呈递细胞表面表达该分子足够时间从而以抗原特异性方式活化上述CTL)相接触，其中所述抗原为根据本发明所述的任何肽。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法，该方法将抗原载入表达于适当的抗原呈递细胞表面的I类或MHCII类分子(通过将足量的抗原与抗原呈递细胞相接触)。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法，其中所述抗原呈递细胞含有可表达上述包含SEQIDNo.1至SEQIDNo.92(优选为SEQIDNo.1至SEQIDNo.65和SEQIDNo.76至SEQIDNo.84，以及SEQIDNo.92)或其上述变异氨基酸序列的肽的表达载体。
本发明还涉及根据本发明所述的方法所制备的活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，它们可选择性地识别异常表达含有根据本发明所述氨基酸序列的多肽的细胞。
本发明还涉及在患者中杀伤异常表达含有任何根据本发明所述的氨基酸序列的多肽的靶细胞的方法，包括根据本发明所述的方法给予患者有效数量的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
本发明还涉及一种药剂的或药剂生产所使用的任何上述肽、根据本发明所述的核酸、根据本发明所述的表达载体、根据本发明所述的细胞或根据本发明所述的活化细胞毒性T淋巴细胞。
本发明还涉及根据本发明所述的用途，其中所述药剂为疫苗。
本发明还涉及根据本发明所述的用途，其中所述药剂具有抗肿瘤活性。
本发明还涉及根据本发明所述的用途，其中癌细胞为肺癌、胃癌、胃肠癌、结直肠癌、胰腺癌或肾癌细胞，以及成胶质细胞瘤细胞。
本发明还涉及基于根据本发明所述的肽的特定标记蛋白和生物标记物，可用于肺癌、胃癌、胃肠癌、结直肠癌、胰腺癌或肾癌，以及成胶质细胞瘤的诊断和/或预后。
本发明还涉及上述癌症治疗新型靶点的用途。
免疫应答的激发取决于于被宿主免疫系统识别为外源性的抗原。肿瘤相关性抗原的发现提高了用宿主免疫系统阻碍肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索各种利用免疫系统的体液和细胞免疫作用的机制。
细胞性免疫应答的特异性元素可特异性地识别和破坏肿瘤细胞。将细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与肿瘤浸润细胞群或外周血相分离后发现，该细胞对于癌症的天然免疫防御起到重要作用。CD8阳性T细胞在该应答中的作用尤为重要，原因是其可识别携带主要组织相容性复复合物(MCH)的肽分子(通常由8至10个由蛋白或细胞溶质中的缺陷核糖体产物(DRIPS)所衍生的氨基酸残基所组成)。人体中的MHC分子亦称为人白细胞抗原(HLA)。
MHC分子分为两类：MHCI类分子存在于多数带核细胞中。MHC分子包含一条α重链和一个β-2微球蛋白(MHCI类受体)或α和β重链各一条(MHCII类受体)。其三维构象形成一个结合槽，供与肽进行非共价相互作用。I类MHC所呈递的肽多源于主要内源蛋白、DRIP和较大肽的溶蛋白性裂解。MHCII类分子多见于专业性抗原呈递细胞(APC)，其所呈递的肽多源于由APC在细胞内吞中所摄取的外源性或跨膜蛋白。肽与MHCI类分子的复合物可由负载适当的TCR(T细胞受体)的CD8阳性细胞毒性T细胞所识别，而肽与MHCII类分子的复合物可由负载适当的TCR的CD4阳性辅助T细胞所识别。本领域已熟知，TCR、肽与MHC由此按1：1：1的化学计算量比存在。
CD4阳性辅助T细胞对于引发和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效应答起到重要作用。鉴别源于肿瘤相关性抗原(TAA)的CD4阳性T细胞表型对激发抗肿瘤免疫应答的药品之开发有重要意义(Kobayashietal.,2002；Qinetal.,2003；Gnjaticetal.,2003)。在肿瘤部位，辅助T细胞可提供亲CTL的细胞因子环境(Mortaraetal.,2006)并吸引效应细胞，例如CTL、自然杀伤细胞、巨噬细胞、粒细胞(Hwangetal.,2007)。
在炎症环境中，MHCII类分子的表达主要限于免疫系统细胞，特别是专业性抗原呈递细胞(APC)，例如单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。在癌症患者中，意外发现肿瘤细胞可表达MHCII类分子(Dengjeletal.,2006)。
哺乳动物模型(如小鼠)试验显示，即使不存在CTL效应细胞(例如CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞仍足以通过抑制干扰素γ(IFNγ)分泌所导致的血管生成来抑制肿瘤表现。
此外，研究显示，可识别源自肿瘤相关性抗原(由HLAII类分子呈递)的肽的CD4阳性T细胞可通过引发抗体(Ab)应答来阻止肿瘤进展。
不同于与HLAI类分子相结合的肿瘤相关性肽，迄今仅报告了少数肿瘤相关性抗原(TAA)的II类配体。
由于HLAII类分子的组成型表达通常限于免疫系统细胞，因此认为无法直接从原发肿瘤中分离II类肽。但Dengjel等人成功地从肿瘤中直接识别出若干MHCII类表型(WO2007/028574，EP1760088B1；(Dengjeletal.,2006))。
由肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原(即其表型)可以是源自各类蛋白(例如酶、受体、转录因子等)的分子，此类分子在相应的肿瘤细胞中存在表达和上调(相比于同源的未变化细胞)。
由于两种类型的应答(分别为CD8和CD4依赖型)可共同产生协同抗肿瘤作用，因此肿瘤相关性抗原(通过CD8+CTL(配体：MHCI类分子+多肽表型)或CD4阳性辅助T细胞(配体MHCII类分子+多肽表型)来识别)的鉴别和表征对于抗肿瘤疫苗的开发有重要意义。
本发明另涉及两种非常有用的新型MHCII类肽(对应于SEQIDNO76和77)。这两种肽对于胃癌、NSCLC和其它分别过量表达和/或过量呈递MMP12和POSTN的癌症之诊断和/治疗尤为有用。
本发明另涉及新型MHCII类肽的所谓长度变异体(对应于SEQIDNO76或77)。如上文所述，对应于SEQIDNO76的肽含有氨基酸序列INNYTPDMNREDVDYAIR(MMP12-肽)，对应于SEQIDNO77的肽含有氨基酸序列TNGVIHVVDKLLYPADT(POSTN-002-肽)。变异体的长度通常为N和/或C末端延伸(1至5个氨基酸，优选为1至10个氨基酸)或N和/或C末端缩短(1至5个氨基酸)，这些变异体仍可与MHC相结合并引发本文所述的细胞性免疫应答。目前已知肽与II类蛋白的结合不受限于大小，长度为11至30个氨基酸不等。MHCII类分子中的肽结合槽在两端均敞开，由此可结合相对较长的肽。虽然“核心”的9个残基长的一段对识别肽最重要，而侧翼区对肽的II类等位基因的特异性有重要作用(参见MeydanC,etal.,PredictionofpeptidesbindingtoMHCclassIandIIallelesbytemporalmotifmining.BMCBioinformatics.2013；14Suppl2:S13.Epub2013Jan21)。使用现有的诸多软件工具(如上文所述工具)，具备当前技术水平的人员可确定结合基序，并由此确定MHCII类肽是否能够出现相对于SEQIDNO76或77的延伸和/或缺失，以此产生长度变异体。
肽须与一种MHC分子相结合方可触发(引发)细胞系免疫应答。该过程取决于该MHC分子的等位基因以及该肽氨基酸序列的特定多态性。MHCI类结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，其序列中通常包含2个保守残基(“锚位点”)，可与相应MHC分子的结合槽相反应。由此每个MHC等位基因均包含一个“结合基序”，此基序可决定何种肽可与结合槽特异性结合。
在MHCI类依赖型免疫反应中，肽不仅须与特定的由肿瘤细胞表达的MHCI类分子相结合，而且须被负载特异性T细胞受体(TCR)的T细胞所识别。
由肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原(即其表型)可以是源自各类蛋白(例如酶、受体、转录因子等)的分子，此类分子在相应的肿瘤细胞中存在表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。
目前的肿瘤相关性抗原主要分为以下几组：
a)肿瘤-睪丸抗原：第一个发现可被T细胞识别的TAA即属于此类别。最初称其为肿瘤-睪丸(CT)抗原是因为该组成员在具有组织学差异的人体肿瘤中存在表达，而在正常组织中的表达仅限于睪丸精母细胞/精原细胞以及(少数情况下)胎盘。由于睪丸细胞不表达I类和II类HLA分子，此类抗原无法在正常组织中被T细胞识别，因此可认为具有免疫学肿瘤特异性。较为知名的CT抗体包括MAGE家族成员和NY-ESO-1。
b)分化抗原：此类抗原在肿瘤以及产生肿瘤的正常组织中均存在，最常见于黑素瘤和正常黑素细胞。有许多此类黑素细胞谱系相关性蛋白参与黑色素的生物合成，因此不具肿瘤特异性，但广泛用于肿瘤免疫治疗。实例包括但不限于络氨酸酶、Melan-A/MART-1(针对黑素瘤)和PSA(针对前列腺癌)。
c)过量表达的TAA：已在具有组织学差异的多种肿瘤以及许多正常组织中发现了编码广泛表达的TAA之基因，通常为低表达水平。有可能许多由正常组织加工并可能由正常组织呈递的表型低于T细胞识别阈水平，但这些表型在肿瘤细胞中的过量表达可通过打破之前建立的耐受性而触发抗肿瘤应答。该TAA类别中的知名抗原包括Her-2/neu、生存素、端区酶和WT1。
d)肿瘤特异性抗原：此类独特的TAA产生于正常基因(例如β-连环蛋白、CDK4等)的突变。此类分子变化中有一部分与瘤性转化和/进展相关。肿瘤特异性抗原通常可引发较强的免疫应答，且没有对正常组织的自免疫反应这一风险。从另一方面讲，此类TAA在多数情况下仅与发现此类TAA的特定肿瘤有关，且不同时存在于多种肿瘤。
e)异常翻译后修饰所产生的TAA：此类TAA可产生于在肿瘤中非特异性亦非过量表达的蛋白，但可通过主要活跃于肿瘤的翻译后加工过程而成为肿瘤相关性抗原。实例有:该类抗原产生于糖基化方式的改变，由此引发肿瘤中的新表型(例如MUCI)或降解过程中的蛋白质剪接等事件，可能具有肿瘤特异性，也可能不具有。
f)肿瘤病毒蛋白：此类TAA为病毒蛋白，可在肿瘤发生过程中起到关键作用，且由于其为外源性(非人源)蛋白，因此可引起T细胞应答。此类蛋白包括人乳头瘤16型病毒蛋白、E6和E7(表达于宫颈癌中)。
蛋白被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性或相关性抗原并用于治疗需满足特定的前提条件。该抗原需主要由肿瘤细胞表达，且在正常健康组织中无表达或表达量相当小，或该肽在另一优选的实施方案中需由肿瘤细胞过量呈递(相比于正常健康组织)。若相关抗原不仅存在于某一肿瘤类型，而且含量较高，则更为理想。肿瘤特异性和肿瘤相关性抗原通常源自直接参与正常细胞转化为肿瘤细胞这一过程(通过细胞周期控制、雕亡抑制等功能)的蛋白。此外，直接引发转化的蛋白之下游目标可能因上调而间接具有肿瘤相关性。此类间接肿瘤相关性抗原也可作为接种免疫的目标(Singh-Jasujaetal.,2004)。两种情况下均须有表型存在于抗原的氨基酸序列，原因是此类源自肿瘤相关性抗原的肽(“免疫原性肽”)应能引发体外或体内T细胞应答。
基本上所有可与MHC分子结合的肽均可作为T细胞表型。引发体外或体内T细胞应答的前提条件是具有相应TCR的T细胞以及不存在对这一特定表型的免疫耐受。
综上所述，TAA是肿瘤疫苗开发的起始点。TAA的鉴别与表征方法基于(从患者或健康受试者分离的)CTL的使用，或基于肿瘤与正常组织间的分化转录谱或分化肽表达谱。然而仅鉴别在肿瘤组织或人肿瘤细胞系中过量表达(或在此组织或细胞系中选择性表达)的基因不能为从此类基因转录的抗原用作免疫疗法提供准确的信息。其原因是：须存在具有相应TCR的T细胞，且对于此特定表型的免疫耐受须不存在或极小，导致此类基因仅有个别表型亚群适用于此用途。因此，在本发明的实施方案中，所选用的过量呈递或选择性呈递的肽须存在相应的功能性和/或增生性T细胞。该功能性T细胞定义为经特异性抗原刺激，可克隆性地扩张并产生效应功能的T细胞(“效应T细胞”)。
若为根据本发明所述的TCR和抗体，则基本肽的免疫原性为继发性。就根据本发明所述的TCR和抗体而言，其呈递为决定因素。
辅助T细胞对于CTL在抗肿瘤免疫中发挥效应功能有重要作用。可触发TH1型辅助T细胞应答的辅助T细胞表型可支持CD8阳性杀伤T细胞的效应功能。CD8阳性杀伤T细胞的细胞毒性功能直接作用于呈现肿瘤相关性肽/MHC复合物的肿瘤细胞。由此，肿瘤相关性辅助T细胞肽表型(单用或与其它肿瘤相关性肽联合使用)可作为疫苗组合物中的活性药物成分刺激抗肿瘤免疫应答。
下文披露了根据本发明所述的肽的蛋白在其它癌症中的应用。
ATP结合盒亚族A(ABC1)成员13(ABCA13)
在人体中，跨膜运载体的ATP结合盒(ABC)家族至少包含48个基因和7个基因亚族。预测的ABCA13蛋白由5，058个氨基酸残基组成，使其成为目前为止最大的ABC蛋白(Pradesetal.,2002)。Knight等人测定，ABCA13蛋白在小鼠和人海马体和皮质中存在表达，这两个区域均与精神分裂症和双相性精神障碍相关(Knightetal.,2009)。ABAC13的基因定位于7p12.3染色体，该区域涉及一种胰腺遗传病(Shwachman-Diamond综合征)，并包含一个参与T细胞肿瘤浸润和转移的位点，因此可作为此类病症的定位候选之一(Pradesetal.,2002)。
基质金属蛋白酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)
MMP12亦称人金属蛋白酶(HME)或巨噬细胞弹性蛋白酶(MME)，是一种可降解弹性蛋白的锌内肽酶。除此之外，其底物范围较广，亦覆盖其它基质蛋白(例如胶原蛋白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖)和非基质蛋白(例如α-1-抗胰蛋白酶)。在哮喘、肺气肿和慢性阻塞性肺病(COPD)情况下，MMP12可参与肺泡破坏与气道重塑(Cataldoetal.,2003；Wallaceetal.,2008)。MMP12参与巨噬细胞游走，并且由于其能从纤溶酶原中产生血管抑素，MMP12还参与抑制血管生成(Chakrabortietal.,2003；Chandleretal.,1996；Sang,1998)。和其它金属蛋白酶一样，MMP12参与胚胎发生、伤口愈合和经期等生理过程(Chakrabortietal.,2003；Labiedetal.,2009)，但也参与组织破坏的病理过程。
尽管数据是基于数量有限的病例，但有充分的文献资料表明癌症中常存在MMP12过量表达(Denysetal.,2004；Hagemannetal.,2001；Maetal.,2009；Vazquez-Ortizetal.,2005；Yeetal.,2008)。但是资料中对于MMP12过量表达对临床参数和预后的影响存有争议。MMP12一方面可能因参与基质溶解而参与转移，另一方面可通过产生血管抑素而抑制肿瘤生长，从而对血管生成产生抑制作用(Gorrin-Rivasetal.,2000；GorrinRivasetal.,1998；Kimetal.,2004)。
MMP12表达在肺癌中的影响存有争议。曾在炎症触发的肺重塑中报告上皮细胞中的MMP12过量表达。MMP12上调可能对肺气肿-肺癌的转化起到一定作用(Quetal.,2009)。动物试验表明，MMP12在间质或巨噬细胞中的表达可抑制肺部肿瘤生长(Acuffetal.,2006；Houghtonetal.,2006)。但也有报告称MMP12在肺部肿瘤中的过量表达与肿瘤复发、转移以及较短的无复发生存期相关(Choetal.,2004；Hofmannetal.,2005)。
肌动蛋白结合蛋白(DST)
DST(BPAG1-e)可编码一种属于桥粒斑蛋白家族的粘着斑蛋白。BPAG1-e在上皮组织中表达，将含角蛋白的中间丝锚定于半桥粒(HD)。HD是一种多蛋白粘着复合物，可促进复层上皮和复杂上皮中的上皮间质着丝(Litjensetal.,2006)。对其功能的调节对于一系列生物过程(例如伤口愈合与肿瘤浸润中的角质化细胞分化和游走)有极为重要的意义，其中的细胞从底物上脱离并获得活动表型(Litjensetal.,2006)。
恶性黑素瘤是侵袭性最强的肿瘤类型之一。BPAG1表达于人黑素瘤细胞系(A375和G361)以及正常人黑素细胞中。黑素瘤患者血清中的抗BPAG1自体抗体水平显著高于健康志愿者血清中的水平(p<0.01)。抗BPAG1自体抗体有希望成为黑素瘤诊断标记物(Shimboetal.,2010)。DST也与乳腺癌浸润相关(Schuetzetal.,2006)。BPAG1基因很可能参与鼻咽癌(NPC)的增殖、雕亡、浸润和转移(Fangetal.,2005)。
基质重塑相关蛋白5(MXRA5)
MXRA5可编码一种蛋白粘多糖，属于参与ECM重塑和细胞-细胞粘附的基因组(Rodningenetal.,2008)。尽管MXRA5在癌症中的功能尚不清楚，但已从多种组织(例如皮肤、脑、肺和卵巢)的肿瘤中发现了MXRA5的体细胞突变。对MXRA5所作的RT-PCR微阵列分析发现其在结肠癌(相比于正常结肠组织)中存在过量表达(13例结直肠癌，13例正常组织)(Zouetal.,2002)。在一项近期研究中，MXRRA5是NSCLC中第二常见的突变基因(第一为TP53)(Xiongetal.,2012)。
周期素依赖性激酶4(CDK4)/周期素依赖性激酶6(CDK6)
CDK4是Ser/Thr蛋白激酶家族成员之一。作为蛋白激酶复合物的催化亚单位，CDK4对于细胞周期G1相的进行具有重要意义。该激酶的活性限于细胞周期中的G1-S相转换，其表达主要受控于转录水平(Xiaoetal.,2007)。CDK4和CDK6酶及其调节因子(例如周期素)在胚胎发生、内环境稳定以及癌发生中起到关键作用(Grafetal.,2010)。
相比于正常组织，CDK4蛋白在肺癌组织中的表达水平显著升高(P<0.001)。CDK4表达水平较高的患者的总生存期显著短于CDK4水平较低的患者。多变量分析表明，CDK4表达水平是肺癌患者生存期的独立预后指标(P<0.001)。此外，抑制CDK4的表达还显著提高了细胞周期调节因子p21的表达水平(Wuetal.,2011a)。在表达一种内源性K-Ras肿瘤基因的肺细胞中，切除CDK4(而不是CDK2或CDK6)即刻引发了衰老反应。在表达单一CDK4等位基因的肺组织或其它表达K-Ras的组织中未发现此类反应。在可通过计算机断层扫描发现的晚期肿瘤中，以CDK4等位基因作为靶标同样引发了衰老并延缓了肿瘤进展(Puyoletal.,2010)。
异质核核糖核蛋白H1(H)(HNRNPH1)/异质核核糖核蛋白H2(H')(HNRNPH2)上述基因属于普遍表达的异质核核糖核蛋白(hnRNP)的亚族。hnRNP为RNA结合蛋白，可与异质核RNA(hnRNA)形成复合物。此类蛋白与胞核中的pre-mRNA相关，并影响pre-mRNA加工以及mRNA代谢和转运的其它方面。
作为剪接致癌开关的中心，hnRNPH活性参与神经胶质瘤的发生与进展，可反映干细胞格局的再激活并介导侵袭性肿瘤行为中的多个关键环节(包括逃脱雕亡和侵袭力)(Lefaveetal.,2011)。小干扰RNA介导的hnRNPH或A-Raf敲除诱导了MST2依赖性雕亡。相比之下，hnRNPH或A-Raf表达的上调阻碍了依托泊苷诱导的雕亡。在少数通常表达低胞质水平hnRNPH/H'的组织中观测到hnRNPH/H'的上调，例如胰腺癌、肝细胞癌和胃癌(Honoreetal.,2004)。
含三角形四肽重复序列、锚蛋白重复序列和卷曲螺旋2(tetratricopeptiderepeat，ankyrinrepeatandcoiled-coilcontaining2，TANC2)
TANC家族包含TANC1和TANC2，于2005年发现(Hanetal.,2010)。TANC家族的蛋白参与树突棘、空间学习以及胚胎发育的调控，其依据是小鼠中的TANC1缺乏降低了海马体中的树突棘密度并损伤了空间学习能力，而TANC2缺乏导致了胚胎死亡。相比之下，TANC1和TANC2在培养的神经元中的过量表达提高了树突棘以及兴奋性突触的密度。TANC1和2蛋白主要在大脑中表达，其中相当一部分蛋白位于囊泡膜中(Hanetal.,2010)。
环指蛋白213(RNF213)
RNF213可编码一种包含一个C3HC4型环指状结构域的蛋白。该域为一种专门的锌指类型，与2个锌原子结合，被认为参与介导蛋白-蛋白相互反应。
有研究组首次提供的证据表明RNF213与对烟雾病的遗传易感性相关(Liuetal.,2011b)。
另一项研究表明，RNF213基因与汉族人对烟雾病的遗传易感性相关(Wuetal.,2012)。
溶质携带物家族34(磷酸钠)，成员2(SLC34A2)
SLC34A2是一种pH敏感性、钠依赖性磷酸盐运载体。高度分化肿瘤中的SLC34A2基因上调可反映卵巢癌发生中的细胞分化过程，可作卵巢癌诊断和预后的潜在标记物之一(Shyianetal.,2011)。RT-PCR证实SLC34A2的表达在乳头状甲状腺癌中有所增加(Kimetal.,2010b)。相比于正常组织，乳腺癌组织中的SLC34A2基因表达也显著增加(Chenetal.,2010a)。
含蛋白3的SET和MYND域(SMYD3)
之前有报告称SMYD3(一种组蛋白H3赖氨酸4特异性甲基转移酶)对结直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)的增生起到关键作用。在另一项研究中也发现大部分乳腺癌组织中存在SMYD3表达的升高。与CRC和HCC的情况相似，通过对应于该基因的小干扰RNA使SMYD3沉默，引起乳腺癌细胞生长抑制，表明SMYD3表达的增多对于乳腺癌细胞增生也有关键作用(Hamamotoetal.,2006)。通过RNA干扰敲除SMYD3使c-Met的表达下调并抑制了HGF诱导的细胞迁移和浸润(Zouetal.,2009)。SMYD3在HeLa细胞增殖和迁移/浸润中起到关键作用，有可能作为人宫颈癌的有效治疗靶标(Wangetal.,2008b)。
醛固酮类还原酶家族1成员C1(AKR1C1)/醛固酮类还原酶家族1成员C2(AKR1C2)AKR1C1和AKR1C2的差别仅在于7个氨基酸残基(Leetal.,2010)。AKR1C1和AKR1C2可调节雄激素、雌激素和孕酮的活性，及其相应受体的占领和转活(Penningetal.,2000；Steckelbroecketal.,2004)。AKR1C酶类(除AKR1C4为肝特异性外)可在不同的正常和病变组织中表达，因此与多种疾病(如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、髓性白血病等)相关(Brozicetal.,2011；Byrnsetal.,2011)。在肺癌上皮细胞系(Chenetal.,2010b)和NSCLC患者(Kuangetal.,2012；Stewart,2010)中显示，对顺铂的敏感性与AKR1C水平相关。因此AKR1C过量表达可作为人NSCLC预后不良和化疗抗性的指标之一(Wangetal.,2007)。AKR1C2的过量表达也与前列腺癌的进展相关(Huangetal.,2010)。通过RNAi使AKR1C2缺失可抑制体内和体外的肿瘤发生，高度提示AKR1C2siRNA可能在阻碍肝癌发生中起到关键作用(Dong-Dong,2007)。
网钙蛋白1(RCN1)EF手钙结合域/网钙蛋白3(RCN3)EF手钙结合域
RCN1是一种位于内质网腔的钙结合蛋白。免疫组织化学检测表明，RCN在胎儿与成人的多种器官中均有分布，主要分布于内分泌和外分泌器官。RCN的过量表达可能在肿瘤发生、肿瘤浸润和药物耐受中起到一定作用(Fukudaetal.,2007)。RCN1是一种细胞表面结合蛋白，在内皮(EC)和前列腺癌(PCa)细胞系中均存在。RCN1在细胞表面的表达可通过用肿瘤坏死因子α处理骨髓内皮细胞而上调(Cooperetal.,2008)。RCN1在结直肠癌(CRC)中存在上调，位于癌细胞或癌细胞附近的间质细胞中(Watanabeetal.,2008)。RCN3是多EF手Ca2+结合蛋白的CREC(Cab45/网钙蛋白/ERC45/钙腔蛋白)家族成员之一，此类蛋白定位于分泌途径中(Tsujietal.,2006)。在少突神经胶质细胞瘤中提示RCN3可能是重要的候选基因之一，尽管对于RCN3的功能所知甚少(Druckeretal.,2009)。
白介素8(IL8)
IL8是属于CXC家族的趋化因子，是炎性反应的主要介质之一。有数种细胞类型可分泌此趋化因子。其功能为化学引诱物，也是一种较强的血管生成因子。类似IL8的CXC(ELR+)趋化因子可诱导血管生成，对于存在血管生成表型的癌症(例如NSCLC)可能有重要意义(Arenbergetal.,1997)。近期研究发现，肿瘤源性的IL8可作为引诱剂促使循环肿瘤细胞返回原始肿瘤(乳腺癌、结肠癌、黑素瘤)，从而产生侵袭性更强的肿瘤表型(Kimetal.,2009)。即便在确诊前数年，IL-8水平即已与肺癌风险相关(Pineetal.,2011)。激活KRAS或EGFR突变可下调IL-8在NSCLC中的表达；男性、吸烟、老年NSCLC患者、胸膜累及的NSCLC以及KRAS突变型腺癌中IL-8表达水平较高；在致癌性KRAS驱动型NSCLC中，IL-8对细胞生长和迁移起到一定作用(Sunagaetal.,2012)。.
G蛋白耦合嘧啶能受体P2Y6(P2RY6)
P2RY6属于G蛋白耦合受体家族。该家族包含数种受体亚型，对多种腺苷和尿嘧啶核苷酸具有不同药理选择性(某些情况下有所重合)。P2Y6亚型在胎盘中的表达水平尤高，表明P2Y6对胎盘功能起到重要作用。但P2Y6在胎盘中的细胞定位尚不清楚。P2Y6可能在滋养层发育、分化和瘤形成中起到重要作用(Somersetal.,1999)。研究提示嘧啶活化的P2Y受体在肺上皮炎性反应中的重要作用(Schaferetal.,2003)。
含蛋白1的HECT、UBA和WWE域，E3泛素蛋白连接酶(HUWE1)
HUWE1可编码一种HECTE3泛素连接酶家族成员。其中HECT域位于C末端，且含有活性位点半胱氨酸，由此形成一个居间泛素-硫酯键。
ARF-BP1(HUWE1)对p53非依赖性和p53依赖性的ARF肿瘤抑制功能均为关键介质，因此ARF-BP1有望作为肿瘤干预治疗靶标(无论p53状态如何)(Chenetal.,2005a)。ARF-BP1的失活可使p53稳定并诱导雕亡(Chenetal.,2006)。HUWE1(HectH9)在多种人肿瘤中存在过量表达，且对一肿瘤细胞亚组的增殖不可或缺(Adhikaryetal.,2005；Zhangetal.,2011a)。在乳腺癌中，HUWE1与有关预后因子显著相关(Confalonierietal.,2009)。
多功能蛋白聚糖(VCAN)
VCAN是聚集蛋白聚糖/多功能蛋白聚糖粘蛋白家族的成员之一。已知VCAN可在细胞外基质中与数种分子(包括透明质烷、结合腕蛋白、腓骨蛋白(fibulin)-1、纤维结合素、CD44和L选择蛋白、原纤维蛋白、整合蛋白和连接蛋白)相关联(Zhengetal.,2004)。VCAN在多种组织中存在表达，在组织发育的早期阶段高度表达，在组织成熟后表达减少。其表达在伤口愈合和肿瘤生长中亦有升高(Ghoshetal.,2010)。通过RNA干扰从腺癌(A549)细胞中敲除VCAN，在体内显著抑制了肿瘤生长，但在体外没有(Creightonetal.,2005)。VCAN是p53的直接靶标。在早期前列腺癌和乳腺癌的瘤前间质组织中发现有VCAN高表达，且伴随侵袭性肿瘤行为(Yoonetal.,2002)。
Drosha核糖核酸酶III(DROSHA)
Drosha是一种2类核糖核酸酶III，负责发起微RNA或细胞中自然表达的短RNA分子的加工。Drosha通过与RNA诱导的沉默复合体(RISC)相互作用来诱导互补信使RNA(mRNA)的裂解作为RNAi途径的一部分，从而调节多种其它基因。微RNA分子是长RNA的初级转录物，被称为pri-miRNA。pri-miRNA通过Drosha裂解产生茎-环结构(长约70个碱基对)，被称为pre-miRNA(Leeetal.,2003)。Drosha是被称为微处理器复合体的蛋白复合体的一部分，该复合体还包含双链RNA结合蛋白Pasha(亦称DGCR8)(Denlietal.,2004)。Pasha对于Drosha活性不可或缺，并可与正确加工所需的pri-miRNA单链碎片相结合(Hanetal.,2006)。2000年实现了人Drosha的克隆，当时发现其为一种核dsRNA核糖核酸酶，参与核糖体RNA前体的加工(Wuetal.,2000)。Drosha是第一种被发现并克隆的人核糖核酸酶III。另外两种参与miRNA的加工和活性的人酶为Dicer和Argonaute蛋白。Drosha和Pasha均位于细胞核，pri-miRNA和pre-miRNA的加工均在此发生。后一种分子在细胞质中被核糖核酸酶Dicer进一步加工为成熟miRNA(Leeetal.,2003)。Drosha和其它miRNA加工酶对于癌症预后可能有重要意义(SlackandWeidhaas,2008)。
含血小板白细胞C激酶底物同源结构域(Pleckstrinhomologydomain)，家族A(磷脂酰肌醇结合特异性)成员8(PLEKHA8)
磷脂酰肌醇-4-磷酸盐衔接因子-2(FAPP2＝PLEKHA8)的基因可编码一种包含血小板白细胞C激酶底物同源结构域的细胞质脂质转移酶，该域与膜泡成熟及膜泡从转运高尔基体至胞浆膜的转运相关(Caoetal.,2009)。在结肠癌细胞中引入以FAPP2基因为靶向核酶，在加入抗Fas抗体后诱导了肿瘤细胞雕亡。此外，经FAPP2siRNA转染的神经胶质瘤和乳腺瘤细胞的雕亡出现显著减少(Tritzetal.,2009)。随后的研究强调了FAPP2作为脂质转移蛋白在高尔基复合体中参与糖鞘脂类类代谢(D'Angeloetal.,2012)。FAPP2在糖鞘脂类(GSL)的生成中起到关键作用：使用其C末端域将新合成的GSL转运离开高尔基体顺面囊膜中面对胞质溶胶的葡萄糖神经酰胺合成酶，以便进一步的合成代谢加工(Kamlekaretal.,2013)。
乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)
ACACA是一种含有生物素的酶，可催化乙酰辅酶A羧化为丙二酸单酰辅酶A，此过程为脂肪酸合成中的限速步骤(TongandHarwood，Jr.,2006)。已在多种人体癌症中发现了ACACA上调，因此ACACA有可能作为肿瘤干预的高效靶标，且治疗代谢疾病所开发的抑制剂可作为肿瘤治疗的潜在治疗药物(Wangetal.,2010a)。有两项研究表明，RNA干扰所引发的ACACA沉默导致了生长抑制，并诱导细胞死亡，其程度与FASN基因表达沉默后所观测的程度相当(Brusselmansetal.,2005；Chajesetal.,2006)。TOFA(5-十四烷基氧-2-糠酸)是一种ACACA的变构抑制剂，对于肺癌细胞NCI-H460以及结肠癌细胞HCT-8和HCT-15具有细胞毒性，且可诱导雕亡(Wangetal.,2009a)。soraphenA是另一种ACACA的高效抑制剂，可阻碍前列腺癌细胞中的脂肪形成并促进脂肪酸氧化(Beckersetal.,2007)。以上发现表明，除丙二酸单酰辅酶A的累积外，抑制脂肪形成本身亦可引发癌细胞死亡，且ACACA有望作为抗肿瘤治疗的靶标(Brusselmansetal.,2005)。
整合蛋白α11(ITGA11)
整合蛋白在多种细胞和发育过程中起到关键作用，包括细胞生长、分化和存活，以及肿瘤发生、癌细胞浸润和转移。整合蛋白α11(ITGA11/α11)定位于间质成纤维细胞，通常在NSCLC中存在过量表达。α11mRNA在肺腺癌和鳞状细胞癌中均存在过量表达(Wangetal.,2002)。有报告称α11对于成纤维细胞促进NSCLC细胞体外生长起到重要作用，此活性一部分通过调控IGF2表达来介导(Zhuetal.,2007)。NSCLC患者的临床病理特征中，hMTH1、SPD、HABP2、ITGA11、COL11A1和CK-19的过量表达与病理阶段显著相关(p<0.05)。此外，hMTH1、SPD、ITGA11和COL11A1的过量表达与淋巴结转移和预后不良相关(Chongetal.,2006)。
XII型胶原蛋白，α1(COL12A1)
COL12A1基因可编码XII型胶原的α链，该胶原属于FACIT(断续三股螺旋的原纤维缔合胶原蛋白)胶原家族。XII型胶原是一种同型三聚体，是I型胶原的相关物质，这一关联被认为是修饰胶原I原纤维与周围机制之间的相互反应(Ohetal.,1992)。COL12A1可能参与了基底膜调节，在原纤维和其它基质组分中形成特定的分子桥(Thierryetal.,2004)。COL12A1在心脏、胎盘、肺、骨胳肌和胰腺中(Dharmavarametal.,1998)，以及多种结缔组织(包括关节软骨和骨骺软骨)中(Gregoryetal.,2001；Walchlietal.,1994；Wattetal.,1992)均有表达。相比于小随体不稳定性较低或无不稳定的稳定组，COL12A1在小随体不稳定性高的肿瘤中出现下调(Ortegaetal.,2010)。
中性粒细胞表达的弹性蛋白酶(ELANE)
中性粒细胞弹性蛋白酶(或白细胞弹性蛋白酶)亦称ELA2(中性粒细胞弹性蛋白酶2)，是一种丝氨酸蛋白酶，与糜蛋白酶属于同一家族，具有较广的底物特异性。该酶在炎症环境中由中性粒细胞分泌，可破坏细菌和宿主组织(Belaaouajetal.,2000)。人中性粒细胞弹力蛋白酶(ELANE)是慢性阻塞性肺病的主要发病因素之一，最近发现还参与非小细胞肺癌的进展。该酶可作用于多个部位：(i)在细胞内清扫诸如转接分子胰岛素受体底物1(IRS-1)等分子；(ii)在细胞表面水解CD40等受体；(iii)在细胞外间隙中生成弹力蛋白碎片(即形态弹力因子，morphoelastokine)，此类碎片可强力激发肿瘤细胞的侵袭力和血管生成(Moroyetal.,2012)。通过进入肿瘤细胞中的一个内涵体腔室，中性粒细胞弹力蛋白酶直接诱导肿瘤细胞增殖(IRS-1)，其中中性粒细胞弹力蛋白酶可降解IRS-1(Houghtonetal.,2010)。
丝氨酸蛋白酶抑制物，进化枝B(卵白蛋白)，成员3(SERPINB3)
鳞状细胞癌抗原(SCCA)亦称SERPINB3，是高分子丝氨酸蛋白酶抑制物(serpin)家族成员之一(Suminamietal.,1991)。曾报告在头颈组织和其它上皮癌中发现其水平升高(Torre,1998)。曾报告SCCA在肿瘤组织中出现相比于肿瘤前组织的过量表达(Pontissoetal.,2004)。SerpinB3/B4，特别是B4可能在上皮异常增生中起到重要作用，特别是在肺癌易感性较高的患者中(Calabreseetal.,2012)。SCCA1(SERPINB3)一方面抑制溶酶体损伤诱导的细胞死亡，另一方面独立于死亡受体雕亡途径而激活半胱天冬酶8，以使细胞对内质网应激敏感(Ullmanetal.,2011)。一些发现表明，SERPINB3在诱导打破表皮屏障中起到重要作用。SERPINB3可能是上皮屏障功能的关键决定因素(Katagirietal.,2010)。
驱动蛋白家族成员26B(KIF26B)
驱动蛋白属于动力蛋白类，该类蛋白存在于真核细胞中。驱动蛋白随着微管丝移动，其能量来源为ATP水解(因此驱动蛋白也是ATP酶)。Kif26b是一种驱动蛋白家族基因，是Sall1的下游靶标(Nishinakamuraetal.,2011)。Kif26b对于肾发育不可或缺，原因是其可调控与输尿管芽相接触的间质细胞的粘附。通过与非肌肉肌球蛋白相互反应，KiF26b的体外过量表达引发细胞粘附的增多(Terabayashietal.,2012；Uchiyamaetal.,2010)。
进行性关节强直同源物(小鼠)(ANKH)
ANKH(进行性关节强直的人同源物)调节无机焦磷酸盐的经细胞膜转运(Wangetal.,2008a)。有资料表明，ANKH的表达和功能可在体外和体内被低氧环境所抑制，该作用受到HIF-1的调节(Zakaetal.,2009)。人ANKH基因在特定组织中表达，其中在脑、心脏和骨胳肌中的mRNA表达水平最高(Guoetal.,2001)。ANKH基因的突变可引发常染色体显性的颅骨骺发育异常(Kornaketal.,2010)。相比于不存在扩增的细胞系，ANKH在存在扩增的宫颈癌细胞系中显著上调(Klothetal.,2007)。染色体臂5p区域中的基因组扩增在SCLC中较为常见，提示该臂中包含多种肿瘤基因。Coe等人报告了传统筛选方法无法发现的微缺失，以及作为新型推定肿瘤基因的TRIO和ANKH(Coeetal.,2005)。
核RNA输出因子1(NXF1)
在人体细胞中，mRNA输出因子NXF1位于核质和核孔复合体中(Zhangetal.,2011b)。mRNA从胞核中的转录位点至细胞质中的翻译位点的转运对于真核基因的表达不可或缺(KellyandCorbett,2009)。通过同时与mRNA、mRNA衔接蛋白以及核孔复合体中的苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重复序列相结合，NXF1(亦称TAP)伴随mRNA转录物离开胞核(KellyandCorbett,2009)。NXF1在核转运因子中作用独特，因其为多域蛋白，与核转运蛋白在结构或作用机制上无相似之处，后者通过NPC来转运蛋白货物、tRNA和微RNA。NXF1支持的mRNA输出这一过程不依赖于GTPaseRan(Gruteretal.,1998)。mRNP的核输出通过NXF1等转运因子介导，此类因子可与mRNP结合，并通过核孔中央通道(NPC)(通过与FG-核孔蛋白的瞬时反应)介导其移位(Wickramasingheetal.,2010)。mRNA的转运既可通过涉及NXF1/TAP的大量输出途径，也可通过涉及染色体区域维持蛋白1(CRM1)的专门途径(SiddiquiandBorden,2012)。
G蛋白信号传导调节因子4(RGS4)
RGS4作为GTP酶加速蛋白对μ和δ阿片类受体(分别为MOR和DOR)信号传导的调控。阿片类激动剂诱导的RGS4还原通过泛素-蛋白酶体途径发生，可能对吗啡依赖状态下的细胞稳态维持起到作用(WangandTraynor,2011)。RGS4对于调控β细胞功能起到重要作用(Ruiz，Ietal.,2010)。Xie等人的研究表明，RGS4可作为乳腺癌迁移和浸润(转移阶梯反应的重要步骤)的新型抑制剂(Xieetal.,2009)。RGS4在甲状腺癌中存在过量表达、在甲状腺癌细胞中有效下调其表达水平显著降低了甲状腺癌细胞的活力，提示RGS4对甲状腺癌发生起到重要作用(Nikolovaetal.,2008)。RGS4在人胰腺肿瘤细胞系中存在分化表达，且被发现可能作为胰腺癌中局部肿瘤浸润和肝转移的标记基因(Niedergethmannetal.,2007)。通过选择性地抑制G蛋白介导的p38MAPK活化，RGS4过量表达可延缓和改变非上皮细胞成管过程，并由此减少上皮增殖、迁移以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达(AlbigandSchiemann,2005)。
谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶2(GFPT2)
GFPT2参与神经突生长、早期神经元细胞发育、神经肽信号传导/合成以及神经元受体(Tondreauetal.,2008)。GFPT2的遗传变异体与2型糖尿病和糖尿病肾病相关(Zhangetal.,2004)。此外，SNP与GFPT2的关联表明，参与氧化途径调控的基因可能是糖尿病慢性肾功能不全的主要诱因(Prasadetal.,2010)。GFPT2基因的DNA甲基化在原发性急性成淋巴细胞白血病(ALL)样本中得以确证(Kuangetal.,2008)。GFPT2对谷氨酰胺代谢起到一定作用，且在间质细胞系中表达更高。谷氨酰胺代谢可能对肿瘤进展起到重要作用。对细胞代谢途径的抑制剂有可能用作表观遗传疗法(Simpsonetal.,2012)。
脑内皮细胞粘附因子(CERCAM)
CERCAM位于上皮细胞表面(Starzyketal.,2000)，其序列位于染色体9q34.11(一个9q上的候选区域)，与家族性特发性脊柱侧凸相关(Milleretal.,2012)。CERCAM1基因在神经系统以及数种分泌组织(例如唾液腺、胰腺、肝脏和胎盘)中存在广泛转录(Scheggetal.,2009)。CERCAM与ColGalT酶GLT25D1和GLT25D2在结构上近似。
尽管其功能尚不清楚，但其功能似乎与其相关的GLT25D1蛋白有所差异，且与GLT25D1和GLT25D2蛋白不同，该蛋白不起到糖基转移酶的作用(Perrin-Tricaudetal.,2011)。
UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(GalNAc-T2)(GALNT2)
GALNT2可催化高尔基体中肽粘蛋白型O糖基化的第一步。此类酶可将N-乙酰半乳糖氨基转移酶(GalNAc)从UDP-GalNAc转移至目标蛋白的丝氨酸或苏氨酸羟基(Pengetal.,2010)。GLNT2在几乎所有人腺癌细胞系(包括所检查的胰腺、结肠、胃和乳腺)中均有连续的低水平表达(Sutherlinetal.,1997)。研究表明，O-葡聚糖和GALNT以及在多种生理功能和人体疾病发生中起到关键作用。上皮卵巢癌(Terryetal.,2010)和冠状动脉疾病(Willeretal.,2008)的风险与GALNT2的单核苷酸多态性相关。由糖基转移酶活性改变所引起的细胞表面糖蛋白的异常糖基化通常与癌症的浸润和转移相关。GALNT2参与了胃癌(Huaetal.,2012)、肝细胞癌(HCC)(Wuetal.,2011b)以及人恶性神经胶质瘤(Liuetal.,2011a)的转移和浸润。
异质核核糖核蛋白M(HNRNPM)
HNRNPM基因属于普遍表达的异质核核糖核蛋白(hnRNP)的亚族。HNRNPM是人hnRNP复合体的多量组分，该复合体可通过剪切其自身pre-mRNA(Haseetal.,2006)或通过调节成纤维细胞生长因子受体2的可变剪切(HovhannisyanandCarstens,2007)来影响pre-mRNA剪切。对体外纯化剪接体作蛋白质组学分析，在前剪切体H复合体以及整个剪接体组装过程中均发现存在HNRNPM(Rappsilberetal.,2002；Wahletal.,2009)。HNRNPM通过与CDC5L/PLRG1剪接体的子复合体相互反应而参与剪接体机制(Lleresetal.,2010)。在人癌症细胞中，某些结果表明IMP-3和HNRNPM的细胞质滞留导致增殖的显著减少。核IMP-3-HNRNPM复合体对于CCND1、D3和G1的高效合成以及人癌症细胞的增殖起到重要作用(Riveraetal.,2013)。
碱性核蛋白1(BNC1)
碱性核蛋白是一种锌指蛋白，其组织分布极为有限(Tseng,1998)。目前为止碱性核蛋白主要在复层鳞状上皮(皮肤、口腔上皮、食道、阴道和角膜)基底角质化细胞以及睪丸和卵巢配子生成细胞中发现(TsengandGreen,1994；WeinerandGreen,1998)。目前已有较多证据表明碱性核蛋白是rRNA基因的一种细胞类型特异性转录因子。碱性核蛋白的锌指与rDNA启动子中的三个保守位点相互反应(IuchiandGreen,1999；Tsengetal.,1999)。通过CpG甲基化进行表观遗传调控对于肿瘤发生以及癌症治疗的疗效起到重要作用。BNC1在辐射耐受性H1299人NSCLC中存在低甲基化。在H1299细胞中抑制BNC1mRNA表达亦降低了此类细胞对离子化辐射的耐受性(Kimetal.,2010a)。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)样本中亦发现BNC1的异常DNA甲基化(Tongetal.,2010)。在肾细胞癌(RCC)中，BNC1甲基化与较差的预后相关(无论肿瘤大小、期别或等级)(Morrisetal.,2010)。
FK506结合蛋白10，65kDa(FKBP10)
FK506结合蛋白10(FKBP10)属于FKBP类肽酰-脯氨酰顺/反异构酶家族，位于内质网中，是一种分子伴侣蛋白(Ishikawaetal.,2008；Pattersonetal.,2000)。FKBP10在肺部发育中存在高表达，可在肺损伤后与细胞外基质蛋白协调而再活化(Pattersonetal.,2005)。
鬈毛家族受体1(FZD1)，鬈毛家族受体2(FZD2)，鬈毛家族受体7(FZD7)
FZD2、FZD1和FZD7均属于“鬈毛”基因家族。该基因家族的成员可编码7-跨膜域蛋白作为Wnt信号蛋白的受体。
FZD2基因的表达受到发育性调控，在胚胎肾和肺以及成人结肠和卵巢中表达水平较高(Sagaraetal.,1998；Zhaoetal.,1995)。
FZD1蛋白包含一个信号蛋白、一个N末端细胞外区域的一个富含半胖氨酸域、7个跨膜域以及一个C末端PDZ域结合基序。FZD1转录物在多种组织(例如肺、心脏、肾、胰腺、前列腺和卵巢)中均有表达(Sagaraetal.,1998)。在乳腺癌中发现存在鬈毛1和2受体表达(Milovanovicetal.,2004)。
FZD7蛋白含有一个N末端信号序列、10个半胖氨酸残基(Fz家族成员富含半胖氨酸细胞外域的典型残基)、7个推定的跨膜域以及一个细胞内C末端尾(带有一个PDZ域结合基序)。FZD7基因的表达可在低分化的人食道癌中下调APC功能并加强β连环蛋白介导的信号(Sagaraetal.,1998；Tanakaetal.,1998)。
心肌快缩肌Ca++转运ATP酶1(ATP2A1)，心肌快缩肌Ca++转运ATP酶2(ATP2A2)
两种基因(ATP2A1和ATP2A)2均可编码SERCACa(2+)-ATP酶。肌质网(SR)1/ER钙APT酶(SERCAs)是一种钙离子泵，可将ATP水解与钙离子经SR/ER膜的转运相结合(MacLennanetal.,1997)。SERCAs由三种同源基因编码：SERCA1(ATP2A1)、SERCA2(ATP2A2)和SERCA3(Wuetal.,1995)。已有一些证据表明，SERCA可能对雕亡、分化和细胞增殖过程有直接影响(Chamietal.,2000；Maetal.,1999；Sakuntabhaietal.,1999)。
ATP2A1(可编码SERCA1)的突变导致了某些常染色体隐性的Brody病，其特点为运动过程中的肌肉松弛功能损伤(Odermattetal.,1996)。
ATP2A2是一种与Darier's病相关的ATP酶。该病为罕见的常染色体显性遗传皮肤病，其特点为异常角质化和皮肤棘层松解(Huoetal.,2010)。ATP2A2的胚系变异体可使人易患肺癌和结肠癌，ATP2A2基因损伤可能参与肿瘤发生过程(Korosecetal.,2006)。在小细胞肺癌(H1339)和肺腺癌(HCC)细胞系中，ERCa2+的含量相比于正常人支气管上皮有所下降。Ca2+含量的降低与SERCA2将钙离子泵入ER的减少呈现相关性(Bergneretal.,2009)。ATP2A2有望成为结直肠癌CRC患者的潜在预后标记物。ATP2A2曾在循环肿瘤细胞(CTC)中发现，且术后复发与其基因过量表达显著相关(Huangetal.,2012)。
层粘连蛋白γ2(LAMC2)
层粘连蛋白是一个细胞外基质糖蛋白家族，是基底膜的主要非胶原性组分，广泛参与多种生理过程，包括细胞粘附、分化、迁移、信号传导、神经突生长和转移。LAMC2基因负责编码层粘连蛋白-5γ2链。该链是层粘连蛋白-5的一部分，后者是基底膜区的主要组分之一。胃癌中常存在启动子去甲基化所介导的LAMC2上调(Kwonetal.,2011)。曾发现LAMC2在向血管性黑素瘤区(相比于无血管黑素瘤区)存在过量表达(Lugassyetal.,2009)。LAMC2是膀胱癌转移的标记物之一，其表达水平与肿瘤等级相关(Smithetal.,2009b)。32个非SCLC细胞系中有21个(66％)存在LAMB3和LAMC2基因共表达，而13个SCLC细胞系中仅有1个(8％)。所有4例非SCLC细胞中均发现存在LAMB3和LAMC2基因共表达，但相应的非癌性肺细胞系中不存在(Mandaetal.,2000)。
热休克70kDa蛋白2(HSPA2)，热休克70kDa蛋白8(HSPA8)
已发现HSPA2有望在一个人体癌症亚组(例如乳腺癌(Mestirietal.,2001)、宫颈癌(Gargetal.,2010a)、膀胱泌尿道上皮细胞癌(Gargetal.,2010b)、鼻咽癌(Jalboutetal.,2003)和恶性肿瘤(Chouchaneetal.,1997))中作为表达水平异常的促癌蛋白。数种人体癌症细胞系中也观察到一定水平的HSPA2基因活性(Scieglinskaetal.,2008)，而癌症细胞中HSPA2基因的沉默导致了生长停滞和致癌潜能的降低(Rohdeetal.,2005；Xiaetal.,2008)。此外，HSPA2基因的多态性与肺癌发生风险的升高相关(Wangetal.,2010b)。在人乳腺癌、宫颈癌和膀胱泌尿道上皮癌中，HSPA2的过量表达与细胞增殖的增多、低分化和淋巴结转移相关(Gargetal.,2010a；Gargetal.,2010b；Mestirietal.,2001)。HSPA8基因编码热休克蛋白70家族(Hsc70)，该家族同时包含热诱导的和固有性表达的成员(Beckmannetal.,1990)。Hsc70可作为分子伴侣蛋白辅助蛋白合成、折迭、组装以及在细胞腔隙中的运输和降解(BukauandHorwich,1998；HartlandHayer-Hartl,2002)。在非恶性乳腺细胞和乳腺癌细胞中均存在Hsc70表达(Kaoetal.,2003；Vargas-Roigetal.,1998)，而Hsp/hsc70在化疗抗性癌细胞中的过量表达(Cioccaetal.,1992；Lazarisetal.,1997)促成了对此类蛋白潜在临床标记物的研究(CioccaandCalderwood,2005)。此分泌型hsc70伴侣蛋白可能在细胞增殖中起到一定作用，使得过量表达组织蛋白酶D的癌细胞之肿瘤生长增多(Nirdeetal.,2010)。此外，Ruisin等人报告称此基因的多态性与肺癌风险相关(Rusinetal.,2004)。
空泡分选蛋白13同源物B(酵母)(VPS13B)
VPS13B是一种定位于高尔基复合体的外周膜蛋白，并在高尔基复合体中与高尔基体顺面基质蛋白GM130重合。与其亚细胞定位一致的是，RNAi所致的VPS13B缺失导致高尔基带断裂为小堆栈(ministacks)(Seifertetal.,2011)。Kolehmainen等人(2003)在染色体8q22上的Cohen综合征关键区域发现了COH1基因(亦称VPS13B)(Kolehmainenetal.,2003)。VPS13B基因的功能缺失突变导致染色体隐性的Cohen综合征(Seifertetal.,2011)。曾报告在具有小随体不稳定性的胃癌和结直肠癌中发现VPS13B和其它基因的突变(Anetal.,2012)。
CSE1染色体分离样1(酵母)(CSE1L)
研究表明细胞雕亡易感性(CSE1L)基因可调控多种细胞基质，包括有丝分裂纺锤体检查点以及增殖和雕亡。CSE1L同时存在于细胞质与细胞核中。核CSE1L调控p53蛋白(一种主要的肿瘤抑制蛋白)的转录活性(Raoetal.,2011；Tanakaetal.,2007)。细胞质CSE1L与微管相关，该关联显示可激发侵袭伪足的延伸并促进肿瘤细胞的迁徙(Taietal.,2010)。CSE1L在多数癌症中均高度表达，例如良恶性皮肤黑素细胞变性(Bonietal.,1999)、子宫内膜癌(Peiroetal.,2001)、卵巢癌(Brustmann,2004)、乳腺癌(Behrensetal.,2001)和尿路膀胱泌尿道上皮癌(Changetal.,2012)，且研究表明其表达与癌症进展相关。CSE1L沉默有望成为结肠癌的疗法之一(Zhuetal.,2013)。
二氢嘧啶酶样4(DPYSL4)
二氢嘧啶酶相关性蛋白4(DPYSL4)是海马神经元发育的已知调控因子之一。DPYSL4可在牙胚形态发生过程中参与牙上皮细胞的生长调控、极化和分化(Yasukawaetal.,2013)。有研究表明，DPYSL4通过抑制微管聚合来延缓神经突生长，并揭示了其在神经元死亡前的核凝结中与波形蛋白的新型关联(Aylsworthetal.,2009)。p53肿瘤抑制剂基因(在多种肿瘤中常存在突变)对于维持基因组完整性具有重要作用。DPYSL4mRNA和蛋白的表达均由富含p53的细胞中的抗癌抗原特异性地诱导。DPYSL4是一种雕亡诱导因子，在DNA损伤情况下由p53所调控(Kimuraetal.,2011)。
Sec61γ亚单位(SEC61G)
SEC61γ是一条异源三聚体蛋白通道，由SEC61α、β和γ亚单位所组成的，是SEC61转位子成员之一(GreenfieldandHigh,1999)。SEC61复合物可形成一个跨膜孔，以便初生多肽转位至ER腔中，以及跨膜蛋白进入ER双分子层中(Osborneetal.,2005)。SEC61γ为肿瘤细胞存活以及对内质网应激的细胞反应所必需(Luetal.,2009)。将SEC61γ表达敲除引发了雕亡和EGFR/AKT存活信号传导的阻断(Luetal.,2009)，以及肿瘤细胞生长的抑制(Neidertetal.,2012)。
ORM1样蛋白1(啤酒酵母)(ORMDL1)
该人体基因(ORMDL1、ORMDL2和ORMDL3)在成人和胚胎组织中广泛表达，可编码锚定于内质网中的跨膜蛋白(此类基因很可能参与ER中的蛋白折迭)。通过基因组序列分析，Hjelmqvist等人(2002)将ORMDL1基因定位于染色体2q32.2(Hjelmqvistetal.,2002)。ORMDL蛋白是哺乳动物细胞中神经酰胺生物合成的主要调节因子(SiowandWattenberg,2012)。存在早老素1(PS1)突变时出现了ORMDL1特异性下调(Arakietal.,2008)。
山核桃素样蛋白3(果蝇属)(PCNXL3)
山核桃素样蛋白3(PCNXL3)是一种多通道膜蛋白，属于山核桃素家族。
PCNXL3定位于染色体区域11q12.1-q13。在染色体11q13区域中的D11S4933和D11S546标记间存在3个新型人肿瘤相关移位断裂点。因此PCNXL3可能为11q13相关疾病基因(vanetal.,2000)。
小核核糖核蛋白200kDa(U5)(SNRNP200)
Pre-mRNA的剪接由剪接体催化(snRNP)。剪接体是一种专门的RNA与蛋白亚单位之复合物，可将内含子从已转录的pre-mRNA片段中移除。剪接体包含小核RNA蛋白(snRNP)U1、U2、U4、U5和U6，以及约80个保守蛋白(Maederetal.,2009)。在心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾和胰腺中发现存在SNRNP200表达(Zhaoetal.,2009)。最近发现SNRNP200突变与常染色体色素性视网膜炎(adRP)相关(Benaglioetal.,2011；Liuetal.,2012)。
SAM结构域、SH3结构域和核定位信号1(SAMSN1)
SAMSN1是一个推定的衔接因子和支架蛋白(含有SH3和SAM(护颖α基序)域)的新型基因家族成员之一。SAMSN1在造血组织、肌肉、心脏、脑、肺、胰腺、内皮细胞和骨髓瘤中存在表达。内源性SAMSN1在经增殖和增殖诱导刺激的原代B细胞中呈现表达上调，而在转导试验中，SAMSN1对B细胞分化为原生质细胞起到刺激作用(Brandtetal.,2010)。从急性髓性白血病和多发性骨髓瘤患者分离的细胞系和原代细胞可表达SAMSN1(Claudioetal.,2001)。SAMSN1在大细胞肺癌细胞系Calu-6中存在下调(Yamadaetal.,2008)。SAMSN1在溃疡性结肠炎相关性癌中存在分化表达(Watanabeetal.,2011)。
信号转导及转录活化子2，113kDa(STAT2)
STAT2是结直肠癌和皮肤癌发生的新型诱因之一，其作用为增加促炎介质的基因表达和分泌，而促炎介质可激活致癌性STAT3信号途径(Gameroetal.,2010)。STAT2是I型IFN诱导的雕亡激活的关键介质。更重要的是，STAT2表达或核定位的缺陷可降低I型IFN免疫治疗的疗效(Romero-Weaveretal.,2010)。研究发现STAT2在低级星形细胞瘤的表达低于高级星形细胞瘤。结果表明，STAT和PPARγ信号传导与神经胶质瘤之间存在明确关系，进一步证实STAT在此类肿瘤生长和分化中所预期的重要作用(Ehrmannetal.,2008)。
CCR4-NOT转录复合体亚单位1(CNOT1)
人CCR4-NOT脱腺苷酶复合体包含至少9个酶和非酶亚单位。CNOT1对抑制CCR4-NOT复合体的酶活性起到重要作用，因此对于mRN脱腺苷化和mRNA诱饵的控制至关重要。CNOT1缺失可结构性和功能性地破坏CCR4-NOT复合物并引发mRNA的稳定，使得翻译增多，最终引发ER应激介导的雕亡。Ito等人推断，CNOT1通过保证CCR4-NOT脱腺苷酶的活性来促进细胞活力(Itoetal.,2011)。在乳腺癌细胞中通过siRNA介导内源性CNOT1或其它Ccr4-Not亚单位的缺失，引发了ERα目的基因的脱调节(增加了ERα目的基因TTF1和c-Myc的诱导)。以上发现证实了人Ccr4-Not复合物作为核受体信号传导的转录抑制物的作用，这关乎对癌症中的分子途径的理解(Winkleretal.,2006)。
丝氨酸羟甲基转移酶2(线粒体)(SHMT2)
SHMT2基因可编码磷酸吡哆醛依赖性酶的线粒体形式，可催化从丝氨酸和四氢叶酸酯至甘氨酸和5，01-亚甲基四氢叶酸酯的可逆反应。其编码产物主要对甘氨酸合成起到作用。在肺癌等多基因疾病中，基因-基因相互反应对于确定疾病的表型变异性具有重要作用。MTHFR677、MTHFR1298和SHMT多态间的相互反应可能对肺癌患者的遗传不稳定性有显著影响。研究显示，在细胞遗传学改变方面，暴露于烟草特异性致癌物4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮[NNK]的肺癌患者，若存在MTHFR677、MTHFR1298和SHMT等位变异体，则其淋巴细胞可相当大幅度地增多细胞遗传学损伤(Piskac-Collieretal.,2011)。药物基因组研究调查了SHMT基因多态性对结直肠癌患者5-Fu和FOLFIRI治疗方案疗效的影响，表明存在显著影响，并引起总生存期的改变(Timaretal.,2006)。
JunB原癌基因(JUNB)
JunB是二聚转录因子AP-1(激活蛋白-1)家族成员之一。转录因子AP-1参与细胞增殖、转化和死亡(ShaulianandKarin,2002)。JunB可能通过NF-êB途径来调节，而HGF诱导的JunB上调可能通过MMP-9表达对细胞增殖和细胞浸润起到重要作用(LeeandKim,2012)。JunB表现出对淋巴瘤(特别是霍奇金淋巴瘤)有致癌作用(Shaulian,2010)。JunB是p16的必需上游调控因子，参与维持细胞衰老以阻碍TAC的恶性转化。因此JunB在控制前列腺癌发生中有明显作用(Konishietal.,2008)。JunB在VHL缺陷型ccRcc中提高肿瘤侵袭力并增强血管生成(Kannoetal.,2012)。
转化型含酸性卷曲蛋白3(TACC3)
TACC3存在于包含ch-TOG(结肠与肝肿瘤过量表达基因)和笼型蛋白的复合体中，可与着丝点纤维中的微管相交联。TACC3在某些增生性组织中存在表达，例如睪丸、肺、脾、骨髓、甲状腺和外周血白细胞。在某些人肿瘤类型中存在TACC3表达的改变。在细胞中，TACC3也定位于中心体和纺锤体微管，但不定位于星状微管(HoodandRoyle,2011)。TACC3的表达与p53的表达相关，高度表达TACC3和p53的肿瘤患者的预后相比于二者免疫染色表达水平低的患者显著较差(P＝0.006)。研究表明TACC3的增多可能预示NSCLC的增殖优势，且有利于肿瘤进展，TACC3表达是NSCLC临床转归的有力预后指标(Jungetal.,2006)。TACC3可能是Notch信号传导途径的负向调节因子(Bargoetal.,2010)。
RAD54同源物B(啤酒酵母)(RAD54B)
DNA修复与重组蛋白RAD54B是在人体中由RAD54B基因编码的一种蛋白。RAD54与双链DNA结合，在DNA的存在下可表现ATP酶活性。人RAD54B蛋白是RAD54蛋白的旁系同源物，后者在同源染色体重组中起到重要作用。同源染色体重组(HR)对于DNA双链断裂(DSB)的准确修复不可或缺(Saraietal.,2008)。已知RAD54B基因在癌症中存在体细胞突变，其敲除可在哺乳动物细胞中引起染色体不稳定(CIN)(McManusetal.,2009)。在GBM患者中，RAD54B基因表达的增多引起了较短的至进展时间和较差的OS(Grundaetal.,2010)。
幼红细胞增强因子2(EEF2)
EEF2可编码GTP结合翻译延长因子家族的成员之一。该蛋白是蛋白合成的要素之一。EEF2促进GTP依赖性的初生蛋白链从核糖体的A位点移位至P位点。EEF2在肺腺癌(LADC)中存在高表达，但在邻近的非肿瘤肺组织中不存在表达。有研究表明，eEF2是LADC的抗雕亡标记物，其原因是eEF2高表达患者的早期肿瘤发生率显著较高，且预后显著较差。eEF2表达的沉默增加了线粒体延长、细胞自噬和对顺铂的敏感性。此外，eEF2可在LADC细胞中SUMO化，而eEF2的SUMO化与耐药性相关(Chenetal.,2011a)。EEF2是值得关注的癌症治疗靶标，因为抑制EEF2可引发蛋白合成的迅速停止，由此诱导雕亡并最终引起细胞死亡。siRNA诱导的EEF2沉默在肿瘤细胞中产生了特异性的细胞毒性(Chenetal.,2011b；Wullneretal.,2008)。
细胞周期调节蛋白A2(CCNA2)
CCNA2属于高度保守的细胞周期调节蛋白家族。细胞周期调节蛋白是CDK激酶的调节因子。不同的细胞周期调节蛋白的表达和降解情况截然不同，由此可对各线粒体事件进行时序调节(Deshpandeetal.,2005)。人细胞周期调节蛋白A2是S相进行和进入有丝分裂的关键调节因子。CCNA2结合并激活CDC2或CDK2激酶，由此加速细胞周期的G1/S和G2/M转换(Hondaetal.,2012)。该基因的突变、扩增和过量表达可改变细胞周期进程，常见于多种肿瘤中，可促进肿瘤发生(Cooperetal.,2009；Karsetal.,2011；Kimetal.,2011；Tompkinsetal.,2011)。此外，有报道称CCNA2表达在7种癌症中引发预后不良(Yasmeenetal.,2003)，而细胞周期调控蛋白A与较短的生存期相关(Dobashietal.,1998)。
神经上皮细胞转化蛋白1(NET1)41
NET1是Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子家族的一部分。该家族的成员可通过催化GDP与GTP的交换来活化Rho蛋白。由NET1编码的蛋白可与细胞核中的RhoA相互反应，在离子化辐射后的DNA损伤修复中起到一定作用。
NET1基因在乳腺腺癌细胞(而不是阿片类受体)中存在表达，可能加速该细胞的迁移(Ecimovicetal.,2011)。NET1在胃癌(GC)组织中上调，并驱动该疾病的浸润性表型(SrougiandBurridge,2011)。NET1在GC细胞迁移和浸润(GC进展的关键过程)中起到重要作用(Bennettetal.,2011)。经短期内分泌治疗后，RhoC和NET1可在人前列腺癌中出现高表达，表明RhoC和NET1有望成为内分泌疗法的治疗靶标(Kawataetal.,2012)。
染色体11开放阅读框24(C11orf24)
C11orf24由Tweels等人首先发现(2001)。Cllorf24基因与其它基因无已知的相似性，其功能尚不清楚。Northern印迹分析在心脏、胎盘、肝、胰腺和结肠中发现了1.9-kb转录物的高表达，在脑、肺、骨胳肌、肾、脾、前列腺、睪丸、卵巢和小肠中存在低表达，在甲状腺和白细胞中存在极低表达(Twellsetal.,2001)。长度为449个氨基酸的C11orf24蛋白位于染色体区域11q13。该区域曾被描述为多癌症易感性区域(Gudmundssonetal.,2009；Purdueetal.,2011)。
染色体浓缩调控因子1(RCC1)
染色体浓缩调控因子1(RCC1)是RanGTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换因子。Ran-GTP通过RCC1在染色质上定位生成，这是核质转运、有丝分裂纺锤体组装和核被膜形成的关键过程(Hitakomateetal.,2010)。有资料表明，有丝分裂调节因子(如RCC1、Mad2和存活素)的染色体结合对有丝分裂进程不可或缺(Hoetal.,2008)。Wong等人发现，核RanGTP水平在雕亡的早期阶段有所降低，这与染色体上RCC1的固定相关。因此他们提出，RCC可读取半胱天冬酶激活的Mst1所产生的组蛋白密码，以此通过降低胞核中的RanGTP水平来启动雕亡(Wongetal.,2009)。
黑素瘤抗原F家族蛋白，1(MAGEF1)
MAGE(黑素瘤相关性抗原)超家族中的多数已知成员在肿瘤、睪丸和胚胎组织中存在表达，该表达被描述为癌症/睪丸表达模式(MAGE亚组I)。MAGE亚组I中的肽已成功用于肽和DC接种免疫(Nestleetal.,1998；Marchandetal.,1999；Marchandetal.,1999；Marchandetal.,1995；Thurneretal.,1999)。相比之下，某些MAGE基因(MAGE亚组II，例如MAGEF1)在所检测的所有成人和胚胎组织以及许多肿瘤类型(包括卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、黑素瘤和白血病)中均有普遍表达(Nestleetal.,1998；Marchandetal.,1999；Marchandetal.,1999；Marchandetal.,1995；Thurneretal.,1999)。尽管如此，在NSCLC中(Tsaietal.,2007)，以及一个台湾结直肠癌患者队列79％的患者中(Chungetal.,2010)均发现存在MAGEF1过量表达。
非SMC集缩素I复合物，亚单位D2(NCAPD2)
集缩素属于异五聚复合物，最早发现是作为线粒体染色体的结构组分。NCAPD2是人集缩素复合物的必需组分，后者为线粒体染色体浓缩所必需。NCAPD2缺失可影响有丝分裂中期的染色体排列，延缓进入有丝分裂后期(WatrinandLegagneux,2005)。近期的连接与关联性研究表明，染色体12p13位点可能携带阿尔茨海默病(AD)的易感基因变异体。单标记关联性表明，NCAPD2中的两种SNP(rs7311174和rs2072374)产生名义上显著的p值(分别为p＝0.0491和0.0116)。上述遗传学分析证明，染色体12p13位点与中国人中的AD具有相关性(Lietal.,2009)。
染色体12开放阅读框44(C12orf44)
通过在数据库中搜索果蝇属Atg13相互作用蛋白的直系同源基因，Mercer等人(2009)发现了人ATG101(亦称C12orf44)(Merceretal.,2009)。ATG101基因定位于染色体12q13.13。预测该推定的218氨基酸蛋白是一种细胞溶质亲水蛋白(Hosokawaetal.,2009)。大自吞是溶酶体介导的细胞质蛋白、细胞器和大分子降解中的分解代谢过程。ATG101等ATG蛋白为自噬体形成所必需。自噬体是一种双层膜囊泡，在与溶酶体融合前包围并隔离细胞质货物。ATG101(C12orf44)对于自吞作用不可或缺(Merceretal.,2009)。
含HECT和RLD结构域E3泛素蛋白连接酶4(HERC4)
HERC4属于泛素连接酶HERC家族，此类酶均含一个HECT结构域和至少一个类RCC1(MIM179710)结构域(RLD)。预计350个氨基酸的HECT域可催化泛素硫酯的形成，随后将其转入一种底物中。预计RLD可作为小G蛋白的鸟氨酸核苷酸交换因子(Hochraineretal.,2005)。E3泛素连接酶虽然在所有组织中广泛表达，但在睪丸中的表达最高(具体为精子形成期间)。Herc4连接酶是细胞质小滴的适当成熟与移除所必需的，以使精子功能完善(RodriguezandStewart,2007)。
胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)
IGF2BP3是胰岛素样生长因子-IImRNA结合蛋白家族成员之一，参与mRNA的定位、翻转和翻译控制。该蛋白包含数个KH(K同源)结构域。这些域对于RNA的结合有重要作用，且已知参与RNA合成和代谢。其表达主要发生于胚胎发育过程中，已在某些肿瘤中发现。因此IGF2BP3被认为是一种癌胚蛋白(Liaoetal.,2005)。通过CD44mRNA的稳定来促进IGF-II蛋白合成以及引发细胞粘附和浸润，IGF2BP3可促进肿瘤细胞增殖(Findeis-HoseyandXu,2012)。此外，已在许多人体肿瘤中研究了IGF2BP3表达，有越来越多的证据表明，IGF2BP3可介导迁移、浸润、细胞存活和肿瘤转移(Jengetal.,2009；Kabbarahetal.,2010；Lietal.,2011；Liaoetal.,2011；Luetal.,2011；Hwangetal.,2012；Samantaetal.,2012)，且可能参与血管生成(Suvasinietal.,2011；Chenetal.,2012)。在肺腺癌中，可在中度或低度分化的腺癌中发现IGF2BP3表达的增多，由此可能引起侵袭性生物行为(Findeis-Hoseyetal.,2010；Beljanetal.,2012；Findeis-HoseyandXu,2012)。
细胞分裂周期6同源物(啤酒酵母)(CDC6)
CDC6蛋白可作为DNA复制早期步骤的调控因子，在细胞周期G1中位于细胞核中，但在S相开始时移位至细胞质中。此外，有研究认为CDC6通过与高等真核细胞中的ATR相互反应来调控复制-检查点激活(Yoshidaetal.,2010)。CDC6对于DNA复制不可或缺，其脱调节参与肿瘤发生。研究发现，通过RNA干扰(RNAi)引发CDC6下调可抑制细胞增殖并促进雕亡(Lauetal.,2006)。在数种癌症中均发现存在CDC6过量表达。过量表达CDC6的癌症类型包括胃癌(Tsukamotoetal.,2008)、脑部肿瘤(Ohtaetal.,2001)、口腔鳞状细胞癌(Fengetal.,2008)、宫颈癌(Wangetal.,2009b)和恶性内皮瘤(Romagnolietal.,2009)。
成纤维细胞激活蛋白α(FAP)
成纤维细胞激活蛋白(FAP)是一种II型膜内在糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族。推定的FAPα丝氨酸蛋白酶活性及其体内诱导特征提示该分子可能对发育、组织修复和上皮细胞癌发生过程中的成纤维细胞生长或上皮-间质相互反应起到一定作用(Scanlanetal.,1994)。多数正常成人组织和良性上皮细胞肿瘤中仅存在极少的或不存在FAP表达。但在超过90％的恶性乳腺、结直肠、肺、皮肤和胰腺肿瘤、愈合伤口中的成纤维细胞、软组织肉瘤以及某些胚胎间质细胞的间质中存在表达。FAP可能通过参与细胞粘附和迁移过程以及ECM组分的快速降解来对癌症生长和转移产生一定作用。因此FAP存在于浸润ECM的肿瘤细胞以及参与血管生成的内皮细胞中，但不存在于同类的非活性细胞中(Dolznigetal.,2005；Kennedyetal.,2009；Rettigetal.,1993；Rettigetal.,1994；Scanlanetal.,1994；Zhangetal.,2010a)。
无翅型MMTV整合位点家族成员5A(WNT5A)
Wnt5a通常可调控多种细胞功能，例如增殖、分化、迁移、粘附和极化(Kikuchietal.,2012)，在未分化的人胚胎干细胞中存在表达(Katoh,2008)。WNT5A被归类为非转化性WNT家族成员，其在肿瘤发生中的作用尚存争议。WNT5A可在某些癌症(甲状腺癌、脑癌、结直肠癌)中表型出肿瘤抑制活性，但在肺癌、胃癌和前列腺癌中存在异常上调(Lietal.,2010)。致癌性WNT5A在癌症干细胞中激活经典WNT信号途径以实现自我更新，并在肿瘤-间质交界区激活非经典WNT信号途径以实现浸润和转移(KatohandKatoh,2007)。已在多种肿瘤中报告了WNT5A的表达，例如在28％的前列腺癌中观察到Wnt5a的异常蛋白表达，起到增强进侵袭力的作用(Yamamotoetal.,2010)。此外报告WNT5A过量表达与在卵巢癌(Badiglianetal.,2009)、黑素瘤(DaFornoetal.,2008；Weeraratnaetal.,2002)、GBM(Yuetal.,2007)、肺癌(Huangetal.,2005)和胰腺癌(Ripkaetal.,2007)中与预后不良和/或肿瘤分级升高相关。在HCC中，经典Wnt信号传导通路参与肿瘤发生，而非经典Wnt信号传导通路参与肿瘤进展(Yuzugulluetal.,2009)。
TPX2微管相关蛋白同源物(非洲爪蟾)(TPX2)
TPX2是一种纺锤体组装因子，为有丝分裂纺锤体和雕亡中微管的正常组装所必需，也为染色质和/或着丝点依赖性微管成核过程所必需(BirdandHyman,2008；Mossetal.,2009)。几乎所有的AuroraA激活以及卵母细胞成熟过程中的完整p53体内合成和磷酸化均需要新合成的TPX2(Pascreauetal.,2009)。TPX2是一种细胞周期相关蛋白，在许多肿瘤类型中均存在过量表达，例如脑膜瘤(Stuartetal.,2010)、喉鳞状细胞癌(SCCL)(Cordesetal.,2010)、口腔鳞状细胞癌(SCC)(Shigeishietal.,2009)、肝细胞癌(HCC)(Satowetal.,2010)、胰腺癌(Warneretal.,2009)、卵巢癌(Ramakrishnaetal.,2010)和肺鳞状细胞癌(Linetal.,2006；Maetal.,2006)。TPX2常与Aurora-A同时过量表达，由此产生一个带有致癌性质的新型功能单元(Asteritietal.,2010)。TPX表达是肺癌的预后指标之一(Kadaraetal.,2009)。
透明质酸所致细胞运动受体(RHAMM)(HMMR)
透明质酸所致细胞运动受体RHAMM(HMMR)对细胞以及细胞膜具有多种不同功能。RHAMM可被输出至细胞表面，在此与透明质酸结合并与HA受体CD44相互反应。细胞运动、伤口愈合和浸润等过程均受RHAMM调控(SohrandEngeland,2008)。RHAMM是透明质烷(HYA)受体之一(GaresandPilarski,2000)。此外，癌症细胞中存在HYA的结合位点(CD44、RHAMM等)，HYA可保护癌症细胞不受免疫细胞攻击。转移性患者中常存在血清HYA的升高(Delpechetal.,1997)。此外，有学者提出HYA在癌症细胞中与RHAMM(HMMR)和CD44的相互反应是肿瘤进展与传播的重要促进因子(Lietal.,2000b)。并且RHAMM在数种肿瘤组织中存在过量表达((Tzankovetal.,2011)；(Krameretal.,2010)；(Twarocketal.,2010)；(Shigeishietal.,2009)；(Zlobecetal.,2008)；(Lietal.,2000a))。
ADAM金属肽酶结构域8(ADAM8)
ADAM8是ADAM(一种解聚素与金属蛋白酶结构域)家族成员之一。许多ADAM类型(包括ADAM8)均在人恶性肿瘤中存在表达，在肿瘤中参与生长因子活性和整合蛋白功能的调节，由此促进细胞生长与浸润(MochizukiandOkada,2007)。ADAM8的表达与EGFR正相关。二者均主要在细胞质和细胞膜中表达(Wuetal.,2008)。ADAM8在所研究的大多数肺癌中均大量表达。ADAM8的外源性表达提高了哺乳动物细胞的迁移活性，提示ADAM8可能对肺癌进展起到重要作用(Ishikawaetal.,2004)。ADAM8与肺癌预后不良相关(Hernandezetal.,2010)。ADAM8过量表达与患者较短的生存期相关，且是RCC远处转移的良好预测因子(Roemeretal.,2004b；Roemeretal.,2004a)。ADAM8的表达水平和蛋白酶活性与神经胶质瘤细胞的浸润活性相关，提示ADAM8可能在脑部癌症浸润中起到显著作用(Wildeboeretal.,2006)。
胶原蛋白α-3(VI)链蛋白(COL6A3)
COL6A3可编码α-3(VI)链，即VI型胶原的三个α链之一。研究显示其蛋白结构域可与细胞外基质蛋白相结合，该相互反应可解释该胶原在基质组分的组织中所起的重要作用。
胶原VI过量表达引起的细胞外基质重塑增加了卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。胶原VI的存在与肿瘤等级相关，后者为卵巢癌预后因子之一(Sherman-Baustetal.,2003)。COL6A3在结直肠癌(Smithetal.,2009a)、唾液腺癌(Leivoetal.,2005)中存在过量表达，在胃癌中存在分化表达(Yangetal.,2007)。COL6A3是已发现的7种肿瘤特异性剪接变体之一。已证实的肿瘤特异性剪接变化高度一致，由此可以明确区分正常和癌变样本，在某些情况下甚至可以区分不同的肿瘤期别(Thorsenetal.,2008)。
Thy-1细胞表面抗原(THY1)
Thy-1(CD90)是一种25-37kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的糖蛋白，在多种细胞类型中存在表达，包括T细胞、胸腺细胞、神经元、内皮细胞和成纤维细胞。Thy-1的活化可促进T细胞活化。Thy-1也影响众多非免疫生物过程，包括细胞粘附、神经突生长、肿瘤生长、肿瘤抑制、迁移、伤口愈合和细胞死亡。Thy-1是细胞-细胞以及细胞-基质相互反应的重要调节因子，在神经再生、转移、炎症和纤维化中起到重要作用(RegeandHagood,2006b；RegeandHagood,2006a)。此外，Thy-1在成人中表现为血管生成标记物，但非胚胎血管生成标记物。通过细胞因子上调Thy-1而不是生长因子表明了炎症对成人血管生成的病因的重要作用(Leeetal.,1998)。相比于正常组织或良性肿瘤组织，肺癌细胞核中的Thy-1存在过量表达，该过量表达是NSCLC患者的预后相关因子之一。因此Thy-1可能是肺癌发病中的新型隐形恶性标记物之一(Chenetal.,2005b)。Thy-1可考虑作为多种干细胞(例如脑膜干细胞、肝干细胞(“椭圆形细胞”)(Massonetal.,2006)、角质化细胞干细胞(Nakamuraetal.,2006)和造血干细胞(Yamazakietal.,2009)的替代标记物。
II型碘化钾腺氨酸脱碘酶(DIO2)
DIO2基因所编码的蛋白属于碘化钾腺氨酸脱碘酶家族，在甲状腺中高度表达，可能对Grave病和甲状腺腺瘤患者中甲状腺性T3生成的相对增多有显著作用(Meyeretal.,2008)；(deSouzaMeyeretal.,2005)。其基因表达模式与向上和向下进展型鼻咽癌(NPC)显著不同。向下进展型(向下＝远处转移)中的DIO2基因表达高于向上进展型(局部生长和颅底浸润)，这可能与NPC的转移潜能密切相关(Liangetal.,2008)。在脑部肿瘤中存在DIO2mRNA以及DIO2活性(Murakamietal.,2000)。肺组织中存在D2活性，且该活性与在周围肺组织和肺癌组织中相近(Wawrzynskaetal.,2003)。
骨膜蛋白(成骨细胞特异性因子)(POSTN)
POSTN基因可编码一种与成束蛋白家族具有相似性的蛋白，参与细胞存活与血管生成，有望成为多种人体癌症类型的肿瘤进展标记物(Ruanetal.,2009)。
在多数实体瘤中均发现存在骨膜蛋白或其mRNA的高表达，包括乳腺癌(Zhangetal.,2010b)、结肠癌(Kikuchietal.,2008)、头颈癌(Kudoetal.,2006)、胰腺癌(Kannoetal.,2008)、乳头状甲状腺癌(Puppinetal.,2008)、前列腺癌(Tischleretal.,2010)、卵巢癌(Choietal.,2010)、肺癌(Takanamietal.,2008)和肝癌(Utispanetal.,2010)，以及食道鳞状细胞癌(Kwonetal.,2009)。骨膜蛋白在肺癌中异常高表达，且与血管生成、浸润和转移相关(Takanamietal.,2008)。在A549NSCLC细胞中沉默骨膜蛋白抑制了肿瘤细胞生长，减少了细胞浸润(Wuetal.,2013)。
SLIT1(slit同源物1(果蝇属))，SLIT2(slit同源物1(果蝇属))
SLITs(SLIT1、SLIT2和SLIT3)是一个分泌蛋白家族，可通过ROBO受体信号传导来介导发育过程中细胞与其环境的位置相互反应(Hinck,2004)，但SLIT/ROBO信号传导不限于发育过程，而上述信号的缺失很可能对肿瘤进展起到重要作用(Narayanetal.,2006；Schmidetal.,2007；Latiletal.,2003)。约50％的人乳腺肿瘤样本中存在SLIT2或SLIT3基因表达的沉默(Sharmaetal.,2007)。SLIT2的超甲基化常在NSCLC中发现，且与多种临床特征相关(Suzukietal.,2013)。
TLX3(T细胞白血病同源盒蛋白3)
TLX3(亦称RNX或HOX11L2)属于一个孤儿同源盒基因家族，该家族基因可编码DNA结合核转录因子。HOX11基因家族成员特征为高度保守的同源结构与中苏氨酸-47取代胞嘧啶(Dearetal.,1993)。TLX3在发育中的延髓中独特表达。第一级内脏感觉神经元以及脑干中多数肾上腺素能(特别参与心血管和呼吸系统的生理调控)的正常形成均需要TLX3(Qianetal.,2001)。在T细胞急性淋巴细胞白血病患者中，有20％的儿童和13％的成人的白血病样本中检测到TLXZ3表达(Caveetal.,2004)，尽管该基因从不参与正常T细胞分化(Ferrandoetal.,2004)。
CEP192(中心体蛋白192kDa)
中心体在多种细胞过程中起到重要作用，包括纺锤体形成和染色体分离。CEP192是一种中心体蛋白，在哺乳动物、果蝇属和秀丽隐杆线虫中心体的生物发生和功能中起到关键作用(Gomez-Ferreriaetal.,2012)。CEP192可刺激有丝分裂中脚手架的形成，而γ微管蛋白环复合物和其它参与微管成核过程的蛋白以及纺锤体组装均依赖于该脚手架而起作用(Gomez-Ferreriaetal.,2007)。
ANKS1A(含锚定蛋白重复序列和护颖α基序结构域1A)
含锚定蛋白重复序列和SAM结构域蛋白是一种由ANKS1A基因编码的人体蛋白(Nagaseetal.,1996)。ANKS1A首先被报告为EGFR和PDGFR等受体酪氨酸激酶的靶标和信号递质(Pandeyetal.,2002)，近期被报告为受体酪氨酸激酶EphA8的相互反应伴侣(Shinetal.,2007)。近期一项研究中对348名晚期NSCLC患者的单核苷酸多态(SNPs)进行了基因分型，结果发现与预后最为相关的17个候选SNPs。SNPs位于ANKS1A基因的基因组区域(Leeetal.,2013)。
CEP250(中心体蛋白250kDa)
CEP250基因可编码一种核心中心体蛋白，该蛋白为细胞周期分裂间期中中性粒-中心粒连接所必需(Mayoretal.,2002)。通过放射杂交分析，Fry等人(1998)将CEP250定位至染色体20的着丝粒区域，位置接近20q11.2(Fryetal.,1998)。Mayor等人(2002)发现，CEP250在人骨肉瘤细胞系中的过量表达引起大中心体相关结构的形成。CEP250过量表达不影响中心体分离或细胞分裂，但提示细胞周期调节的活性可将CEP250从中心体中分离(Mayoretal.,2002)。
MDN1(MDN1，midasin同源物(酵母))
MDN1，midasin同源物(酵母)是一种蛋白，在人体中由MDN1基因编码。Midastin是一种单拷贝基因，该基因在所有已有资料的真核生物中均编码一种约600kDa的极保守蛋白。在人体中，该基因定位于6q15，可编码一种含5596个残基的预测蛋白(632kDa)(GarbarinoandGibbons,2002)。近期研究发现，MDN1在乳腺癌线腔A亚型中存在突变。MDN1可能对此侵袭性亚型的发生和激素耐抗起到一定作用(Cornenetal.,2014)。
OLFM1(嗅素1)
OLFM1亦称嗅球蛋白，是一种分泌型糖蛋白，属于含嗅素结构域蛋白家族，对神经管生成神经脊细胞起到重要的调控作用(Barembaumetal.,2000)。溴素最初发现为粘液层的主要组分之一，该层包围嗅觉神经元的化学感觉树突(Kulkarnietal.,2000)。嗅素1蛋白在肺腺癌中的表达显著高于其它组织化学类型的肺癌和正常肺组织(Wuetal.,2010)。此外，OLFM1在子宫内膜癌、Ewing肉瘤和成神经细胞瘤中存在脱调控(Wongetal.,2007；Allanderetal.,2002；Khanetal.,2001)。
BUB1B(苯并咪唑出芽抑制解除蛋白1同源物β(酵母))
BUB1B亦称BubR1，是一种核心有丝分裂检查点组分，可结合并抑制Cdc20活化的有丝分裂后期促进因子(APC/CCdc20)。该因子是一种泛素E3连接酶，通过调控分离酶介导的粘附环(此环将姐妹染色单体相结合)来启动有丝分裂后期(Bakeretal.,2004)。BubR1不仅通过活化有丝分裂检查点而且通过调节染色体-纺锤体附着区来促进正常染色体分离(Malureanuetal.,2009；LampsonandKapoor,2005)。已在多种肿瘤中发现了纺锤体检查点功能损伤。已发现BubR1突变与非整倍体综合征相关联。该症是一种特征为非整倍体化、肿瘤易感性和多种早老症样特征(包括寿命较短、生长和心智发育迟缓、白内障和面部畸形)的罕见人综合征(Matsuuraetal.,2006)。
PI4KA(催化性磷脂酰肌醇4-激酶α)
人体细胞中可表达4种不同的磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)。此类同工酶(PI4KA、PI4KB、PI4K2A和PI4K2B)可在细胞膜的细胞质面催化磷脂酰肌醇(PtdIns)的磷酸化，从而产生磷脂酰肌醇4-磷酸(PtdIns4P)(MinogueandWaugh,2012)。PI4KA主要存在于内质网(ER)中，其活性似乎可同时调节ER出口位点的形成(Blumental-Perryetal.,2006)和PtdIns4P在质膜中的浓集(Ballaetal.,2008)。有研究组发现，HCC中的PI4KAmRNA在正常健康组织中含量更多。这一上调与HCC的低度分化和增值活跃率均显著相关(Ilboudoetal.,2014)。
AURKB(aurora激酶B)
AuroraB激酶是一种蛋白，作用于有丝分裂纺锤体着丝至中心体(Kimetal.,2011)。AURKB位于着丝点附近的微管中(Kunitokuetal.,2003)。Aurora激酶在多种肿瘤细胞系中存在过量表达，表明该酶可能对肿瘤发生起到一定作用，已成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶标之一(Fuetal.,2007)。最近发现了5种基因(TOP2A、AURKB、BRRN1、CDK1和FUS)的基因标签，与NSCLC患者的转归密切相关。结果表明，参与染色体浓缩的基因(例如AURKB)很可能与干细胞样特性相关，有望预测肺腺癌的生存期(Perumaletal.,2012)。
SLC3A2(溶质携带物家族3(二元酸性与中性氨基酸转运活化因子)，成员2)
SLC3A2是较大的中性氨基酸转运体(LAT1)的轻亚单位，亦称CD98(分化抗原决定簇98)(Lemaitreetal.,2005)。CD98异二聚体含有一条约80–85kDa的II型单通道跨膜重链(CD98hc，亦称4F2抗原重链或FRP-1，在人和小鼠中分别由SLC3A2和Slc3a2基因所编码)，通过二硫键与一条约40kDa的多通道轻链键合(DevesandBoyd,2000)。CD98hc作用于整合素信号传导的扩增以及氨基酸转运；这两种功能均可促进细胞存活和增殖(CantorandGinsberg,2012)。许多肿瘤可表达CD98hc(SLC3A2)，其表达与B细胞淋巴瘤的预后不良相关。此外，几乎所有CD98hc或CD98轻链在实体瘤中的表达的研究均显示其表达与进展性或转移性瘤相关(Kairaetal.,2009)。
IFT81(细胞纤毛内转运蛋白81同源物(衣滴虫))
纤毛前体(例如微管蛋白)从细胞质至纤毛尖端的细胞纤毛内转运(IFT)参与纤毛(一种见于多数真核细胞的毛发样细胞器)的构建。IFT81敲除以及点突变挽救试验显示，IFT81介导的微管蛋白结合为人体细胞纤毛形成所必需(Bhogarajuetal.,2013)。IFT81与IFT74/72一同形成一个核心复合物，以此构建纤毛形成所必需的IFT粒子(Luckeretal.,2005)。
COG4(低聚高尔基复合体组分4)
COG复合体包含8个亚单位，分别为COG1–8(Ungaretal.,2002；WhyteandMunro,2001)，可分为2种子复合体：COG1–4(LobeA)和COG5–8(LobeB)(Ungaretal.,2005)。COG复合体参与囊泡回收高尔基体驻留蛋白(例如糖基化酶)的系链(Pokrovskayaetal.,2011)。COG4基因定位于染色体16q22.1(Reyndersetal.,2009)。Ungar等人(2002)推断，COG4对于Golgi体的结构和功能至关重要，可影响细胞内膜运输(Ungaretal.,2002)。
NCBP1(核冠结合蛋白亚单位1，80kDa)
核冠结合蛋白复合物是一种RNA结合蛋白，与RNA聚合酶II的5'冠相结合。Kataoka等人(1994)报告了一种可编码HeLa细胞核提取物中的80kD核冠结合蛋白(NCBP1)的基因的克隆，该提取物可能参与mRNA剪接和RNA输出(Kataokaetal.,1994)。通过与一个体细胞杂交板中的基因组DNA杂交，Chadwick等人(1996)将NCBP1基因定位于9q34.1(Chadwicketal.,1996)。
NEFH(神经丝重链多肽)
编码神经丝重链的NEFH是神经元细胞骨架神经丝的主要组分之一。神经丝重链多肽(NEFH,200kD)基因位于染色体带22q12.2，被认为是2型多发性神经纤维瘤(NF2)家族症状发生前的DNA标记物之一。NEFH的缺失或下调多报告于人自主神经瘤或中枢神经细胞瘤中(Menaetal.,2001；Segaletal.,1994)。此外，在人前列腺癌(Schleicheretal.,1997)、透明细胞上皮样瘤(Tanakaetal.,2000)和小细胞肺癌(Bobosetal.,2006)中观察到NEFH表达的缺失或减少。值得注意的是，NEFH的过量表达可破坏正常细胞结构和功能，并引发细胞死亡(Szebenyietal.,2002)。
本发明的详细说明
除非另有说明外，本文所使用的所有术语定义如下：
本文所用的“肽”这一术语系指一系列的氨基酸残基，彼此之间通常通过邻近氨基酸的α氨基酸与羰基间的肽键相连接。肽的长度优选为9个氨基酸，但也可以短至8个氨基酸，长至10、11、12、13或14个氨基酸，而MHCII类肽可长至15、16、17、18、19或20个氨基酸。
此外，“肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐类，彼此之间通常通过邻近氨基酸的α氨基酸与羰基间的肽键相连接。此盐类优选为药用盐。
“肽”这一术语应包括“寡肽”。本文所用的“寡肽”这一术语系指一系列的氨基酸残基，彼此之间通常通过邻近氨基酸的α氨基酸与羰基间的肽键相连接。只要寡肽能维持正确的表型，其长度对于本发明并非关键。寡肽通常少于约30个氨基酸残基，多余约15个氨基酸。
“本发明的肽”这一术语应由上文所述的对应于SEQIDNo.1至SEQIDNo.92的肽所组成。
“多肽”这一术语系指一系列的氨基酸残基，彼此之间通常通过邻近氨基酸的α氨基酸与羰基间的肽键相连接。只要多肽能维持正确的表型，其长度对于本发明并非关键。与“肽”或“寡肽”相对，多肽这一术语系指包含多余约30个氨基酸残基的分子。
若一种肽、寡肽、蛋白或多聚核苷酸所编码的分子可引发免疫应答，则此肽、寡肽、蛋白或多聚核苷酸具有“免疫原性”(由此是本发明范围内的“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性更具体定义为可诱导T细胞应答。因此“免疫原”是可诱导免疫应答的分子(具体到本发明则为可诱导T细胞应答的分子)。另一方面，免疫原可为一种肽、肽与MHC的复合物、寡肽和/或蛋白，用于产生其特异性抗体或TCR。
I类T细胞“表型”系指与I类MHC受体相结合的短肽，由此形成一个三元络合物(MHCI类α链、β-2-微球蛋白和肽)，可由T细胞(携带与具有适当亲合力的MHC/肽复合物结合的相应T细胞受体)所识别。与MHCI类分子相结合的肽长度通常为8-14个氨基酸，以9个氨基酸最为常见。
人体中有3个不同的基因位点可编码MHCI类分子(人MHC-分子亦称人真核细胞抗原(HLA)：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07代表可从此位点表达的不同MHCI类等位基因。
表2：HLA*A02和最常见HLA-DR血清型的表达频率(F)。
依据Mori等人的方法，频率的推算基于美国人群中的单倍体频率Gf(Morietal.,1997)，该方法使用Hardy-Weinberg公式F＝1-(1-Gf)2。由于连锁不平衡，A*02与某些HLA-DR等位基因组合后可能引起其各自单独频率的升高或降低。详情请参见Chanock等人的文献(Chanocketal.,2004)。
因此，出于治疗和诊断目的，能以适当的亲合力与多种不同的HLAII类受体相结合的肽是非常理想的。与数种不同的HLAII类分子结合的肽被称为混杂结合剂。
本文中对DNA序列的引用同时包括单链和多链DNA。因此除文中特别说明外，特定的序列均指该序列的单链DNA、此序列与其互补序列的双链体(双链DNA)以及此序列的互补序列。“编码区”这一术语系指可在自然基因组环境中自然或正常编码某基因表达产物的该基因组分，例如可在体外编码该基因天然表达产物的区域。
编码区域可来自非突变(“正常”)、突变或改变的基因，甚至可来自使用当前DNA合成方法在实验室全合成的DNA序列或基因。
“核苷酸序列”这一术语系指脱氧核糖核酸的异源多聚体。
编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然存在，也可为人工合成。通常而言，编码本发明的肽、多肽和蛋白的DNA片段组装自cDNA碎片和短寡核苷酸连接器，或组装自一系列的寡肽，由此产生一个合成基因，该基因可在重组转录单元(由源自微生物或病毒操纵子的调控元素所组成)中表达。
本文所用的“编码肽的核苷酸”这一术语系指可编码肽的核苷酸序列(该肽含有适用于表达该序列的生物系统的人工起始和终止密码子)。
“表达产物”这一术语系指作为基因自然翻译产物的多肽或蛋白，或由遗传密码的简并性所产生的(因此可编码同种氨基酸的)任何氨基酸序列的同等编码产物。
“碎片”这一术语用于编码序列时系指小于完整编码区的DNA的一部分，其表达产物所携带的生物功能或活性与完整编码区的表达产物本质上相同。
“DNA片段”这一术语系指作为单独片段或较大DNA构造组分的DNA聚合物。该片段源自至少分裂过一次、基本为初凝形式(即不含污染性内源物质，且其含量或浓度允许通过克隆用载体等标准生物化学方法对该片段或其氨基酸序列组分进行识别、操作和恢复)的DNA。此类片段表现为不被内部非翻译序列或内含子(通常存在于真核基因中)所打断的连续开放阅读框。非翻译DNA序列可能存在于该开放阅读框的下游，且该非翻译DNA序列不干扰编码区的操作或表达。
“引物”这一术语系指一种短核苷酸序列，可与一条DNA链配对形成一个游离3'-OH端，DNA聚合酶在此游离端开始合成脱氧核糖核酸链。
“启动子”这一术语系指一个参与RNA聚合酶结合(以此启动转录)的DNA区域。
“分离的”这一术语系指从原始环境(例如其天然环境(若为天然存在物质))中转移的物质。举例来说，天然存在的多聚核苷酸或存在于活体动物中的多肽为非分离物质，而从天然系统中某些或全部共存物质中分离的同种多聚核苷酸或多肽则为分离物质。此类多聚核苷酸可为载体的一部分，且/或此类多聚核苷酸或多肽可为某组分的一部分，但若此载体或组分不是其天然环境的一部分，此多聚核苷酸或多肽仍为分离物质。
根据本发明公开的多聚核苷酸以及重组或免疫原性多肽也可为“纯化”型。“纯化”这一术语并不要求绝对纯净，而是一个相对定义，可包含高度纯化的制剂或仅部分纯化的制剂。此类术语由具备相应的当前技术水平的人员所各自理解。例如，从cDNA库中分离的个体克隆物通常纯化至电泳匀质性即可。明确规定起始物料和自然物料应纯化至至少一个数量级(优选为2或3个数量级，更优选为4或5个数量级)。此外，明确规定多肽的纯度优选为99.999％，或至少99.99％或99.9％；甚至适宜以重量计为99％以上。
根据本发明公开的核苷酸和多肽表达产物以及含有此氨基酸和/或多肽的表达载体可能为“浓缩型”。本文所用“浓缩”这一术语系指物质的浓度至少为其(例如)天然浓度的2、5、10、100或1000倍，宜为0.01％(按重量)，优选为至少0.1％(按重量)。也可考虑约0.5％、1％、5％、10％和20％(按重量)的浓缩制剂。本发明所涉序列、构造、载体、克隆物和其它物质宜为浓缩或分离型。
“活性碎片”这一术语系指可单独使用或与适当辅剂联合使用，在动物(例如家兔或小鼠也包括人等哺乳动物)中产生免疫应答(即具有免疫原活性)的碎片，此免疫应答的形式为在受体动物(例如人)中激发T细胞应答。“活性碎片”也可用于引发体外T细胞应答。
本文中“部分”(portion)、“片段”(segment)和“碎片”(fragment)等术语用于多肽时系指残基(例如氨基酸残基)的连续序列，该序列组成较大序列的一个亚组。例如，用常见的内肽酶(例如胰蛋白酶或糜蛋白酶)处理多肽后，由此处理所产生的寡肽即为起始多肽的部分、片段或碎片。当用于多聚核苷酸时，以上术语系指用任何核酸内切酶处理相关多聚核苷酸后的产物。
本发明所涉“百分同一性”这一术语，用于序列时系指将需要比较的某一序列(“比较序列”)进行排列后与已明确的或已报告的序列(“参考序列”)相比较，然后用以下公式计算百分同一性：
百分同一性＝100[1-(C/R)]
其中C为参考序列与比较序列在参考序列与比较序列之间排列长度中的差异数，其中(i)在比较序列中不存在相应排列碱基或氨基酸的参考序列中的各碱基或氨基酸、(ii)参考序列中的各空隙以及(iii)与比较序列中的排列碱基或氨基酸不同的参考序列中的各碱基或氨基酸均构成差异，并且(iiii)该排列必须起始于所排列序列的位置1；
R为位于比较序列排列长度中的参考序列的碱基或氨基酸数量(将参考序列中的空隙也记为碱基或氨基酸)。
若比较序列与参考序列间存在排列，且二者按上述方法计算的百分同一性等于或大于特定的最低百分同一性限度，则可认为该比较序列与参考序列具有特定的最低百分同一性，即使也有可能存在按上述方法计算的排列百分同一性低于特定的百分同一性的情况。
如非另作说明，本文所涉的原始(非修饰)肽可均通过取代肽链中不同位点(有可能是选择性位点)上的一个或多个残基来进行修饰。
上述取代宜发生于氨基酸链的末端。此类取代可为保守性的，例如用一个结构或特性相似的氨基酸取代另一氨基酸(例如用一个疏水性氨基酸取代另一疏水性氨基酸)。相同或近似大小和化学性质的氨基酸间的取代则更为保守，例如用异亮氨酸取代白氨酸。在对天然存在的同源蛋白家族的序列变异体的研究中，某些氨基酸取代较之其它取代更易耐受，此类取代通常与相似大小、电荷、极性以及原氨基酸和其取代氨基酸间的疏水性相关。此类性质是定义“保守性取代”的基础。
本文定义保守性取代为以下任意五组残基间的交换：第1组-脂肪族、非极性或微极性小残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；第2组-极性、带负电荷残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；第3组-极性、带正电荷残基(His，Arg，Lys)；第4组-脂肪族、非极性大残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)；第5组-芳香族大残基(Phe，Tyr，Trp)。
较不保守的取代方式可能涉及用特性相近但大小有所不同的氨基酸取代另一氨基酸，例如用异亮氨酸残基取代丙氨酸。高度非保守取代可能涉及用酸性氨基酸取代具有极性或甚至碱性性质的氨基酸。但上述“激进”的取代不能因为有可能无效而被忽略，原因是化学作用并不是完全可预测的，激进的取代也有可能产生单一化学原则所无法预测的偶然效应。
当然，上述取代可能涉及与常见L-氨基酸不同的结构。因此，即使D-氨基酸有可能被本发明中的常见抗原性肽的L-氨基酸所替代，但是本发明仍然涵盖D-氨基酸。此外，可加工非标准R基团(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)的氨基酸也有可能用于取代，以此产生根据本发明所述的免疫原和免疫原性多肽。
若发现存在多个位置的取代，产生了具有本质上同等或更强的抗原活性(定义见下文)的肽，则应检测此类取代组合以明确此组合取代是否对肽的抗原性产生了迭加或协同效应。同一个肽中最多可有不超过4个位置被同时取代。
本发明的肽可延长最多4个氨基酸，即：1、2、3或4个氨基酸可以4：0至0：4的任何组合形式加入任一末端。
表3列出了本发明所允许的肽延长组合类型：
用于延长的氨基酸可为蛋白原始序列的肽或任何其它氨基酸。延长的目的是提高肽的稳定性或溶解性。
“T细胞应答”这一术语系指肽在体外或体内引起的效应功能的特异性增殖和活化。对于MHCI类限制性CLT，其效应子功能可为肽冲击的、肽前体冲击的或天然肽呈递的靶细胞的溶解、细胞因子(优选为肽诱导的干扰素γ、TNFα或IL-2)分泌、效应分子(优选为肽诱导的粒酶或穿孔蛋白)分泌或脱粒。
理想情况下，当检测对SEQIDNo.1至SEQIDNo.92肽(相比于取代肽)特异性的CTL时，取代肽达到相对于背景值的最大溶解增值时的肽浓度不应超过约1mM，最好不超过约1μM，更优选为不超过约1nM，再更优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10pM。取代肽宜在至少一个个体(最少为2个，更优选为3个)中被CTL识别。
因此本发明的表型可能与天然存在的肿瘤相关或肿瘤特异性表型一致，也可能包含与参考肽差异不超过4个残基的表型，只要该表型的抗原活性基本一致。
免疫应答的激发取决于被宿主免疫系统识别为外源性的抗原。肿瘤相关性抗原的发现提高了用宿主免疫系统阻碍肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索各种利用免疫系统的体液和细胞免疫作用的机制。
细胞性免疫应答的特异性元素可特异性地识别和破坏肿瘤细胞。将细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与肿瘤浸润细胞群或外周血相分离后发现，该细胞对于癌症的天然免疫防御起到重要作用。CD8阳性T细胞在该应答中的作用尤为重要，原因是其可识别携带主要组织相容性复复合物(MCH)I类分子(通常由8至10个由蛋白或细胞溶质中的缺陷核糖体产物(DRIPS)所衍生的氨基酸残基所组成)。人体中的MHC分子亦称为人白细胞抗原(HLA)。
MHCI类分子存在于多数带核细胞中，其所呈递的肽多源于内源蛋白、DRIPs和较大肽的溶蛋白性裂解。但也经常在MHCI类分子上发现源于内涵体腔室的或外源性肽。文献中将该非经典I类呈递称为交叉呈递。
由于两种类型的应答(分别为CD8和CD4依赖型)可共同产生协同抗肿瘤作用，因此肿瘤相关性抗原(通过CD8+CTL(配体：MHCI类分子+多肽表型)或CD4阳性辅助T细胞(配体MHCII类分子+多肽表型)来识别)的鉴别和表征对于抗肿瘤疫苗的开发有重要意义。因此本发明的目的之一是提出可与各类型MHC复合物相结合的肽组分。
考虑到癌症治疗的严重副作用和高昂费用，亟需更好的预后和诊断方法。因此有必要发现其它可作为癌症生物标记物的因子，特别是肺癌。此外，有必要发现肿瘤治疗所使用的因子，特别是肺癌。
本发明提出可用于治疗癌症/肿瘤(优选为肺癌，最优选为可过量表达或独特表达本发明的肽的非小细胞肺癌(NSCLC))的肽。质谱分析表明，此类肽可在原发性人肺癌样本中由HLA分子天然呈递(参见示例1和图1)。
肽的源基因/蛋白(亦称“全长蛋白”或“基本蛋白”)在非小细胞肺癌以及SEQIDsNo.66至75的胃癌和成胶质细胞瘤中相比于正常组织存在高度过量表达(参见示例2，NSCLC参见图2)，表明源基因与肿瘤的高度关联。此外，肽自身在肿瘤组织中也大量过量呈递，在正常组织中则没有(参见示例3和图3)。
HLA结合肽可被免疫系统特别是T淋巴细胞所识别。T细胞可破坏呈递所识别的HLA/肽复合物的细胞，例如呈递衍生肽的肺癌细胞。
研究显示本发明的肽可激发T细胞应答并/或存在过量呈递，因此可用于产生本发明所涉的抗体和/或TCR，特别是TCR(参见示例4和图4)。此外，与相应MHC络合的肽可用于产生本发明所涉的抗体和/或TCR，特别是TCR。相应的方法为技术熟练的人员所熟知，也可在相应的文献中找到。因此本发明的肽有助于产生免疫应答，该应答可在患者中破坏肿瘤细胞。可通过直接给予患者文中所述的肽或合适的前体物质(例如延长肽、蛋白或编码此类肽的核苷酸)可在患者中引发免疫应答，最好与促免疫原性药物(例如辅剂)联合使用。通过此治疗性接种免疫产生的免疫应答预计可对肿瘤细胞具有高度特异性，其原因是本发明的目的肽在正常组织中不存在一定的拷贝数，由此可防范对正常细胞的不良自免疫反应这一风险。
药品组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽。本文中“药用盐”系指本发明所公开的肽的一种衍生物，其中的肽通过形成相应药物的酸或碱盐来进行修饰。例如酸盐可由游离碱(特别是含中性-NH2基团的药物的中性形式)与合适的酸反应而制得。用于制备酸盐的合适的酸包括有机酸(例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、枸橼酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、p-甲苯磺酸、乙酰水杨酸等)和无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等)。相反地，可能存在于肽中的酸基团的碱盐的制备需使用药用碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等。
在优选的实施方案中，药学组分可包括乙酸盐、三氟乙酸盐或盐酸盐形式的肽。
除可用于癌症治疗外，本发明的肽还可能用于诊断。由于此类肽产生于肺癌细胞而在正常细胞中不存在或水平较低，此类肽可用于癌症的诊断。
存在于活检组织中的相关肽类可协助病理医师诊断癌症。通过抗体、质谱或其它目前所用方法检测特定的肽可提示病理医师该组织为恶性、炎性还是一般疾病。特定组别的肽可用于病变组织的分类或次级分类。
检测病变组织标本中的肽可预测从免疫系统疗法的获益情况，特别是在已知或预期T淋巴细胞参与其作用机制的情况下。MHC表达缺失这一机制已得以充分报告，恶性细胞可通过该机制逃脱免疫监视。因此肽的存在显示所分析的细胞并未利用该机制。
本发明的肽有望用于分析淋巴细胞对此类肽的应答，例如对肽或肽-MHC分子复合物的T细胞应答或抗体应答。上述淋巴细胞应答可用作决定后续治疗步骤的预后标记物。此类应答亦可在旨在用多种方法(例如蛋白、核苷酸、自体物质的免疫接种和淋巴细胞的过继性转移)引发淋巴细胞应答的免疫疗法中用作替代标记物。在基因治疗中，副作用评估可考虑淋巴细胞对肽的应答。对淋巴细胞应答的监测有可能作为移植治疗中随访检查(例如发现移植物抗宿主或宿主抗移植物疾病)的有效工具。
本发明的肽可用于产生MHC/肽复合物的特异性抗体。此类抗体可用于治疗，使毒素或放射性物质靶向作用于病变组织。此类抗体的另一用途是使放射性核素靶向作用于病变组织，以便进行PET等影像疗法。这一用途有助于发现小转移或确定病变组织的大小和准确位置。
因此本发明的另一方面是提出产生一种可与人重要组织相容性复合物(MHC)I或II(与HLA限制性抗原相络合)特异性结合的重组抗体的方法，该方法包括：用络合了上述HLA限制性抗原的MHCI类或II类分子的可溶型对基因工程制备的非人哺乳动物细胞(可表达上述人MHCI类或II类)进行免疫；将mRNA分子从上述产生抗体的非人哺乳动物细胞中分离；产生一个噬菌体呈现文库以呈现由上述mRNA分子编码的蛋白分子；并从上述噬菌体呈现文库中分离至少一种噬菌体，该噬菌体可呈现上述可与MHCI类或I类(与上述HLA限制性抗原相络合)特异性结合的抗体。
本发明的另一方面是提出一种可与人重要组织相容性复合物(MHC)I或II(与HLA限制性抗原相络合)特异性结合的抗体，该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。
此外，本发明的另一方面涉及产生一种可与人重要组织相容性复合物(MHC)I或II(与HLA限制性抗原相络合)特异性结合的上述抗体的方法，该方法包括：用络合了上述HLA限制性抗原的MHCI类或II类分子可溶型对基因工程制备的非人哺乳动物细胞(可表达上述人MHCI类或II类)进行免疫；将mRNA分子从上述产生抗体的非人哺乳动物细胞中分离；产生一个噬菌体呈现文库以呈现由上述mRNA分子编码的蛋白分子；并从上述噬菌体呈现文库中分离至少一种噬菌体，该噬菌体可呈现上述可与MHCI类或I类(与上述HLA限制性抗原相络合)特异性结合的抗体。产生上述抗体、单链I类MHC以及产生上述抗体所用的其它工具的相应方法参见WO03/068201、WO2004/084798、WO01/72768、WO03/070752以及CohenCJ,DenkbergG,LevA,EpelM,ReiterY.RecombinantantibodieswithMHC-restricted,peptide-specific,T-cellreceptor-likespecificity:newtoolstostudyantigenpresentationandTCR-peptide-MHCinteractions.JMolRecognit.2003Sep-Oct；16(5):324-32.；DenkbergG,LevA,EisenbachL,BenharI,ReiterY.SelectivetargetingofmelanomaandAPCsusingarecombinantantibodywithTCR-likespe-cificitydirectedtowardamelanomadifferentiationantigen.JImmunol.2003Sep1；171(5):2197-207；以及CohenCJ,SarigO,YamanoY,TomaruU,JacobsonS,ReiterY.DirectphenotypicanalysisofhumanMHCclassIantigenpresentation:visualization,quanti-tation,andinsitudetectionofhumanviralepitopesusingpeptide-specific,MHC-restrictedhumanrecombinantantibodies.JImmunol.2003Apr15；170(8):4349-61，上述文献用于本发明时均通过完整引用而明确成为本文的一部分。
抗体对复合物的结合亲合力宜低于20纳摩尔，最好低于10纳摩尔，由此在本发明中即可认为具有“特异性”。
本发明的另一方面是提出可识别特异性肽-MHC复合物的一种可溶性T细胞受体的产生方法。此类T细胞受体可由特异性T细胞克隆产生，其亲合力可因作用于互补性决定区域的突变发生而增强。T细胞受体的选择可使用噬菌体呈现(US2010/0113300,LiddyN,BossiG,AdamsKJ,LissinaA,MahonTM,HassanNJ,etal.MonoclonalTCR-redirectedtumorcellkilling.NatMed2012Jun；18(6):980-987)。出于使噬菌体呈现中的T细胞受体稳定的目的，以及在药物的实际应用中，α和β链可由非天然二硫键、其它共价键(单链T细胞受体)或二聚作用域等所连接(参见BoulterJM,GlickM,TodorovPT,BastonE,SamiM,RizkallahP,etal.Stable,solubleT-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng2003Sep；16(9):707-711.；CardKF,Price-SchiaviSA,LiuB,ThomsonE,NievesE,BelmontH,etal.Asolublesingle-chainT-cellreceptorIL-2fusionproteinretainsMHC-restrictedpeptidespecificityandIL-2bioactivity.CancerImmunolImmunother2004Apr；53(4):345-357；andWillcoxBE,GaoGF,WyerJR,O'CallaghanCA,BoulterJM,JonesEY,etal.ProductionofsolublealphabetaT-cellreceptorheterodimerssuitableforbiophysicalanalysisofligandbinding.ProteinSci1999Nov；8(11):2418-2423)。T细胞受体可与毒素、药物、细胞因子(参见US2013/0115191)、抗CD3域等效应细胞募集域等相连接，以对靶细胞产生特定功能。此外，T细胞受体可表达于过继性转移所用的T细胞中。
更详细信息参见WO2004/033685A1和WO2004/074322A1。sTCR的组合物使用报告于WO2012/056407A1。受体产生的更详细信息包含于WO2013/057586A1。
此外，此类受体可用于病理医师对活检标本所作的癌症诊断。
对呈递谱进行了测算以选择过量呈递肽，表明存在中度样本呈递和复制变异性。该图谱将相关肿瘤样本与正常组织样本(基线)相并列。由此可通过计算线性混合效应模型的p值将上述各谱用于过量呈递评分中(J.Pinheiro,D.Bates,S.DebRoy,SarkarD.,RCoreteam.Nlme:LinearandNonlinearMixedEffectsModels.2008)从而通过假发现率调整多项检验(Y.BenjaminiandY.Hochberg.ControllingtheFalseDiscoveryRate:APracticalandPowerfulApproachtoMultipleTesting.JournaloftheRoyalStatisticalSociety.SeriesB(Methodological),Vol.57(No.1):289-300,1995)。
使用质谱法进行HLA配体的鉴别和相对定量分析，对来自急速冷冻组织样本的HLA分子进行纯化，且分离HLA相关性肽。所分离的肽互相分开，用在线纳米电喷射离子化(nanoESI)液相色谱-质谱(LC-MS)试验对其序列进行鉴别。通过将NSCLC样本所记录的天然TUMAP的断裂谱与相应的合成参考肽同一序列的断裂谱相比较，对所产生的肽序列进行了验证。由于将肽直接鉴别为原发肿瘤HLA分子的配体，因此上述结果为所鉴别的肽在NSCLC患者原发肿瘤组织中的自然加工和呈递提供了直接证据。
专利发现平台v2.1(参见US2013-0096016等，以完整引用形式并入本文))可实现相关过量呈递肽候选疫苗的鉴别和选择(通过将癌症组织中的HLA限制性肽水平进行直接相对定量，与数种不同的肺癌组织器官相比较)。这一功能依赖于无标记型鉴别定量分析(使用经专利数据分析平台处理的LC-MS数据)的开发，结合了序列鉴别算法、谱聚类、离子计数、保留时间校正、电荷状态去卷积(deconvolution)和正态化。
确立了各个肽和样本的呈递水平(包括误差预估)。发现了仅呈递于肿瘤组织和在肿瘤组织(相比如非癌组织器官)中过量呈递的肽。
对从50份急速冷冻NSCLC肿瘤组织样本中获取的HLA-肽复合物进行了纯化，并用LC-MS对HLA相关性肽进行了分离和分析。
本项申请所含的所有TUMAPs均使用上述方法在原发NSCLC肿瘤样本中发现，证实其在原发NSCLC中的呈递。
通过对无标记LC-MS数据进行离子计数对多种NSCLC肿瘤和正常组织中的TUMAPs进行了定量分析。该方法假定肽的LC-MS信号面积与其在样本中的含量相关。多种LC-MS试验中的所有肽定量信号均按集中趋势和每个样本的平均值进行正态化，并绘制为条形图，该图即为呈递谱。呈递谱结合了多种不同的分析方法，例如蛋白质数据库搜索、谱聚类、电荷状态去卷积(去电荷)、保留时间校正和正态化。
因此本发明涉及由从SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92或其变异序列组(与SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92至少90％同源(优选为同一))中所选择的序列所组成的肽，且上述变异序列可引发T细胞与上述肽的交叉反应，其中上述肽为非全长多肽。
本发明还涉及由從SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92或其變異序列組(與SEQIDNo.1至SEQIDNo.65和SEQIDNo.76至SEQIDNo.84至少90％同源(优选为同一))中所選擇的序列所組成的肽。其中，上述肽或其变异体的总长度为8至100个氨基酸(优选为8至30个，最优选为8至14个)。
T本发明还涉及根据本发明所述的、可与人主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类相结合的肽。
本发明还涉及根据本发明所述的肽，此类肽由(或本质上由)SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92氨基酸序列所组成。
本发明还涉及根据本发明所述的肽，此类肽经过修饰且/或包含非肽键。
本发明还涉及根据本发明所述的肽，此类肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关性不变链(Ii)的N末端氨基酸相融合的蛋白，或与某种抗体(或其序列)(例如树突细胞特异性抗体)相融合的蛋白。
本发明还涉及一种核酸，该核酸可编码根据本发明所述的肽(条件是该肽并非完整人体蛋白)。
本发明还涉及根据本发明所述的核酸，该核酸为DNA、cDNA、PNA、RNA或DNA、cDNA、PNA、RNA的组合形式。
本发明还涉及一种表达载体，该载体可表达根据本发明所述的核酸。
本发明还涉及一种根据本发明所述的肽、根据本发明所述的核酸或根据本发明所述的药用表达载体。
本发明还涉及根据本发明所述的、由核酸组成的一种宿主细胞，或根据本发明所述的一种表达载体。
本发明还涉及根据本发明所述的一种宿主细胞，须为抗原呈递细胞。
本发明还涉及根据本发明所述的一种宿主细胞，其中的抗原呈递细胞为树突细胞。
本发明还涉及根据本发明所述的一种肽的制备方法，该方法包括根据本发明所述的宿主细胞的培养，以及将肽从宿主细胞或其培养基中分离。
本发明还涉及活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外制备方法，该方法包括将体外CTL与抗原负载人I类或MHCII类分子(在适当的抗原呈递细胞表面表达该分子足够时间从而以抗原特异性方式活化上述CTL)相接触，其中所述抗原可为根据本发明所述的任何肽。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法，该方法将抗原载入表达于适当的抗原呈递细胞表面的I类或MHCII类分子中(通过将足量的抗原与抗原呈递细胞相接触)。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法，其中的抗原呈递细胞含有可表达上述包含SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84，以及SEQIDNo.92或其上述变异氨基酸序列的肽的表达载体。
本发明还涉及根据本发明所述的方法所制备的活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，可选择性地识别异常表达含有根据本发明所述的氨基酸序列的多肽的细胞。
本发明还涉及在患者中杀伤异常表达含有任何根据本发明所述的氨基酸序列的多肽的靶细胞的方法，包括根据本发明所述的方法给予患者有效数量的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
本发明还涉及一种药剂或药剂生产所使用的任何上述肽、根据本发明所述的核酸、根据本发明所述的表达载体、根据本发明所述的细胞或根据本发明所述的活化细胞毒性T淋巴细胞。
本发明还涉及根据本发明所述的用途，其中所述药剂为疫苗。
本发明还涉及根据本发明所述的用途，其中所述药剂具有抗肿瘤活性。
本发明还涉及根据本发明所述的用途，其中癌细胞为肺癌、胃癌、胃肠癌、结直肠癌、胰腺癌或肾癌细胞，以及成胶质细胞瘤细胞。
本发明还涉及基于根据本发明所述的肽的特定标记蛋白和生物标记物，可用于肺癌的预后。
此外，本发明还涉及上述新型靶标用于癌症治疗的用途。
本文所用的“抗体”是一个广义术语，包括多克隆与单克隆抗体。除了完整的或“全”免疫球蛋白分子外，“抗体”这一术语也包括此类免疫球蛋白的碎片或多聚体，或免疫球蛋白分子的人源化形式，只要其能产生本发明所期望的特性(例如肺癌标记物多肽的特异性结合、将毒素传递至肺癌标记物基因表达水平升高的肺癌细胞以及/或抑制肺癌标记物多肽的活性)。
本发明的抗体应尽可能购自市售途径。本发明的抗体也可通过常用的方法来制备。本领域技术人员会知晓全长肺癌标记物多肽或其碎片皆可用于生成本发明的肽。生成本发明的抗体所用的多肽可通过自然途径部分或完全纯化，也可通过重组DNA技术制得。
例如，编码ABCA13、MMP12、DST、MXRA5、CDK4、HNRNPH、TANC2、1RNF213、SMYD3和SLC34A2或SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84或SEQIDNo.92的任何相关多肽的cDNA(或其碎片)可在原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，其后可对重组蛋白进行纯化，用于产生单克隆或多克隆抗体制品，该抗体可与本发明中用于产生抗体的肺癌标记物多肽特异性地结合。
具备当前技术水平的人员知晓，产生至少2组单克隆或多克隆抗体可最大程度的确保所得抗体具备其预定用途所(例如ELISA免疫组织化学、体内影像分析、免疫毒素治疗)要求的特异性和亲合力。可依据抗体的预定用途采用已知方法(例如ELISA、免疫组织化学、免疫治疗等；有关抗体生成和检测的更为具体的指导请参见HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1988,new2ndedition2013等)对抗体的期望活性进行检测。例如，可使用ELISA分析、Western印迹或免疫组织化学染色对福尔马林固定的肺癌或冷冻组织切片进行抗体检测。在初次体外表征完成后，对计划用于治疗或体内诊断的抗体，应使用已知的临床检测方法进行检测。
本文所用“单克隆抗体”这一术语系指从本质上同源的抗体群中获取的抗体，即：该抗体群中的各抗体除了可能的少量天然突变外是完全相同的。本文中单克隆抗体具体还包括“嵌合”抗体，该抗体中的一部分重链和/或轻链与从特定物种获取的或属于特定的抗体类别或子类别的抗体的相应序列同一或同源，而剩余的链与从另一物种获取的或属于另一的抗体类别或子类别的抗体(以及此抗体的碎片)的相应序列同一或同源，只要该抗体可表现期望的抗肿瘤活性(美国专利编号4816567，以完整引用形式并入本文)。
本发明的单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备。采用杂交瘤方法时，通常用免疫剂对小鼠或其它适当的宿主细胞进行免疫，以使淋巴细胞生成或可以生成可与该免疫剂特异性结合的抗体。或者可以对淋巴细胞进行体外免疫。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法(例如美国专利编号4816567所描述的方法)制得。编码本发明的单克隆抗体的DNA可用传统的操作进行分离和测序(例如使用可与编码鼠抗体重链和轻链的基因相结合的寡核苷酸探针)。
体外方法也适用于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规方法将抗体分解为其碎片(特别是Fab碎片)。例如可用番木瓜蛋白酶进行分解。1994年12月22日发表的WO94/29348以及美国专利编号4342566均描述了番木瓜蛋白酶分解的示例。番木瓜蛋白酶分解抗体通常产生两个完全相同的抗原结合碎片(称为Fab碎片，各含一个单抗原结合位点)以及一个残留Fe碎片。胃蛋白酶处理可产生一个包含2个抗原结合位点且可与抗原进行交联的碎片。
抗体碎片(无论是否加入其它序列)也可包含特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定的修饰，只要与未修饰的抗体或抗体碎片相比该碎片的活性未被显著改变或损伤即可。这些修饰可产生某些附加特性，例如移除/加入可成二硫键的氨基酸以延长其生物寿命或改变其分泌特征等。任何情况下该抗体碎片均应具备生物活性特性，例如结合活性以及对结合域结合的调控等。可通过蛋白特定区域中的突变发生然后通过量表达以及所表达多肽的检测来识别抗体的功能或活性区域。此类方法为本领域技术人员所熟知，可包含编码抗体碎片的核苷酸的特定位点的突变。
本发明的抗体还可包含人源化抗体或人体抗体。非人(例如鼠类)抗体的人源化形式可为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其碎片(例如Fv、Fab、Fab'或抗体的其它抗原结合序列)，包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)残基被非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔)的CDR中具有期望的特异性、亲合力和能力的残基所取代。某些情况下人免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基可被相应的非人残基所取代。人源化抗体还可包含受体抗体、输入的CDR或框架序列中均不存在的残基。一般而言，人源化抗体包含至少1个(通常为2个)可变域，其中所有或几乎所有的CDR区域均与一种非人免疫球蛋白的CDR区域相对应，且所有或几乎所有FR区域均为人免疫球蛋白共有序列的FR区域。人源化抗体最好还包含免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一个片段。
非人抗体的人源化方法为本领域所熟知。一般而言，一种人源化抗体含有一个或多个氨基酸残基，该残基来源于非人途径。此类非人氨基酸残基常被称为“输入”残基，通常来源于“输入”可变域。本质上人源化通常可通过用相应的人体抗体序列取代啃齿类CDR或CDR序列来实现，由此产生的“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利编号4816567)，其中一个小于完整的人可变域的序列被来自非人物种的相应序列所取代。实际操作中，人源化抗体通常为人抗体，其中某些CDR残基(也有可能是某些FR残基)被源于啃齿类抗体中同类位点的残基所取代。
可使用即使不存在在内源性免疫球蛋白也可经免疫产生全部人抗体的转基因动物(例如小鼠)。例如，嵌合与种系突变小鼠的抗体重链链接区基因的纯合缺失可引发内源性抗体生成的完全抑制。而将人种系免疫球蛋白基因阵列转移至上述种系突变小鼠中可在抗原激发下产生人抗体。人抗体也可在噬菌体呈现文库中产生。
本发明的抗体优选为通过药用载体给予受试者。通常在制剂中使用适当剂量的药用盐，以使该制剂呈等渗性。药用载体包括生理盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，更优选为约7至约7.5。其它载体包括缓释制剂(例如含抗体的固体疏水多聚物的半渗透性基质溶液)，其基质为有形物，例如膜、脂质体或微粒。本领域的技术人员熟知，某些载体可为更优选(依据给药途径和所给予的抗体浓度等)。
抗体可注射(例如静脉注射、腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射)给予受试者、患者或细胞，也可通过其它途径(例如输注)，只要能保证抗体可以有效形式进入血流。抗体也可通过瘤内或瘤周途径给药，以产生局部和全身疗效反应。局部或静脉注射给药为优选。
抗体给药剂量和日程可在当前技术范围内按经验确定。本领域的技术人员知晓抗体的给药剂量会依据接受抗体的受试者类型、给药途径、所使用的抗体和其它药物的特定类型等而有所不同。依据上述因素，常见的抗体单用每日剂量从约每日1μg/kg至最高100mg/kg体重不等，也可能更高。肺癌治疗抗体给药后可通过技术熟练的相关人员所熟知的多种方式评估治疗用抗体的疗效。例如可通过标准肿瘤影像技术对接受治疗的受试者的肿瘤大小、数量和/或分布情况进行监测。若某一治疗性抗体可停止肿瘤生长、引发肿瘤缩小并/或防止肿瘤新生的治疗性抗体(相比于不进行抗体治疗的正常病程)，则可认为该抗体可有效治疗肺癌。
由于本发明的非肿瘤标记物ABCA13和MMP12在肺癌细胞中高度表达且在正常细胞中表达水平极低，因此抑制ABCA13和MMP12表达或多肽活性可作为NSCLC治疗或预防策略的一部分。
反义治疗原则基于下列假设：基因表达的序列特异性抑制(通过转录或翻译)可通过基因组DNA或mRNA与互补反义序列的细胞内杂交而实现。此杂交核酸双链体的形成可干扰编码目标肿瘤抗原的DNA的转录，或干扰目标肿瘤抗原mRNA的加工/转运/翻译和/或稳定性。
反义核酸可通过多种途径来传递。例如反义寡核苷酸或反义RNA可以肿瘤细胞可摄取的形式直接给予(例如通过静脉注射)受试者。或者可在体外将编码反义RNA(或RNA碎片)的病毒或质粒载体导入细胞中。也可通过有义序列引发反义效应；但表型变化的大小具有高度差异性。有效的反义治疗所引发的表型变化可根据变化来评估，例如通过靶mRNA水平、靶蛋白水平和/或靶蛋白活性水平。
具体举例而言，反义基因治疗抑制肺部肿瘤标记物功能可通过直接给予受试者反义肺部肿瘤标记物RNA而实现。反义肿瘤标记物RNA可通过标准技术产生和分离，但也可在高效启动子(例如T7启动子)的调控下通过反义肿瘤标记物cDNA在体外即刻制备。反义肿瘤标记物RNA的细胞内给药可通过以下任一直接核酸给药方法来进行。
抑制ABCA13和MMP12功能的另一种基因治疗策略涉及抗ABCA13、MMP12抗体或抗ABCA13、MMP12抗体片段的细胞内表达。例如可使编码某一可与ABCA13、MMP12多肽特异性结合并抑制其生物活性的单克隆抗体的基因在核酸表达载体中受到特异性(例如组织或肿瘤特异性)基因调控序列的转录调控。随后将该载体给予受试者以便肺癌细胞或其它细胞摄取，该细胞随后分泌抗ABCA13、MMP12抗体，以此抑制ABCA13、MMP12多肽的活性。ABCA13、MMP12多肽宜位于胃癌细胞的细胞外表面中。
在上述将外源DNA给予或摄入受试者细胞(例如通过基因转导或转染)的方法中，本发明的核苷酸可为裸DNA形式，或者核苷酸可通过载体传递至细胞中，以抑制胃部肿瘤标记物蛋白的表达。该载体可为市售制剂，例如腺病毒载体(QuantumBiotechnologies，Inc.(Laval，Quebec，Canada)。可通过多种机制将核苷酸或载体传递至细胞中。例如可使用LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-25BRL，Inc.，Gaithersburg，Md.)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.，Madison，Wis.)等市售脂质体制剂以及其它按照当前标准操作制备的脂质体进行脂质体传递。此外，本发明的核苷酸或载体可通过电穿孔法在体内传递，这一技术可购自Genetronics，Inc.(SanDiego，Calif.)，也可通过SONOPORATION仪器(ImaRxPharmaceuticalCorp.，Tucson，Arizona)来开展。
举例而言，可通过病毒系统(例如可包装一个重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统)进行载体传递。重组逆转录病毒随后可感染细胞，由此将可抑制ABCA13、MMP12表达的反义核苷酸传递至受染细胞中。当然，将改变的核苷酸导入哺乳动物细胞的具体方法不限于使用逆转录病毒载体。这一步骤所普遍采用的其它技术包括使用腺病毒载体、腺病毒伴随病毒(AAV)载体、慢病毒载体和假型病毒载体。也可使用物理传导技术，例如脂质体传递以及受体介导的和其它细胞内吞机制。本发明可与上述或任何其它常用的基因转移方法联合使用。
抗体也可用于体内诊断检测。一般而言，可用放射性核苷酸(例如111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)标记抗体，以使用免疫闪烁照相术进行肿瘤定位。在一实施方案中，抗体或其碎片可与至少2个ABCA13、MMP12靶标的细胞外域相结合，其亲合力值(Kd)低于1x10μM。
诊断抗体可用适于通过多种影像方法检测的探针来标记。探针检测方法包括但不限于荧光、自然光、共聚焦和电子显微镜；磁共振成像和磁共振波谱；荧光镜透视检查、计算机断层摄影和正电子发射断层摄影。适用的探针包括但不限于荧光素、罗丹明、曙红和其它荧光基团、放射性同位素、金、钆或其它镧系元素、顺磁离子、氟-18和其它正电子发射放射性核素。此外，上述探针可为双功能或多功能探针，且可用上述多种方法来检测。探针与抗体的结合方法包括探针共价结合、探针掺合入抗体、螯合物共价结合引发的探针结合以及其它常用的技术。用于免疫组织化学检测的病变组织样本可为新鲜或冷冻样本，也可为石蜡包埋样本或防腐剂(例如福尔马林)固定样本。固定或包埋切片样本与标记的初级抗体或次级抗体相接触，其中的抗体用于检测ABCA13、MMP12蛋白的原位表达。
因此本发明提出一种从SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92或其变异序列组(与SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92为90％同源)中所选择的序列所组成的肽，且上述序列或其变异序列可引发T细胞与上述肽的交叉反应。
本发明的肽具有与人主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类分子相结合的能力。
在本发明中，“同源的”这一术语系指两个氨基酸序列(即肽或多肽序列)之间的同一度(参见上文中的百分同一度)。上文所述“同源性”通过将两个序列在最优条件下排列在需比较的序列之上来评定。此序列同源性可通过使用ClustalW等算法来建立序列对比来计算。公共数据库中提供了常用的序列分析软件(体为VectorNTI，GENETYX)或其它分析工具。
技术熟练的人员有能力评估由特定的肽变异序列引发的T细胞是否可与肽本身交叉反应(Fongetal.,2001)；(Zarembaetal.,1997；Colombettietal.,2006；Appayetal.,2006)。
发明者所使用的特定氨基酸序列的“变异序列”是指一或两个氨基酸残基的侧链发生改变(例如通过用另一天然氨基酸残基的侧链或其它的侧链来取代该侧链)，但该肽仍可以与SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84以及SEQIDNo.92中特定氨基酸序列所组成的的肽基本相同的方式与HLA分子相结合。例如，某肽经修饰后至少可以维持(即使不能提高)与适当的MHC分子(例如HLA-A*02或-DR)的结合槽相反应和结合的能力，且至少可以维持(即使不能提高)与活化CTL的TCR相结合的能力。
上述CTL可与细胞进一步交叉反应，并可杀伤表达包含本发明所定义的关联肽的天然氨基酸序列的多肽。可从科学文献(Rammenseeetal.,1997)以及数据库(Rammenseeetal.,1999)推断，HLA结合肽中的某些位置是典型的锚定残基，可形成一个核心序列，该序列可装配至HLA受体的结合基序。这一过程由组成结合槽的多肽链的极性、电子物理学特性、疏水性和空间特性所决定。由此本领域技术人员可通过维持已知的锚定残基来修饰SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92所对应的氨基酸序列，并可确定此类变异序列是否可保持与MHCI或II类分子相结合的能力。本发明的变异序列可保留与活化CTL的TCR相结合的能力，后者可进一步与表达包含本发明所定义的关联肽的天然氨基酸序列的多肽的细胞交叉反应并杀死该细胞。
基本不参与与T细胞受体相互反应的氨基酸残可通过由另一氨基酸(其掺合基本不影响T细胞反应性且不消除与相关MHC的结合)取代来修饰。因此，除了上述条件外，本发明的肽可能是任何肽(发明者使用该术语时同时包含寡肽和多肽)，包含给定的氨基酸序列或其片段或变异序列。
表4：与SEQIDNO：1、2、4、5和7相对应的肽的变异序列和基序
较长的肽也可能适用。虽然MHCI类表型通常长度为8-11个氨基酸，但也有可能产生于包含实际表型的更长的肽或蛋白的加工。实际表型的侧面残基优选为基本不影响实际表型暴露所需的蛋白水解裂解的残基。
相应地，本发明也提出MHCI类表型的肽与变异序列，其中的肽或变异序列总长度为8至100个氨基酸(优选为8至30个氨基酸，最优选为8至14个，即8、9、10、11、12、13或14个氨基酸，而II类结合肽的长度也可为15、16、17、18、19、20,21或33个氨基酸)。
当然，本发明的肽或变异序列有能力与人主要组织相容性复合物(MHC)I类分子相结合。肽或变异序列与MHC的结合可由已知的方法来检测。
在本发明的一优选实施方案中，此类肽由(或本质上由)SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92氨基酸序列所组成。
“本质上包含”意指本发明的肽以及SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92所对应的序列或其变异序列包含额外的N或C末端氨基酸延伸，而该延伸对形成MHC分子表型所需的肽表型并非必需。
尽管如此，此类延伸有可能对根据本发明所述的肽有效导入细胞起到重要作用。在本发明的一优选实施方案中，肽可以是一种融合蛋白，例如含80个N末端氨基酸的HLA-DR抗原相关性不变链(p33，后面简称“Ii”)(衍生自NCBI，GenBank登记号X00497)。在其它融合中，本发明的肽可与本文所述的抗体(或其功能基团)(具体为抗体的序列)相融合，以此特异性的针对上述抗体，例如树突细胞特异性抗体。
此外，肽或变异序列可被进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子的结合强度，以此激发更强的免疫应答。肽序列的此种优化方法为该技术领域所常用，例如导入反向肽键或非肽键。
在反向肽键中，氨基酸残基不通过肽的(-CO-NH-)键合而连接，而是通过反向的肽键。此类逆向拟肽可由本领域已知的方法所制得，例如Meziereetal(1997)J.Immunol.159，3230-3237(通过引用并入本文)中所描述的方法。这一方法包括制备含有骨架(而不是侧链方向)变化的假肽。Meziere等人(1997)表明，上述假肽有助于MHC结合与辅助T细胞应答。包含NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆向肽对于蛋白水解更为耐抗。
非肽键包括-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、-CH2SO-等。美国专利4897445提出了一种多肽链中非肽键(-CH2-NH)固相合成的方法，其中涉及通过标准操作合成多肽，以及在NaCNBH3的参与下通过氨基醛与氨基酸反应来合成非肽键。
组成上述序列的肽可通过在其氨基和/或羧基端加入化学基团来合成，以此提高肽的稳定性、生物利用度和/或对肽的亲合力。例如可在肽的氨基末端加入芐氧羰基、丹酰基或t-叔丁氧羟基等疏水基团。类似地，可在肽的氨基末端加入乙酰基或9-芴甲氧羰基。此外，可在肽的羧基末端加入疏水基团、t-叔丁氧羟基或氨基。
本发明的肽也可通过改变其空间构型来合成。例如可使用肽的一种或多种氨基酸残基的D-异构体(而不是常见的L-异构体)。此外，本发明的肽的至少一个氨基酸残基可被一种常见的非天然氨基酸残基所取代。此类改变可提高本发明的肽的稳定性、生物利用度和/或结合活性。
类似地，本发明的肽或变异序列可通过与特定的氨基酸进行化学反应(在该肽的合成前后均可)来修饰。此类修饰的实施例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《ChemicalReagentsforProteinModification》(3rded.CRCPress,2005)(通过引用并入本文)对其进行了汇总。氨基酸的化学修饰包括但不限于酰化、胍基化、赖氨酸吡哆酸化、还原烷基化、用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)进行氨基的三硝基苯基化、羧基的酰胺修饰、通过半胱氨酸氧化为磺丙氨酸进行巯烃基修饰、汞衍生物的形成、与其它巯基化合物形成混合二硫化物、与马来酰亚胺反应、碘乙酸或碘乙酸胺引起的羧甲基化以及碱性环境下氰酸盐所引起的氨基甲酰化。有关蛋白化学修饰的更多方法，技术人员参考了《蛋白质科学最新技术方案》第15章，Eds.Coliganetal.(JohnWileyandSonsNY1995-2000)。
简而言之，蛋白中精氨酰残基等的修饰一般基于邻近的二碳化合物(例如苯乙二醛、2，3-丁二酮和1,2-环己二酮)以形成加成物。另例如甲基乙二醛与精氨酸残基的反应。半胱氨酸不经其它亲核位点(例如赖氨酸和组氨酸)的伴随修饰也可进行修饰，因此可用于半胱氨酸修饰的试剂数量众多。Sigma-Aldrich等公司的网站(http://www.sigma-aldrich.com)提供了特定试剂的信息。
蛋白二硫键的选择性还原也较常见。二硫键可在生物药物的热处理过程中形成和氧化。
Woodward试剂K可用于修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-(二甲氨)丙基)-N’-碳酰二亚胺可用于形成赖氨酸残基和谷氨酸残基间的分子内交联。
例如，焦碳酸二乙酯试剂可用于修饰蛋白中的组氨酸残基。组氨酸也可用4-羟基-2-壬烯醛来修饰。
赖氨酸残基和其它α-氨基的反应有助于肽结合至蛋白/肽表面或与蛋白/肽的交联等。赖氨酸是聚(乙烯)乙二醇的附着位点，且是蛋白糖基化的主要修饰位点。
蛋白中的甲硫氨酸残基可用碘乙酰胺、溴乙胺和氯胺-T来修饰。
四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸残基的修饰。二酪氨酸形成所产生的交联可通过过氧化氢/铜离子来实现。
近期的色氨酸修饰研究使用了N-溴代琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基溴化苄或3-溴基-3-甲基-2-(2-硝苯巯基)-3H-吲哚(BPNS-甲基吲哚)。
治疗用蛋白和肽成功的PEG修饰常涉及循环半衰期的延长。蛋白与戊二醛、丙烯酸聚乙二醇以及甲醛的交联用于水凝胶的制备。常通过氰酸钾氨的甲酰化来实现变应原化学修饰用于免疫治疗。
本发明实施方案中优选采用经过肽修饰的或包含非肽键的肽或变异体。一般而言，肽或变异体(至少为氨基酸残基间存在肽链合的肽或变异体)可通过Fmoc-聚酰胺固相肽合成法(如Lu等人(1981年)和本文的参考文献所述)来合成。9-芴甲氧羰基(Fmoc)可为时序N氨基提供保护。使用N，N-二甲基酰胺的20％哌啶溶液来进行这一高度碱基不稳定的保护基团的重复裂解。侧链功能的保护形式可为其丁基醚(丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的情况)、丁基酯(谷氨酸和天冬氨酸的情况)、叔丁氧羟基衍生物(赖氨酸和组氨酸的情况)、三苯甲基衍生物(半胱氨酸的情况)以及4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺基衍生物(精氨酸的情况)。若谷氨酸或天冬氨酸为C末端残基，则使用4，4'-二甲基联苄来保护其侧链氨功能。固相支持的基础是由三种单体构成的聚二甲基-丙基酰胺聚合物：二甲基丙基酰胺(骨架单体)、二丙烯酰乙烯二胺(交联剂)和丙烯酰肌氨酸甲基酯(功能化剂)。所使用的肽-树脂可裂解连接剂为酸敏感性4-羟甲基-苯氧乙酸衍生物。加入的所有氨基酸衍生物皆为其预形成的对称酐衍生物，天冬氨酸和谷氨酸除外(其加成使用反向N，N-二环己基-碳化二亚胺/羟基苯并三唑介导的耦合程序)。所有耦合和脱保护反应均通过茚三酮、三硝基苯磺酸或异荷素检测程序来检测。合成完成后，肽被从树脂支承中裂解开，同时使用含50％清除剂混合物的95％三氟乙酸处理来移除侧链保护基团。常用的清除剂包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，具体的选择取决于所合成肽的组成氨基酸。也有可能将固相和溶液相方法联合用于肽合成(参见(Bruckdorferetal.,2004)及其所引用的参考文献等)。
三氟乙酸通过真空蒸发来去除，随后用二乙醚来碾制粗肽。留存的清除剂采用单一萃取程序来去除，随后将液相冻干制成不含清除剂的粗肽。肽合成所需的制剂基本可购自Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd,NottinghamNG72QJ,UK等。
可采用以下一种或多种技术组合进行纯化：再结晶、分子筛析色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和(通常为)反相高效液相色谱(采用乙腈/水梯度分离)。
可使用薄层色谱、电泳(特别是毛细管电泳)、固体萃取(CSPE)、反相高效液相色谱、酸水解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析，以及MALDI和ESI-Q-TOF质谱分析。
本发明的另一方面提出一种可编码本发明肽或肽变异体的核苷酸(例如多聚核苷酸)。此多聚核苷酸可为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合等，单链或双链皆可，或为多聚核苷酸的天然或稳定化形式，例如包含一个磷硫酰骨架的多聚肽。只要能编码所对应的肽，该多聚核苷酸包不包含内含子皆可。当然，多聚核苷酸仅可编码含由天然肽键结合的天然氨基酸残基的肽。本发明的另一方面提出一种可表达根据本发明所述的多肽表达载体。
已开发了多种方法以使多聚核苷酸(特别是DNA)与载体相连接，例如通过互补性粘性末端。举例而言，可在插入载体DNA的DNA片段中加入互补性同聚体区。该载体和DNA片段随后通过互补性同聚体尾之间的氢键来连接，以形成重组DNA分子。
包含一个或多个限制位点的合成连接子是DNA片段与载体相连接的另一种方法。包含多个限制位点的合成连接子可从多个渠道购得，例如InternationalBiotechnologiesInc.NewHaven,CN,USA。
编码本发明的多肽的DNA的理想修饰方法之一使用聚合酶链式反应，如(Saikietal.,1988)所述。该方法可用于将DNA导入合适的载体(例如合适限制位点的操作)，也可用于在常见的技术中进行DNA修饰。若使用病毒载体，则宜使用痘病毒或腺病毒载体。
DNA(逆转录病毒载体则为RNA)可在合适的宿主中表达以产生含有本发明的肽或变异序列的多肽。因此可使用编码本发明的肽或变异序列的DNA，按已知的技术(根据本文作适当改进)来构建表达载体，该载体随后用于转化合适的宿主细胞使其表达和产生本发明的多肽。上述技术包括美国专利号4440859、4530901、4582800、4677063、4678751、4704362、4710463、4757006、4766075和4810648所述的技术。
编码本发明化合物的组成多肽的DNA(逆转录病毒载体则为RNA)可与许多其它DNA序列相结合以导入合适的宿主。伴侣DNA的选择取决于宿主的性质、将DNA导入宿主的方式以及是否需要附加型维持或整合。
一般而言，DNA以适当的方向和按正确的表达阅读框插入表达载体(例如质粒)。如有必要，可将DNA与适当的转录或翻译调控核苷酸序列(由期望的宿主所识别)相连接，虽然此类调控通常在表达载体中已存在。随后使用标准技术将载体导入宿主中。一般而言，并非所有宿主都会被载体所转化。因此有必要选择被成功转化的宿主细胞。有一种选择技术涉及使用任何必要的控制元素将一个DNA序列掺入表达载体中，该DNA序列可编码转化细胞的可选择特征(例如抗生素耐抗)。
此类可选择特征的基因也可位于用于共转化期望的宿主细胞的另一载体中。
经本发明的重组DNA转化的宿主细胞随后按本文的指导在适当的条件下(该条件为技术熟练人员所熟知)培养足够长时间以实现多肽的表达，随后可回收此多肽。
已知有多种表达系统，包括细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)、酵母(例如啤酒酵母)、丝状真菌(例如曲霉属)、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。该系统优选为哺乳动物细胞，例如ATCC细胞生物学收集库中的CHO细胞。
用于组成型表达的典型哺乳动物细胞载体质粒包含带有一个适当的polyA尾和抗性标记的CMV或SV40启动子，例如新霉素。例如可购自Pharmacia,Piscataway,NJ,USA的pSVL。诱导性哺乳动物表达载体包括pMSG(也可购自Pharmacia)。有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416，通常可购自StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA。pRS403、pRS404、pRS405和pRS406质粒属于酵母整合型质粒(YIP)，掺入了酵母可选择标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒属于酵母中心粒质粒(Ycp)。含CMV启动子的载体(例如Sigma-Aldrich供应的载体)可产生顺势或稳定表达、细胞质表达或分泌，以及多种FLAG、3xFLAG、c-myc或MAT组合形式的N末端或C末端标记。此类融合蛋白可实现重组蛋白的检测、纯化和分析。双标记融合可使检测具有灵活性。
强效人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区可使COS细胞中组成蛋白的表达水平高达1mg/L。而较弱细胞系的蛋白水平通常为约0.1mg/L。存在SV40复制起点可在SV40复制受纳COS细胞中引发高水平的DNA复制。CMV载体可含有细菌细胞中的pMB1(pBR322衍生物)复制起点、细菌中氨苄西林耐抗选择的b-内酰胺酶基因、hGHpolyA以及f1起点。胰蛋白酶原前前导(PPT)序列的载体可将FLAG融合蛋白的分泌导入培养基中，以使用抗-FLAG抗体、树脂和板进行纯化。其它载体和表达系统使用该技术领域常用的多种宿主细胞。
在另一实施方案中，本发明的两种或两种以上的肽或肽变异体被编码并相继表达(类似于“线珠”(beadsonastring)结构)。由此可将肽或肽变异体与连接氨基酸的延伸基团(例如LLLLLL)相连接或融合，其间没有任何其它肽时,也可相连接。
本发明还涉及一种由本发明的一种多聚核苷酸载体结构所转化的宿主细胞。该宿主细胞可为原核或真核细胞。某些情况下，细菌细胞是优先使用的原核宿主细胞，通常是大肠杆菌株，例如大肠杆菌DH5菌种，可购自BethesdaResearchLaboratoriesInc.,Bethesda,MD,USA以及RR1菌种，可供自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD,USA(NoATCC31343)。优先选用的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，例如小鼠、大鼠、猴或人成纤维细胞或结肠细胞系。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，通常可购自StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA。优先选用的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCCCCL61细胞系)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(ATCCCRL1658)、猴肾源COS-1细胞(ATCCCRL1650细胞系)以及293细胞(人真核肾脏细胞)。优先使用的昆虫细胞包括Sf9细胞(可通过杆状病毒表达载体转染)。合适的表达用宿主细胞的选择的综述可参见PaulinaBalbás和ArgeliaLorence的教科书《分子生物技术重组基因表达的方法：综述与方案》第2版第1部分，ISBN978-1-58829-262-9，以及为熟练人员所知的其它文献。
通过本发明的DNA结构对宿主细胞进行适当的转化可通过常见的方法来实现，该方法通常依赖于所使用的载体类型。原核宿主细胞转化方面的信息可参见Cohenetal(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,2110以及Sambrooketal(1989)MolecularCloning,ALa-boratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY等。酵母细胞的转化方法参见Shermanetal(1986)MethodsInYeastGenetics,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY。Beggs(1978)Nature275,104-109所提供的方法同样有用。脊椎动物细胞方面，可用于转染该类细胞的试剂(例如磷酸钙和DEAE-乙基葡聚糖或脂质体制剂)可购自StratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.,Gaithersburg,MD20877,USA。电穿孔也可用于细胞的转化和/或转染，该方法常用于酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞转化技术中。
成功转化的细胞(即包含本发明的DNA结构的细胞)可通过常见的PCR等技术来识别，或者可使用抗体来检测上清液中的蛋白质。
有价值的是,本发明的某些宿主细胞(例如细菌、酵母和昆虫细胞)可用于本发明的肽的制备。但其它宿主细胞也可能用于某些治疗方法。例如，抗原呈递细胞(例如树突细胞)有可能用于表达本发明的肽，此肽可能被载入适当的MHC分子中。因此本发明提出根据本发明所述的包含氨基酸的宿主细胞或表达载体。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞或抗原呈递细胞。载入了含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白的APC(Sipuleucel–T)目前正研究用于治疗前列腺癌(Smalletal.,2006；Rinietal.,2006)。
本发明的另一方面还包括一种肽或其变异体的制备方法，该方法包括培养宿主细胞以及将肽从宿主细胞或其培养基中分离。
在另一实施方案中，本发明的肽、核酸或表达载体被用于药物中。例如，可将肽或其变异体制成静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂和肌肉(i.m.)注射剂。优先选用的肽注射方法包括皮下、皮内、腹膜内和静脉注射。优先选用的DNA注射方法包括皮内、肌肉、皮下、腹膜内和静脉注射。所给予的肽或DNA剂量可为50μg至1.5mg之间(优选为125μg至500μg之间)，具体取决于肽或DNA类型。该剂量范围在既往试验中曾被成功使用(WalteretalNatureMedicine18,1254–1261(2012))。
本发明的另一方面包括一种体外制备活化T细胞的方法，该方法涉及将体外T细胞与负载抗原的人MHC分子相接触，该分子在合适的抗原呈递细胞表面表达足够长的时间以抗原特异性地激活T细胞，其中所述抗原为根据本发明所述的肽。宜采用抗原呈递细胞使用足量的抗原。
理想情况下哺乳动物应缺少或具备降低的TAP肽转运体水平或功能。缺少TAP肽转运体的合适细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP是与抗原加工相关的转运体。
可携带缺失T2细胞系的人体肽参见美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland20852,USA)目录号CRL1992；Drosophila细胞系Schneider细胞系2可参见ATCC目录号CRL19863；小鼠RMA-S细胞系详情参见Karreetal1985。
理想情况下，转染前的宿主细胞应基本不表达MHCI类分子。优先使用一种刺激细胞，该细胞可表达对于T细胞共刺激信号(例如B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA3)具有重要作用的分子。许多MHCI类分子和共刺激分子的核酸序列可参见公共的GenBank和EMBL数据库。
若将MHCI类表型用作抗原，则T细胞为CD8阳性CTL。
若将抗原呈递细胞转染用于表达上述表型，则该细胞宜包含可表达含SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92序列的肽(或其变异氨基酸序列)的表达载体。
另有数种方法可用于体外制备CTL。例如Peoples等人(1995)和Kawakami等人(1992)所描述的方法使用自体肿瘤浸润淋巴细胞来制备CTL。Plebanski等人(1995)使用自体外周血淋巴细胞(PLB)制备CTL。Jochmus等人(1997)描述了通过用肽或多肽冲击树突细胞(或通过重组病毒感染)来制备自体CTL。Hill等人(1995)和Jerome等人(1993)使用B细胞制备自体CTL。此外，经肽或多肽冲击或经重组病毒感染的巨噬细胞也可用于制备自体CTL。S.Walter等人(2003)描述了使用人工抗原呈递细胞(aAPC)来体外激发T细胞，这种方法也适用于制备抗首选肽的T细胞。该研究中通过将预成MHC/肽复合物耦合至聚苯乙烯粒子(微珠)表面(通过生物素/抗生蛋白链霉素生物化学机制)来产生aAPC。该系统可实现aAPC中MHC密度的精准控制，由此可从血液样本中选择性地高效激发高亲合力或低亲合力的抗原特异性T细胞应答。除MHC/肽复合物外，aAPC还应携带其它具有共刺激活性的蛋白(耦合至aAPC表面)，例如抗CD28抗体。此外，此类aAPC系统常需要加入适当的可溶性因子，例如白介素-12等细胞因子。
也可使用同种异体细胞来制备T细胞，其中一种方法详述于WO97/26328(通过引用而成为本文的一部分)。举例而言，除Drosophila细胞和T2细胞外，其它细胞也可用于抗原呈递，例如CHO细胞、感染杆状病毒的昆虫细胞、细菌、酵母、感染牛痘的靶细胞等。此外还可使用植物病毒(参见Portaetal(1994)等)，该文献描述了将豇豆花叶病毒开发为外源性肽呈递的高产系统。
靶标为本发明的肽的活化T细胞可用于治疗。因此本发明的另一方面提出可通过本发明上述方法获得的活化T细胞。
通过上述方法制得的活化T细胞可选择性地识别异常表达一种含有SEQIDNo.1至SEQIDNo.92(优选为SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92)氨基酸序列的多肽的细胞。
优选情况是，T细胞通过其TCR与HLA/肽复合物相互反应(例如结合)来识别细胞。T细胞可用于一种靶细胞杀伤方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明氨基酸序列的多肽，且患者接受有效数量的活化T细胞。患者接受的T细胞可来源于患者自身并通过上述方法活化(即为自体T细胞)。该T细胞也可并非来自患者自身而是来自另一个体。当然，该个体优选为健康个体。发明者所用“健康个体”系指个体的总体健康状况良好，优选为具有完备的免疫系统，更优选为未患有易于检测或发现的疾病。
在体内，根据本发明所述的CD8阳性T细胞的靶细胞可为肿瘤细胞(某些情况下表达MHCII类)和/或肿瘤(肿瘤细胞)周围的间质细胞(某些情况下也可表达MHCII类；(Dengjeletal.,2006))。
本发明的T细胞可用作治疗组分中的活性成分。因此本发明还提出一种靶细胞杀伤方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明氨基酸序列的多肽，且患者接受有效数量的活化T细胞(如上文所定义)。
发明者使用“异常表达”系指多肽相比于正常表达水平过量表达，或在肿瘤中表达的基因在肿瘤组织标本中沉默。发明者使用“过量表达”系指多肽的表达水平至少为正常组织中的1.2倍，优选为正常组织中的至少2倍，更优选为至少5倍或10倍。
T细胞可通过本领已知的技术方法制得，例如上文所述方法。
T细胞的所谓过继性转移方法为常见的技术方法。其综述可参见(Gattinonietal.,2006)和(Morganetal.,2006)。
本发明的任何分子(即肽、核苷酸、抗体、表达载体、细胞、活化CTL、T细胞受体或其编码核苷酸)均可用于治疗特征为细胞逃脱免疫应答的疾病。因此本发明的任何分子均可能用作药剂或用于药剂生产。上述分子可单独使用或与本发明的其它分子或已知的分子结合使用。
优选情况是，本发明的药剂是一种疫苗。该疫苗可直接给予患者的病变器官或通过皮内、肌肉、皮下、腹膜内和静脉全身给药；或离体作用于源自患者的细胞或人细胞系中，随后将该细胞或细胞系给予患者；或在体外作用于源自患者的免疫细胞亚群，随后将该免疫细胞再次给予患者。若在体外给予细胞核苷酸，则将细胞转染以共表达免疫刺激细胞因子(例如白介素2)可能有所帮助。所用的肽可为基本纯净或与免疫刺激辅剂(见下文)联合使用，或通过合适的传递系统(例如脂质体)来给药。肽也可与合适的载体(例如钥孔戚血蓝素或甘露聚糖)相结合(参见WO95/18145和Longenecker,1993)。肽也可进行标记，可为融合蛋白，也可为杂交分子。根据本发明所述的序列所编码的肽预期可刺激CD4或CD8T细胞，但刺激CD8CTL在CD4辅助T细胞的协助下更为高效。因此，对于刺激CD8CTL的MHCI类表型而言，使用融合伴侣或杂交分子剖面可适当产生刺激CD4阳性T细胞的表型。CD4和CD8刺激表型在相关技术领域常见，包括本发明所提出的表型。
一方面，疫苗包含SEQIDNo.1至SEQIDNo.92至少一个氨基酸序列所编码的肽，以及至少一种附加肽，优选为2至50个附加肽，更优选为2至25个，再更优选为2至20个，最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个。肽可源自一种或多种特异性TAA，且可与MHCI类分子相结合。
另一方面，疫苗包含SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92至少一个氨基酸序列所编码的肽，以及至少一种附加肽，优选为2至50个附加肽，更优选为2至25个，再更优选为2至20个，最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个。肽可源自一种或多种特异性TAA，且可与MHCI类分子相结合。
多肽可为基本纯净，或包含在合适的载体或传递系统中。核苷酸可为DNA、cDNA、PNA、RNA或DNA、cDNA、PNA、RNA的组合(Pascoloetal.,2005)。多聚核苷酸疫苗易于制备，但此类载体诱导免疫应答的作用方式尚不完全清楚。合适的载体和传递系统包括病毒DNA和/或RNA，例如腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒系统，或含有多种病毒原件的杂交体。非病毒传递系统包括阳离子脂质和阳离子多聚体，此类系统为DNA传递技术所常见。也可使用物理传递方法，例如“基因枪”。由核酸编码的肽可为融合蛋白，例如含有刺激T细胞相应CDR的T细胞的表型的融合蛋白。
本发明的药剂也可含有一种或多种辅剂。辅剂是指可非特异性地提高或增强对抗原的免疫应答(例如CTL和辅助T(TH)细胞所介导的免疫应答)的物质，因此可认为对本发明的药剂有用。合适的辅剂包括但不限于1018ISS、铝盐、AS15、BCG、CP-870，893、CpG7909、CyaA，dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特瑞奎莫特、ImuFactIMP321、IL-2、IL-13、IL-21等白介素、干扰素-α或干扰素-β或其PEG化衍生物、IS贴剂、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酸类脂A、山小星蒜碱IMS1312、山小星蒜碱ISA206、山小星蒜碱ISA50V、山小星蒜碱ISA-51、油包水和水包油乳剂、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、载体系统、聚羟基乙酸共聚物[PLG]和葡聚糖微利、乳铁传递蛋白SRL172、病毒小体或其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、AquilaQS21促病毒素(衍生自皂角苷)、分支杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物，以及其它专利辅剂例如Ribi'sDetox、Quil或Superfos。优选佐剂如：Freund或GM-CSF。针对树突细胞的数种免疫辅剂(例如MF59)及其制剂曾有报告(AllisonandKrummel,1995；AllisonandKrummel,1995)。此外可使用细胞因子。已发现数种细胞因子可直接影响树突细胞迁移至淋巴组织(例如TNF-)，由此加速树突细胞成熟为T淋巴细胞高效抗原呈递细胞(例如GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利编号5849589，特别以完整引用形式并入本文)并起到免疫辅剂的作用(例如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich,1996)。
也有报告称CpG免疫刺激性寡核苷酸可增强疫苗中辅剂的作用。不受理论约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要是TLR9)产生激活先天(非适应性)免疫系统。CpG触发的TLR9活化可增强对一系列抗原的抗原特异性体液性或细胞性应答，包括肽或蛋白抗原、活病毒或死病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，该活化可促进树突细胞成熟和分化，引发TH1细胞活化和强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成的增多(即使不存在CD4T细胞的协助)。即使存在通常促进TH2偏倚的不完全弗氏佐剂(IFA)，TLR9刺激所引发的TH1偏倚仍可以维持。CpG寡核苷酸与其它辅剂联合给药时或在微粒、毫微粒、脂质乳剂或类似制剂中可产生更高的辅助活性，这对于效力相对较弱的抗原引发较强的应答尤为必要。CpG寡核苷酸还可加速免疫应答并确保抗原剂量降低约2个数量级，其所产生的抗体应答与不使用CpG的某些试验中的全剂量疫苗相当(Krieg,2006)。美国6406705B1号专利描述了CpG寡核苷酸、非核苷酸辅剂和抗原联合使用以引发抗原特异性免疫应答。一种CpGTLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其它TLR结合分子，例如RNA结合性TLR7、TLR8和/或TLR9。
其它有用的辅剂还包括但不限于化学修饰的CpGs(例如CpR，Idera)、dsRNA类似物(例如聚(I：C))及其衍生物(例如聚(ICLC)、聚(IC-R)、聚(I：C12U))、非CpG细菌DNA或RNA，以及免疫活性小分子和抗体，例如环磷酰胺、舒尼替尼、西乐葆、NCX-4016、昔多芬、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、驮瑞塞尔、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF陷阱、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、其它针对免疫系统关键结构的抗体(例如抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)以及SC58175(可起到治疗作用并/或用作辅剂)。本领域技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。
优先选用的辅剂包括咪喹莫特、瑞奎莫特、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、干扰素-α、CpG寡核苷酸及衍生物、聚(I：C)和衍生物、RNA、昔多芬以及含有PLG或病毒小体的颗粒剂型。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组成中的辅料选自一组集落刺激因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙漠司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特、瑞奎莫特和干扰素-α。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组成中的辅料选自一组集落刺激因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙漠司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特和瑞奎莫特。
在根据本发明的药物组合物的一个优选实施方案中，辅剂为环磷酰胺、咪喹莫特或瑞奎莫特。.
更为优先使用的辅剂为山小星蒜碱MS1312、山小星蒜碱ISA206、山小星蒜碱ISA50V、山小星蒜碱ISA-51、聚-ICLC以及抗-CD40mAB或上述辅剂的组合物。
这一组成用于经肠给药，例如皮下、皮内、肌肉或口服给药。为方便给药，肽或其它分子溶解或混悬于药用、优选为液体的载体中。此外，药物组合物可包含辅料(例如缓冲剂、结合剂、爆炸剂、稀释剂、增味剂、润滑剂等)。肽也可与免疫刺激物质(例如细胞因子)联合给药。此药物组合物可用辅料的更广泛的列表可参见A.Kibbe,HandbookofPharmaceuticalExcipients,3rdEd.,2000,AmericanPharmaceuticalAssociationandpharma-ceuticalpress等。此组合物可用于腺瘤样或癌性疾病的预防和/或治疗。典型的制剂可参见EP2113253等。
尽管如此，根据本发明的肽的数量和物理化学性质，需进行进一步研究以产生肽的特定组合制剂，特别是含超过20个肽、稳定期超过12至18个月的组合制剂。
本发明提出一种可用于治疗癌症的药剂，特别是非小细胞肺癌、胃癌、肾细胞癌、结肠癌、腺癌、前列腺癌、良性肿瘤和恶性黑素瘤。
本发明还涉及下列药盒：
(a)包含上述药物组合物的包装，可为溶液或冻干剂型；
(b)(非必需)包含冻干制剂的稀释剂或复溶溶液的次级包装；
(c)(非必需)(i)溶液使用或(ii)冻干制剂复溶和/或使用说明书。
该药盒还可包含(iii)缓冲剂、(iv)稀释剂、(v)过滤器、(vi)针头或(v)注射器中的一种或多种。包装优选为药瓶、西林瓶、注射器或是试管，可为多用途包装。药物组合物优选为冻干制剂。
本发明的药物包装宜包含本发明的冻干制剂(带有合适的包装及其复溶和/使用说明书)。合适的包装包括药瓶、西林瓶(例如双腔西林瓶)、注射器(例如双腔注射器)和试管。理想情况下药盒和/或包装应在包装上或包装中加入复溶和/或使用说明。例如，可在标签中注明应将冻干制剂复溶至上述肽浓度。可在标签中进一步注明该制剂可用于或预定用于皮下给药。
存放制剂的包装可为多用途西林瓶，以便进行复溶制剂的重复给药(例如2-6次给药)。药盒中可包含另一装有适当稀释剂(例如碳酸氢钠溶液)的包装。
将稀释剂和复溶制剂混合后所得的最终复溶制剂中的肽浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(＝75μg)且不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。药盒中还可包含其它销售和使用者方面的材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和包含使用说明的说明书。
本发明的药盒可为根据本发明所述药物组合物制剂的单一包装，含有或不含有其它成分(例如其它化合物或这些化合物的药物组合物)皆可，也可为每一成分提供独立的包装。
理想情况下，本发明的药盒包含本发明的一种制剂，用于与另一化合物(例如辅剂(GM-CSF等)、化疗药物、天然制品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或血管生成抑制剂、雕亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合给药。在患者给药前，药盒的成分可为预混合，也可为每一成分提供独立包装。药盒的成分可为一种或多种液体溶液，优选为水性溶液，更优选为无菌水性溶液。药盒成分也可为固体，可通过加入适当的溶剂来转换为液体，该溶剂宜保存在另一独立包装中。
治疗药盒的包装可为西林瓶、试管、细颈瓶、药瓶、注射器或包封固体或液体的任何其它装置。通常情况下，若存在不止一种成分，则药盒会包含另一西林瓶或其它包装，以便于分开给药。药盒也可包含另一包装用于存放药用液体。理想情况下，治疗药盒应包含一种装置(例如一个或多个针头、注射器、滴眼管、移液管等)，用于该药盒组分中本发明药物的给药。
本制剂允许用任何可接受的途径(例如口服(肠内)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌肉、静脉或经皮给药)进行肽的给药。优先使用皮下给药，皮内给药最宜使用输注泵。
由于本发明的肽分离自NSCLC，因此本发明的药剂优选用于治疗NSCLC。在一个优选实施方案中，由于源自ABCA13和MMP12的本发明的肽分离自NSCLC，因此本发明的药剂宜用于治疗NSCLC。
序列为SEQIDNos.78至92的肽分离自Merkel细胞癌，因此可用于治疗Merkel细胞癌。
现将在以下示例(描述其优先使用的实施方案)中介绍本发明，但不限于这些示例。出于本发明的目的，所有参考文献均以完整引用形式并入本文。
附图简要说明
图1：原发肿瘤样本NSCLC898中ABCA13-001的呈递情况：ABC13-001典型质谱图。对从NSCLC样本898洗脱的肽池进行NanoESI-LCMS。m/z543.8318±0.001Da,z＝2的质谱图呈现保留时间为86.36min的肽峰。B)质谱图中86.36min处的检测峰代表MS谱中的m/z543.8318信号。C)nanoESI-LCMS试验中特定保留时间处所记录的m/z543.8318选定前体的碰撞衰变质谱证实NSCLC898肿瘤样本中存在ABCA13-001。D)记录了合成型ABCA13-001参考肽的裂解谱并与C中所生成的天然TUMP裂解谱相比较，以进行序列验证。
图2：选定蛋白在正常组织和21份肺癌样本中的表达谱
a)ABCA13(ProbesetID：1553605_a_at)
b)MMP12(ProbesetID：204580_at)
图3：选定HLAI类分子的呈递谱。测算了每种肽的表达谱，给出样本平均表达量以及重复检测方差。谱中将相关的肿瘤样本与正常组织样本(基线)相并列。
a)ABCA13-001
b)DST-001
c)MXRA5-001
图4：I类TUMAPs肽特异性体外免疫原性的典型结果。特异性CD8+T细胞用连接两种不同荧光色素的HLA多聚体来染色。点状图代表刺激肽的MHC多聚体双阳性肽群(左图)以及相应的阴性对照刺激(右图)。
图5：POSTN-002和MMP12-002对所研究的HLA单倍型的结合特性。图示为POSTN-002和MMP12-002对7种接受分析的HLA-DR单倍型中的5种的结合评分。
图6：HLA-POSTN-002和MMP12-002复合物在37℃下放置24h的稳定性：图示为带有相应HLA分子的完整HLA-POSTN-002和HLA-MMP12-002复合物在37℃下放置24h后的结合评分百分比。
图7：II类ICS分析中疫苗诱导的对CEA-006的典型CD4T细胞应答。体外致敏后，对36-031号患者的PBMCs进行分析以检测时间点池V8/EOS处CD4T细胞对CEA-006(上图)与模拟物(下图)的应答。细胞用相应的肽刺激，并分别用细胞活力、抗CD3、抗CD-8、抗CD4和效应标记物(从右至左：CD154，TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-10)来染色。
图8：多种II类肽的免疫原性。图示为使用ICS检测的对5种II类肽的免疫应答率(16名患者为IMA950肽，71名患者为IMA910肽)。
实施例
实施例1：
细胞表面呈递的肿瘤相关性肽的鉴定与定量分析
组织样本
患者肿瘤样本由UniversityofHeidelberg，Heidelberg，Germany提供。术前所有患者均给予了书面知情同意。手术结束后立即将组织在液氮中急速冷冻并保存于-80℃下，直至TUMAPs的分离。
从组织样本中分离HLA肽
按照一种略有改动的方案(Falk,K.,1991；Seeger,F.H.T.,1999)，通过固态组织的免疫沉淀从急速冷冻样本获取HLA肽池，该方案使用HLA-A*02特异性抗体BB7.2、HLA-A、-B、C-特异性抗体W6/32、CNBr活化的琼脂糖、酸处理以及超滤。
方法
采用反相色谱(AcquityUPLCsystem,Waters)依据其疏水性对获取的HLA肽池进行分离，并用LTQ-軌道阱杂交质谱仪(ThermoElectron)(带有ESI源)对洗脱肽进行分析。肽池直接载入烧结二氧化硅微毛细管分析柱(75μmi.d.x250mm)，填充剂为1.7μmC18反相材料(Waters)，流速为400nL/min。随后以300nL/min的流速进行从10％至33％B的二步二元梯度洗脱180min以分离肽。该梯度包括溶剂A(0.1％甲酸水溶液)和溶剂B(0.1％甲酸乙腈溶液)。采用包金玻璃柱(PicoTip,NewObjective)来导入nanoESi源。LTQ-轨道阱质谱仪的操作采用数据依赖模式中的TOP5策略。简言之，在轨道阱中进行高质量准确度的全扫描以启动扫描周期(R＝30000)，随后依然在轨道阱中对含量最高的5种前体离子进行MS/MS扫描(R＝7500)。采用SEQUEST和其它人工对照物进行串联质谱解析。通过将所生成的天然肽断裂谱与合成型同一序列参考肽的断裂谱相对比来确认所识别的肽序列。图1为肿瘤组织中MHCI类相关肽ABCA13-001在UPLC系统中的典型图谱及其洗脱图谱。
使用离子计数进行了无标记相对LC-MS定量分析(即LC-MS特征的提取和分析)(Muelleretal.2007a)。该方法假定肽的LC-MS信号面积与其在样本中的含量相关。随后通过电荷状态去卷积和保留时间校正对所提取的特征进行了进一步处理(Muelleretal.2007b；Sturmetal.2008)。最后将所有LC-MS特征与序列鉴定结果交叉参考，以将不同样本和组织的定量数据与肽呈递谱相结合。考虑到重复检测中的技术和生物变异性，根据中心趋势对定量数据作双层正态化。因此识别的每种肽均可与定量数据相关联，以实现样本和组织间的相对定量分析。此外，从候选肽获取的所有定量数据均作人工检查以确保数据一致性，并核实自动分析的准确性。测算了每种肽的表达谱，给出了样本平均表达量以及重复检测方差。该图谱将相关肿瘤样本与正常组织样本(基线)相并列。
典型过表呈递肽的呈递谱见图3。
实施例2
本发明肽编码基因的表达谱测定
不是所有可通过MHC分子识别为在肿瘤细胞表面呈递的肽都适用于免疫治疗，其原因是此类肽中的大部分源自由众多细胞类型所表达的正常细胞蛋白。此类肽中仅有极少数与肿瘤相关并有可能诱发对其源肿瘤具有高度识别特异性的T细胞。为明确此类的肽并尽量降低疫苗引起的自体免疫风险，发明者重点关注源自在肿瘤细胞中过量表达(相比于多数正常组织)的蛋白的肽。
理想的肽应源自相关肿瘤中所独有的且不存在于其它任何组织中的蛋白。为明确表达谱与理想表达谱相近的基因所衍生的肽，将所识别的肽分别与其来源蛋白和基因相并列，并生成此类基因的表达谱。
RNA来源和制备
手术切除组织标本由UniversityofHeidelberg,Heidelberg,Germany(参见实施例1)提供。术前所有患者均给予了书面知情同意。手术结束后立即将肿瘤组织标本在液氮中急速冷冻，随后使用研钵和研棒在液氮环境中进行匀化。使用TRI试剂(Ambion,Darmstadt,Germany)从上述样本中制备总RNA，随后用RNeasy(QIAGEN,Hilden,Germany)进行RNA纯化；上述方法均按照制造商的说明来进行。
健康人体组织总RNA购自Ambion,Huntingdon,UK；Clontech,Heidelberg,Germany；Stratagene,Amsterdam,Netherlands；BioChain,Hayward,CA,USA。将来自多个个体(2到123个个体)的RNA进行混合以使来自各个体的RNA比重相同。
采用RNA6000PicoLabChip试剂盒(Agilent)，用Agilent2100生物分析仪(Agilent,Waldbronn,Germany)对所有RNA样本进行定性和定量分析。
微阵列试验
所有肿瘤和正常组织RNA样本的基因表达分析均使用Affymetrix人基因组(HG)U133A或HG-U133Plus2.0寡核苷酸微阵列(Affymetrix,SantaClara,CA,USA)。所有步骤均按照Affymetrix的说明书开展。简言之，按照说明书所述，使用SuperScriptRTII(Invitrogen)和寡-dT-T7引物(MWGBiotech,Ebersberg,Germany)从5-8μg总RNA合成双链cDNA。使用生物阵列高产RNA转录标记试剂盒(ENZODiagnostics，Inc.，Farmingdale,NY,USA)(针对U133A阵列)或GeneChipIVT标记试剂盒(Affymetrix)(针对U133Plus2.0阵列)进行体外转录，随后使用抗生蛋白链霉素-藻红蛋白以及生物素化抗-抗生蛋白链霉素抗体(MolecularProbes,Leiden,Netherlands)进行cRNA链断裂、杂交和染色。随后用Agilent2500A基因阵列扫描仪(U133A)或Affymetrix基因芯片扫描仪3000(U133Plus2.0)进行图像扫描，并用GCOS软件(Affymetrix)(所有参数均为默认设定)进行资料分析。使用了Affymetrix提供的100个管家基因。使用软件所提供的信号对数比计算相对表达值，并将正常肾脏样本值任意设定为1.0。
在非小细胞肺癌中高度过量表达或独特表达的本发明的源基因的典型表达谱见图2。
实施例4
MHCI类呈递肽对NSCLC的体外免疫原性
为获得本发明TUMAP的免疫原性信息，我们使用体外T细胞启动分析进行研究，采用负载肽/MHC复合物的人工抗原呈递细胞(aAPCs)对CD8+T细胞进行反复刺激。通过此方法我们明确了本发明迄今为止对9种HLA-A*0201限制性TUMAPs的免疫原性，表明此类肽为T细胞表型，且在人体中存在其CD8+前体T细胞(表4)。
CD8+T细胞的体外启动
为使用负载肽-MHC复合物(pMHC)和抗-CD28抗体的人工抗原呈递细胞进行体外刺激，我们首先使用CD8微珠(MiltenyiBiotec，Bergisch-Gladbach，Germany)进行正向选择以从新鲜HLA-A*02白细胞分离产物(来自TransfusionMedicineTuebingen，Germany的给予知情同意的健康供者)中分离CD8+T细胞。
分离的CD8+淋巴细胞或PBMCs持续培养直至用于含RPMI-GutaMax的T细胞培养基(TCM)(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中，该培养基加入了10％热失活人AB血清(PAN-Biotech,Aidenbach,Germany)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Cambrex,Cologne,Germany)、1mM丙酮酸钠(CCPro,Oberdorla,Germany)、20μg/ml庆大霉素(Cambrex)。另在此步骤中向TCM中加入2.5ng/mlIL-7(PromoCell,Heidelberg,Germany)和10U/mlIL-2(NovartisPharma,Nürnberg,Germany)。
采用明确定义的体外系统(每种刺激条件使用4种不同的pMHC分子，每种读出条件使用8种pMHC分子)进行pMHC/抗-CD28涂珠的生成、T细胞刺激和读出。
aAPC载入和细胞读数所用的所有pMHC复合物均由UV诱导的MHC配体交换来产生(Rodenkoetal.,2006，有微小的改动)。为测定通过交换所得的pMHC单体数量，我们依据(Rodenkoetal.,2006)的方法进行了抗生蛋白链霉素夹心ELISA。
纯化共刺激鼠IgG2a抗人CD28抗体9.3(Jungetal.,1987)使用生产商(Perbio,Bonn,Germany)推荐的硫代-N-羟基琥珀酰亚胺基生物素进行化学生物素化。所使用的微珠为5.6μm直径抗生蛋白链霉素，涂有聚苯乙烯颗粒(BangsLaboratories,Illinois,USA)。
阳性和阴性对照刺激所使用的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从修饰的Melan-A/MART得到的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5-001(从DDX5得到的DDX5YLLPAIVHI)。
将800.000微珠/200μl涂布于96孔板中(加入了4x12.5ng不同的生物素-pMHC)，洗板后加入200μl的600ng生物素抗-CD28。在96孔板中，将1x106CD8+T细胞与2x105冲洗所得涂布微珠在37℃下共孵育于200μlTCM(加入了5ng/mlIL-12(PromoCell))中3-4天，以此启动刺激。随后用加入了80U/mlIL-2的新鲜TCM取代一半的上述培养基，继续在37℃下孵育3-4天。这一刺激循环共重复三次。对于pMHC多聚体读数(每种条件使用8种不同的pMHC)采用二维组合编码法(如既往文献所述，仅作微小改动)(Andersenetal.,2012)使与5种不同的荧光色素相耦合。最后使用活/死近红外染料(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)、CD8-FITC单抗体克隆SK1(BD,Heidelberg,Germany)以及荧光pMHC多聚体进行多聚体分析。分析中使用带有合适的激光与滤器的BDLSRIISORP细胞仪。肽特异性细胞数记为在总CD8+细胞中的百分比。使用FlowJo软件(TreeStar,Oregon,USA)进行多聚体分析的评估。通过与阴性对照刺激相比较来检测特异性多聚体+CD8+淋巴细胞的体外启动。若体外刺激后至少一名健康供着的可评估体外刺激孔中存在特异性CD8+T细胞系(即该孔CD8+T细胞中至少1％为特异性多聚体+且特异性多聚体+细胞是阴性对照刺激中位值的至少10倍)。
NSCLC肽的体外免疫原性
受试HLAI类肽的体外免疫原性可通过肽特异性T细胞系的产生来表现。图4为本发明的2种肽经TUMAP特异性多聚体染色后典型的流式细胞计量结果(另附相应的阴性对照结果)。本发明的25个肽的结果汇总于表5。
表5：本发明HLAI类肽的体外免疫原性
本发明的肽的申请者开展的体外免疫原性试验的典型结果。<20％＝+；20％-49％＝++；50％-70％＝+++；以及>70％＝++++
实施例5
肽的合成
所有肽的合成均使用标准、公认的固相肽合成方法(使用Fmoc-策略)。通过预备的RP-HPLC进行纯化后，通过离子交换程序结合生理相容性抗衡离子(例如三氟乙酸酯、乙酸酯、铵或氯化物)。
通过质谱法和RP-HPLC分析对各肽进行了鉴别和纯度测定。离子交换程序后所得的肽为白色或类白色冻干产物，纯度为90％至99.7％。
所有TUMAPs的给药形式均优选为三氟乙酸盐或乙酸盐，也可能是其它盐类。示例4中的测定使用肽的三氟乙酸盐形式。
实施例6
UV-配体交换
采用体外启动(priming)分析进一步检测根据本发明所述疫苗的候选肽的免疫原性。该分析所需的各种肽-MHC复合物通过UV-配体交换产生，其中UV敏感肽通过UV辐射来解离，并与所分析的候选肽相交换。只有能有效结合并稳定肽-感受MHC分子的候选肽方可防止MHC复合物的解离。通过ELISA检测稳定后的MHC复合物的轻链(β2m)来测定交换反应的产率。该分析方法基本依据Rodenko等人所述(RodenkoB，ToebesM，HadrupSR，vanEschWJ，MolenaarAM，SchumacherTN，OvaaH.Generationofpeptide-MHCclassIcomplexesthroughUV-mediatedligandexchange.NatProtoc.2006；1(3)：1120-32.)。
96孔MAXISorp板(NUNC)用2ug/ml抗生蛋白链霉素的PBS溶液在室温下涂布整夜，在37℃下冲洗30min，重复4次，并用含封闭液的2％BSA封闭30min。以复性HLA-A*0201/MLA-001单体为标准品(涵盖8-500ng/ml)。UV交换反应中的肽-MHC单体用封闭液稀释100倍。样本在37℃下孵育1h，冲洗4次，用结合了抗-β2m的2ug/mlHRP在37℃下孵育1h，再次冲洗，最后用TMB溶液进行检测(用NH2SO4停流)。测定了450nm处的吸光度。
表6：UV-配体交换
表现出高交换产率(即高于40％，优选为高于50％，更优选为高于70％，最优选为高于80％)的候选肽通常优先用于抗体或其碎片以及/或T细胞受体或其碎片的生成和生产，原因是其对MHC分子具有足够的亲合力并可防止MHC复合物的解离。
实施例7
选定的MHCII类肽的结合与免疫活性
HLAII类蛋白可分为3个主要同种型，即HLA-DR、-DP和DQ，可由多种单倍型所编码。多种α-和β-链的组合增加了任意人群中HLAII类蛋白的多样性。因此选定的HLAII类TUMAP须可与多种不同的HLA-DR分子相结合(即表现出广泛的结合能力)，以此在相当大百分比的患者中引发有效的T细胞应答。
通过外部服务提供商的体外结合试验评估了POSTN-002和MMP12-002与多种HLA-DR单倍型的广泛结合以及所形成的的复合物的稳定性，如下文所述。
材料和方法
肽列表
受试HLA-DR单倍型列表
根据在HLA-A*02和HLA-A*24阳性北美人群中的发生频率选择受试的7种HLA-DR单倍型(表7.1和7.2)
资料来源于对国家骨髓供着计划中登记的135万名经HLA分型的志愿者的分析(Morietal.,1997)。分析人群进一步分为以下人种组：白种美国人(N＝997，193)、非裔美国人(N＝110，057)、亚裔美国人(N＝81，139)、拉丁裔美国人(N＝100，128)和美洲印第安人(N＝19，203)。
表7.1HLA-A*02阳性北美人群中各单倍型的频率：经分析的单倍型标灰突出。
表7.2HLA-A*24阳性北美人群中各单倍型的发生频率：经分析的单倍型标灰突出。
检测原理
ProImmuneMHC-肽结合分析可测定各候选肽与选定的HLAII类单倍型相结合并稳定HLA-肽复合物的能力。通过此方法将候选肽与特定的HLAII类蛋白在体外装配。肽并入HLA分子的程度通过(复性程序完成后的)时间0点时装配后的HLA-肽复合物中天然构象的存在或缺失来评定(所谓“装配率”)。
候选肽与特定HLA分子的结合能力与一种已知的极强结合力肽(阳性对照)相比较，以计算相应的MHC-肽结合评分。阳性对照肽由ProImmune选择并提供(依据此类肽对各HLA单倍型的使用经验)。
除肽对特定HLA分子的亲合力外，所形成的的HLA-肽复合物的长期稳定性也对产生免疫应答至关重要。为此将所形成的HLA-肽复合物在37℃下孵育24h以检测其存在。随后计算所形成的MHC-肽复合物在24h时的结合评分与复性后(即时间0点)的即刻结合评分的百分比，以此评估所形成的的MHC-肽复合物的稳定性。
结果
对POSTN-002和MMP12-002所作的MHC-肽结合分析表明，两种肽均可与多种HLA单倍型相结合。在所研究的7种HLA单倍型中，POSTN-002可与其中的5种形成复合物，MMP12-002可与其中的4种形成复合物(图5)。两种肽均不与HLA-DR3和HLA-DR6结合。所测得的结合评分为阳性对照的0.02％至2.5％不等，且明显高于非结合肽的评分。
对所形成的HLA-POSTN-002和HLA-MMP12-002复合物的稳定性分析表明，在所研究的7种HLA-肽复合物中，分别有3种和2种可在37℃下稳定24h(图6)。
通过将肽的结合评分与已知具有免疫原性的肽的结合评分相比较，可推断该肽的免疫原性(依据与HLA分子的结合能力)。因此本项比较选用了5种经充分研究确认具有免疫原性的肽。离体测定了免疫接种患者(使用胞内细胞因子染色(ICS)CD4体细胞)血液样本中上述肽的免疫原性。
ICS检测原则上通过效应功能来评估特异性T细胞的质量。因此体外培养外周血单核细胞(PBMC)，随后用待测肽、参考肽和阴性对照(此例为MOCK)进行再刺激。随后将再刺激细胞染色产生FN-γ、TNF-α、IL-2和IL-10，并表达共刺激分子CD154。用流式细胞仪对相关细胞进行计数(图7)。
免疫原性分析表明,16名患者通过IMA950肽(BIR-002和MET-005)免疫接种后产生了100％的免疫应答，而71名患者通过IMA910肽(CEA-006、TGFBI-004、MMP-001)免疫接种后产生了44％至86％的免疫应答。
为了将POSTN-002和MMP12-002结合评分与IMA910和IMA950肽的结合评分相比较，将所有肽按对所研究的各HLA-DR单倍型的结合评分结果列于表格中(表8.1、表8.2、表8.3、表8.4和表8.5)。
表8.1POSTN-002和MMP12-002对HLA-DR1的结合评分(相比于已知免疫原性的II类肽的结合评分)：POSTN-002和MMP12-002的结果标灰突出。
表8.2POSTN-002和MMP12-002对HLA-DR2的结合评分(相比于已知免疫原性的II类肽的结合评分)：POSTN-002和MMP12-002的结果标灰突出。
表8.3POSTN-002和MMP12-002对HLA-DR4的结合评分(相比于已知免疫原性的II类肽的结合评分)：POSTN-002和MMP12-002的结果标灰突出。
表8.4POSTN-002和MMP12-002对HLA-DR5的结合评分(相比于已知免疫原性的II类肽的结合评分)：POSTN-002和MMP12-002的结果标灰突出。
表8.5POSTN-002和MMP12-002对HLA-DR7的结合评分(相比于已知免疫原性的II类肽的结合评分)：POSTN-002和MMP12-002的结果标灰突出。
POSTN-002和MMP12-002相比于其它已知具有免疫原性的II类肽的结合评分表明，两种肽的结合能力多位于表的中下部(HLA-DR2除外)。两种肽对HLA-DR2的结合能力位于表的上半部分，其中MMP12-002为结合能力最强的候选肽。基于此分析，预期POSTN-002和MMP12-002这两种肽定可诱导免疫应答。
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Claims (29)

1.由从SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92或其变异序列组(与SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92至少80％同源)中所选择的氨基酸序列所组成的肽，且上述变异序列可引发抗体和/或T细胞与上述肽(或其药用盐)的交叉反应，其中上述肽为非基础全长多肽。
2.根据权利要求1所述的肽，该肽或其变异体的SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92的总长度为8至100个氨基酸(优选为8至30个，最优选为8至14个)，而SEQIDNo.76或77的总长度为12至100个氨基酸(优选为12至30个，最优选为12至18个)。
3.根据权利要求1或2所述的、可与人主要组织相容性复合物(MHC)I或II类分子相结合的肽。
4.根据权利要求1至3任一项所述的的肽，该肽由(或本质上由)SEQIDNo.1至SEQIDNo.65、SEQIDNo.76至SEQIDNo.84和SEQIDNo.92氨基酸序列所组成。
5.根据权利要求1至4任一项所述的肽，该肽为修饰肽、N和/或C末端延长最多4个氨基酸的肽，并/或含有非肽键。
6.根据权利要求1至5任一项所述的肽，该肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关性不变链(Ii)的N末端氨基酸相融合的蛋白，或与某种抗体相融合的蛋白。
7.可编码根据权利要求1至6中任一项所述的肽的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的核酸，该核酸为DNA、cDNA、PNA、RNA或DNA、cDNA、PNA、RNA的组合。
9.可表达根据权利要求7或8所述的氨基酸的表达载体。
10.药用目的的与本权利要求1至6任一项所述的肽、根据权利要求7或8所述的核酸或根据权利要求7或8所述的表达载体。
11.含有根据权利要求7或8所述的核酸或根据权利要求9所述的表达载体的宿主细胞，该宿主细胞不可为人胚胎干细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，该细胞是一种抗原呈递细胞，例如树突细胞。
13.含有根据权利要求1至6中任一项所述的肽的药物组合物或其药用盐，以及药用、优选为液体的至少一种载体和/或辅料(例如缓冲剂、结合剂、爆炸剂、稀释剂、增味剂、润滑剂、免疫刺激或免疫调节物质(例如细胞因子)、免疫调节剂、辅剂和具有免疫调节特性的治疗性物质。
14.根据权利要求1至6任一项所述的肽的制备方法，该方法包括根据权利要求11或12所述的宿主细胞培养，以及将上述肽从宿主细胞或其培养基中分离。
15.活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或辅助T细胞(Th细胞)的体外制备方法，该方法包括将体外CTL与抗原负载人I类或MHCII类分子(以抗原特异性方法，在适当的抗原呈递细胞表面表达该分子足够时间以活化上述CTL)相接触，其中的抗原可为根据权利要求1至6任一项所述的任何肽。
16.根据权利要求15所述的方法，该方法将上述抗原载入表达于适当的抗原呈递细胞表面的I类或II类MHC分子(通过将足量的抗原与抗原呈递细胞相接触)。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中的抗原呈递细胞含有可表达权利要求1至6任一肽的表达载体。
18.根据权利要求15至17任一项所述的方法所制备的活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th细胞)，该CTL或Th细胞可选择性地识别异常表达含有权利要求1至6任一项中的氨基酸序列的多肽的细胞。
19.制备TCR或sTCR或其碎片(对权利要求1至6任一项中的肽具有特异性)的体外方法，该方法包含从权利要求18中的CHL或Th细胞进行可变域克隆以及在合适的宿主和/或表达系统中表达上述TCR或sTCR或其碎片。
20.分离型结合剂，例如抗体或其碎片、蛋白、氨基酸、肽、TCR或sTCR或其抗体，该结合剂可(优选为特异性地)根据权利要求1至4任一项中的肽或根据权利要求1至4任一项中的肽的MHC分子复合物相结合。
21.与从SEQIDNo.1至SEQIDNo.92中所选择的氨基酸序列至少80％同源的可与HLA配体反应的分离T细胞受体。
22.权利要求21中的分离T细胞受体，其中的氨基酸序列与EQIDNo.1至SEQIDNo.92至少90％同一，优选为95％同一，最优选为100％同一。
23.在患者中杀伤靶细胞的方法，其中所述靶细胞异常表达或呈递含有权利要求1至6任一项中的氨基酸序列的多肽，包括按权利要求18的方法给予患者有效数量的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或Th细胞。
24.根据权利要求1至6任一项中所述的肽、根据权利要求7或8所述的核酸、根据权利要求9所述的表达载体、根据权利要求18所述的活化细胞毒性T淋巴细胞或根据权利要求20至22任一项中所述的抗体或TCR或sTCR的用途，其中所述药剂为活性抗癌药。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述药剂为疫苗。
26.根据权利要求24或25所述的用途，其中癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、胃癌以及/或成胶质细胞瘤细胞。
27.根据权利要求24至26所述的人适应性细胞治疗用途。
28.经根据权利要求20所述的T细胞受体重组转染的自体或同种异体人细胞毒性T细胞(CTL)或辅助T细胞(Th细胞)。
29.包含下列成分的药物组合物：
(a)下列一组物质之一：
(a1)根据权利要求1至6中任一项所述的分离肽，
(a2)根据权利要求20至22中任一项所述的T细胞受体、sTCR或其碎片，
(a3)根据权利要求6所述的融合蛋白，
(a4)根据权利要求7或8所述的核酸，
(a5)根据权利要求9所述的表达载体
(a6)根据权利要求11至12任一项所述的宿主细胞，
(a7)根据权利要求18所述的活化细胞毒性T淋巴细胞或受体T细胞，
(b)药用载体
(c)(非必选)至少一种药用辅料、缓冲剂、结合剂、爆炸剂、稀释剂、增味剂、润滑剂、免疫刺激或免疫调节物质(例如细胞因子)、免疫调节剂、辅剂和具有免疫调节特性的治疗性物质。
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