CN116583295A - 使用白术内酯i使癌细胞对免疫攻击敏感的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及在癌细胞中诱导或增加免疫原性的组合物和方法，包括使癌细胞与白术内酯I(ATT‑I)接触。在一些实施方式中，该方法包括与癌症治疗剂组合使癌细胞与ATT‑I接触。
Description
相关申请的交叉引用
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电子提交材料的援引加入
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背景技术
免疫系统可以区分健康细胞和肿瘤细胞，因为后者表达肿瘤相关抗原(TAA)。在CD8+T细胞介导的免疫应答的情况下，TAA的识别是通过肿瘤细胞上经由MHC-I呈递TAA以及它们与CD8+T细胞上的T细胞受体(TCR)的相互作用而发生的。削弱这一事件将最终减少或消除CD8+T细胞介导的肿瘤细胞毒性。然而，抗原呈递的减少或丧失是肿瘤细胞用来逃避免疫识别和破坏的一种常见且重要的机制。相反，增加负载抗原的MHC-I复合物在癌细胞上的呈递会使它们对T细胞介导的杀伤敏感。
本公开总体上涉及增加癌细胞免疫原性的方法。更具体地说，本公开涉及一种使癌细胞与白术内酯I接触以促使癌细胞产生MHC-I，从而导致免疫细胞识别和攻击癌细胞的能力的方法。
发明内容
尽管癌症免疫治疗技术取得了巨大进步，但癌症伪装自身和逃避检测的能力仍然是一个问题。本文描述的是激活癌细胞上的抗原加工和呈递，使其易于被免疫细胞识别的方法。更具体地，本公开提供了包括使癌细胞与白术内酯I(atractylenolide I，称为ATT-I)接触以增强免疫细胞识别和攻击癌细胞的能力的方法。
小分子ATT-I与癌细胞的蛋白酶体26S亚基非ATP酶4(PSMD4)的结合增强了细胞免疫蛋白酶体复合物的抗原加工活性，并增强了主要组织相容性I类(MHC-I)介导的抗原在癌细胞上的呈递。本质上，通过使癌细胞与ATT-I接触，癌细胞开始在其表面表达抗原，从而允许免疫细胞识别并攻击它。具体而言，本公开描述了在癌细胞暴露于ATT-I之后增强CD8+T细胞识别癌细胞的能力。
在一些方面，本公开提供了使用ATT-I与另一种治疗分子的组合来增加肿瘤浸润和对CD8+T细胞细胞毒性的敏感性的方法。在一种实施方式中，提供了一种使癌细胞与ATT-I接触的方法，其中ATT-I增加了癌细胞对CD8+T细胞细胞毒性的敏感性。在一些方面，ATT-I为基本上纯的，为约98％纯、约97％纯、约96％纯、约95％纯或约90％纯。
在一种实施方式中，提供了增强CD8+T细胞对癌细胞的细胞毒性疗效的方法，其中所述方法包括使所述癌细胞与白术内酯(ATT-I)接触。根据一种实施方式，通过给药包含ATT-1的药物组合物在体内接触癌细胞。在一种实施方式中，增强CD8+T细胞细胞毒性疗效的方法包括向诊断患有癌症的患者给药包含ATT-1的药物组合物，任选地与检查点抑制剂的给药组合并且任选地与抗癌症免疫治疗剂的给药组合。在一种实施方式中，检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，并且癌细胞是结直肠癌(CRC)细胞。
在一种实施方式中，提供了增加负载抗原的MHC-I复合物在癌细胞上的呈递的方法，其中所述方法包括使所述癌细胞与ATT-I接触，任选地，其中所述癌细胞是结直肠癌(CRC)细胞。
在一种实施方式中，提供了一种治疗肿瘤的方法，其中使肿瘤细胞与ATT-I和一种或多种另外的治疗分子的组合接触，包括例如给药一种或多种检查点抑制剂。在一些实施方式中，治疗分子包含程序性死亡-1(PD-1)抑制剂，任选地其中所述抑制剂选自阿替利珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和阿维单抗(avelumab)。在一些实施方式中，治疗分子包含细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。在一些实施方式中，提供了ATT-I与CTLA-4和/或PD-L1抑制剂的组合治疗肿瘤的方法。在一种实施方式中，提供了一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向诊断患有癌症的患者给药包含白术内酯(ATT-I)的药物组合物。在一种实施方式中，待治疗的癌症是实体瘤，任选地其中癌症是结直肠癌(CRC)。根据一种实施方式，向被诊断患有癌症并正在接受抗癌免疫疗法的患者给药包含白术内酯(ATT-I)的药物组合物。在另一种实施方式中，接受ATT-I的患者可以在给药ATT-I的同时或之前或之后进一步给药检查点抑制剂，任选地其中检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
在一种实施方式中，提供了使癌细胞对来自免疫细胞的攻击敏感的方法，其中所述方法包括使癌细胞与ATT-I接触。在一种实施方式中，免疫细胞是工程化的或天然的，并且在一种实施方式中，免疫细胞是CD8+T细胞。
附图说明
图1A-1F呈现的数据显示ATT-I增强了CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。共测试了从传统药用植物中纯化的594种天然小分子化合物的它们对从C57BL/6小鼠新鲜分离的MC38细胞和T细胞的毒性。数据呈现为3个独立实验的平均值(图1A)。图1B显示了446种具有低毒性的药物的测试中，它们对CD8+T细胞介导的细胞毒性的影响的结果。在每种药物(5.0μM)存在的情况下，将表达荧光素酶的MC38-OVA细胞与OT-I CD8+T细胞共培养，并通过荧光素酶测定法测量T细胞介导的细胞毒性。差异(log2)：(log2[相对生存力]>1；P<0.05)。相对生存力＝(处理组的肿瘤细胞生存力)/(对照组的肿瘤细胞生存力)。数据呈现为3个独立实验的平均值。使用1因素ANOVA进行统计分析。ATT-I的化学结构如下：
在肿瘤细胞与T细胞的不同比例下测量ATT-I处理对CD8+T细胞杀伤MC38-OVA细胞的影响，以及结果如图1C所示。数据呈现为3个独立实验的平均值±SD。使用2因素ANOVA进行统计分析。图1D呈现了使用OT-I CD8+T细胞与用5μM的ATT-I(+)或载剂对照DMSO(–)预处理的MC38-WT细胞(分道1和2)或MC38-OVA细胞(分道3-6)的共培养物进行的CD8+T细胞杀伤测定的数据。数据呈现为3个独立实验的平均值±SD。通过ELISA确定OT-I T细胞与用ATT-I(+)或DMSO对照(–)预处理的MC38-WT细胞(分道1和2)或MC38-OVA细胞(分道3-6)的共培养之后上清液中的IFN-γ(图1E)和TNF-α(图1F)的水平。数据呈现为3个独立实验的平均值±SD。使用2因素ANOVA进行统计分析。**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图2：ATT-I增强了MC38肿瘤来源的类器官中的抗原特异性T细胞应答。在有或没有ATT-I处理的情况下，将OT-I CD8+T细胞与由C57BL/6小鼠中的MC38来源肿瘤产生的肿瘤类器官共培养。图2是表示类器官尺寸量化的图，呈现为3个平行实验的平均值±SD。使用Image J软件将类器官的尺寸测量为投影面积(μm2)。使用2因素ANOVA进行统计分析。**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图3A-3I：ATT-I增强肿瘤细胞上的抗原呈递。图1A-1F是显示用ATT-I(0、5、10和30μM)处理的MC38-OVA细胞(shNT对照(图3A和3B)、shPsmd4(图3C和3D)和shPsmd7(图3E和3F))上H-2Kb和H-2Kb-SIINFEKL(OVA)的MFI值，其通过流式细胞术分析确定。数据呈现为平均值±SEM，并且代表2个独立实验(n＝2)。使用1因素ANOVA进行统计分析。通过免疫荧光的3D共聚焦成像分析HCT116细胞和SW837细胞表面的HLA-A、B、C。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。定量数据(对于HCT116细胞，在图3G中，以及对于SW837细胞，在图3H中)呈现为3至4个平行实验(n＝3–4)的平均值±SD。未配对的双尾t检验用于统计分析。图3I提供的数据表明，在使用MHC-I抗体阻断MHC-I/TCR相互作用后，ATT-I对MC38 OVA+细胞毒性的影响(分道1和4：载剂对照处理的MC38 OVA+细胞；分道2和5：载剂对照处理的MC38OVA+细胞加T细胞；分道3和6：ATT-I处理的MC38 OVA+细胞加T细胞)。具体来说，我们在使用和不使用30μM ATT-I的情况下处理MC38 OVA+细胞48小时。大鼠IgG2a同种型对照和抗小鼠MHC I类(H2)用于阻断细胞过夜。通过流式细胞术分析抗原特异性细胞毒性。数据呈现为平均值±SEM，并且代表2个独立实验(n＝4)。使用1因素ANOVA进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图4A-4E：ATT-I增强免疫检查点阻断的免疫应答。图4A-4C展示了ATT-I(每天)和抗-PD-1(3次/周，总共5次注射)对C57BL/6小鼠模型中皮下MC38来源肿瘤的肿瘤生长(图4A)和肿瘤体积(图4B)的影响。误差棒代表SEM(每组n＝10只小鼠)。所示数据代表2个独立实验。使用2因素ANOVA(图4A)和1因素ANOVA(图4B)进行统计分析。切除肿瘤的图片如图4C所示。比例尺：1cm。通过生物发光成像测量的ATT-I(每天50mg/kg)和抗PD-1(200μg/小鼠，3次/周，总共5次注射)对肿瘤生长的影响，以及原位MC38来源肿瘤模型上的生存(对数秩检验)和生存率如图4D所示。每组包括5只小鼠。图4E显示了具有或不具有PSMD4敲低且仅用抗PD-1处理或者用抗PD-1与ATT-I(combo)一起处理的MC38来源肿瘤的肿瘤生长曲线图。每组包括6只小鼠。使用2因素ANOVA进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图5A-5D：ATT-I增强肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤活性。小鼠接受MC38细胞的原位盲肠壁植入，并接受ATT-1、PD-1抗体、或组合处理，以及28天后切除肿瘤用于使用质谱流式细胞术(CyTOF)分析肿瘤微环境。原位MC38肿瘤在植入后28天通过手术切除，分离成单个细胞，并用金属同位素缀合抗体染色。免疫概况通过CyTOF(26个标记)进行评估，并使用Cytobank平台进行分析。进行了viSNE分析，以及然后评估了viSNE上的SPADE的免疫细胞群的重叠聚类。图5A是呈现盲肠壁植入肿瘤的代表性MC38重量的图(每组n＝5)。使用1因素ANOVA进行统计分析。使用Cytobank(n＝5)分析的结直肠癌肿瘤中CD45+浸润性免疫细胞内不同免疫细胞群的百分比列于表1。一旦皮下MC38肿瘤建立，将小鼠随机分配到7个组中并按照图5B-5D的指示进行处理。在B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞耗竭后ATT-I(每天50mg/kg)和抗PD-1(每周3次，总共5次注射)处理对肿瘤生长(图5B和图5C)和肿瘤体积(图5D)的影响(n＝6)。Iso表示同种型对照抗体。误差棒代表SEM，统计分析使用2因素ANOVA(E和F)和1因素ANOVA(G)进行。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图6A-6B：用ATT-I和免疫检查点阻断疗法的组合处理的小鼠结直肠肿瘤的单细胞RNA-seq分析。用载剂对照、ATT-I(每天50mg/kg)、抗PD-1(每周3次，总共5次)或ATT-I+抗–PD-1组合处理携带原位植入的MC38来源肿瘤的C57BL/6小鼠。初始处理后2周收集肿瘤(每组合并5个肿瘤样品)。通过已知标记基因的表达水平评估细胞类型，并分析所选免疫细胞类型中功能标记基因的基因表达谱。来自不同条件的CD8+效应T细胞中T细胞活化和细胞毒性标记基因的平均表达水平如图6A所示。点大小表征了每种条件的CD8+效应T细胞的比例(y轴)和所选基因的表达水平(由强度表示)(x轴)。图6B提供了每种条件下CD8+效应T细胞的细胞毒性评分分布。每个细胞的细胞毒性水平由CD8+T标记基因Prf1、Ifng、Tnf、Pdcd1、Sla2和Cd8a的平均表达水平推断。y轴表示细胞毒性评分。组合对比于抗PD-1(P＝1.121×10–6)；组合对比于ATT-l(P＝0.0024)。使用未配对的双尾t检验进行统计分析。
图7A-7H：ATT-I增强了CRC患者来源的肿瘤类器官中的自体T细胞应答。在存在或不存在ATT-I的情况下，患者来源的类器官(PDO)与自体CD8+T细胞共培养。类器官尺寸的量化呈现为来自8名不同患者的平均值±SD(PDO1-PDO8；如图7A-7H所示)。使用Image J软件将类器官的尺寸测量为投影面积(μm2)。使用1因素ANOVA进行统计分析。
图8A和8B显示淫羊藿苷或鹰嘴豆芽素A处理对CD8+T细胞杀伤MC38-OVA细胞的影响，如所指示的，在肿瘤细胞与T细胞的不同比例下测量。数据呈现为三个独立实验的平均值±SD。使用二因素ANOVA检验进行统计分析。
具体实施方式
定义
在描述和要求保护本发明时，将根据下面阐述的定义使用以下术语。
本文所用的术语“约”是指大于或小于指定的值或值范围10％，但并不旨在将任何值或值范围仅限于该更广泛的定义。以术语“约”开头的每个值或值范围也意在包括指定的绝对值或值范围的实施方式。
如本文所用，术语“纯化的”和类似术语涉及以基本上不含污染物的形式的分离分子或化合物，该污染物在天然或自然环境中通常与分子或化合物相关。如本文所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它旨在作为一个相对定义。
术语“分离的”要求参考材料从其原始环境(例如，如果它是自然发生的，则为自然环境)中移除。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸不是分离的，但是与自然系统中的一些或所有共存物质分离的相同多核苷酸是分离的。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药学载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何药剂。
如本文所用，术语“治疗”包括减轻与特定障碍或病症相关的症状和/或预防或消除所述症状。
如本文所用，药物的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒但足以提供期望效果的药物。“有效”的量将在受试者与受试者之间变化，或甚至在受试者内随着时间而变化，这取决于个体的年龄和一般状况、给药方式等。因此，并不总是可以指定确切的“有效量”。然而，在任何个别情况下合适的“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
如本文所用，没有进一步指定的术语“患者”旨在包括在有或没有医师监督的情况下接受治疗性治疗的任何温血脊椎家养动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、狗和其他宠物)和人。
术语“抑制”定义活动、应答、状况、疾病或其他生物学参数的降低。这可以包括但不限于完全消除活动、应答、状况或疾病。这也可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活动、应答、状况或疾病降低10％。因此，与天然或对照水平相比，降低可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何降低量。
发明详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但优选的方法和材料描述如下。
根据一种实施方式，提供了一种药物组合物，其包含通式I的一般结构的化合物：
在一种实施方式中，该组合物包含纯化的白术内酯I。在一种实施方式中，该组合物进一步与一种或多种免疫检查点抑制剂诸如抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体组合。在一种实施方式中，将包含式I化合物的组合物连同抗癌免疫疗法治疗给药于癌症患者。在一种实施方式中，待治疗的癌症是实体瘤癌症，包括例如结直肠癌。
在一些实施方式中，教导了一种方法，包括使癌细胞与小分子接触，其中小分子包含ATT-I，并且其中癌细胞变得对CD8+T细胞的细胞毒性作用更加敏感。
在一些实施方式中，ATT-I是单独提供的。在一些实施方式中，ATT-I是基本上纯的、约98％纯、约97％纯、约96％纯、约95％纯、约94％纯、约93％纯、约92％纯、约91％纯、或约90％纯。
在一些实施方式中，ATT-I与其他治疗剂、抗体或小分子组合提供。在一些实施方式中，其他治疗剂包括PD-1、PD-L1或CTLA-4。在这些实施方式中，PD-1、PD-L1或CTLA-4部分用于帮助CD8+T细胞破坏癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞能够形成肿瘤。在一些实施方式中，癌细胞来自肾癌。在一些实施方式中，癌细胞来自结肠癌。
如本文所用，术语“致敏”是指在与ATT-I接触后，癌细胞开始产生并展示能够被CD8+T细胞识别的量的抗原。
淫羊藿苷的化学结构如下：
鹰嘴豆芽素A的化学结构如下：
制备了四种生物学上不同的细胞培养物，并且两种用DMSO处理(对照)和两种用ATT-I处理(处理)。在裂解每个细胞沉淀后，将所得蛋白质溶液分成六个相同的等分试样(50μL)，并如方法中所述在六个温度点—35.0℃；45.3℃；50.1℃；55.2℃；60.7℃；74.9℃平衡3分钟。接下来将每个管中产生的变性蛋白质沉淀出来，并将上清液部分依次进行以下程序：蛋白水解消化(基于胰蛋白酶/Lys-C)，用不同的同位素标签(TMT：串联质量标签)标记肽，混合，和基于高pH溶剂的反相分级。如方法中所述，使用nanoLC-MS/MS分析所有级分。使用MaxQuant软件套件1.6.0.16.分析所有结果文件以识别和量化蛋白质丰度值，并使用Pro 14.0.0(64bit)生成S形蛋白质熔解曲线，并使用后续数据分析筛选出ATT-I的潜在靶点,如实施例中所述。
在考虑以下非限制性实施例后将更充分地理解本公开。
实施例1研究设计
本研究的最初目标是从草药中鉴定增加结直肠癌(CRC)细胞对CD8+T细胞介导的细胞毒性的响应性的天然小分子化合物。使用了两个标准进行筛选：1)候选药物对肿瘤和T细胞没有毒性或具有最小毒性，这是与化疗药物不同的特征；2)它们增强了CD8+T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。从594种化合物的文库中鉴定出符合这两个标准的白术内酯I(ATT-I)。使用2D共培养和3D肿瘤类器官模型，进行了体外T细胞细胞毒性测定，以确定ATT-I对CD8+T细胞抗肿瘤活性的影响。为了鉴定结直肠癌细胞中ATT-I的分子靶点，对用DMSO或ATT-I(5.0μM)处理的MC38肿瘤细胞裂解物中的超过13,000种蛋白质应用了基于质谱的细胞热漂移分析(CETSA)。
Psmd4是免疫蛋白酶体的功能成分，被确定为ATT-I的最有潜力的结合靶点之一。ATT-I与Psmd4的相互作用通过微量热泳动(MST)结合测定得到证实。使用组成型26S蛋白酶体和特异性免疫蛋白酶体的不同蛋白酶底物测试ATT-I处理对免疫蛋白酶体活性的影响。为了测试ATT-I处理是否增强免疫检查点阻断疗法的疗效，使用MC38细胞(在C57BL/6小鼠中)和CT26细胞(在BALB/c小鼠中)的皮下和原位盲肠壁植入建立免疫活性小鼠的同基因肿瘤模型。
所有动物研究均经印第安纳大学医学院动物护理委员会批准(协议#11269)，并按照机构和国家政策进行。肿瘤植入后七天，将小鼠随机分配到四个不同的处理组：载剂对照、ATT-I(50mg/kg，每天)、PD-1抗体(200μg/小鼠，3次/周，共5次)，和ATT-I+PD-1组合。在研究终点通过尺寸和肿瘤重量监测皮下肿瘤生长。在腹腔内注射荧光素后，使用IVIS光谱通过体内生物发光肿瘤成像监测原位肿瘤生长。接下来，通过CyTOF分析了ATT-I处理对CRC肿瘤中的免疫谱的影响。
为了进一步确定负责ATT-I的抗肿瘤作用的免疫细胞类型，进行了耗竭CD4+T细胞(抗CD4)、CD8+T细胞(抗CD8)、B细胞(抗CD20)或对照(同种型抗体)的体内实验。由于ATT-I的主要作用是通过CD8+T细胞介导的，我们接下来对来自用对照、ATT-I、PD-1抗体或ATT-I+PD-1组合处理的小鼠的结直肠肿瘤样品应用scRNA-seq分析，以进一步评估每种条件下的CD8+T细胞功能。在scRNA-seq数据的t-SNE图分析中，肿瘤中的细胞类型通过它们的基因表达特征进行评估。最后，建立了来自人类CRC患者样品的患者来源的肿瘤类器官(PDO)，以确定用ATT-I处理肿瘤类器官是否会影响自体CD8+T细胞的细胞毒性。PDO与预激活的自体CD8+T细胞共培养。通过PDO尺寸和数量以及肿瘤细胞死亡评估球体解离和T细胞细胞毒性。
实施例2小鼠和细胞系
6-8周大的C57BL/6和BALB/c小鼠购自Jackson Laboratory并在无病原体条件下饲养。OT-I小鼠(C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J)购自JacksonLaboratory并在室内饲养。所有小鼠都饲养在印第安纳大学医学院的动物设施中。所有程序均按照印第安纳大学机构动物护理和使用委员会协议的批准进行。MC38细胞系获自MD Anderson癌症中心的Patrick Hwu博士，并且CT26、SW837和HCT116细胞系获自ATCC。MC38、HCT116和SW837细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS,Sigma-Aldrich)和1％青霉素-链霉素溶液(10,000单位/ml青霉素+10,000μg/ml链霉素，HyClone)的DMEM培养基中。CT26细胞维持在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的RPMI培养基中。细胞系在37℃、含5％CO2的加湿培养箱中培养。
实施例3试剂
使用了以下抗体：蛋白质印迹抗体，包括S5a/PSMD4(3336S,CellSignaling)和抗β-肌动蛋白(sc-8432,Santa Cruz)；免疫荧光染色抗体，包括抗人HLA-A,B,C(ab70328,Abcam)和抗EGFR(#4267,Cell Signaling)；免疫组织化学染色抗体，包括抗CD8a(98941S,Cell Signaling)、抗F4/80(70076S,Cell Signaling)和抗CD4(25229S,Cell Signaling)；流式细胞术抗体，包括H2kb-PerCPCy5.5(克隆AF6-88.5；Biolegend)、CD45-BV605(克隆30-F11；Biolegend)、TCRβ-PE/Cy7(克隆H57-597；Biolegend)、CD11b-eFluor450(克隆M1/70；eBioscience)、CD4-AF700(克隆GK1.5；Biolegend)、CD8-APC/Cy7(克隆53-6.7；Biolegend)、7-AAD(Biolegend)、H-2kd-APC(克隆SF1-1.1；Biolegend)、同种型小鼠IgG2a-APC(克隆MOPC-173,Biolegend)和HLA-A,B,C-APC/Cy7(克隆W6/32,Biolegend)；BioXCell抗体，包括抗小鼠PD1(克隆RMP1-14；BE0146)、抗小鼠CD4(克隆GK1.5；BE0003-1)、大鼠IgG2a同种型对照(克隆2A3，BE0089)、抗CD20(克隆AISB12，BE0302)、抗CD8(克隆53-6.72；BE0004-1)。使用pH 7.0稀释缓冲液(BioXcell)稀释抗体。ATT-I(B20054；CAS#73069-13-3)购自YuanyeBiotechnology Co.(中国)。
实施例4肿瘤植入和处理
对于盲肠中MC38结直肠癌细胞的原位注射，将小鼠麻醉并在腹部周围剃毛。为了暴露盲肠，我们在皮肤和肌肉上做了小切口。使用30号针将表达荧光素酶的MC38细胞在包含2x105个细胞的终体积为50μl的PBS中注射。将盲肠重新定位在小鼠体内，并使用手术缝合线和伤口夹闭合伤口。对于皮下肿瘤实验，使用30号针将1x105个MC38细胞或5x104个CT26细胞在终体积为50μl的PBS中注射。小鼠在肿瘤植入后7天被随机分配到不同的组中。每周3次腹膜内给药抗PD1或同种型对照处理，以200μg/小鼠总共5次注射。ATT-I每天以50mg/kg体重腹腔内给药。对于耗竭实验，每周给药抗CD4、抗CD8、抗CD20和同种型抗体三次。抗体在肿瘤细胞接种前两天给药，并且注射持续到实验结束。在腹腔内注射200μl的15mg/ml荧光素(荧光素钾；Gold Biotechnology,MO,USA)后，使用IVIS光谱通过体内生物发光肿瘤成像监测原位肿瘤生长。在底物给药后15分钟获得荧光信号。
实施例5CyTOF样品处理和数据分析
切除肿瘤并手动切割成2mm x 2mm的块。然后根据制造商的程序使用小鼠肿瘤解离试剂盒和GentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotec)对它们进行酶促和机械解离两者。使用100微米过滤器(BD Falcon)进一步过滤细胞。离心后，将红细胞裂解(Biolegend)、中和、洗涤并重悬于自制的CyTOF缓冲液(包含0.5％BSA和0.02％叠氮化物的冷PBS)中。对于每个样品使用1.5x 106个细胞。使用Cytobank平台(36)通过viSNE分析评估CyTOF数据。viSNE分析允许使用t-分布随机邻域嵌入(tSNE)算法的Barnes-Hut实现在二维中进行高维分析可视化。我们通过比例采样对样品进行viSNE分析，具有7500次迭代，困惑度为30，θ为0.5。在此viSNE分析中，我们执行了SPADE聚类。然后基于所选标记在SPADE树上手动门控细胞群。此后，这些聚类的细胞群在viSNE上显示为叠加图。
实施例6微量热泳动分析
将纯化的Psmd4蛋白用Alexa-647(Thermo Fisher,A20173)标记。化合物在1nM至500uM之间滴定至恒定量的Alexa-647标记的Psmd4。测量前将样品在室温下温育10分钟。在具有20mM Tris、100mM NaCl和0.02％吐温-20的缓冲液中进行结合测定。NanoTemperMonolith Instrument(NT.115)用于测量热泳动。实验中使用了标准毛细管(cat#K002,Nanotemper)。在化合物存在下对蛋白质的热泳动分析30秒。在室温下进行测量。
实施例7三维蛋白质结构分析
PyMol图形程序用于描绘三维结构。Schrodinger药物发现包用于预测在ATT-I和Psmd4之间的共价复合物的结构。Schrodinger中的Maestro模块用于处理蛋白质结构。添加氢原子，并且可电离残基的质子化状态由pro-pKa指定。该结构是能量最小化的。CovDock模块用于ATT-I与Psmd4的共价对接。
实施例8小鼠和人类患者来源的肿瘤类器官的产生
将MC38 OVA肿瘤和人结直肠癌样品(使用经批准的机构方案和患者知情同意获得)切成小块(3mm x 3mm)，根据制造商的指南(Miltenyibiotec)，分别使用MACSDissociator(Miltenyi Biotec)将其加工成小块并使用小鼠或人肿瘤分离试剂盒消化成单细胞。将分离的细胞用F12/DMEM 10％FBS培养基培养过夜，该培养基补充有1％青霉素-链霉素和150U/ml鼠IL2(#575402,Biolegend)或人IL2(#589102,Biolegend)。收获贴壁细胞以产生类器官。对于人临床样品，还通过抗人CD8+T细胞珠富集并用人T活化剂CD3/CD28Dynabeads(Milenyi Biotec)刺激CD8+T细胞。使CD8+T细胞在F12/DMEM 10％FBS培养基中扩增。将贴壁细胞以2x105个细胞/ml的浓度悬浮在包含10％Matrigel基底膜基质(Corning,356255)的HICS minus Wnt培养基中，据报道其可以用于产生结直肠肿瘤类器官(37)。将细胞以每孔2ml的总体积接种在具有超低附着表面的6孔培养板中(Corning)。将细胞培养一周以产生类器官。每2-3天添加相同体积的培养基并分到两个孔中。直径为70-150μm的鼠类器官依次通过70μm和然后150μm细胞过滤器(70μm,Fisher Scientific,#07201431；150μm,pluriStrainer,#43-50150-03)进行过滤。MC38 OVA类器官用和不用药物处理48小时，并且然后与从OT-I小鼠分离的CD3/CD28珠活化的CD8+T细胞共培养24小时。患者来源的肿瘤类器官与自体CD8+T细胞共培养。类器官在光学显微镜下成像，消化成单细胞并通过流式细胞术分析。使用图像J软件1.50e分析类器官尺寸。
实施例9Psmd4蛋白表达和纯化
pGEX-6P-1载体用于克隆重组蛋白GST-Psmd4。使Mouser PSMD4cDNA片段(NM_001330692.2.)扩增并连接到pGEX-6P-1载体(Addgene)中。为了获得重组蛋白，将pGEX-6P-1/PSMD4转化到大肠杆菌BL21(DE)(BioLab,UK)中。将阳性克隆在37℃下在LB培养基中培养至OD600达到约0.6。具有终浓度为1mM的异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,Sigma)用于在37℃下诱导蛋白质表达5小时。收获细胞并悬浮在结合缓冲液(140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，pH 7.3)中。细胞通过超声裂解30min，并且然后在4℃下以12,000rpm离心20min去除细胞碎片。收集上清液并根据制造商的说明应用于GlutathioneSepharose4FF柱(Sigma,USA)以纯化重组蛋白。通过Prescission蛋白酶(Sigma,USA)消化GST-标签以纯化没有标签的Psmd4蛋白。
实施例10CD8+T细胞细胞毒性测定
为了产生成熟的细胞毒性T细胞(CTL)，从OT-I小鼠中分离出脾细胞，并在2ng/mlIL-2的存在下用5μg/ml OVA257-264(S7951-1MG,Sigma)刺激3天。然后将T细胞离心并在包含2ng/ml鼠IL2、10％FBS和1％PS的RPMI1640培养基中培养。为了测量CD8+T细胞的细胞毒性，在96孔板中将50,000个富集的CD8+T细胞与MC38-OVA细胞以5:1、1:1或1:5的比例混合。在共培养前48小时，将ATT-I添加到MC38细胞或CD8+T细胞中。在T细胞与肿瘤细胞共培养6小时后，我们通过测量荧光素酶(#E1910,Reporter Assay System,Promega)的活性来评估杀伤效率。
实施例11PSMD4 shRNA和具有稳定PSMD4敲低的MC38细胞
将两种PSMD4 shRNA用于PSMD4敲低：
PSMD4 shRNA#1:
5’-CCGGTTATAGAACAGGGTCACATTGCTCGAGCAATGTGACCCTGTTCTATAATTTTTG-3’(SEQID NO.1).。
PSMD4 shRNA#2:
5’-CCGGGTGAATGTTGACATCATTAATCTCGAGATTAATGATGTCAACATTCACTTTTTG-3’(SEQID NO.2)。
将慢病毒PSMD4 shRNA转导到MC38细胞中。感染后48小时，添加2μg/ml嘌呤霉素培养MC38细胞，以及使存活细胞长成单菌落，从中选择稳定敲低PSMD4的菌落(通过q-PCR测定PSMD4表达)用于体内。
实施例12免疫蛋白酶体测定
使用免疫蛋白酶体活性荧光测定(UBPBio,Cat J4170)，我们确定了用DMSO对照或5μM ATT-I处理来处理的MC38和MC38-PSMD4缺失肿瘤细胞的胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样和胱天蛋白酶样活性。处理24小时后，获得细胞裂解物。使用在360nm激发波长和460nm发射波长下检测到的AMC荧光，确定暴露于每种底物后各自的免疫蛋白酶体切割能力。根据制造商的指南使用孵育期和底物。
实施例13免疫荧光
如前所述进行免疫荧光(38)。简而言之，将细胞(每孔5x103)接种到Millicell EZ8孔载玻片上并培养过夜，用PBS冲洗并在室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定10min。将固定的细胞用0.5％Triton X-100/PBS孵育，并用0.2％BSA/PBS封闭。然后将细胞与一抗(抗HLA-A、B、C)在4℃下孵育过夜，然后在室温下与缀合Alexa Fluor 488的山羊抗小鼠IgG抗体(1:300稀释)孵育1小时。抗体染色后进行DAPI(Sigma-Aldrich)染色。使用封固介质(Sigma-Aldrich)封固样品，并使用Leica TCS SP8(立式高速多光子)共聚焦成像系统拍摄荧光图像。使用Imaris x64 8.1.2软件构建和分析3-D模型。对于3-D成像，使用Imaris显微镜图像分析软件v8.0建立3-D模型。
实施例14单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析
如对于CyTOF样品那样制备肿瘤单细胞悬液。此后，对单细胞进行染色：CD45-BV605、TCRβ-PE/Cy7、CD11b-eF450、CD4-AF700、CD8-APC/Cy7和7-AAD。活的(7-AAD阴性)单细胞被分类为CD45+、CD11b-、TCRβ+。分选后的样品立即提交给核心设施，用于scRNA测序的样品制备。使用3'v2文库制备试剂盒按照制造商的方案(10X基因组学)构建用于下游scRNA测序的文库。扩增和归一化后，将带有索引条形码的cDNA加载到NovaSeq6000(Illumina)上并进行测序。
将测序数据解复用并映射到mm10基因组，以利用Cell Ranger(10XGenomics)检索基因表达计数矩阵。这些矩阵的下游分析由Seurat(V3.1)进行，除非另有说明。所有样品的细胞过滤遵循两个标准：1)单个细胞中检测到的RNA数量应超过500，2)单个细胞中检测到的线粒体基因百分比不应超过15％。合并每个样品的剩余细胞并进行对数归一化。Seurat中的PhenoGraph应用于细胞簇，分辨率设置为0.5。使用归一化的转录表达谱由Rtsne包计算低维t-SNE可视化，困惑度设置为30。每个细胞簇由Seurat中的FindAllMarkers函数找到的标记基因注释。然后使用对数归一化表达水平绘制热图。我们通过点可视化进一步研究了代表性基因的T细胞活化和细胞毒性水平。每个代码的颜色代码代表来自不同样品的相对平均表达水平，以及每个点的大小代表样品中表达细胞的百分比。为了评估每个细胞的细胞毒性水平，我们使用了六种细胞毒性和CD8+T细胞标记基因的平均表达水平，即：Prf1、Ifng、Tnf、Pdcd1、Sla2和Cd8a。通过使用左截断混合高斯模型计算每个细胞中的每个细胞毒性标记基因的显著表达。将具有显著表达的细胞毒性基因的CD8+效应T细胞限定为六个基因中至少有三个显著表达的CD8+效应T细胞，进一步计算其比例。
实施例15使用熔解温度(Tm)漂移基于质谱法(MS)的细胞热漂移测定(CETSA)来鉴定MC38细胞中ATT-I的潜在靶点
为了以高通量方式筛选出ATT-I的潜在结合靶点，对两组细胞进行了它们的蛋白质水平温度依赖性变性曲线比较，每组使用两种生物学上不同的复制细胞培养物。简而言之，这两组是1)DMSO处理的对照MC38细胞；和2)ATT-I(5.0μM)处理的MC38细胞。样品制备、质谱分析、生物信息学和数据评估是与印第安纳大学医学院的蛋白质组学核心设施(ProteomicsCore Facility at the Indiana University School of MedicineMethods)合作进行的，下文简要描述的方法改编自先前公开的报告(39-43)和供应商提供的方案。
实施例16细胞裂解和蛋白质测定
对于细胞裂解，首先制备新鲜溶剂系统(10mL)，其中包含50mMHEPES、200mM NaCl、10mM MgCl2、5mMβ-甘油磷酸盐、0.1mM活性正钒酸钠、2mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)和1x无EDTA的蛋白酶抑制剂(cOmplete Mini,Roche)。然后在包含在1.5mL微管(来自Diagende Inc.的用于超声处理的TPX塑料)中的溶剂缓冲系统(800μL)中使沉淀的细胞活动。接下来使用超声处理系统(Diagende)对活动的细胞进行超声处理，在4℃冷水浴中以开/关分别为30秒/30秒的循环进行15分钟。使用Bradford蛋白质测定法确定每个样品的总蛋白质浓度。然后将所有裂解物稀释至2μg/μl的蛋白质浓度，用于随后的温度处理。
实施例17温度处理、上清液“倾析”和蛋白水解消化
将用DMSO或化合物处理的每个样品的六个等分试样(50μl)放置在为PCR工作流程设计的六个管中，并在热循环仪(Mastercycler Pro，艾本德(Eppendorf))系统中在六个温度点平衡3min：35.0℃；45.3℃；50.1℃；55.2℃；60.7℃；和74.9℃，如别处所述(39,41)。热处理后，将裂解物在4℃下离心20min以沉淀不溶性蛋白质，并且然后倾析出可溶性级分。将来自每个热处理样品中的45μL等分试样进行蛋白质沉淀，以及然后在30μL的Tris.HCl中的8M脲(pH 8.0)中重构。接下来用5mM TCEP对样品进行Cys-Cys键还原，并用10mM氯乙酰胺(CAM)进行烷基化以保护还原的Cys残基。将样品稀释至具有2M脲，并使用胰蛋白酶(Promega)在溶液中消化过夜以得到肽。
实施例18肽的富集
使用真空歧管，使用Vac 1cc C18柱，每个柱50mg吸附剂，55-105μm粒度(Waters Co.)，将所得肽“脱盐”。简而言之，首先将适用于萃取歧管的柱依次用以下洗涤：(1)ACN(500μL)-两次，(2)ACN/H2O70/30(v/v；0.1％FA；200μL)-一次，和(3)MS级水(500μL)-两次。然后通过将真空温和地应用到萃取歧管真空室中将来自每个“消化”溶液的肽固定在C18材料上，以通过收集“流过”级分并将它们再次运行到相同的柱，使每个溶液移动三次。接下来，用500μL的MS级H2O洗涤肽结合的C18柱，并且然后通过使150μL的ACN/H2O 70/30(v/v；0.1％FA)通过三次进行洗脱。将所有洗脱级分收集到1.5mL艾本德管中，并使用快速真空系统进行完全干燥。
实施例19基于串联质谱标签(TMT)的肽标记和分级
然后使用sixplex试剂盒(TMT6plexTM Isobaric Label Reagent Set,2x0.8mg)对各干燥的样品进行基于TMT的标记。TMT通道——TMT126、TMT127、TMT128、TMT129、TMT130和TMT131用于标记源自35.0℃、45.3℃、50.1℃、55.2℃、60.7℃和74.9℃温度处理的肽溶液。简而言之，将每个干燥的样品(相当于10μg的蛋白质消化物)在100μL的50mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)中重构，并将干标记试剂溶解在40μL的乙腈(ACN)中。然后将重构的肽溶液与40μL标记试剂溶液混合，并在室温下放置过夜以标记肽。接下来通过添加8μL的5％羟胺并将反应混合物在室温下保持超过15分钟来淬灭标记反应。接下来将标记的肽溶液混合在一起，并在快速真空系统中进行完全干燥。使用供应商提供的方案(Pierce Biotechnology)，使用反相分级柱(8个级分)对干燥的标记肽混合物进行分级。使用快速真空系统对产生的8个级分进行干燥，并在nano-LC-MS/MS分析之前在0.1％甲酸(30μL)中重构。
实施例20Nano-LC-MS/MS分析
在与EASY-nLCTM HPLC系统(Thermo Scientific)耦合的Q-Exactive PlusTM质谱仪(Thermo Scientific)上进行Nano-LC-MS/MS分析。使用300bar作为施加的最大压力，将十μL当量体积的上述重构级分加载到内部制备的反相柱上。通过使用P-2000激光拉制仪拉动100μm熔融二氧化硅柱以携带用于纳米喷雾的5μm尖端，以及然后用C18反相树脂(粒度：3μm直径；Dr.Maisch HPLC GmbH)填充毛细管来制备每个反相柱。以400nL/min使用从95％A相(FA/H2O 0.1/99.9，v/v)到24％B相(FA/ACN 0.4/99.6，v/v)150分钟、从24％B相到35％B相25分钟的不同流动相(MP)梯度洗脱肽，并且然后保持相同的MP组成再进行5min，以确保洗脱所有肽。使用Nanospray Flex Source(Proxeon Biosystems A/S)将Nano-LC流动相引入质谱仪。加热的毛细管温度保持在275℃，以及离子喷雾电压保持在2.5kV。在肽洗脱过程中，质谱仪方法在正离子模式下运行180min，编程为使用前20种方法从全MS扫描中选择最强烈的离子。其他参数：Microscans 1；分辨率70k；AGC目标3E6；最大IT50 ms；扫描范围数1；扫描范围400至1600m/z；以及频谱数据类型“profile”，以及然后使用参数执行数据相关MS/MS扫描：Microscans 1；分辨率35k；AGC目标1E5；最大IT 64ms；循环计数20；MSX计数1；隔离窗口0.7m/z；固定第一质量100m/z；NCE 38.0；以及频谱数据类型“质心(Centroid)”。相应的数据相关设置使用参数进行设置：最小AGC目标为1.00e3；强度阈值为1.6e4；顶点触发为“-”；电荷排除为“1,7,8,>8”；多个电荷状态为“全部”；肽匹配为“优选”；排除同位素为“开”；动态排除为30.0s；如果空闲“选择其他”。使用ThermoXcalibur(4.1.31.9)软件(Thermo Fisher)记录数据。
实施例21数据分析
使用MaxQuant软件套件1.6.0.16分析生成的RAW文件。根据来自UniProt序列数据库(v.May 2017)的小家鼠蛋白质数据库(FASTA格式)的计算机胰蛋白酶消化搜索MS/MS谱图。使用从www.maxquant.org下载的默认MaxQuant参数设置，但以下内容除外：1)在组特定参数选项中将“类型”设置为“报告离子MS2”；“同位素标记”设置为“6plex TMT”；“报告蛋白质量公差(Reporter mass tol.)”设置为“0.003Da”；2)在组特定参数中——“消化”模式设置为胰蛋白酶特异性，具有最多3个缺失裂解；3)将组特定参数——“修饰”设置为具有可变修饰乙酰基(蛋白质N-末端)；磷(STY)和甲硫氨酸氧化，肽携带每个肽最多5个修饰；和4)全局参数选项——携带7个残基的最小肽长度，最大肽质量为4600Da。请注意，对四个样品分别进行了4次此类搜索。然后将生成的Maxquant“peptides.txt”文件导入MicrosoftExcelTM(版本14.07182.5000,32位)，然后导入12.1.0(64位,Microsoft Windows7Enterprise 64-位,Service Pack 1,/>2015SASInstitute Inc.)进行处理。仅选择那些鉴定为最小PEP值为0.05的肽进行进一步评估。蛋白质定量值是通过仅对独特肽(至少为一种蛋白质对应一种肽)的定量值求和得出的。以下方法用于对每个实验中每种蛋白质获得的量化值进行程序误差校正/归一化。
实施例22统计分析
使用GraphPad Prism和R进行统计分析。使用未配对的t检验对两个数据集进行比较。多于两个数据集的比较使用单因素ANOVA进行，然后进行邦费罗尼(Bonferroni)多重比较检验。对于肿瘤生长测定，我们使用双因素ANOVA进行，然后进行图基多重比较检验。结果显示为平均值±SD或±SEM。卡普兰一梅尔(Kaplan-Meier)图用于生存曲线，并使用对数秩检验进行分析。星号的数量表示显著性水平：*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001和****,p<0.0001。对于scRNA-seq，这些矩阵的下游分析由Seurat(V3.1)进行。所有样品的细胞过滤遵循两个标准：1)单个细胞中检测到的RNA数量应超过500，2)单个细胞中检测到的线粒体基因百分比不应超过15％。合并每个样品的剩余细胞并进行对数归一化。Seurat中的PhenoGraph应用于细胞簇，分辨率设置为0.5。使用归一化的转录表达谱由Rtsne包计算低维t-SNE可视化，困惑度设置为30。每个细胞簇由Seurat中的FindAllMarkers函数找到的标记基因注释。通过使用左截断混合高斯模型计算每个CD8+T细胞中细胞毒性标记基因的显著表达。详细描述了CETSA的统计分析，并包含在方法中。
实施例23ATT-I是促进CD8+T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的天然小化合物
为了鉴定用于改善CD8+T细胞介导的对结直肠肿瘤细胞体外杀伤的小分子化合物，我们筛选了包含594种小分子化合物的文库，这些小分子化合物从中药中广泛使用的超过500种的草本药用植物中纯化(化合物表未显示)。该筛选系统包括稳定表达OVA257-264(鸡卵清蛋白的MHC I类限制性肽表位)的小鼠结直肠肿瘤细胞系MC38和受MHC I类限制并表达OVA特异性TCR的CD8+T细胞。CD8+T细胞新鲜分离自OT-I小鼠(C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J)的脾脏。为了排除具有与化疗药物相似的细胞毒活性的化合物，我们首先评估了它们对CD8+T细胞和肿瘤细胞的细胞毒性(图1A)。筛选出对T细胞和肿瘤细胞二者具有最小低至低细胞毒性(>载剂处理细胞中80％的生存力)的449种化合物，用于使用体外荧光素酶测定法针对抗原特异性OT-I CD8+T细胞对MC38-OVA肿瘤细胞的杀伤进行下一步筛选。最能影响T细胞活性的三种排名靠前的化合物是淫羊藿苷、鹰嘴豆芽素A和白术内酯I(图1B)。它们的活性在T细胞与肿瘤细胞的比例范围为5:1至1:5的T细胞细胞毒性测定中得到验证(图1C)。由于白术内酯I(ATT-I)表现出最有效的活性，我们选择进一步确定其作用机制。在分别预处理CD8+T细胞或肿瘤细胞后，我们发现ATT-I以依赖于肿瘤细胞的方式增强肿瘤杀伤作用，但不依赖于CD8+T细胞，因为仅处理CD8+T细胞对其细胞毒性没有显著影响(图1D和1E)。为了进一步证实ATT-I的活性，我们生成了源自MC38-OVA肿瘤的3D肿瘤类器官，并将它们与OT-I细胞共培养(图2)。与未处理的类器官相比，通过ATT-I处理，肿瘤类器官表现出显著增强的来自OT-I细胞的杀伤。然而，如果不添加OT-I细胞，这种处理对类器官没有显著影响。总的来说，结果表明ATT-I治疗增加了肿瘤细胞的免疫原性。
实施例24ATT-I与免疫蛋白酶体组分Psmd4相互作用
ATT-I是从白术的根茎中分离的主要生物活性成分之一。先前的研究报道了ATT-I的各种药理活性，包括抗炎、神经保护活性和抗肿瘤活性。然而，除了已报道的生物活性外，ATT-I的分子靶点和相关作用机制尚待确定。由于ATT-I的化学结构，在技术上很难通过直接生化方法诸如亲和下拉分析鉴定其蛋白质靶点。在这里，我们对用或不用ATT-I处理的MC38肿瘤细胞进行了称为细胞热漂移测定(CETSA)的基于熔解温度变化的质谱流式细胞术筛选测定。CETSA方法建立在与传统热漂移测定相同的原理上，因为小分子化合物的靶蛋白在暴露于升高的温度时显示出改变的熔解曲线，并且药物结合导致潜在靶蛋白的显著热稳定或不稳定。对照和ATT-I处理的MC38肿瘤细胞裂解物被加热到不同的温度(32℃至75℃)。通过质谱法对细胞裂解物可溶性级分中的可检测蛋白质进行定量，并确定它们的熔解温度漂移。在筛选出的最有潜力的蛋白质靶点(Cggbp1、Sorbs3、Copb1和Psmd4)中，我们从其蛋白质变性曲线和热漂移中验证了Psmd4是ATT-I的主要靶蛋白。蛋白酶体26S亚基非ATP酶4(Psmd4)是处理MHC-I相关抗原肽的26S免疫蛋白酶体复合物中的19S调节复合体盖的重要组成部分。在免疫蛋白酶体中，Psmd4充当泛素(Ub)受体，介导泛素化蛋白的募集以进行降解和抗原加工。通过对小鼠(MC38)和人(HCT116)CRC细胞的蛋白质印迹测定进一步验证了Psmd4的改变的蛋白质稳定性和热漂移，其表明在ATT-I处理后增强的Psmd4蛋白质稳定性。为了证实ATT-I与Psmd4的直接相互作用，纯化了细菌表达的小鼠Psmd4并在微量热泳动(MST)结合测定中在不同浓度下与ATT-I一起孵育。结果显示ATT-I对Psmd4具有显著高的亲和力(Kd＝0.4μM)(图2)。包含Psmd4的人26S蛋白酶体的结构分析预测了ATT-I在Psmd4的Cys58基团附近的潜在结合位点。ATT-I的结合可能会阻止Psmd7(蛋白酶体的另一个调节亚基)与Psmd4的相互作用。虽然Psmd7在免疫蛋白酶体中的功能作用尚不清楚，但我们想了解ATT-I是否能促进免疫蛋白酶体在癌细胞抗原加工中的活性。为了验证ATT-I对26S免疫蛋白酶体的活性，我们评估了用或不用ATT-1处理的MC38细胞裂解物的胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样和胱天蛋白酶样的活性。将Ac-ANW-AMC(胰凝乳蛋白酶底物)、Ac-PAL-AMC(胰蛋白酶底物)和Ac-KQL-AMC(胱天蛋白酶底物)底物与免疫蛋白酶体一起孵育，并通过释放的AMC荧光测量它们的裂解活性。ANW和PAL是免疫蛋白酶体的优选底物，而KQL可以被免疫蛋白酶体和组成型26S蛋白酶体二者裂解。ATT-I处理导致免疫蛋白酶体在处理所有三种类型底物时的活性显著增强。然而，细胞中PSMD4的敲低消除了ATT-I的作用，表明ATT-I对免疫蛋白酶体的活性依赖于PSMD4。
实施例25ATT-I促进抗原呈递并增强CRC免疫疗法的疗效
我们证明了在ATT-I处理后增强了免疫蛋白酶体对蛋白酶底物的裂解活性。因此，这种增强的免疫蛋白酶体活性最终可以促进肿瘤细胞上的抗原加工和呈递。向CD8+T细胞呈递肿瘤抗原是由MHC I类复合物介导的。因此，我们评估了小鼠(MC38、CT26)和人(HCT116、SW837)CRC细胞表面的MHC-I水平。结果表明，小鼠和人肿瘤细胞在细胞表面均表现出更高水平的MHC-I(MC38和CT26分别为H-2Kb和H-2Kd，以及HCT116和SW837为HLA-A、B、C)，表明ATT-I处理的肿瘤细胞上的抗原呈递增加。因为CD8+T细胞通过MHC-I与TCR的相互作用识别肿瘤细胞，我们推断增强的肿瘤细胞识别将改善基于抗PD-1的免疫疗法的疗效。因此，我们在分别携带MC38和CT26来源肿瘤的C57BL/6和BALB/c小鼠中评估了CRC肿瘤对PD-1单克隆抗体(mAb)与ATT-I(50mg/kg)的组合处理的治疗响应(图4A、4B和4C)。至于临床背景，具有高微卫星不稳定性(MSI-H)的MC38来源的结直肠肿瘤对PD-1处理响应更好，而微卫星稳定(MSS)肿瘤模型的CT26荷瘤小鼠显示出低的PD-1治疗效益。有趣的是，在这两种情况下，在PD-1阻断处理中加入ATT-I使得显著控制肿瘤生长，而ATT-I处理本身仅具有适度的效果。结果表明，无论MSI-H和MSS肿瘤细胞中肿瘤新抗原的数量如何，ATT-I处理都可以促进肿瘤细胞的整体抗原呈递。此外，由于免疫抑制性肿瘤微环境，CD8+T细胞通常处于非活性状态，其可以通过PD-1抑制被激活，以更好地杀死具有增强的抗原呈递的肿瘤细胞。我们在原位MC38肿瘤模型中进一步验证了ATT-I与PD-1阻断剂组合的增强的治疗效果(图4D)。尽管与对照小鼠(中位生存时间30天)或仅ATT-I处理的小鼠(中位生存时间35天)相比，PD-1mAb处理显著延长了荷瘤小鼠的生存期(中位生存时间50天)，但PD-1mAb和ATT-I的组合进一步延长了荷瘤小鼠的生存期，中位生存时间>150天。与之前关于白术(每天1.32g，最长达七周)在临床应用中的生物安全性研究一致，在测试剂量下ATT-I的处理在体内没有显著毒性。动物体重和主要器官的病理分析未显示ATT-I处理组和对照载剂组之间有任何实质性差异，表明ATT-I的全身毒性可忽略不计。为了确定ATT-I对Psmd4的特异性靶向是否增强了PD-1阻断的治疗响应，我们用仅PD-1或PD-1与ATT-I组合处理携带MC38-PSMD4缺失肿瘤的小鼠(图4E)。组合治疗中ATT-I的额外益处完全消失，由此证实了ATT-I通过靶向Psmd4的特异性作用。
实施例26ATT-I增强CRC免疫疗法中的CD8+T细胞浸润和细胞毒性
由于ATT-I在免疫检查点阻断疗法中促进了抗肿瘤免疫应答，我们接下来想要明确ATT-I处理对CRC肿瘤免疫学变化的影响。为此，我们在MC38细胞的原位盲肠壁植入后28天收集结直肠肿瘤，用于使用质谱流式细胞术(CyTOF)分析肿瘤微环境。与上述肿瘤生长研究类似，ATT-I处理显著增强了PD-1mAb处理的抗肿瘤作用(图5A)。与PD-1mAb或ATT-I的单剂处理相比，PD-1mAb和ATT-I的组合导致T细胞浸润显著增强并减少巨噬细胞浸润(表1)，从而将平衡向更抗肿瘤的微环境倾斜。进一步分析表明，CD8+和CD4+T细胞在ATT-I与PD-1mAb组合后均表现出较低的CD69表达水平。CD69表达水平降低可能是T细胞耗竭的原因，这也反映在它们分泌干扰素γ(IFN-γ)的能力增强上。
表1：结直肠癌肿瘤中CD45+浸润免疫细胞内不同免疫细胞群的百分比
为了确定负责ATT-I的抗肿瘤作用的免疫细胞群，我们耗竭了小鼠的B细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞(图5B-5D)。在肿瘤接种前和此后每三天腹腔内给药耗竭抗体，直至实验结束。ATT-I与PD-1mAb的组合的抗肿瘤作用在CD8+T细胞耗竭后完全消除。相比之下，CD4+T细胞的耗竭没有显著影响，而B细胞的耗竭仅最低限度地降低了抗肿瘤作用。由于ATT-I的主要作用是通过CD8+T细胞介导的，我们接下来对来自用对照、ATT-I、PD-1mAb或ATT-I+PD-1mAb处理的小鼠的结直肠肿瘤样品应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，以进一步评估每种条件下的CD8+T细胞功能。在scRNA-seq数据的t-SNE图分析中，肿瘤中的细胞类型通过它们的基因表达特征进行评估。我们确定了每次处理的肿瘤中T细胞活化(Icos、Cd28、Cd8a)和细胞毒性(Ifng、Prf1、Pdcd1和Sla2)基因的表达水平(图6A)。我们的数据证实了ATT-I和PD1 mAb的组合处理增强了活化和细胞毒性(图6B)。组合处理组的细胞毒性水平在高细胞毒性CD8+T细胞中显示出显著增加。
接下来，我们应用患者来源的肿瘤类器官(PDO)模型来确定用ATT-I处理肿瘤类器官是否会影响来自同一肿瘤组织的自体CD8+T细胞的细胞毒性。新鲜切除的肿瘤组织取自两名结肠腺癌患者。肿瘤解离后，肿瘤细胞与粘附的基质细胞(成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞)混合形成PDO。当类器官直径达到100μm时，将它们与从同一肿瘤组织中分离出来的预激活自体CD8+T细胞共培养。评估了球体解离和T细胞的细胞毒性(图7A-7G)。正如预期的那样，与对照PDO相比，经ATT-I处理的PDO变得更容易受到CD8+T细胞杀伤的影响，这表现为显著高水平的类器官解离和肿瘤细胞死亡。总的来说，体内和体外研究的结果表明，ATT-I处理通过促进T细胞浸润和细胞毒性，进一步增强了免疫检查点阻断疗法在治疗结直肠癌中的能力。
序列表
<110> 印地安纳大学理事会(The Trustees of Indiana University)
<120> 使用白术内酯I使癌细胞对免疫攻击敏感的方法
<130> PPI23170855US
<150> 63/122,232
<151> 2020-12-07
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 1
ccggttatag aacagggtca cattgctcga gcaatgtgac cctgttctat aatttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 2
ccgggtgaat gttgacatca ttaatctcga gattaatgat gtcaacattc actttttg 58
Claims (12)
1.一种增强CD8+T细胞对癌细胞的细胞毒性疗效的方法，所述方法包括使所述癌细胞与白术内酯(ATT-I)接触。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括与ATT-1的给药组合给药检查点抑制剂的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述癌细胞是结直肠癌(CRC)细胞。
5.一种增加负载抗原的MHC-I复合物在癌细胞上的呈递的方法，所述方法包括使所述癌细胞与ATT-I接触。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述癌细胞是结直肠癌(CRC)细胞。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述接触发生在体内。
8.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的患者给药包含白术内酯(ATT-I)的药物组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述癌症是实体瘤，任选地其中所述癌症是结直肠癌(CRC)。
10.根据权利要求8或9所述的方法，还包括给药检查点抑制剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述ATT-I与化学疗法组合给药。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
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