JP2000508628A

JP2000508628A - 対象体内で免疫応答を誘導する方法

Info

Publication number: JP2000508628A
Application number: JP9533616A
Authority: JP
Inventors: エーデルソン，リチャード・エル
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2000-07-11
Also published as: AU2331597A; CA2249412A1; WO1997034472A1; EP0896506A4; EP0896506A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、光化学療法などの体外血液処理のための改良された方法を提供し、そして関連する組成物を提供する。改良された方法は、因子処理の間に体外血流中に樹状細胞を導入して、末梢血液中に存在する抗原に対する対象の免疫系応答をさらに増大することを含む。本発明はさらに、因子がMHC発現を増大する能力に基づいて血液の体外処理において使用するための因子を同定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】対象体内で免疫応答を誘導する方法技術分野本発明は、対象体内での細胞または組織、特に腫瘍細胞および／または自己免疫疾患を引き起こすＴまたはＢ細胞に対する免疫応答を誘導するための改良された方法に関する。本発明は具体的には、血液を体外処理しおよび体外処理された血液混合物を対象に投与し、標的となる抗原を発現する細胞または組織に対する免疫応答を誘導するための方法および組成物を提供する。特に、本方法は、光化学療法因予などのMHCクラスＩペプチドの発現を増加する体外処理因子を使用すること、および樹状細胞および／または他の抗原提示細胞をそのような因子を使用した処理の間に体外血流に対して使用／添加することを含む。技術の背景免疫系の応答は、体液性または細胞媒介性に分類されうる。体液性応答は、自由に拡散しうる抗体分子の形態をとってＢリンパ球により媒介される。細胞媒介性応答はＴリンパ球（Ｔ細胞）などの特異的に反応性のリンパ球により媒介される。Ｔ細胞は、それぞれのＴ細胞クローンに特徴的な表面受容体を介して外来性抗原と反応する。Ｔ細胞表面受容体は一般的に、ジスルフィド結合された独特のアミノ酸配列を有する２つのタンパク質鎖から構成される（Edelson，R，Annals of N.Y．Acad．of Sclences 636:154-164(1991)）。これら受容体の物理的性質により、特異的な結合能力が付与され、そして個体中に存在する数百万のＴ細胞クローンのそれぞれを別個に機能させることができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞表面受容体の免疫系により認識されることを介して免疫応答を調節する際に機能する。免疫応答の開始の際に、樹状細胞などの抗原提示細胞上の表面マーカーと結合する場合にのみ、Ｔ細胞受容体は特定の抗原を認識することができる。これらの表面マーカーは、もっとも一般的には主要組織適合性抗原複合体（MHC）として知られている分子の一群に属している。抗原提示細胞上の抗原に対してＴ細胞受容体が結合することにより、Ｔ細胞に変化が誘導され、その変化が選択的に細胞媒介性免疫学的応答を導くイベントのカスケードを開始する。皮膚のＴ細胞リンパ腫（CTCL）は、異常Ｔ細胞の単一クローンの充実性拡大（massive expansion）により引き起こされる、免疫系疾患である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療のための体外光療法である"フォトフェレーシス"が記載された（ Edelson，R，Scientific American 256(8):68-75(1988);Edelson，R，上記(1991 )）。フォトフェレーシス処理は、対象の白血球（Ｔ細胞を含む。）を分離し、感光性（photoactivatable）因子（8-メトキシソラレン、"8-MOP"）の存在下にて細胞を放射線照射し、そして傷害を受けた細胞を再注入することを含む。8-MO Pは紫外光により活性化され、細胞DNAを光修飾することができる励起された分子を一過的に形成する。伝えられるところでは、この療法の結果、悪性のＴ細胞クローンの選択的破壊が生じる。悪性Ｔ細胞クローンの一群のうち5％程度を8-MOP ／照射処理に対して曝露し、それに続いて照射され傷害された細胞を対象に戻すことにより、Ｔ細胞表面受容体により媒介される異常Ｔ細胞に対する特異的な応答が起こる；すなわち、実質的には悪性クローンの傷害された細胞が免疫系を駆動し、異常クローンの未処理の残りを特異的に破壊する。フォトフェレーシスはまた、尋常天疱瘡、全身性硬化症、リウマチ様動脈炎、HIV感染および移植器官の拒絶を含む、数種類の自己免疫疾患の治療に対しても使用されている。米国特許第4,321,919号、第4,398,906号、第4,428,744号および第4,464,166号（すべてEdelsonに対して発効されたものである。）は、疾病を有する対象の血液の処理についてのフォトフェレーシス法を記載している。その中で、疾患産生血球細胞は、免疫学的応答状態または悪性度のいずれかである疾病状態の結果として自然に刺激された。具体的には、この方法はそのような自然に刺激された特異的なヒト血球細胞を、紫外光または可視光照射の存在下において、疾患性細胞のDNAと光付加生成物を形成することができるソラレンなどの感光性薬剤を溶解したもので処理することを含む。体外照射の後、傷害されたリンパ球を対象に戻す。傷害されたリンパ球は、自然の工程により、しかし加速されたペースで対象のシステムから一掃される。これはおそらく、細胞膜の完全性が破壊され、細胞内のDNAが改変され、または関連する修飾が生じたためであろう。もっと最近には、特定の抗原に対する免疫応答を特異的に修飾するための方法と薬学的組成物が報告されている。これらの方法は、抗原提示細胞を処理して主要組織適合性抗原複合体分子が結合されていない細胞による発現を増大させ、引き続いて処理された抗原提示細胞を体外で感光性試薬と照射の存在下で抗原と反応させ、抗原結合抗原提示細胞を形成することを含む（例えば、PCT出願第US93/ 11220号、公開番号第WO94/11016号などを参照）。本明細書中で開示される参考文献および／または特許のうちのいずれも、特定の標的抗原に対する免疫応答性を増大する体外血液処理方法および既存のフォトフェレーシス法を増強するために使用しうる方法について記載していない。そのため、標的抗原に対する免疫応答を誘導するための改良された方法および薬学的組成物、対象に特異的な疾患関連抗原調製物を調製する方法および既存のフォトフェレーシス法を増強するための方法が、今もなお必要とされている。発明の概要本発明の方法および組成物は、1）１またはそれ以上の標的抗原に対して免疫応答を誘導するためにフォトフェレーシス法において使用される最新の因子が、処理された細胞中でのMHC発現のレベルを増大するため、それらが有効であること、2）既知のフォトフェレーシス法において体外で処理される疾患エフェクター細胞を含む血液が、結果として疾患関連抗原がMHC分子に弱く結合する抗原として、処理された細胞の表面に移送されること、3）既知のフォトフェレーシス法が、再注入する前の樹状細胞または他の抗原提示細胞に、処理された血液に添加することにより実質的に改良しうること、および4）分離されそして培養された樹状細胞が、ほとんどの場合において免疫系応答が望まれる対象の免疫系応答を活性化するために使用しうること、を同定することに基づいている。これらの観察に基づいて、本発明は、1）疾患関連抗原調製物の調製のための方法および薬学的組成物；2）血液の体外処理を使用する対象体内における免疫応答を誘導するための方法；3）光化学療法などの既存の体外血液処理方法を増強するための方法；4）血液を体外処理する際に使用することができる因子を同定するための方法；5）体外血液処理方法を最適化するための方法；および6）既存の免疫療法的方法を増強するための方法、を提供する。本発明の一態様は、少なくとも一部において、MHCクラスIの発現を増加する薬剤による処理にさらされた未分画の血液中に含まれる疾患関連抗原が（光活性化した化学物質を用いるフォトフェレーシスにおけるものなどの）、in vivoにおいて外来性に添加した樹状細胞により、抗原特異的免疫応答を引き起こすように提示されうるという知見に基づいている。より具体的には、本発明の一態様においては、樹状細胞をフォトフェレーシスなどの体外処理時に処理された血液中に導入する体外血液処理のための方法および改良された方法のための組成物を提供する。同様に、自己抗原または外来性抗原に対する免疫学的寛容を誘導するための方法および臨床的に望ましくない免疫学的応答を抑制する際に有用な組成物も提供する。一般的には、これらの方法は樹状細胞を使用することに頼っている。樹状細胞、好ましくは末梢血液樹状細胞、またはその他の抗原提示細胞をまず対象から回収し、そしてin vitroにおいて培養する。培養された樹状細胞を、例えば上述したような体外で処理した血液試料に添加し、得られる免疫応答の程度を増大することができる。さらに、培養した樹状細胞をサブユニットワクチンと組み合わせて添加し、ワクチン提示を促進しそして増大させることができる。さらに、培養した樹状細胞を追加免疫として使用し、フォトフェレーシスおよびワクチンプロトコルなどの免疫応答の誘導に依存する方法の効果を長くすることができる。本発明はさらに、フォトフェレーシスにおいて使用される光化学因子が処理された細胞上のMHCクラスI発現を増大することから、それらがフォトフェレーシス法において効果的であるという知見に基づいている。この知見に基づいて、本発明は現在使用されている光化学因子に加えて、体外処理方法において使用するための因子を同定するための方法を提供する。さらにこの知見は、因子処理のあいだにMHCクラスI発現の増大をアッセイすることによって処理プロトコルを最適化する手段を提供する。循環"疾病エフェクター"細胞の存在により媒介されまたはそれにより調節される疾患を有する対象を治療するために、本発明の方法および組成物は使用される。疾病エフェクター細胞の例としては、これに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および／またはウィルス感染細胞または細菌感染細胞などの感染された白血球細胞が含まれる。本発明の方法を使用して治療しうる疾患の例としては、これに限定されないが、白血病、リンパ腫、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、および移植組織拒絶が含まれる。これらの症状においては、疾病状態を媒介する抗原（すなわち、"疾患関連抗原"）は、MHCクラスI部位、MHCクラスII部位、またはMHC部位に対してまたはMHC部位から移送されるペプチドに関連する熱ショックタンパク質（すなわち、シャペロン）と関連（結合）するペプチドである。本方法を使用して処理しうるその他の症状としては、ウィルス性ペプチドまたは細菌性ペプチドなどの疾病関連抗原が感染白血球の表面に、通常はMHCクラスIまたはクラス II分子と結合して発現している疾病を含む。本発明の方法および組成物は、いずれかのタイプの抗原提示細胞上での抗原提示に関連する治療用ストラテジーの効率および特異性を改良するために、そして特異的抗原に対する免疫応答を誘導しそして増強するための方法を提供する際に有用である。本発明は、その対象集団に対するフォトフェレーシスが、処理の物理療法としてほとんどまたは全く価値がないことが証明された対象集団（例えばフォトフェレーシスが完全に無効かであることが証明された皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有すると診断された対象のうち25％、および効果が一過的および／または不完全である対象の50％）においてフォトフェレーシスなどの体外血液処理方法の効率を改良するために特に有用である。本発明はまた、一回の手順でその後の投与で使用するための複数の治療用組成物を生成することができる方法および組成物を提供することにより、実質的なコスト節約も提供する。本発明のさらに別の観点によれば、細胞性免疫系応答を増大するための抗原組成物を提供する。抗原組成物は、血液中に含まれる疾病エフェクター細胞から放出される疾病関連抗原と、ソラレンまたはその他の光活性化因子などの検出可能量の処理因子を含む。組成物は、細胞性ワクチンを形成するように、単一濃度の樹状細胞と混合する量の疾病関連抗原を含むように処方される。本発明のさらに別の観点によれば、免疫応答を増大するための生成物を生成する方法およびそれにより生成される生成物が開示されている。この方法は、（ａ）複数の疾病エフェクター細胞を含む調製物を、疾病エフェクター細胞が融解されることなく疾病関連抗原を放出させるために十分な期間酸性化し；そして（ｂ）酸性化された調製物を中性化して生成物を形成することを含む。この方法の一態様においては、調製した抗体を安定化するためにβ２−ミクログロブリンを添加する。本発明は、体外処理の間のいつ停止因子処理を行うか、および処理血液をいつ対象に投与するかを決定するための、力価測定点をさらに提供する。一般的には、これらの方法は体外血液の因子処理の過程中でMHC発現の過程を決定するための当該技術分野で既知の方法に依存している。処理された血液混合物は、因子処理の結果としてMHCクラスI発現の増加が観察／検出されるときに、いつでも投与できまたは樹状細胞と混合することができる。より好ましい態様の詳細な説明を参照することにより、本発明のこれらのおよびその他の観点、および様々な利点および有用性がより明らかになるだろう。図面の簡単な説明図１は、照射２Ｂ４．１１腫瘍細胞および樹状細胞を含む療法用混合物を用いた、腫瘍増殖に対するワクチン接種の抗腫瘍反応を示すグラフである。図２は、樹状細胞（ＤＡＰＣ）を単独で用いた腫瘍増殖阻害を示す。図３は、ＭＨＣクラスＩ発現に対する８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処理の作用を示す。発明の詳細な記述Ａ．一般的記述本発明は、対象において免疫反応を誘導するのに用いるための体外血液処理に用いる改良法を提供する。この改良法は、２種類の療法、すなわちＭＨＣクラスＩ発現（たとえばフォトフェレーシス）を高める因子による体外血液処理と樹状細胞その他の抗原提示細胞により仲介される免疫療法との、相乗的組合わせを採用する。本発明の１態様は、これら２方法を組み合わせると循環Ｔ細胞、Ｂ細胞、または感染した循環細胞、たとえば感染体（たとえばウイルス、細菌、原虫など：ただしこれらに限定されない）に感染した白血球が仲介する疾病状態を伴うと診断された対象の治療に際し相乗的療法効果を及ぼすという知見に関する。Ｂ．具体的記述Ｉ）体外血液処理本発明の１態様によれば、疾病状態にある対象を体外血液処理して１またはそれ以上の疾病関連抗原に対する免疫系反応を誘導するための、改良法が提供される。１態様においては、本発明方法は以下の工程を含む：１）対象から１またはそれ以上の疾病関連抗原を発現する疾病エフェクター細胞を得る；２）対象から樹状細胞その他の抗原提示細胞を得る：３）疾病エフェクター細胞を含有する血液を、ＭＨＣクラスＩ発現を高める因子で処理する（体外血液処理）：４）樹状細胞その他の抗原提示細胞をこの処理した血液混合物に導入して、療法用混合物を調製する；および５）この療法用混合物を、処理細胞と樹状細胞の混合物として、または精製した抗原負荷樹状細胞を含有するワクチンとして、疾病状態にある対象に再注入その他の方法で導入する。本発明はさらに、本発明方法および標的抗原に対する免疫反応を誘導するために用いる他の体外血液処理法に使用できる因子を同定する方法を提供する。具体的には、一部は光化学的因子／治療が処理細胞におけるＭＨＣ発現を誘導する効力により、フォトフェレーシスの有効性が高められることが見出された。ＭＨＣ発現を高める効力を、本発明方法に用いる因子の同定のためのアッセイ点として利用できる。さらにＭＨＣ発現は、本発明方法に最適な治療因子／プロトコールを判定するための効力測定点として利用できる。 II）疾病エフェクター細胞および本発明方法で治療できる状態本発明方法は、疾病状態にある対象、すなわち“疾病エフェクター細胞”、“ 循環性異常細胞”、または“非循環性疾病エフェクター細胞”、すなわち充実性腫瘍細胞など、病理学的状態に関連する抗原を発現する細胞を伴うと診断された対象の治療に有用である。本明細書中で用いる“疾病エフェクター細胞”または“循環性異常細胞”とは、（１）末梢血中に存在し（好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、またはウイルスもしくは細菌に感染した白血球）、（２）病理学的状態または疾病状態を仲介し、かつ（３）病理学的状態を伴わない他の類似細胞とそれらを区別するために利用できるペプチドまたは蛋白質を発現する細胞を意味する。たとえば疾病エフェクター細胞は、トランスフォーメーションして腫瘍細胞となったＴ細胞、自己免疫障害を仲介するＴ細胞であってもよく、あるいは細胞にウイルス、細菌、原虫または微生物に由来する１またはそれ以上の蛋白質／ペプチドを発現させるウイルス、細菌または微生物に感染した細胞であってもよい。本明細書中で用いる“非循環性疾病エフェクター細胞”とは、（１）末梢血中に存在せず（好ましくは充実性腫瘍または感染臓器）、（２）病理学的状態または疾病状態を仲介し、かつ（３）病理学的状態を伴わない他の同様な細胞とそれらを区別するために利用できるペプチドまたは蛋白質を発現する細胞を意味する。たとえば非循環性疾病エフェクター細胞は充実性腫瘍であってもよい。したがって疾病エフェクター細胞（循環性および非循環性）には、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、自己免疫反応または移植組織拒絶反応を仲介するＴ細胞またはＢ細胞、ウイルスまたは細菌に感染してウイルスまたは細菌の蛋白質／ペプチドを発現する白血球または組織、および充実性腫瘍細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、疾病エフェクター細胞は細胞表面に抗原を発現し、Ｔ細胞またはＢ細胞、より好ましくはＴ細胞であろう。好ましい疾病エフェクター細胞は単一クローンに属するＴ細胞である。より好ましくは、疾病エフェクター細胞は多クローン性Ｔ細胞であるか、または充実性腫瘍から得られる腫瘍細胞である。以下に記載するように、本発明方法の因子処理工程、たとえばフォトフェレーシスは、その因子処理細胞のＭＨＣクラスＩ発現および／または疾病関連抗原の輪送／放出が増大するが、直ちに細胞が溶解または死滅することはない程度に、疾病エフェクター細胞に損傷を与える。次いでこの輪送／放出されたペプチドは、空のＭＨＣ部位に進入することにより、または付加された樹状細胞ＭＨＣクラスＩもしくはクラスII部位に存在するペプチドと置換することにより、“バトン方式”で樹状細胞の主要組織適合性遺伝子複合体分子に提示のために伝達される。したがって本発明方法は、白血病、リンパ腫、充実性腫瘍、転移性腫瘍、自己免疫疾患、移植組織拒絶、および移植片宿主相関病などの疾病の治療に有用である。さらに本発明方法は、ＨＩＶ、マラリアなどウイルスまたは細菌性の状態、および細胞内寄生生物その他の因子（たとえばリステリア属菌（listeria）、エプスタイン・パールウイルス、ＨＴＬＶ−１、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス、肝炎Ａ、ＢおよびＣウイルス、原虫、たとえばドノバン・リーシュマニア）により仲介される他の血液性感染症を含めた、ウイルス性または細菌性の状態を治療するのに有用である。本明細書に開示した方法で治療できる原虫感染症の記述に関しては、たとえばGoodman and Gilman's“The Pharma coIogical Basis of Therapeutics”，W.A.Goodman Gilmanら、パーガモン・プレス、ニューヨーク州ニューヨーク（1990）を参照されたい。これらの感染症には、マラリア、アメーバ症、ガーデイア症（guardiasis）、トリコモナス症、リーシュマニア症、トリパノゾーマ症およびトキソプラズマ症が含まれる。 III）対象本発明方法は、対象が疾病エフェクター細胞に対する免疫反応の誘導を必要とする限り、いかなる哺乳動物対象の治療にも用いられるものとする。本発明方法は、好ましくはヒトの治療に用いられる。細胞性免疫反応の調節は本発明の実施にとって重要であるので、本発明方法の対象レシピエントは、たとえば正常に近いＣＤ８陽性Ｔ細胞絶対量により証明されるように、受容能力のある免疫系をもつことが好ましい。ＩＶ）血液採取または組織採取本発明の１態様を実施する際に用いる第１工程は、対象から前記に定義した疾病エフェクター細胞を含む血液、または非循環性疾病エフェクター細胞を含む組織を採取することである。疾病エフェクター細胞を含む血液を採取するための、採取した血液から、たとえば遠心分離により疾病エフェクター細胞を単離するための、および非循環細胞、たとえば充実性腫瘍を採取するための多様な方法が、当技術分野で知られている。これらの方法のうちの幾つかにつき以下に詳述する。当業者は、当技術分野で知られている血液／組織の採取法、分離法および培養法をいずれも、本発明方法において疾病エフェクター細胞、１もしくはそれ以上の標的抗原を発現する疾病エフェクター細胞集団、または非循環性疾病エフェクター細胞集団を含有する血液を得るのに用いるために容易に調整できる。血液または組織の採取量は主として、治療される障害および採用する療法プロトコールに依存するであろう。たとえば処理細胞の１回注射から週１回または月１回までの注射を必要とする療法プロトコールを採用してＣＴＣＬを治療するためには、約２００〜約７５０ｃｃの血液を採取すろ。当業者は、血液１ｃｃ当たりの疾病エフェクター細胞数に基づいて、治療のために採取する必要のある血液量を容易に決定できる。自明のとおり、体外処理に使用する血液を数回に分けて採取してもよい。あるいは、連続法で血液を採取し、処理し、そして再注入してもよい。充実性腫瘍の治療には、療法用および樹状細胞負荷のための抗原供給源の提供用の両方に用いる量の腫瘍を採取する。Ｖ）疾病エフェクター細胞の因子処理対象から血液を採取した後、疾病エフェクター細胞を含有する血液、または精製した疾病エフェクター細胞を、処理因子で体外処理する。本明細書中で用いる “体外血液処理”とは、疾病状態にある対象の血液を採取し、そして因子で処理して因子処理血液試料を調製するプロセスを意味する。本発明の１所見は、フォトフェレーシス法に用いられている光化学的因子が、ＭＨＣ、特にＭＨＣクラスＩの発現を高めるという従来既知の作用を、処理細胞に及ぼすことである。したがって本発明方法に用いられる因子は、ＭＨＣ発現、特にＭＨＣクラスＩ発現を高める作用をもつ、いかなる因子であってもよい。ＭＨＣ蛋白質を発現しない細胞については、細胞の蛋白分解を高めるいかなる因子も使用できる。さらにこの処理因子は、血球の重要成分に対する親和性、または特定の疾病エフェクター細胞に対する親和性をもつ因子であってもよい。本発明方法に使用する因子は化学的因子および物理的因子であってよいが、これらに限定されない。たとえばこの因子は、ＭＨＣ発現および／または細胞性蛋白質分解を誘導する化合物、たとえばプソラレン（psoralen）のような光活性化しうる薬物であってもよい。あるいはこの因子は、血液に施される物理的処理であってもよい。たとえばＵＶ光線、熱ショック、および他の環境ストレスがＭＨＣクラスＩ発現を誘導することは、他の実験下示された。以下に概説するように、当業者はその因子が処理（疾病エフェクター）細胞におけるＭＨＣ発現を誘導する効力に基づいて、本発明方法に用いる因子を容易に同定できる。本発明方法に使用できる光活性化しうる化学的因子の例には、プソラレン類、ポルフィリン類、ピレン類、フタロシアニン、光活性化コルチゾン、血液中に存在する疾病エフェクター細胞と特異的に反応しうる光活性化抗体、光活性化しうる色素、およびポルフィリン分子に結合したモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。光活性化したもの以外の化学的因子の例には、化学療法薬、たとえばシクロホスファミドまたはメトトレキセート、およびサイトカイン、たとえばＴＮＦ−αおよびインターフェロン−γが含まれるが、これらに限定されない。化学的因子以外の例には、ＵＶ照射、Ｘ線照射、γ線照射、静水圧その他の圧力、熱または低温ショック、および超音波が含まれるが、これらに限定されない。プソラレン類は現在のフォトフェレーシス法に用いられている好ましい一群の光活性化しうる因子である。経口投与後、プソラレンは消化管から吸収され、１〜４時間で血液または他の組織中の最大量に達し、経口投与後２４時間以内にほぼ完全に排出される。これらの因子は体外血流に直接に代替として添加するか、または迫加することができる。プソラレン分子は照射前は不活性であり、照射後に一時的に励起状態に活性化される。この一時的に活性化されたプソラレン分子は、細胞のＤＮＡ、蛋白質または脂質と光学付加物を形成し、他の反応性分子種、たとえば単原子酸素を発生することができ、これらは他の細胞成分、たとえば細胞膜、ならびに蛋白質および芳香族アミノ酸のような細胞質成分を修飾することができる。他の因子、たとえばマイトマイシンＣおよびシス−白金化合物も核酸鎖を架橋させることによりＤＮＡに損傷を与えるが、このような他の因子は再注入後も活性状態を維持し、全身性有害作用を及ぼすので、本発明の目的を達成するにはプソラレン類ほど望ましくはない。好ましいプソラレン類には、８−メトキシプソラレン（８−ＭＯＰ）、４'− アミノメチル−４，５'，８−トリメチルプソラレン（ＡＭＴ）、５−メトキシプソラレン（５−ＭＯＰ）、およびトリメチルプソラレン（ＴＭＰ）が含まれる。これら、および他の８−ＭＯＰ類似体は、Berger et al.,Annals N.Y.Acad.Sc ience 453:80-90(1985)に記載されている。８−ＭＯＰの経口投与条件は米国特許第5,147,289号に記載されている。８−ＭＯＰは本発明方法に使用するのに好ましいプソラレンである。光活性化しうる因子を用いる場合、この因子で処理した血液試料を因子処理工程においてさらにＵＶ光線または可視光線で照射する。プソラレン化合物のような光活性化しうる因子を活性化するための照射条件の考察については、たとえば米国特許第5,462,733号（エーデルソンらに交付）を参照されたい。フォトフェレーシス法は、米国特許第4,321,919；4,398,906；4,428,744；4,464,166；および5,147,289号（すべてエーデルソンらに交付）にも記載されている。処理因子による血液または精製した疾病エフェクター細胞の処理は、当決術分野で知られているように、連続血流に対し、またはバッチ方式で行うことができる。体外連続処理は５工程に分けることができる：（１）血液採取；（２）遠心分離；（３）因子処理；（４）細胞プールおよび（５）再注入。用いる因子処理法の選択は主として、治療すべき障害、使用する因子、および利用できる設備に依存する。たとえば光活性化しうる因子を用いる因子処理工程では、因子は血液試料の細胞内またはその表面に存在しうる。これは一般に、体外処理のために血液を採取する前に対象に因子を投与することにより、または連続流処理法を採用する場合には因子を体外血流に直接注入することにより達成される。フォトフェレーシスの基礎となる機構は抗原提示細胞を微妙に修飾してそれらが免疫系の反応を誘導する効力を高めることによると示唆する文献と異なり、実施例に示すように体外血液処理はＭＨＣクラスＩ発現を高め、抗原が輪送されて表面ＭＨＣ分子に結合する（弱く）速度や程度を高めることができる。こうしてこれらの抗原は、再注入前のある時点で血液に添加される樹状細胞その他の抗原提示細胞による提示に利用できる状態になる。ＶＩ．樹状細胞の添加本発明の体外処理法は、休外因子処理と組み合わせて樹状細胞その他の抗原提示細胞を使用することに依存する。樹状細胞その他の抗原提示細胞は、疾病エフェクター細胞を含有する血液に直接または間接に添加されて、因子処理した疾病エフェクター細胞および対象に再注入する前に添加した樹状細胞を含む療法用混合物を形成する。樹状細胞は、１またはそれ以上の疾病関連抗原に対する対象の免疫系反応を増大させるのに十分な量で、血液または精製した疾病エフェクター細胞に添加される（因子処理の前または後）。このような増大は、樹状細胞または抗原提示細胞を添加しない状態で体外血液処理を実施した場合に誘導される免疫系反応水準に対比して測定される。この目的を達成するために１回量に含有される樹状細胞の量は一般に１００万個であるが、１回当たり１０００個から１億個の範囲であってよい。しかし後記のように、多数回分の抗原負荷または非−抗原負荷樹状細胞を得るために、より多数の樹状細胞を調製して処理細胞に導入することができる。一般にこれらの細胞数は、腫瘍攻撃したマウスに、充実性腫瘍に対する動物の特異的免疫系反応を高めるためにペプチド負荷樹状細胞を投与した動物モデルにつきZitvogel,L.,et al.,J.Exp.Med．184:87-97(1996)に記載された細胞数と一致する。Zitvogel,L．らによれば、免疫原性の弱い腫瘍モデルにおいて、ペプチドでパルス処理した樹状細胞３〜５×１０⁵個を、腫瘍樹立後４日目または８日目から開始し、その後４日目ごとに３〜４回、動物に注射した。免疫原性がより強い腫瘍モデルでは、初回（皮内）腫瘍接種後１４、２１および２８日目に動物に注射した。同様な方法で、対象の免疫状態を考慮して、標準的臨床実務に従って対象ヒトのためのプースター免疫化を設計する。樹状細胞を得るための方法は当技術分野で周知であり、以下に詳述される。一般に、用いる樹状細胞は処理細胞の再注入前のある時点で、対象から得られるであろう。樹状細胞は、処理のために血液を採取するのと同時に得るか、または血液採取の前もしくは後に得ることができる。一つの応用において、樹状細胞は、対象からそれらを取出す前にin vivoで活性化することができる。様々な方法を用いて、樹状細胞を取出す前にそれらをin vivoで活性化することができる。例えば、活性化は、樹状細胞を取出す前に、対象に対して充分な用量のＧＭ−ＣＳＦを投与することによって達成できる。本明細書中で用いられる「充分な用量のＧＭ−ＣＳＦ」は、対象において樹状細胞の数および／または活性化状態を増加させるのに充分であるＧＭ−ＣＳＦの投与量および投与回数である。対象の樹状細胞の数および／または活性化状態を増大させるＧＭ−ＣＳＦの典型的な用量は、実施例で与えられる（“Isolation of D endritic Cells from Human Blood”を参照されたい）。このような使用において、本方法の工程は、（１）樹状細胞を取出す前に、対象に対してＧＭ−ＣＳＦを投与し、ここにおいて、そのＧＭ−ＣＳＦの用量は、対象において樹状細胞の数および／または活性化状態を増加させるのに充分であり；（２）疾病に関連した１種類またはそれ以上の抗原を発現する疾病エフェクター細胞を含有する血液を対象から得；（３）樹状細胞または他の抗原提示細胞を対象から得且つin vitroで培養し；（４）疾病エフェクター細胞を含有する血液を、ＭＨＣクラスＩ発現を増加させる因子で処理し（体外血液処理）；（５）樹状細胞または他の抗原提示細胞を、その処理された血液混合物中に導入して治療用混合物を形成し；そして（６）その治療用混合物を罹患した対象中に再注入するまたは他の方法で導入することを含む。概して、単離された樹状細胞は、次の体外処理工程中のいずれの段階でも導入することができる。（１）血液または組織採取工程中；（２）疾病エフェクター細胞単離工程（すなわち、遠心分離）前または後；（３）因子処理工程前または後；および（４）疾病エフェクター細胞プール前または後。したがって、樹状細胞は、因子処理前、中または後に、処理された血液／組織へ導入することができる。血液採取工程中に樹状細胞を導入する利点は、血液採取バッグに対して直接的に樹状細胞を加えることによって高樹状細胞濃度を得ることができるということである。しかしながら、遠心分離法を用いて血液を血漿、白血球および赤血球成分に分離する場合、それは１００％有効ではなく、しかも若干の樹状細胞は血漿および／または赤血球部分に入るかもしれないし、そして白血球部分において因子処理された細胞から放出直後の抗原に対して近接しないかもしれない。したがって、樹状細胞は、引続きの再注入（例えば、注射）のための充分な数のペプチド負荷樹状細胞を確保するために、１種類またはそれ以上の因子処理工程中に体外血流中に導入されるのが好ましい。遠心分離作用は、単独で、または光活性化剤の存在における照射中のような因子処理との組合わせで、樹状細胞と疾病エフェクター細胞との間の接触を増加させることによって疾病エフェクター細胞からの疾病に関連した抗原の放出および転移を促進すると考えられる。したがって、遠心分離中に樹状細胞を導入することは、放出された疾病関連抗原を、加えられた樹状細胞にごく接近して好都合に配置し、それによって、疾病エフェクター細胞から樹状細胞のＭＨＣ部位までの放出されたペプチドの転移を促進し、そしておそらくは、放出されたペプチドの酵素消化を最小限にする。或いは（または更に）、樹状細胞は、因子処理工程中に、処理された血液／組織中に導入することができる。例えば、フォトフェレーシスの因子処理工程は、疾病エフェクター細胞含有部分を、向い合った照射源の間に位置する照射暴露現場に通過させることによって行われる。照射工程中に樹状細胞を導入することは、その樹状細胞を、それらの照射時に疾病エフェクター細胞にごく接近して配置し、それによって、放出されたペプチドの樹状細胞への転移を促進し、そして酵素消化を最小限にする。更に、樹状細胞は、因子処理の前に加えられた後、疾病エフェクター細胞と一緒に処理されることができる。特定の理論に拘束されたくはないが、樹状細胞の因子処理（すなわち、光活性化剤の存在における樹状細胞のフォトフェレーシス照射）は、樹状細胞を活性化してサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ− γ、ＴＮＦ−α，ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３）を放出することもあり、その作用は、対象に対する抗原負荷樹状細胞の再注入後に免疫系応答を更に増大させると考えられる。或いは（または更に）、樹状細胞または他の抗原提示細胞は、因子処理された疾病エフェクター細胞を再注入する前に、血液投与バッグに対して加えることができる。処理工程のいずれの段階でも、樹状細胞または他の細胞を導入する方法は慣用法に基づいており、処理された血液標品中へ樹状細胞を加えるのに容易に適合できる。例えば、処理工程のそれぞれの段階で、慣用的な静脈内管連結は、樹状細胞を注射して通すことができる出入口、例えば、血液採取バッグ、遠心分離装置、因子／照射処理室中に位置した管、および血液再注入バッグを与える。サイトカインなどの追加の試薬は、これらの同じ注入口によって導入することもできる。上の方法において、樹状細胞または他の抗原提示細胞は、血液または組織に対して直接的にまたは間接的に加えることができる。本明細書中で用いられる直接的添加は、加えられた樹状細胞と疾病エフェクター細胞との間に直接的細胞対細胞接触が存在できる条件下において血液または組織（処理前または後）に対して直接的に樹状細胞を加えることを意味する。本明細書中で用いられる間接的添加は、樹状細胞が疾病エフェクター細胞と直接接触した状態にならないように血液または組織（処理前または後）に対して樹状細胞を加えることを意味する。例えば、フィルター膜、透析膜または他の分配用膜は、樹状細胞と疾病エフェクター細胞との間に置くことができる。このような隔膜は、樹状細胞に対して疾病関連抗原を転移させるように作用するが、細胞種を混合させることはない。好ましい隔膜は、約６ミクロン以下の細孔度を有するであろうが、それは、この大きさが、隔膜の通過を妨げる必要があると考えられる小細胞の近似寸法であるからである。下限はないが、しかしながら、細孔度は、処理された疾病エフェクター細胞から放出された抗原または他のサイトカインを通過させるように充分大きくなければならない。或いは、処理された細胞を処理溶液から、例えば、遠心分離によって、放出された疾病関連抗原を残して除去することができ、そして樹状細胞をその得られた細胞不含溶液に対して加えることができる。間接的添加は、処理された疾病エフェクター細胞の対象への再導入に関係することがある潜在的な問題を回避するので、それは大部分の方法において好ましい。樹状細胞は、好ましくは、末梢血から得られるが、骨髄、リンパ節、浸潤した腫瘍および／または拒絶された臓器から得ることができる。樹状細胞は、対象の細胞と「遺伝学的に同一」であるべきである。したがって、本発明の樹状細胞は、好ましくは、対象若しくは対象の一卵性双生児から得られた自己細胞であるし、または概して、対象の免疫系によって自己細胞と認識されるように遺伝子操作されている。理論的には、多数の樹状細胞を末梢血から（例えば、樹状細胞が血液から特異的に吸着され且つ濃縮されるアフィニティー法によって）単離することが可能であり、例えば、Radmayerら，Int.J.Cancer 63:627-632(1995)を参照されたい。しかしながら、樹状細胞をin vitroで培養してそれらの数を増大させた後、処理された体外血流へそれら細胞を導入することが好ましい。概して、培養された樹状細胞は、対象から新たに単離された天然に存在する樹状細胞と同じまたはそれより大きい表面上の提示特性（すなわち、ＭＨＣ分子の数および種類）を有する。樹状細胞は、処理された血液に対してそれら細胞を導入する前に、例えば、細胞表面上の空いているクラスＩまたはクラスＩ部位の数を増加させることによって変更することができる。これは、“Specific Immune System Modulation”と題するＰＣＴ出願第ＵＳ93/1120号、公開第ＷＯ94/11016号（Edelson,R.ら）で開示された方法にしたがって行うことができる。更に、樹状細胞の培養は、ブースター接種に用いることができる樹状細胞源を提供する。多数の参考文献が、樹状細胞を培養し、培養された樹状細胞と精製抗原とを接触させて抗原負荷樹状細胞を形成し、そしてその抗原負荷樹状細胞を動物に対して投与して、その抗原に対する特異的免疫応答を増大させることを記載してきた。例えば、Steinmanら（ＰＣＴ／ＵＳ93/03141号，公開第ＷＯ93/20185号）は、樹状抗原提示細胞（ＤＡＰＣ）前駆体の増殖性培養物を生産する方法を開示している。その方法は、前駆体を単離し、そしてサイトカインの存在下でそれら前駆体を培養することを行う。Steinmanらは、ＧＭ−ＣＳＦが、in vitroの樹状細胞培養に必須のサイトカインであると報告している。したがって、Steinmanらは、 in vitro増殖のための樹状細胞を得るために、対象の血液を試料採取する前のその対象に対してＧＭ−ＣＳＦを投与することを提示した。Steinmanらは、更に、培養された未熟の樹状細胞は、in vitroにおいて抗原を用いてパルスすることができ、そして抗原を貧食し且つそれを樹状細胞表面上で提示される形に処理するであろう、すなわち、Steinman樹状細胞は、クラスIIの適切な抗原提示のための抗原を貧食するに違いないということを報告している。 Steinman法は、（ａ）樹状細胞前駆体を含有する組織源（例えば、血液、骨髄）を提供し；（ｂ）その組織源を、その樹状細胞前駆体の割合を増加させるように処理して、in vitro培養に適した細胞集団を得（例えば、組織源をＧＭ−ＣＳＦと接触させることによる）；（ｃ）その組織源を基質上でおよびＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦの生物活性誘導体を含有する培地中で培養して、増殖性非付着細胞および細胞クラスターを得；（ｄ）それら非付着細胞および細胞クラスターを継代培養して、増殖性樹状細胞前駆体を含む細胞凝集体を生じ；そして（ｅ）それら細胞凝集体を１回またはそれ以上連続継代培養して、樹状細胞前駆体の割合を強化することを含む。成熟樹状細胞は、増殖性細胞培養物から、樹状細胞前駆体を、これら細胞が成熟して成熟樹状細胞になるのに充分な時間培養し続けることによって生産される。成熟樹状細胞は、例えば、高ＭＨＣクラスII，２Ａ１陽性顆粒および指状突起細胞（ＮＬＤＣ）抗原などの細胞マーカーによって識別される。Steinmanらの教示とは対照的に、本発明の好ましい実施態様は、成熟樹状細胞を処理された血液中に導入して、疾病関連抗原負荷樹状細胞を形成することを含む。したがって、本発明の樹状細胞が未熟な状態にあり、そして本発明の疾病関連抗原を与えるように食作用可能である必要はない。樹状細胞（または前駆体）は、樹状細胞前駆体の生存および増殖を促進するのに充分な濃度のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４および線維芽細胞成長因子の存在下で培養される。この量は、ＧＭ−ＣＳＦ等に関する他の細胞（例えば、マクロファージ対顆粒球）からの競合の量に、更には、細胞集団における不活化因子であるＧＭ−ＣＳＦ等の存在に依存する。概して、樹状細胞は、約１〜１，０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養される。更に好ましくは、血液から得られる樹状細胞は、約３０〜８００Ｕ／ｍｌの濃度のＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養される。最も好ましくは、血液からの増殖性ヒト樹状細胞を培養するためのＧＭ−ＣＳＦ濃度は、約４００〜８００Ｕ／ｍｌである。骨髄から得られた樹状細胞を培養するには、更に高濃度のＧＭ−ＣＳＦ（例えば、５００〜１，０００Ｕ／ｍｌ）が好ましい。ＧＭ−ＣＳＦは、天然源から単離できるし、組換えＤＮＡ技術を用いて製造できるし、または化学合成によって製造できる。「ＧＭ−ＣＳＦ」は、天然に存在する（自然の）ＧＭ−ＣＳＦの何等かの生物活性類似体、フラグメントまたは誘導体として定義される。この定義には、ＧＭ−ＣＳＦのフラグメントおよび誘導体が含まれるが、それらフラグメントまたは誘導体は、樹状細胞前駆体の増殖および培養を促進し、そして更に、適当な細胞種上のＧＭ−ＣＳＦ受容体に対して結合するそれらの能力によって識別することができるということを条件とする。追加のサイトカインは、場合により、樹状細胞の収量を更に増加させるように培地中に含まれることができる。これらには、ＩＬ−４（ＧＭ−ＣＳＦとほぼ同様のＵ／ｍｌで（例えば、L.Zitvogel，ら，J Exp Med 183:87-97(1996)を参照されたい））；ＩＬ−１αおよびβ（１〜１００ＬＡＦＵ／ｌ）；ＴＮＦ−α （５〜５００Ｕ／ｍ）；ＩＬ−３（２５〜５００Ｕ／ｍｌ）；単球−マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ，１００〜１，０００Ｕ／ｍｌ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，２５〜３００Ｕ／ｍｌ）；幹細胞因子（SINGLE-C HAIN FORMS，１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）；ＩＬ−６（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）；およびＦＧＦ（１ｎｇ〜５００Ｕ／ｍｌ）などのサイトカインが含まれる。約１０〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のＴＮＦαは、報告によれば、樹状細胞収量を数倍に増加させる。当業者は、本発明で用いるため既知の樹状細胞培養法を容易に適応できる。単クローン性抗体のパネルは、ＧＭ−ＣＳＦで増大した培養物中の細胞を識別し且つ特性決定して、それらが樹状細胞または他の抗原提示細胞であることを確かめるのに用いることができる。成熟樹状細胞を識別するのに適した抗体には、（１）ＭＨＣクラスＩ抗原に対して結合するもの（Ｍ１／４２抗ＭＨＣクラスＩ，ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ 126）；（２）ＭＨＣクラスII抗原、Ｂ２１−２抗ＭＨＣクラスII，ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ 229）に対して結合するもの（Ｍ５／１１４抗ＭＨＣクラスII，ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ 120）；（３）熱安定抗原に対して結合するもの（Ｍ１／６９抗熱安定抗原，ＨＳＡ，ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ 125）；（４）３３Ｄ１抗樹状細胞抗体，ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ 227；（５）指状突起細胞抗原に対して結合するもの（ＮＬＤＣ１４５抗指状突起細胞，Kraal,G.,ら，J Exp Med 163 :981(1986)）；および（６）成熟樹状細胞の周辺核部分の顆粒中の抗原に対して結合するもの（単クローン性抗体２Ａ１およびＭ３４２，Agger,R.,ら,Int Rev Immunol 6:89(1990)）が含まれるが、これらに制限されない。成熟樹状細胞を識別するのに用いることができる樹状細胞によって発現される更に別の抗原には、ＣＤ４４（単クローン性抗体２Ｄ２Ｃで識別された）およびＣＤ１１ｂ（単クローン性抗体Ｍ１／７０で識別された）が含まれる。（例えば、成熟樹状細胞で発現される抗原を識別するのに用いられる若干の単クローン性抗体の説明については、Monoclonal Antibodies，ニューヨーク，プレナム（Plenum）1980年，R.Ken nettら監修，185-217頁を参照されたい）。当業者は、他の抗体を用いて成熟樹状細胞を特性決定し且つ識別することができるし、そして前駆体樹状細胞を特性決定し且つ識別すること、およびこれら樹状細胞の成長段階を区別することもできるということを理解するであろう。処理血液への導入には、薬剤処理の間又はその後のいずれであっても、成熟樹状細胞が好ましいが、未成熟樹状細胞を本発明の疾患関連抗原調製品でパルス処理することもできる。したがって、成熟もしくは未成熟樹状細胞をイン・ビトロで本発明の抗原調製品と接触させることにより、抗原が樹状細胞の表面上に存在する抗原負荷（antigen-loaded）樹状細胞を含む組成物が生じる。特定の理論に結び付けようとするものではないが、これらの成熟樹状細胞は（放出された、疾患関連）抗原を空のMHC部位に直接負荷させることにより、又は、その代わりに、これらの成熟樹状細胞のMHC部位に既存のペプチドを疾患関連抗原と交換することにより抗原を提示するものと信じられる。対照的に、未成熟樹状細胞は、放出された抗原を食作用により取り込み、その放出された抗原を処理してより小さな断片とし、かつMHC分子と結合したそのより小さい断片を抗原提示細胞の表面上に発現させることによるものに加えて、前述の機構により抗原を提示する。様々な参考文献が樹状細胞の培養及び免疫系応答の改変におけるそのような培養細胞の使用を開示しているが、外来性抗原を提示する細胞、例えば樹状細胞、特には成熟樹状細胞を体外で処理した血流に導入して免疫系応答を高めることは従来記述されてはいない。さらに、当該技術分野においては、抗原負荷又は非抗原負荷樹状細胞を体外で処理した血液を再注入した後の追加免疫接種に用いることができることは教示されていない。当該技術分野にそのような教示が存在しないことは、フォトフェレーシス（photopheresis）のような対外血液処理法の根底をなす機構の完全な理解が欠如していること、すなわち、フォトフェレーシスが疾患関連ペプチドの放出を誘発することを当業者が認識できていないことと一致するものと信じられる。このフォトフェレーシスの効果の認識が存在しない状況においては、放出された疾患関連抗原に対する免疫応答を高めるために処理血液に外来性抗原を提示する細胞を加えようとする動機は生じない。樹状細胞に加えて、他の型の抗原提示細胞を本発明の方法に従って、すなわち、本明細書に開示される方法及び組成物において樹状細胞をこれらの代替抗原提示細胞に置き換えることにより、用いることができる。例えば、“抗原特異的Ｔリンパ球応答の誘発（Induction of an antigen-specific T-lymphocyte respon se）”と題するカナダ特許出願2,069,541号（発明者、Meliefら）には、ペプチドをMHC部位に負荷することができない抗原提示細胞が、すなわち、細胞表面での適正な抗原の提示を妨げる抗原処理欠陥をそれらの細胞が有することが記述されている。その結果、これらの欠陥細胞のMHC部位は空であり、本発明の疾患関連抗原への結合に利用することができる。一般に、これらの細胞は、MHCクラスI 又はMHCクラスII分子へのペプチドの負荷が生じる部位である亜細胞区画（小胞体及びゴルジ装置）へのペプチド移送の責任を負うその細胞の遺伝子産生物の1 つに欠陥を有する。例示的な処理欠陥細胞系には、ネズミ科起源のRMA−S細胞及びヒト起源の174CEM T2細胞（Salter，R．D.ら，EMBO J 5:943-949(1986)）が含まれる。内的に処理されたペプチドを欠く細胞表面MHCクラスI又はクラスII分子の集団を増大させて発現するのであれば、本発明の抗原提示細胞における処理欠陥は完全である必要はない。このような細胞は、MHCクラスI結合ペプチドを適切に負荷させた場合、主要CTL応答を誘発することが可能である。また、本法において用いられる抗原提示細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理して適正な抗原処理及び細胞表面での提示の責任を負う1以上の遺伝子が不活性化されている抗原提示細胞であってもよい。このアプローチは抗原提示細胞上の空のクラスI分子の数を増加させ、それにより、処理された疾患作動体細胞から放出される抗原性ペプチドをこれらの細胞が結合するのをより可能なものとする。したがって、例えば、樹状細胞又は他の抗原提示細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの処理遺伝子もしくはmRNA（例えば、ヒトTAP−2遺伝子）へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、インキュベートする。このTAP遺伝子は、細胞表面への連結移送に先立って、関連細胞質ペプチドをクラスI分子に移送するのに必要なタンパク質をコードする。したがって、TAPタンパク質の形成を阻害することによりクラスI分子がペプチドで充満することが少なくなる。そのため、この状況は表面の “空の”クラスIの量を増加させる。培養RMA及びEL4細胞又は新たに単離した脾臓細胞においてTAP−2遺伝子を不活性化するための例示的な条件及びオリゴヌクレオチドは、Nair，S.ら，J Immunology 156:1772-1780(1996)に提供されている。特に、S．Nairは、MHCクラスIの発現がAS-1又はAS-2アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されている細胞の約30％で減少したことを報告している。これらのオリゴヌクレオチドはTAP−2 mRNAの2つの異なる領域に相補的であり、25ヌクレオチド長のホスホロチオエート誘導体として合成された（これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列及び貯蔵情報についてはNair，S.ら、同書を参照のこと）。 Nair．S.ら、同書によって記述されるものに基づく以下の手順は、本発明における使用に好ましい抗原提示細胞の調製に用いられる。簡潔に述べると、抗原提示細胞（好ましくは対数期にあるもの）を培地（例えば、Opti−MEM培地、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））で洗浄し、5ないし10×10⁶細胞／m lで培地に再懸濁し、かつ24−ウェル又は6−ウェルプレートに加える。Chiangら，J Biol Chem 266:18162(1991)に記述されるように、カチオン性液体、例えばリポフェクチン（Lipofectin）（ライフ・テクノロジーズ）、を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に送達する。オリゴヌクレオチドを細胞内に送達するための当該技術分野において公知の他の方法（例えば、受容体介在送達、電気穿孔法）を本明細書に説明されるリポフェクチン法の代わりに用いることができる。オリゴヌクレオチド及びリポフェクチンを所望の濃度（下記参照）で培地に添加し、12×75mmポリスチレン管内において室温で20分間混合する。この複合体を細胞に添加して400mMオリゴヌクレオチド及び15μg／mlリポフェクチンの最終濃度を達成し、37℃で6ないし8時間インキュベートする。これらのアンチセンス処理細胞を洗浄し、下生理学的温度（好ましくは、23ないし30℃の範囲内）で24 ないし48時間インキュベートしてフローサイトメトリによりMHCクラスIの発現について分析し、標準手順（例えば、クロム放出検定）を用いるCTL誘導の刺激体として用い、及び／又は引き続くイン・ビボでの疾患関連ペプチドの提示のための抗原提示細胞として（例えば、アンチセンス処理細胞を体外血液系に再注入し、もしくは他の方法で導入することにより、又はアンチセンス処理細胞をイン・ビトロで疾患関連ペプチドと共にインキュベートし、次いでそのペプチド負荷アンチセンス処理細胞を被験者に導入することにより）用いる。好ましくは、アンチセンス処理細胞は、それらのアンチセンス処理細胞を疾患関連ペプチドと共にインキュベートする前に、又はそれと同時に、ベータ2−ミクログロブリンと共にインキュベートする。ベータ2−ミクログロブリン及び疾患関連ペプチドでの前処理又は同時インキュベーションは、アンチセンス処理抗原提示細胞の空のMH CクラスI部位へのペプチドの負荷を容易にするものと信じられる。特に好ましい態様においては、以下のタンパク質をコードする１以上のcDNA（又は遺伝子配列）を処理欠陥細胞系（例えば、T2細胞系）に導入（例えば、形質移入）して本発明の方法に従って用いるための改善された抗原提示細胞を得る：（1）サイトカイン（1種もしくは複数）（例えば、GM−CSF、IL−12）;（2）同時刺激分子（1種もしくは複数）（例えば、B7−1/CD80及びB7-２/CD86（Mayordo mo，J.ら，Nature Med 1:1297-1302(1995)）又は接着分子（例えば、ICAM−1／C D54、ICA−3／CD50（Young，J.ら，J Exp Med 183:7-11(1996)及びそこで引用される参考文献））のようなアクセサリ分子；並びに（3）被験者のMHCクラスI分子の１以上。ヒトB7−1及びB7−2はFreedman，A．S.ら，J Immunol 137:3260-32 67(1987)、Freeman，G．J.ら，J Immunol 143:2714-2722(1989)、Freeman，G．J .ら，Science 262:909-911(1993)及びAzuma，M.ら，Nature 366:76-79(1993)に記述されている。したがって、サイトカイン（好ましくは、GM−CSF）及びアクセサリ分子（好ましくは、B7及び／又はICAM−1分子）をコードする1以上のcDNA を処理欠陥細胞系（好ましくは、T2細胞系）に導入することにより改善された樹状貯蔵細胞系を調製することができる（マウスモデル系において樹状細胞に GM−CSFをコードする遺伝子を形質導入するための例示的な手順については、例えば、Paglia，P.ら，J Exp Med 183:317-322(1996)を参照のこと)。改善された樹状貯蔵細胞系は、哺乳類動物（好ましくは、ヒト）細胞における遺伝的物質の導入及び発現について当該技術分野において公知の標準的手順に従って調製及び維持することができる。さらに、好ましい態様においては、この樹状貯蔵細胞系は被験者に特異的な抗原を発現する細胞の調製に用いられ、この調製は、例えば、標準的な遺伝子工学手順を用いて被験者のMHCクラスI分子をコードするcDNAをこの貯蔵細胞系に導入することによるものである。もちろん、このような形質転換抗原提示細胞は、被験者に投与する前に処理して（例えば、ガンマ−照射して）さらなる細胞分裂を防ぐ。さらなる細胞分裂を防止するのに十分である照射の量及び性質は、細胞を予め選択された照射源（例えば、ガンマ−照射、8−MOP及び紫外線照射、X−線照射、8−MOP及び可視光照射）で一続きの強度（例えば、1 000ないし3000rad）にわたって予め選択された期間（例えば、0.5分ないし24時間）照射し、所定の期間、通常は1ヶ月間クローンが生じるかどうかを観察することにより、経験的に決定する。この期間あらゆるクローンの発生を防止するのに十分である照射の量及び性質が選択される。報告されるところでは、典型的には、2000radのガンマ−照射がこの目的を達成するのに十分なものである（例えば、Zitvogei，L.ら，J Exp Med 183:87-97(1996)を参照)。イン・ビボでのさらなる細胞分裂を防止するために照射しなければならない上述の形質転換細胞系とは対照的に、被験者から誘導された培養樹状細胞は被験者への再導入に先立つ照射を必要としない。しかしながら、疾患関連抗原を負荷している樹状細胞は、好ましくは、被験者への再導入（例えば、静脈内再注入）に先立って（例えば、ガンマ−照射で、又はフォトフェレーシスの間に体外流内で）照射し、被験者への投与に続く樹状細胞による自己（非疾患関連）ペプチド（例えば、自己免疫応答に介在することが可能なペプチド）のイン・ビボ処理及び望ましくない提示を防止する。提示される抗原に対する被験者の免疫応答をさらに高めるため、任意に、樹状細胞の培養に重要なサイトカインであるGM−CSF及びIL−4が抗原負荷樹状細胞と共に被験者に同時投与される。これらの鍵となるサイトカインに加えて、報告されるところでは、TNF−α及びIL−12も、おそらくはCD8 T細胞応答を誘発することにより、樹状細胞が介在する免疫系調節に重要である。したがって、本発明の方法は、以下のサイトカイン、GM−CSF，IL−4、TNF−α及びIL−12のうちの1以上の存在下において樹状細胞を処理血液に導入する工程を任意に包含する。好ましくは、TNF−α及び／又はIL−12を樹状細胞と共に処理血液に導入し、又は再注入に先立つ特定の段階で導入する。樹状細胞の導入に続く体外処理工程のあらゆる段階で、その治療用混合物の試料を採取して検定し、上に収載されるマーカーを用いて、例えば、生存可能な樹状細胞の数及び／又は疾患関連抗原負荷樹状細胞の数を決定することができる。これらのマーカーを生存不可能な細胞の細胞質を標識するフルオレセイン二酢酸塩と共に用いることにより、生存可能な樹状抗原提示細胞の数を決定することができる。生存可能な樹状細胞の数は標準的な慣例に従い、例えばトリパンブルー排除検定により、決定することができる。抗原負荷樹状細胞の数は、例えば、PC T公開WO 94／02156号又はWO 94／21287号に記述されるもののような細胞毒性T細胞検定を用いて決定することができる。樹状細胞の生存可能性及び／又は機能的活性を検定するための代替手順は当業者に公知であり、定型的な実験法を用いて行うことができる。例えば、PCT公開WO93／20185号、WO93／03766号、WO95／296 98号、WO94／02156号、WO94／20127号、WO91／13632号、WO95／28479号、WO94／ 21287号及びCA特許出願2,069,541号を参照のこと。ＶＩＩ）再注入治療用混合液を形成するため、樹状突起のまたは他の抗原提示細胞を処理済血液に加えた後（直接または間接的に）、その混合液を処理済樹状細胞／処理済細胞混合液として対象に再注入する、または単離された抗原負荷樹状細胞を得るためにさらに処理することができる。前者は病気細胞抗原のさらなる源（すなわち、因子（ａｇｅｎｔ）で処理した病気細胞抗原）を提供することのできる効率的な方法を提供する、一方後者は潜在的生存可能疾病エフェクター細胞を除去するだろう。再注入に先立つ樹状細胞の再単離は多様な再注入量および免疫療法に用いることのできる抗原負荷樹状細胞の源を得る方法を提供する。特に、該当技術分野において通常の知識を有するものに知られる方法に従い、免疫応答を誘導するために、樹状細胞を因子処理した血液と接触させることにより作られたペプチド負荷樹状細胞は免疫原として対象にその細胞を施すことにより用いられることが可能である。好ましくは、樹状細胞はもとの細胞を得た個体と同じ個体に注射される。注射部位は皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、または静脈内(i.v.)、であろう。抗原負荷樹状細胞の静脈内投与は投与の方法として好ましい。対象に投与される抗原負荷樹状細胞の数は、抗原、対象の免疫状態、対象の大きさ、および処置される病気の関数として変化する。好ましい態様において、血液は組織の源として用いられ、好ましくは血液生成を刺激するために対象は最初にサイトカインで処置される。樹状前駆細胞の単離および増大に続き、抗原を導入前に成熟させるために前駆細胞は因子処理した疾病エフェクター細胞から作られた抗原調製物と接触される、および／または、あるいはサイトカイン（たとえばGM-CSF）により刺激される。抗原負荷樹状細胞は免疫反応を引き出すために十分量を対象に対し再導入される。一般的に1Ｘ10⁶と10Ｘ１０⁶の間の樹状細胞は対象へ１回の注射量を構成する。好ましくは、およそ１から100μgの抗原がその提示された型式において一回あたりに投与される。例えば、10から１００回の投与に十分量の樹状細胞（抗原の負荷した）を調製するため、およそ1ｘ10⁸からおよそ1ｘ10⁹の樹状細胞が、処理に先立ち、または処理中または処理に引き続き体外血液へ導入される。体外処理済血液中に含まれた病気関連抗原との接触に続き、樹状細胞は病気関連抗原を処理（貧食）しMHC クラスIまたはII分子との相互作用において処理した抗原を提示するか、あるいは直接MHCクラスIまたはII分子に病気関連抗原を付与する。結局、このような抗原負荷樹状細胞は、体外処理の最終段階の間に再注入に先立って１つに集められる。集められた樹状細胞は処理した疾病エフェクター細胞とともに、または伴わずに次の追加抗原刺激免疫化まで保存できる。好ましくは、これらの集められた抗原負荷樹状細胞および他の処理を施した疾病エフェクター細胞は保存に先立ち別の分注へと分けられ、各分注は対象への１回の注射に十分な量の樹状細胞を含む。細胞は細胞が生存性を回復できるような標準的方法に従い保存されることが可能である。好ましくは-70℃で細胞は保存される。ＶＩＩＩ）抗原非負荷樹状細胞本発明の別の態様において、抗原非負荷樹状細胞は、本発明の方法の処置を施されている、または免疫反応を誘導することの望まれる別の方法（例えば日常的な予防接種プロトコールの間）による処置を施されている、または免疫活性の上昇の必要がある（例えば腫瘍細胞成長を阻害すること）対象に対し、１回またはもっと多くの追加接種に用いられることが可能であることが見いだされた。特に、処理済疾病エフェクター細胞と接触させていない、単離または培養される樹状細胞は、細胞性および体液性の免疫反応の上昇の手段として対象に導入される。この方法の適用において、樹状細胞は疾病エフェクター細胞に対し記載した方法と類似の方法で処理された。実施例に示したように、光化学因子（ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｇｅｎｔ）で処理された樹上細胞は、樹状細胞を処理済疾病エフェクター細胞または病気関連抗原と接触させることなしに、動物モデルにおいて腫瘍成長を大幅に減少または除去した。ＩＸ）化合物含有抗原先行技術は固体腫瘍抗原の混合物または精製ペプチド抗原に対する細胞性免疫の強化のための抗原負荷樹状細胞を報告したが、血液を因子処理（フォトフェレシス等）することによって病気関連抗原を調製する方法、および処理済血液を抗原ソースとして用いることは記載されていない。本発明の別の側面によれば、免疫系の反応を増大させる抗原組成物が開示される。抗原組成物は共通して、本明細書に記載したように、体外での因子処理によって血液に含まれる疾病エフェクター細胞から遊離された複数の病気関連抗原を有する。さらに、組成物は所望により検出可能な量の１つまたはより多くのプロテアーゼまたはペプチダーゼに対する阻害剤含む。例示的なプロテアーゼまたはペプチダーゼ阻害剤、およびそれらを含む化合物は：(1)ベスタチン(30μM)、チオルファン(10μM)、およびカプトプリル(10μM)を含む混合物、(2)フェニルメチルスルフォニルフルオイド(セリンプロテアーゼ阻害剤)、(3)n-エチルマレイミド、およびさまざまな非選択的ペプチダーゼ阻害剤(例えばEDTA,o-フェナントロリン、バシトラシン)、(4)ベンゾアミド(2ｘ10²mol／L)、(5)アマスタチン、カプトプリル、フォスフォラミドンを含むペプチダーゼの混合物、(6)アクチノニン(6μM)、アルファメニンB(6μM)、ベスタチン(10pM)、カプトプリル(10μM)、およびチロファン(0.3μM)などのペプチダーゼ阻害剤の混合物、および(7)ＨＩＶ感染の処置に有用なな一つまたはそれ以上のプロテアーゼ阻害剤（例えばリトナヴィル、サクィノヴィル、インディノヴィル）を含む。本発明の抗原組成物は低温（例えば細菌類の増殖を避けるために凍結する）において保存できる、または長期の保存に際し凍結乾燥されることが可能である。好ましくは、抗原組成物は１回の使用量の樹状細胞との混合するための量の病気関連抗原を含むように処方される。一般的に各樹状細胞は、抗原ペプチドと結合するようなおよそ100,000のMHC部位を含む。それゆえ１回分の樹状細胞は反応が完全に進むため、すなわちできるだけ多くの病気関連抗原が樹状細胞のMHC部位に負荷されるようにするために、過剰の病気関連抗原に導入される。十分量の病気関連抗原が各樹状細胞と反応し、300から300,000のクラスI部位を満たすことが可能であり、提示されたペプチドに対し特異的な免疫系の応答を誘導する。わずか300程度のある抗原ペプチドに占拠されたMHC部位は免疫反応を誘導するのに十分であることがよく知られている。一般的に10倍から100倍の疾病エフェクター細胞の溶出物を1倍の数の樹状抗原提示細胞と共にインキュベートすることによりこれは成し遂げられる。本発明のさらに別の側面において、免疫反応を強化するのに用いる抗原産物を製造するための選択的な工程が提供される。工程は2つの段階を含む。：（ａ）複数の疾病エフェクター細胞を含む調製物を、疾病エフェクター細胞が、細胞をすぐに融解することなく疾病関連抗原を放出させるために十分な期間酸性化する。そして（ｂ）酸性化された調製物を中性化して生成物を形成する。疾病エフェクター細胞は末梢血より得られ、例えば悪性T細胞、悪性B細胞、自己免疫反応を媒介するT細胞またはB細胞、移植組織拒絶を媒介するT細胞またはB細胞、ならびに細胞表面にウィルス、細菌、または原生動物のタンパク質および／またはペプチドを発現する、ウィルス的、細菌的、または原生動物的が感染した疾病エフェクター細胞を含む。好ましくは、疾病エフェクター細胞は、その表面においてMH CクラスIタンパク質、MHCクラスIIタンパク質、またはMHC部位へ、またはMHC部位からペプチドを運搬することのできる熱ショックタンパク質と相互作用した(結合した)抗原を発現している。より好ましくは、疾病エフェクター細胞は酸性化に先立ち、末梢血より単離される。好ましい態様において、疾病エフェクター細胞はT細胞またはB細胞である。さらに好ましくは、疾病エフェクター細胞はT細胞であり、好ましくは単一のファミリーに属するものである。もっとも好ましい態様において、T細胞は単一クローンである。前記の工程の酸性段階は公開された手順に基づいている。例えば、Storkus，W .，et al．J Immunotherapy 14:94-103(1993)およびL．Zitvogel，et al．,J Ex p Med 183:87-97(1996)参照。例示的なMHCクラスI部位からの抗原の酸溶出の手法は実施例において提供される。好ましい態様において、酸溶出法は室温において行われる。一般的に、疾病エフェクター細胞の調製物をおよそpH2からpH6の間 (好ましくはpH2とpH4の間)におよそ0,5分からおよそ20分の間さらす。好ましい態様において、酸性化は調製物をおよそpH3.3におよそ1分間さらす。その後、細胞調製は標準的方法に従い中和され（例えばペレット化したまたはフラスコに吸着した細胞を緩衝化組織培養培地で洗浄することによる）、溶出したペプチドは好ましくはさらに濃縮される（例えばクロマトグラフィーおよび／または凍結乾燥による）。酸性化の段階をこれらの条件で行うことは、疾病エフェクター細胞をすぐに融解することなしに疾病エフェクター細胞によるそれらの病気関連抗原の放出を導く。所望により、酸可溶化抗原調製物をアリコートに等分し、各アリコートは免疫系の強化のための樹状細胞の１回の量と混合するための十分な量の抗原を含む。好ましくは、分注は保存および輸送を容易にするため、凍結乾燥される。ある特定の理論に拘束されるものではないが、細胞のpH3.3でクエン酸-リン酸緩衝液中での保温は、クラスI複合体を変性させ、ベータ2ミクログロブリンおよび前からクラスIに結合しているペプチドを細胞外培地へと放出させることになることが信じられている(Storkus，W.，et al.(J Immunotherapy 14:94-103(1993))。穏やかなpH処理は即座に疾病エフェクター細胞を可溶化しないために、細胞はそれらのクラスＩペプチド複合体を培養液中に再合成し、それにより培養物中の疾病エフェクター細胞から複数の一団の病気関連抗原が回収されることを可能にする機構を提供する。ある好ましい態様において、樹状細胞または他の抗原提示細胞は病気関連抗原と細胞を接触させるのに先立ち、上記の酸溶出／中和過程を行われる。この方法では、樹状細胞のMHC分子は病気関連抗原への露出に先立ち、それらの外因性抗原が全くない状態にされる。それにより病気関連抗原と相互作用できる空のMHC 分子の数は増加する。また、おそらく病気関連抗原の負荷できる空のMHC部位の数の増加を提供することにより、酸可溶化樹状細胞または他の抗原提示細胞はさらに効率的抗原提示細胞にされる。上記の酸溶出／中性化プロトコールもまたMH C分子からのB2-マイクログロブリンの放出をもたらすと信じられている。それゆえに、酸溶出、中性化された抗原提示細胞による抗原提示の効率を上昇させるために、酸溶出、平中性された抗原提示細胞は、細胞を疾病関連抗原と接触させる前かあるいは同じに、B2-マイクログロブリンとともに保温することが好ましい。さらに好ましい態様においては、酸溶出、中性化された樹状細胞は、これらの抗原提示細胞の空のMHC部位をさらに安定化させるために、生理的温度以下の温度で疾病関連細胞と接触させる。本発明の関連した局面においては、免疫反応を増強させる生成物も開示される。その生成物は(a)即座に細胞を溶出することなく疾病エフェクター細胞が疾病関連抗原を放出するのに十分な時間のあいだ、複数の疾病エフェクター細胞を含む調製物を酸性化すること、および(b)酸性化された調製物を中性化して生成物を形成することの工程によって産生される。好ましくは、疾病エフェクター細胞は末梢血から得る。その工程に関して上に記載したようにその生成物は、提示された抗原に反応する対象の特異的免疫系を増強するために対象に投与するための 1使用量の樹状細胞とともに混合するために十分である量の中性化産物をアリコートが含むように等分された生成物でありうる。以下に提示した特異的な実施例は単に説明上のものであり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。実施例1 樹状細胞の調製例えばヒト末梢血、骨髄および脾臓細胞からの樹状細胞を単離するための様々な方法が報告されている。例えば、名称”Method for Using Dendritic Cells t o Active T Cells(樹状細胞のT細胞を活性化するための使用方法)"(Englemanら、以下"WO 94/02156"）をもつ公開番号WO 94/02156であるPCT出願第PCT/US93/06 653号はヒト末梢血から樹状細胞を単離するための方法、および抗原特異的なT細胞を介した免疫反応を誘発するために、単離された樹状細胞を抗原を提示するために使用するための方法を記載している。さらに近年、前駆樹状細胞の単離およびｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞の増大のための方法が報告されている。例えば、名称"Method for in vitro Proliferation of Dendritic cell Precursors an d their use to produce Immunogens（in vitroでの樹状細胞前駆体の増殖および免疫原を産生するためのその使用の方法）”(Steinmanら、以下WO93/20185)であり公開番号WO93/20185であるPCT出願第PCT/US93/03141号は、ヒト血液からの樹状細胞前駆体の単離の方法、単離された細胞前駆体をｉｎｖｉｔｒｏにおいてGM-CSFの存在下で増大するための方法、および免疫系反応を誘発するために適した、ペプチド負荷された樹状細胞を得るために、増大した細胞前駆体をｉｎｖｉｔｒｏにおいてペプチド抗原により刺激するための方法を記載している。ヒト末梢血からの樹状細胞／樹状細胞前駆体の単離および培養のための以下の過程はWO94/02156およびWO93/20185において記載されているような細胞の培養のための実験計画に基づくものである。 (A) ヒト血液から得られた樹状細胞前駆体の単離および培養本明細書に記載した過程はWO 93/20185(Steinmanら)において供給される単離および培養実験計画から改変したものである。簡潔に述べると、血液単核細胞は Lymphoprep(Nycomed,Oslo)などの標準密度培地における沈澱作用によって単離される。単離された単核細胞は樹状細胞前駆体ではない細胞が激減している。例えば、これらの不純物はCD3およびHLA-DR抗原に対するモノクローナル抗体によって覆われ、親和性精製したヤギ抗マウスIgGによって覆われたペトリ皿において激減している(「ふるい(panning)」)。1mlの培養培地の中のおよそ10⁶個の細胞を直径16mmプラスチック培養穴(Co-star，New-York)に置く。培地(例えばRPMI-1 640)は典型的な増殖栄養成分(例えば50uM 2-メルカプトエタノール、10mMグルタミン、 50μg/mlゲンタマイシン、索状組織由来の加熱による不活性化がなされていない 5%血清または5%ウシ胎仔血清(不活化したもの))およびヒト組換えGM-CSF(好ましくは400U/ml)によって補われる。所望により、哺乳類細胞培養に適した無血清培地が使用可能である。その後2日おきおよび計16日の間、培養液は0.3mlを取り除き、0.5mlをサイトカインが補われた新鮮な培地に取り替えることにより栄養が与えられる。好ましくは、細胞はIL-4，IL-12，IL-1アルファ、TNFアルファ、IL -3，FGFおよび／またはLAFなどの付加的なサイトカインの存在下で培養される。典型的に、これらの付加的なサイトカインは樹状細胞培養の最後の24時間のあいだ添加される。これら同じサイトカインは、抗原負荷された樹状細胞の被験者への投与の間、所望により加えられる。逆位相差顕微鏡を用いた試験により明確である様に、特徴的な増殖樹状細胞の凝集(WO93/20185においてSteinmanらによって「球(balls)」と呼ばれる)が第5日までに現れる。その球は一週間を越える期間のあいだ大きく拡張する。いくつかの球は元の穴に現れるが、典型的にこれらは非接着細胞と同程度ほどには拡がらない。穴は二次培養される。たとえば、細胞密度が上昇するにつれて、1個の穴を2 または3個の穴に分配する。成熟樹状細胞を増殖培養から単離するためには2通りの代替的な研究方法が使用可能である。第一の方法は非接着性の細胞を除去することおよび1gの沈澱作用によって球を非球から分離することを含む。次に樹状細胞は付加的な1または2日の培養を越えて球から多数放出され、成熟樹状細胞は既に記載されたように(Fre udenthalおよびSteinman，Proc Natl Aced Sci USA 87:7688-7702(1990))、密度の高いメトリザミドにおける浮力によって非球から単離される。あるいは、球が非常に大きいときには、成熟樹状細胞は非接着細胞を回収することによって単離される。次いで細胞は氷上に20分放置し、球を分解させるためにピペットで激しく再懸濁し、そして成熟樹状細胞はメトリザミドカラムに浮上する。 GM-CSFは報告されているとおり、樹状細胞球の発生に本質的なサイトカインである。IL-4およびそれより程度は低いがIL-12もまた樹状細胞培養を促進する。T NFアルファを10-50U/ml添加することにより、樹状細胞収率がおよそ2倍に上昇する。60mlの血液をGM-CSFのみの存在下において培養することから始めて、成熟樹状細胞の収率は6から12x10⁶細胞の間であり、細胞の40-80％を表している。あるいは、本発明の目的を達成するために十分な数の樹状細胞は、前培養なしで血液から単離することができる(以下の「ヒト血液からの樹状細胞の単離」を参照) 。例えば骨髄、脾細胞、および胎児または臍帯血液などの樹状細胞前駆体のその他の源が使用され得る。例えば、PCT出願番号第PCT/US91/01683号、公開番号第W O 91/13632号、標題「B細胞リンパ腫に対するイディオタイプワクチン化」("Hoh lenら")は脾臓から樹状細胞を単離するプロトコールを記載している。HohlenらのプロトコールはSteinmanおよびCohen，J Exp Med 139:380-397(1974)により既に報告されている方法に基づいている。 (B) ヒト血液からの樹状細胞の単離本明細書中に記載した方法はWo 94/02156(Englemanら)において供給される単離および培養プロトコールから改変したものである。樹状細胞はリンパ性および非リンパ性組織の両方において見られるが、ヒトにおいて最も直ちに利用できる樹状細胞の供給源は末梢血であり、100個の疾病エフェクター細胞当たりおよそ1 個以下の樹状細胞を含む。樹状細胞培養を必要とすることなく血液から直接十分な数の樹状細胞を得るために、疾病エフェクター細胞濃度を標準ロイカフェレシス実験に従って調製する。一般的に、およそ2億個の疾病エフェクター細胞がロイカフェレシスの間に回収される。このように、樹状細胞はロイカフェレシスによって回収される総疾病エフェクター細胞の母集団のうち1%を表すと仮定して、およそ20億個の樹状細胞がロイカフェレシス疾病エフェクター細胞濃縮物中に存在している。以下で記載するように、この数の細胞は本明細書に開示された方法に従って多重治療を実行するために十分である。さらに、これらの樹状細胞の更なる培養は、治療のため樹状細胞の総数をさらに増加させるために実行することができる。ｉｎｖｉｖｏにおける免疫系応答を開始させるため、高度に精製した樹状細胞の母集団(少なくともおよそ80%、好ましくは少なくともおよそ90%の) が推奨される。血中における、ロイカフェレシス疾病エフェクター細胞濃縮物における血液内の樹状細胞の数は、従って、フォトフェレシスまたはロイカフェレシスの前に造血を刺激するひとつまたはそれ以上の因子を投与することにより増加し得る。それらの因子はG-CSF，GM-CSFを含み、そして造血を促進するその他の因子を含みうる。投与されるべき造血因子の量は要素(群)が投与される対象の細胞の分化を確認することによって決定する。典型的に、G-CSF，GM-CSFなどのサイトカイン因子の濃度は細胞障害性因子による治療から回復途上にある対象を治療するために投与するこれらの因子濃度と同様である。好ましくは、GM-CSFまたはG-CSFは供給組織(例えば血液、骨髄)の除去の前に4から7日間、標準濃度で投与して、樹状細胞の割合を増加させる。(Editorial，Lancet 339:648-649(3月14日，1992))。例示的な濃度はSteinmanら(WO93/20185)において提供される。例えば、1日当たり 300μgのG-CSF濃度での5から13日間および1日当たり400μgのGM-CSF濃度で4から 19日間の服用することにより報告の通り、ｉｎｖｉｖｏにおける樹状細胞前駆体の有意な増加をもたらす。GM-CSFはｉｎｖｉｖｏで樹状細胞を活性化し、それによってｉｎｖｉｖｏにおいてさらにCD8+細胞を活性化する樹上細胞のサイトカインの放出をもたらす、と考えられている。従って、GM-CSFに加えてサイトカイン(例えばIL-12およびIL-4)が、所望により、この方法を促進するために対象に投与される。一般的に、ヒト末梢血単核白血球(PBML)は血液試料、特に、例えばアフェレシス(所望による)、フィコールヒパック勾配遠心および次に続くパーコール密度遠心によって調製される白血球層（ｂｕｆｆｙｃｏａｔ）または白血球から単離される。フィコールヒパック勾配遠心およびパーコール密度遠心によって加工された25から500ミリリットルの血液はｉｎｖｉｔｒｏにおけるさらなる拡張のために十分な数の樹状細胞を提供しうる。高浮遊性密度画分(HD)はT細胞、B細胞および樹状細胞を含み、一方で単核白血球は低浮遊性密度(LD)画分に含まれる。 HD画分のNycodenz/Nycoprep(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)における遠心により樹状細胞(LD画分に存在する)がTおよびB細胞(HD画分に存在する)から分離される。樹状細胞は所望により以下の付加的なプロトコールを用いてさらに増加される（以下に記載）。あるいは、樹状細胞は反復密度勾配遠心、陽性選択、陰性選択、またはその組み合わせを含む過程を用いて単離される。例えば、樹状細胞の陰性選択は非樹状細胞を除去するための抗体を用いてふるいにかけることによって達成され、およそ80-90%の樹状細胞を含む調製物を産生することができる。あるいは、親和性クロマトグラフィーを行う陽性選択が行われ、ここにおいて、樹状細胞表面マーカーに対する抗体が親和性クロマトグラフィーのリガンドとして複合体混合物から樹状細胞を取り出すために使用される。陰性および／または陽性選択に有用な典型的な抗体はWO 94/02156に記載されている。簡潔に示すと、ヒト樹状細胞を以下の方法を用いて白血球層より得ることができた。末梢血単核白血球(PBML)はFicoll-Hypaque勾配遠心分離(Bouyam，Scand J Clin Lab Invest 21:21-29(1968))によって単離される。血液樹状細胞は場合により、さらに例えばＷ０９４／０２１５６に記載された方法によって随意に分離し得る(分離方法を概観するためには特にWO 94/02156図1を見よ)。簡潔に示すと、PBMLは4段階の不連続なPercollの勾配(Pharmacia Uppsala Sweden)(Markowic z and Engleman,J Clin Invest 85:955-961(1990))中でLDおよびHD分画に分離される。樹状細胞を含むHD分画を回収し、テフロン管中の培養液中で、37℃で16-28 時間培養された。その後Nycodenz/Nycopret不連続勾配(Nycomed Pharma,Oslo，N orway)上で遠心分離された。樹状細胞は完全にLD分画に含まれており、全細胞集団の約30-40%を占める。部分的に精製されたこの樹状細胞集団はT細胞プライミングおよびｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでの活性化実験に用いることができる。好ましい態様においては、樹状細胞はｉｎｖｉｖｏでの利用の為にさらに精製され得る。樹状細胞集団のさらなる精製はNycodenz/Nycoprep遠心分離の第２ラウンドを行ってそこから得られるLD分画を集めることで達成される。このLD分画は約80-90%の樹状細胞を含む。あるいは、初めのNycodenz/Nycoprep工程の後のLD分画を抗体で被覆したペトリ皿中でインキュベートしてCD3⁺、CD14⁺、CD16⁺ およびCD20⁺細胞を除くことで約80-90%の樹状細胞を含む非接着性の細胞集団が得られる。一般にこれらの方法によって約400-500mlの全血液から、1-2.5x10⁶個の細胞が得られる。濃縮後の樹状細胞の純度の評価は検出可能な試薬(例えば蛍光色素)に結合された抗HLA-DR抗体(例えばCA141のような抗MHCクラスII抗体)およびフィコエリトリン-結合抗CD14のような抗単核球抗体による染色によって決定される。細胞集団の細胞蛍光画像解析は蛍光活性化細胞ソーターによって評価される。HLA-DR⁺; C D1 4_-細胞は樹状細胞集団を表す。一般に樹状細胞はそのMHC-クラスII決定基の高度な発現及びそのCD14発現の欠如に基づいて容易に他のPBMLから区別され得る。細胞集団のさらなる完全な解析は、樹状細胞と推定される細胞がT細胞およびB細胞の様々な既知のマーカーについて陰性でもあり、樹状細胞の様々な既知のマーカー (上に論じた)について陽性であるかを決定することで達成される。実施例２ｉｎｖｉｔｒｏ投与のための疾病関連抗原の調製樹状細胞または本発明のその他の抗原提示細胞への疾病関連抗原のｉｎｖｉｔｒｏでの投与は当該技術分野におけるいわゆる当業者に既知の方法に従って調製される。本明細書に記載された方法はZitovogel,L．et al．J Exp Med 183:87 -97(1996)に記載された酸溶出プロトコールに基づいている(酸溶出プロトコールについての緩衝溶液および試薬の調製については例えばstorkus.W.et al．J Imm unotherapy 14:94-103(1993)も参照)。体外血流から得られた疾病エフェクター細胞(約1-5x10⁹細胞)はHBSS(GIBCO-BR L)中で３回洗浄され、そして細胞沈殿は穏やかな酸緩衝溶液で処理された。簡潔に示すと、10mlのクエン酸−リン酸緩衝溶液pH3.3を室温で加え、細胞沈殿は速やかに例えばピペッティングなどによって再懸濁し、そして1,000gで５分間遠心分離する。無細胞上清は集められ、そして酸によって抽出された上清内のペプチドは例えば活性化されたSepPak C18 cartridge(Millipore Corp.,Bedford,MA)上で濃縮される。結合した物質は2-3mlの60%アセトニトリル水溶液によって溶出され、ほぼ完全に乾燥するまで(例えば20-50μl)凍結乾燥される。次いで、ペプチドは1ml HBSS(GIBCO-BRL)中に再懸濁され、そして樹状細胞または本発明のその他の抗原提示細胞上に投与されるまで(例えば-70℃で)凍結保存される。一般的に百万個の樹状細胞を、総量にして1-2mlの樹状細胞培養液中で(例えば37℃で、5% 二酸化炭素下で一晩インキュベートする)10⁸から10⁹のエフェクター細胞相当に由来するペプチドと反応させることができる。望ましい態様においては投与反応は生理的な温度よりも低い温度(例えば、22℃から27℃)で行われる。実施例3 疾病関連抗原の樹状細胞への投与望ましい態様においては、フォトフェレシスの任意の段階において樹状細胞を体外血流に導入され得る。より望ましくは体外血流への導入に先立って樹状細胞は上記のように酸溶出または薬剤処理される。樹状細胞の酸溶出または(8-MOP/U VA等を用いた)因子処理は、細胞の単離および/または細胞培養中にそれらのMHC C lassI分子に結合したペプチドの、細胞による放出を誘導する。従って最も好ましい態様においては酸溶出された樹状細胞は樹状細胞の結合されていないMHCの安定性を増大させ、抗原ペプチドの酵素的な分解を最小化するため生理的な温度よりも低い温度(22℃と27℃の間)で体外血流に導入される。体外血流への樹状細胞の導入は当該技術分野におけるいわゆる当業者に既知の標準的な注射筒(すなわち静脈注射筒セットの注射筒)を用いてなされた。望ましくは1x10⁶および10x10⁶の間の樹状細胞が対象への注入に際しての一回の投薬量を構築する。しかしながら上述のように数多くの樹状細胞(例えば一回の投与につき100倍量の細胞)が保存及び追加抗原刺激のための抗原負荷細胞の保存用調製物として体外血流内に導入され得る。望ましい態様においてはこの抗原負荷細胞調製物は対象に再注入されるための一回分を含むアリコートの状態で保存される。一般的には一回分の抗原負荷樹状細胞においては細胞あたり300から300,000の MHC部位が疾病関連ペプチドによって占められる。より望ましくは、細胞あたり1 000から200,000の間のMHC部位が疾病関連ペプチドによって占められる。樹状細胞の注入に続いて疾病エフェクター細胞からの放出に続いて体外血流中に提示された疾病関連抗原は外来的に与えられた樹状細胞のMHC部位に結合される。フォトフェレシス過程の段階(例えば遠心分離)は樹状細胞よび抗原がそこから由来している疾病エフェクター細胞の十分な撹拌と混和をもたらし、放出された抗原の樹状細胞MHC部位への迅速な結合を可能にすることで、放出された抗原の酵素による分解の可能性をさらに減少させる。あるいは、細胞補体外血流に導入するのとは逆に、疾病関連抗原を含む処理血液が試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で樹状細胞のMHC部位に導入される。疾病エフェクター細胞の酸溶出による疾病関連抗原の調製は上記の図２に記載される。この目的に対し有用な本発明の抗原組成物は血液中に含まれる疾病エフェクター細胞から放出された疾病関連抗原である。この組成物はフォトフェレシス治療を受けた対象の血液中に存在するような量であるような検出可能な量の、光によって活性化される試薬(例えばソラレン)を含む。この組成物はフォトフェレシスされた血液の一部を、一回分またはそれ以上の量の樹状細胞と混和するのに適した量の疾病関連抗原を含むような部位に導入することで調製される。望ましくは免疫応答を増強するための抗原組成物は、多数の疾病エフェクター細胞(例えば体外血流中に含まれる疾病エフェクター細胞)を含む調製物を疾病エフェクター細胞が疾病エフェクター細胞を酔溶解することなく疾病関連抗原を放出するのに十分な時間酸化することで調製される。この調製物は樹状細胞のMHC部位に放出された抗原を結合させることに先立って中和される。一般的には、本発明の方法に従って(フォトフェレシス単独、または抗原の酸溶出と併用することで)調製された疾病関連抗原はSteinman et al.(WO 93/2018 5)に記載された方法に従って樹状細胞上に導入される。簡潔に示すと、上述のように調製された樹状細胞は24穴培養プレートの穴あたり約1x10⁵細胞の濃度で処理される。ペプチドがMHC部位上に(貧食されずに)直接結合されることを意図した抗原調製の為には成熟した樹状細胞が望ましい。細胞は望ましくは付加的な栄養分 (5%ウシ胎児血清)およびGM-CSF(望ましくは30U/ml)を含む培養液(例えばRPMI164 0)中で放置される。望ましくは樹状細胞が疾病関連抗原に接触することに先立って、樹状細胞は酸溶出をうけ(上記実施例２に記載されるように)、洗浄され、適切な付加培養液中に生理的な温度以下で静置される。生理的な温度以下の温度での樹状細胞の導入は空いたMHCの安定性を増大させ、疾病関連抗原と結合し得るM HC部位の数を最大化させる。低温はまた放出されたペプチド抗原の酵素的分解を最小化させる。本発明の疾病関連抗原調製物は樹状細胞培養物に加えられ、培養物は抗原と共に数時間または樹状細胞がT細胞に認識される形態で抗原を提示するのに十分な時間放置される。望ましくは培養物は生理的な温度よりも低い温度で放置されることで、抗原が負荷され得る空のMHC部位の数を最大化される。樹状細胞のMHC部位への疾病関連抗原の負荷の後に、細胞は培養物から集められ、激しく洗浄され、対象を免疫感作するために用いられる。勿論対照として既知の対照抗原が調製物に含まれ得るしまた、集められた細胞は(1)樹状細胞の生存率および/または(2 )試験管内(例えば細胞傷害性T細胞試験)または生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で抗原特異的免疫応答を誘導する能力に関する抗原負荷樹状細胞の機能的な活性を決定するための質的対照試験のために用いられ得る。例えばペプチド負荷樹状細胞はマウス中に既知の対照抗原にたいしての免疫応答を誘導するのに十分な量皮下注射され、試験される細胞の抗原負荷効率を見積もられる。望ましい態様においては抗原負荷樹状細胞は注入(望ましくはi.v.またはi.d.注入)の前に(3000radのγ線を)照射される。より望ましくは抗原負荷樹状細胞は一つまたはそれ以上のサイトカイン(例えばGM-CSF,IL-12,IL-4)と共に注入されることで疾病関連抗原に対する特異的な免疫応答が増強される。(例えばペプチドを断続的に負荷された樹状細胞および少量のIL-12を併せて投与することで腫瘍特異的T細胞の準備を補助することを報告しているZitvogel et al．J EXP Med 184:87-97(1996)を参照。) 所望の抗原刺激は、上に記載された疾患関連抗原負荷された樹状細胞調製物を用いて、標準的な方法に従って行われた。総じて、対象に対する投与に先だって活性、生存率、毒性および不稔性に関して細胞は試験された。ペプチドを投与された樹状細胞の細胞毒性活性は、適当なMHC分子を発現する標的細胞を用いて、細胞毒性T細胞試験(例えばクロム放出試験)によって決定され得る。これは、試験管内で樹状細胞に投与されて細胞毒性T細胞応答を引き起こすことが知られている疾患関連ペプチド、または他の既知の対照ペプチドの存在下または非存在下でなされる(例えば、WO94-20127およびZitvogel,L.ら、J.Exp.Med．183:87-97(19 96)参されたペプチドでパルス刺激を受けた)が生体内で腫瘍の進行を阻害する能力を試験するための動物モデルを記載している。本発明の疾患関連抗原を本発明の樹状または他の抗原提示細胞のMHC部位に投与し、対象にとって最適の投与量および追加抗原剌激頻度を選択することによって抗原を得る方法を最適化するように本発明中で用いるために、Zitvogel動物モデルは適合される。しかし文献の報告とは異なり、(固形腫瘍の大きさではなく)CD4+および/またはCD8+ T細胞の血清レベルの上昇が、疾患の阻害の指標として用いられる。生存細胞のtrypan blue色素の排出によって、細胞の生存率が決定される。通常の当業者に既知の慣用的な方法によって、内毒素、および細菌または真菌による汚染の有無について、細胞が試験される。これらの安全性および活性基準に合格した細胞は、洗浄され、適当な溶液(例えば生体内注入液のためのリンガー/グルコース乳酸のような注入液)中に入れられ、対象に投与される。さらに樹状細胞をパルス刺激する方法、および/または試験管内または生体内で細胞毒性T細胞応答を誘導するために樹状細胞を用いる方法は、WO93/20185、W O94/21287、WO94/02156;Mayordomo,J.ら、Nature Medicine 1(12):127-1302(199 5);およびHsu,F.ら、Nature Medicine 2(1):52-58(1996)に記載されている。また、抗原負荷された樹状細胞を放射線照射して細胞が対象に投与された際の細胞増殖を阻害する実験法の例については、WO94-21287、WO94-20127およびHsu,F.ら、Nature Medicine 2(1):52-58(1996)を参照。実施例４フォトフェレーシス/樹状細胞処理の効率の証明疾患エフェクター細胞の体外処理と樹状細胞の付加を併用することの効果性を証明するために、ネズミ2B4.11腫瘍性T細胞が8-MOPおよびUVAを用いて上に記載されたように処理された。ネズミ2B4.11腫瘍細胞は2つの原細胞型:正常AKRマウスT細胞およびBW5147マウス悪性T細胞をハイブリッド化または結合させることによって作製された。AKR親細胞は、抗腫瘍免疫反応の標的となるT細胞受容体を含む(明らかに腫瘍特異的抗原として働き得る)特定の抗原を提供する。BW5147親細胞の寄与により、2B4.11細胞は癌細胞のように振舞い、無制限に分裂して動物を死に至らしめることが可能になる。 8-MOP/UVA処理の後、樹状細胞は処理された細胞混合物に加えられる。 5匹の試験マウスの2つのグループは、8-MOP/UVA処理によって不活性化され樹状細胞(DPAC)と混合された500万の2B4.11細胞で種痘化された。8-MOP/UVA放射線照射腫瘍細胞は、DAPCと2B4.11細胞間の細胞間接触を最大にするように20万の樹状細胞と共に(比25:1)一晩振とうされた。細胞の一つのグループ(放射線照射2B4 .11+DAPC)は23℃で保温され、DAPC上の空のクラスI MHC分子の安定性を最大化された。他の細胞グループは37℃で保温され、正常な細胞代謝を最大化された。混合された放射線2B4.11/DAPC細胞混合物は、試験マウスを生存可能な腫瘍性2B4.11 細胞で攻撃する1週間前に、試験マウスに注入された。図1においては(左から右)、腫瘍増殖は5つの対照マウスにおいて観察された。これらの対照は0日目に腫瘍細胞の皮下注射のみを受け、抗腫瘍種痘は受けなかった。これらのマウスの全ては8日目に顕著な腫瘍を発生し、腫瘍は(これらの実験の最後の観察日である)21日目まで増殖し続けた。種痘化されたマウスの中で、全て(DAPCを受けた2つのグループ)が腫瘍を発生したが、腫瘍は対照マウスのものよりも増殖が遅いか、または全く増殖しなかった。23℃細胞混合物を投与された3つのマウス、および37℃細胞混合物を投与された2つのマウスは腫瘍を全く発生しなかった。23℃グループの他の2つのマウスは小さい腫瘍を発生したが、腫瘍は11日目に増殖を停止した。37℃グループの他の1つのマウスも非常に小さい腫瘍を発生したが、腫瘍は11日目までに増殖を停止した。非常に興味深いことに、37℃グループの他の2つのマウスも増殖の遅い小さい腫瘍を発生したが、腫瘍は後に完全に消失した。このデータから、8-MOP/UVA放射線照射腫瘍細胞とDAPCの接触によって効果的な細胞種痘の形成が起きることが証明される。この細胞種痘は腫瘍の増殖を阻害するのみならず、ある種の腫瘍の増殖を逆行させる。図1から、遺伝的に同一の樹状抗原提示細胞(DAPC)と8-MOP/UVA前処理ネズミ2B4.11腫瘍性T細胞との組み合わせによって、特定の腫瘍に対する効果的な種痘が構成されることが証明される (腫瘍に対して首尾よく種痘化されていないマウスに2B4.11種瘍性細胞を投与するとマウスは40日目までに死ぬことは以前に示されている)。また、抗原負荷された樹状細胞は混合後に単離されてもよい。さらに、膜による分離(例えば45μ フィルター)が樹状細胞と疾患エフェクター細胞との間に置かれ、2つの細胞集団を分離したままで抗原を樹状細胞まで透過させ得る。実施例5 樹状細胞治療の効果性の証明図2には、処理された疾患エフェクター細胞との事前の接触なしで外来供給された抗原提示細胞が腫瘍に与える効果を証明する結果が示される。対照動物においては大きな腫瘍が発生し、最初の腫瘍発生は7日目であり、28日目までの観察期間の間連続的に増殖した。23℃または37℃で一晩培養されたDAPCによる種痘化によって、5匹の2つのグループ中で3および4匹のマウスについてそれぞれ腫瘍増殖は阻害され、残存する腫瘍については初期の程度の低い増殖まで逆行させられた。この効果は実質的であったが、図1の2B4.11/DAPC混合物による種痘化の後に起きた特異的な免疫記憶は引き起こさなかった。例えば、これらのグラフには示さないが、腫瘍の消失の後に2B4.11腫瘍細胞の二次投与がされた場合、DAPCを混合した2B4.11による種痘化を受けたグループにおいてのみ免疫防御が見られる。実施例6 フォトフォレーシスに伴うMHC発現の上昇の証明図3は、クラスIの発現に8-MOP/UVAが与える効果を示す。クラスIタンパク質に対する蛍光抗体によって同定された細胞表面のクラスIタンパク質の量が、平均の蛍光チャンネルによって定量される。通常、少なくとも20万のクラスI分子が提示され、対照細胞集団においては値2.4によって示される。8-MOP/UVA(1J/cm2 UVAおよび200ng/ml 8-MOP)に曝して一晩保温した後、クラスIの発現は倍増した。クラスIの発現のこの大量の増加はエメチンによって阻害されるため、タンパク質の新生に由来する。以上は好ましいいくつかの態様の詳細な説明に過ぎないことは理解されると考えられる。即ち、種々の変更および等価物が本発明の精神および範疇に適合して成され得ることは通常の当業者には明らかであると考えられる。本出願において記述された全ての参考文献、特許および特許開示物は、本明細書中では全て参考文献として挙げる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｚ 39/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｎ 5/06 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．１またはそれ以上の疾病関連抗原に対する免疫系応答を増強するため疾患を有する対象の血液、細胞または組織を体外処理する改良された方法であって、血液、細胞または組織が疾病状態の結果として１またはそれ以上の疾病関連抗原を発現するように自然に刺激された疾病エフェクター細胞を含み、そして体外処理が疾病エフェクター細胞による疾病関連抗原の放出を誘導し、改良が、（ａ）処理された血液、細胞または組織中に、抗原提示細胞と疾病エフェクター細胞により放出される抗原との接触を増大するような条件下で抗原提示細胞を導入し、治療用混合物を形成すること、；そして（ｂ）抗原提示細胞の不存在下で体外処理を行った場合に誘導される免疫系応答と比較して、疾病を有する対象の１またはそれ以上の疾病関連抗原に対する免疫系応答を増大するのに十分な量で抗原提示細胞が存在する治療用混合物を、疾病を有する対象に再注入すること、を含む、前記改良された方法。２．抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１の方法。３．体外処理が、疾病を有する対象の血液、細胞または組織を、処理された細胞上のMHC発現を増大する因子（agent）と反応させることを含む、請求項１の方法。４．体外処理が、疾病を有する対象の血液、細胞または組織を、光活性化因子と反応させて、因子処理された血液、細胞または組織サンプルを形成し、そして薬剤処理されたサンプルを光活性化することを含む、請求項３の方法。５．光活性化因子がソラレンである、請求項４の方法。６．疾病を有する対象が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ウィルスが感染した疾病エフェクター細胞、細菌が感染した疾病エフェクター細胞、原虫が感染した疾病エフェクター細胞、および固形腫瘍細胞からなる群から選択される疾病エフェクター細胞により媒介される疾病を有する、請求項１の方法。７．疾病が、白血病、リンパ腫、固形腫瘍、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、移植組織拒絶、ウィルスが感染した疾病エフェクター細胞により媒介されるウィルス感染症、細菌が感染した疾病エフェクター細胞により媒介される細菌感染症、および原虫が感染した疾病エフェクター細胞により媒介される原虫感染症からなる群から選択される、請求項１の方法。８．疾病関連抗原が、MHCクラスIタンパク質、MHCクラスIIタンパク質、およびMHC部位に対してまたはMHC部位からペプチドを移送することができる熱ショックタンパク質からなる群から選択されるタンパク質と結合するペプチドである、請求項１の方法。９．樹状細胞が、（１）血液採取；（２）疾病エフェクター細胞の分離；（３）因子処理；および（４）疾病エフェクター細胞の貯蔵からなるステージからなる群から選択される体外処理のステージで導入される、請求項１の方法。１０．前記樹状細胞および前記疾病エフェクター細胞が、抗原およびサイトカインを透過することができるが細胞を透過することができない膜により、接触工程の間にお互いが分離される、請求項１の方法。１１．サイトカインの存在下で治療用混合物を再注入する工程をさらに含む、請求項１の方法。１２．サイトカインが、GM-CSF、IL-4、TNF-α、FGFおよびIL-12からなる群から選択される、請求項１１の方法。１３．樹状細胞が、自然に出現する樹状細胞と同一の提示特性を有する、請求項２の方法。１４．樹状細胞を導入することが、約1000から約100000000の樹状細胞を処理血液に導入することを含む、請求項２の方法。１５．血液中に含まれる疾病エフェクター細胞から放出される疾病関連抗原；および光活性化因子およびプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される少なくとも一つの因子の検出可能量を含む免疫応答を増大するための組成物であって、単一濃度の樹状細胞と混合する量の疾病関連抗原を含むように処方される前記組成物。１６．組成物が凍結乾燥される、請求項１５の組成物。１７．（ａ）複数の疾病エフェクター細胞を含む調製物を、末梢血液から得られた疾病エフェクター細胞が、細胞を融解することなく疾病関連抗原を放出させるために十分な期間酸性化し；そして（ｂ）酸性化された調製物を中性化して生成物を形成することを含む、免疫応答を増大するための生成物を産生する方法。１８．疾病エフェクター細胞が、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、自己免疫応答を媒介するＴ細胞、自己免疫応答を媒介するＢ細胞、移植組織応答を媒介するＴ細胞、移植組織応答を媒介するＢ細胞、固形腫瘍細胞、細胞表面にウィルスタンパク質を発現するウィルスが感染した疾病エフェクター細胞、細胞表面に細菌タンパク質を発現する細菌が感染した疾病エフェクター細胞、および細胞表面に原虫タンパク質を発現する原虫が感染した疾病エフェクター細胞からなる群から選択される、請求項１７の方法。１９．酸性化の前に、疾病エフェクター細胞を末梢血から分離する、請求項１８の方法。２０．（ｃ）生成物を、免疫系応答を増大するために単一濃度の抗原提示細胞と混合するために十分な量の生成物をそれぞれのアリコート（aliquot）が含むようにいくつかに等分する工程、をさらに含む、請求項１９の方法。２１．生成物を請求項１９の方法により生成する、免疫応答を増大するための生成物。２２．（１）対象体内の樹状細胞の数および活性化状態の少なくとも一つを増大するために十分な量および投与頻度のGM-CSFを対象に投与し；そして（２）対象をフォトフェレーシスの対象とする工程を介して、対象体内の樹状細胞の数および活性化状態の少なくとも一つを増大することを含む、フォトフェレーシス法における改良。