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Die
vorliegende Offenbarung umfasst Verfahren zur Handhabung und/oder
Behandlung von biologischen Zellen, insbesondere zur Wechselwirkung
von Tumorzellen und dendritischen Zellen, Verfahren zur Erzeugung
von Verbunden aus dendritischen Zellen und erkrankten Zellen, z.
B. Tumorzellen, oder deren Zellbestandteilen (z. B. Membranteilen),
Verfahren zur Modifizierung von dendritischen Zellen mit erkrankten
Zellen, z. B. Tumorzellen, oder deren Zellbestandteilen (z. B. Membranteilen),
Verfahren zur passiven Immunisierung oder Impfung von Organismen
gegen Tumorerkrankungen, Verfahren zur Behandlung von Tumorerkrankungen
und/oder Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen zur passiven
Immunisierung oder Impfung von Organismen gegen Tumorerkrankungen,
Vorrichtungen zur Umsetzung der Verfahren, Verwendungen von Vorrichtungen
zur dielektrophoretischen Manipulierung von Zellen in Mikrosystemen
zur Modifizierung von dendritischen Zellen und Anwendungen der genannten
Verfahren.
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Es
gibt Versuche, zur Tumorbehandlung einen Organismus einer Anregung
des Immunsystems zu unterziehen, indem körpereigene dendritische Zellen
mit Antigenen modifiziert und dem Organismus zugeführt werden.
Die dendritischen Zellen wirken als immunoaktive Zellen, die in
Abhängigkeit
von den jeweiligen Antigenen immunostimulierende Eigenschaften besitzen.
Die Bildung und Eigenschaften von dendritischen Zellen werden bspw.
von K. Shortman et al. in „Stem
Cells", Band 15,
1997, Seite 409 ff. beschrieben. Die Modifizierung der dendritischen
Zellen mit Antigenen bedeutet, dass die Antigene in die Oberfläche der
dendritischen Zelle eingebaut werden. Als Antigene werden bspw.
bestimmte Modellpeptide (siehe P. Paglia et al. in „Minerva
Biotecnologica",
Band 11, 1999, Seite 261 ff.) oder von den jeweiligen Tumorzellen
gebildete Antigene verwendet. Zur Beladung der dendritischen Zellen
mit Antigenen von Tumorzellen sind die folgenden Verfahren bekannt.
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Bei
dem bspw. von T. H. Scott-Taylor et al. in „Biochimica et Biophysica
Acta", Band 1500,
2000, Seite 265 ff. beschriebenen Verfahren werden Tumorzellen mittels
Elektrofusion mit dendritischen Zellen verschmolzen, die mit den
Tumorzellen insbesondere die Tumor-Antigene aufnehmen und dadurch eine
Anregung des Immunsystems auslösen
können. Dieses
Verfahren besitzt den Nachteil, dass die Elektrofusion ein komplexer
Vorgang ist, der eine anwendungsspezifische Optimierung der Fusionsbedingungen
erfordert. Die Elektrofusion von dendritischen Zellen mit Tumorzellen
hat ferner den Nachteil, dass die in der Literatur beschriebenen
Ausbeuten sehr gering sind und dass, bedingt durch die zufällige Kombination
der Gene der beiden Fusionspartner, Fusionsprodukte mit unterschiedlichen
Eigenschaften entstehen, die nach Rückgabe in den Patienten zu
unterschiedlichen Immunreaktionen führen können. Um nicht den zu behandelnden
Organismus noch mit Tumorzellen zu belasten, müssen die Tumorzellen vor der
Elektrofusion, bspw. mittels radioaktiver Bestrahlung, abgetötet werden.
Es bleibt jedoch bei den üblichen
Bestrahlungsmethoden ein Restrisiko, dass Tumorzellen überleben
und zu Metastasen führen.
Damit besitzen Immunisierungsverfahren, die auf der Elektrofusion
beruhen, nur eine eingeschränkte
Zuverlässigkeit,
da gewährleistet sein
muss, dass die Tumorzellen alle abgetötet sind sowie alle Krankheitserreger,
die sich in den Tumorzellen befinden, wie z. B. Viren, tot sind.
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Aus
der Publikation von K. Shimizu et al. in „Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Band 96, 1999,
Seite 2268, ist die Verwendung von Tumorzell-Lysaten zur Modifizierung
der dendritischen Zellen bekannt. Die Lysate sind Tumorzellen, die
durch einen Einfrier- und Auftauvorgang zerstört worden sind. Die Interak tion
der dendritischen Zellen mit den Lysaten wird durch eine Langzeitinkubation über rund
20 Stunden induziert. Die Verwendung der Lysate besitzt neben dem
großen
Zeitaufwand auch den Nachteil einer eingeschränkten Zuverlässigkeit.
Wie bei der Elektrofusion ist eine radioaktive Bestrahlung vorgesehen,
um die Gefahr einer zusätzlichen
Metastasierung zu vermindern.
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Die
Erzeugung einer Assoziation aus dendritischen Zellen und Tumorzellen
wird auch von C. M. Celluzzi et al. in „The Journal of Immunology", Band 160, 1998,
Seite 3081 ff. beschrieben. Die Assoziation erfolgt entweder durch
eine elektrisch stimulierte Zellfusion oder durch eine physikalische
Wechselwirkung bei einer Langzeitinkubation, die zu einer sogenannten
Scheinfusion (mock fusion) führt.
Auch bei diesem Verfahren treten die genannten Probleme auf. Die
zur Auslösung
der Immunreaktion verwendete Zellassoziation trägt mit dem Zellkern der Tumorzelle
ein erhebliches Metastasierungsrisiko in sich. Außerdem erfordert
die Bildung von Scheinfusionen eine zeitaufwendige Koinkubation
mit einer Dauer von mehr als zehn Stunden.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, neue Verfahren zur Behandlung biologischer
Zellen anzugeben, bei dem Zellen bzw. Zellbestandteile miteinander
zur Wechselwirkung gebracht werden. Es soll insbesondere ein verbessertes
Verfahren zur Modifizierung dendritischer Zellen geschaffen werden,
mit dem die Nachteile herkömmlicher
Techniken überwunden
werden und das sich durch einen schnellen Verfahrensablauf und den
Ausschluss eines Metastasierungsrisikos auszeichnet. Die Aufgabe
der Erfindung ist es ferner, neue Verfahren entsprechend den o.
a. Verfahren anzugeben. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen
zur Durchführung des
Verfahrens und Anwendungen des Verfahrens anzugeben.
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Die
Grundidee der Erfindung ist es, biologische Zellen bzw. Zellbestandteile
miteinander zu Wechselwirkungen zu veranlassen, indem die Zellen und
Zellbestandteile miteinander in Kontakt gebracht werden. Dendritische
Zellen und Zellbestandteile von erkrankten Zellen (z. B. Tumorzellen
oder Tumorzellbestandteile) werden in einer Suspension äußeren Kräften derart
ausgesetzt, dass die verschiedenen Zelltypen oder Zellbestandteile
sich gegenseitig berühren.
Der Erfinder hat festgestellt, dass eine Berührung unter Einwirkung äußerer Kräfte ausreicht,
um ausschließlich
Membrankomponenten mit den Antigenen von den erkrankten Zellen oder
Zellbestandteilen auf die dendritischen Zellen zu übertragen. Zellkerne
und andere Bestandteile der erkrankten Zellen bleiben in der Suspension.
Anschließend
werden die modifizierten dendritischen Zellen von den noch freien
Zellbestandteilen in der Suspension getrennt und für die jeweiligen
Anwendung, insbesondere die Anregung des Immunsystems eines Organismus,
bereitgestellt. Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung wird das Verfahren zur Erzeugung
immunologisch aktiver dendritischer Zellen verwendet.
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Unter
Wechselwirkung der Zellen wird allgemein jede Art von mechanischer
oder stofflicher oder anderweitiger Wechselwirkung, insbesondere
Wechselwirkungen, bei denen eine Substanzübertragung oder eine Übertragung
von Zellbestandteilen auf eine dendritische Zelle erfolgen, betrachtet.
Die Zellen werden durch Bildung chemischer Verbindungen oder physikalischer
Assoziationen gekoppelt, so dass sich die Zellmembranen berühren. Wenn
sich die Zellmembranen berühren,
kommt es zur gegenseitigen Wechselwirkung. Es werden bspw. Membranstücke des
einen Zelltyps auf den anderen Zelltyp übertragen.
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Ein
entscheidender Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Modifizierung
der dendritischen Zellen innerhalb kurzer Zeiten, wie bei der herkömmlichen
Elektrofusion durchgeführt
werden kann, wobei jedoch gegenüber
den herkömmlichen
Fusions- oder Scheinfusionstechniken vorteilhafterweise nur die
gewünschten
Antigene, nicht jedoch ganze Tumorzellen an die dendritischen Zellen
angekoppelt werden. Damit wird erstmalig das Metastasierungsrisiko
bei Anwendung der dendritischen Zellen eliminiert.
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Als
Verfahren zur Kontaktierung und Aneinanderkopplung der Zellen durch
Ausübung äußerer Kräfte sind
alle an sich bekannten Verfahren zu Manipulierung von Zellen oder
Partikeln verwendbar, wie z. B. die Dielektrophorese, die Sedimentation,
die Zentrifugation, der hypo-osmolare Schock, die Ausübung von
Strömungskräften (z.
B. Vermischung und Schütteln),
Filtertechniken, optische Manipulierung mit Laserpinzetten und dergleichen.
Die äußeren Kräfte werden
so stark eingestellt, dass die Zellen auch im aneinanderhaftenden
Zustand bleiben, wenn die Kraftwirkung abgeschaltet oder beendet
wird.
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Zur
Modifizierung dendritischer Zellen mit erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen,
wie z. B. Membranvesikeln, die vorteilhafterweise leicht aus Tumorzellen
gewonnen werden können,
werden beide Zelltypen in einen Wechselwirkungsbereich gebracht
und dort äußeren Kräften zur
gegenseitigen Kontaktierung ausgesetzt. Die Kräfte zur Kontaktierung werden
anwendungsabhängig
so lange ausgeübt,
bis sich die gewünschte
chemische oder physikalische Bindung ausgebildet hat. Dies wird
ggf. durch Beobachtung oder Vermessung der Zellen oder des Zellverbundes
festgestellt.
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Es
können
gleichzeitig einzelne oder mehrere Zellen beider Zelltypen zur Wechselwirkung
gebracht werden.
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Gemäß der Erfindung
werden die dendritischen Zellen mit Zellbestandteilen der erkrankten Zellen
in Kontakt gebracht, so dass Antigene der Tumorzellen auf die dendritischen
Zellen übertragen werden.
Die Übertragung
der Antigene erfolgt indem Membranbestandteile der erkrankten Zellen
an den dendritischen Zellen anhaften oder in deren Membranen eingebaut
oder aufgenommen werden.
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Nach
der Kontaktierung ist es, in Abhängigkeit
von den spezifischen Eigenschaften der Tumorzellen, unter Umständen vorteilhaft,
den Einbau der Tumorantigene in den dendritischen Zellen durch einen
Feldimpuls, der zum reversiblen dielektrischen Durchbruch der Membran
führt,
zu verstärken
(z. B. feldinduzierte Endozytose). Es wird, z. B. mit einem Mikroelektrodensystem,
wie es an sich zur Manipulierung von Zellen bekannt ist, ein Durchbruchimpuls
in hypo- oder iso-osmolarer Lösung
induziert. Dies hat den Vorteil, dass Membranbestandteile besonders schnell
von den dendritischen Zellen aufgenommen werden.
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Gemäß der Erfindung
werden die dendritischen Zellen mit Zellbestandteilen von erkrankten Zellen,
insbesondere mit Membranbestandteilen, in Kontakt gebracht, um die
Antigene auf die dendritischen Zellen zu übertragen. Hierzu werden die
gewünschten
Zellbestandteile zunächst
von den Kernen und dem Zytoplasma der erkrankten Zellen abgetrennt
und dann mit den dendritischen Zellen zur Wechselwirkung gebracht.
Als Zellbestandteile werden vorzugsweise Membranbruchstücke, die
sich spontan zu Membranvesikeln formieren, verwendet.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur passiven
Immunisierung oder Impfung von Organismen gegen Tumorerkrankungen
bereitgestellt. Zur Umsetzung des Verfahrens werden allogene dendritische
Zellen, d. h. Zellen von einem anderen (gesunden) Menschen, sowie
Tumorzellen des Patienten entnommen, gegen den die behandelten Zellen
immunologisch aktiviert werden sollen. Die entnommenen Zellen werden
einem der genannten Verfahren zur gegenseitigen Wechselwirkung unterzogen,
so dass die dendritischen Zellen Tumor-Antigene aufnehmen. Die behandelten
dendritischen Zellen werden anschließend dem Probanden (Patienten)
rückinjiziert.
Als Tumorzellen können
auch bereits bestrahlte (abgetötete) Tumorzellen
verwendet werden.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch ein zellulärer Impfstoff, der dendritische
Zellen enthält,
die mit Antigenen von erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen modifiziert
sind.
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Die
vorliegende Beschreibung offenbart auch eine Vorrichtung zur Manipulierung
biologischer Zellen. Die Vorrichtung enthält eine Einrichtung zur Lagerung
und Zuführung
der Zellen in einen Wechselwirkungsbereich, eine Manipulierungseinrichtung im
Wechselwirkungsbereich z. B. ein Mikroelektrodensystem zur dielektrophoretischen
Manipulierung von Zellen, ggf. eine Mess- und Beobachtungseinrichtung
zur Erfassung des Ergebnisses der Zellbehandlung, und eine Extraktionseinrichtung.
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Die
Erfindung wird vorzugsweise zur passiven Immunisierung oder Impfung
gegen Tumorwachstum angewendet.
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Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
unter Bezug auf die beigefügten
Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
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1 eine
schematische Illustration der erfindungsgemäßen Modifizierung dendritischer
Zellen, und
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2 bis 4 graphische
Darstellungen experimenteller Ergebnisse, die mit erfindungsgemäß modifizierten
Zellen erzielt wurden.
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Das
Grundprinzip der Erfindung, nämlich
der Einbau von Antigenen in dendritische Zellen durch deren Kontaktierung
mit Zell bestandteilen erkrankter Zellen unter Wirkung äußerer Kräfte, kann
jeweils mit dem Ziel einer Immuntherapie mit den verschiedensten
Typen erkrankter Zellen realisiert werden. Neben Tumorzellen können bspw.
auch Stammzellen oder Epithelzellen verwendet werden, um Membranbestandteile
dieser Zellen auf die dendritischen Zellen zu übertragen. Im Folgenden werden
Ausführungsbeispiele
der Erfindung ohne Einschränkung
in Bezug auf Tumorzellen erläutert.
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Die
Erfindung ist insbesondere durch die Ankopplung von Membranbestandteilen
erkrankter Zellen an die dendritischen Zellen umsetzbar. Die Membranbestandteile
werden aus den erkrankten Zellen gewonnen und dann mit den dendritischen
Zellen zur Wechselwirkung gebracht. Die direkte Wechselwirkung der
dendritischen Zellen mit den erkrankten Zellen, kein Bestandteil
der Erfindung, hätte
den Vorteil eines vereinfachten Verfahrensablaufes, da der Schritt
der gesonderten Bereitstellung der Membranbestandteile entfällt. Es
müssten
jedoch besondere Maßnahmen
zum Metastasierungs- oder Infektionsschutz getroffen werden, falls
die erkrankten Zellen komplett an die dendritischen Zellen angekoppelt würden. Werden
die Membranbestandteile gesondert präpariert, besitzt dies den Vorteil,
dass die modifizierten dendritischen Zellen in ihrer Größe und in ihren
funktionellen Eigenschaften kaum verändert sind. Die modifizierten
Zellen bewegen sich auf dem Weg zum Lymphknoten und verhalten sich
dort wie unmodifizierte Zellen. Damit wird die immunstimulierende
Funktion der dendritischen Zellen verbessert. Im Folgenden wird
ohne Einschränkung
vorrangig auf die Wechselwirkung dendritischer Zellen mit Membranbestandteilen,
die gesondert präpariert wurden,
Bezug genommen.
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Ein
wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, dass die dendritischen
Zellen einerseits und die Zellbestandteile der erkrankten Zellen
andererseits in einer gemeinsamen Suspension äußeren Kräften ausgesetzt werden. Dies
ermöglicht
eine Kurz zeitkontaktierung, die je nach Art der äußeren Kräfte wenige Minuten oder bis
zu ein bis zwei Stunden betragen kann. Damit wird gegenüber herkömmlichen
Verfahren eine erhebliche Reduzierung der Behandlungsdauer erzielt.
Der Anteil der dendritischen Zellen, die die Behandlung ohne Funktionseinbuße überleben,
wird damit erhöht.
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffs auf der Grundlage
modifizierter dendritischer Zellen wird erhöht. Im Folgenden wird ohne
Einschränkung
auf die Ausübung
von Strömungskräften in
der gemeinsamen Suspension, z. B. durch Bewegung des die Suspension
enthaltenden Gefäßes oder
anderweitiges Vermischen, und/oder elektrischen Kräften Bezug
genommen. Die äußeren Kräfte können analog
durch die dielektrophoretische Kräfte, Zentrifugationskräfte, optische
Kräfte
und/oder die weiteren, oben genannten Kräfte ausgeübt werden. Dabei sind die entsprechenden,
an sich bekannten Techniken zur Handhabung von Zellen oder Zellbestandteilen
einsetzbar.
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1 zeigt
schematisch den Präparationsschritt
1. zur Herstellung von Membranvesikeln aus Tumorzellen und den Kontaktierungsschritt
2. zur Modifizierung der dendritischen Zellen. Im Folgenden wird
zunächst
der Präparationsschritt
an einem Verfahrensbeispiel und anschließend der Kontaktierungsschritt
an verschiedenen Verfahrensbeispielen erläutert.
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1. Präparationsschritt
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Beim
Präparationsschritt
werden Membranvesikel aus Tumorzellen durch ein an sich bekanntes Homogenisierungsverfahren
mit anschließender
Entfernung der Zellkerne hergestellt. Die Verfahrensweise wird bspw.
von J. M. Graham et al. in „Molekularbiologische
Membrananalyse",
Spektrum Akademischer Verlag GmbH, 1998, erläutert.
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Die
Tumorzellen werden mit einem Glas-Potter homogenisiert. Es werden
bspw. mit einem üblichen
Labor-Potter (Spaltbreite z. B. 150 μm) 5-ml-Proben mehrfach (z.
B. 15-fach) homogenisiert. Anschließend wird die homogenisierte
Suspension zentrifugiert. Im Ergebnis der Zentrifugation befinden sich
die schweren Zellbestandteile, insbesondere die Kerne und Organellen,
im Pellet. Die Zellbestandteile geringerer Dichte (Membranbestandteile)
befinden sich im Überstand.
Es erfolgt bspw. eine Zentrifugation bei 3500 rpm (2000·g) mit
einer Dauer von 15 Minuten. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vom
Pellet getrennt. Aus den Membranbestandteilen bilden sich Membranvesikeln,
d. h. geschlossene, lediglich mit der Suspensionsflüssigkeit
gefüllte
Membranhüllen
in Kugelform. Die Membranvesikeln besitzen charakteristische Durchmesser
von weniger als 1 μm.
In den Membranen der Membranvesikeln sind die Tumorantigene mit
dem immunstimulierenden MHCI-Komplex enthalten. Die Vesikelsuspensionen werden
z. B. als 4-ml-Proben im Kühlschrank
gelagert. Die ursprüngliche
Osmolalität
der Vesikelsuspensionen wird zur Vermeidung einer Verletzung der Membranvesikeln
durch osmotischen Druck von zunächst
20 mOsm auf eine höhere
Osmolalität
(z. B. 80 mOsm) eingestellt. Dies erfolgt bspw. mit 10-facher PBS
(80 μl 10-fach
PBS + 4 ml Vesikelsuspension).
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Im
Ergebnis des Präparationsschrittes
1. ist der Zellkern von den Membranvesikeln getrennt, wie dies in 1 schematisch
illustriert ist. Die erfindungsgemäße Modifizierung der dendritischen
Zellen erfolgt lediglich mit den Membranvesikeln, die die Tumorantigene
tragen.
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Für Analyse-
oder Testzwecke (experimentelle Ergebnisse siehe unten) kann eine
Einfärbung der
Membranproteine vorgesehen sein. Zur Einfärbung wird zunächst die
Tumorzellsuspension mit dem Markierungsfarbstoff (z. B. FITC) versetzt.
Anschließend
erfolgt eine Entfernung des ungebundenen Farbstoffes aus der Suspension.
Die Zellsuspension (1.2 ml, PBS, 1·107/ml)
wird mit 50 ... 150 μmol/l FITC
(36 μl,
Stammlösung
5 mmol/l in DMF) versetzt. Die Färbung
dauert bei 37°C
rund 5 ... 15 min. Zur Entfernung des ungebundenen Farbstoffes erfolgen mehrere
Waschschritte mit einem den restlichen Farbstoff bindenden Protein
(z. B. mit PBS-BSA, 20°C,
1% BSA), jeweils kombiniert mit Zentrifugationsschritten. Anschließend erfolgt
ein Waschen in einer Pufferlösung,
eine Zentrifugation und die Bereitstellung des Pellets mit den Tumorzellen
in einem PMSF-Puffer, der hypo-osmolar ist, so dass die Tumorzellen
anschwellen. Als PMSF-Puffer ist die folgende Zusammensetzung vorgesehen:
10 mmol/l Tris, 0.5 mmol/l Proteasen-Inhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid),
pH 7.2.
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2. Kontaktierungsschritt
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Osmotisch-induzierter
Einbau der Vesikeln in dendritische Zellen
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Zur
Kontaktierung wird zunächst
ein Ansatz der dendritischen Zellen als Zellsuspension oder als Zellprobe
(ohne Suspensionsflüssigkeit)
bereitgestellt. Der Ansatz wird dann mit der Vesikelsuspension in
eine gemeinsame Suspension überführt, in
der die Kontaktierung der Membranvesikeln mit den dendritischen
Zellen unter Wirkung äußerer Kräfte erfolgt.
Die Suspension dendritischer Zellen kann isoton oder hypoton gebildet
sein. Die hypotone Suspension wird bevorzugt, da in dieser die dendritischen
Zellen angeschwollen sind. Die unten erläuterten experimentellen Ergebnisse
zeigen, dass die angeschwollenen dendritischen Zellen mit größerer Effektivität mit den
Membranvesikeln modifizierbar sind. Zur Herstellung der isotonen
Suspension wird z. B. eine Suspension von 106 dendritischen
Zellen/ml (2 ml) zunächst
abzentrifugiert und dann in 5 ml PBS (280 mOsm) gewaschen und dann
in 100 μl
PBS (280 mOsm) aufgenommen. Zur Herstellung der hypotonen Suspension
werden ent sprechend 2 ml der Ausgangssuspension abzentrifugiert
und dann in 5 ml PBS, verdünnt
mit H2O (80 mOsm), gewaschen und dann in
100 μl hypo-osmolarem
PBS (80 mOsm) aufgenommen.
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Die
isotone oder hypotone Suspension wird dann mit der Vesikelsuspension
(2 ml, 80 mOsm) zusammengeführt,
um die erfindungsgemäße Modifizierung
der dendritischen Zellen mit den Membranvesikeln zu bewirken. Hierzu
erfolgt zunächst
eine Inkubation bei 37°C
(10 min). Anschließend
erfolgt eine Einstellung der Suspension auf einen iso-osmolaren Zustand
(z. B. mit 147 μl
10-fach PBS auf 280 mOsm). Dadurch werden die dendritischen Zellen verkleinert,
es entsteht eine unregelmäßig gekrümmte Membranoberfläche, deren
Gestalt den Einbau der Membranvesikel in die Membran, Endozytosevorgänge und
ein äußeres Adherieren
fördert.
Es folgt eine Inkubation bei 37°C
für rund
1.5 ... 2 Stunden. Während
dieser Inkubation erfolgt die Modifizierung der dendritischen Zellen.
Die äußeren Kräfte werden in
Form von Strömungskräften ausgeübt. Anschließend erfolgt eine Waschung mit PBS (280 mOsm), um
die nicht-angekoppelten
(noch freien) Membranvesikel zu entfernen.
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Die
am Ende vorliegende Suspension enthält modifizierte dendritische
Zellen als zellulären
Tumorimpfstoff (siehe 1, links unten), der die Antigene
der Tumorzelle in der Membran direkt oder in angehefteten Membranbestandteilen
enthält.
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2 illustriert
die Fluoreszenzanalyse von gefärbten
Zellproben im Vergleich mit ungefärbten Kontrollproben mittels
FACS-Analyse. Bei den Proben 1 und 3 wurden Suspensionen mit gefärbten Vesikeln
einen isotonen (Probe 1) oder hypotonen (Probe 3) Ansatz dendritischer
Zellen zugeführt.
Bei den Kontrollproben 2 und 4 erfolgte entsprechend eine Zufuhr
ungefärbter
Vesikel. Es zeigt sich, dass eine stark erhöhte Intensität der FITC-Fluoreszenz
bei 525 nm der dendritischen Zellen nach der Inkubation mit den
FITC-markierten Membranvesikeln von Tumorzellen (H7-Zellen). Die
Vorbehandlung der dendritischen Zellen mit hypotonem Medium (Probe
3) bewirkt eine erheblich höhere
Inkorporation von Membranvesikeln als die isotone Vorbehandlung
(Probe 1). Die Kurven der Kontrollproben 2 und 4 zeigen die erheblich
schwächere
Autofluoreszenz der dendritischen Zellen nach Fusion mit ungefärbten Vesikeln.
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Eine
quantitative Auswertung der Fluoreszenzanalyse wird in 3 illustriert.
Die FITC-Fluoreszenz wird als Maß für den Einbau der gefärbten Vesikel
in die dendritischen Zellen verwendet. Die mit ungefärbten Vesikeln
behandelten dendritische Zellen zeigen eine geringfügige Erhöhung der
Autofluoreszenz. Die gefärbten
Vesikeln ergeben deutlich erhöhte
Fluoreszenzintensitäten,
wobei die hypo-osmolare Vorbehandlung der dendritischen Zellen eine stärkere Fluoreszenz
ergibt, die den effektiveren Einbau der gefärbten Vesikeln in die dendritischen
Zellen bestätigt.
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Elektrisch-induzierter
Einbau der Vesikeln in dendritische Zellen
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Beim
elektrisch-induzierten Einbau der Vesikeln werden zunächst eine
isotone oder eine hypotone Suspension dendritischer Zellen wie oben
beschrieben mit einer Vesikelsuspension zusammengeführt und
für kurze
Zeit (z. B. 5 min) bei Raumtemperatur inkubiert. Jeweils 800 μl der Suspension
aus dendritischen Zellen und Vesikeln werden einem elektrischen
Feldimpuls ausgesetzt, der die äußeren Kräfte zur
Modifizierung der dendritischen Zellen bildet. Die Parameter des
Feldimpulses betragen bspw. 1 kV/cm, Dauer: 20 μs. Nach der Ausübung der
Feldimpulse erfolgt eine Inkubation bei Raumtemperatur und anschließend zur
Regenerierung der Zellen eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Schließlich wurden
die Proben mit PBS (280 mOsm) gewaschen, um die nicht fusionierten,
freien Vesikeln zu entfernen.
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Die
FACS-Analyse der modifizierten dendritischen Zellen ist in 4 illustriert.
In 4 sind die mittleren FITC-Fluoreszenzintensitäten bei 525 nm für die verschiedenen
Proben illustriert. Die linke Säule
zeigt die Fluoreszenz ohne Ausübung
eines Feldimpulses. Diese Probe entspricht somit dem oben erläuterten
Verfahren der osmotisch-induzierten Vesikelinkorporation. Die mittlere
Säule zeigt, dass
die Pulsausübung
im hypo-osmolaren Zustand der Zellsuspension fast eine Verdoppelung
des Vesikeleinbaus bewirkt. Bei Pulsausübung im iso-osmolaren Zustand
(rechte Säule)
ergibt sich eine weniger starke Zunahme der Fluoreszenz. Dies wird
damit erklärt,
dass die Permeabilität
der Membranoberfläche im
iso-osmolaren Zustand geringer als im hypo-osmolaren Zustand ist.
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3. Wichtige Merkmale der
Erfindung sind im Folgenden zusammengefasst:
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- a) Der Erfinder hat festgestellt, dass eine
passive Immunisierung oder Impfung sich überraschenderweise ohne Fusion
von dendritischen Zellen mit erkrankten Zellen erreichen lässt. Es
ist ausreichend, wenn eine Kontaktierung der Zellen bewirkt wird.
Eine enge Kontaktierung zwischen Zellen beider Zelltypen lässt sich
durch chemische Verbindungen oder durch physikalische Kräfte wie z.
B. Dielektrophorese, Zentrifugation, Filtertechniken, usw., erreichen.
Die Kontaktierung ist vorzugsweise so durchzuführen, dass bei Abschalten der
mechanischen bzw. elektrischen Kräfte die kontaktierten Zellen
sich nicht voneinander lösen.
- b) Es reicht bereits aus, wenn die Membran der Tumorzellen in
einen engen physikalischen oder chemischen Kontakt mit den dendritischen
Zellen gebracht wird.
- c) Besonders vorteilhaft ist es, die Kontaktierung über Dielektrophorese
in Mikrostrukturen durchzuführen.
Dies besitzt insbesondere den Vorteil, dass in Mikroelektrodensystemen
lokal hohe Felder erreicht werden.
- d) Es ist vorteilhaft, eine Aufnahme von adherierenden Tumormembranstücken in
die dendritischen Zellen vorzusehen und diese durch die Verwendung
von stark hypo-osmolaren Lösungen
zu erhöhen.
Dies ergibt sich daraus, dass ggf. nach Übertragung in iso-osmolaren
Lösungen
eine Endozytose beobachtet wird. Die Verwendung iso-osmolarer Lösungen ist
grundsätzlich
jedoch auch möglich.
- e) Besonders vorteilhaft ist es, eine feld-induzierte Endozytose
auszulösen.
Dies bedeutet, dass nach physikalischer oder chemischer Kontaktierung
ein Durchbruchimpuls in hypo-osmolarer
Lösung
induziert wird.