DE69533474T2

DE69533474T2 - Gerät und methode für die effiziente inkorporation von molekülen in zellen

Info

Publication number: DE69533474T2
Application number: DE69533474T
Authority: DE
Inventors: Rafi Korenstein; Yosef Rosemberg
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2015-02-25
Also published as: EP0750663A4; EP0750663B1; DE69533474D1; IL108775A; WO1995023211A1; AU1930795A; IL108775A0; EP1496107A2; EP1496107A3; EP0750663A1; US5964726A

Description

GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zum Transferieren von Molekülen in Zellen, insbesondere ein für den Transfer von Makromolekülen geeignetes gepulstes Niedervolt-System.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Um Moleküle in Zellen einzubringen, muss die Permeabilitätsbarriere der Zellmembran überwunden werden. Jüngere Entwicklungen haben zwei Kategorien von Ansätzen ergeben, um an sich membranimpermeable Moleküle in Zellen einzubringen.
Bei einem ersten Verfahren werden Moleküle von niedrigem Molekulargewicht in Zellen eingebracht, entweder mit Hilfe von lipophilen Molekülen, die in hydrophile Moleküle modifiziert werden, nach ihrer Penetration in das Cytosol durch intrazelluläre Enzyme, wie Esterasen, die zum Beispiel einwirken auf den pH-Indikator 2',7'-bis(2-Carboxyaethyl)-5(6)-carboxyfluorescin oder Acetoxymethylesther, oder durch eine durch Adenosintriphosphat induzierte Bildung kleiner Poren in der Membran.
Das zweite Verfahren umfasst die Einbringung von Molekülen mit hohem Molekulargewicht und basiert auf verschiedenen Ansätzen. Ein Ansatz ist die Verwendung von Chemikalien wie etwa Detergentien, Polyethylenglykol und Lipofektin. Weitere Ansätze umfassen die Liposomzellenfusion, E lektroporation sowie die Bombardierung einer Zelle mit ummantelten Molekülen.
Ein Problem bei diesem Verfahren besteht darin, dass sie entweder Zellen zerstören oder ineffizient und von beschränktem wirtschaftlichem Nutzen sind.
Eine Anwendung, bei der die Einbringung von Molekülen in Zellen erforderlich ist, ist das Gebiet der Gentherapie. Bei dieser Anwendung müssen Makromoleküle, üblicherweise DNA, in die Zelle eingebracht werden. Die Zellen müssen mit der DNA transfiziert werden, um so transformierte, lebensfähige Zellen zu erhalten.
Obwohl bei der Manipulation von zellularen Genen erhebliche Fortschritte gemacht wurden, ist die Anwendung auf die Gentherapie bislang begrenzt, und der Bereich der Gentherapie ist noch immer nicht kommerziell erschlossen. Ein Haupthindernis der effektiven Anwendung der Gentherapie ist das Erfordernis, eine sehr hohe Anzahl transformierter Zellen zu erhalten. In den meisten Fällen tritt nach der Transfizierung die Transformation nicht ein, und es lässt sich weder eine weitere Selektion, noch eine Multiplikation der Zellen erreichen. Daher ist die Effizienz der Transfizierung, die zur Transformation führt, der Hemmschuh für die Anwendungen der Gentherapie.
Ein erfolgreicher Ansatz bei der Gentherapie bestand darin, ein Gen zu verwenden, das in ein Retrovirus eingeschleust wurde, als Vektor zum Einbringen des Gens in die Zielzelle. Der Nachteil bei dieser Strategie besteht jedoch darin, dass sie die Multiplikation der Zielzellen in vitro umfasst. Andere Begrenzungen dieses Ansatzes liegen in der beschränkten Größe des Gens, das vom Vektor getragen und implantiert werden kann, und den benötigen Verfahren zum Exprimieren nur des Zielgens ohne die zusätzliche Exprimierung der viralen Gene. Dieses Verfahren ist beschränkt auf DNA und nicht für andere Arten von Molekülen verwendbar, welche zum Beispiel zur intrazellularen Anwendung exogener Enzyme, wie etwa Begrenzungs-Enzyme für Genmanipulationen führen könnten.
Ein weiterer Ansatz besteht in der Verschmelzung von Liposomen. Die Liposomen werden mit den geeigneten Genen geladen und mit den Zielzellen verschmolzen.
Ein alternatives Verfahren für die Einbringung von Genen in Zellen basiert darauf, dass man die Zellen exogener DNA starken elektrischen Feldern aussetzt; das Verfahren ist als Elektroporation bekannt. Elektroporation lässt sich allgemein definieren als die Bildung hydrophiler Poren durch einen elektrischen Prozess, wobei größere Poren eine höhere Permeabilität erlauben. Bei der Elektroporation werden kurze elektrische Hochspannungsimpulse eingesetzt, um einen vorübergehenden Zustand hoher Permeabilität (reversibler elektrischer Durchschlag (reversible electrical breakdown, REB) zu erzeugen, welcher am Beginn des Zustands hoher Permeabilität auftritt. REB ist eine Verminderung des elektrischen Widerstandes eines Gewebes verursacht durch ein kurzes Ausgesetztsein gegenüber einem abnorm hohen Potential durch das Gewebe hindurch.
Das US-Patent 5,019,034, Weaver, offenbart die Verwendung eines elektrischen Hochspannungsimpulses von kurzer Dauer auf die Gewebeoberfläche zur Erzeugung von Elektroporation von Molekülen in Zellen des Gewebes.
Ein oszillierendes elektrisches Feld mit einer Amplitude (Spitze zu Spitze) von 50 bis 200 V/cm, einer Frequenz von 0,1 Hz bis 1 MHz und einer Impulsdauer von 1 bis 100 s wurde für die Transfizierung von DNA in einer Lösung von E.coli-Zellen verwendet (Xie & Tsong (1990) Biophys. J. 58,897-903). Die Überlebensrate von E.coli-Zellen ist viel höher verglichen mit Stan dard-Verfahren der Elektroporation umfassend einen einzelnen Impuls eines hohen elektrischen Feldes von 1 bis 3 kV/cm.
Allerdings leiden die bekannten Verfahren jeweils unter wenigstens einem der folgenden Probleme:

1) Die Effizienz des Einbringens oder Transfizierens von Molekülen mit hohem Molekulargewicht (d.h. Makromolekülen) ist gering;
2) die nachgewiesene Einbringung von Makromolekülen ist offenbar auf DNA beschränkt. Es ist nicht möglich, Proteine von hohem Molekulargewicht, Enzyme mit Molekulargewicht von 250 kD und größer einzubringen, wie in der Literatur offenbart.
3) Viele der verbreitet verwendeten Verfahren beinhalten Schritte zur Transfizierung mit einer großen Zellsterberate.

Die vorliegende Erfindung bietet ein alternatives Verfahren zu den oben dargestellten, welches nicht nur die Einbringung von Makromolekülen in Zellen ohne Zerstörung der Zellen ermöglicht, sondern auch eine effiziente Einbringung der Moleküle bietet. Das Verfahren ist in vitro anwendbar.
Zum Einbringen von Molekülen in adhärente Zellen (auf Zellen, die an eine Oberfläche gebunden wachsen) sind verschiedene Elektroden nach dem Stand der Technik benutzt worden. Eine derartige Elektrode basierte darauf, dass Zellen dazu gebracht wurden, sich an eine erste Elektrodenoberfläche zu binden, woraufhin eine zweite Elektrode oberhalb der mit der ersten verbundenen Zellen angebracht wurde. Eine zweite bekannte Elektrode basierte auf der Anwendung mehrerer Sätze paralleler Elektroden, welche senkrecht zu der Oberfläche positioniert wurden, an die die Zellen gebunden waren. Die zweite Elektroden-Konfiguration erforderte einen Kontakt zwi schen Elektrode und Zelle, was das Problem zur Folge hatte, dass aufgrund der geringen Größe der Zellen die Elektroden in engen Toleranzen hergestellt werden mussten, um sicherzustellen, dass die Zellen in Kontakt mit beiden Elektroden standen, was schwierig zu leisten war.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG UND VORTEILE
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Einbringen von Molekülen, (einschließlich Makromolekülen) in ein Membran-Vesikel, eine Zelle oder Gewebe, mit dem die Moleküle in Kontakt stehen, wobei das Verfahren das Anwenden einer Folge unipolarer oder Wechselspannungs-Impulse auf die Moleküle und das Membran-Vesikel, die Zelle oder das Gewebe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Folge von Impulsen eine Spannungsamplitude im Bereich von 10V/cm bis 250V/cm in einem Frequenzbereich von 1 Hz bis 50 MHz und eine Impulsbreite von 20 ns bis 20 ms aufweist.
Die vorliegende Erfindung erlaubt die Einbringung von Molekülen in Zellen und ist nicht beschränkt durch das Molekulargewicht der Moleküle. Die Moleküle, einschließlich Makromoleküle, können hoch effizient inkorporiert werden, wodurch zytoplasmatische Konzentrationen erreicht werden, die wenigstens um eine Größenordnung höher als die extrazellulare Konzentration des Moleküls und der Makromoleküle ist. Die vorliegende Erfindung besitzt auch eine hohe Überlebensrate der behandelten Zellen. Das Verfahren benutzt ähnliche elektrische Parameter für die Einbringung von Molekülen, einschließlich Makromolekülen, in verschiedene Zelltypen. Dies erlaubt eine leichte Anwendung der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich, indem diese unter Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beschreibungen illustriert wird, die im Zusammenhang mit den anlegenden Zeichnungen zu verstehen sind. Darin zeigen:
1A eine Balkengraphik zum Vergleich der Inkorporation von 70 kD (Dextran-FITC) und 486 kD (Dextran-FITC) intrazellular in Lymphozyten (Lymphom-B-Zellen, I29) durch Elektroporation (horizontale Schraffierung, im Vergleich zu dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (diagonale Schraffierung), und bezeichnet den Prozentsatz fluoreszierender Zellen, wobei die Elektroporation durchgeführt wird, indem auf die Lösung zehn Impulse von 1600 V/cm mit einer jeweiligen Impulsdauer von 200 μs angewendet wurde;
1B eine Balkengraphik zum Vergleich der Inkorporation von 70 kD (Dextran-FITC) und 486 kD (Dextran-FITC) intrazellular in Lymphozyten (Lymphom-B.Zellen I29) durch Elektroporation (horizontale Schraffierung) im Vergleich zum Verfahren der vorliegenden Erfindung (diagonale Schraffierung);
2 eine Balkengraphik, die die Inkorporation von 70 kD (Dextran-FITZC) und 486 kD (Dextran-FITC) in Membranvesikel (Thyllakoide) zeigt und die vorliegende Erfindung (diagonale Schraffierung) mit dem Verfahren der Elektroporation (horizontale Schraffierung) vergleicht;
9A – D Photos, die die interzellulare Inkorporation von Molekülen von 150 kD (Dextran-FITC) mit dem gegenwärtigen Verfah ren in Lewis-Lungenkarzinom-Zellen zeigt, die adhärent in Petrischalen wachsen, wobei die Zellen in einem schwach leitenden Medium bestehend aus 0,3 M Mannitol, 1,5 mM Hepes, pH = 7,4 inkubiert wurden. Dem Medium wurden 20 mM 150 kD Dextran-FITC hinzugegeben; und wobei (A) Kontrolle (Phasenmikroskop), (B) Kontrolle (Fluoreszenzmikroskop), (C) einem Stimulus (Wechselstrom) von 100 V/cm, 0,9 mSec, 1000 Hz für zehn Minuten ausgesetzt (Phasenmikroskop), (D) einem Stimulus (Wechselstrom) von 100 V/cm, 0,9 mSec, 1000 Hz für zehn Minuten ausgesetzt (Fluoreszenzmikroskop), und die rote Fluoreszenz wird erzeugt durch Propidiomiodid, welches beiden Proben hinzugegeben wurde, um den Anteil toter Zellen festzustellen;
10A – D sind Photographien, die die intrazellulare Inkorporation von Molekülen von 200 kD Dextran-FITC mittels der vorliegenden Methode in Lewis-Lungenkarzinom-Zellen teilt, die adhärent in Petrischalen wachsen, wobei ein Medium umfassend BGJ + 10% FCS, in welche 0,194 mM 2000 kD Dextran-FITC hinzugefügt wurde; und wobei (A) Kontrolle (Phasenmikroskop), (B) Kontrolle (Fluoreszenzmikroskop), (C) ausgesetzt für vierzig Minuten einem Stimulus (Wechselstrom) von 90 V/cm, 0,9 mSec, 1000 Hz (Phasenmikroskop), und (D) ausgesetzt für vierzig Minuten einem Stimulus (Wechselstrom) von 90 V/cm, 0,9 mSec, 1000 Hz (Fluoreszenzmikroskop); sowie
11A – D Photographen, die die intrazellulare Inkorporation von Molekülen von 70 kD Dextran-FITC in Lewis-Lungenkarzinom-Zellen zeigen, die adhärent in Petrischalen wachsen, wobei die Folge von unipolaren Impulsen durch einen Gleichstrom- Stimulus ersetzt wurde, und das Medium der Reaktion BGJ + 10% FCS war, welchem 20 mM 70 kD Dextran-FITC hinzugegeben wurden; und wobei (A) Kontrolle (Phasenmikroskop), (B) Kontrolle (Fluoreszenzmikroskop), (C) ausgesetzt für fünfzig Minuten einem Stimulus (Wechselstrom) von 60 V/cm, 30 kHz (Phasenmikroskop), (D) ausgesetzt fünfzig Minuten einem Stimulus (Wechselstrom) von 60 V/cm, 30 kHz (Fluoreszenzmikroskop).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Allgemein sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das Einbringen von Molekülen einschließlich Makromolekülen in eine Zelle vor. Dies erreicht man durch die allgemeinen Schritte des Anfertigens entweder einer Suspension oder einer adhärenten Kultur der Zellen und der Moleküle, die in die Zellen eingebracht werden sollen, und des Anwendens einer Folge unipolarer oder alternierender Impulse von niedriger Spannung auf die Suspension oder die adhärente Schicht zur Erhöhung der Konzentration der Moleküle auf der Zelloberfläche. Dies führt zu einer vermehrten Interaktion der Moleküle/Makromoleküle mit der Lipid-Doppelschicht der Zellmenbranen, angeregt durch elektrische und thermische Kräfte. Gleichzeitig führt die Folge oder Serie von Folgen unipolarer oder alternierender Spannungsimpulse zu einer elektrophoretischen Bewegung der geladenen Proteine in die Zellmembranen, was zu ihrer Akkumulation in einer Hälfte der Zelle führt. Die Akkumulation der Moleküle/Makromoleküle an der Zelloberfläche und die auf die Makromoleküle einwirkenden elektrischen und thermischen Kräfte führen zu einer vermehrten Interaktion der Makromoleküle und Moleküle mit der Zelloberfläche mit der Folge einer Destabilisierung der Zellmembran. Die Destabilisierung der Zellmembran verursacht die Penetration der Moleküle und Makromoleküle in den zytosolischen Raum der Zelle über endozytische Prozesse, was zu einer vermehrten Vesikelbildung mit den Molekülen und Makromolekülen führt, wobei diese innerhalb der Vesikel eingeschlossen sind und/oder die Makromoleküle die Zellen über Diffusion durch die induzierten strukturellen Defekte in der Lipid-Doppelschicht penetrieren.
Genauer gesagt wird eine Serie von Impulsen, wie etwa eine einzelne Folge oder mehrere Folgen unipolarer Gleichstromimpulse oder Wechselstromimpulse, auf eine Umgebung angewandt, die die Zellen und Moleküle enthält. Der Begriff Serie soll eine einzelne Folge von Spannungsimpulsen oder eine Anzahl kontinuierlicher Wiederholungen der Folge an Spannungsimpulsen oder eine Anzahl kontinuierlicher Wiederholungen der Folge von Spannungsimpulsen bezeichnen. Diese Spannungsimpulse können entweder unipolar oder bipolar sein. Dieser Schritt des Verfahrens ist ein wesentlicher Unterschied zu anderen Verfahren, wie etwa Elektroporation.
In vitro, bei in Suspension wachsenden Zellen, werden die Zellen in einem Medium mit schwacher Leitfähigkeit suspendiert, um elektrische Heizeffekte und/oder elektrolytische Reaktionen an der Schnittstelle Elektrode zu Medium gering zu halten. Ein solches Medium kann bestehen aus 300 mM Saccharose oder Mannitol in Anwesenheit einer geringen Menge eines Pulvers (zum Beispiel 1 bis 3 mM Hepes) von einem pK im Bereich eines pH-Wertes von 7,0 bis 8,0. In machen Fällen kann dem Medium 5% Glyzerol hinzugefügt werden, um die Inkorporation zu verbessern. Nach dem Aussetzen gegenüber dem elektrischen Feld sollten die Zellen mit PBS oder einem Nährmedium gewaschen werden und abschließend das Medium durch frisches Nährmedium in Anwesenheit von 5% bis 10% FCS (fetal calf serum), fötales Kalbserum, oder bovinem Kalbserum ersetzt werden. Die Folge oder Serie von Folgen unipolarer Spannungsimpulse wird mittels Anlegen zweier Elektroden auf die Suspension appliziert. Die Elektroden könnten aus unterschiedlichen Metallen bestehen, wobei Edelmetalle und nicht polarisierbare Elektroden (z.B. Platin oder Ag/AgCL-Elektroden) zu bevorzugen sind.
In vitro, bei Zellen, die angelagert oder gebunden an eine Oberfläche wie etwa eine Petrischale oder einen Kulturkolben wachsen, werden die Zellen durch Kultivieren in einem geeigneten Nährmedium angehaftet, wie in 9A – D, 10A – D und 11A – D gezeigt. Das Nährmedium wird dann entfernt und durch ein geeignetes Inkubationsmedium ersetzt, wie etwa ein BGJ-Medium ergänzt mit 10% FCS. Danach werden die Zellen einem Wechselstromfeld (60 V/cm bei 30 kHz) ausgesetzt. Nach dem Aussetzen gegenüber diesem Feld werden die Zellen mit PBS oder einem Medium gewaschen, und es wird schließlich ersatzweise frische Nährlösung zugesetzt. Anders als bei der Behandlung von suspendierten Zellen kann die Inkorporation von Makromolekülen in Anwesenheit eines sehr leitfähigen Mediums stattfinden. Das bedeutet, dass Makromoleküle in Anwesenheit eines hoch leitenden Mediums in Zellen inkorporiert werden können.
Die vorliegende Erfindung kann auch angewendet werden, um die Inkorporation von Molekülen in adhärente Zellen zu verbessern, indem das Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. In der Verwendung mit adhärenten Zellen besteht keine Notwendigkeit, die Nährlösung der Zellen durch ein Medium von niedriger Leitfähigkeit auszutauschen. Dies bedeutet, dass dasselbe Medium, das für das Zellwachstum verwendet wird, für die Reaktion Verwendung finden kann, die die Makromoleküle inkorporiert.
Die Wirkung der vorliegenden Erfindung kann weiterhin dadurch herbeigeführt werden, dass die Verbindungen mit hydrophilen Verbindungen (als Träger), wie etwa bovines Serumalbumin, vernetzt werden. Das heißt, die Moleküle können (kovalent und nicht kovalent) mit hydrophil aufgeladenen Trägern verbunden sein, welche die Bewegung der Moleküle bei Anwendung der Impulse potenzieren, wodurch die Effizienz des Systems verbessert wird. Die zellulare Wirkung der hydrophilen äußeren Oberfläche der Membrane kombiniert mit der Wirkung der Folge oder Serie von Folgen von Spannungs- Impulsen ermöglichen die Konzentration der Moleküle und Makromoleküle an der Zelloberfläche. Wenn die konzentrierten Moleküle an der Zelloberfläche mit der Zellmembran kollidieren, häufen sich die Moleküle an und in dem hydrophilen Bereich der Membran. Es bilden sich intrazellulare Pinozythen, was zu einer vermehrten intrazellularen Bildung von Vesikeln führt. Die Moleküle haben damit intrazellularen Zugang erreicht. Anders als bei bekannten Methoden wird jedoch der Konzentrierungseffekt der vorliegenden Erfindung zu einer konzentrierten Einbringung der Moleküle in die Zellen. Die gebildeten Vesikel enthalten eine hohe Konzentration der Moleküle, wodurch eine effiziente Einbringung der Moleküle in die Zelle geboten wird.
Alternativ lässt sich dasselbe Endergebnis, die Aufladung oder Transfizierung, dadurch erreichen, dass man die Bewegung von Zellen in Richtung auf nicht aufgeladene Moleküle oder Makromoleküle induziert.
Moleküle, die für die zur Inkorporation mittels der vorliegenden Erfindung fähig sind, lassen sich über einen weiten Bereich definieren. Das heißt, die vorliegende Erfindung ermöglicht ein effizientes Einbringen von Molekülen und Makromolekülen in lebende Zellen in vitro. Diese Moleküle liegen innerhalb eines extrem weiten Bereichs von Molekulargewichten. Die Moleküle können von der Größe von Ionen und kleinen Molekülen bis zu Proteinen, Antikörpern und großen Enzymen reichen. Außerdem kann eine Transfizierung mit verschiedenen DNA-Vektoren mit dem vorliegenden erfinderischen Verfahren entweder allein oder in Kombination mit anderen Transfizierungsverfahren erreicht werden, wodurch die Effektivität dieser Verfahren verbessert wird. Andere bekannte Verfahren zum Einbringen beinhalten die Inkorporation von Makromolekülen auf der Basis der Verwendung chemischer Verbindungen, zum Beispiel die DNA-Transfizierung auf der Basis von Kalziumphosphat-Ausfällung.
Wie bereits gesagt, basiert die vorliegende Erfindung auf der durch ein elektrisches Feld induzierten relativen Bewegung geladener Moleküle, geladener Makromoleküle oder geladener Liposomen in Richtung auf Zellen (oder umgekehrt) mittels geeigneter Parameter des elektrischen Feldes, welche zu einer Akkumulation der aufgeladenen Einheiten nahe der Zellmembran führen. Im Gegensatz zu bekannten Verfahren verwendet die vorliegende Erfindung nicht entweder hohe Spannungen, wie bei der Elektroporation, oder Frequenzen, welche eine Summierung von Spannungsimpulsen erzeugen, in einer Weise, wo der effektive Puls die Summe mehrerer Impulse darstellt, was zu Molekülen im Spannungszustand zwischen dem extrazellularen und dem intrazellularen Raum führt. Das vorliegende Verfahren unterscheidet sich von der Elektroporation (oder entsprechenden Begriffen) durch die folgenden Merkmale:

1. Die bei der vorliegenden Erfindung zur effektiven Inkorporation von Molekülen/Makromolekülen in Zellen verwendeten elektrischen Parameter induzieren eine transmembrane Potentialdifferenz über die Zellmembrane, welche wesentlich geringer ist als der bekannte Schwellwert der transmembranen Potentialdifferenz, welcher zum Stattfinden von Elektroporation führt.
2. Es wurde gezeigt, dass die Elektroporation und dementsprechend die Aufnahme unter einem elektrischen Feld mit spezifischen Parametern proportional zum Volumen des biologischen Objektes (zum Beispiel Zelle, Bakterium, usw.) ist, welches dem elektrischen Feld ausgesetzt wird. Unter den experimentellen Bedingungen der vorliegenden Erfindung ist die Aufnahme mittels des Verfahrens der vor liegenden Erfindung unabhängig vom Volumen des ausgesetzten biologischen Objektes und kann proportional zur Oberfläche des Objektes sein.
3. Die Aufnahme ist nicht begrenzt durch die elektrochemische Potentialdifferenz über der Membrankonzentration. Unter Bedingungen der Elektroporation lassen sich bestenfalls gleiche Konzentrationen von Molekülen/Makromolekülen im Zytosol und im externen Medium erreichen. Unter experimentellen Bedingungen haben Anwender Erhöhungen bis zur doppelten Größenordnung in der Molekül/Makromolekül-Konzentration im Zytosol verglichen mit der Konzentration im externen Medium demonstriert.

Genauer gesagt, um eine vermehrte Inkorporation der Moleküle in Zellen hinein zu erreichen, wird die Zellensuspension oder werden die an eine Oberfläche angehafteten Zellen in Anwesenheit der zu inkorporierenden molekularen Einheit einem elektrischen Feld ausgesetzt, das durch mehrere Folgen von elektrischen Impulsen gebildet wird. Die Amplitude der Spannung bei jeder Impulsfolge oder Serie von Impulsfolgen liegt im Amplitudenbereich von 10 V/cm bis 250 V/cm. Der Frequenzbereich der Impulse liegt zwischen 1 Hz und 50 Hz mit Impulsbreiten von 20 ns bis 20 ms im Falle unipolarer Impulse (Gleichstrom) und 10 und 100 kHz bei bipolaren (Wechselstrom) Impulsen. Die genauen Eigenschaften des anzuwendenden Feldes hängen von der Ladung und dem Molekulargewicht der spezifischen Moleküle ab, die inkorporiert werden sollen.
Die vorliegende. Erfindung kann in den verschiedensten Bereichen Anwendung finden. Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, Zellen mit Medikamenten für eine langsame Freisetzung von Medikamenten aufzuladen. Bei dieser Anwendung sind die Medikamente die Moleküle, die mittels der vorliegenden Erfindung in die Zellen transferiert werden. Andere Moleküle, etwa Farbstoffe und Marker, können in Zellen eingebracht werden zum Zwecke von bildgebenden diagnostischen Verfahren. Auch die in situ – Enzymologie (Einbringen von Agentien für diagnostische Zwecke) ist möglich. Auch können Antikörper zur Therapie oder für diagnostische Zwecke angebracht werden.
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, Medikamente in spezifische Zellen oder Gewebetypen einzubringen, zum Beispiel zum Einbringen von Medikamenten in Tumorgewebe zur Krebstherapie. Auch können Enzyme für spezifische Zwecke in Zellen eingebracht werden.
Ein anderer Bereich für die Anwendung der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben ist die Gentechnologie und Gentherapie. Die vorliegende Erfindung ist anwendbar als Mittel der Transfizierung sowie in der Gewebe-Gentherapie.
Die vorstehende Liste der Fähigkeiten ist nur eine Auswahl der Möglichkeiten der Anwendung der vorliegenden Erfindung. Die Liste soll nur exemplarisch sein und die Einsatzbereiche der vorliegenden Erfindung nicht abschließend aufzählen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Anwendung der vorliegenden Erfindung:
Materialien und Verfahren
In den folgenden Beispielen wurden die folgenden allgemeinen Bedingungen verwendet; alle Modifikationen sind jeweils in den Beispielen aufgeführt. Zellen wurden allgemein mit einer Konzentration von 1 – 4 × 10⁶ /ml behandelt. Vor dem Aussetzen gegenüber dem elektrischen Feld wurden die Zellen zweimal mit einem Reaktionsmedium gewaschen. Das Aussetzen gegenüber dem elektrischen Feld wurde in einem Reaktionsmedium in einem Temperaturbereich von 2°C bis 38°C durchgeführt. Das einzubringende Mo lekül befand sich ebenso in dem Reaktionsmedium mit einer Konzentration wie jeweils in den folgenden Beispielen angegeben, doch allgemein innerhalb eines Bereichs von 0,5 μM bis 0,1 mM. Das Molekül befindet sich während dem Aussetzen gegenüber dem externen elektrischen Feld in dem Medium. Manchmal wird es für eine kurze Zeit nach dem Aussetzen gegenüber dem externen elektrischen Feld in Eis gelagert. Nach dem Aussetzen wurden die Zellen zweimal mit dem Reaktionsmedium gewaschen. Bei Langzeitexperimenten wurden die Zellen zweimal nach dem Aussetzen mit einem Kulturmedium gewaschen, das 10% fötales Kalbserum enthielt, und dann eine Kultur angesetzt.
Die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Aussetzen wurde ermittelt durch einen Trypan-Blau-Ausschluss oder die Aufnahme von Propidiumiodid. Allgemein war 40 Minuten nach dem Aussetzen kein Unterschied in der Lebensfähigkeit zwischen behandelten und unbehandelten Zellen nach dem Trypan-Blau-Ausschlussverfahren festzustellen. Die Vermehrung wurde ermittelt durch die Inkorporation von ³H-Thymidin sowie durch Zellzählung. Nach dem Aussetzen wurden die Lymphozyten auf ihre Fähigkeit zur Fortsetzung der Produktion von Antikörpern nach ihrem Aussetzen gegenüber Lipopolysaccharid (LPS) gescreent. Die Aufnahme von Molekülen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie oder durch ein biochemisches Testverfahren gemessen.
Allgemein bestanden die elektrischen Felder, denen die Zellen ausgesetzt wurden, aus mehreren Impulsfolgen. Die Amplitude der Spannung in jeder Impulsfolge liegt im Amplitudenbereich zwischen 10 V/cm und 250 V/cm. Der Frequenzbereich der Impulse liegt zwischen 1 Hz und 50 MHz mit Impulsbreiten zwischen 20 ns und 20 ms. Die genauen Eigenschaften des anzuwendenden Feldes hängen von der Ladung und dem Molekulargewicht der spezifischen zu inkorporierenden Moleküle ab und ist in den Beispielen aufgeführt. Die Wahl des angewendeten elektrischen Feldes hängt auch von der Zusammensetzung und Viskosität des Mediums ab.
Beispiel 1
Fünf zellulare Systeme wurden erfolgreich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt, um 70 kD Dextran in die Zellen einzubringen, unter den experimentellen Parametern wie in Tabelle 1 zusammengefasst. Die prozentuale Aufnahme des Moleküls wurde durch die Anzahl fluoreszierender Zellen gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 2 aufgeführt sind. Allgemein zeigten 80 bis 100% der Zellen eine Aufnahme, d.h. Fluoreszenz, des Dextrans. Das Medium der Reaktion setzt sich zusammen aus 0,3 M Mannitol oder Saccharose und 1 mM Puffer-Hepes-NaOH oder Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0. Die Leitfähigkeit des finalen Mediums ist sehr niedrig (<200 μMHO), so dass die Zellen vor dem Aussetzen gegenüber den elektrischen Feldern dreimal in diesem Medium gewaschen werden. Nach dem Aussetzen können die Zellen 5% bis 10% Glyzerol in dem Medium der Waschlösungen ausgesetzt werden. Nach der Reaktion werden die Zellen dreimal mit dem für die Kultur dieser spezifischen Zelllinie gewaschen (RPMI + 10% fötales Kalbserum, DMEM + 10 fötales Kalbserum, PBS, etc.).
Tabelle 1
(Aufnahme von 70 kD Dextran)
Rote Blutkörperchen (RBC):

Konzentration: 20 μM
Medium: 0,3 M Mannitol 1 mM Hepes-NaOH
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 90 μ sek bei 1.000 Hz
Frequenz: 120–1.000 Hz – (Impulsweite 90/ μ sek)
Zeit des einzelnen Aussetzens: 21 Sekunden
Gesamtzahl von Aussetzungen: 1

B-Lymphozyten (I₂₉)

Konzentration: 20 μM
Medium: 0,3 M Saccharose, 1,2 mM tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 150 und 200 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 120 Hz
Zeit des einzelnen Aussetzens: 21 Sekunden
Gesamtzahl von Aussetzungen: 6
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

Cos 5–7:

Konzentration: 20 μM
Medium: 0,3 M Mannitol, 1 mM Tris PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 200 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 5
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

Geschwollene Thylakoid-Vesikel:

Konzentration: 20 μM
Medium: 1,2 mM tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 200 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 5
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

Rote Blutkörperchen-„Geister" (Geister mit niedrigem PH-Wert):

Konzentration: 2 μM
Medium: 0,3 M Saccharose, 1,2 mm tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 150 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 120 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 6
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden Tabelle 2

Zellulares System % zellulare Aufnahme

RBC 80 % – 100%

Lymphozyten I₂₉ 80%

Cos 5–7 80% – 100%

Geschwollene Thylakoid-Vesikel 80%

RBC (Geister) 80 % – 100%

Wie in Tabelle 2 gezeigt, waren die Zellen alle fluoreszierend, was die Aufnahme des 70kD-FITC-Dextrans anzeigt. Die Ergebnisse für die geschwollenen Thylakoid-Vesikel beziehen sich auf die Population von Vesikeln, die leicht unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden kann (1–10 μM). Dies liegt daran, dass die Vesikel in ihrer Größe äußerst heterogen sind und es daher schwierig ist, eine genaue Zahl zu bestimmen. Auch besitzt die Thylakoid-Membran eine intrinsische rote Fluoreszenz, während das Dextran war ein FITC-Konjugat war. Deshalb wurden die Vesikel ostmotisch geschrumpft, um zwischen Aufnahme und Bindung unterscheiden zu können, so dass sich das Verhältnis Wert zu Bereich veränderte.
Beispiel 2
Acht Zellularsysteme wurden mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt, um unter den in Tabelle 3 detailliert dargestellten Bedingungen 486 kD Dextran in Zellen einzufügen. Die Behandlung war bei 80–100 % der Zellpopulation erfolgreich (Tabelle 4).
Tabelle 3
(Aufnahme von 486 kD Dextran)
Rote Blutkörperchen (RBC):

Konzentration: 0,5 μM
Medium: 0,3 M Mannitol, 1 mM Hepes PH-Wert 7,0
Amplitude des elektrischen Felds: 150 V/cm
Dauer einer einzelnen elektrischen Feld-Impulses: 90 μ-Sekunden
Frequenz: 1.000 Hz
Gesamtzeit der Aussetzung: 10 Minuten
Anzahl der Aussetzungen: 1

Lewis-Lungen-(LL)-Karzinom:

Konzentration: 0,5 μm
Medium: 1 mM tris HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 200 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 5
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

B-Lymphocytes (I₂₉):

Konzentration: 0,5 μm
Medium: 0,3 m Saccharose, 1,2 mm tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 150 und 200 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 milliseconds
Frequenz: 120 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 6
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

Cos 5–7:

Konzentration: 20 μm
Medium: 0,3 m Mannitol, 1 mM Tris PH-Wert 8,0, 1, mm Hepes PH-Wert 7,4
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 90 m Sekunden
Frequenz: 1000 Hz
Zeit des Aussetzens: 15 Minuten
Anzahl von Aussetzungen: 1

Geschwollene Thylakoid-Vesikel:

Konzentration: 0,5 μM
Medium: 1,2 mm tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 100 Hz
Zeit der Belichtung: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 5
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

Rote Blutkörperchen-Geister (Geister mit niedrigem PH-Wert):

Konzentration: 20 μM
Medium: 0,3 M Saccharose, 1,2 mm tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 150 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 120 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 6

Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden Tabelle 4

Zellulares System	% zellulare Aufnahme
RBC	80 % – 100%
Lewis-Lungen-(LL)-Karzinom	80%
Lymphozyten I₂₉	80% – 100%
Cos 5–7	80% – 100%
Geschwollene Thylakoid-Vesikel	80%
RBC (Geister)	80 % – 100%

Diese Ergebnisse können mit den Ergebnissen verglichen werden, die man beim Gebrauch von Elektroporation zum Einzufügen von 70 kD Dextran in Lymphoma B-Zellen, I₂₉, erhält, wie in 1 gezeigt. Bei der Verwendung der Lymphomzellen führte Elektroporation zu etwa 80% toten Zellen, und weniger als 5% zeigten irgendeine Aufnahme des 70 kD Dextrans. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führte zu weniger als 10% toten Zellen und mehr als 90% Aufnahme von 70 kD Dextran. Entsprechend, bei der Verwendung von Membran-Vesikeln, wie in 2 gezeigt, führte Elektroporation dazu, dass etwa 5% der Zellen eine Aufnahme von 70 kD Dextran zeigten. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führte zu mehr als 90% Aufnahme von 70 kD Dextran.
Beispiel 3
B Lymphozyten I₂₉ wurden erfolgreich mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt, um IgG-FITC in 85% der Zellpopulation einzubringen. Die folgenden Parameter wurden benutzt:

Konzentration: 1 mg/ml
Medium: 1,0 mM tris-HCl, PH-Wert 8,0
Amplitude des elektrischen Felds: 200 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 0,9 Millisekunden
Frequenz: 200 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 10
Zeit zwischen Aussetzungen. 40 Sekunden

Beispiel 4
Unter Verwendung der experimentellen Parameter des Beispiels 3, wurden ein spezifischer Antikörper gegen Tyrosinkinase und ein nichtspezifischer Antikörper als Kontrolle wurde in die Lymphoblasten inkorporiert. 48 Stunden nach der Inkorporierung wurde die DNA-Synthese (³H-Thymidin-Aufnahme) gemessen. Die Synthese von DNA war 2629 cpm verglichen mit den Kontrollen, die 2411 cpm anzeigten.
Das Einbringen von Lymphozyten mit einem Antikörper gegen Tyrosinphosphat (verglichen mit einem unspezifischen Antikörper) führte zu einer teilweisen Hemmung der Antikörpersekretion aus diesen Zellen. Diese Ergebnisse zeigen ein hoch effiziente Einbringung von Antikörpern in Zellen und eine spezifische Wirkung auf die zellularen Maschinerie als Folge solch einer Einbringung. Tyrosinphosphat wurde gewählt, um die Bedeutung von Tyrosinkinase bezüglich des Prozesses der Antikörperproduktion zu überprüfen.
Beispiel 5
β-Galactosidase (540 kD) wurde in Cos 5–7 Zellen eingebracht. Das Maß an in die Zellen integriertem Enzym wurde ermittelt mittels eine Kalori metrietests, der O-Nitrophenyl-β-d-Galactopyranosid als Substrat verwendet. Die Aktivität wurde durch Subtrahieren der Hintergrundaktivität (Kontrollprobe) und Teilung durch die Anzahl von Zellen berechnet. Das β-Galactosidase wurde erfolgreich in die Zellen eingebracht. Die für Inkorporation verwendeten Parameter waren wie folgt:

Konzentration: 5 μg/ml
Medium: 1 mM tris-HCl, PH-Wert 8,0, 6% Glycerol
Amplitude des elektrischen Felds: 100 V/cm
Dauer des elektrischen Felds: 90 P unterstützt
Frequenz: 1000 Hz
Zeit des Aussetzens: 21 Sekunden
Anzahl von Aussetzungen: 5
Zeit zwischen Aussetzungen: 40 Sekunden

Da die Konzentration der β-Galactosidase 5 μg/ml betrug, betrug die Anzahl von Molekülen von β-Galactosidase pro ml 5,58 × 10¹², davon ausgehend, dass das Volumen der Zellen 2,7 × 10^–10 betrug. Demzufolge betrug die Anzahl von wiedererlangten Molekülen 7,2 × 10⁴. Theoretisch hätte die Anzahl von Molekülen, die hätten aufgenommen werden können, wenn es ein vollständiges chemische Gleichgewicht bestehen würde, nicht mehr als 1.496/Zelle sein sollen. Die Anzahl von pro Zelle aufgefundenen Molekülen war 40-mal größer als die theoretische Berechnung.
Beispiel 6
Die oben genannten Beispiele zeigen, dass die mit Elektroporation verbundenen Probleme mit der gegenwärtigen Erfindung überwunden worden sind. Sie ist eine sehr effiziente Methode (Aufnahme von 80–100 % der Zellpopulation) für das Einbringen von Molekülen, die Molekulargewichte über einer weiten Bereich von 1–10⁴ kD (Tabellen 1–3) haben, einschließlich En zymen (z.B. β-Galactosidase von 540 kD), Antikörpern (z.B. IgG von ungefähr 160 kD) oder Plasmiden (z.B. von 11,5 kD Größe). Außerdem erhielt man 80–90 % der Zellpopulation als lebensfähige Zellen mit dem Verfahren zur Einbringung oder Transfizierung.
Beispiel 7
Inkorporation von Makromolekülen durch Aussetzen gegenüber Wechselstromreizung. Die Versuche wurden mit dem Nadelelektrodensystem gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt. 3 LL-Zellen wurden in der Gegenwart des Wachstumsmediums an Petrischalen gehaftet. Das Medium wurde entfernt und durch ein Inkubationsmedium ersetzt. Das Inkubationsmedium bestand aus Wachstumsmedium (BGJ), das mit 10% FCS ergänzt war. Zu diesem Medium wurden Dextran-FITC-Moleküle (70 kD) mit einer finalen Konzentration von 20 μm hinzugefügt. Eine anregende Spannung mit einer Amplitude (Spitze zu Spitze) von 60 V/cm mit einer Frequenz von 30 kHz wurde fünfzig Minuten angewandt. Nach Beendigung des Reizes wurde das Medium entfernt. Die Petrischalen wurden sechsmal mit demselben Medium, aber ohne das Dextran-FITC 70 kD gewaschen. Die Proben wurden dann mit einem fluoreszierenden Mikroskop geprüft und mit einem 400 ASA-Film (Kodak) photographiert, wie in 11A–D gezeigt.
Beispiel 8
Inkorporation von Dextran-FITC (2000 kD) mittels unipolaren Spannungsimpulsen. Der Versuch wurde mit dem Nadelelektrodensystem gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt. 3 LL-Zellen bildeten eine einfache Schicht in Petrischalen. Das Medium wurde entfernt und durch das Inkubationsmedium ersetzt, das aus mit 10% FCS ergänztem BGJ Medium bestand. Dann wurden 2000 kD Dextran FITC hinzugefügt, zu einer finalen Konzentration von 0,19 μM. Die gepulste Reiz-Amplitude betrug 90 V/cm, die Dauer des Impulses 0,9 ms, und die Frequenz betrug 1000 Hz. Der Reiz wurde vierzig Minuten (eine Folge von Impulsen) angewandt. Schließlich wurde der Reiz beendet, und das Medium wurde entfernt. Die Petrischalen wurden sechsmal mit demselben Medium, aber ohne Dextran-FITC 70 kD gewaschen. Die Proben wurden mit einem fluoreszierenden Mikroskop geprüft und mit einem 400 ASA-Film (Kodak) photographiert, wie in 10A–D gezeigt.
Die Erfindung wurde auf eine illustrative Art beschrieben, und sei darauf hingewiesen, dass die verwendete Terminologie so zu verstehen sein soll, dass sie nur beschreibender und nicht einschränkender Natur ist.
Ersichtlich sind viele Änderungen und Abwandlungen der vorliegenden Erfindung im Lichte der oben genannten Lehren möglich. Es versteht sich deshalb, dass innerhalb des Umfangs der nachfolgenden Ansprüche, in denen Bezugszeichen lediglich zum leichteren Verständnis verwendet wurden und nicht auf irgendeine Weise einschränken sein sollen, die Erfindung anderweitig angewandt wird, als wie ausdrücklich beschrieben.
Referenzen
Tatham und Lindau, (1990), J. Gen. Physiol. 95 (3): 459–76.

Claims

Ex-Vivo-Verfahren zum Einbringen von Molekülen, (einschließlich Makromolekülen) in ein Membran-Vesikel, eine Zelle oder Gewebe, mit dem die Moleküle in Kontakt stehen, wobei das Verfahren das Anwenden einer Folge unipolarer oder Wechselspannungs-Impulse auf die Moleküle und das Membran-Vesikel, die Zelle oder das Gewebe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Folge von Impulsen eine Spannungsamplitude im Bereich von 10V/cm bis 250V/cm in einem Frequenzbereich von 1 Hz bis 50 MHz und eine Impulsbreite von 20 ns bis 20 ms aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter beinhaltend die Schritte des Herstellens einer Suspension der Zellen und der in diese einzubringenden Moleküle und des Anwendens der Folge von Spannungsimpulsen auf die Suspension.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter beinhaltend die Schritte des Herstellens einer anhaftenden Kultur der Zellen und der in diese einzubringenden Moleküle und des Anwendens der Folge von Spannungsimpulsen auf die anhaftenden Zellen.