EP2978410A2 - Fusionsmischung - Google Patents

Fusionsmischung

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Publication number
EP2978410A2
EP2978410A2 EP14722528.8A EP14722528A EP2978410A2 EP 2978410 A2 EP2978410 A2 EP 2978410A2 EP 14722528 A EP14722528 A EP 14722528A EP 2978410 A2 EP2978410 A2 EP 2978410A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fusion
membrane
molecule
lipid
mol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP14722528.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Hoffmann
Agnes Csiszar
Nils Hersch
Rudolf Merkel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP2978410A2 publication Critical patent/EP2978410A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Definitions

  • the invention relates to a fusion mixture for lipid-containing membrane modification of any lipid membrane, a cell membrane, a component of a cell membrane or cell membrane separated from the other cell components in vivo or in vitro, and a method for lipid-containing membrane modification by fusion with this mixture ,
  • Cationic lipids can be used for the preparation of cationic liposomes. It is known that the formation of cationic liposomes from the starting constituents is difficult to control, since different structures are derived from the starting materials. Substances can be formed. Cationic lipids are therefore mixed to form liposomes in advance regularly with neutral lipids as so-called helper lipids, since cationic lipids alone can not ensure the formation of liposomes obviously. As a helper z. As DOPE or cholesterol used, as is known from the above literature Khalil et al. (Khalil et al., page 40, right column, first paragraph).
  • the helper lipid has z.
  • Example a hydrophilic region and a hydrophobic region (in particular C 10 -C 30 ) with or without double bonds. Both areas have a neutral character. As a result, the large charge density and the repulsive forces between the positively charged molecules of the molecule type A are neutralized.
  • helper lipids are thus necessary and also increases the transfection efficiency of the system.
  • the proportion of helper lipid is set up to a maximum of 70% wt / wt. Suitable are molecules such.
  • phosphatidylethanolamines phosphatidylcholines (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamines, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamines, 1,2-dimiristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamines, 1, 2-Dielaidoylsn-glycero-3-phosphoethanolamines, 1, 2-diphytanolsn-glycero-3-phosphoethanolamines, 1, 2-dilinoleoylsn-glycero-3-phosphoethanolamines or 1, 2-dioleoyl sn-glycero-3-phosphatidylcholines).
  • Positively charged fusion mixtures with neutral helper lipids are known, for example, from WO 201 1/003406 A2.
  • the disclosed fusion mixtures are each based on a specific composition of molecule type A (cationic lipid), molecule type B (fluorescence marker) and molecule type C, the neutral helper lipid.
  • molecule type A cationic lipid
  • B fluorescence marker
  • C the neutral helper lipid
  • fusogenic liposome systems consisting of cationic (type A), neutral (type C) and aromatic lipids (type of molecule B) are composed and in which the molecule types A: B: C in the ratio of 1: 0.1: 1 wt / wt are present.
  • molecule type A DOTAP is used, as molecule type B fluorescent lipophilic molecules such as DiO, DiR, Bodipy-, Lissa- mine-Rhodamin- and FITC-labeled lipids.
  • the helper lipid C used is DOPE.
  • a biologically irrelevant fluorescent moiety initially promotes rapid membrane fusion between the cellular plasma membranes and the lipid bilayers of the fusogenic liposomes comprising the neutral (molecular type C) and the positively charged (molecule type A) lipids. After insertion into the cellular membranes, a fluorescence representation of the cell membrane and / or the transport processes taking place there can take place by determining the amount of a second fluorescent component.
  • These fusogenic liposome systems thus have four components (type A of molecules, type of molecule C and twice type of molecule B) and, similar to Csiszär et al. or in WO 201 1/003406 with respect to 3-systems, disclosed only in a well-defined and fixed relationship to each other.
  • a disadvantage of the fusion mixtures known from the prior art is thus the narrow concentration ranges for the molecule types A, B and C as well as the synergistic interaction of at least 3 components in order to achieve an effective fusogenic mixture.
  • the object of the invention is to provide a fusion mixture of simple composition for the lipid-containing membrane modification of any lipid membrane, cell membrane, a component of a cell membrane or a cell membrane separated from the other cell components in vivo or in vitro from a few types of molecules.
  • the fusion mixture should fuse with any lipid membranes.
  • the constituents of the fusion mixture should be able to be present over a relatively large concentration range in order to be able to carry out the fusion rapidly and efficiently, depending on the type of cell membrane and the constituents of the fusion mixture used.
  • the fusion mixture should also be easy to produce.
  • the fusion mixture for lipid-containing membrane modification of any lipid membrane e.g. A cell membrane, a component of a cell membrane, or a cell membrane separated from the remaining cell constituents in vivo or in vitro, comprises a positively charged amphipathic molecule A and a molecule B which is an aromatic molecule.
  • the molecule types A and B are present in a ratio of 1: 0.02 to 1: 2 mol / mol.
  • the molecule type A and the molecule type B are present in the fusion mixture according to the invention in a ratio A: B of 1: 0.02 to 1: 2 mol / mol.
  • the ratio A: B is preferably from 1: 0.05 to 1: 1 mol / mol. This molar mixing ratio is surprisingly wide compared to the known mixing ratios.
  • the fusion mixture according to the invention may be in aqueous suspension.
  • the fusion takes place here in a rapid time, ie within a few minutes after contact of the fusion mixture with any lipid membrane or a component or a fragment thereof.
  • the fusion can be performed in vivo or in vitro.
  • the fusion mixture according to the invention can be supplemented with at least one additive Z such.
  • nucleic acids eg DNA, siRNA
  • nanoparticles magnetic, fluorescent, etc.
  • the proportion of the additional component Z should as a rule not exceed 46 mol% of the fusion mixture.
  • Z can assume all possible intermediate values of 1 to 46 mol% depending on the type of additive Z and the underlying fusion mixture with A and B. There may also be several different additives depending on the application in the fusion mixture according to the invention.
  • these Z1 ... Zn generally also have a total proportion of not more than 46 mol%.
  • the fusion mixture according to the invention can be used both in fusion with synthetic model membranes (vesicles) and for fusion with cellular membranes including plasma or cell organelle membranes and their components or fragments.
  • the membrane particles thus fused may advantageously continue to have fusogenic properties, so that they can be used for further fusions with other membranes. Such fusions can be repeated as many times as the fusogenic property of the respective (intermediate) product is given.
  • the fusion can be carried out in suspension as well as on the surface of adhered membranes.
  • the positively charged fusion mixture according to the invention contains the molecule types A and B in a ratio A: B of 1: 0.02 to 1: 2 mol / mol.
  • the molecule type B can take any intermediate value for the molecule type A, that is in the ratio A: B of 1: 0.02, 1: 0.03, 1: 0.04, ... 1: 1, 96, 1: 1 , 97, 1: 1, 98, 1: 1, 99, 1: 2 as well as in all other intermediate values for these indicated intermediate values, eg 1: 0.0025, 1: 0.0032, 1: 0.0039, 1: 1, 986 or 1: 1, 999.
  • Type of molecule A The criteria for the type of molecule A are that
  • the molecule has a hydrophilic region with at least one or more positive charges, so that the total charge of the hydrophilic part of the molecule is positive, and
  • the molecule also has a hydrophobic region, preferably a C10-C30 moiety with or without double bonds.
  • This molecule A is to bring the fusion mixture by electrostatic forces in the vicinity of the negatively charged (cell) membrane. Double bonds can have the beneficial effect of making the membrane of the resulting liposome elastic so that fusion of the liposome with the cell membrane is facilitated. Suitable are molecules such. B.
  • DOTAP 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • DOTIM 1-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (chloride) Salt
  • the type of molecule B of the fusion mixture according to the invention must be an aromatic molecule. This may mean that the molecule type B itself is an aromatic compound represents or contains at least one aromatic group. The molecule type B must therefore have at least one delocalized electron system. Other hydrophobic as well as hydrophilic areas are expressly possible, but not absolutely necessary. Their impact on merger efficiency must be assessed individually. Suitable are molecules such as
  • Fluorescent dyes or dye-labeled lipids e.g. B .:
  • Texas Red® 1 2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red® DHPE), or polyphenols, e.g.
  • Resveratrol e.g., curcumin, 5-hydroxyflavone, or vitamins, e.g.
  • Vitamin E Vitamin E, Vitamin A or Vitamin K or cytostatics, such as:
  • Doxorubicin, paclitaxel, or other pharmacologically active aromatic substances are examples of compounds that are useful in the treatment of cancer.
  • Doxorubicin, paclitaxel, or other pharmacologically active aromatic substances are examples of compounds that are useful in the treatment of cancer.
  • paclitaxel or other pharmacologically active aromatic substances.
  • DOTAB is chosen as molecule type A, for example DiO, DiR, BODIPY FL-DHPE, Texas Red-DHPE, a polyphenol, an aromatic vitamin or an aromatic cytostatic can be selected as molecule type B, so that e.g. Combinations, like
  • DOTAB can also be exchanged for another example of the molecule type A, such as e.g. DOTIM, DDAB or DOTMA. All of these combinations of molecule type A and B are encompassed by the present invention, provided that the molar mixing ratios between see 1: 0.02 and 1: 2. The molar mixing ratios may in particular also be between 1: 0.05 and 1: 1.
  • the constituents of the mixture according to the invention with the molecule types A and B are preferably taken together with the optional additives Z in the desired molar ratio simultaneously in an organic solvent, preferably in chloroform, methanol, ethanol, propanol, hexane, heptane or a mixture thereof. After homogenization in organic solvent, the organic solvent is removed.
  • organic solvent preferably in chloroform, methanol, ethanol, propanol, hexane, heptane or a mixture thereof.
  • the dried homogeneous mixture is taken up in an aqueous solution, preferably at a pH of around 7, and homogenized again.
  • the mixtures are durable, for example at 4 ° C for at least 1 -2 months. These steps serve to prepare the process according to the invention.
  • the fusion mixture is suitable for storage for weeks.
  • the fusion mixture advantageously forms into liposomes comprising the added types of molecules.
  • nucleic acids DNA, RNA
  • lipids, proteins, nanoparticles or pharmacological agents are then admixed.
  • lipid-containing membranes of any kind are used.
  • the molecule types A and B as cationic lipid A and aromatic molecule B can advantageously be present in any conceivable mixture according to claim 1.
  • the fusion mixture according to the invention fused with the (target) membrane.
  • the additives Z possibly bound in the lumen or otherwise bound to the fusion mixture are released to or into the cell.
  • This can equally apply to the type of molecule B, which can be at least partially released into the cell interior after the fusion with the membrane.
  • the target membrane may be a synthetic or a cellular membrane or membrane fraction. It may be a functionally as structurally complete membrane that fuses with the fusion mixture during the process.
  • Advantageously and in a surprising way By using the molecule types A and B in the ratio indicated causes all types of membranes with the fusion mixture according to the invention can fuse.
  • the fusion process thus provides according to the invention that the fusion mixture or the fusion liposomes is brought into contact with a lipid-containing membrane, for.
  • a lipid-containing membrane for.
  • mixture cell medium; v / v).
  • fluorescent molecule B By choosing a fluorescent molecule B, this can be detected in the membrane or in a cell, for. Example by means of fluorescence microscopy or flow cytometry. Aromatic compounds with conjugated double bonds fluoresce differently depending on the size of the conjugation. Highly fluorescent molecule types B as indicated above
  • Fluorescers are readily detectable by fluorescence microscopy already in the membrane.
  • a transfection is carried out simultaneously with the fusion. Fusion-bound transfections are advantageously much more efficient than transfections of the prior art, e.g. with lipofectamine.
  • Biotinylation of a target membrane is particularly advantageously carried out by selecting a biotin-containing substance as component Z in the fusion mixture.
  • This process step is particularly advantageous in that target membranes are biotinylated and prepared for further process steps.
  • This can be advantageous z.
  • magnetic particles may be attached later.
  • a membrane type is biotinylated in a cell mixture and another type of membrane in mixture is not biotinylated by this fusion mixture.
  • the method may then comprise a further step in which the biotinylated membrane is bound with magnetic particles and subsequently separated by means of magnetic force from non-biotinylated membrane.
  • This fusion-mediated biotinylation has the particularly advantageous effect that purification methods of the mixed culture can be carried out in order to separate the biotinylated, magnetized membranes from the non-biotinylated, non-magnetized membranes.
  • purification processes lead particularly advantageously to a high degree of purified membranes.
  • the (intermediate) product of the fusion mixture and the target membrane is fusogenic after the successful fusion.
  • Cell culture media with or without additives (serum) and any aqueous buffer can be used as dilution medium for the fusion mixture.
  • the fusion mixture according to the invention with the molecule types A and B and optionally Z are advantageously present in the solvent as a fusion liposome.
  • molecule type B is a fluorescent aromatic molecule
  • the use of molecule type A and B alone may combine (model) membrane staining with the process according to the invention.
  • a transfection is carried out simultaneously with the method according to the invention, provided that Z is a nucleic acid (DNA, RNA). carried out a biotinylation, provided Z are biotin-containing molecules.
  • Z is a nucleic acid (DNA, RNA).
  • a biotinylation provided Z are biotin-containing molecules.
  • This can be used for cell separation processes in which different types of membranes are present in biotinylated and non-biotinylated form.
  • a pharmacologically active substance introduced into the cell if Z or B is such a pharmacologically active substance.
  • the molecule type Z can be identical to the molecule type B. Molecule type B is first fused with the target membrane and then taken up in the cell.
  • FIG. 1 shows CHO cells 5 minutes after treatment with aroma-containing liposomes.
  • FIG. 2 DiR intensity in CHO cells 5 minutes after treatment with aroma-containing liposomes. From a ratio of molecule type A: B (here: DOTAP: DiR) of 1: 0.02 mol / mol, a linear relationship between intensity I and concentration C can be established, in which the mixture is preferably used, whereby liposomes are produced by fusion be recorded ( Figure 1 B). This process allows a controlled and effective delivery of substances to and into the CHO cells.
  • B here: DOTAP: DiR
  • FIG. 3 DOPC giant vesicles after fusion with a fusion mixture (fluorescence (top) and bright field image (bottom)).
  • FIG. 4 DOPC giant vesicles after fusion with a fusion mixture containing myocyte membrane sections.
  • FIG. 5 GFP signal distribution (A) and DiR signal distribution (B) of transfected cells 24 h after the treatment.
  • FIG. 6 Purification of primary myocytes from fibroblast / myocyte mixed culture by biotinylating the plasma membrane of fibroblasts.
  • FIG. 8 BODIPY FL intensity in CHO cells 5 minutes after the treatment: comparison of the fluorescence intensity after treatment with liposomes of composition A. (DOTAP) and B (BODIPY FL-DHPE) and A (DOTAP), B (BODIPY FL-DHPE) and C (DOPE), respectively.
  • the mixing ratios of A: B and A: B: C were varied over a wide range.
  • Figure 9 CHO cells were fused with liposomes of composition A (DOTAP) and B (DiR). 3 different molar mixing ratios (A: B) were tested:
  • FIGS. 1 and 2 Fusion in cell suspension (fusion of fusion mixtures of molecule type A: B (DOTAP: DiR) from 1: 0.005 to 1: 0.2 mol / mol with CHO cells).
  • B DOTAP: DiR
  • the first embodiment validates the claimed molar ratios of molecule types A and B in the fusion mixture.
  • DOTAP Type A molecule
  • DiR Type B molecule
  • FIG. 1 shows microscopic images (fluorescence of DiR and bright field images) in the left and in the middle column, and corresponding flow cytometric measurements in the right column for this purpose.
  • Each CHO cell was treated with the fusion mixture. Shown is the result every 5 minutes after the start of treatment, that is, bringing the fusion mixture into contact with the cells.
  • this linear relationship occurs up to a ratio of A: B of 1: 2 mol / mol (not shown).
  • FIG. 3 Fusion with Model Membranes (Fusion of the Fusion Mix of Molecule A: B (DOTAP: DiO) with DOPC Model Membranes and A: B Molar Ratio of 1: 0.1 Mol / Mol)
  • Unilamellar giant vesicles from 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholines were incubated in a 250 mM sugar solution (pH 7.4, adjusted with 4 mM imidazole / HCl) at 1, 3 V and 10 Hz
  • FIG. 3A shows the DOPC giant vesicles (arrows) after the membrane fusion has taken place.
  • the transfer of fluorescence from the small, microscopically indissoluble fusion vesicles to the large unilamellar DOPC model membranes is evidence of complete membrane fusion.
  • the fusion also takes place in a controlled and exclusive manner between the fusion vesicles and the outer membrane of the DOPC giant vesicles.
  • This experiment demonstrates a targeted uptake of the fusion mixture by fusion into the outer membrane of a target.
  • FIG. 4 Fusion with Cellular Membrane Fractions - Fusion of Molecule A: B (DOTAP: DiO) in a molar ratio of 1: 0.1 mol / mol with isolated plasma membrane of HL-1 cells and further fusion of these fused membrane fractions with DOPC giant vesicles.
  • HL1 cells myocyte cell line
  • HL1 cells were osmotically swollen in a PBS buffer at 200 mOsm. Thereafter, the cells were minced in a homogenizer. Nuclei and mitochondria could be separated from the residual membrane by centrifugation. The residual fraction contains the cellular plasma membranes with dystroglycan, ER membranes and lysosomal membranes. This fraction was taken up in a buffer solution of 250 mM sugar / imidazole / HCl.
  • a second fusion (C, D) was started between the plasma membrane-containing fusion liposomes and DOPC giant vesicles. All DOPC giant vesicles were prepared without fluorescent markers.
  • FIG. 4A shows giant vesicles after fusion with a fusion mixture of DOTAP and DiO (green channel).
  • Figure 4B shows the same giant vesicles after fusion with fusion mixture of DOTAP and DiO and antibody stained against Dystroglykan (red channel).
  • the PM fraction of the myocytes were fused with fusion mixture DOTAP (molecule type A) and DiO (molecule type B) (first fusion).
  • DOTAP molecule type A
  • DiO molecule type B
  • the plasma membrane protein dystroglycan was then transfused into the DOPC giant vesicle membrane (second fusion).
  • Figure 4 shows the DOPC giant vesicles after fusion with fusion liposomes without (A, B) and with (C, D) plasma membrane portion.
  • the green color of DiO was transferred to the giant vesicles by membrane fusion.
  • the plasma membrane protein dystroglycan was introduced into the vesicle membrane. This was shown with the red anti-dystroglycan staining.
  • fusion liposomes here DOPE / DOTAP / DiR were mixed in a ratio of 1/1 / 0.1 mol / mol from 1 mg / ml stock solutions in chloroform. After homogenization of the lipids, the organic solvent was removed under vacuum. The dried mixture was taken up in a buffer solution of 20 mM HEPES / NaOH, pH 7.4, and homogenized in an ultrasonic bath for 20 minutes. The final concentration of the fusion mixture was adjusted to 2 mg / ml.
  • fusion mixture 20 ⁇ fusion mixture were homogenized again with 2 ⁇ g eGFP plasmid for 10 minutes in an ultrasonic bath. Subsequently, the fusion mixture / plasmid complex was diluted 1: 100 v / v with PBS, added to about 100,000 CHO cells (suspension) and incubated for 20 minutes at 37 ° C. Both eGFP expression and fusion efficiency were assessed using Flow cytometer measured. Untreated CHO cells and CHO cells transfected classically via Lipofectamine 2000 (Invitrogen) were used as controls.
  • Figure 5A shows the GFP intensity distribution of the three samples. Both transfected samples showed a significantly shifted intensity profile compared to the untreated control. The difference is particularly evident in the profile distribution.
  • the transfection efficiency of the lipofectamine sample is about 60% and shows strongly varying GFP intensities. That is, there are cells with high GFP expression, while other cells express very little GFP. The analyzes of such cells are usually very difficult or not meaningful.
  • the transfection efficiency of the cells transfected by the fusion mixture method according to the invention is more than 75%.
  • the advantage over classical transfection lies in the homogeneous expression level of all cells. Namely, Fig. 5B shows that the transfection efficiency in the fusion liposome / plasmid complex-treated cells correlates with the fusion efficiency.
  • the fusion efficiency was calculated based on the DiR signal distribution and has a value of 90-95%.
  • This cell population was retained from the suspension by means of a chromatographic column in a magnetic field.
  • the pure myocyte population was not retained by the magnetic field and was collected.
  • Figure 6 shows the two cell populations. Actin staining identifies both cell types (myocytes and fibroblasts) and the myocyte-specific antibody alpha-actinin visualizes exclusively myocytes in immunostaining.
  • the ratio of the starting culture is about 50:50 and shifts by the method described to about 5% fibroblasts to 95% myocytes.
  • Doxorubicin is used today as a drug in chemotherapy. It intercalates into DNA in the nucleus and interferes with DNA synthesis. Doxorubicin has an aromatic molecular structure and has been tested directly as a type of molecule B and as a constituent of positively charged liposomes with regard to the induction of membrane fusion between the liposome and cell membranes. To demonstrate the introduction of doxorubicin into cancer cells, subsequent experiments were performed following fusion.
  • fusion liposomes DOTAP (molecule type A) and doxorubicin (molecule type B), were mixed in a ratio of 1: 0.1 mol / mol from 1 mg / ml stock solutions in chloroform. After homogenization of the lipid molecules with the aromatic doxorubicin, the organic solvent was removed under vacuum. The dried mixture was taken up in 20 mM pH 7.4 HEPES solution and homogenized in an ultrasonic bath for 20 minutes. The final concentration of the fusion mixture was adjusted to 2 mg / ml. After dilution of 1/100 v / v in DMEM medium, 500 ⁇ M of the fusion mixture was added to approximately 100,000 MDA-MB-231 adherent cancer cells and incubated at 37 ° C for 10 minutes.
  • doxorubicin was incorporated into neutral DOPC liposomes (without molecule type A) (DOPC: Dox in the ratio of 1: 0.1 mol / mol) and adhered to the same concentration as in the other sample (2 ⁇ g / ml) Given cells. Doxorubicin uptake was always observed by fluorescence microscopy. Then the results were compared.
  • FIG. 7 shows the microscopic images in the bright field (left column) and the corresponding fluorescence microscopic (green channel, right column) after a 10-minute incubation. The most effective doxorubicin uptake was detected using the fusion librolo- gens (FIG. 7C). Here, all the cells used showed an intense doxorubin fluorescence signal in the cell nucleus.
  • Mass transfer processes typically take a longer period of time to complete (hours to days).
  • Figure 7C shows the intercalation of the Dox with the DNA into the nucleus and thus, the rapid uptake and use as a pharmacologically active substance and at the same time its use as a DNA dye.
  • Figure 8 Comparison of fluorescence intensity between liposomes prepared from the molecule types A (DOTAP :) and B (BODIPY FL-DHPE). and liposomes prepared from the molecule types A (DOTAP :), B (BODIPY FL-DHPE) and C
  • the fluorescence intensities of CHO cells after treatment with A / B-type liposomes and A / B / C-type liposomes are directly compared.
  • relatively low concentrations of the molecule type B ie in the concentration range of 0.1 to 0.4 ug / ml or molar mixing ratios of 1 / 0.005 to 1 / 0.02 at A / B and from 1 / 0.005 / 1 to 1 / 0.02 / 1 at A / B / C
  • liposome uptake is via endocytosis and no difference in fluorescence intensities between the A / B type and the A / B / C type can be seen.
  • the intensities in the range up to 1 / 0.02 at A / B and up to 1 / 0.02 / 1 at A / B / C are at approximately the same, low level.
  • A: B DOTAP: BODIPY FL
  • A: B: C DOTAP: BODIPY FL: DOPE
  • FIG. 9 Fusion with adherent CHO cells (fusion of fusion mixtures of molecule type A: B (DOTAP: DiR) of 1: 0.5 to 1: 2 mol / mol)
  • B DOTAP: DiR
  • the eighth embodiment validates in comparison to the first Embodiment higher proportions of the molecule type B to the molecule type A.
  • the phase contrast recordings show that the cells remain vigorous after treatment even at high levels of the molecular species B and undergo no morphological changes. The biocompatibility is therefore very high.
  • the fluorescence images illustrate the increasing cellular dye incorporation with increasing dye content in the liposomes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Fusionsmischung zur lipidhaltigen Membranmodifikation einer beliebigen Zielmembran, einen Zellmembran, einem Bestandteil einer Zellmembran oder einer von den übrigen Zell-Bestandteilen getrennten Zellmembran in vivo oder in vitro, umfassend ein positiv geladenes amphipathisches Molekül A und ein aromatisches Molekül B, wobei die Molekülsorte A und die Molekülsorte B in einem Verhältnis A:B von 1:0,02 bis 1:2 mol/mol vorliegen.

Description

B e s c h r e i b u n g Fusionsmischung
Die Erfindung bezieht sich auf eine Fusionsmischung zur lipidhaltigen Membranmodifikation einer beliebigen Lipidmembran, einer Zellmembran, einem Bestandteil einer Zellmembran oder einer von den übrigen Zell-Bestandteilen getrennten Zellmembran in vivo oder in vitro sowie auf ein Verfahren zur lipidhaltigen Membranmodifikation durch Fusion mit dieser Mi- schung.
Stand der Technik
Für therapeutische Anwendungen gibt es einen Bedarf an Verfahren, welche pharmazeutisch wirksame Substanzen in Zielzellen einbringen.
Aus Khalil et al. (I.A. Khalil, K. Kogure, H. Akita, H. Harashima, 2006. Uptake Pathways and Subsequent Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery. PHARMACOLOGICAL
REVIEWS, Vol. 58, No. 1 , 32-45) ist bekannt, zwischen endozytotischen und nicht endozytotischen Aufnahmeverfahren für DNS zu unterscheiden. In der wissenschaftlichen Gemeinschaft wird nach diesem Review-Artikel angenommen, dass der Hauptweg der Aufnahme von DNS mittels Lipoplexen (auch kationische Lipid-DNA Komplexe genannt) auf dem endo- zytotischen Wege erfolgt. Als Endozytose wird die vesikuläre Aufnahme extrazellulärer Makromoleküle bezeichnet. Die bis Mitte der 1990er Jahre postulierte direkte Aufnahme von Makromolekülen nach der Fusion der Lipide der Lipoplexe mit der Zellmembran ist danach nicht haltbar, sondern allenfalls in sehr geringem Anteil beteiligt.
Beweis für diese Annahme liefert die Arbeit von Friend et al., bei der DNS in Vesikeln nach einer Endozytose über elektronenmikroskopische Aufnahmen gezeigt wurden (Friend DS,
Papahadjopoulos D, and Debs RJ (1996) Endocytosis and intracellular processing accom- panying transfection mediated by cationic liposomes. Biochim Biophys Acta 1278:41-50).
Dieser Aufnahmeweg wird durch Weijun und Szoka Jr. bestätigt (Weijun Li and Francis C.
Szoka Jr. 2007. Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Pharmaceutical Rese- arch, 24, 438-449.).
Kationische Lipide können für die Herstellung von kationischen Liposomen verwendet werden. Es ist bekannt, dass die Ausbildung kationischer Liposomen aus den Ausgangsbestandteilen schwierig zu kontrollieren ist, da unterschiedliche Strukturen aus den Ausgangs- Substanzen ausgebildet werden können. Kationische Lipide werden daher zur Ausbildung von Liposomen vorab regelmäßig mit neutralen Lipiden als sogenannte Helferlipide gemischt, da kationische Lipide allein die Liposomenausbildung offensichtlich nicht gewährleisten können. Als Helfer wird z. B. DOPE oder Cholesterol verwendet, wie dies aus der oben genannten Literatur Khalil et al. bekannt ist (Khalil et al. Seite 40, rechte Spalte, erster Absatz).
Das Helferlipid weist z. B. einen hydrophilen Bereich sowie einen hydrophoben Bereich (insbesondere C10-C30) mit oder ohne Doppelbindungen auf. Beide Bereiche weisen einen neutralen Charakter auf. Hierdurch werden die große Ladungsdichte und die abstoßenden Kräfte zwischen den positiv geladenen Molekülen der Molekülsorte A neutralisiert. Dieser
Effekt führt zur Stabilisierung des Systems. Der Einsatz von Helferlipiden ist somit notwendig und steigert darüber hinaus die Transfektionseffizienz des Systems. Der Anteil des Helferli- pids wird bis zu maximal 70 % wt/wt eingestellt. Geeignet sind Moleküle, wie z. B. Phos- phatidylethanolamine, Phosphatidylcholine (1 ,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphoethanolamine, 1 ,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine , 1 ,2-Dimiristoyl- sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1 ,2-Dielaidoylsn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1 ,2- Diphytanolsn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1 ,2-Dilinoleoylsn-Glycero-3- Phosphoethanolamine oder 1 ,2-Dioleoyl sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine).
Positiv geladene Fusionsmischungen mit neutralen Helferlipiden sind z.B. aus der WO 201 1/003406 A2 bekannt. Die offenbarten Fusionsmischungen basieren auf jeweils einer konkreten Zusammensetzung aus Molekülsorte A (kationisches Lipid), Molekülsorte B (Fluo- reszenzmarker) und Molekülsorte C, dem neutralen Helferlipid. Hier erfolgt eine Fusion der Liposomen mit der Zellmembran an adhärierten Zellen und deren Plasmamembran, wobei ein Verhältnis von 1 :0,1 :1 wt/wt für die Molekülsorten A:B:C vorgeschlagen wird. Aus Csiszär et al. (Csiszär A. et al. Novel Fusogenic Liposomes for Fluorescent Cell La- beling and Membrane Modification, Bioconjugate Chemistry, 2010, 21 , 537-543) sind fusogene Liposomsysteme bekannt, die aus kationischen (Molekülsorte A), neutralen (Molekülsorte C) und aromatischen Lipiden (Molekülsorte B) zusammengesetzt sind und in denen die Molekülsorten A:B:C im Verhältnis von 1 :0,1 :1 wt/wt vorliegen. Als Molekülsorte A wird DOTAP, als Molekülsorte B fluoreszierende lipophile Moleküle wie DiO, DiR, Bodipy-, Lissa- mine-Rhodamin- und FITC-markierte Lipide verwendet. Als Helferlipid C wird DOPE verwendet. Diese Mischungen werden zum Aufbau von Liposomen und im Weiteren für Fluoreszenzzellmarkierungen, Proteineinbau, Zellmembranfunktionalisierung, Wirkstoffaufnahme, DNA-Aufnahme, etc. verwendet. Die Autoren weisen ausdrücklich darauf hin, dass nur die synergistische Interaktion dieser 3 Komponenten zu effektiven fusogenen Mischungen führen. Kleusch et al. (Kleusch Ch. et al. Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization, Molecules, 201 1 , 16, 221 -250) offenbaren ebenfalls kationische Liposomsysteme aus den Molekülsorten A:B:C im Verhältnis 1/0,1/1 wt/wt, wobei zwei fluoreszierende Moleküle (Molekülsorte B) zwei aufeinanderfolgen- de Funktionen besitzen. Eine biologisch nicht relevante Fluoreszenzkomponente fördert zunächst eine schnelle Membranfusion zwischen den zellulären Plasmamembranen und den Lipiddoppelschichten der fusogenen Liposomen, welche die neutralen (Molekülsorte C) und die positiv geladenen (Molekülsorte A) Lipide umfassen. Nach Insertion in die zellulären Membranen kann eine Fluoreszenzdarstellung der Zellmembran und/oder der dort ablaufen- den Transportvorgänge durch Bestimmung der Menge einer zweiten Fluoreszenzkomponente erfolgen. Diese fusogenen Liposomsysteme weisen somit vier Komponenten auf (Molekülsorte A, Molekülsorte C und zweimal Molekülsorte B) und sind, ähnlich wie bei Csiszär et al. oder in der WO 201 1/003406 in Bezug auf 3-er Systeme, nur in einem genau definierten und fixierten Verhältnis zueinander offenbart. Nachteilig bei den aus dem Stand der Technik bekannten Fusionsmischungen sind somit die engen Konzentrationsbereiche für die Molekülsorten A, B und C sowie die synergistische Interaktion von mindestens 3 Komponenten, um eine effektive fusogene Mischung zu erzielen.
Aufgabe der Erfindung Aufgabe der Erfindung ist es, eine einfach zusammengestellte Fusionsmischung zur lipidhal- tigen Membranmodifikation einer beliebigen Lipidmembran, Zellmembran, einem Bestandteil einer Zellmembran oder einer von den übrigen Zell-Bestandteilen getrennten Zellmembran in vivo oder in vitro aus wenigen Molekülsorten bereit zu stellen. Die Fusionsmischung soll mit beliebigen Lipidmembranen fusionieren. Die Bestandteile der Fusionsmischung sollen insbe- sondere über einen relativ großen Konzentrationsbereich zueinander vorliegen können, um in Abhängigkeit von dem Typus der Zellmembran und der verwendeten Bestandteile der Fusionsmischung die Fusion schnell und effizient durchführen zu können.
Die Fusionsmischung soll ferner einfach herstellbar sein.
Weiterhin ist es eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur effizienten Membranfusion mit der Fusionsmischung bereit zu stellen.
Lösung der Aufgabe Diese Aufgaben werden gelöst mit einer Fusionsmischung nach Patentanspruch 1 und dem Verfahren gemäß dem Patentanspruch 6.s Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Beschreibung der Erfindung Die Fusionsmischung zur lipidhaltigen Membranmodifikation einer beliebigen Lipidmembran, z. B. einer Zellmembran, einem Bestandteil einer Zellmembran oder einer von den übrigen Zell-Bestandteilen getrennten Zellmembran in vivo oder in vitro, umfasst ein positiv geladenes amphipathisches Molekül A und ein Molekül B, das ein aromatisches Molekül ist. Die Molekülsorten A und B liegen dabei in einem Verhältnis von1 :0,02 bis 1 :2 mol/mol vor.. In überraschender Weise wurde entgegen dem Stand der Technik und der bisherigen Lehrmeinung erkannt, dass eine Molekülsorte C in Form eines neutralen Helferlipids nicht notwendig ist, um reproduzierbar und effizient eine Fusion der Fusionsmischung mit beliebigen Lipidmembranen zu erzielen.
Die Molekülsorte A und die Molekülsorte B liegen in der erfindungsgemäßen Fusionsmi- schung in einem Verhältnis A:B von 1 :0,02 bis 1 :2 mol/mol vor. Vorzugsweise liegt das Verhältnis A:B von 1 :0,05 bis 1 :1 mol/mol vor. Dieses molare Mischungsverhältnis ist gegenüber den bekannten Mischungsverhältnissen überraschend breit.
Vorteilhaft kann die Fusionsmischung nach der Erfindung in wässriger Suspension vorliegen.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt und anhand von experimentellen Belegen gezeigt, dass es möglich ist, in dem angegebenen Verhältnisbereich A:B reproduzierbar Membranfusionen in Abwesenheit weiterer Lipidkomponenten durchzuführen.
Es wurde in überraschender Weise erkannt, dass ein amphipathisches Molekül A und ein Aromat B im angegebenen Verhältnis hinreichende Voraussetzung für die Fusion ist.
Vorteilhaft ist bei der erfindungsgemäßen Fusionsmischung, dass sie einfacher herstellbar ist als die Mischungen nach dem Stand der Technik, da diese wenigstens drei Molekülsorten umfassen.
Besonders vorteilhaft wird mittels der Auswahl auf die beiden Molekülsorten A und B in den angegebenen Bereichen bewirkt, dass reproduzierbar Membranfusionen durchgeführt werden können, und zwar unabhängig davon welcher Stoff an oder in die Zelle mittels der Fusi- onsmischung herangeführt werden soll. Die Fusion erfolgt hierbei in rascher Zeit, d.h. in wenigen Minuten nach Kontakt der Fusionsmischung mit einer beliebigen Lipidmembran oder einem Bestandteil oder einem Fragment davon. Die Fusion kann in vivo oder in vitro durchgeführt werden.
Die Fusionsmischung nach der Erfindung kann mit mindestens einem Zusatzstoff Z ergänzt werden wie z. B.: 1 . mit synthetischen Lipidmolekülen und Lipidmischungen,
2. mit natürlichen Lipidmolekülen oder Lipidmischungen,
3. mit cytoplasmatischen Proteinen und Transmembranproteinen,
4. mit Protein-Lipid-Mischungen,
5. mit unterschiedlichen Nukleinsäuren (z.B.: DNA, siRNA), 6. mit verschiedensten Nanopartikeln (magnetisch, fluoreszierend, etc.),
7. mit pharmakologischen Wirkstoffen oder anderen chemischen oder biologischen Substanzen.
Hierbei ist zu beachten, dass der Anteil der zusätzlichen Komponente Z 46 mol% an der Fusionsmischung in der Regel nicht übersteigen soll. Selbstverständlich kann Z alle mögli- chen Zwischenwerte von 1 bis46 mol% je nach Art des Zusatzstoffes Z und der zugrundeliegenden Fusionsmischung mit A und B annehmen. Es können auch mehrere verschiedene Zusatzstoffe je nach Anwendungszweck in der Fusionsmischung nach der Erfindung vorliegen.
Wenn mehrere Zusatzstoffe Z1 ...Zn in der Fusionsmischung beigefügt sind, so weisen diese Z1 ...Zn in der Regel auch einen Gesamtanteil von maximal 46 mol% auf.
Die erfindungsgemäße Fusionsmischung kann sowohl bei Fusion mit synthetischen Modellmembranen (Vesikeln) als auch für die Fusion mit zellulären Membranen einschließlich Plasma- oder Zellorganellmembranen und deren Bestanteile oder Fragmente verwendet werden. Die so fusionierten Membranpartikel können in vorteilhafter Weise weiterhin fusogene Eigenschaften aufweisen, so dass diese für weitere Fusionen mit anderen Membranen verwendet werden können. Solche Fusionen können so oft wiederholt werden, wie die fusogene Eigenschaft des jeweiligen (Zwischen-) Produkts gegeben ist. Die Fusion kann in Suspension sowie auf der Oberfläche adhärierter Membranen durchgeführt werden.
Die positiv geladene Fusionsmischung nach der Erfindung enthält die Molekülsorten A und B in einem Verhältnis A:B von 1 :0,02 bis 1 :2 mol/mol. Die Molekülsorte B kann dabei jeden Zwischenwert zur Molekülsorte A einnehmen, das heißt im Verhältnis A:B von 1 :0,02, 1 :0,03, 1 :0,04, ...1 :1 ,96, 1 :1 ,97, 1 :1 ,98, 1 :1 ,99, 1 :2 sowie in allen weiteren Zwischenwerten zu diesen angegebenen Zwischenwerten, z.B. 1 :0,0025, 1 :0,0032, 1 :0,0039, 1 :1 ,986 oder 1 :1 , 999, vorliegen.
Molekülsorte A Die Kriterien für die Molekülsorte A sind, dass
(a) das Molekül einen hydrophilen Bereich mit mindestens einer oder mehreren positiven Ladungen aufweist, so dass die Gesamtladung des hydrophilen Teils des Moleküls positiv ist, und
(b) das Molekül zudem einen hydrophoben Bereich aufweist, vorzugsweise einen C10-C30- Anteil mit oder ohne Doppelbindungen.
Die Aufgabe dieses Moleküls A ist es, die Fusionsmischung durch elektrostatische Kräfte in die Nähe der negativ geladenen (Zell-)Membran zu bringen. Doppelbindungen können die vorteilhafte Wirkung haben, dass die Membran des entstehenden Liposoms elastisch wird, so dass die Fusion des Liposoms mit der Zellmembran erleichtert wird. Geeignet sind Mole- küle wie z. B.
1 ,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP)
N-(2,3-Dioleyloxypropyl)-N, N, N-Trimetylammonium Chlorid (DOTMA)
Dimetyl-Dioctadecyl Ammonium Bromid (DDAB)
(1 -[2-(Oleoyloxy)Ethyl]-2-Oleyl-3-(2-Hydroxyethyl)lmidazolinium Chlorid (DOTIM). Als ein erstes Beispiel wird DOTAP (1 ,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (Chlorid- Salz)) genannt.
Molekülsorte B
Die Molekülsorte B der erfindungsgemäßen Fusionsmischung muss ein aromatisches Molekül sein. Dies kann bedeuten, dass die Molekülsorte B selbst eine aromatische Verbindung darstellt oder mindestens eine aromatische Gruppe enthält. Die Molekülsorte B muss also mindestens ein delokalisiertes Elektronensystem aufweisen. Weitere hydrophobe als auch hydrophile Bereiche sind ausdrücklich möglich, aber nicht zwingend notwendig. Deren Ein- fluss auf die Fusionseffizienz ist einzeln zu beurteilen. Geeignet sind Moleküle wie
Fluoreszenzfarbstoffe oder farbstoff markierte Lipide, z. B.:
- Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO),
- 1 ,1 '-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyanine lodide (DiR),
- N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-lndacene-3-Propionyl)-1 ,2- Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (BODIPY® FL DHPE),
- 2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-lndacene-3-Dodecanoyl)-1 -Hexadecanoyl- sn-Glycero-3-Phosphocholine (ß-BODIPY® 500/510 C12-HPC),
- Texas Red® 1 ,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red® DHPE), oder Polyphenole wie z.B.
Resveratrol, Curcumin, 5-Hydroxyflavon, oder Vitamine, wie z.B.
Vitamin-E, Vitamin-A oder Vitamin-K oder Zytostatika, wie z.B.:
Doxorubicin, Paclitaxel, oder andere pharmakologisch wirksame, aromatische Substanzen.
Ferner sind alle in der DE 10 2009 032 658 offenbarten chemischen Verbindungen der Molekülsorte B geeignete Moleküle für die Molekülsorte der erfindungsgemäßen Fusionsmi- schung.
Alle Moleküle, welche die Kriterien für die Molekülsorte A erfüllen, können in beliebiger Weise mit allen Molekülen, welche die Kriterien für die Molekülsorte B erfüllen, kombiniert wer- den. Dies ist ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Fusionsmischung. Um schnell und effektiv Fusionen durchzuführen, werden die Komponenten A und B je nach Verwendungszweck und Absicht kombiniert. Eine einfache experimentelle Testung gemäß der vorliegenden Erfindung führt zu den notwendigen und/oder optimalen Bestandteilen der Fusi- onsmischung hinsichtlich der Molekülsorten A und B für eine vorgegebene beliebige Lipid- membran und für den beabsichtigten Zweck der Fusion mit der erfindungsgemäßen Fusionsmischung.
Wird als Molekülsorte A zurn Beispiel DOTAB gewählt, kann als Molekülsorte B zum Beispiel DiO, DiR, BODIPY FL-DHPE, Texas Red-DHPE, ein Polyphenol, ein aromatisches Vitamin oder ein aromatisches Zytostatikum gewählt werden, so dass sich z.B. Kombinationen, wie
DOTAB/DiO, DOTAB/DiR, DOTAB/BODIPY FL-DHPE, DOTAB/Polyphenol ergeben. DOTAB kann dabei auch ausgetauscht werden gegen ein anderes Beispiel der Molekülsorte A, wie z.B. DOTIM, DDAB oder DOTMA. Alle diese Kombinationen von Molekülsorte A und B sind von der vorliegenden Erfindung umfasst, sofern die molaren Mischungsverhältnisse zwi- sehen 1 :0,02 und 1 :2 liegen. Die molaren Mischungsverhältnisse können insbesondere auch zwischen 1 :0,05 und 1 :1 liegen.
Die Bestandteile der erfindungsgemäßen Mischung mit den Molekülsorten A und B werden zusammen mit den optionalen Zusatzstoffen Z vorzugsweise gleichzeitig in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Chloroform, Methanol, Ethanol, Propanol, Hexan, Heptan oder einer Mischung hieraus, im gewünschten Molverhältnis aufgenommen. Nach der Homogenisierung in organischem Lösungsmittel wird das organische Lösungsmittel entfernt.
Die eingetrocknete homogene Mischung wird in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert um 7, aufgenommen, und erneut homogenisiert. In dieser Form liegen die Mischungen haltbar vor, beispielsweise bei 4 °C für mindestens 1 -2 Monate. Diese Schritte dienen zur Vorbereitung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einem Puffer ist die Fusionsmischung zur Aufbewahrung über Wochen geeignet.
Die Fusionsmischung bildet sich vorteilhaft zu Liposomen aus, welche die zugefügten Molekülsorten umfasst. Es können weitere Zusatzstoffe Z wie z. B. Nukleinsäuren (DNS, RNS), Lipide, Proteine, Nanopartikeln oder pharmakologische Wirkstoffe anschließend zugemischt werden.
Als Fusionspartner mit den erfindungsgemäßen Fusionsmischungen werden lipidhaltige Membranen jeder Art verwendet. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die Molekülsorten A und B als kationisches Lipid A und aromatisches Molekül B vorteilhaft in jeder denkbaren Mischung entsprechend des Patentanspruches 1 vorliegen können.
Es wird vorteilhaft regelmäßig erfindungsgemäß bewirkt, dass die Partner A und B eine Fusionsmischung ausbilden und in hoher Effizienz mit der Zielmembran fusionieren. Hierzu ist kein neutrales Helferlipid notwendig.
Ab einem Molverhältnis A:B von 1 :0,02 mol/mol in der erfindungsgemäßen Fusionsmischung erfolgt ein kontrollierter Stofftransport von Fusionsliposomen zu den Zellmembranen. Das bedeutet, dass in der Fusionsmischung aus Molekülsorte A und Molekülsorte B dieses Min- destangebot an der Molekülsorte B vorliegen sollte.
Vorteilhaft wird eine Molekülsorte B im Verhältnis zu A gewählt, bei der ein linearer Zusammenhang zwischen der Aromatenkonzentration (bezeichnet mit C) und der Intensität (bezeichnet mit I) des Aromaten in den behandelten Zellen z. B. mit Hilfe der Durchflusszyto- metrie festgestellt werden kann. Dies tritt etwa ab einem Verhältnis von Molekülsorte A:B von etwa 1 :0,02 bis zu einem Verhältnis von A:B von 1 :2 mol/mol auf. Diese Abhängigkeit entspricht einer allgemeinen Steigungsfunktion Y=m*x+b, vorliegend also l=m*C+b mit m>0.
Es wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass eine Fusion der Fusionsmischung mit einer Membran immer dann stattfindet, solange ein Fachmann für die beiden Molekülsorten A und B ein Verhältnis wählt, bei dem abhängig von der Konzentration C von Molekülsorte B ein linearer Zusammenhang mit der Intensität I von Molekülsorte B, mit m>0 vorliegt bzw. eingestellt wird.
Die Fusionsmischung nach der Erfindung fusioniert mit der (Ziel-)Membran. Dabei oder anschließend werden die möglicherweise im Lumen oder anderweitig an die Fusionsmischung gebundenen Zusatzstoffe Z an oder in die Zelle entlassen. Dies kann in gleicher Weise auch für die Molekülsorte B gelten, die nach der Fusion mit der Membran zumindest teilweise in das Zellinnere entlassen werden kann.
Dies ist ein anderes Verfahren als die nach dem Stand der Technik bekannte Endocytose, welche nach dem Stand der Technik für den Einsatz des Transports von DNS oder anderer pharmakologischer Wirkstoffe genutzt wird. Die Zielmembran kann eine synthetische oder eine zelluläre Membran oder Membranfraktion sein. Sie kann eine funktionell wie strukturell vollständige Membran sein, die während des Verfahrens mit der Fusionsmischung fusioniert. Vorteilhaft und in überraschender Weise wird durch Einsatz der Molekülsorten A und B im angegebenen Verhältnis bewirkt, dass alle Membrantypen mit der Fusionsmischung nach der Erfindung fusionieren können.
Das Fusionsverfahren sieht somit erfindungsgemäß vor, dass die Fusionsmischung bzw. die Fusionsliposomen mit einer lipidhaltigen Membran in Kontakt gebracht wird, z. B. in einem Verhältnis von 1 :50-1 :200 (Mischung : Zellmedium; v/v). Nach der Verdünnung wird die
Mischung erneut homogenisiert und auf die Zellen gegeben. Der Kontakt muss nicht lange dauern. Ein Kontakt für wenige Minuten, z.B. 1 -10 Minuten, zwischen Membran und Fusionsmischung reicht vollkommen aus. Dies ist ein klarer Vorteil gegenüber bekannten Verfahren mit deutlich langsamer ablaufenden Molekülaufnahmen über eine Endozytose. Mit der Fusion der erfindungsgemäßen Fusionsmischung mit der Membran können besonders vorteilhaft verschiedene weitere Verfahrensschritte kombiniert werden.
Durch Wahl eines fluoreszierenden Moleküls B kann dieses in der Membran bzw. in einer Zelle nachgewiesen werden, z. B. mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytomet- rie. Aromaten mit konjugierten Doppelbindungen fluoreszieren je nach Größe der Konjugie- rung verschieden stark. Stark fluoreszierende Molekülsorten B wie die oben angegebenen
Fluoreszenzstoffe sind ohne weiteres mittels Fluoreszenzmikroskopie schon in der Membran nachweisbar.
Durch die Wahl einer Nukleinsäure als Komponente Z wird neben der Fusion gleichzeitig eine Transfektion durchgeführt. Fusionsgebundene Transfektionen sind in vorteilhafter Wei- se deutlich effizienter als Transfektionen nach Stand der Technik, z.B. mit Lipofectamine.
Besonders vorteilhaft wird durch die Wahl einer biotinhaltigen Substanz als Komponente Z in der Fusionsmischung gleichzeitig eine Biotinylierung einer Zielmembran durchgeführt. Dieser Verfahrensschritt bewirkt besonders vorteilhaft, dass Zielmembranen biotinyliert werden und für weitere Verfahrensschritte vorbereitet werden. Hieran können vorteilhaft z. B. Magnetpar- tikel im Weiteren angeheftet werden.
In einem besonders vorteilhaften Verfahren, werden in einer Zellmischung ein Membrantyp biotinyliert und ein anderer Membrantyp im Gemisch durch diese Fusionsmischung nicht biotinyliert. Das Verfahren kann dann einen weiteren Schritt umfassen, bei dem die biotiny- lierte Membran mit magnetischen Partikeln gebunden wird und im Nachgang mittels Magnet- kraft von nicht biotinylierter Membran getrennt wird. Diese fusionsvermittelte Biotinylierung bewirkt ganz besonders vorteilhaft, dass Aufreinigungsverfahren der Mischkultur durchgeführt werden können, um die biotinylierten, magnetisierten Membranen von den nicht biotiny- lierten, nicht magnetisierten Membranen zu trennen. Solche Aufreinigungsverfahren führen besonders vorteilhaft zu einem hohen Grad an aufgereinigten Membranen. In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das (Zwischen-) Produkt aus Fusionsmischung und Zielmembran nach der erfolgten Fusion fusogen.
Dadurch wird besonders vorteilhaft bewirkt, dass eine weitere Fusion mit einer weiteren lipidhaltigen Membran durchgeführt werden kann. Hierdurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die entstehenden Zellen und / oder Membranen noch einmal mit Lipidmembranen fusioniert werden können. Fusionsschritte können entsprechend wiederholt werden, solange das entsprechende (Zwischen-) Produkt fusogene Eigenschaften aufweist bzw. fusogen bleibt.
Diese verschiedenen Verfahrensschritte können durch die Wahl der Molekülsorten A und insbesondere B sowie ggf. Z miteinander kombiniert werden, sodass mehrere Verfahren gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielhaft seien die Markierungen der Membran und der DNS mit einer Wirkstoffabgabe und die Aufreinigungsverfahren und die Transfektionen genannt.
Als Verdünnungsmedium für die Fusionsmischung können Zellkulturmedien mit oder ohne Zusätze (Serum) und jegliche wässrige Puffer eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Fusionsmischung mit den Molekülsorten A und B und gegebenenfalls Z liegen im Lösungsmittel vorteilhaft als Fusionsliposom vor.
Ist Molekülsorte B ein fluoreszierendes aromatisches Molekül, so kann durch die Verwendung von Molekülsorte A und B allein, eine (Modell-)Membranfärbung mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren verbunden sein.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit je nach Art der zusätzlich beigefügten Komponente(n) Z gleichzeitig eine Transfektion durchgeführt, sofern Z eine Nukleinsäure (DNS, RNS) ist. eine Biotinylierung durchgeführt, sofern Z Biotin umfassende Moleküle sind. Diese kann für Zelltrennverfahren eingesetzt werden, bei denen verschiedene Membrantypen in biotinylierter und nicht-biotinylierter Form vorliegen. eine pharmakologisch wirksame Substanz in die Zelle eingebracht, sofern Z oder B eine solche pharmakologisch wirksame Substanz ist. In diesem Fall kann die Molekülsorte Z identisch sein mit der Molekülsorte B. Molekülsorte B wird zunächst mit der Zielmembran fusioniert und sodann in die Zelle aufgenommen.
Ausführunqsbeispiele Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.
Es zeigen: Figur 1 : CHO-Zellen 5 Minuten nach der Behandlung mit aromathaltigen Liposomen. Die Aufnahme der Liposomen wurde durch Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie beobachtet und mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Maßstab = 50 μηι. Dargestellt sind Fluoreszenzmikroskopische (linke Spalte) sowie Hellfeld-Aufnahmen (mittlere Spalte) sowie Durchflusszytometrie-Messungen (rechte Spalte) in Abhängigkeit vom eingesetzten Verhältnis der Molekülsorten A:B.
Figur 2: DiR-Intensität in CHO-Zellen 5 Minuten nach der Behandlung mit aromathaltigen Liposomen. Ab einem Verhältnis von Molekülsorte A:B (Hier: DOTAP:DiR) von 1 :0,02 mol/mol ist ein linearer Zusammenhang zwischen Intensität I und Konzentration C feststellbar, in der vorzugsweise die Mischung angewendet wird, wodurch Li- posomen durch Fusion aufgenommen werden (Figur 1 B). Dieser Prozess ermöglicht eine kontrollierte und effektive Stofflieferung zu bzw. in die CHO-Zellen.
Figur 3: DOPC-Riesenvesikel nach der Fusion mit einer Fusionsmischung (Fluoreszenz- (oben) und Hellfeldaufnahme (unten)).
Figur 4: DOPC-Riesenvesikel nach der Fusion mit einer Fusionsmischung, die Myozyten- membranabschnitte enthalten.
Figur 5: GFP-Signalverteilung (A) und DiR-Signalverteilung (B) transfizierter Zellen 24 h nach der Behandlung.
Figur 6: Aufreinigung von primären Myozyten aus Fibroblasten/Myozyten-Mischkultur durch Biotinylierung der Plasmamembran von Fibroblasten. Figur 7: MDA-MB-231 -Krebszellen nach 10 minütiger Behandlung mit freiem Doxorubicin im Medium, mit liposomalem Doxorubicin (DOPC:Dox von 1 :0,1 mol/mol) und mit in Fusionsliposomen eingebautem Doxorubicin (DOTAP:Dox von 1 :0,1 mol/mol). Aufgrund seiner aromatischen Molekularstruktur kann der Doxorubicin-Einbau und die Doxorubicin-Anreicherung in der Zelle durch Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden. Messbalken = 50 μηι.
Figur 8: BODIPY FL-Intensität in CHO-Zellen 5 Minuten nach der Behandlung: Vergleich der Fluoreszenzintensität nach Behandlung mit Liposomen der Zusammensetzung A (DOTAP) und B (BODIPY FL-DHPE) bzw. A (DOTAP), B (BODIPY FL-DHPE) und C (DOPE). .Die Mischungsverhältnisse von A:B sowie A:B:C wurden über einen großen Bereich variiert.
Figur 9: CHO-Zellen wurden mit Liposomen der Zusammensetzung A (DOTAP) und B (DiR) fusioniert. Es wurden 3 verschiedene molare Mischungsverhältnisse (A:B) getestet:
1 :1 ; 1 :1 ,5 und 1 :2 mol/mol. Phasenkontrast- und Fluoreszenzaufnahmen. Messbalken 50 μηι (gültig für alle Aufnahmen).
Erstes Ausführunqsbeispiel (Fig. 1 und 2): Fusion in Zellsuspension (Fusion von Fusionsmi- schunqen aus Molekülsorte A:B (DOTAP:DiR) von 1 :0.005 bis 1 :0,2 mol/mol mit CHO Zellen).
Das erste Ausführungsbeispiel validiert die beanspruchten Molverhältnisse von Molekülsorten A und B in der Fusionsmischung.
Bei den Durchflusszytometrie-Messungen sind die in der unteren Abbildung angegebenen Beschriftungen der X- und Y-Achse auch für die darüber angeordneten Messergebnisse anzuwenden.
Die Komponenten der Fusionsmischung, hier DOTAP (Molekülsorte A) und DiR (Molekülsorte B), wurden in einem Verhältnis von 1 :0,005 bis 1 :2 mol/mol aus 1 mg/ml Stammlösungen in Chloroform gemischt, um den fusionsinduzierenden Konzentrationsbereich von DiR zu bestimmen.
Als ein Ergebnis kann festgehalten werden, dass ab einem Molverhältnis von Molekülsorte A:B von 1 :2 oder größer (das heißt z. B. Molekülsorte A:B von 1 :3 mol/mol) eine Homogenisierung der beiden Substanzen in der Fusionsmischung schwierig ist, da die Substanzen verklumpen. Im Kontext der Erfindung sollten also derartige Fusionsmischungen mit einem zu hohen Anteil an Molekülsorte B in der Fusionsmischung vermieden werden.
Nach der Homogenisierung des Lipidmoleküls A mit dem Aromaten B wurde das organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Die eingetrocknete Mischung wurde in 20 mM HEPES- Lösung mit pH 7,4 aufgenommen, und im Ultraschallbad 20 Minuten homogenisiert.
Die Endkonzentration der Fusionsmischung in der Suspension wurde auf 2 mg/ml eingestellt. Nach einer Verdünnung von 1/100 v/v in DMEM-Medium wurden 500 μΙ der Liposomensus- pension zu etwa 100.000 adhärenten CHO-Zellen gegeben und 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Figur 1 zeigt mikroskopische Aufnahmen (Fluoreszenz von DiR und Hellfeldaufnahmen) in der linken und in der mittleren Spalte sowie hierzu entsprechende durchflusszytometrische Messungen in der rechten Spalte. Mit der Fusionsmischung behandelt wurden jeweils CHO- Zellen. Gezeigt ist das Ergebnis nach jeweils 5 Minuten nach Behandlungsbeginn, das heißt dem in Kontakt bringen der Fusionsmischung mit den Zellen.
Bei einem Verhältnis von Molekülsorte A:B (DOTAP:DiR) von 1 : 0,005 entspricht die Signalverteilung einem punktuellen Muster, siehe Figur 1 (Mikroskopie und Durchflusszytometrie). Dies weist auf einen endozytotischen Aufnahmeprozess der Molekülsorte B hin.
Ab einem Molverhältnis A:B (DOTAP:DiR) von 1 :0,02 mol/mol erfolgt hingegen ein kontrol- lierter Stofftransport von Fusionsliposomen zu den Zellmembranen. Das bedeutet, dass in der Fusionsmischung aus Molekülsorte A und Molekülsorte B dieses Mindestangebot an der Molekülsorte B vorliegen sollte.
Es wird ein linearer Zusammenhang zwischen der Aromatenkonzentration CDir und der Intensität des Aromaten lDir in den behandelten Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie festge- stellt und zwar etwa ab einem Verhältnis von Molekülsorte A:B von etwa 1 :0,02 bis zu einem Verhältnis von A:B von 1 :0,2 (Figur 2).
Tatsächlich tritt dieser lineare Zusammenhang bis zu einem Verhältnis von A:B von 1 :2 mol/mol auf (nicht gezeigt). Diese Abhängigkeit entspricht einer allgemeinen Steigungsfunktion Y=m*x+b, vorliegend also mit m>0. Es wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass eine Fusion der Fusionsmischung mit der Membran immer dann stattfindet, solange ein Fachmann für die beiden Molekülsorten A und B ein Verhältnis wählt, bei dem abhängig von der Konzentration C von Molekülsorte B ein linearer Zusammenhang mit der Intensität I von Molekülsorte B, mit m>0 vorliegt bzw. eingestellt wird. Unterhalb einem Verhältnis der Molekülsorten A:B von 1 :0,02, werden die Liposomen endo- zytotisch aufgenommen (siehe Reihe A von Figur 1 ), und die Ergebnisse streuen zusammenhanglos um einen Intensitätswert. Dies lässt darauf schließen, dass die positiv geladenen Liposomen durch eine Zugabe von aromatischen Molekülen B über ein Verhältnis von Molekülsorte A:B von 1 :0,02 mol/mol hinaus durch Membranfusion in eine andere Membran gelangen. Zweites Ausführunqsbeispiel (Fig. 3): Fusion mit Modellmembranen (Fusion der Fusionsmi- schunq aus Molekülsorten A:B (DOTAP:DiO) mit DOPC Modellmembranen und Molverhältnis A:B von 1 :0,1 mol/mol)
Unilamellare Riesenvesikel aus 1 ,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine wurden in einer 250 mM Zuckerlösung (pH 7,4, eingestellt mit 4 mM Imidazol/HCI) bei 1 ,3 V und 10 Hz
Wechselstrom geschwollen. 100 μΙ Vesikellösung wurden in eine Messkammer überführt, die zuvor mit Avidin beschichtet und mit 1 ,8 ml 250 mM Glukoselösung befüllt wurde. Zusätzlich wurden 100 μΙ Fusionsvesikel (DOTAP:DiO=1 :0,1 mol/mol) zugeführt. Die Präparation der Fusionsvesikel erfolgt wie in Beispiel 1 . Der Probenhalter wurde mit einem Deckglas bedeckt und die Temperatur auf 37°C erhöht.
Figur 3 A zeigt die DOPC-Riesenvesikel (Pfeile) nach der erfolgten Membranfusion. Die Übertragung der Fluoreszenz von den kleinen, mikroskopisch nicht auflösbaren Fusionsvesi- keln auf die großen unilamellaren DOPC-Modellmembranen ist der Beweis für eine vollständige Membranfusion. Die Fusion findet zudem kontrolliert und ausschließlich zwischen den Fusionsvesikeln und der äußeren Membran der DOPC-Riesenvesikel statt. Die inneren
Vesikel bleiben wie in Figur 3 B (Hellfeld) im Vergleich zu Figur 3 A zu erkennen, hingegen ungefärbt (Pfeil).
Dieses Experiment beweist eine gezielte Aufnahme der Fusionsmischung mittels Fusion in die äußere Membran eines Targets.
Drittes Ausführunqsbeispiel (Fig. 4): Fusion mit zellulären Membranfraqmenten -Fusion von Molekülsorten A:B (DOTAP:DiO) in einem Molverhältnis von 1 :0,1 mol/mol mit isolierter Plasmamembran von HL-1 Zellen und weitere Fusion dieser fusoqenen Membranfraktionen mit DOPC-Riesenvesikel. HL1 -Zellen (Myozyten-Zellinie) wurden in einem PBS-Puffer mit 200 mOsm osmotisch geschwollen. Danach wurden die Zellen in einem Homogenisator zerkleinert. Zellkerne und die Mitochondrien konnten von der Restmembran durch Zentrifugation getrennt werden. Die Restfraktion beinhaltet die zellulären Plasmamembranen mit Dystroglykan, ER-Membranen und Lysosomale Membranen. Diese Fraktion wurde in einer Pufferlösung aus 250 mM Zu- cker/lmidazol/HCI aufgenommen.
Fusioniert wurde sie mit Fusionsliposomen aus DOTAP/DiO (1 :0,1 mol/mol) in einem Volumenverhältnis von 1 /10, um plasmamembranhaltige Fusionsliposomen zu erzeugen.
Eine zweite Fusion (C, D) wurde zwischen den plasmamembranhaltigen Fusionsliposomen und DOPC-Riesenvesikeln gestartet. Alle DOPC-Riesenvesikel wurden ohne Fluoreszenzmarker hergestellt.
Figur 4A zeigt Riesenvesikel nach Fusion mit Fusionsmischung aus DOTAP und DiO (grüner Kanal).
Figur 4B zeigt dieselben Riesenvesikel nach Fusion mit Fusionsmischung aus DOTAP und DiO und Antikörper gegen Dystroglykan gefärbt (roter Kanal).
Im Fall einer erfolgreichen Fusion wurde die grüne Farbe von DiO auf die DOPC- Riesenvesikel übertragen (grüner Kanal, Figur 4A). Der rote Kanal (4B) zeigte kein Signal, das heißt Abwesenheit von Dystroglykan (Negativkontrolle).
Die PM-Fraktion der Myozyten wurden mit Fusionsmischung DOTAP (Molekülsorte A) und DiO (Molekülsorte B) fusioniert (erste Fusion). Das Plasmamembranprotein Dystroglykan wurde dann in die DOPC-Riesenvesikelmembran durch Fusion übertragen (zweite Fusion).
Dies konnte durch die Immunfärbung mit dem Anti- Dystroglykan -Atto633-Antikörper gezeigt werden (roter Kanal).
Figur 4 zeigt die DOPC-Riesenvesikel nach der Fusion mit Fusionsliposomen ohne (A, B) und mit (C, D) Plasmamembrananteil. Die grüne Farbe von DiO wurde durch Membranfusion auf die Riesenvesikel übertragen. Ebenso durch Fusion wurde das Plasmamembranprotein Dystroglykan in die Vesikelmembran eingebracht. Dies wurde mit der roten Anti- Dystrogly- kan-Färbung gezeigt.
Viertes Ausführunqsbeispiel (Fig. 5): Transfektion - Fusion von DOTAP/DiR/DOPE (1 :0,1 :1 mol/mol)/Plasmid-Komplex mit CHO Zellen in Suspension
Die Komponenten von Fusionsliposomen, hier DOPE/DOTAP/DiR wurden in einem Verhältnis von 1 /1/0,1 mol/mol aus 1 mg/ml Stammlösungen in Chloroform gemischt. Nach der Homogenisierung der Lipide wurde das organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Die eingetrocknete Mischung wurde in einer Pufferlösung von 20 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, aufgenommen, und im Ultraschallbad 20 Minuten homogenisiert. Die Endkonzentration der Fusionsmischung wurde auf 2 mg/ml eingestellt.
20 μΙ Fusionsmischung wurden mit 2 μg eGFP Plasmid für 10 Minuten im Ultraschallbad erneut homogenisiert. Im Anschluss wurde der Fusionsmischung/Plasmid-Komplex 1 :100 v/v mit PBS verdünnt, zu ca. 100000 CHO-Zellen (Suspension) gegeben und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Sowohl die eGFP-Expression als auch die Fusionseffizienz wurde mittels Durchflusszytometer gemessen. Als Kontrolle wurden nicht behandelte CHO-Zellen und klassisch über Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfizierte CHO-Zellen verwendet.
Figur 5A zeigt die GFP-Intensitätsverteilung der drei Proben. Beide transfizierten Proben zeigten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ein deutlich verschobenes Intensitätsprofil. Der Unterschied zeigt sich besonders bei der Profilverteilung. Die Transfektionseffizienz der Lipofectamineprobe liegt bei ca. 60 % und zeigt stark variierende GFP Intensitäten. Das heißt, es gibt Zellen mit einer hohen GFP-Expression, während andere Zellen nur sehr wenig GFP exprimieren. Die Analysen solcher Zellen sind meistens sehr schwierig oder nicht aussagekräftig.
Die Transfektionseffizienz der durch das erfindungsgemäße Verfahren mit Fusionsmischung transfizierten Zellen liegt hingegen bei über 75%. Der Vorteil gegenüber einer klassischen Transfektion liegt im homogenen Expressionslevel aller Zellen. Figur 5B zeigt nämlich, dass die Transfektionseffizienz bei der mit Fusionsliposomen/Plasmid-Komplex behandelten Zellen mit der Fusionseffizienz korreliert. Die Fusionseffizienz wurde aufgrund der DiR- Signalverteilung berechnet und weist einen Wert von 90-95% auf.
Fünftes Ausführunqsbeispiel (Fig. 6): Plasmamembran-Biotinylierunq durch Fusion von DOTAP:DiO:CapBiotin-DHPE (1 :0,05:0,1 mol/mol) mit primären kardialen Fibroblasten in Suspension. Die Komponenten der Fusionsmischung aus A:B:Z (DOTAP:DiO:capBiotin-DHPE als Komponente Z) wurden in einem Verhältnis von A:B:Z von 1 :0, 05:0,1 mol/mol aus 1 mg/ml Stammlösungen in Chloroform gemischt und homogenisiert. Weiterhin wurden die Fusionsli- posomen entsprechend Beispiel 1 beschrieben präpariert.
10 μΙ der biotinylierten Fusionsliposomen wurden 1 :100 in DME- Medium verdünnt und die kardialen Fibroblasten (1 -6 Millionen) wurden anschließend in der Fusionsmischung resuspendiert. Nach der erfolgten Inkubation für 1 -3 Minuten, - diese Zeit war ausreichend für die Fusion der Fibroblasten, während die Myozytenpopulation noch nicht fusioniert war -, wurden die Zellen 2 mal mit PBS gewaschen, pelletiert und in 100 μΙ magnetischer Anti-Biotin- Beads Lösung resuspendiert und 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Alle fusionierten Fibroblasten wurden über die Biotin-Anti-Biotin-Bindung mit magnetischen Beads markiert.
Diese Zellpopulation wurde mit Hilfe einer in einem Magnetfeld steckenden Chromatographiesäule aus der Suspension zurückgehalten. Die reine Myozytenpopulation wurde nicht über das Magnetfeld zurückgehalten und wurde aufgefangen. Figur 6 zeigt die zwei Zellpopulationen. Die Aktinfärbung markiert beide Zelltypen (Myozyten und Fibroblasten) und der myozytenspezifische Antikörper alpha-Actinin visualisiert in der Immunfärbung ausschließlich Myozyten. Das Verhältnis der Ausgangskultur liegt bei ca. 50:50 und verschiebt sich durch die beschriebene Methode auf ca. 5% Fibroblasten zu 95% Myozyten.
Es gibt derzeit kein Verfahren um ähnlich reine Myozytenkulturen zu erhalten. Das Verfahren der Fusion gesteuerten Biotinylierung ist mit anderen Zelltypen anwendbar.
Sechstes Ausführunqsbeispiel (Fig. 7): Doxorubicin-Abqabe von Fusionsliposomen in Krebs- zellen
Doxorubicin wird heute als Arzneistoff in der Chemotherapie eingesetzt. Es interkaliert in die DNA im Zellkern und stört die DNA-Synthese. Doxorubicin besitzt eine aromatische Molekularstruktur und wurde hier direkt als Molekülsorte B und als Bestandteil positiv geladener Liposomen hinsichtlich der Induktion einer Membranfusion zwischen Liposomen- und Zell- membran getestet. Um die Einschleusung von Doxorubicin in Krebszellen zu demonstrieren, wurden nach voran gegangener Fusion nachfolgende Experimente durchgeführt.
Die Komponenten von Fusionsliposomen, DOTAP (Molekülsorte A) und Doxorubicin (Molekülsorte B), wurden in einem Verhältnis von 1 :0,1 mol/mol aus 1 mg/ml Stammlösungen in Chloroform gemischt. Nach der Homogenisierung der Lipidmoleküle mit dem aromatischen Doxorubicin wurde das organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Die eingetrocknete Mischung wurde in 20 mM HEPES- Lösung mit pH 7,4 aufgenommen, und im Ultraschallbad 20 Minuten homogenisiert. Die Endkonzentration der Fusionsmischung wurde auf 2 mg/ml eingestellt. Nach einer Verdünnung von 1 /100 v/v in DMEM-Medium wurden 500 μΙ der Fusionsmischung zu etwa 100.000 adhärenten MDA-MB-231 -Krebszellen gegeben und 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Als Kontrolle wurde eine weitere Zellprobe mit der gleichen Menge Doxorubicin (2 μg) im Kulturmedium ohne Fusionsmischung inkubiert. Die herkömmliche Dosis beträgt 1 mg/ml.
Weiterhin wurde Doxorubicin in neutralen DOPC-Liposomen (ohne Molekülsorte A) einge- baut (DOPC:Dox im Verhältnis von 1 :0,1 mol/mol) und in der gleichen Konzentration wie in der anderen Probe (2 μg/ml) zu adhärenten Zellen gegeben. Die Doxorubicin- Aufnahme wurde in allen Fällen durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Anschließend wurden die Ergebnisse miteinander verglichen. Figur 7 zeigt die mikroskopischen Aufnahmen im Hellfeld (linke Spalte) und die korrespondierenden Fluoreszenzmikroskopischen (grüner Kanal, rechte Spalte) nach einer 10 minüti- gen Inkubation. Die effektivste Doxorubicin- Aufnahme wurde bei Verwendung der Fusionsli- posomen festgestellt (Figur 7C). Hier haben alle eingesetzten Zellen ein intensives Doxoru- bicin- Fluoreszenzsignal im Zellkern gezeigt.
Eine derart schnelle Einschleusung von Doxorubicin in den Zellkern ist bisher nicht bekannt. Die am häufigsten angewendeten Doxorubicin- Inkubationszeiten liegen zwischen 24-72 h.
Die Kontrolle mit freiem Doxorubicin im Medium (Fig. 7A) zeigt ein geringes Fluoreszenzsignal und die DOPC/Dox-Mischung zeigt kein Signal (Fig. 7B). Endozytose vermittelte
Stofftransportprozesse benötigen in der Regel eine längere Zeitperiode, um vollständig abzulaufen (Stunden bis Tage).
Figur 7C zeigt die Interkalierung des Dox mit der DNS in den Zellkern und damit, die schnelle Aufnahme und Verwendung als pharmakologisch wirksame Substanz und gleichzeitig die Verwendung als DNS-Farbstoff. Mit dieser Methode ist es möglich, Krebszellen innerhalb weniger Minuten mit einem Zytostatikum zu behandeln.
Siebtes Ausführunqsbeispiel (Fig. 8): Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen Liposomen, hergestellt aus den Molekülsorten A (DOTAP:) und B (BODIPY FL-DHPE). und Lipo- somen, hergestellt aus den Molekülsorten A (DOTAP:), B (BODIPY FL-DHPE) und C
(DOPE) mit jeweils verschiedenen molaren Anteilen der Molekülsorte B.
Bei diesem Ausführungsbeispiel werden die Fluoreszenzintensitäten von CHO-Zellen nach Behandlung mit Liposomen des A/B-Typs und mit Liposomen des A/B/C-Typs direkt miteinander verglichen. Bei Verwendung von relativ geringen Konzentrationen der Molekülsorte B, d.h. im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 0,4 μg/ml bzw. molaren Mischungsverhältnissen von 1/0,005 bis 1 /0,02 bei A/B und von 1/0,005/1 bis 1 /0,02/1 bei A/B/C, erfolgt die Aufnahme der Liposomen über Endozytose und es ist kein Unterschied in den Fluoreszenzintensitäten zwischen dem A/B-Typ und dem A/B/C-Typ erkennbar. Ferner liegen die Intensitäten im Bereich bis 1/0,02 bei A/B und bis 1/0,02/1 bei A/B/C in etwa auf dem gleichen, niedrigen Niveau. Es besteht somit fast keine Linearität zwischen der eingesetzten Aromatenkonzent- ration (Molekülsorte B) und der gemessenen Intensität des Aromaten (Figur 8). Ab einem molaren Mischungsverhältnis von A:B (DOTAP:BODIPY FL) von 1 :0,02 mol/mol sowie von A:B:C (DOTAP:BODIPY FL:DOPE) von 1 :0,02:1 mol/mol wird in beiden Fällen eine Membranfusion induziert. Hierbei erfolgt allerdings die Fusion und damit die Übertragung von Molekülen deutlich effizienter mit Liposomen, die nur aus den Molekülsorten A und B zusammengesetzt sind, im Vergleich zu den Liposomen, die aus 3 Komponenten (A/B/C) bestehen. In der Figur 8 ist dies für molare Mischungsverhältnisse von 1 /0,035 bzw. 1/0,035/1 bis 1/0,5 bzw. 1 /0,5/1 gezeigt. Die deutliche Überlegenheit der A/B-Liposomen gegenüber den A/B/C-Liposomen ist klar ersichtlich, obwohl in beiden Fällen die eingesetzten Mengen der Molekülsorte B identisch sind, wie dies an den Konzentrationen von B, ausgedrückt in μg/ml, in der Figur 8 abzulesen ist. Ab einem molaren Mischungsverhältnis A:B von 1 :0,02 mol/mol erfolgt eine Fusion und ein kontrollierter Stofftransport von Fusionsliposomen zu den Zellmembranen, der mit einem linearen Zusammenhang zwischen der Aromatenkonzentrati- on und der Intensität des Aromaten in den behandelten Zellen einhergeht. Dies ist in der Figur 8 bis zu einem molaren Mischungsverhältnis A:B von 1 :0,5 dargestellt, wobei dieses Mischungsverhältnis A:B aber bis zu 1 :2 erweitert werden kann, wie dies z.B. Figur 9 in Zusammenhang mit dem achten Ausführungsbeispiel zeigt.
Im Gegensatz zu den vorherigen Ausführungsbeispielen 1 bis 7, bei denen als Molekülsorte B DiO, DiR oder Doxorubicin eingesetzt wurde, wurde im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine weitere Molekülsorte B (BODIPY FL-DHPE) erfolgreich getestet.
Achtes Ausführungsbeispiel (Fig. 9): Fusion mit adhärenten CHO-Zellen (Fusion von Fusionsmischungen aus Molekülsorte A:B (DOTAP:DiR) von 1 :0,5 bis 1 :2 mol/mol) Das achte Ausführungsbeispiel validiert im Vergleich zum ersten Ausführungsbeispiel höhere Anteile der Molekülsorte B zur Molekülsorte A. Die Phasenkontrastaufnahmen zeigen, dass die Zellen nach der Behandlung auch bei hohen Anteilen der Molekülsorte B vital bleiben und keine morphologischen Veränderungen durchlaufen. Die Biokompatibilität ist somit sehr hoch. Die Fluoreszenzaufnahmen veranschaulichen den steigenden zellulären Farbstoffein- bau mit steigendem Farbstoffanteil in den Liposomen.

Claims

P ate n t a n s p r ü c h e
Fusionsmischung zur lipidhaltigen Membranmodifikation einer beliebigen Lipidmemb- ran, einer Zellmembran, einem Bestandteil einer Zellmembran oder einer von den übrigen Zellbestandteilen getrennten Zellmembran in vivo oder in vitro, umfassend ein positiv geladenes amphipathisches Molekül A und ein Molekül B, wobei die Molekülsorte B ein aromatisches Molekül ist und die Molekülsorte A und die Molekülsorte B in einem Verhältnis A:B von 1 :0,02 bis 1 :2 mol/mol vorliegen.
Fusionsmischung nach vorherigem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fusionsmischung in wässriger Lösung vorliegt.
Fusionsmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens einen Zusatzstoff Z umfasst.
Fusionsmischung nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet durch synthetische Lipidmoleküle, natürliche Lipidmoleküle, cytoplasmatische Proteine, Transmembranproteine, Protein-Lipid-Mischungen, Nukleinsäuren, Nanopartikeln (magnetisch, fluoreszierende etc.), oder pharmakologischen Wirkstoffen oder Mischungen hieraus als Zusatzstoff Z.
Fusionsmischung nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet durch einen Anteil des Zusatzstoffes Z von maximal 46 mol%.
Verfahren zur lipidhaltigen Membranmodifikation einer beliebigen Lipidmembran, einer Zellmembran, einem Bestandteil einer Zellmembran oder einer von den übrigen Zell- Bestandteilen getrennten Zellmembran in vivo oder in vitro, gekennzeichnet durch in Kontakt bringen der lipidhaltigen Membran mit der Fusionsmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, wobei die Fusionsmischung mit der Membran fusioniert.
Verfahren nach vorherigem Anspruch, bei der durch Wahl einer Nukleinsäure als Komponente Z gleichzeitig eine Transfektion durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6 bis 7, bei der durch Wahl einer biotinhaltigen Substanz als Komponente Z in der Fusionsmischung gleichzeitig eine Biotinylierung einer Zielmembran durchgeführt wird.
9. Verfahren nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet dadurch, dass eine weitere Membran durch diese Fusionsmischung nicht biotinyliert wird.
10. Verfahren nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet durch einen Schritt bei dem biotinylierte Membran mit magnetischen Partikeln verbunden wird und im Nachgang mittels Magnetkraft von nicht biotinylierter Membran getrennt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt aus Fusionsmischung und Zielmembran nach der erfolgten Fusion fusogen ist und eine weitere Fusion mit einerweiteren lipidhaltigen Membran durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 6 bis 11 , gekennzeichnet durch Wahl einer pharmakologisch wirksamen Substanz als Komponente Z, die nach der Fusion in die Membran in die Zelle aufgenommen wird.
13. Verfahren nach vorherigem Anspruch, gekennzeichnet durch Wahl einer Komponente Z, die neben der pharmakologischen Wirkung einen aromatischen Bestandteil aufweist.
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