DE102011114951A1

DE102011114951A1 - Molekülmischung, umfassend eine amphipathische Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich elne positive Gesamtladung aufweist und eine amphipathische Molekülsorte B sowie ein Polyphenol C, Verfahren zur Herstellung der Molekülmischung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102011114951A1
Application number: DE102011114951A
Authority: DE
Inventors: Dr. Csiszár Agnes; Christian Kleusch; Dr. Hoffmann Bernd; Prof. Dr. Merkel Rudolf
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2011-10-06
Publication date: 2013-04-11
Also published as: JP6322733B2; US20150037398A1; JP2014528956A; CN103957889B; US9610254B2; CN103957889A; EP2763657A1; JP2017095495A; EP2763657B1; WO2013050017A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Molekülmischung, umfassend eine amphipathische Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung aufweist und eine amphipathische Molekülsorte B sowie ein Polyphenol C, das Verfahren zur Herstellung der Molekülmischung und deren Verwendung. Dabei liegen die Molekülsorten A und B in einem molekularen Verhältnis von A:B von 1(±0,2):1(±0,2) mol/mol vor. Ein Verfahren zur Herstellung der Mischung und die Verwendung sind offenbart.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Molekülmischung, umfassend eine amphipathische Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung aufweist und eine amphipathische Molekülsorte B sowie ein Polyphenol C, das Verfahren zur Herstellung der Molekülmischung und deren Verwendung.
Stand der Technik
Polyphenole sind sekundäre Pflanzenstoffe, die in Pflanzensamen, in Blättern und in Früchten vorkommen. Einige dieser Stoffe wirken auf Krebszellen hemmend (Mentha, R. G., Murillo G., Naithani R. and Peng X., Pharm Res (2010) 24: 950–961) oder schützen vor unerwünschten Oxidationsprozessen (Queen B. L., Tollefsbold T. O., Curr. Aging Sci. (2010). 3: 34–42). Daher zählen sie zu den wichtigen Bestandteilen menschlicher Ernährung. Auf der anderen Seite sind sie auch wichtige Bestandteile in der Chemotherapie, da sie bei extrem hohen Konzentrationen eine toxische Wirkung aufweisen. Aufgrund der hohen therapeutischen Relevanz der Polyphenole ist deren kontrollierte und effektive Verabreichung an Lebewesen von großem Interesse.
Die Verabreichung solcher hydrophober Wirkstoffe in wässrigen Lösungen hat mehrere Nachteile. Zum einen wird eine sehr hohe Konzentration benötigt, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Der größte Teil des Wirkstoffes liegt für die Zellen nicht erreichbar vor und daher bleiben ca. 99% der Polyphenole ohne zelluläre Aufnahme. Zum Anderen verlieren sie durch unerwünschte Oxidation in der wässrigen Umgebung ihre Wirkung.
Liposomen und Polymerkapseln erhöhen zwar die Bioverfügbarkeit der Polyphenole, da diese eher den physiko-chemischen Charakter und die Hydrophylie im Vergleich zur wässrigen Verabreichung aufweisen (Nair H. B. et al., Biochem. Pharmacology (2010). 80: 1833–1843; Kristl J. et al., Eu. J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2009). 73: 253–259; Narayanan N. K., Nargi D., Randolph C., and Narayanan B. A., (2009). Int. J. Cancer. 125: 1–8). Obwohl diese Kapseln somit Vorteile haben, ist nachteilig eine kontrollierte Abgabe und schnelle Aufnahme des Polyphenols durch die Zielzellen nicht gewährleistet. Auch können diese Liposomen das Polyphenol nur zum Teil gegen unerwünschte Oxidationsprozesse schützen.
Aufgabe und Lösung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Molekülmischung bereit zu stellen, in der das Polyphenol stabilisiert und vor Oxidationsprozessen geschützt vorliegt. Das Polyphenol oder eine Mischung an Polyphenolen soll derartig vorliegen, dass es schnell und mit hoher Effizienz auch in überdurchschnittlich hohen Menge kontrolliert, das heißt in der gewünschten Menge in lebende Zellen eingebracht werden kann und dadurch entweder eine gezielt präventive oder aber eine gezielt toxische Wirkung auf die Zelle zu erzielen. Ferner ist es die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Mischung und deren Verwendung anzugeben.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung wird durch die erfindungsgemäße Mischung nach dem Hauptanspruch, das Verfahren zur Herstellung der Mischung und die Verwendung der Mischung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweils darauf rückbezogenen Ansprüchen und insbesondere aus dem Patentanspruch 6, der die Molekülmischung als Liposom beansprucht.
Die erfindungsgemäße Molekülmischung weist mindestens zwei Molekülsorten A und B sowie das Polyphenol C auf.
Die beiden Molekülsorten A und B liegen in einem molekularen Verhältnis von A:B von etwa 1:1 vor. Geringfügige Abweichungen von dem bevorzugten Verhältnis von 1:1 mol/mol sind zuzulassen, das heißt A:B von 1(±0,2):1(±0,2) mol/mol.
Das Molverhältnis der Molekülsorten A, B und des Polyphenols C soll vorteilhaft etwa 1(±0,2):1(±0,2):0,1–25 mol/mol, besonders vorteilhaft 1(±0,2):1(±0,2):0,1–10 mol/mol und ganz besonders vorteilhaft 1(±0,2):1(±0,2):0,5–5 mol/mol betragen. Für den letztgenannten Fall ist in vitro der Nachweis des Einbaus des Polyphenols C in die Zielzelle über ein Liposom bereits erfolgt.
Geringfügige Abweichungen von dem Verhältnis hiervon sind wie erwähnt erlaubt, soweit die sich abstoßenden Ladungen der Molekülsorte A durch die neutralen Hilfsmoleküle B etwa ausgeglichen werden. Das Verhältnis aus A:B:C wird für das Polyphenol C ab etwa 1:1:5 mol/mol in vitro hin zu toxischen Konzentrationen verschoben.
Es versteht sich, dass die entsprechenden Zwischenwerte für die jeweilige Molekülsorte A und B zuzulassen sind, das heißt z. B. jeweils 0,8, 0,9, 1,0, 1,1 und 1,2 für die Molekülsorte A und die Molekülsorte B und wiederum deren Zwischenwerte. Das Gleiche gilt für das Polyphenol C. das heißt es sollen alle Zahlenwerte von 0,01, 0,02, 0,03, 0,04...24,98, 24,99 und 25,00 in freier Kombination mit den genannten Zahlenwerten in der Mischung mit den Molekülsorten A und B zuzulassen sein, sofern nur gewährleistet ist, dass eine schnelle Inkorporation des Polyphenols C in die Zielzelle aus einer Mischung heraus und insbesondere aus dem Liposom in die Zelle gewährleistet ist.
Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin erkannt, dass Polyphenole mittels positiv geladener Liposome, die aus den erfindungsgemäßen Mischungen heraus hergestellt werden, viel besser in Zielzellen und in deren Membran eingeschlossen und inkorporiert werden können, als wenn man von neutralen Liposomen ausgeht, wie dies im angezeigten Stand der Technik nach Kristl et al. getan wird. Dort ist bedingt durch das Herstellungsverfahren nur eine geringe Beladung des Liposoms mit Resveratrol weitgehend auf der Oberfläche des fertigen Liposoms erfolgt, da das Polyphenol dort erst nach der Herstellung des Liposoms in wässriger Phase hinzugegeben wird. In dem erfindungsgemäßen Fall ist das Polyphenol hingegen bereits bei der Herstellung des Liposoms aus der getrockneten Mischung zugegen. Das Polyphenol stellt daher einen essentiellen Bestandteil in der Liposommembran dar und wird in hohem Maße in diese eingebaut. Dadurch erfolgt vorteilhaft eine kontrollierte, gezielte, vollständige Beladung des Liposoms mit dem Polyphenol C. Darüber hinaus wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass das Polyphenol in der Liposommembran dann selbst Fusion auslösend mit der Membran der Zelle ist. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass das Polyphenol mit einer hohen Effizienz schnell in die Zielzellen überfuhrt wird.
Im Übrigen. wurde festgestellt, dass das Polyphenol in der Membran des sich bildenden Liposoms sehr von vorläufigen Oxidationsprozessen geschützt vorliegt.
Für das Herstellungsverfahren der Mischung wurde erkannt, dass Polyphenole generell gut löslich in organischen Lösungsmitteln, wie Ethanol oder Chloroform sind und diese deshalb eine vorläufige Oxidation der Polyphenole unterbinden können. Eine Mischung des gelösten Polyphenols mit den neutralen und positiv geladenen Lipiden der Molekülsorten A und B in mindestens einem organischen Lösungsmittel wird daher zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen Mischung durchgeführt. Dies dient der Homogenisierung der Molekülmischung.
Es versteht sich, dass die Mischung nach Entfernung des organischen Lösungsmittels vorteilhaft in pulverförmiger, homogenisierter Form vorliegt. Dies allein löst bereits die Aufgabe der Erfindung.
Wie für die Mischung soll für das Herstellungsverfahren entsprechend als molekulares Verhältnis A:B von 1(±0,2):1(±0,2) mol/mol gewählt werden. Das Molverhältnis der positiven und neutralen Lipide der Molekülsorten A, B und des Polyphenols C soll vorteilhaft etwa 1(±0,2):1(±0,2):0,1–25 mol/mol, besonders vorteilhaft 1(±0,2):1(±0,2):0,1–10 mol/mol und ganz besonders vorteilhaft 1(±0,2):1(±0,2):0,5–5 mol/mol betragen bzw. eingestellt werden. Geringfügige Abweichungen hiervon sind wie erwähnt erlaubt.
Die erfindungsgemäße Mischung, die vorzugsweise als Liposom definiert ist und das zur Anwendung gelangende Medikament auf Basis der erfindungsgemäßen Mischung, insbesondere des Liposoms, umfasst somit die Molekülsorte A und eine Molekülsorte B sowie ein Polyphenol C im angegebenen Verhältnis.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird durch die Überführung von der organischen Phase über die pulverförmige Phase in die wässrige, liposomale Umgebung in besonders vorteilhafter Weise die Bioverfügbarkeit der Polyphenole für therapeutische Zwecke bei gleichzeitigem Schutz vor Oxidation erhöht.
Die erfindungsgemäße Molekülmischung aus den Molekülsorten A und B mit dem Polyphenol C wird somit von dem organischen Lösungsmittel bzw. den organischen Lösungsmitteln getrennt und schonend in einen wässrigen Puffer um pH 7 überführt. Das heißt, dass zur Herstellung des Liposoms im Wesentlichen die organische Komponente gegen eine auf wässrigem, physiologischem Puffer beruhenden System ausgetauscht wird.
Erst in der wässrigen Umgebung bilden sich die besonders bevorzugten multilamellaren, in sich geschlossenen sphärischen Strukturen, die sogenannten Liposome aus. Durch zusätzliche Schritte wie Ultraschallbehandlung. Extrusion oder mehrfaches Abkühlen und Aufheizen der Lösungen auf bis zu 4°C bzw. auf bis zu 70°C können die Liposomen weiter homogenisiert werden. Diese Strukturen weisen auf Grund der Molekülsorte A eine positive Ladung (Zeta Potential Uz = 30–100 mV) auf. Die meisten apolaren Polyphenole befinden sich im Inneren der Lipiddoppelschichten, der Liposommembran und sind dadurch von reaktiven Sauerstoffradikalen in vorteilhafter Weise abgeschirmt und geschützt. Derartige Liposome sind aus allen erfindungsgemäßen Mischungen heraus zu bilden.
Diese mit Polyphenol beladenen, erfindungsgemäßen Liposome fusionieren aufgrund der Wechselwirkung der positiv geladenen Lipide und der delokalisierten Elektronen der pflanzlichen Polyphenole durch einfachen Oberflächenkontakt über wenige Minuten (5–20 min) hocheffizient mit der Plasmamembran tierischer Zellen.
Wenn die Mischung als Liposom vorliegt, so liegt das Polyphenol C zum größten Teil in der Liposommembran eingebaut vor. Nur zum kleineren Teil ist es im Innern des Liposoms selbst in wässrigem Puffer gelöst. Dies hat zur Folge, dass das Polyphenol selbst eine Fusion mit der Zielzellenmembran auslöst.
Die Phenole selber werden während der therapeutischen Anwendung anstelle der zellulären Moleküle oxidiert. Dadurch verhindert die Anwesenheit der Polyphenole vorteilhaft die Überoxidation der Zelle. Die erfindungsgemäße Mischung und das Medikament hieraus ist daher ein wirksames Therapeutikum bei der Behandlung aller oxidativen Krankheitsprozesse oder bei bestimmten Krebserkrankungen.
Wenn in vitro größere Mengen von diesen Radikalfängern in der Mischung bzw. im Liposom vorhanden sein sollen, können Werte mit einem Molverhältnis von etwa 1:1:5 mol/mol der Molekülsorten A, B und des Polyphenols C angewendet bzw. verabreicht werden. Diese Mischung wirkt dann eher toxisch. Daher wird diese hohe oder noch höhere Menge bei Krebstherapien vorgeschlagen, um Krebszellen in hohen Maßen zu überoxidieren und dadurch abzutöten. In vivo sind andere Konzentrationen möglich und in Betracht zu ziehen.
Die Mischungen und positiv geladenen Liposomen müssen somit eine Molekülsorte A und eine Molekülsorte B beinhalten. Die Kriterien für die Molekülsorte A sind, dass (a) das Molekül einen hydrophilen Bereich mit mindestens einer oder mehreren positiven Ladungen aufweist, so dass die Gesamtladung des hydrophilen Teils des Moleküls positiv ist. Die Aufgabe dieses Moleküls ist es, die Fusionsmischung durch elektrostatische Kräfte in die Nähe der negativ geladenen Zellmembran zu bringen. (b) Molekülsorte A weist zudem einen hydrophoben Bereich auf, vorzugsweise einen C10-C30–Anteil mit oder ohne Doppelbindungen. Doppelbindungen haben die vorteilhafte Wirkung, dass die Membran des entstehenden Liposoms elastisch wird, so dass die Fusion des Liposoms mit der Zellmembran erleichtert wird. Geeignet sind Moleküle wie z. B. 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP), N-(2,3-Dioleyloxypropyl)-N,N,N-Trimetylammonium Chlorid (DOTMA), Dimetyl-Dioctadecyl Ammonium Bromid (DDAB) oder (1-[2-(Oleoyloxy)Ethyl]-2-Oleyl-3-(2-Hydroxyethyl)Imidazolinium Chlorid (DOTIM). Als ein erstes Beispiel wird DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (Chlorid-Salz)) genannt.
Die Kriterien für Molekülsorte B sind, dass (a) das Molekül einen hydrophilen Bereich sowie (b) einen hydrophoben Bereich (insbesondere C10-C30) mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen muss. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A. (c) Beide Bereiche sollen einen neutralen Charakter aufweisen, um die große Ladungsdichte und die abstoßenden Kräfte zwischen positiv geladenen Molekülen von Molekülsorte A zu neutralisieren. Dieser Effekt führt zur Stabilisierung des Systems. Molekülsorte B ist somit ein Helfermolekül. Geeignet sind Moleküle wie z. B. Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylcholine, wie z. B. 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DPPE), 1,2-Dimiristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DMPE), 1,2-Dielaidoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DEPE), 1,2-Diphytanolsn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, 1,2-Dilinoleoylsn-Glycero-3-Phosphoethanolamin oder 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylcholin (DOPC).
Die verwendeten Polyphenole sind Moleküle, die mindestens zwei, direkt an einen aromatischen Ring gebundene Hydroxylgruppen enthalten und zu den sekundären Pflanzenstoffen gehören. Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäße Mischung und Liposome Polyphenole, wie beispielweise Resveratrol, Curcumin, Hydroxyflavon und Genistein in dem angegebenen Verhältnis gewählt.
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten zwei Figuren näher beschrieben, ohne dass es hierdurch zur Einschränkung der Erfindung kommen soll.
Es zeigen:
1: Strukturen der bevorzugten Polyphenole: I. Resveratrol. II. Curcumin. III. Hydroxyflavon. IV. Genistein.
2: Einbau von Resveratrol in positiv geladene Liposomen und dessen in vitro Nachweis in Zellen.
Die in der 1 dargestellten Strukturformeln sind lediglich beispielhaft für einige besonders relevante und gut verfügbare Polyphenole gezeigt. Andere, hier nicht dargestellte Polyphenole sollen aber explizit mit von den geltenden Patentansprüchen umfasst sein. Es sind also selbstverständlich auch andere Polyphenole als die gezeigten zur Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Mischungen und Liposome denkbar.
1. Ausführungsbeispiel – in vitro Untersuchungen an Zellen:
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propan, Chlorid-Salz (DOTAP) als positiv geladenes Lipid der Molekülsorte A sowie 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) als neutrales Lipid der Molekülsorte B (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA) und N-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-prapionyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (Triethylammonium-Salz) (entspricht BODIPY^® FL-DHPE) (Invitrogen, Eugene, OR, USA) als fluoreszentes Markerlipid wurden in Chloroform/Ethanol (10/1 vol/vol) Lösungsmittel-Mischung in einem Molverhältnis von DOTAP/DOPE/BODIPY^® FL-DIPE = 1/1/0,005 mol/mol in einer Gesamtlipidkonzentration von etwa 1 mg/ml aufgenommen und gemischt.
BODIPY^® FL-DIPE dient hierbei lediglich zum Zwecke des Nachweises einer erfolgreichen Membranfusion zwischen Liposom und Plasmamembran. Derartige Farbstoffe sind explizit nicht Gegenstand der erfindungsgemäßen Mischung bzw. des erfindungsgemäßen Liposoms.
Resveratrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde zunächst in Ethanol als organisches Lösungsmittel in einer Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst und homogenisiert.

Die Lipidkomponente aus Molekülsorte A und B und BODIPY FL-DIPE wurde sodann mit Resveratrol in folgenden Molverhältnissen aus der organischen Lösungsmittelmischung heraus miteinander gemischt (Tabelle 1). Tabelle 1: Angaben zu Mengen und Volumina der Komponente A, B und des Polyphenols C sowie der Lösungsmittel (MW = Molekulargewicht; stock = Stammlösung).

Komponente	MW [g/mol]	C_Stock [mg/ml]	Lösungsmittel	Molverhältnis [mol/mol]	m [μg]	V [μl]
DOPE (Molekülsorte B)	744,03	1	Chloroform/EtOH	1	515	515
DOTAP (A)	698,54	1	Chloroform/EtOH	1	485	485
BFL-DHPE¹	1067,23	1	Chloroform	0,005	4	4
Resveratrol (Polyphenol C)	228,24	1	EtOH	a. 0	0	0
				b. 0,62	100	100
				c. 1,25	200	200
				d. 2,5	300	300

¹nicht zur Molekülmischung zugehörig, sondern lediglich zum Nachweis der Fusion vorhanden.

Es ergeben sich somit vier Ansätze mit einem Gesamtlipid aus Molekülsorte A, B und BODIPY^® FL-DHPE/Resveratrol-Verhältnis von:

a) 2,005/0 mol/mol (Kontrolle)
b) 2,005/0,62 mol/mol
c) 2,005/1,25 mol/mol und
d) 2,005/2,5 mol/mol.

Die Komponenten wurden erst in Chloroform/Ethanol homogen vermischt. Nach der Mischung der Lipide mit dem Resveratrol wurden die organischen Lösungsmittel im Vakuum 30–60 min eingetrocknet und danach erneut in einer Pufferlösung von 20 mM HEPES (pH 7,4) in einer Endkonzentration von etwa 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad 20 min homogenisiert. Die Emulsion liegt dann als Liposom haltbar mindestens 4 Wochen vor.
Behandlung von 3T3-Zellen mit Resveratrolhaltigen Liposomen:
10 μl der Resveratrolhaltigen Liposomen wurden 100-fach mit RPMI Medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verdünnt und vor der Zugabe zu einer Zellkulturschale mit 3T3-Zellen (20.000–30.000 per Schale, (Durchmesser = 3,5 cm)) noch mal 5–10 Minuten lang mit Ultraschall (80–100 W) behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit HEPES-Medium gewaschen und die Fusionseffizienz des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluoreszenzmikroskop überprüft. 2A–D sind die entsprechenden Ergebnisse zu den Experimenten a)–d). Der Balken gibt jeweils 50 μm an.
Die Experimente und die zugehörigen Figuren zeigen, dass eine sehr effektive und homogene Membranfusion ab einem Molverhältnis von Gesamtlipid/Resveratrol von 2,005/1,25 induziert wird (2C), was durch den grün-fluoreszerienden Membranmarker BODIPY^® FL-DHPE angezeigt wird. Dieser gibt in den in schwarz-weiss gehaltenen 2A–2D die Umrisse der Zellen durch Färbung der Membran, einige markiert durch die weißen Pfeile, an. Bei einer doppelten Resveratrol-Konzentration (2D) ist die Zellmorphologie und die Anzahl der markierten Zellen unverändert.
2A zeigt, dass die positiv geladenen Liposomen ohne Resveratrol bzw. ein Polyphenol (DOPE/DOTAP/BODIPY FL-DHPE 1/1/0,005 mol/mol) keine Membranfusion mit 3T3-Zellen auslösen.
2B zeigt, dass ab einer Resveratrol-Konzentration von Gesamtlipid/Resveratrol = 2,005/0,62 die erste inhomogene Fusion beobachtet werden kann. Ab dieser Konzentration ist in vitro und mit dem gewählten Nachweisverfahren eine Wirkung des Polyphenols C als Therapeutikum nachweisbar.
2C zeigt, dass eine Erhöhung der Resveratrol-Konzentration auf Gesamtlipid/Resveratrol = 2,005/1,25 mol/mol die Fusionseffizienz der Liposomen deutlich erhöht. Ab dieser Konzentration des Resveratrol liegt man unter den gegebenen Untersuchungsbedingungen, das heißt in vitro, im optimalen Bereich einer Fusion.
2d zeigt, dass sogar beim doppeltem der Resveratrolkonzentration und einem Gesamtlipid/Resveratrol-Verhältnis = 2,005/2,5 neben einer hohen Fusionsrate eine unveränderte Zellmorphologie beobachtet wurde.
Darüber hinausgehende Konzentrationen wurden nicht mehr untersucht, da das Polyphenol C bei einem molekularen Verhältnis größer als 1:1:5 mol/mol nicht weiter effektiv in die Liposomen eingebaut werden kann und dadurch keine verbesserte therapeutische Wirkung im Vergleich zu neutralen Vesikeln nachgewiesen werden kann.
Es versteht sich somit, dass

1. Resveratrol bzw. das Polyphenol C in der Liposommembran selbst fusionsauslösend ist und
2. die in der wässrigen, liposomalen Phase vorliegenden Phenolanteile nach der Fusion in die Zelle und insbesondere in die Zellmembran überführt werden und dort effektiv als Therapeutikum für die auf oxidativem Stress beruhenden Erkrankungen, z. B. als Tumorbehandelndes Medikament, eingesetzt werden können und
3. in vivo mit deutlich verschobenen Konzentrationen des Polyphenols C gerechnet werden muss. Hier sollen molekulare Verhältnisse von A:B:C von 1(±0,2):1(±0,2):0,1–25 mol/mol bzw. die oben angegebenen Zwischenwerte gewählt und kombiniert werden, um das optimale Wirkergebnis für die entsprechenden Versuche zu erzielen.

Diese Maßnahmen stellen somit einen wirksamen Mechanismus bei der Behandlung aller oxidativer Erkrankungsprozesse in den Zellen dar.
2-112 Ausführungsbeispiel:
Es werden die übrigen in dieser Patentanmeldung offenbarten Ausführungsbeispiele für die Molekülsorte A und die Molekülsorte B und das Polyphenol C, wie in den Patentansprüchen 2 bis 4 angezeigt, miteinander kombinatorisch vermischt, wobei insgesamt 112 Kombinationen möglich sind. Die Molverhältnisse und Lösungsmittel entsprechen denjenigen des Ausführungsbeispiels 1. Dann erhält man die Molkülmischungen 2-112, die wie die Mischung 1 des Ausführungsbeispiels 1 als Liposom zur Anwendung in der Tumorbehandlung oder einer anderen oxidativen Erkrankung herangezogen werden können.
Es ist denkbar, alle genannten Ausführungsbeispiele auch in pulverförmiger Tablettenform zu verabreichen, sofern auf die Überführung in die wässrige-liposomale Phase verzichtet wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Mentha, R. G., Murillo G., Naithani R. and Peng X., Pharm Res (2010) 24: 950–961 [0002]
Queen B. L., Tollefsbold T. O., Curr. Aging Sci. (2010). 3: 34–42 [0002]
Nair H. B. et al., Biochem. Pharmacology (2010). 80: 1833–1843 [0004]
Kristl J. et al., Eu. J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2009). 73: 253–259 [0004]
Narayanan N. K., Nargi D., Randolph C., and Narayanan B. A., (2009). Int. J. Cancer. 125: 1–8 [0004]
Kristl et al. [0012]

Claims

Molekülmischung, umfassend eine amphipathische Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung aufweist und eine amphipathische Molekülsorte B, welche im hydrophilen Bereich neutral ist und ein Polyphenol C, wobei die Molekülsorten A und B in einem molekularen Verhältnis von A:B von 1(±0,2):1(±0,2) mol/mol vorliegen.
Mischung nach vorherigem Anspruch gekennzeichnet durch 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP), N-(2,3-Dioleyloxypropyl)-N,N,N-Trimetylammonium Chlorid (DOTMA), Dimetyl-Dioctadecyl Ammonium Bromid (DDAB) oder (1-(2-(Oleoyloxy)Ethyl]-2-Oleyl-3-(2-Hydroxyethyl)Imidazolinium Chlorid (DOTIM) oder einer Mischung hieraus als Molekülsorte A.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylcholine, wie z. B. 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, 1,2-Dimiristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, 1,2-Dielaidoylsn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, 1,2-Diphytanolsn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, 1,2-Dilinoleoylsn-Glycero-3-Phosphoethanolamin oder 1,2-Dioleoyl sn-Glycero-3-Phosphatidylcholin oder einer Mischung hieraus als Molekülsorte B.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Resveratrol, Curcumin, Hydroxiflavon und/oder Genistein oder einer Mischung hieraus als Polyphenol.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülsorten A und B und das Polyphenol C in einem molekularen Verhältnis von A:B:C von 1(±0,2):1(±0,2):0,5–5 mol/mol vorliegen.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese als Lipsosom in wässriger Umgebung vorliegt.
Verfahren zur Herstellung einer Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) die Molekülsorten A und B werden in einem organischen Lösungsmittel gelöst, b) das Polyphenol C wird von den Molekülsorten A und B getrennt in einem organischen Lösungsmittel gelöst und gemischt oder zusammen mit den Molekülsorten A und B in demselben organischen Lösungsmittel gelöst und gemischt, c) sofern die Lösung des Polyphenols C in dem organischen Lösungsmittel in Schritt b) getrennt von der Lösung der Molekülsorten A und B erfolgte, werden das Lösungsmittel mit den Molekülsorten A und B und das Lösungsmittel mit dem Polyphenol C miteinander vermischt und homogenisiert, wobei in jedem Fall in den Schritten b) und c) ein molekulares Verhältnis von A:B von 1(±0,2):1(±0,2) mol/mol gewählt wird, d) das bzw. die organischen Lösungsmittel werden entfernt.
Verfahren nach vorherigem Anspruch gekennzeichnet durch Wahl von Methanol oder Ethanol als Lösungsmittel für das Polyphenol C und durch Wahl von Chloroform, Ethanol und/oder Methanol als Lösungsmittel für die Molekülsorten A und B.
Verfahren nach einem der vorhergehenden zwei Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in den Schritten b) und c) ein molekulares Verhältnis von A:B:C von 1(±0,2):1(±0,2):0,5–5 mol/mol gewählt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden drei Ansprüche zur Herstellung des Liposoms nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülmischung in eine wässrige, physiologische Lösung überführt wird.
Medikament, umfassend eine Mischung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 6.
Verwendung einer Mischung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Zellerkrankungen, die durch oxidativen Stress verursacht werden.
Verwendung einer Mischung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 6 oder eines Medikaments nach Anspruch 10 zur Behandlung von Zellerkrankungen, die durch oxidativen Stress verursacht werden.
Verfahren zur Behandlung von Zellerkrankungen, die auf oxidativen Stress beruhen mit einer Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 oder einem Medikament nach Anspruch 10.