JP6322733B2 - 親水性領域において正の全電荷を示す両親媒性分子種ａおよび両親媒性分子種ｂおよびポリフェノールｃを含む分子混合物、該分子混合物の製造方法、ならびにその使用 - Google Patents

Description

本発明は、親水性領域において正の全電荷を示す両親媒性分子種Ａ、および両親媒性分子種Ｂ、ならびにポリフェノールＣを含む分子混合物、該分子混合物の作製方法とその使用に関する。

ポリフェノールは、植物の種、葉、および果実中に存在する二次的な植物質である。この物質のいくつかは、がん細胞を抑制するように働き（Ｍｅｎｔｈａ，Ｒ．Ｇ．、Ｍｕｒｉｌｌｏ Ｇ．、Ｎａｉｔｈａｎｉ Ｒ．およびＰｅｎｇ Ｘ．、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ （２０１０） ２４：９５０−９６１（非特許文献１））、または望ましくない酸化過程から防護する（Ｑｕｅｅｎ Ｂ．Ｌ．、Ｔｏｌｌｅｆｓｂｏｌｄ Ｔ．Ｏ．、Ｃｕｒｒ． Ａｇｉｎｇ Ｓｃｉ．（２０１０）．３：３４−４２（非特許文献２））。したがって、ポリフェノールは、ヒトの食料の重要な成分とされる。他方において、ポリフェノールは、非常に高い濃度においては毒性作用を示すので、化学療法における重要な成分でもある。ポリフェノールは治療における重要性が高いことから、生物への制御された効果的なその投与に対する関心が高い。

こうした疎水性作用物質の水性溶液での投与には、多くの不利な点がある。一方では、治療的作用を実現するには、非常に高い濃度が必要となる。作用物質の大部分は細胞に到達できずにおり、ポリフェノールの約９９％は、細胞に取り込まれないままである。他方では、ポリフェノールは水性環境下で好ましくない酸化により効力を失ってしまう。

リポソームおよびポリマー・カプセルは、水系の投与に比べ、どちらかというと物理化学的特徴および親水性を示すので、ポリフェノールの生物学的利用率を確かに高める。（Ｎａｉｒ Ｈ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１０）．８０：１８３３−１８４３（非特許文献３）、Ｋｒｉｓｔｌ Ｊ．ら、Ｅｕ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２００９）．７３：２５３−２５９（非特許文献４）、Ｎａｒａｙａｎａｎ Ｎ．Ｋ．、Ｎａｒｇｉ Ｄ．、Ｒａｎｄｏｌｐｈ Ｃ．、およびＮａｒａｙａｎａｎ Ｂ．Ａ．、（２００９）．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１２５：１−８（非特許文献５））。したがって、こうしたカプセルには利点もあるが、ポリフェノールの制御された放出、および標的細胞による迅速な取込みが保証されない欠点がある。こうしたリポソームも、望ましくない酸化過程から部分的にしかポリフェノールを保護できない。

Ｍｅｎｔｈａ，Ｒ．Ｇ．、Ｍｕｒｉｌｌｏ Ｇ．、Ｎａｉｔｈａｎｉ Ｒ．およびＰｅｎｇ Ｘ．、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ（２０１０）２４：９５０−９６１ Ｑｕｅｅｎ Ｂ．Ｌ．、Ｔｏｌｌｅｆｓｂｏｌｄ Ｔ．Ｏ．、Ｃｕｒｒ．Ａｇｉｎｇ Ｓｃｉ．（２０１０）．３：３４−４２ Ｎａｉｒ Ｈ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１０）．８０：１８３３−１８４３ Ｋｒｉｓｔｌ Ｊ．ら、Ｅｕ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２００９）．７３：２５３−２５９ Ｎａｒａｙａｎａｎ Ｎ．Ｋ．、Ｎａｒｇｉ Ｄ．、Ｒａｎｄｏｌｐｈ Ｃ．、およびＮａｒａｙａｎａｎ Ｂ．Ａ．、（２００９）．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１２５：１−８

したがって、本発明の課題は、ポリフェノールが安定化され、酸化過程から防護されている分子混合物を提供することである。ポリフェノールまたはポリフェノールの混合物は、平均より多量でも迅速に高効率で制御される、すなわち、所望の量を生細胞に導入できるようにすることで、意図通りの予防作用、あるいは意図通りの毒性作用を細胞に対し及ぼせるような状態にすべきである。本発明のさらなる課題は、そうした混合物の作製法、およびその使用を提供することにある。

本発明の課題は、請求項１に記載の本発明による混合物、前記混合物の作製方法、前記混合物の使用により解決される。有利な形態は、それぞれがこれに従属する請求項、とりわけ分子混合物をリポソームとして用いる請求項６により与えられる。

本発明による分子混合物は、少なくとも２つの分子種ＡおよびＢならびにポリフェノールＣを有する。

２つの分子種ＡおよびＢは、分子比Ａ：Ｂがおよそ１：１で存在する。この好ましい１：１モル／モルの比からの多少の逸脱、すなわちＡ：Ｂが１（±０．２）：１（±０．２）モル／モル、は許容される。

分子種Ａ、ＢおよびポリフェノールＣのモル比は、有利にはおよそ１（±０．２）：１（±０．２）：０．１〜２５モル／モル、特に有利には１（±０．２）：１（±０．２）：０．１〜１０モル／モル、および非常に特に有利には１（±０．２）：１（±０．２）：０．５〜５モル／モルである。最後に示したケースでは、インビトロで、リポソームによるポリフェノールＣの標的細胞への取込みがすでに立証されている。

既述のように、前記の比からの多少の逸脱は、分子種Ａの斥力が働く電荷が、中性の補助分子Ｂでおおむね相殺される限り、許容される。Ａ：Ｂ：Ｃの比は、ポリフェノールＣに対し、およそ１：１：５モル／モルから、インビトロでは、毒性濃度へと移行する。

分子種ＡおよびＢのそれぞれにおいて、対応する中間値が取れる、すなわち例えば、分子種Ａおよび分子種Ｂに対し、それぞれ０．８、０．９、１．０、１．１および１．２、さらにはそれらの中間値が取れると理解される。ポリフェノールＣについても同様である、すなわち、混合物から標的細胞への、とりわけリポソームからその細胞へのポリフェノールＣの迅速な取込みが確保されると保証される限り、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４・・・２４．９８、２４．９９および２５．００のすべての数値を、分子種ＡおよびＢとの混合物において前述の数値との自由な組合せで取ることが可能となるべきである。

本発明において、ポリフェノールを、本発明による混合物から作製される正に荷電されたリポソームにより、Ｋｒｉｓｔｌらによる前記従来技術において実施されるように中性のリポソームに依るよりも、はるかに良く標的細胞およびその膜に取り込み、組み込めることがさらに判明した。前記従来技術では、ポリフェノールが、リポソームの作製後になって水性相中に加えられるので、この作製法によっては、リポソームへのレスベラトロールの添加は、生成したリポソームの主として表面に少量しかできない。これに対し、本発明による場合は、ポリフェノールが、乾燥した混合物からリポソームを作製するときにすでに加えられている。したがって、ポリフェノールはリポソーム膜の本質的な構成要素であり、高度に前記膜に組み込まれている。これにより、ポリフェノールＣでのリポソームの意図通りの制御された十分な負荷が有利に行われる。本発明において、リポソーム膜中のポリフェノールが、細胞膜と自発的に融合をひき起こすことがさらに見出された。これにより、有利には、ポリフェノールが、高い効率で迅速に標的細胞内に移行することが生じる。

その上、生成するリポソーム膜中のポリフェノールは、一時的な酸化過程から非常に良く保護されていることが確認された。

混合物の作製法に関して、ポリフェノールは、一般的にエタノールまたはクロロホルムといった有機溶媒に良く溶解するので、これがポリフェノールの一時的な酸化を阻止できることが見出された。したがって、本発明による混合物を調整するため、溶解したポリフェノールを、分子種ＡおよびＢの中性脂質および正荷電脂質と、少なくとも１種の有機溶媒中で混合することが行われる。これにより分子混合物の均質化が行われる。

当然、前記混合物は有機溶媒を除去した後、有利には、粉末状の均質形態となる。これのみで、本発明の課題がすでに解決する。

混合物に関するのと同様に、作製法においても、相当する分子比Ａ：Ｂとして１（±０．２）：１（±０．２）モル／モルを選ぶべきである。分子種Ａ、Ｂの正荷電脂質および中性脂質ならびにポリフェノールＣのモル比は、有利にはおよそ１（±０．２）：１（±０．２）：０．１〜２５モル／モル、特に有利には１（±０．２）：１（±０．２）：０．１〜１０モル／モル、非常に特に有利には１（±０．２）：１（±０．２）：０．５〜５モル／モルであるか、またはそのように調整するべきである。これからの多少の逸脱は、既述の通り許される。

したがって、好ましくはリポソームとして定義される本発明による混合物、および本発明による混合物、とりわけリポソームに基づく、適用される医薬品は、分子種Ａおよび分子種ＢならびにポリフェノールＣを前述した比で含む。

さらなる特に有利な本発明の実施形態において、有機相から粉末相を経て水性のリポソーム環境に移行することで、治療目的のためのポリフェノールの生物学的利用率が酸化に対する保護と同時に非常に有利に向上する。

分子種ＡおよびＢ、加えてポリフェノールＣからの本発明による分子混合物は、これにより１種または複数の有機溶媒から分離され、ｐＨ７程度の水性緩衝液中に穏やかに移される。すなわち、リポソームを作製するために、有機成分が水性の生理的緩衝液に基づく系の方へ実質的に交換される。

水性環境中ではじめて、特に好ましい多重膜の、自体で閉じた球形構造のいわゆるリポソームを形成する。超音波処理、押出または４℃もしくは７０℃までの溶液の繰り返し冷却および加熱といった追加的な工程で、リポソームはさらに均質化される。こうした構造は分子種Ａによって、正の荷電（ゼータ電位Ｕｚ＝３０〜１００ｍＶ）を示す。大方の、無極性のポリフェノールは、脂質二重層、リポソーム膜の内側にあり、これにより反応性の酸素ラジカルから有利に遮蔽され保護される。すべての本発明による混合物から、そうしたリポソームが形成される。

ポリフェノールを負荷した本発明によるリポソームは、正に荷電された脂質と植物性ポリフェノールの非局在化電子との相互作用のために、動物細胞の原形質膜と、単純な表面接触により分単位の短い時間（５〜２０分）で高効率に融合する。

前記混合物がリポソームとして存在すると、ポリフェノールＣの大部分はリポソーム膜中に組み込まれている。小部分のみが、リポソーム自体の内部で水性緩衝液に溶解している。この結果、ポリフェノール自体が標的細胞膜との融合をひき起こす。

フェノール類自体は、治療応用中に細胞分子の代わりに酸化される。これにより、ポリフェノールの存在が、有利には細胞の過剰酸化を防止する。したがって本発明による混合物およびそれからの医薬は、すべての酸化的発症過程または特定のがん疾患の治療における有効な治療薬である。

インビトロでこれらのラジカル捕捉剤を混合物中またはリポソーム中により多い量で存在させるときは、分子種Ａ、ＢおよびポリフェノールＣのモル比としておよそ１：１：５モル／モルの値を適用または投与できる。この場合、この混合物はどちらかというと毒性に作用する。したがって、こうした多量または一層の多量が、がん細胞を高度に過剰酸化し、それにより死滅させるために、がん療法で提案されている。インビボでは、他の濃度が可能であり、考慮に入れるべきである。

このため前記混合物および正に荷電されたリポソームは、分子種Ａおよび分子種Ｂを含まねばならない。分子種Ａに対する選定基準は以下の通りである。（ａ）分子には、少なくとも１つまたは複数の正の電荷を有する親水性領域を有し、分子の親水性部分の全電荷が、正である。この分子の役割は、融合混合物を、静電気力で負に荷電された細胞膜の近傍に運ぶことにある。（ｂ）分子種Ａは、さらに疎水性の領域、好ましくは二重結合を有するかまたは有しないＣ１０〜Ｃ３０部分を有する。二重結合には、生成するリポソームの膜が弾性となるという有利な作用があるので、リポソームの細胞膜との融合が容易になる。好適な分子の例として、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル（Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ））−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｔｒｉｍｅｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）クロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチル（Ｄｉｍｅｔｙｌ）ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、または（１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）が挙げられる。第１に、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩））が例示される。

分子種Ｂに対する選定基準は以下の通りである。（ａ）分子が親水性領域ならびに（ｂ）二重結合を有するかまたは有しない疎水性領域（とりわけＣ１０〜Ｃ３０）を有しなければならない。二重結合の機能については種Ａ参照。（ｃ）両方の領域とも、中性の性質を示して、分子種Ａの正に荷電された分子間の高荷電密度および斥力を中和しなくてはいけない。この効果により、系が安定化される。このように、分子種Ｂは補助分子である。好適な分子の例として、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２−ジフィタノール−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）といったホスファチジルエタノールアミン、および、ホスファチジルコリンが挙げられる。

用いられるポリフェノールは、芳香族環に直接結合した少なくとも２つのヒドロキシ基を含み、二次的な植物質に属する分子である。好ましくは、本発明による混合物およびリポソーム用に、例えばレスベラトロール、クルクミン、ヒドロキシフラボン、およびゲニステインといったポリフェノールが上述の比で選ばれる。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．親水性領域において正の全電荷を示す両親媒性分子種Ａおよび親水性領域において中性の両親媒性分子種ＢおよびポリフェノールＣを含む分子混合物であって、分子種ＡおよびＢならびにポリフェノールＣが、１（±０．２）：１（±０．２）：０．５〜５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃで存在する分子混合物。
２．分子種Ａとしての、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）または（１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、あるいはそれらの混合物を特徴とする、上記１に記載の混合物。
３．分子種Ｂとしてのホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジフィタノール−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、あるいはそれらの混合物を特徴とする、上記１または２に記載の混合物。
４．ポリフェノールとしての、レスベラトロール、クルクミン、ヒドロキシフラボンおよび／またはゲニステイン、またはそれらの混合物を特徴とする、上記１〜３のいずれか一つに記載の混合物。
５．分子種ＡおよびＢならびにポリフェノールＣが、１（±０．２）：１（±０．２）：０．５〜２．５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃ、とりわけ１（±０．２）：１（±０．２）：０．６２〜２．５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃ、またとりわけ１（±０．２）：１（±０．２）：１．２５〜２．５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃで存在することを特徴とする、上記１〜４のいずれか一つに記載の混合物。
６．リポソームとして水性環境に存在することを特徴とする、上記１〜５のいずれか一つに記載の混合物。
７．以下の工程：
ａ）分子種ＡおよびＢが有機溶媒に溶解される工程、
ｂ）ポリフェノールＣが、分子種ＡおよびＢとは別に有機溶媒に溶解され、混合されるか、または分子種ＡおよびＢと一緒に同一の有機溶媒に溶解され、混合される工程、
ｃ）ポリフェノールＣの有機溶媒への溶解が、工程ｂ）において分子種ＡおよびＢの溶解とは別に行われる場合、分子種ＡおよびＢを含む溶媒と、ポリフェノールＣを含む溶媒が互いに混合され、均質化されるが、工程ｂ）およびｃ）におけるいずれの場合も、１（±０．２）：１（±０．２）：０．５〜５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃが選択される工程、
ｄ）１種または複数の有機溶媒が除去される工程、
を特徴とする、上記１〜５のいずれか一つに記載の混合物の製造方法。
８．ポリフェノールＣ用の溶媒としての、メタノールまたはエタノールの選択、ならびに、分子種ＡおよびＢ用の溶媒としての、クロロホルム、エタノールおよび／またはメタノールの選択を特徴とする、上記７に記載の方法。
９．工程ｂ）およびｃ）において、分子比Ａ：Ｂ：Ｃが、１（±０．２）：１（±０．２）：０．６２〜２．５モル／モルの分子比に、とりわけ分子比Ａ：Ｂ：Ｃが１（±０．２）：１（±０．２）：１．２５〜２．５モル／モルに選択されることを特徴とする、上記７または８に記載の方法。
１０．分子混合物が、水性の生理的溶液に移されることを特徴とする、上記６に記載のリポソームを製造するための、上記７〜９のいずれか一つに記載の方法。
１１．上記１〜６のいずれか一つに記載の混合物を含む医薬。
１２．酸化ストレスにより生じる細胞疾患の治療用医薬を製造するための、上記１〜６のいずれか一つに記載の混合物の使用。
１３．酸化ストレスにより生じる細胞疾患を治療するための、上記１〜６のいずれか一つに記載の混合物の、または上記１０に記載の医薬の使用。
１４．上記１〜６のいずれか一つに記載の混合物または上記１０に記載の医薬を用いる、酸化ストレスに基づく細胞疾患の治療方法。
１５．上記６に記載のポリフェノールＣ負荷リポソームが、正に荷電された脂質と植物性ポリフェノールの非局在化電子との相互作用に基づいて、数分間にわたる単純な表面接触により、動物細胞の細胞形質膜と高効率に融合する、融合方法。

以下に本発明をより詳細に実施例および添付の２枚の図を用いて説明するが、それにより本発明に制限を加えようとするものではない。

好ましいポリフェノール、つまり、Ｉ．：レスベラトロール、ＩＩ．：クルクミン、ＩＩＩ．：ヒドロキシフラボン、ＩＶ．：ゲニステインの構造を示す図である。 レスベラトロールの正に荷電されたリポソームへの組み込みと、そのインビトロにおける細胞中での証明を示す図である。 追加的実験の結果を示す。

図１は、いくつかの特に重要でありまた入手し易いポリフェノールに関して単に例示的に示した構造式である。しかし、そこに示さなかった他のポリフェノールを特許請求の範囲に明示的に含めてある。つまり、本発明による混合物およびリポソームの作製や使用には、示されたものとは異なるポリフェノールも、もちろん考えられる。

１．実施例−細胞でのインビトロ試験：
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）を分子種Ａの正に荷電された脂質として、そして１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｐｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ）（ＤＯＰＥ）を分子種Ｂの中性の脂質として（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）、そしてＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ＤＨＰＥに相当）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）を蛍光マーカー脂質として、クロロホルム／エタノール溶媒混合物（１０／１体積／体積）中に、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ＤＨＰＥ＝１／１／０．００５モル／モルのモル比、全脂質濃度およそ１ｍｇ／ｍｌで入れ混合した。

この際ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ＤＨＰＥは、単にリポソームと原形質膜間の膜融合の成功を立証するために役立つ。こうした色素は、明白に本発明による混合物または本発明によるリポソームの対象物ではない。

レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）をまず有機溶媒としてのエタノール中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し均質化した。

次に、分子種ＡおよびＢ、ならびにＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ＤＨＰＥの脂質成分を、レスベラトロールと以下のモル比で有機溶媒混合物から互いに混合した（表１）。

表１：成分Ａ、ＢおよびポリフェノールＣならびに溶媒の量および体積の詳細（ＭＷ＝分子量、ｓｔｏｃｋ＝原液）。

これにより、以下：
ａ） ２．００５／０モル／モル（コントロール）
ｂ） ２．００５／０．６２モル／モル
ｃ） ２．００５／１．２５モル／モル
ｄ） ２．００５／２．５モル／モル
の、分子種Ａ、ＢおよびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ＤＨＰＥからなる全脂質／レスベラトロールの比を有する４つの出発物質が生じる。

前記成分をまずクロロホルム／エタノール中で均一に混合した。脂質とレスベラトロールの混合後、有機溶媒を真空中で３０〜６０分間蒸散させた後再び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に最終濃度がおよそ２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波浴中で２０分間均質化した。このエマルジョンは、リポソームとして少なくとも４週間存続する。

３Ｔ３細胞のレスベラトロール含有リポソームでの処理
１０μＬのレスベラトロール含有リポソームをＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）で１００倍に希釈し、３Ｔ３−細胞（２０，０００〜３０，０００／皿、（直径＝３．５ｃｍ））を入れた細胞培養皿に加える前に、再度５〜１０分間超音波で処理した（８０〜１００Ｗ）。続いて、細胞をＨＥＰＥＳ培地を用いて洗浄し、前記試薬の細胞膜との融合効率を蛍光顕微鏡で調べた。図２Ａ〜Ｄが、実験ａ）〜ｄ）に対応する結果である。図中の標尺はそれぞれ５０μｍを示す。

前記実験および付属の図が示すように、非常に効果的かつ均一な膜融合が、全脂質／レスベラトロールのモル比が２．００５／１．２５から、誘導され（図２Ｃ）、これが緑色蛍光化膜マーカーＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ＤＨＰＥで表示されている。これは、図２Ａ〜２Ｄの白黒写真では、膜の着色により細胞の輪郭を表わし、いくつかは白の矢印でマークされる。２倍のレスベラトロール濃度（図２Ｄ）において、細胞の形状、およびマークされた細胞の数は変わっていない。

図２Ａが示すように、レスベラトロール、またはポリフェノール無しでの正に荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＤＨＰＥ１／１／０．００５モル／モル）は、３Ｔ３−細胞と膜融合を生じない。

図２Ｂが示すように、全脂質／レスベラトロール＝２．００５／０．６２のレスベラトロール濃度から、はじめての不均一な融合を観察できる。この濃度から、インビトロの選定された立証方法において、ポリフェノールＣの治療薬としての作用を示すことができる。

図２Ｃが示すように、レスベラトロール濃度を全脂質／レスベラトロール＝２．００５／１．２５モル／モルに上げると、リポソームの融合効率は、明瞭に上昇する。このレスベラトロール濃度から、与えられた試験条件、すなわちインビトロでは、融合の最適領域となる。

図２ｄが示すように、レスベラトロール濃度を２倍にし、全脂質／レスベラトロール比＝２．００５／２．５としても、融合率が高いほか、細胞形状が変化していないのが観察された。

それ以上の濃度についてはもはや試験しなかった。なぜなら、分子比が、１：１：５モル／モル超であると、ポリフェノールＣは、さらに有効にはリポソーム中に組み込めなくなり、したがって中性のベシクルと比較して改善された治療効果が、示せなくなるからである。

これにより、以下のことが分かる。

１． レスベラトロールまたはポリフェノールＣは、リポソーム膜中にあって、自発的に融合をひき起こせる、および
２． 水性のリポソーム相に存在しているフェノールの部分は融合後、細胞内に、とりわけ細胞膜に移行され、そこで、酸化ストレスに基づく疾患用の治療薬、例えば腫瘍治療薬として有効に使用できる、および
３． インビボではポリフェノールＣの濃度は大きく動くと考えなければならない。この場合、対応の試験で最適の作用結果を得るために、分子比Ａ：Ｂ：Ｃとして１（±０．２）：１（±０．２）：０．１〜２５モル／モル、または上述した中間値を選び、組み合わせるべきである。

したがって、この手段は、細胞におけるすべての酸化的発症過程の治療において効果的な仕組みを提示する。
２−１１２の実施例：
分子種Ａと分子種ＢおよびポリフェノールＣに関して、本特許出願中に開示されている他の実施例は、請求項２〜４に示されるように互いに組み合わせる場合、全部で１１２種類の組み合わせが可能である。モル比および溶媒は、実施例１のものに対応する。こうすると、実施例１の混合物１と同様に、腫瘍治療または別の酸化性の疾患に用いるリポソームとして利用できる分子混合物２〜１１２が得られる。

例として以下の追加的実験を示し、その結果を図３に示す。

本特許出願に挙げられている、レスベラトロール以外のポリフェノール、例えばクルクミンおよび５−ヒドロキシフラボンをＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ））細胞でテストした。リポソーム調製および細胞培養方法は、前述の実験に対して変更しなかった。

図３Ａは、ポリフェノールを含まない正に荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＤＨＰＥ １／１／０．００５モル／モル）も、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞との膜融合を起こさないことを示している。これには、次の分子混合物、すなわちＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＤＨＰＥとして１：１：０．００５モル／モルを用いた。ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＤＨＰＥは、分子混合物に属さず、単に融合を実証するために存在する。

図３Ｂは、ここではクルクミンであるポリフェノール濃度を全脂質／クルクミン＝２．００５／１．２５モル／モルまで増やすと、リポソームのＣＨＯ細胞の原形質膜との融合効率が、レスベラトロールにおけると同様に明瞭に上昇するのを示している。これには、次の分子混合物、すなわちＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥ：クルクミン＝１：１：０．００５：１．５モル／モルを用いた。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥは、分子混合物に属さず、単に融合を実証するために存在する。

図３Ｃは、５−ヒドロキシフラボン含有リポソーム（全脂質／５−ヒドロキシフラボン＝２．００５／１．２５モル／モル）をＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞に使用した後、前出のポリフェノールを用いたときと同様の高い融合率を示している。これには、次の分子混合物、すなわちＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥ：５−ヒドロキシフラボン＝１：１：０．００５：１．５モル／モルを用いた。ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＤＨＰＥは、分子混合物に属さず、単に融合を実証するために存在する。

本発明の課題は、分子混合物、およびその作製方法によってさらに解決され、その際、分子種ＡおよびＢならびにポリフェノールＣの分子比を１（±０．２）：１（±０．２）：０．５〜２．５モル／モル、とりわけ分子比Ａ：Ｂ：Ｃが１（±０．２）：１（±０．２）：０．６２〜２．５モル／モル、またとりわけ分子比Ａ：Ｂ：Ｃが１（±０．２）：１（±０．２）：１．２５〜２．５モル／モルにする、またはそのように調整する。

水性リポソーム相への移行を行わない場合、上記の実施例のいずれにおいても、粉末状の錠剤剤形投与することも考えられる。

Claims (13)

1. 親水性領域において正の全電荷を示す両親媒性分子種Ａおよび親水性領域において中性の両親媒性分子種ＢおよびポリフェノールＣを含み、分子種ＡおよびＢならびにポリフェノールＣが、１（±０．２）：１（±０．２）：０．６２〜５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃで存在する分子混合物であって、ポリフェノールＣが膜に組み込まれたリポソームとして存在する分子混合物。
2. Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の分子混合物。
3. 分子種Ａとしての、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）または（１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、あるいはそれらの混合物を特徴とする、請求項１または２に記載の混合物。
4. 分子種Ｂとしてのホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジフィタノール−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、あるいはそれらの混合物を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の混合物。
5. ポリフェノールとしての、レスベラトロール、クルクミン、ヒドロキシフラボンおよび／またはゲニステイン、またはそれらの混合物を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の混合物。
6. リポソームとして水性環境に存在することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の混合物。
7. 以下の工程：
   ａ）分子種ＡおよびＢが有機溶媒に溶解される工程、
   ｂ）ポリフェノールＣが、分子種ＡおよびＢとは別に有機溶媒に溶解され、混合されるか、または分子種ＡおよびＢと一緒に同一の有機溶媒に溶解され、混合される工程、
   ｃ）ポリフェノールＣの有機溶媒への溶解が、工程ｂ）において分子種ＡおよびＢの溶解とは別に行われる場合、分子種ＡおよびＢを含む溶媒と、ポリフェノールＣを含む溶媒が互いに混合され、均質化されるが、工程ｂ）およびｃ）におけるいずれの場合も、１（±０．２）：１（±０．２）：０．６２〜５モル／モルの分子比Ａ：Ｂ：Ｃが選択される工程、
   ｄ）１種または複数の有機溶媒が除去される工程、
   を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の混合物の製造方法。
8. ポリフェノールＣ用の溶媒としての、メタノールまたはエタノールの選択、ならびに、分子種ＡおよびＢ用の溶媒としての、クロロホルム、エタノールおよび／またはメタノールの選択を特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 分子混合物が、水性の生理的溶液に移されることを特徴とする、請求項６に記載のリポソームを製造するための、請求項７または８に記載の方法。
10. 請求項１〜６のいずれか一つに記載の混合物を含む医薬。
11. 酸化ストレスにより生じる細胞疾患の治療用医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一つに記載の混合物の使用。
12. 酸化ストレスにより生じる細胞疾患を治療するための、請求項１〜６のいずれか一つに記載の混合物。
13. 酸化ストレスにより生じる細胞疾患を治療するための、請求項１０に記載の医薬。

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