DE102009032658A1

DE102009032658A1 - Mischung amphipathischer Moleküle und Verfahren zur Zellmembranmodifikation durch Fusion

Info

Publication number: DE102009032658A1
Application number: DE102009032658A
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr. Hoffmann; Agnes Dr. Csiszár; Nils Hersch; Rudolf Prof. Dr. Merkel
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2011-01-13
Also published as: JP2012532151A; EP2451441A2; JP5775073B2; WO2011003406A2; US20120100077A1; WO2011003406A3

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Mischung amphipathischer Moleküle und ein Verfahren zur in vivo Zellmodifikation durch Membranfusion mit diesen Molekülen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Mischung amphipathischer Moleküle und ein Verfahren zur Zellmembranmodifikation durch Fusion mit diesen Molekülen.
Stand der Technik
Aus der Veröffentlichung von Simberg et al. (D. Simberg, Weisman S., Talmon, Y, Barenholz (2004) DOTAP (and Other Cationic Lipids): Chemistry Biophysics, and Transfection. Crit. Reviews in Therap. Drug Carr. Systems, 2004, 21, 257–317.) ist bekannt, dass kationische Lipide, wie z. B. DOTAP gemischt mit anderen Phospholipiden, wie z. B. DOPE (S. W. Hui, M. Langner, Y. Zhao, P. Ross, E. Hurley, and K. Chan (1996) The Role of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer. Biophysical Journal, 1996, 71, 590–599.) für das Einschleusen von DNA in Zellen (Transfektion) verwendet werden können. Der Weg, wie diese Partikel durch die Zellen aufgenommen wird, ist die Endozytose, wie aus Weijun et al. bekannt (Weijun Li and Francis C. Szoka Jr. 2007. Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Pharmaceutical Research, 24, 438–449.). Dieser Weg erweist sich als besonders ineffizient, da nur 1 bis 10% der in Liposomen eingeschlossenen DNA durch die Zellen aufgenommen werden.
Eine Modifizierung dieser Mischungen mit weiteren Proteinen, wie z. B. Transferrin ist aus Sakaguchi et al. bekannt (N. Sakaguchi, Ch. Kojima, A. Harada, K. Koiwai and K. Kono, 2008. The correlation between fusion capability and transfection activity in hybrid complexws of lipoplexes and pH-sensitive liposomes. Biomaterials 29, 4029–4036).
Eine weitere Modifikation einer Fusionsmischung erfolgt durch die Bindung viraler Komponenten auf der Oberfläche der Carrierpartikel. Nachteilig an diesem Verfahren ist der Aufwand und Kosten mit der die Komplexe hergestellt werden müssen.
Ein weiteres Fusionssystem ist aus Gopalakrishnan et al. (G. Gopalakrishnan, C. Danelon, P. Izewska, M. Prummer, P.-Y. Solinger, I. Geissbühler, D. Demurtas, J. Dubochet, and H. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5478–5483.) bekannt. Die Autoren beschreiben die Fusion einer lebenden Zellmembran mit einer Vesikelstruktur aus DMPE, DOTAP, DPPE-PEG2000 und Quantum-Nanodots. Der Nachteil des Verfahrens ist, dass biologisch nicht abbaubare Teilchen (Quantum-Nanodots) verwendet werden. Dadurch sind weitere medizinische oder pharmazeutische Verwendungen ausgeschlossen.
Somit sind die Verfahren nach dem Stand der Technik nachteilig ineffizient oder für die Zellen mit hohem Stress verbunden. Zusätzlich müssen sie für jeden Zelltyp optimiert werden und sind dadurch arbeits- und kostenintensiv.
Aufgabe und Lösung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Molekülmischung bereit zu stellen, die zu einer effizienten Fusion mit Zellmembranen auch in vivo führt. Ferner ist es die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur effizienten in vivo Zellmembranmodifikation durch Fusion mit einer Molekülmischung bereit zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verwendungsmöglichkeiten für die Molekülmischung bei der Modifikation von Zellen aufzuzeigen.
Die Aufgabe wird durch eine Mischung nach Anspruch 1 und durch das Verfahren zur in vivo Zell(membran-)modifikation und durch die auf diese Weise bereitgestellten Zellen gemäß Nebenansprüche gelöst. Das Verfahren basiert auf einer Membranfusion zwischen einer beliebigen Zellmembran mit einer erfindungsgemäßen Mischung amphipathischer Moleküle. Hierdurch können biologisch oder pharmazeutisch relevante Moleküle in das Zellinnere und/oder in die Zellmembran mittels Fusion eingebaut und/oder auch auf deren Oberfläche an sie angekoppelt werden. Die Mischung ist an Einzelzellen als auch vorteilhaft an Geweben oder Gewebeschnitten einsetzbar.
Die Fusionsmischung
Die Mischung amphipathischer Moleküle weist eine amphipathische Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung trägt, auf, und eine amphipathische Molekülsorte B, welche im hydrophilen und/oder im hydrophoben Bereich ein delokalisiertes Elektronensystem ausbildet.
Eine Molekülsorte B mit einem delokalisierten Elektronensystem umfasst daher erfindungsgemäß mindestens ein (oder auch mehrere) zyklisches Strukturmotiv, welches durch konjugierte Doppelbindungen und/oder freie Elektronenpaare und/oder unbesetzten p-Orbitale ausgebildet werden. Diese folgen der Hückel-Regel.
Besonders vorteilhaft weisen kovalent gebundene Nachbaratome der Molekülsorte B im delokalisierten Elektronensystem einen Elektronegativitätsunterschied (Δλ) von größer oder gleich 0,4 auf. Eine Molekülsorte B, die diesen Regeln genügt steigert die Fusionseffizienz.
Ferner ist es vorteilhaft, dass in der Molekülsorte B am hydrophoben oder hydrophilen Bereich eine Gruppe R gebunden ist, welche das delokalisierte Elektronensystem ausbildet.
In einer Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Mischung 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP) als Molekülsorte A.
Die Molekülsorte B wird in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung durch ein Phospholipid, an dem ein Fluoreszenzfarbstoff mit delokalisiertem Elektronensystem gebunden ist, ausgebildet. Es kann aber auch ein anderer Farbstoff, z. B. ein Azofarbstoff, an einem Phospholipid gebunden sein.
Als Phosholipid der Molekülsorte B ist in der Mischung insbesondere 1-Hexadecanoyl-2-Dodecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin oder 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, oder 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin vorgesehen.
Das delokalisierte Elektronensystem in der Molekülsorte B wird vorteilhaft durch eine Gruppe R ausgebildet, wie nachfolgend angegeben: 2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diazas-Indacene-3-Dodecanoyl) oder N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl) oder Lissamine Rhodamine B Sulfonyl oder (5-(Chlorosulfonyl)-2-(1H,2H,3H,5H,6H,7H,11H,12H,13H,15H,16H,17H-pyrido[3,2,1-ij]quinolizino[1',9':6,7,8]chromeno[2,3-f]quinolin-4-ium-9-yl)benzenesulfonate oder 7-Nitro-2-1,3-Benzoxadiazol-4-yl oder Carboxyfluorescein oder 1-Pyrensulfonyl.
Die angegebenen Grundbestandteile der Molekülsorte B, das heißt z. B. die Phospholipide und die genannten Gruppen R sind frei miteinander kombinierbar, das heißt, dass jeder der Farbstoffe an einem Phospholipid gebunden werden kann.
Die Fusionsmischung hat weit reichende Vorteile gegenüber den bisher bekannten Fusionsmischungen. So ist die Mischung bei allen (Säugetier-)Zelltypen, und somit ubiquitär anwendbar. Die Mischung ist dabei hocheffizient (> 50%), und es treten durch die Fusion auch keine Schädigungen an den Zellen auf. Die Zellen sind daher nach der Fusion uneingeschränkt teilungsfähig. Die Mischung ist dabei auch an Gewebeschnitten anwendbar. Weitere Vorteile werden durch die Funktionalisierung der Zellmembran mit spezifischen Molekülen erzielt, wie unten z. B. im Weg 3. angegeben.
In der erfindungsgemäßen Mischung kann eine weitere amphipathische Molekülsorte C als Helfermolekül vorgesehen sein.
Hierzu kann insbesondere 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DOPE) als Molekülsorte C vorliegen.
Das bevorzugte Verhältnis zwischen den Molekülsorten A, B und C liegt bei etwa 1:0,05–0,2:1 wt/wt.
Die Mischung umfasst bis zu 99% wt amphipathische Molekülsorte A, 40% wt amphipathische Molekülsorte B (mit Gruppe R), und bis zu 70% wt amphipathische Molekülsorte C.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden beliebige Mischungen in einem organischen Lösungsmittel gelöst und gut homogenisiert (z. B. Vortex, Ultraschall). Das Lösungsmittel wird entfernt, z. B. im Vakuum, und die getrocknete Mischung an Molekülsorten in einem wässrigen Puffer gelöst. Diese Mischung ist dauerhaft haltbar unter Kühlung.
Besonders bevorzugt liegen die Molekülsorten A, B und C als Lipide vor. Dann bilden diese bei der Aufnahme in einem wässrigen Puffer ein Liposom aus. Liposome sind bevorzugt, da in hervorragender Weise weitere Molekülsorten in und an die Zellmembran angeordnet werden können und auch in das Liposom eingeschlossene Moleküle während der Fusion des Liposoms mit der Zellmembran in das Zellinnere eingebracht werden können.
Ganz besonders bevorzugt liegt die Mischung daher als Liposom vor. Das erfindungsgemäße Liposom bewirkt besonders vorteilhaft, dass in diesem weitere Moleküle angeordnet werden können, die zu bevorzugten Modifikationen der Zellen führen können.
Es ist aber denkbar, Polymere an Stelle der Lipide als Molekülsorte A und/oder B und/oder C anzugeben.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur in vivo Zellmodifikation wird die ausgewählte Zelle mit seiner Zellmembran mit einer vorzugsweise gepufferten Mischung, bzw. Liposom, in Kontakt gebracht. Der Vorgang des in Kontaktbringens dauert vorteilhaft nur wenige Minuten, z. B. 1 bis 120, bevorzugt 10 bis 30 Minuten, während der Fusion. Einzelzellen werden vorteilhaft in kürzester Zeit nach dem Kontakt mit der Mischung, bzw. dem Liposom, hiermit fusioniert. Zellgewebe benötigen unter Umständen etwas länger, das heißt bis zu etwa 120 Minuten. Von der Fusion ist die Endozytose des Liposoms strikt zu unterscheiden.
Das Verfahren weist im Vergleich zum Stand der Technik und für die Kürze der Kontaktzeit einen hohen Anteil an mit der Mischung oder dem Liposom fusionierten Zellen auf. Die Effizienz liegt daher vorteilhaft über 50%.
Während des Verfahrens können verschiedene weitere Moleküle der erfindungsgemäßen Mischung zugeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erweist sich diesbezüglich als vielseitig und robust. Damit ist gemeint, dass eine Vielzahl an verschiedenen funktionalen Molekülsorten einzeln oder auch gleichzeitig beigemischt werden können und so zur gewünschten Modifikationen der Zelle und nicht nur der Membran führen. Da es sich um ein vivo-System handelt, bleibt die Zelle funktionstüchtig.
Beispielhaft kann eine amphipatische Molekülsorte D mit einer Funktionsgruppe im hydrophilen Bereich, insbesondere mit einer Chelatgruppe als Funktionsgruppe, der erfindungsgemäßen Mischung mit Molekülsorten A, B und gegebenenfalls C zugeführt werden.
Dann umfasst die Mischung z. B. die Molekülsorten A, B, D und optional C. Die Funktionsgruppe wird während der Fusion der Mischung, bzw. des Liposoms, mit der Zellmembran der Zelle auf der Oberfläche der Zellmembran angeordnet.
Mit diesem Ansatz kann die Oberfläche der Zellmembran spezifisch modifiziert und funktionalisiert werden. Die Funktionsgruppe ragt hierzu aus der Oberfläche der Zelle nach außen heraus und ist durch weitere chemische Gruppen gezielt modifizierbar. Dies kann in einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung zur erfolgreichen Krebstherapie führen.
Eine erfindungsgemäße Mischung umfasst daher zu diesem Zweck z. B. 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan als Molekülsorte A und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine als Molekülsorte B und Triethylammonium Salz/1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin als Molekülsorte C und 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-1-Carboxypentyl)IminodiaceticAcid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D, z. B. in einem Mischungsverhältnis von 1:0,1:1:0,002 wt/wt.
Die genannte, weitere Zellmodifikation erfolgt dann durch Zugabe von tumor necrosis factor (TNF)α, gebunden an ein 6 × Histidin repeat. Dies führt zur erfolgreichen Therapie von Krebs, wie unter Weg 3 (siehe unten) angegeben.
Es kann eine amphipathische Molekülsorte E der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet werden, insbesondere Bacteriorhodopsin oder Glycophorin A oder Integrin als Molekülsorte E.
Ferner kann eine auch nicht amphipathische, hydrophile Molekülsorte F in einer gepufferten Lösung einer vorab getrockneten Mischung zugeführt und während der Fusion in das Lumen der Zelle abgegeben werden. Mit Molekülsorte F sind insbesondere RNA, DNA, Ca²⁺, Peptid, Protein oder ein Arzneimittel, wie Azetylsalicylsäure, umfasst.
Eine nicht amphipathische, hydrophobe Molekülsorte G kann ebenfalls gleichzeitig der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet werden.
Hiermit sind insbesondere Cholesterin, Vitamin A, D, E und K oder Arzneimittel, wie Kortison, umfasst.
Alle Moleküslsorten A, B, C, D, gegebenenfalls G können in einem organischen Lösungsmittel gelöst und homogenisiert werden. Sodann können sie getrocknet, und in einem wässrigen Puffer gelöst und gelagert werden. Bei der Lösung im wässrigen Puffer können die genannten Molekülsorten E und/F zugemischt werden. Je nach Art der Molekülsorte können dabei vorteilhaft Liposome aus den Molekülsorten A, B, C, D, E, F, G gebildet werden.
Folgende Moleküle zur Herstellung einer Fusionsmischung zur Zellmembranmodifizierung durch Fusion mit der Membran können verwendet werden. Die nachfolgende Aufzählung ist nicht abschließend bzw. einschränkend.
Ausführungsbeispiele zu Molekülsorte A:
Die Kriterien zum Molekül A sind, dass (a) das Molekül einen hydrophilen Bereich mit mindestens einer oder mehreren positiven Ladungen aufweist, so dass die Gesamtladung des hydrophilen Teils des Moleküls positiv ist. Die Aufgabe dieses Moleküls ist es, die Fusionsmischung durch elektrostatische Kräfte in der Nähe der negativ geladenen Zellmembran zu bringen. (b) Es weist zudem einen hydrophoben Bereich auf, vorzugsweise C₁₀-C₃₀-Anteil mit oder ohne Doppelbindungen. Doppelbindungen bewirken vorteilhaft, dass die Membran des entstehenden Liposoms elastisch wird, so dass die Fusion des Liposoms mit der Zellmembran erleichtert wird. (c) Der Anteil der Molekülsorte A in der erfindungsgemäßen Mischung kann bis zu 99 wt/wt% betragen.
Geeignet sind Moleküle, wie z. B. 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (DOTAP), N-(2,3-Dioleyloxypropyl)-N,N,N-Trimetylammonium Chlorid (DOTMA), Dimetyl-Dioctadecyl Ammonium Bromid (DDAB), oder (1-[2-(Oleoyloxy)Ethyl]-2-Oleyl-3-(2-Hydroxyethyl)Imidazolinium Chloride (DOTIM).
Als ein erstes Beispiel wird DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (Chloride Salz)) genannt.
Ausführungsbeispiele zu Molekülsorte B:
Die Kriterien zur amphiphatischen Molekülsorte B als erfindungsgemäße Fusion induzierende Moleküle sind wie folgt. (a) Es muss einen hydrophilen Bereich mit oder vorzugsweise ohne Ladung haben. (b) und es muss einen hydrophoben Bereich, vorzugsweise C₁₀-C₃₀-Anteil mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A. (c) Das Molekül weist eine Gruppe (R), entweder im hydrophoben und/oder im hydrophilen Bereich auf, die ein delokalisiertes Elektronensystem aufweist. Damit ist ein zyklisches Strukturmotiv aus konjugierten Doppelbindungen und/oder freien Elektronenpaaren und/oder unbesetzten p-Orbitalen, gemeint.
Besonders bevorzugt ist in Gruppe R ein großer Elektronegativitätsunterschied zwischen kovalent verbundenen Nachbaratomen. Dieser kann besonders vorteilhaft mindestens 0,4 (Δχ ≥ 0,4) betragen. Dies dient einer erhöhten Polarisierbarkeit und beeinflusst die Fusion auf positive Weise. (d) Der Anteil der Fusion induzierenden Molekülsorte B in der Mischung kann bis zu 40 wt/wt% eingestellt werden.

Die nachfolgende Tabelle fasst einige relevante Gruppen R für die Moleküle der Sorte B zusammen. Tabelle 1: Zusammenfassung der Eigenschaften von Fusion induzierenden und nicht Fusion induzierenden Gruppen R gebunden an amphipatischen Molekülen B (z. B.: Phospholipiden, wie z. B. DHPE oder DOPE).

Fusion-induzierende Gruppe (R)	Zahl der Ringe	Zahl der delokalisierten Elektronen	Größtes Δχ	Kovalent gebunden an Lipid-	Fusionsqualität^a
BODIPY	3	10	F – B (4 – 2 = 2)	Kette von C₁₂HPC	1
BODIPY	3	10	F – B (4 – 2 = 2)	Kopf von DHPE
DiO perse	2 × 2	2 × 8	O – C (3,4 – 2,5 = 0,9)	-	1
LR	3 + 1	12 + 6	O – C (3,4 – 2,5 = 0,9)	Kopf an DHPE/DOPE	1
Texas-Red	7 + 1	14 + 6	O – C (3,4 – 2,5 = 0,9)	Kopf an DHPE	1
NBD	2	8	N – C (3 – 2,5 = 0,5)	Kopf an DOPE	2
Fluorescein	3 + 1	12 + 6	O – C (3,4 – 2,5 = 0,9)	Kopf an DHPE	3
Pyren	4	16	C – H (2,5 – 2,1 = 0,4)	Kette an C₁₀HPC	5
Pyren	4	16	C – H (2,5 – 2,1 = 0,4)	Kopf an DOPE	5 (toxisch)
capBiotin	2	0	N – C (3 – 2,5 = 0,5)	Kopf an DOPE	6
Inositol	1	0	O – C (3,4 – 2,5 = 0,9)		6 (toxisch)
PEG(2000)	0	0	O – C (3,4 – 2,5 = 0,9)	Kopf an DOPE	6 (toxisch)

^a 1-sehr gut, 2-gut, 3-befriedigend, 4-ausreichend, 5-funktioniert kaum, 6-funktioniert nicht

Erstes Beispiel zu Molekülsorte B (β-BODIPY-C₁₂-HPC):
2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoyl) ist β-BODIPY und stellt die Gruppe R dar. Diese Gruppe R ist gebunden an 1-Hexadecanoyl-2-Dodecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (C₁₂-HPC). Beide zusammen ergeben die folgende Strukturformel:
Zweites Beispiel zu Molekülsorte B (BODIPY FL DHPE):
N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl) ist BODIPY-FL. Diese Gruppe R ist gebunden an DHPE (1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Triethylammonium Salz)). Beide zusammen ergeben nachfolgende Strukturformel:
Drittes Beispiel zu Molekülsorte B (’DiO’):
DiOC₁₈(3)3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate. Dieses Molekül ist kein lipidgebundener Farbstoff wie die ersten beiden Moleküle B, sondern ein amphiphatisches Molekül per se der Strukturformel:
Viertes Beispiel zu Molekülsorte B (LR-DOPE):
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl ist Gruppe R. Diese ist gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE) als amphiphatisches Molekül. Beides ergibt die Strukturformel:
Fünftes Ausführungsbeispiel zu Molekülsorte B (Texas Red^®-DHPE):
Texas Red ist (5-(Chlorosulfonyl)-2-(1H,2H,3H,5H,6H,7H,11H,12H,13H,15H,16H,17H-pyrido[3,2,1-ij]quinolizino[1',9':6,7,8]chromeno[2,3-f]quinolin-4-ium-9-yl)benzenesulfonate also Gruppe R. Dieses ist gebunden an 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine und ergibt gemeinsam die Strukturformel:
Sechstes Beispiel zu Molekülsorte B (NBD-DOPE):
NBD ist (7-Nitro-2-1,3-Benzoxadiazol-4-yl) also Gruppe R. Dieses ist gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine mit Strukturformel:
Siebtes Beispiel zu Molekülsorte B (Fluorescein-DOPE):
Carboxyfluorescein ist Gruppe R und gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine mit der Strukturformel:
Achtes Beispiel zu Molekülsorte B (Pyrene-DOPE)
1-Pyrenesulfonyl ist Gruppe R und gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine mit der Strukturformel:
Neuntes Beispiel zu Molekülsorte B (β-py-C₁₀-HPC)
Pyrenedecanoyl ist Gruppe R gebunden an 1-Hexadecanoyl-2-sn-Glycero-3-Phosphocholine mit der Strukturformel:
Alle Gruppen R weisen eine delokalisierte Elektronenstruktur im Sinne der Erfindung auf. Auf Grund der Delokalisierung liegt die Gruppe R in Molekülsorte B häufig als Farbstoff vor.
Es ist denkbar, dass die Gruppe R selbst durch einen hydrophoben Teil eines amphipathischen Moleküls und durch delokalisierte Doppelbindungen gebildet wird.
Wie der Tabelle 1 zusätzlich zu entnehmen ist, ist die Fusionsqualität umso besser, je stärker die Unterschiede unmittelbar benachbarter Atome bezüglich ihrer Elektronegativität ist.
Nicht funktionieren tun hingegen nachfolgende Moleküle, wie z. B. capBio-DOPE:
cap Biotinyl wäre Gruppe R gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine mit der Strukturformel:
Ebenfalls nicht funktionieren tut P1: L-α-Phosphatidylinositol (Natrium Salz)
und
Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000 wäre Gruppe R gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (PEG2000-DOPE) mit der Strukturformel:
Den drei letztgenannten Molekülen fehlt es an einer Delokalisierung der Elektronenstruktur. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäße Mischung diese aufweisen muss.
Wie beschreiben ist es denkbar, die positiven Eigenschaften der Molekülsorte A in Bezug auf die positive Ladung und die der Molekülsorte B in Bezug auf das delokalisierte Elektronensystem, bzw. in Bezug auf die Unterschiede in der Elektronnegativität in einem chemisch synthetisierten Molekül zu vereinigen. Dieses, den Erfindern bisher nicht bekannte Molekül, soll daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung sein.
Optional und zur weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Mischung sind folgende weitere Moleküle zur Herstellung einer Fusionsmischung bzw. für die Zellmembranmodifizierung möglich.
Ausführungsbeispiele zu Molekülsorte C als Helfermolekül
Die Kriterien zum Helfermolekül/Trägermolekül C sind: (a) Das Molekül muss einen hydrophilen Bereich sowie (b) einen hydrophoben Bereich (insbesondere C₁₀-C₃₀) mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A und/oder B. (c) Beide Bereiche sollen einen neutralen Charakter aufweisen, um die große Ladungsdichte und die abstoßenden Kräfte zwischen positiv geladenen Molekülen von Molekülsorte A zu neutralisieren. Dieser Effekt führt zur Stabilisierung des Systems. (d) Der Anteil des Trägermoleküls kann bis maximal 70% wt/wt eingestellt werden. Geeignet sind Moleküle, wie z. B. Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylcholine (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dimiristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dielaidoylsn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Diphytanolsn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dilinoleoylsn-Glycero-3-Phosphoethanolamine oder 1,2-Dioleoylsn-Glycero-3-Phosphatidylcholine).
Als ein erstes Beispiel wird 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE) genannt.
Vorteilhaft ist es möglich, die Molekülsorten A, B und C als Lipide oder als Polymere auszubilden. Im Fall von amphipathischen Lipiden werden bei der Herstellung der fertig einsetzbaren Mischung Liposomen gebildet.
Das Gewichtsmischungsverhältnis (wt/wt) liegt vorteilhaft bei 1:0,05–0,2:1 zwischen den Molekülsorten A, B und C.
Molekülsorte D (amphipatisch mit Funktionsgruppe)
Die Kriterien zur amphiphatischen Molekülsorte D sind: (a) Das Molekül muss einen hydrophilen Bereich sowie (b) einen hydrophoben Bereich (insbesondere mit C₁₀-C₃₀) mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A, B, oder C. (c) Das Molekül muss eine Funktionsgruppe im hydrophilen Bereich aufweisen, die weitere chemische Bindungen auf der Zelloberfläche nach der Fusion ermöglichen.
Geeignet sind Moleküle, wie z. B. langkettige Fettsäuren und Alkohole, Chelat-Komplex modifizierte Lipide, z. B. 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-1-Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickel salt), Biotin modifizierte Lipide (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-cap-Biotin), oder PEG modifizierte Lipide (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000] (Ammonium Salz) oder auch Arzneimittel.
Ein erstes Ausführungsbeispiel hierzu ist (Iminodiacetic Acid)succinyl (Nickel Salz) als Funktionsgruppe, hier in Form einer Chelatgruppe, gebunden an 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-5-Amino-1-carboxypentyl. Dies ergibt die Strukturformel:
Molekülsorte E (amphipatisch):
Die Kriterien zur Molekülsorte E sind ferner: (a) Sie sind amphiphatisch. (b) Dies können Membranproteine, Peptide, Oberflächenrezeptoren, wie z. B. Bacteriorhodopsin, Integrin, Glycophorin A und viele andere sein. (c) Molekülsorte E kann wie die übrigen Bestandteile A, B, C, D künstlich synthetisiert oder von Zellen gewonnen werden. (d) Modifikation dieser Moleküle, wie z. B. Fluoreszenz oder Radioaktive Markierung können vorhanden sein. (e) Molekülsorte E kann der Mischung bis zu 20% wt/wt zugefügt werden.
Die amphiphatische Molekülsorten E wird bei der Nutzung von Lipiden als Sorte A–D mit in die Liposommembran eingebaut. Nicht-amphiphatische Molekülsorten E werden bei Nutzung von Lipiden als Sorte A–D auf der Liposommembran gebunden eingebaut.
Molekülsorte F (wasserlöslich oder hydrophil)
Die Kriterien zur Molekülsorte F sind: (a) Die Moleküle sollen wasserlöslich sein. Folgende Beispiele sind gegeben: Ionen, Peptide, Proteine, Arzneimittel, DNA oder RNA.
Molekülsorte F wird bei der Nutzung von Lipiden als Molekülsorten in das Lumen des Liposoms eingebaut.
Molekülsorte G (nicht wasserlöslich oder hydrophob)
Die Kriterien zur Molekülsorte G sind: (a) Die Moleküle weisen hydrophoben Charakter auf und sind in organischem Lösungsmittel gut löslich. Folgende Beispiele sind gegeben: Cholesterol, Vitamin B. Zusammen mit den Molekülsorten A, B, C, und D werden diese in einem organischen Lösungsmittel gemischt.
Das Fusionsverfahren
Die Bestandteile der erfindungsgemäßen Mischung mit den Molekülsorten A und B werden zusammen mit den optional weiteren, hinzu gemischten Molekülen C, gegebenenfalls D und gegebenenfalls G gleichzeitig in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Chloroform, Methanol, Ethanol, Propanol, Hexan, Heptan oder einer Mischung hieraus, im gewünschten Gewichtsverhältnis aufgenommen. Nach der Homogenisierung im organischen Lösungsmittel soll das organische Lösungsmittel entfernt werden.
Die eingetrocknete Mischung wird in einer wässrigen Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert um 7, aufgenommen, und wieder homogenisiert. Dann bildet sich vorteilhaft ein Liposom aus, das die zugefügten Molekülsorten umfasst. Dabei können Moleküle der Molekülsorte E und F ebenfalls zugemischt werden. In dieser Form liegen die Mischungen haltbar vor, beispielsweise bei 4°C für mindestens einen Monat. Diese Schritte dienen zur Vorbereitung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Das eigentliche Verfahren sieht vor, dass die Fusionsmischung mit einem Zellmedium z. B. 1:100 (Mischung: Zellmedium v/v) verdünnt, erneut homogenisiert und auf die Zellen gegeben wird.
Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Fusionsmischung zu lebenden Zellen wird vorzugsweise in vivo die Fusion erzeugt. Hierzu ist es ausreichend, dass die Zellen mit der Mischung etwa 1 bis 60 Minuten, bei Gewebeproben z. B. 60 bis 120 Minuten in Kontakt gebracht werden. Ein Waschschritt der Zellen sollte dann eingefügt werden.
Das Verfahren ist vorteilhaft durch eine besonders hohe Fusionseffizienz von mindestens 50%, vorzugsweise mehr als 70%, insbesondere mehr als 90%, gekennzeichnet.
Die Membranfusion ist besonders vorteilhaft nicht auf einzelne Zelltypen beschränkt, sondern stellt einen fast universellen Mechanismus dar, wie in Tabelle 2 darlegt. Sogar dichte Gewebeproben können durch einer verlängerten Inkubationszeit erfolgreich behandelt werden. Das Verfahren ist daher besonders vorteilhaft sehr vielseitig verwendbar.
Bei der Fusion der erfindungsgemäßen Mischung mit einer Zellmembran werden die vesikulären Volumina in Form von Molekülsorte F in die Zelle eingeschleust, was vorteilhaft zur Einbringung von löslichen Molekülen, Ionen, Proteinen oder DNA in das Zytoplasma der Zelle genutzt werden kann. Molekülsorte F ist daher im eigentlichen Sinn kein Bestandteil der Mischung amphipathischer Molekülsorten.
Während des Fusionsverfahrens können die biologisch oder die pharmazeutisch relevanten Molekülsorten D, E, oder G in intakte Zellmembranen inkorporiert werden. Die in der Zellmembran eingebrachten reaktiven Gruppen der Molekülsorte D können z. B. für Kopplungsreaktionen eingesetzt werden. Es können zusätzliche membraneigene Moleküle der Sorte E in die Zellmembran eingebaut werden, wie Peptide oder Proteine.
Die erfindungsgemäße Mischung und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichen Wege zur Durchführung von Analysen auf einer Vielzahl von Gebieten der Grundlagenforschung, wie etwa der Diffusionsanalyse von Molekülen eingebaut in intakten Zellmembranen, der Charakterisierung von Lipidmikro- und nanodomänen, in der Literatur auch als Lipid rafts bekannt, oder der Untersuchung der Regulation sowie der Transportwege von Membranmolekülen in der Zelle.
Gleichzeitig kann das System, beispielsweise zur medizinisch hochrelevanten, gezielten Markierung bestimmter Zelltypen z. B. zur Markierung von Krebszellen, zur Unterstützung von Wundverschluss mittels Induktion von Zellwanderung, zur Ausbildung von Zell-Zellkontakten, von Zellausläufern oder der Proliferationsinduktion oder Zell-Zellfusion genutzt werden.
Bestimmte erfindungsgemäße amphiphatische Mischungen der Molekülsorten A, B, (C), D mit TNFα können daher als Medikamente und gleichzeitig bei der gezielten Markierung und Behandlung von Krebszellen eingesetzt werden.

Eine Übersicht einiger Verfahren zur Zellmembranmodifikation zeigt Tabelle 2. Tabelle2: Zusammenfassung von Zellmodifizierungsexperimenten mittels der Fusionsmischung.

Nr	Fusionsmischung				Methode	Zelltyp	Anwendung
Nr	Sorte C	Sorte A	Sorte B^a	Sorte D–G	Methode	Zelltyp	Anwendung
1	DOPE	DOTAP	LR-DOPE	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
2	DOPE	DOTAP	Texas-Red-DHPE	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
3	DOPE	DOTAP	NBD-DOPE	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
4	DOPE	DOTAP	BODIP Y FL DHPE	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
5	DOPE	DOTAP	B-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
6	DOPE	DOTAP	Fluorescein-DHPE	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
7	DOPE	DOTAP	DiO	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
8	DOPE	DOTAP	Pyren-DOPE	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
9	DOPE	DOTAP	β-Pyren C₁₀-HPC	-	1	HEK	Zellmembranfärbung
10	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	PI^d	2	HEK	PI Funktionsuntersuchungen
11	DOPE	DOTAP	LR-DHPE	CaCl₂	3	HEK	Drug delivery
12	DOPE	DOTAP	BODIP Y FL DHPE	BR-TRITC^b	4	HEK	Prot. Funktionsuntersuchungen
13	DOPE	DOTAP	BODIP Y FL DHPE	GPA-TRITC^b	4	HEK	Prot. Funktionsuntersuchungen
14	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	DOGS-NTA^c	2	HEK	His-Tag-Bindung
15	DOPE	DOTAP	LR-DOPE	DOGS-NTA^c	2	HEK	Aktivierung der Makroph. durch TNF-Bindung
16	DOPE	DOTAP	BODIP Y FL-DHPE	DOGS-NTA^c	2	HEK	Aktivierung der Makroph. durch TNF-Bindung
17	DOPE	DOTAP	LR-DOPE	-	1	Myofibroblasten	Zellmembranfärbung
18	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	Myofibroblasten	Zellmembranfärbung
19	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	DOGS-NTA^c	2	Myofibroblasten	His-Tag-Bindung
20	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	DOGS-NTA^c	2	Myofibroblasten	Aktivierung der Makroph. durch TNF-Bindung
21	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	BR-TRITC^b	4	Myofibroblasten	Prot. Funktionsuntersuchungen
22	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	GPA-TRITC^b	4	Myofibroblasten	Prot. Funktionsuntersuchungen
23	DOPE	DOTAP	LR-DOPE	-	1	Keratinozyten	Zellmembranfärbung
24	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	Keratinozyten	Zellmembranfärbung
25	DOPE	DOTAP	LR-DOPE	DOGS-NTA^c	2	Keratinozyten	His-Tag-Bindung
26	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	DOGS-NTA^c	2	Keratinozyten	His-Tag-Bindung
27	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	R37	Zellmembranfärbung
28	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	DOGS-NTA^c	2f	R37	His-Tag-Bindung
29	DOPE	DOTAP	LRDHPE	-	1	BSMC	Zellmembranfärbung
30	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	BSMC	Zellmembranfärbung
31	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	BR-TRITC^b	4	BSMC	Prot. Funktionsuntersuchungen
32	DOPE	DOTAP	LR-DHPE	-	1	ESMC	Zellmembranfärbung
33	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	ESMC	Zellmembranfärbung
34	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	BR-TRITC^b	4	ESMC	Prot. Funktionsuntersuchungen
35	DOPE	DOTAP	LR-DHPE	-	1	h. Fibroblasten	Zellmembranfärbung
36	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	h. Fibroblasten	Zellmembranfärbung
37	DOPE	DOTAP	LR- DHPE	-	1	Makrophagen	Zellmembranfärbung
38	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂- HPC	-	1	Makrophagen	Zellmembranfärbung
39	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	BR-TRITC^b	4	Makrophagen	Prot. Funktionsuntersuchungen
40	DOPE	DOTAP	LR-DHPE	-	1	Neuronen	Zellmembranfärbung
41	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	-	1	Neuronen	Zellmembranfärbung
42	DOPE	DOTAP	β-BODIP Y C₁₂-HPC	BR-TRITC^b	4	Neuronen	Prot. Funktionsuntersuchungen
43	DOPE	DOTAP	BODIP Y FL-DHPE		1	Herzbeutel	Zellmembranfärbung

^a Molekülsorte C1 Molekülsorte A Molekülsorte B = 1/1/0,1 wt/wt in jedem durchgeführten Experiment.
^b für die genaue Zusammensetzung siehe Weg 2 unten.
^c für die genaue Zusammensetzung siehe Weg 3. unten.
^d DOPE/DOTAP/β-BODIPY C₁₂-HPC/PI = 1/1/0,001/0,1

Abkürzungen zu Tabelle 2:

Methode 1: Zellmembranfärbung; Methode 2: Zelloberflächenmodifizierung; Methode 3: Zelllumenmodifizierung; Methode 4: Proteinrekonstruktion in der Zellmembran
Zu Molekülsorte C: DOPE = 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Zu Molekülsorte A: DOTAP = 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-(Trimethylammonium-Propane (Chloride salt)
Zu Molekülsorte B: β-BODIPY C₁₂-HPC: 2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoyl)-1-Hexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine β-Pyrene C₁₀-HPC: 1-Hexadecanoyl-2-(1-Pyrenedecanoyl)-sn-Glycero-3-Phosphocholine BODIPY FL DHPE: N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, (Triethylammonium salt) DiO: DiOC₁₈(3)3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate Fluorescein-DHPE: 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Carboxyfluorescein) (Ammonium salt) LR-DHPE: Lissamin Rhodamine B 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, (Triethylammonium salt) LR-DOPE: Lissamin Rhodamine B 1,2-Diolenoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, (Triethylammonium salt) NBD-DOPE: N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-1,2-Diolenoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Triethylammonium salt) Pyrene-DOPE: 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(1-pyrenesulfonyl) (Ammonium salt) Texas Red-DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Triethylammonium salt)
Zu Molekülsorten D–G: BR-TRITC: Bacteriorhodopsin aus Halobacterium salinarum gelabeled mit Tetramethylrhodamin isothiocyanat gemischte Isomere als Molekülsorte E DOGS-NTA: 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-1-Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D. GPA-TRITC: Glycophorin A (MNS blond group) gelabeled mit Tetramethylrhodamine isothiocyanate mixed isomers als Molekülsorte E. PI: L-α-Phosphatidyl-Inositol (Sodium salt) als Molekülsorte E. CaCl₂ × H₂O als Molekülsorte F.
Zelltypen und Zelllinien: BSMC: Bronchial smooth muscle cells ESMC: Embryonal smooth muscle cells HEK: Human Embryonic Kidney, HEK293 h. Fibroblasten: human fibroblasts Keratinozyten: human keratinocytes Makrophagen: human makrophage Myofibroblasten: cardiac fibroblasts of rat Neuronen: embryonal cortical neurons of rat R37: breast cancer cell line Herzbeutel: rat embryonic heart bag
Sonstiges zu Tabelle 2: TNF: TNFα-His-Tag: Tumor Necrosis Factor linked with 6 × histidin repeat

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass dies zu einer Beschränkung der Erfindung führen soll.
Es zeigen:
1: Schematische Darstellung von drei Einsatzmöglichkeiten des Fusionsreagenzes.
2: Mikroskopische Aufnahmen von in Fluo-4 AM vorinkubierten HEK293 Zellen nach Zugabe der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/LR-DHPE (Molekülsorte B)= 1/1/0,1 wt/wt) gefüllt mit 1 mM CaCl₂ (Molekülsorte F) Lösung. Die rot markierte Lipidmischung (Molekülsorten A–C) (LissRhod Kanal) wurde in die Zellmembran eingebaut während der grüne Ca²⁺-Indikator (Fluo-4 Kanal) auf eine erhöhte Ca¹⁺-Konzentration (Molekülsorte F) im Zellinneren hinweist. (Massstab = 20 μm).
3: Mikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten 10 Minuten nach Zugabe der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/β-Bodipy-C₁₂HPC (Molekülsorte B)/BR-TRITC (Molekülsorte E) = 1/1/0,1/0,0005 wt/wt). Die grün markierte Lipidmischung (Molekülsorte A–C) (β-Bodipy Kanal) sowie das rot markierte Kanalprotein (Molekülsorte E) (TRITC Kanal) wurden in die Zellmembran eingebaut. (Massstab = 20 μm)
4: Mikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten 4 Stunden nach dem Abwaschen der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/β-Bodipy-C₁₂HPC (Molekülsorte B)/BR-TRITC (Molekülsorte E) = 1/1/0,1/0,0005 wt/wt). Die grün markierte Lipidmischung (Molekülsorte A–C) (β-Bodipy Kanal), als auch das rot markierte Kanalprotein (Molekülsorte E) (TRITC Kanal) wurden in der Zellmembran eingebaut. Die Trennung der zwei Farbstoffe in Abhängigkeit der Zeit lässt auf einen unterschiedlichen Transportablauf der Membranlipide und Proteine von der Zellmembran in das Zellinnere schließen. (Massstab = 20 μm).
5: Mikroskopische Aufnahmen von HEK293 Zellen 10 Minuten nach Zugabe der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/Bodipy FL-DHPE (Molekülsorte B)/DOGS-NTA (Molekülsorte D) = 1/1/0,1/0,002 wt/wt). (Massstab = 50 μm)
6: Mikroskopische Aufnahme von TNFα-His-Tag behandelten HEK293 Zellen mit eingebautem DOGS-NTA (Molekülsorte D) in der Zellmembran und Makrophagen und B: Mikroskopische Aufnahme von TNFα-His-Tag behandelten HEK293 Zellen ohne DOGS-NTA (Molekülsorte D) in der Zellmembran und Makrophagen. (Massstab = 50 μm)
7: Mikroskopische Aufnahme von primärem Herzbeutelgewebe (Perikard) aus embryonalen Ratten (Tag 19) nach einer einstündigen Behandlung mit der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/Bodipy FL-DHPE (Molekülsorte B) = 1/1/0,1 wt/wt). Auf der Aufnahme ist deutlich erkennbar, dass die Fusionsmischung aus Molekülsorten A–C bis etwa 3–4 Zellschichten tief in die Gewebe eingedrungen ist und Membranfusion induziert hat. (Massstab = 70 μm).
1 zeigt drei erfindungsgemäße Wege der Zellmembranmodifizierung. Jeder Weg wird in einem weiteren Ausführungsbeispiel ausgeführt.
Weg 1 aus Fig. 1: Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A–C und Einbringung von Ca²⁺ Ionen als Sorte F in das Lumen von Zellen.
Human Embryonic Kidney (HEK293) (DSMZ Deutschland) Zellen wurden in DMEM Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Zelldichte von 30.000 Zellen pro Zellkulturschale (Ø 3,5 cm) in Fluo-4 AM-Ca²⁺-Indikator (Invitrogen, Eugene, OR, USA) in (1 μg/ml) 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit DMEM Medium gewaschen und mit einer erfindungsgemäßen Fusionsmischung 30 Minuten inkubiert.
Die erfindungsgemäße Fusionsmischung besteht aus einer Lipidmischung von 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP: Molekülsorte A) (beide Avanti Polar Lipids Inc., Alabama, AL, USA), Lissamine Rhodamine B 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (LR-DHPE: Molekülsorte B mit Gruppe R) (Invitrogen) im Gewichtsverhältnis von DOPE/DOTAP/LR-DHPE (1/1/0,1 wt/wt).
Die Lipidkomponenten wurden zunächst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES-Puffer) (VWR) und 1 mM CaCl₂ als Molekülsorte F (VWR) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80–100 W) 20 Minuten bei Raumtemperatur homogenisiert.
Die Mischung liegt somit als Liposom vor. Diese Mischung ist etwa 1 Monat lang im Kühlschrank bei 4°C haltbar und nach einem wiederholten Homogenisierungsschritt wieder verwendbar.
5 μl dieser Fusionsmischung werden 100-fach mit DMEM Medium verdünnt und vor der Zugabe zu einer Zellkulturschale mit Ca²⁺-Indikator Fluo-4 AM (Invitrogen) inkubierten HEK293-Zellen erneut 5 bis 10 Minuten mittels Ultraschall homogenisiert.
Die Zellen werden im erfindungsgemäßen Fusionsverfahren 10 bis 30 Minuten mit der erfindungsgemäßen Mischung bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Danach wurden die Zellen mit DMEM Medium gewaschen und die Fusion des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluoreszenzmikroskop (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) überprüft (2).
Nach erfolgreicher Membranfusion sind die rot fluoreszierenden Lipidmoleküle der Molekülsorte B in die Zellmembran der HEK293-Zellen eingebaut. Hierdurch ist die Zellmembran unter einem Fluoreszenz Mikroskop gut erkennbar (siehe 2 – LissRhod Kanal).
Einen Beweis der Abgabe des Vesikellumens in das Zellinnere, und dadurch auch der Molekülsorte F, liefert die verstärkte grüne Fluoreszenzintensität des Ca²⁺-Indikators Fluo4 AM, der durch die erhöhte Ca²⁺ Konzentration im Zellvolumen nach der Membranfusion hervorgerufen wurde (2 – Fluo-4 Kanal).
Die Aufnahmen und zugehörigen Zählungen zeigen eine Fusionseffizienz oberhalb von 80%, das heißt mehr als 80% aller Zellen fusionierten mit der erfindungsgemäßen Mischung/Liposom.
Als Kontrolle wurden HEK293-Zellen identisch behandelt, nur dass das Vesikellumen mit 20 mM HEPES anstatt mit 1 mM CaCl₂ Puffer gefüllt wurde. In diesem Fall zeigte der Ca²⁺-Indikator eine deutlich geringere Ca²⁺ Konzentration in den Zellen (nicht gezeigt).
Weg 2 aus Fig. 1: Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A–C und Einbringung von Bacteriorhodopsin (Molekülsorte E) in die Zellmembran:
Kardiale Fibroblasten wurden aus embryonalen (Tag 19) Rattenherzen isoliert und in F10 Ham's Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Zellkulturschale (Ø 3,5 cm) bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Über einen Zeitraum von 6 Tagen differenzierten die kardialen Fibroblasten zu Myofibroblasten und wurden beim nachfolgenden erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.
Die Myofibroblasten wurden in einer Fusionsmischung von 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A) (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA) und 2-(4,4-difluoro-5-methyl-4-borg-3a,4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (β-BODIPY C₁₂-HPC: Molekülsorte B von Invitrogen (Eugene, OR, USA) im Gewichtsverhältnis 1/1/0,1 in einer Endkonzentration von 20 μg Lipid/ml Medium und Fluoreszenz markierten Kanalprotein (Bacteriorhodopsin von Halobacterium Salinarum(Sigma Aldrich)-Tetramethylrhodamine Isothiocyanat (Sigma Aldrich)) (BR-TRITC: Molekülsorte E) 0,4 ng/ml) inkubiert.
Die erfindungsgemäße Mischung wurde auf folgende Weise angefertigt. Die Lipidkomponenten (Molekülsorte A–C) wurden in Chloroform (VWR) homogen gemischt. Nach der Mischung wurde die Lösung im Vakuum für 30–60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure (VWR)) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80–100 W) 20 Minuten homogenisiert. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die Mischung liegt somit als Liposom vor.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden mit 0,7 μl einer BR-TRITC Lösung (Molekülsorte E) (0,06 mg/ml HEPES) 60 Minuten inkubiert, und dabei vorsichtig gerührt. Die Kanalproteine E werden in die Lipiddoppelschichten des Liposom aufgenommen.
Die Lösung wurde 100-fach mit F10 Ham's Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zu einer Zellkulturschale mit Myofibroblasten ein weiteres Mal für 1 bis 2 Minuten mit Ultraschall (80–100 W) behandelt.
Die Zellen wurden erfindungsgemäß mit der Fusionsmischung 10 bis 20 Minuten inkubiert, dann mit F10 Ham's Medium gewaschen und analysiert.
Nach dem Waschen konnten etwa 80 bis 100% der Zellen Cytoplasmamembranen der Zellen im Fluoreszenzmikroskop (grün für Lipide, rot für Proteine) (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) nachgewiesen werden, was einen erfolgreichen Membraneinbau sowohl der Lipidmischung (Molekülsorte A–C) als auch der Proteinmoleküle (Molekülsorte E) anzeigt (3 und 4).
Weg 3 aus Fig. 1: Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A–D zur Proteinbindung auf der Zellmembranoberfläche, Grundzüge einer neuartigen Tumorbehandlung und eines Medikaments hierfür.
Human Embryonic Kidney (HEK 293) (DSMZ, Deutschland) Zellen wurden in RPMI Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Zelldichte von 40.000 Zellen pro Zellkulturschale (Ø 3,5 cm) bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert und bei einer Konfluenzdichte von etwa 90% in die nachfolgenden Schritte eingesetzt. HEK293-Zellen wurden direkt in einer Fusionsmischung, umfassend 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A), (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA), N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salz (Bodipy FL-DHPE: Molekülsorte B) (Invitrogen, Eugene, OR, USA) und 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-1-Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickel Salz) (DOGS-NTA: Molekülsorte D Avanti Polar Lipids Inc.) im Gewichtsverhältnis von DOPE/DOTAP/Bodipy FL-DHPE/DOGS-NTA (1/1/0,1/0,002 wt/wt) in einer Endkonzentration von 20 μg Lipid/ml RPMI Medium (Sigma Aldrich) 10 bis 20 Minuten lang bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
Die Fusionsmischung wurde auf folgende Weise vorbereitet. Die Lipidkomponenten (Molekülsorten A bis D) wurden erst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES-Puffer) (VWR) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80–100 W) 20 Minuten homogenisiert.
Die Mischung liegt somit als Liposom vor. Diese Mischung ist etwa 1 Monat lang im Kühlschrank bei 4°C haltbar und nach einem wiederholten Homogenisierungsschritt wieder verwendbar.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden 100-fach mit RPMI Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zu einer Zellkulturschale mit HEK293-Zellen erneut 5 bis 10 Minuten mittels Ultraschall (80–100 W) homogenisiert. Alle Preparationsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
Anschließend wurden die Zellen mit RPMI Medium (Sigma Aldrich) gewaschen und die Fusion des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluoreszenzmikroskop (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) überprüft.
5 zeigt eine derartige Überprüfung und weist auf eine Fusionseffizienz oberhalb von 80% hin. Diese Effizienz wurde mit Hilfe der mikroskopischen Aufnahmen durch Zählen festgestellt.
Um eine Bindung zwischen der reaktiven Kopfgruppe des verwendeten DOGS-NTA als Molekülsorte D mit einem Reaktionspartner zu ermöglichen, wurden die Zellen in einer Lösung von Tumor Necrosis Faktor-α gebunden an ein 6 × histidin-repeat (TNFα-His-Tag) (ProSpec, Rehovot, Israel) in der Konzentration von 1 bis 5 ng/ml RPMI Medium etwa 20 Minuten, bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
Reste des Proteins wurden durch einen dreimaligen Waschprozesses mit RPMI Medium aus der Suspension entfernt. TNFα dient im Körper als Makrophagen aktivierender Faktor und stellt für das Immunsystem den Hauptfaktor in der Erkennung und Bekämpfung von Krebszellen dar. Um die Funktionalität des Systems zu überprüfen, wurden ausdifferenzierte Makrophagen verwendet. Humane Monocyten wurden aus Blut mittel Leukoseptsystem (Greiner bio-one, Kremsmünster, AU) und Biocoll Separationsmedium (Biochrom, Cambridge, UK) gewonnen. Nach der Zentrifugation mit 1000 g, 10 Minuten wurden Monocyten aus der gebildeten Interphase geerntet und nachträglich mit Phosphat-Puffer (PBS von Sigma Aldrich) gewaschen. Monocyten wurden in RPMI Medium (Sigma Aldrich) aufgenommen und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach 2 Tagen wurde 0,1 ng/ml Granulocyten Macrophagen Kolonie Stimulationsfaktor (G-MCF von Sigma Aldrich) zu den Monocyten gegeben. Nach weiteren 3 Tagen differenzierten sich inaktive Makrophagen aus Monocyten.
Die so gewonnenen Makrophagen wurden anschließend auf einem HEK293-Zell Rasen ausplattiert, die mittels der Fusion und nachfolgender Inkubation mit TNFα-His-Tag das Erkennungssignal für Makrophagen tragen sollten. Bei Erkennung sollte die zelluläre Immunant-Wort in Makrophagen induziert werden und HEK293-Zellen lysiert werden. Als Kontrolle wurden HEK-Zellen identisch behandelt, nur dass das amphipatische Molekül mit reaktiver Kopfgruppe von der Molekülsorte D (DOGS-NTA) aus dem Fusionsansatz herausgelassen wurde. Beide Ansätze wurden für 24 Stunden inkubiert und nachfolgend lichtmikroskopisch analysiert (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena). zeigt die Erkennung und Lyse von HEK293-Zellen (Bildung von Plaques) nur auf den mit DOGS-NTA (Molekülsorte D) im Fusionsansatz inkubierten Zellen. Dieses Beispiel zeigt, dass mittels Membranfusion gezielt Zelltypen markiert und beispielhaft für das Immunsystem sichtbar gemacht werden können.
Weg 4: Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A–C auf Gewebeproben
Mit der Fusionsmischung können nicht nur einzelne Sängerzellen, sondern auch Zellen im Gewebe und in Gewebeschnitten zur Fusion gebracht werden. Es wurde primäres Herzbeutelgewebe (Perikard) aus embryonalen Ratten (Tag 19) isoliert und in F10 Ham's Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) auf einer 3,5 cm Zellkulturschale mit einer Fusionsmischung von 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A), (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA) und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salz (Bodipy FL-DHPE: Molekülsorte B) (Invitrogen, Eugene, OR, USA) in einem Gewichtsverhältnis von 1/1/0.1 wt/wt, bei 37°C und 5% CO2 1 Stunde inkubiert. (Molekülsorte C und B wurden von Avanti Polar Lipids Inc., Alabama, AL, USA; Molekülsorte B von Invitrogen, Eugen, OR, USA besorgt). Die Fusionsmischung wurde auf folgende Weise vorbereitet:
Die Lipidkomponenten (Molekülsorte A bis C) wurden erst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES-Puffer) (VWR, Darmstadt, Deutschland) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80–100 W) 20 Minuten homogenisiert. Die Mischung liegt wiederum als Liposom haltbar bei 4°C vor.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden 100-fach mit F10 Ham's Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zur Gewebeprobe erneut 5–10 Minuten mittels Ultraschall (80–100 W) homogenisiert. Alle Preparationsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
Anschließend wurde das fusionierte Gewebe fluoreszenz-mikroskopisch analysiert (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena). 7 zeigt, dass sowohl Zellen der äußeren Gewebeschicht als auch Zellen in tieferen Zellebenen sich erfolgreich fusionieren bzw. anfärben ließen. Etwa 3–4 Zellschichten aus Bindegewebszellen sind deutlich erkennbar. Eventuelle Verwendung in der Gentherapie, Krebsbehandlung und Wundheilung ist hierdurch denkbar.
Es können weitere Ausführungsbeispiele angegeben werden. Diese sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Verfahren zur Herstellung der Mischungen sind von den hier angegebenen vier Beispielprotokollen zu entnehmen. Die Zellmembranfusion folgt denen der oben genannten Verfahren. Im Sinne der Erfindung, sind alle Verfahrensschritte in den Ausführungsbeispielen in nicht einschränkender Natur anzusehen. Insbesondere sollen die Fusionsmischungen und deren Verwendung weit ausgelegt werden. Dies bedeutet, dass die in Ausführungsbeispielen gezeigte Wege und Fusionsmischungen miteinander kombiniert werden können um zu neue Mischungen und Ausführungen zu gelangen.
Die vorliegend ausführlich dargestellten vier Wege gehen von Liposomen aus, da nach Chloroformzugabe und der Aufnahme in Puffer die amphiphatischen Bestandteile zu Liposomen umformen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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- S. W. Hui, M. Langner, Y. Zhao, P. Ross, E. Hurley, and K. Chan (1996) The Role of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer. Biophysical Journal, 1996, 71, 590–599. [0002]
- Weijun Li and Francis C. Szoka Jr. 2007. Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Pharmaceutical Research, 24, 438–449. [0002]
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- G. Gopalakrishnan, C. Danelon, P. Izewska, M. Prummer, P.-Y. Solinger, I. Geissbühler, D. Demurtas, J. Dubochet, and H. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5478–5483. [0005]

Claims

Mischung amphipathischer Moleküle mit einer amphipathischen Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung aufweist und einer amphipathischen Molekülsorte B, welche im hydrophilen und/oder im hydrophoben Bereich ein delokalisiertes Elektronensystem ausbildet.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Molekülsorte B mit einem delokalisierten Elektronensystem, umfassend mindestens ein zyklisches Strukturmotiv, welches durch konjugierte Doppelbindungen und/oder freie Elektronenpaare und/oder unbesetzten p-Orbitale ausgebildet werden.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass kovalent gebundene Nachbaratome der Molekülsorte B im delokalisierten Elektronensystem einen Elektronegativitätsunterschied (Δχ) von größer oder gleich 0,4 aufweisen.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Molekülsorte B, umfassend eine Gruppe R, welches das delokalisierte Elektronensystem ausbildet.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP) als Molekülsorte A.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Phospholipid, an dem ein Fluoreszenzfarbstoff mit delokalisiertem Elektronensystem als Gruppe R gebunden ist, als Molekülsorte B.
Mischung nach vorhergehendem Anspruch, gekennzeichnet durch 1-Hexadecanoyl-2-Dodecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin oder 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, oder 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, als Phosholipid der Molekülsorte B.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch 2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoyl) oder N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl) oder Lissamine Rhodamine B Sulfonyl oder (5-(Chlorosulfonyl)-2-(1H,2H,3H,5H,6H,7H,11H,12H,13H,15H,16H,17H-pyrido[3,2,1-ij]quinolizino[1',9':6,7,8]chromeno[2,3-f]quinolin-4-ium-9-yl)benzenesulfonate oder 7-Nitro-2-1,3-Benzoxadiazol-4-yl oder Carboxyfluorescein oder 1-Pyrensulfonyl, welche das delokalisierte Elektronensystem in der Molekülsorte B ausbildet.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine weitere amphipathische Molekülsorte C als Helfermolekül.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DOPE) als Molekülsorte C.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Verhältnis von 1:0,05–0,2:1 wt/wt zwischen den Molekülsorten A, B und C.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit bis zu 99% wt amphipathische Molekülsorte A.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit bis zu 40% wt amphipathische Molekülsorte B.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit bis zu 70% wt amphipathische Molekülsorte C.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese in einem wässrigen Puffer gelöst vorliegt.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Lipide als Molekülsorte A und/oder B und/oder C.
Liposom, umfassend eine Mischung nach vorhergehendem Anspruch 15 und 16.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Polymere als Molekülsorte A und/oder B und/oder C.
Verfahren zur in vivo Zellmodifikation, gekennzeichnet durch in Kontakt bringen und Fusion der Zellmembran mit einer Mischung oder einem Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verfahren nach vorhergehendem Anspruch, gekennzeichnet durch höchstens 1 bis 120 Minuten, vorzugsweise 10 bis 30 Minuten Kontakt zwischen der Zellmembran einer Zelle und der Mischung während der Fusion.
Verfahren nach Ansprüchen 19 bis 20, gekennzeichnet durch einen Anteil der fusionierten Zellen mit der Mischung oder dem Liposom (Effizienz) von über 50%.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 21, gekennzeichnet dadurch, dass eine Funktionsgruppe im hydrophilen Bereich einer amphipatischen Molekülsorte D, insbesondere eine Chelatgruppe als Funktionsgruppe, der Mischung zugeführt und während der Fusion auf der Oberfläche der Zelle angeordnet wird.
Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, gekennzeichnet dadurch, dass eine Mischung umfassend 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan als Molekülsorte A und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine als Molekülsorte B und Triethylammonium Salz/1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin als Molekülsorte C und 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-1-Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D z. B. in einem Mischungsverhältnis von 1:0,1:1:0,002 wt/wt zur Fusion verwendet wird.
Verfahren nach vorhergehendem Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere Zellmodifikation durch Zugabe von tumor necrosis factor (TNF)α, gebunden an ein 6 × Histidin repeat, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 24, gekennzeichnet dadurch, dass eine amphipathische Molekülsorte E der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet wird, insbesondere Bacteriorhodopsin oder Glycophorin A oder Integrin als Molekülsorte E.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 25, gekennzeichnet dadurch, dass eine nicht amphipathische, hydrophile Molekülsorte F in einer gepufferten Lösung einer getrockneten Mischung zugeführt und während der Fusion in das Lumen der Zelle abgegeben wird, insbesondere mit RNA, DNA, Ca²⁺, Peptid, Protein oder einem Arzneimittel wie Azetylsalicylsäure als Molekülsorte F.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 26, gekennzeichnet dadurch, dass eine nicht amphipathische, hydrophobe Molekülsorte G der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet wird, insbesondere Cholesterin, Vitamin A, D, E and K oder Arzneimittel wie Kortison als Molekülsorte G.
Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 18, gekennzeichnet durch 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan als Molekülsorte A und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine als Molekülsorte B und Triethylammonium Salz/1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin als Molekülsorte C und 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-1-Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D, insbesondere in einem Mischungsverhältnis von 1:0,1:1:0,002 wt/wt.
Zelle, fusioniert in vivo mit einer Mischung bzw. einem Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche.