DE69633669T2

DE69633669T2 - Verfahren zur zelltransfektion mit liposomal-verkapselten nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69633669T2
Application number: DE69633669T
Authority: DE
Inventors: Alain Thierry; Anatoly Dritschilo
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: AU5976896A; EP0835099B1; EP0835099A1; EP0835099A4; DE69633669D1; AU700376B2; CA2223637A1; WO1996040062A1; US5756122A; ATE279912T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zellen, die heterologe Genprodukte exprimieren, sind als wissenschaftliches Handwerkszeug, als „Fabriken" für die Erzeugung von Genprodukten und für die Gentherapie von Wert. Es ist deshalb in zunehmendem Maße wichtig geworden, in der Lage zu sein, "Ingenieurszellen" mit heterologen Polynucleotid-Konstrukten schnell und kostenunaufwendig zu schneidern bzw. passend zu erzeugen. Ein größerer Faktor bei der Zeit und den Kosten für die Erzeugung solcher Zell-Linien ist die Wirksamkeit, mit der Polynucleotide in die gewünschten Zellen eingeführt und stabil inkorporiert werden können.
Derzeit existiert eine Anzahl von Methoden, um Zielzellen mit Polynucleotiden zu transfizieren. Solche Methoden umfassen gängige Mittel wie die Calciumphosphat- und die Polykationen-mediierte Transfektion, wie auch Protoplasten-Fusion, virale und retrovirale Infektion, Mikroinjektion und Elektroporation.
Eine andere kürzlich untersuchte Methode zur Einschleusung von Polynucleotiden in Zellen umfasst die Einführung von liposomal verkapselten Nucleinsäuren. Solche Methoden stammen aus den frühen 1980er Jahren, als Papahadjopoulos et al. die Verkapselung von biologisch aktiven Materialien, beispielsweise Nucleinsäuren und Proteinen, in Liposomen offenbarten. Diese Liposomen wurden dann für die Abgabe des biologisch aktiven Materials an Zielzellen benutzt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,241,046; US-Patent Nr. 4,235,871; US-Patent Nr. 4,394,448. Siehe außerdem Lasic et al., Science 267: 1275 (1995).
Derartige Methoden sind verbessert worden, um die Effizienz des Transfektions-Prozesses zu steigern. Beispielsweise ist es bekannt, dass die Konjugation von Liposomen an Liganden, die selektiv an ausgewählte Zellen binden, die Effizienz der Abgabe an gewünschte Zellen steigert. Einschlägige Patente, die die Konjugation von Liposomen an zellspezifische Einheiten, insbesondere an Antikörper, offenbaren, sind beispielsweise US-Patent Nr. 5,210,040; US-Patent Nr. 4,957,735; US-Patent Nr. 4,925,661; US-Patent Nr. 4,806,466; US-Patent Nr. 4,762,915; US-Patent Nr. 4,708,933; US-Patent Nr. 4,483,921; US-Patent Nr. 4,480,041, US-Patent Nr. 4,429,008.
pH-empfindliche Liposomen sorgen ebenfalls für eine gesteigerte Abgabe von für ein Ziel bestimmten Nucleinsäuren an Zellen. Beispielsweise offenbaren das US-Patent Nr. 4,789,633 und Huang et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 7851 (1987) pH-empfindliche, DNA enthaltende Liposomen, die bei einem pH-Wert von unter 7 mit Zellmembranen fusionieren, was die Einführung der gewünschten DNA erleichtert. Während derartige Liposomen eine verbesserte Abgabe fremder DNA's ermöglichen, sind sie doch immer noch ziemlich ineffizient, gewöhnlich wegen einer schlechten Verkapselungseffizienz. Diese schlechte Verkapselungswirksamkeit bedeutet sowohl, dass große Mengen an DNA bei der Herstellung der Liposomen verschwendet werden, als auch, dass große Mengen an Liposomen eingesetzt werden müssen, um die Einschleusung einer gegebenen Menge DNA an Zellen zu erreichen.
Ein anderes Verfahren, mit dem eine Abgabe von Liposomen enthaltener DNA erzielt werden kann, umfasst die Verabreichung von DNA-Komplexen mit kationischen Lipiden. Beispielsweise lehrt die US-Patentschrift Nr. 5,227,170 das Verkapseln von Oligonucleotiden in kationischen Lipid-Komplexen, die weiterhin eine Lösung zweiwertiger Kationen mit den gewünschten Oligonucleotiden aufweisen und eine Osmolarität besitzen, die geringer ist als die der internen wässrigen Phase. Siehe auch Felgner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 84: 7413 (1987). Aufgrund ihres kationischen Charakters können diese Liposomen an Serumproteine binden, was zur Inaktivierung der darin enthaltenen Oligonucleotide führt. Auch sind vom osmotischen Druck abhängige Liposomen in der Literatur bekannt, d. h. wie im US-Patent Nr. 5,049,392 offenbart.
Verfahren zum Optimieren der Größe von Liposomen sind ebenfalls bekannt. Beispielsweise lehrt das US-Patent Nr. 4,532,089 ein Verfahren zum Erzeugen von übergroßen Liposomen. Außerdem lehrt das US-Patent Nr. 4,529,561 ein Verfahren zum Herstellen von Liposomen in gewünschten Größenbereichen. Darüber hinaus sind aus dem US-Patent Nr. 5,223,263 Liponucleotid enthaltende Liposomen und deren Verwendung für die Einschleusung der Liponucleotide in gewünschte Zellen bekannt.
Es ist damit klar, dass aus dem Stand der Technik viele Verfahren zur Einschleusung von Nucleinsäuren in Zellen bekannt sind, wie es auch Verfahren sind, die sich auf die Liposomen-vermittelte Einführung von Nucleinsäuren stützen. Gängige Verfahren zur Verkapselung in Liposomen sind jedoch vielen Beschränkungen unterworfen. Beispielsweise sind gängige Verfahren zur Verkapselung von Nucleinsäuren in Liposomen durch geringe Einfang-Effizienzen beschränkt. Das bedeutet, dass nur ein geringer Prozentsatz der ursprünglich eingesetzten Nucleinsäure tatsächlich verkapselt wird. Wie oben diskutiert, ist dies nicht wünschenswert, weil es sowohl bezüglich des Verbrauchs an DNA als auch bezüglich der Menge von Liposomen, die eingesetzt werden müssen, um eine gegebene Menge an DNA einzuschleusen, ineffektiv ist.
Auch sind die meisten gängigen Verfahren zur Verkapselung von Nucleinsäuren in Liposomen nur für die Verkapselung von kleinen Nucleotiden, beispielsweise von Oligonucleotiden, geeignet. Dies ist von Nachteil, da die Expression heterologer Genprodukte in Zellen häufig die Einführung viel größerer DNA-Sequenzen erfordert, die nicht nur codierende Bereiche, sondern auch andere cis-wirkende Steuerungen für die Regulierung der Genexpressionen umfassen, beispielsweise Promotor- und Enhancer-Sequenzen, Operator-Sequenzen und dergleichen, wie auch eine ribosomale Bindungsstelle, ein Initiations-Codon und eine Endstelle für die Transkription und Polyadenylierungs-Signale. Pufferregionen, Replikationsstartpunkte für extrachromosomale Replikation und flankierende Bereiche mit Homologie zu einer Zielstelle für die gezielte chromosomale Insertion durch homologe Rekombination können ebenfalls enthalten sein.
Die gegenwärtigen Verfahren erlauben keine wirksame Verkapselung großer DNA-Vektoren wie beispielsweise von Plasmiden und Phagemiden. Dies ist besonders nachteilig für diejenigen Vektoren, die konstruiert wurden, um in einem episomalen Zustand, d. h. extrachromosomal, in der Zelle zu verbleiben. Diese Vektoren können die potentiellen Probleme vermeiden, die während einer ungezielten Integration einer heterologen DNA in ein Wirtszellgenom auftreten können, beispielsweise Oncogen-Aktivierung, Verlust rekombinierter Sequenzen, Inaktivierung essentieller Gene, ineffizientes Expressionsniveau der heterologen DNA oder ungeeignete bzw. nicht ausreichende Mittel zum Steuern des Niveaus der Genexpression. Große DNA-Vektoren werden üblicherweise auch benötigt, wenn mit Hilfe des Verfahrens der homologen Rekombination eine gezielte Integration in ein Chromosom gewünscht ist. Dies liegt daran, dass relativ große Regionen flankierender DNA verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Insertion an einer bevorzugten chromosomalen Stelle auftritt, was die oben diskutierten Probleme, die mit einer zufälligen Insertion verbunden sind, vermeidet.
Es ist daher offensichtlich, dass ein wirksameres Verfahren zur Einschleusung großer DNA-Moleküle in Zellen in hohem Maße wünschenswert ist. Insbesondere ist es wünschenswert, dass ein verbessertes Verfahren zum Verkapseln von Nucleinsäuren mit hohem Molekulargewicht in Liposomen mit hoher Einfang- bzw. Verkapselungs-Effizienz in hohem Maße wünschenswert ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Deshalb ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Verkapseln von Nucleinsäuren mit hohem Molekulargewicht bereitzustellen, das außerdem eine große Einfang-Effizienz gewährleistet, verglichen mit bekannten Verfahren zum Erzeugen Liposomen-verkapselter Nucleinsäuren.
Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Transfizieren von Zellen bereitzustellen, das schnell, kostenunaufwendig und zuverlässig ist, im Vergleich zu verfügbaren Verfahren zur Transfektion von Zellen.
Darüber hinaus ist es ebenfalls Aufgabe der Erfindung, ein Liposom bereitzustellen, das Nucleinsäuren mit hohem Molekulargewicht enthält, beispielsweise DNA's im Bereich von etwa 1,0 kB bis zu etwa 20 kB und vorzugsweise von etwa 5 kB bis 18 kB.
In Lösung der voranstehenden Aufgaben der Erfindung wird gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Verkapseln von Nucleinsäuren in Liposomen bereitgestellt, die eine Größe im Bereich von etwa 1 bis 20 kB und vorzugsweise von etwa 5 kB bis etwa 18 kB aufweisen, umfassend die Schritte: (i) Inkubieren eines hydratisierten Lipidfilms über einen wirksamen Zeitraum hinweg bei einer abgesenkten Temperatur, wobei der hydratisierte Lipidfilm durch Zugabe einer konzentrierten wässrigen Lösung einer Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht zu einem getrockneten Lipidfilm erhalten wird; (ii) Zugeben einer geringstmöglich wirksamen Menge an Phosphat-gepufferter Salzlösung zum hydratisierten Lipidfilm und Verwirbeln (Vortexen) des Materials über einen Zeitraum hinweg, der ausreichend ist, um Liposomen zu erzeugen und diese Liposomen einer Quellung zu unterziehen; und (iii) Verwirbeln (Vortexen) der erzeugten gequollenen Liposomen. Das Verfahren kann weiterhin den Schritt (iv) des Entfernens unverkapselter Nucleinsäure von den Liposomen durch Waschen der Liposomen umfassen. Das Waschen kann durch Zentrifugieren erfolgen.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Lipidfilm mindestens ein Lipid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Dimyristoyl-diglycerin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Lysophosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Sphingolipiden, Phosphatidylglycerin, Sphingomyelin, Cardiolipin, Glycolipiden, Gangliosiden, Cerebrosiden, Cholesterin, Tocopherol und Retinol besteht.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung besteht der Lipidfilm aus Dimyristoyl-diglycerin, Phosphatidylethanolamin und Cholesterin in einem Molverhältnis der Komponenten zueinander von etwa 5 : 5 : 7.
Gemäß einer wiederum anderen Ausgestaltung der Erfindung besitzt die Nucleinsäurelösung eine Konzentration von 1 bis 5 mg/ml, und die Nucleinsäurelösung wird dem getrockneten Lipidfilm in einem Verhältnis von weniger als oder gleich etwa 1,6 μl pro mg Lipid zugesetzt. Die wirksame Zeit für den Inkubationsschritt dauert vorzugsweise mindestens 12 Stunden, und die Zeit für das Bilden und Quellen des Liposomen dauert mindestens 30 Minuten.
Gemäß einer nochmals anderen Ausgestaltung der Erfindung reicht die Größe der Nucleinsäure vorzugsweise von etwa 1 kB bis zu etwa 25 kB, oder stärker bevorzugt von etwa 5 kB bis zu etwa 18 kB.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird ein Verfahren zum Transfizieren von Zellen bereitgestellt, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge an gequollenen, nucleinsäurehaltigen Liposomen, worin die Liposomen wie oben beschrieben hergestellt sind. Die Nucleinsäure ist vorzugsweise ein Plasmid, ein Phagemid oder ein Cosmid.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung gibt es, mit der ein Liposom bereitgestellt wird, das eine Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht enthält und nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Nucleinsäure eine Größe von mindestens 2 kB, und mindestens 25% der Liposomen enthalten die Nucleinsäure. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat die Nucleinsäure eine Größe von mindestens 5 kB, und mindestens 10% der Liposomen enthalten die Nucleinsäure.
Auch eine transfizierte Zelle wird gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung bereitgestellt, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Liposom eine DNA mit hohem Molekulargewicht, die für eine Antisense-RNA, ein Ribozym oder ein therapeutisches Protein codiert.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen einer liposomenverkapselten Nucleinsäure bereitgestellt, umfassend die Schritte: (i) Inkubieren eines hydratisierten Lipidfilms für etwa zwei Stunden bei etwa 4°C, wobei der hydratisierte Lipidfilm durch die Zugabe einer konzentrierten wässrigen Lösung einer Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht zu einem getrockneten Lipidfilm in einem Verhältnis von weniger als oder gleich etwa 1,6 μl DNA-Lösung pro mg Lipid gebildet wird; (ii) Zugeben einer phosphatgepufferten Salzlösung zu dem hydratisierten Lipidfilm in einem Verhältnis von weniger als oder etwa gleich 1,6 μl pro mg Lipid, und Verwirbeln (Vortexen) des Materials über einen Zeitraum hinweg, der ausreichend ist, um Liposomen zu erzeugen und diese Liposomen einer Quellung zu unterziehen; und (iii) Verwirbeln (Vortexen) der erzeugten gequollenen Liposomen, wodurch mindestens 25% dieser Liposomen die Nucleinsäure enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die DNA mit hohem Molekulargewicht für einen gewebespezifischen Promotor.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung gibt es, mit der ein durch die oben beschriebenen Verfahren hergestelltes Liposom bereitgestellt wird, worin das therapeutische Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus platelet-derived growth factor (PDGF), epidermalem Wachstumsfaktor, Interleukinen 1–14, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, Tumornekrosefaktor, leukemia inhibitory factor, Amphiregulin, Angiogenin, Betacellulin, Calcitonin, ciliärem neurotrophem Faktor, brain-derived neurotrophic factor, Neurotrophinen 3 und 4, Nervenwachstumsfaktor, Kolonie-stimulierendem Faktor 1, Endothelzell-Wachstumsfaktor, Erythropoietin, saurem und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, hepatocyte growth factor, heparin binding EGF-like growth factor, Insulin, Insulin-artigen Wachstumsfaktoren I und II, Interferonen α, δ und γ, keratinocyte growth factor, Macrophagen-Entzündungsprotein α und δ, Midkine, Oncostatin M, RANTES, Stammzellfaktor, transforming growth factors (TGF) α und δ und vascular endothelial growth factor besteht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zum Verkapseln von Nucleinsäuren mit hohem Molekulargewicht in Liposomen bereit, mit dem eine höhere Nucleinsäure-Einfangrate erreicht wird, als man sie bei bisher üblichen Verfahren zum Verkapseln von Nucleinsäuren in Liposomen erzielen kann. In der vorliegenden Erfindung wird die Einfangrate oder -effizienz definiert als der Prozentsatz der anfänglich vorhandenen Menge an eingesetzter Nucleinsäure, die in den gebildeten Liposomen verkapselt wird.
Dieses verbesserte Verfahren stellt auch liposomale Zusammensetzungen bereit, in denen ein größerer Anteil der Liposomen tatsächlich die gewünschten Nucleinsäuren enthält, als man dies mit gängigen Methoden zum Verkapseln von Nucleinsäuren in Liposomen erreichen kann. Darüber hinaus weist jedes Liposom durchschnittlich einen höheren Nucleinsäuregehalt auf als Liposomen, die nach gängigen Techniken hergestellt werden.
Diese Eigenschaften sind aus verschiedenen Gründen vorteilhaft. Zum ersten senkt die hohe Verkapselungsrate bzw. -effizienz, die im Allgemeinen bei mindestens 25% und gewöhnlich bei 50% liegt, bezogen auf die anfänglich vorhandene Menge an Nucleinsäure, die jedoch einen Wert von 90% oder sogar noch darüber erreichen kann, die Kosten, da weniger Nucleinsäure benötigt wird als in gängigen Verfahren zum Verkapseln von Liposomen. Zum zweiten verbessert die hohe Einfangrate bzw. -wirksamkeit die Qualität der Leistung der nucleinsäurehaltigen Liposomen, weil (i) ein größerer Anteil der Liposomen Nucleinsäure enthält und (ii) der durchschnittliche Nucleinsäuregehalt höher ist als in Liposomen, die nach gängigen Methoden hergestellt wurden. Dies übersetzt sich in "eine verbesserte Abgabe von Nucleinsäuren an Zielzellen, und dementsprechend besteht eine größere Wahrscheinlichkeit, dass eine Nucleinsäure in eine beliebige, gegebene Zielzelle eingeschleust wird. Weil nicht jede eingeschleuste Nucleinsäure eine stabile Transfektion bewirken kann, verbessert eine höhere Einschleusungsrate die Chance, dass eine Zelle erzeugt wird, die das gewünschte Produkt exprimiert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die effiziente Verkapselung von Polynucleotid-Molekülen mit hohem Molekulargewicht. Die Ausdrücke „Nucleinsäure" oder „Polynucleotid" sollen, so wie sie hier verwendet werden, untereinander austauschbar sein, sofern nichts anderes angegeben ist, und umfassen DNA, RNA oder eine Mischung aus DNA und RNA. Nucleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können auch jede beliebige Strang-Struktur umfassen, beispielsweise ein-, doppel- oder dreifach-strängige Polynucleotid-Strukturen oder Mischungen davon. Auch können die Nucleinsäuren lineare oder zirkuläre Strukturen aufweisen, beispielsweise Plasmide, Phagenide, Cosmide etc.
Ein Polynucleotid „mit hohem Molekulargewicht" bezieht sich im vorliegenden Gebrauch auf ein Polynucleotid-Molekül, das mindestens eine codierende Sequenz aufweist, die transkribiert werden kann, wenn das Polynucleotid in eine Wirtszelle eingeschleust wird. Diese Transkription kann ein mRNA-Molekül erzeugen, das dann translatiert werden kann, wodurch ein Polypeptid oder Protein entsteht, oder es kann ein Antisense-RNA-Molekül erzeugen. Die Transkription der codierenden Sequenz des hochmolekularen Polynucleotids (HMW polynucleotide) erfolgt vorzugsweise unter der Kontrolle von cis-wirkenden regulatorischen Elementen, beispielsweise Enhancer-Sequenzen, Operator-Sequenzen und dergleichen, und das Polynucleotid enthält außerdem eine ribosomale Bindungsstelle, ein Startcodon und eine Endstelle für die Transkription und Polyadenylierungssignale. Die Definition von hochmolekularen Polynucleotiden ist deshalb in der hier benutzten Verwendung allgemein dahingehend zu verstehen, dass Polynucleotide gemeint sind, die solche regulatorischen Elemente enthalten. Das hochmolekulare Polynucleotid kann außerdem andere Elemente umfassen, beispielsweise Replikationsstartpunkte, wie sie gängigerweise auf für Transfektionen eingesetzten Polynucleotiden gefunden werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die wirksame Verkapselung von großen Vektoren, einschließlich von solchen, die Sequenzen aufweisen, welche eine stabile, episomale Präsenz erlauben, und solchen, die für Multigen-Kassetten codieren. Dies ist im Falle von episomalen Konstrukten von Bedeutung, weil die Integration der gewünschten Nucleinsäure in das Wirtszell-Genom einen negativen Einfluss auf den Transfektions-Prozess haben kann. Für Multigen-Kassetten ist dies ebenfalls wichtig, da eine koordinierte Regulation der codierten Gene leichter erreicht werden kann.
Die Nucleinsäuren, die nach dem vorliegenden Verfahren verkapselt werden können, können in ihrer Größe einen Bereich abdecken, der bei einem so geringen Wert wie etwa 500 Basen beginnt und bis etwa 50 Kilobasen reicht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die verkapselten Nucleinsäuren DNA's im Bereich von etwa 1,0 kB bis 25 kB und vorzugsweise von etwa 5 kB bis etwa 18 kB.
Die Nucleinsäuren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verkapselt werden können, können Sense- oder Antisense-Polynucleotide umfassen. Beispielsweise können Antisense-Oligonucleotide verkapselt werden, die selektiv die Expression von Ziel-DNA's inhibieren. Zum Beispiel können Antisense-Oligonucleotide verkapselt werden, die komplementär zu viralen Sequenzen sind und für antivirale Behandlungen eingesetzt werden können, beispielsweise bei Hepatitis, viraler AIDS-Infektion, Papillomavirus-Infektion und dergleichen. Die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden für Gentherapie ist in der Literatur beschrieben worden. Siehe Stein und Chang, Science 261: 1004 (1993). Auch ribozymale RNA's können verkapselt und zum Studium von Genexpression oder für Gentherapie eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die verkapselten Nucleinsäuren ein episomales Element, beispielsweise ein Plasmid, das ein oder mehrere Gene enthält, die in Zielzellen exprimiert werden sollen. Ein episomales Element, das einen Replikationsstartpunkt aufweist, welcher von den Replikationsfunktionen der Wirtszelle erkannt wird, wird in der Zelle als extrachromosomales Element stabil verbleiben, wodurch eine stabile Expression von auf diesem Element codierten Genen möglich wird. Im Allgemeinen bewirken diese Gene, dass die Zielzelle ein heterologes Expressionsprodukt erzeugt oder einen veränderten Phänotyp annimmt. Wenn das episomale Element keinen Replikationsstartpunkt enthält, der von der Wirtszelle erkannt wird, wird das Expressionsprodukt nur vorübergehend erzeugt.
Ein anderes Einsatzgebiet für die hier in Rede stehenden, liposomal verkapselten Nucleinsäuren betrifft die Erzeugung von Zellen oder Lebewesen, die ein defektes Gen oder solche Gene exprimieren. Die gebildeten Zellen oder Lebewesen können dabei als in vitro oder in vivo fungierende Modelle für die Bewertung der Wirksamkeit potentieller therapeutischer Mittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Anwendungsbereich für die liposomal verkapselten Nucleinsäuren der Erfindung betrifft die Gentherapie, d. h. die Einführung von DNA-Konstrukten, die für ein therapeutisches Produkt codieren, in Zellen. Das therapeutische Produkt kann beispielsweise eine Antisense-RNA oder ein Ribozym-RNA-Molekül sein, oder es kann ein therapeutisches Protein sein. Der Ausdruck „therapeutisches Protein" bezieht sich so, wie er hier gebraucht wird, auf ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein, das für einen Wirt von therapeutischem Nutzen ist, wenn es dem Wirt verabreicht wird oder wenn es in den Zellen des Wirts exprimiert wird. Die Gentherapie kann in vivo erfolgen, wobei die liposomal verkapselten DNA-Konstrukte direkt einem Wirts-Lebewesen, vorzugsweise einem Menschen, zugeführt werden, oder kann ex vivo erfolgen, wobei isolierte Zellen zuerst mit den liposomal verkapselten DNA-Konstrukten transfiziert werden und sodann in ein Wirts-Lebewesen wieder eingeführt werden. Ex vivo erfolgende Gentherapie im Menschen ist im US-Patent 5,399,346 beschrieben, das hier durch Bezugnahme als vollständig aufgenommen gelten soll. Siehe auch den Artikel Tolstoshev, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33: 573–96 (1993) für eine allgemeine Übersicht über die Gentherapie, der ebenfalls hier durch Bezugnahme als gänzlich aufgenommen gelten soll.
Die hier in Rede stehenden, nucleinsäurehaltigen Liposomen werden im Allgemeinen durch ein Verfahren hergestellt, umfassend:

(i) Bilden eines Lipidfilms unter verringertem Druck;
(ii) Hydratisieren des Lipidfilms durch die Zugabe einer wirksamen Menge einer eine Nucleinsäure enthaltenden Lösung;
(iii) Inkubieren der Mischung während der Länge eines wirksamen Zeitraums bei abgesenkter Temperatur;
(iv) Zugeben einer phosphatgepufferten Lösung zu dem hydratisierten Lipidfilm und Verwirbeln (Vortexen);
(v) Inkubieren bei Umgebungstemperatur für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um das Quellen zu erleichtern; und
(vi) Verwirbeln (Vortexen) der erzeugten gequollenen Zusammensetzung zur Erzeugung von nucleinsäurehaltigen Liposomen.

Typischerweise wird ein Schritt zwischen den Schritt (iv) und den Schritt (v) eingeschoben, in dem eine zusätzliche, phosphatgepufferte Salzlösung zugesetzt und die Mischung nochmals verwirbelt (gevortext) wird. Außerdem werden nach Schritt (vi) die unverkapselten (freien) Nucleinsäuren typischerweise entfernt. Das kann beispielsweise dadurch bewirkt werden, dass die Liposomen wiederholt gewaschen werden, indem sie in einer phosphatgepufferten Salzlösung zentrifugiert werden.
Im Allgemeinen werden etwa 20 μmol (etwa 0,64 mg) Lipid unter verringertem Druck (30 mmHg) in einer 40 mm² messenden Oberfläche eines gläsernen Rundkolbens oder einem solchen Glasrohr getrocknet. Der gebildete trockene Lipidfilm wird mit etwa 1,4 μl einer wässrigen, zu verkapselnde DNA enthaltenden Lösung hydratisiert. Im Allgemeinen wird ein Behälter mit einer durchschnittlichen Oberfläche von etwa 10 mm² bis 200 mm² verwendet, und zwar unter einem verringerten Druck von etwa 1 bis 50 mmHg und einem Hydratisierungs-Volumen von etwa 0,7 bis 2 μl.
Schritt (i) wird typischerweise dadurch bewirkt, dass unter Einsatz eines beliebigen Lipids oder einer Mischung geeigneter Lipide, das/die unter einem Vakuum von Flüssigkeit befreit wird/werden, ein Lipidfilm gebildet wird. Die zur Herstellung dieses Lipidfilms eingesetzte Lipidmischung kann ein beliebiges Lipid oder eine beliebige Mischung von Lipiden enthalten, die eine geeignete Verkapselungsrate (Einfang-Wirksamkeit) für Nucleinsäure sicherstellen.
Beispiele von für den erfindungsgemäßen Gebrauch geeigneten Lipiden umfassen beispielsweise bekannte, Vesikel oder Liposomen bildende Verbindungen wie Phosphatidylcholin, sowohl natürlich vorkommend als auch synthetisch hergestellt, Phosphatidsäure, Lysophosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Phosphatidylglycerin, Sphingomyelin, Cardiolipin, Glycolipide, Ganglioside und Cerebroside wie beispielsweise Sojabohnen-Phospholipide. Andere geeignete Lipide umfassen Steroide, Cholesterin, aliphatische Amine wie beispielsweise langkettige aliphatische Amine und Carbonsäuren, langkettige Sulfate und Phosphate, Diacetylphosphate, butyliertes Hydroxytoluol, Tocopherol, Retinol und Isopren-Verbindungen, die den gebildeten Liposomen gewünschte Eigenschaften verleihen können.
Auch können synthetische Phospholipide, die entweder veränderte aliphatische Teile wie Hydroxylgruppen, verzweigte Kohlenstoffketten, Cyclo-Derivate, aromatische Derivate, Ether, Amide, polyungesättigte Derivate, halogenierte Derivate aufweisen, oder veränderte hydrophile Teile, die Kohlenhydrate, Glycol, Phosphat, Phosphamid, quartäre Amine, Sulfat, Sulfonyl, Carboxy, Amin, Sulfhydryl, Imidazol-Gruppen und Kombinationen solcher Gruppen aufweisen, entweder als Substitute eingesetzt oder mit den oben erwähnten Lipiden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, vermischt werden. Lipide, die sich für die Herstellung von Liposomen eignen, sind in der Literatur gut bekannt und sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4,201,767; US-Patent Nr. 4,235,877; US-Patent Nr. 4,241,046; US-Patent Nr. 4,261,975 und US-Patent Nr. 4,394,448 beschrieben, die alle durch Bezugnahme gänzlich als vorliegend enthalten gelten sollen.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines beliebigen Lipids oder einer solchen Kombination, das/die die gewünschte Verkapselungs-Effektivität sicherstellt, die im Allgemeinen bei mindestens etwa 25%, relativ zur anfänglich vorhandenen Menge an für die Verkapselung eingesetzter Nucleinsäure, liegt. In einer bevorzugten Ausgestaltung beträgt die Verkapselungs-Wirksamkeit mindestens 50%, stärker bevorzugt 70%, und noch stärker bevorzugt wird sie im Bereich zwischen etwa 70% und etwa 90% liegen.
Bevorzugte Lipide umfassen Dimyristoyl-phosphatidylglycerin, Cardiolipin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin, Sphingomyelin und Cholesterin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bestehen die Lipide, die zur Herstellung des Lipidfilms verwendet werden, aus einer Mischung aus Dimyristoyldiglycerin, Phosphatidylethanolamin und Cholesterin. Am stärksten bevorzugt liegt das Molverhältnis dieser Lipide bei etwa 5 : 5 : 7 Dimyristoyldiglycerin zu Phosphatidylethanolamin zu Cholesterin.
Schritt (ii), der Hydratisierungsschritt, umfasst im Allgemeinen den Zusatz einer wirksamen Menge einer nucleinsäurehaltigen wässrigen Lösung zu einem getrockneten Lipidfilm. Vorzugsweise ist diese Lösung eine hochkonzentrierte, wässrige Nucleinsäurelösung und stärker bevorzugt eine konzentrierte, DNA-haltige Lösung. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich für die DNA-Lösung reicht von etwa 1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml, aber Konzentrationen außerhalb dieses Bereichs können ebenfalls eingesetzt werden, beispielsweise von etwa 0,01 mg/ml bis etwa 20 mg/ml oder soweit, dass die DNA-Lösung gesättigt ist. In den Beispielen enthält die Lösung Plasmide in einer wässrigen Lösung mit einer Konzentration von etwa 1 bis 2 mg/ml. Diese konzentrierte Nucleinsäurelösung wird dem trockenen Lipidfilm in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Hydratisierung sicherzustellen und zu erreichen, dass die gewünschte Menge an Nucleinsäure verkapselt wird.
Beispielsweise wurde in einem Fall eine 2 mg/ml DNA Plasmid-Lösung verwendet, und zwar mit 1,6 μl Lösung/mg Lipid, um die Hydratisierung zu erleichtern. Diese Menge kann nach Bedarf verändert werden. Eine geeignete Menge der nucleinsäurehaltigen Lösung wird von etwa 1,7 μg bis 17 μg DNA pro mg Lipid schwanken, wenn eine Nucleinsäure-Lösung mit einer Konzentration von etwa 1 bis 5 mg/ml DNA verwendet wird.
Wie oben diskutiert, kann die in dieser Lösung enthaltene Nucleinsäure DNA, RNA oder eine Mischung davon aufweisen, und sie kann lineare oder zirkuläre Strukturen aufweisen. Außerdem können die verkapselten Nucleinsäuren einzel- oder mehrfachsträngig sein und können Sense- oder Antisense-Nucleinsäuresequenzen enthalten. In der bevorzugten Ausführungsform umfassen die Nucleinsäuren DNA-Konstrukte in einem Größenbereich von etwa 5 bis etwa 18 Kilobasen. Im Allgemeinen enthalten derartige DNA-Konstrukte ein Gen oder Gene, die in den Zielzellen exprimiert werden sollen. Das DNA-Konstrukt enthält vorzugsweise außerdem regulatorische Sequenzen, die für die Expression dieser Gene sorgen, zusätzlich zu Sequenzen, die sicherstellen, dass diese DNA-Konstrukte bei Bedarf in Zielzellen autonom repliziert werden, und darüber hinaus geeignete selektierbare Marker, beispielsweise Antibiotikaresistenz-Marker. Im Allgemeinen werden diese Gene unter der Steuerung regulierbarer Promotoren exprimiert.
In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen enthalten die DNA-Konstrukte ein Gen oder Gene, die ein therapeutisches oder wertvolles Genprodukt erzeugen. Beispiele für solche Genprodukte umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, therapeutische Lymphokine, Cytokine, Hormone, Zellanheftungsmoleküle, Enzyme oder Enzyminhibitoren, Rezeptoren, Ionenkanäle, Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen, Proteinphosphatasen und zelluläre Antigene zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Wirt. Alternativ enthalten die DNA-Konstrukte Selbstmordgene, Tumor-Suppressor-Gene, Gene, die für Antisense-RNAs codieren, oder Gene, die den Zelltod (zelluläre Apoptose) induzieren oder verhindern.
Beispiele für Lymphokine und Cytokine, die von den liposomal verkapselten DNA-Konstrukten der Erfindung codiert werden können, umfassen platelet-derived growth factor (PDGF), epidermalen Wachstumsfaktor, Interleukine 1–14, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, Tumornekrosefaktor, leukemia inhibitory factor, Amphiregulin, Angliogenin, Betacellulin, Calcitonin, ciliären neurotrophen Faktor, brain-derived neurotrophic factor, Neurotrophine 3 und 4, Nervenwachstumsfaktor, Kolonie-stimulierenden Faktor-1, Endothelzell-Wachstumsfaktor, Erythropoietin, sauren und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, hepatocyte growth factor, heparin binding EGF-like growth factor, Insulin, Insulin-artige Wachstumsfaktoren I und II, Interferone α, δ und γ, keratinocyte growth factor, Macrophagen-Entzündungsprotein α und δ, Midkine, Oncostatin M, RANTES, Stammzellfaktor, transforming growth factors (TGF) α und δ und vascular endothelial growth factor. Beispiele für Zell-Adhäsionsmoleküle umfassen Integrine, Cadherine, Selektine und Adhäsionsmoleküle der Immunglobulin-Superfamilie, wie zum Beispiel VCAM, ICAM, PECAM und NCAM. Beispiele von Tumor-Suppressor-Genen umfassen p53, DCC, Rb und MTS1. Fachleuten auf diesem Gebiet ist klar, dass auch andere Gene in der Erfindung eingesetzt werden können.
Darüber hinaus enthält, wie oben diskutiert, das DNA-Konstrukt regulatorische Elemente, die die Replikation des Konstrukts innerhalb der Zelle wie auch die Transkription und die Translation der vom Konstrukt codierten Gene steuern können. Für den Einsatz bei der in vivo Gentherapie ist es manchmal von Wert, dass diese regulatorischen Elemente gewebespezifisch sind. Der Ausdruck „gewebespezifischer Promotor" oder „gewebespezifische transkriptionale regulatorische Sequenz" steht für eine transkriptionale regulatorische Sequenz, einen Promotor und/oder einen Enhancer, die/der selektiv oder in einem höheren Ausmaß in Zellen des Zielgewebes induziert wird als in anderen Zellen. Beispielsweise umfassen Tumorzellen-spezifische Promotoren solche Promotoren, die in einem bestimmten Zelltyp oder in einer Tumorzelle selektiv oder in einem höheren Ausmaß induziert werden. Gewebespezifische Promotoren sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele umfassen: den Alpha-Aktin-Promotor (Shani, Mol. Cell. Biol., 6: 2624 (1986)); den Elastase-Promotor (Swift et al., Cell, 38: 639 (1984)); den Alpha-Fetoprotein-Promotor (Krumlauf et al., Nature, 319: 224–226 (1985)); den Beta-Globin-Promotor (Townes et al., EMBO J., 4: 1715 (1985)); den menschlichen Wachstumshormon-Promotor (Behringer et al., Genes Dev., 2: 453 (1988)); den Insulin-Promotor (Seiden et al., Nature, 321: 545 (1986)) und einen Prostata-spezifischen Promotor (Allison et al., Mol. Cell. Biol., 9: 2254 (1989)).
Schritt (iii) des gegenständlichen Verfahrens umfasst das Inkubieren des hydratisierten Lipidfilms für etwa 12 bis 24 Stunden bei einer abgesenkten Temperatur, beispielsweise bei etwa 4°C.
Schritt (iv) wird im Allgemeinen den Zusatz einer minimal wirksamen Menge einer phosphatgepufferten Salzlösung umfassen, woran sich ein Verwirbeln (Vortexen) anschließt. Diese minimal wirksame Menge der zugesetzten Phosphatpufferlösung liegt unter etwa 1,6 μl/mg Lipid und vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5 bis 1,5 μl/mg Lipid. In der durch das Beispiel gezeigten Ausgestaltung wurden 1,4 μl phosphatgepufferte Salzlösung pro mg des hydratisierten Lipids zugesetzt.
In den meisten Fällen schließt sich an das anfängliche Verwirbeln (Vortexen) ein weiterer Schritt an, in dem zusätzliche phosphatgepufferte Salzlösung zugegeben wird, gefolgt von kräftigem Verwirbeln (Vortexen). Dies kann durch den Zusatz einer zweiten phosphatgepufferten Salzlösung in einer Menge von weniger als etwa 1,6 μl/mg Lipid und vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 1,5 μl/mg Lipid bewirkt werden.
Schritt (v) umfasst das Inkubieren der aus Schritt (iv) erhaltenen Mischung für einen Zeitraum, der ausreicht, um das Quellen und danach die Erzeugung von Liposomen zu ermöglichen. Im Allgemeinen umfasst dies das Inkubieren der Mischung bei Umgebungstemperatur für mindestens 30 Minuten und vorzugsweise für mindestens etwa 2 Stunden. In der im Beispiel dargestellten Ausführungsform betrug die Quellzeit 2 Stunden. Fachleuten wird jedoch klar sein, dass dieser Zeitraum mit rein routinemäßigem Experimentieren abgewandelt werden kann, um die Bildung von Liposomen zu optimieren. Zusätzliche PBS-Lösung (8 μl/mg Lipid) kann fakultativ an diesem Punkt zugesetzt werden, um die Liposomen-Lösung zu verdünnen.
Schritt (vi) umfasst das Homogenisieren und Resuspendieren der gequollenen Liposomen-Zusammensetzung, üblicherweise durch Verwirbeln (Vortexen). Wenn die Liposomen kleinere Oligonucleotide enthalten, wird dieser Schritt gängigerweise und wirksam durch Beschallen der Liposomen-Mischung durchgeführt. Dieses Verfahren ist jedoch für Liposomen nicht anwendbar, die größere DNA-Konstrukte enthalten, welche sich unter Beschallungs-Bedingungen leicht zersetzen. Es konnte unerwarteterweise gefunden werden, dass inniges Vermischen, Homogenisieren und Resuspendieren durch Verwirbeln (Vortexen) der Liposomen-Mischung erreicht werden kann.
Wie oben diskutiert, wird die Zusammensetzung dann, wenn die nucleinsäurehaltigen Liposomen erzeugt sind, vorzugsweise behandelt, um die freien Nucleinsäuren zu entfernen. Dies kann mit Hilfe für eines jeden geeigneten Verfahrens bewirkt werden, das die Liposomen nicht beeinträchtigt, beispielsweise durch Waschen der Liposomen in einer geeigneten Lösung, z. B. einer phosphatgepufferten Salzlösung, woran sich ein Zentrifugationsschritt anschließt.
Auf diese Weise erzeugte, nucleinsäurehaltige Liposomen können sofort anschließend verwendet werden, oder sie können unter günstigen Bedingungen, beispielsweise unter 4°C, gelagert werden. Erfindungsgemäße Liposomen sind bis zu drei Wochen lang stabil.
Wenn die Liposomen erzeugt sind, kann die Verkapselungs-Effizienz durch bekannte Verfahren bestimmt bzw. gesichert werden. Beispielsweise kann eine DNA-Probe mit radiomarkierten Plasmid-DNA-Konstrukten eingesetzt werden. Dies erlaubt die Bestimmung der relativen Mengen von in den Liposomen enthaltener und freier Radioaktivität.
Das gegenständliche Verfahren liefert zuverlässig Nucleinsäure-Einfang-Effizienzen im Bereich von mindestens 25% bis 50%, eher aber noch 70% bis 90%, bezogen auf die anfängliche Menge an in der Probe enthaltener Nucleinsäure, beispielsweise in einer Probe, die ein DNA-Plasmid enthält.
Diese Liposomen können für die Transfektion von Nucleinsäuren in Zielzellen sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden. Die Zielzellen können jede beliebige Zelle sein, deren zelluläre Membran aus einer Lipid-Doppelschicht zusammengesetzt ist, und im Allgemeinen fallen darunter eukariontische Zellen und vorzugsweise Säugetier-Zellen, stärker bevorzugt Zellen von mäuseartigen Nagetieren oder menschliche Zellen.
Wenn die gegenständlichen Liposomen in vivo verabreicht werden sollen, kann es bevorzugt sein, diese Liposomen an eine Einheit zu konjugieren, die dafür sorgt, dass die Liposomen an Zielzellen binden. Beispiele für solche zielgerichteten Einheiten umfassen Antikörper oder Liganden, die selektiv an die Zielzellen binden. Verfahren zum Konjugieren von Liposomen an zielgerichtete Einheiten, beispielsweise Antikörper, sind im Stand der Technik gut bekannt und oben diskutiert. Beispielsweise können die gegenständlichen Liposomen an einen antiviralen Antikörper konjugiert werden, wenn die Liposomen ein antivirales Konstrukt enthalten, beispielsweise eine Nucleinsäure, die für ein Genprodukt codiert, dass transfizierte Zellen empfänglich für ein bestimmtes Medikament macht.
Wenn die Transfektion in vitro bewirkt wird, wird eine geeignete Menge der gegenständlichen Liposomen einem Zellkultur-Medium zugesetzt, das die Zielzellen enthält. Eine geeignete Menge an Liposomen-Zusammensetzung kann im Bereich von etwa 0,12 bis 1,2 mg Liposomen pro 10⁶ Zellen oder von etwa 0,1 bis etwa 10 μg verkapselter DNA pro 10⁶ Zellen liegen. Den Fachleuten wird jedoch klar sein, dass diese Menge in Abhängigkeit von Faktoren wie der Labilität der jeweiligen Zielzelle, ihrer Resistenz gegenüber einer Transfektion, ob die Liposomen kleinere oder größere Nucleinsäuren enthalten, der Aktivität des jeweiligen Gens und des gewünschten Niveaus der Genexpression schwanken bzw. verändert werden kann.
Die gebildeten, liposomal transfizierten Zellen können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden. Beispielsweise können die Zellen verwendet werden, um ein Polypeptid zu exprimieren, das von den eingeschlossenen Nucleinsäuren codiert wird, beispielsweise ein gewünschtes Säugetier-Genprodukt. Auch können dann, wenn die eingeschlossenen Nucleinsäuren bewirken, dass die Zellen einen bestimmten genetischen Defekt exprimieren, die Zellen als Modelle zum Studieren der Wirksamkeit vorgeschlagener Therapien für den jeweiligen genetischen Defekt verwendet werden.
Alternativ können dann, wenn eine in vitro erfolgte liposomale Transfektion zur Einschleusung von Genen führt, die gewisse genetische Defekte kompensieren oder die für eine Einheit wie beispielsweise eine Antisense-RNA, ein Ribozym oder ein therapeutisches Protein codieren, diese Zellen an einen Wirt verabreicht werden, der eine genetische Therapie benötigt. Siehe US-Patent Nr. 5,399,346.
Wenn die nucleinsäurehaltigen Liposomen in vivo verwendet werden sollen, werden sie einem Wirt verabreicht, der eine genetische Therapie benötigt. Eine andere Abwandlung eines in vivo erfolgenden Einsatzes betrifft die Erzeugung von genetischen Defekten, beispielsweise transgenen oder „knock-out"-Mäusen, die für das Studium von Krankheiten nützlich sind. Ein Beispiel einer genetischen Therapie in einem Patienten ist dasjenige, dass ein DNA-Konstrukt, das für das menschliche Leukozyten-Antigen B7 (HLAB7) codiert, in einem Liposom wie oben beschrieben verkapselt und direkt in die Tumor-Läsionen eines Patienten injiziert wird, der an einem cutanen Melanom leidet, wie in Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11307 (1993) beschrieben, wobei dieser Artikel durch die Bezugnahme in seiner Gesamtheit als vorliegend enthalten gelten soll. Das HLAB7 stimuliert die Immunantwort des Wirts gegen die Melanomzelle.
Im Allgemeinen wird eine in vivo verabreichte liposomale Dosierung im Bereich von etwa 0,2 bis 20 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise von etwa 2 bis 10 mg/kg Körpergewicht liegen. Der Betrag wird sich natürlich nach dem jeweiligen genetischen Defekt, der Art der verkapselten Nucleinsäure, dem gewünschten Niveau der Genexpression, der Menge an in den Liposomen verkapselter Nucleinsäure und anderen Faktoren wie oben diskutiert richten.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass sie die Einschleusung episomaler Elemente beispielsweise DNA-Plasmide in Zielzellen ermöglicht. Vorzugsweise werden die Liposomen an eine zielgerichtete Einheit, beispielsweise an einen Antikörper konjugiert, um die Einschleusung zu verbessern, wenn das gewünschte Ziel ein in vivo Ziel ist, beispielsweise ein Tumor. Dies vermeidet einige der Probleme, die auf dem Weg über die Integration von heterologen Nucleinsäuren in normale Wirtszell-Genome auftreten.
Liposomen-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können mit zusätzlichen Substanzen verabreicht werden, beispielsweise pharmazeutischen Trägern und Exzipienten (den Zerfall fördernden Mitteln). Geeigneter Träger oder Exzipienten sind in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES: DRUG RECEPTORS AND RECEPTOR THEORY, (18. Ausgabe), Mack Publishing Co., Easton PA (1990) beschrieben. Die Wahl des Trägers, Verdünnungsmittels, Exzipienten etc. wird von der gewünschten Art der Darreichung abhängen. Die liposomalen Zusammensetzungen der Erfindung können auf jedem beliebigen Weg verabreicht werden, der derzeit zur Abgabe von Polynucleotidmolekülen an Zellen bekannt ist, darunter, ohne darauf beschränkt zu sein, intravenöse oder intramuskuläre Injektion, transdermal als Bestandteil einer Salbe oder Creme, intratracheal, intranasal oder oral durch Aerosol oder durch eine Tropflösung, rektal usw. Vorzugsweise werden die Liposomen jedoch durch Injektion verabreicht.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Liposomen in vivo in Kombination mit anderen Medikamenten verabreicht werden, die sich zur Behandlung einer bestimmten Krankheit eignen. Beispielsweise kann es dann wünschenswert sein, wenn die Liposomen ein „Selbstmordgen" enthalten, das die Zielzellen empfänglich für ein bestimmtes Medikament macht, Liposomen zusammen mit dem Medikament zu verabreichen. Das Medikament kann, muss aber nicht, liposomal verkapselt sein.
Die Effizienz einer in vivo oder in vitro erfolgenden Transfektion kann nach Standardmethoden gemessen werden. Siehe Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Beispielsweise kann die Expression von Genen, die auf einem liposomal verkapselten DNA-Konstrukt codiert sind, mit welchem Zellen in vitro transfiziert wurden, durch Northern Blot-Techniken oder RNA-PCR untersucht werden, um die Produktion von RNA-Transkripten zu messen, und durch Western Blot-Techniken, Immunpräzipitation und in situ Immunhistochemie, um die Protein-Erzeugung aufzufinden und zu messen. Die Integration der DNA in das Chromosom der Wirtszelle kann durch PCR oder durch Southern Blot-Techniken nachgewiesen werden. Die gleichen Verfahren werden verwendet, um zu bestimmen, ob in vivo behandeltes Gewebe transfizierte Gene enthält, oder ob es Genprodukte der transfizierten Gene exprimiert. Dies wird vorzugsweise an einer Biopsieprobe des interessierenden Gewebes durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung, auf diese Weise allgemein beschrieben, lässt sich unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstehen, die zum Zwecke der Erläuterung zur Verfügung gestellt werden und nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung anzusehen sind.
BEISPIEL 3: Erzeugung von liposomal verkapselter DNA
Liposomal verkapselte DNA wurde durch Hydratisieren eines dünnen Lipidfilms unter Verwendung einer hochkonzentrierten DNA-Lösung hergestellt. Im Einzelnen wurden Dimyristoylphosphatidyldiglycerin, Phosphatidylethanolamin und Cholesterin in einem Molverhältnis von 5 : 5 : 7 mit einem Gesamtgewicht von 6,4 mg in einem Rundkolben vermischt. Ein dünner Lipidfilm wurde durch Rotationsverdampfen unter Vakuum gebildet. Der gebildete, trockene Lipidfilm wurde dann hydratisiert, indem 10 μl einer 2 mg/ml Lösung von ³²P-markierter Plasmid-DNA zugegeben wurden. Der hydratisierte Lipidfilm wurde dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurden dem hydratisierten Lipidfilm 10 μl Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) hinzugefügt, und die Mischung wurde verwirbelt (gevortext). Nach dem Vortex-Schritt wurde ergänzende PBS zugesetzt, und zwar genauer gesagt 1,4 μl PBS pro mg Lipid, und die Mischung wurde kräftig verwirbelt. Diese gevortexte Zusammensetzung ließ man dann zwei Stunden bei Raumtemperatur quellen, und die gebildete, Liposomen enthaltende Suspension wurde verwirbelt. In einigen Fällen wurde zusätzliche PBS (8 μl/mg Lipid) zugesetzt, sofern erforderlich. Freie (unverkapselte) DNA wurde daraufhin entfernt, indem die Liposomen durch Zentrifugation (3 × bei 70000 g für 30 min) in PBS zentrifugiert wurden.
Die Verkapselungseffizienz wurde dann bestimmt, indem die in einem Aliquot einer liposomalen DNA-Präparation enthaltene Radioaktivität gezählt wurde. Es wurde festgestellt, dass die Einfangrate 70% bis 90% betrug, bezogen auf die Anfangs-Zählwerte (counts). Darüber hinaus war dieses Ergebnis der zusätzlichen Tests in zuverlässiger Weise reproduzierbar.
BEISPIEL 2: In vitro erfolgende Transfektion von Säugerzellen unter Verwendung von liposomal verkapselten DNA-Plasmiden
Squamöse SCC 35 Karzinomzellen wurden mit den Plasmiden pSV40neo und pRSVcat transfiziert, von denen das eine das Neomycin-Resistenzgen und das andere das Chloramphenicol-Acyltransferase-Gen enthält. Diese Plasmide wurden ausgewählt, um die Messung der Wirksamkeit von transienter und stabiler Transfektion von Zellen messen zu können, die mit verschiedenen Transfektionsmethoden transfiziert wurden.
pSV40neo (Promega Corp., Madison, WI) enthält ein Gen für die Neomycin-Resistenz, was es möglich macht, dass transfizierte Zellen, die das Genprodukt exprimieren, in Kultur in einem Neomycin-haltigen Medium überleben können. Wenn die Kultur über längere Zeit in Neomycin gehalten wird, sind die einzigen Zellen, die überleben, solche, die das neo-Gen stabil in ihre Chromosomen integriert enthalten.
pRSVcat (Promega Corp., Madison, WI) enthält ein Gen, das für Chloramphenicol-Acyltransferase codiert. Das Niveau der transienten Expression des cat-Gens in Zellen, die mit pRSVcat transfiziert waren, wurde mit einem Standard-CAT-Test gemessen.
Tabelle 1 vergleicht die Ergebnisse, die nach Transfektion von SCC 35 Zellen mit pSV40neo und pRSVcat unter Verwendung der Minimalvolumen-Einfang-(MVE-)Liposomentransfektionsmethode der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, mit den Ergebnissen, die mit DEAE-Dextran unter Standardbedingungen, mit Calciumphosphat unter Standardbedingungen und mit einem kommerziell erhältlichen kationischen Lipid-Reagens (Lipofectin, Life Technologies, Gaithersburg, MD) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen erhalten wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Nucleinsäuren, die gemäß der vorliegenden Erfindung in Liposomen verkapselt sind, stark verbesserte Transfektionseffizienzen liefern, verglichen mit anderen verfügbaren Techniken, beispielsweise DEAE-Dextran-, Calciumphosphat- und Lipofectin^TM-Reagens-mediierter Transfektion. Ohne dass die Erfinder an irgendeine Theorie des Mechanismus' der Wirkung gebunden sein wollen, glauben sie, dass die gesteigerten Transfektions-Effizienzen, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beobachtet werden, deren hoher Verkapselungs-Effizienz zuzuschreiben sind, was für eine Liposomenpopulation sorgt, in der ein sehr hoher Prozentsatz der Liposomen verkapselte Nucleinsäuren enthalten.
BEISPIEL 3: Zelluläre Aufnahme von liposomal verkapselter Plasmid-DNA
Plasmid-DNA (18 kB) wurde mit ³⁵S unter Standardbedingungen nicktranslatiert. Siehe Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). Diese DNA wurde dann wie in Beispiel 1 beschrieben in Liposomen verkapselt. Die Liposomen bestanden aus Dimyristoylphosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin und Cholesterin in einem Verhältnis von 5 : 5 : 7, wie in Beispiel 1 beschrieben. Diese liposomale Lösung wurde zu einer Kultur von Zellen des SCC 35 Epithelzellenkarzinoms gegeben, die in Mikrokammer-Glasplatten ausgesät waren, und zwar mit einer Liposomen-Endkonzentration von 1 μM. Die Zellen wurden 24 Stunden lang inkubiert, worauf sie gewaschen und dann einer Emulsions-Autoradiographie unterworfen wurden. Diese zeigte ein dichtes Areal von schwarzen Punktenim intrazellulären Kompartiment und in der Umgebung der Zelloberfläche, die dem Vorhandensein von radioaktiv markierter Plasmid-DNA entsprechen. Diese Ergebnisse zeigten, dass liposomale DNA wirksam von den Zellen aufgenommen wurde und eindrang.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, zeigen das Niveau derjenigen Fachleute an, an die sich die Erfindung richtet. Auch wenn sich das Vorstehende auf besonders bevorzugte Ausgestaltungen bezieht, sollte klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht so beschränkt ist. Es wird den Durchschnittsfachleuten deutlich werden, dass die offenbarten Ausführungsformen auf verschiedene Art und Weise abgewandelt werden können und dass es beabsichtigt ist, das solche Modifikationen sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung befinden, die durch die nachstehenden Ansprüche definiert ist.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer liposomenverkapselten Nucleinsäure, umfassend die folgenden Schritte: (i) Inkubieren eines hydratisierten Lipid-Films über einen wirksamen Zeitraum hinweg bei einer abgesenkten Temperatur, wobei der hydratisierte Lipidfilm durch Zugabe einer konzentrierten wässrigen Lösung einer Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht zu einem getrockneten Lipidfilm erhalten wird, worin die Größe der genannten Nucleinsäure mindestens 2 kB beträgt und worin diese Nucleinsäurelösung eine Konzentration von 1 bis 5 mg/ml besitzt und dem genannten getrockneten Lipidfilm in einem Verhältnis von weniger als oder gleich etwa 1.6 μl pro mg Lipid zugesetzt wird; (ii) Zugeben einer möglichst geringen, wirksamen Menge an phosphatgepufferter Salzlösung zum hydratisierten Lipidfilm und Verwirbeln (Vortexen) des Materials über einen Zeitraum hinweg, der ausreichend ist, um Liposomen zu erzeugen und diese Liposomen einer Quellung zu unterziehen; und (iii) Verwirbeln (Vortexen) der erzeugten gequollenen Liposomen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lipidfilm mindestens ein Lipid umfasst, das ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus Dimyristoyl-Diglycerin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Lysophosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Sphingolipiden, Phosphatidylglycerin, Sphingomyelin, Cardiolipin, Glycolipiden, Gangliosiden, Cerebrosiden, Cholesterin, Tocopherol und Retinol besteht.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Lipidfilm Dimyristoyldiglycerin, Phosphatidylethanolamin und Cholesterin in einem Molverhältnis der Komponenten zueinander von etwa 5 : 5 : 7 umfasst.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, worin der genannte wirksame Zeitraum für den Inkubationsschritt mindestens 12 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, worin der genannte Zeitraum zum Bilden und Quellen der Liposomen mindestens 30 Minuten beträgt.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, worin die Größe der Nucleinsäure 2 kB bis etwa 20 kB beträgt, vorzugsweise etwa 5 kB bis etwa 18 kB.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, worin das Verfahren weiterhin den Schritt (iv) des Entfernens von unverkapselter Nucleinsäure von den Liposomen durch Waschen der Liposomen, vorzugsweise durch Waschen derselben durch Zentrifugation, umfasst.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, worin die genannte Nucleinsäure ein Plasmid, ein Phagemid oder ein Cosmid ist.
Verfahren zum Transfizieren von Zellen, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge an gequollenen, Nucleinsäurehaltigen Liposomen, worin die Liposomen nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt sind.
Liposomen, umfassend eine Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht, hergestellt nach dem Verfahren eines beliebigen der Ansprüche 1 bis B.
Liposom nach Anspruch 10, worin die genannte DNA mit hohem Molekulargewicht eine Antisense-RNA, ein Ribozym oder ein therapeutisches Protein codiert.
Liposomen nach Anspruch 11, worin das therapeutische Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Blutplättchenwachstumsfaktor (platelet-derived growth factor), Epidermis-Wachstumsfaktor, Interleukinen 1 bis 14, granulozytenkoloniestimulierendem Faktor, granulozytenmacrophagenkoloniestimulierendem Faktor, Tumornekrosefaktor, leukämieinhibierendem Faktor, Amphiregulin, Angiogenin, Betacellulin, Calcitonin, ciliärem neurotrophem Faktor, aus dem Gehirn stammendem neurotrophem Faktor (brain-derived neurotrophic factor), Neurotrophinen 3 and 4, Nervenwachstumsfaktor, koloniestimulierendem Faktor-1, Endothelzell-Wachstumsfaktor, Erythropoietin, saurem und basischem Fibroblasten- Wachstumsfaktor, Hepatocyten-Wachstumsfaktor, heparinbindendem EGF-artigem Wachstumsfaktor, Insulin, insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II, Interferonen α, β und χ, Keratinocyten-Wachstumsfaktor, Macrophagen-Entzündungsprotein α und β, Midkin, Oncostatin M, RANTES, Stammzellenfaktor, transformierenden Wachstumsfaktoren α and β und vaskulärem endothelialem Wachstumsfakor besteht, oder worin die genannte DNA mit hohem Molekulargewicht weiterhin einen gewebespezifischem Promotor codiert, der operativ mit der genannten Antisense-RNA, dem Ribozym oder dem therapeutischen Protein verknüpft ist.
Liposomenpräparation, umfassend eine Nucleinsäure mit einer Größe von mindestens 2 kB, worin mindesten 25% der genannten Liposome diese Nucleinsäure enthalten.
Liposomenpräparation, umfassend eine Nucleinsäure mit einer Größe von mindestens 5 kB, worin mindesten 10% der genannten Liposomen diese Nucleinsäure enthalten.
Verfahren zum Herstellen einer liposomen-verkapselten Nucleinsäure, umfassend die Schritte: (i) Inkubieren eines hydratisierten Lipidfilms über etwa zwei Stunden hinweg bei Raumtemperatur, wobei der genannte hydratisierte Lipidfilm durch Zugabe einer konzentrierten wässrigen Lösung einer Nucleinsäure mit hohem Molekulargewicht zu einem getrockneten Lipidfilm in einem Verhältnis von weniger als oder gleich etwa 1,6 μl DNA-Lösung pro mg Lipid gebildet wird, worin die Nucleinsäure eine Größe von mindesten 2 kB besitzt und worin die Nucleinsäurelösung eine Konzentration von 1–5 mg/ml besitzt; (ii) Zugeben einer phosphatgepufferten Salzlösung zu dem hydratisierten Lipidfilm in einem Verhältnis von weniger oder gleich etwa 1,6 μl pro mg Lipid und Verwirbeln (Vortexen) über einen Zeitraum hinweg, der ausreichend ist, um Liposomen zu erzeugen und diese Liposomen zum Quellen zu bringen; und (iii) Verwirbeln (Vortexen) der gebildeten gequollenen Liposomen, wodurch mindestens 25% der Nucleinsäure in die Liposomen inkorporiert wird.