JP2023514190A - Ｖｅｇｆ－ａ発現をサイレンシングするための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＶＥＧＦ－Ａを標的化する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物およびＶＥＧＦ－Ａの発現を変更する（例えば、阻害する）ためにこのようなｄｓＲＮＡ 組成物を使用する方法に関する。

Description

関連出願
本願は、２０２０年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／９７２，５１９号、２０２０年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６３／０５５，６２７号および２０２１年１月２２日に出願された米国特許仮出願第６３／１４０，７１４号に対する優先権の利益を主張するものである。前記出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列リスト
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列リストを含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年２月４日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２０３８＿７２３６ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、３２７，２５５バイトのサイズである。
開示の分野
本開示は、ＶＥＧＦ－Ａの発現の特異的阻害に関する。
滲出性加齢性黄斑変性症（滲出性ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を含む血管性眼疾患は、今日の高齢化人口における視力喪失の主な原因である。これらの眼疾患のうちいくつかは、病的血管新生と関連している。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の放出は、眼における血管透過性および不適切な新規血管成長の増大に寄与する。血管新生性眼疾患の新規処置が必要である。
本開示は、ＶＥＧＦ－Ａの発現をモジュレートするための方法およびｉＲＮＡ組成物を記載する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの発現は、ＶＥＧＦ－Ａ特異的ｉＲＮＡを使用して低減または阻害される。このような阻害は、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害、例えば、眼疾患（例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後黄斑浮腫（ＭＥｆＲＶＯ）または網膜中心静脈閉塞症（ＣＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ））の処置において有用であり得る。
したがって、細胞において、または対象において（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト対象において）ＶＥＧＦ－ＡのＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断を達成する組成物および方法が本明細書において記載される。また、ＶＥＧＦ－Ａの発現と関連する障害、例えば、血管新生性眼疾患（例えば、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、ＣＶＯ、ＲＯＰ、ＤＭＥ、ｍＣＮＶおよびＤＲ））を処置するための組成物および方法も記載される。
本明細書において特徴とされる組成物中に含まれるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、領域、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ヒトＶＥＧＦ－Ａ）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である、３０ヌクレオチドまたはそれ以下、一般に、１９～２４ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）（本明細書において「ＶＥＧＦ－Ａ特異的ｉＲＮＡ」とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ転写物は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ転写物、例えば、本明細書における配列番号１である。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡの領域に対して実質的に相補的である領域を有するアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡは、配列ＮＭ＿００１１７１６２３．１（配列番号１）を有する。ＮＭ＿００１１７１６２３．１の配列はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列番号１の逆相補体は、本明細書において配列番号２として提供される。
一部の態様では、本開示は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、ヒトＶＥＧＦ－Ａのコーディング鎖の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、ヒトＶＥＧＦ－Ａの非コーディング鎖の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも１５の連続するヌクレオチドと相補的である。
一部の態様では、本開示は、ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも１５の連続するヌクレオチドと相補的である。
一部の態様では、本開示は、そうでなければ同様の未処置細胞または組織と比較して、低減されたレベルのＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはあるレベルのＶＥＧＦ－Ａタンパク質を含むヒト細胞または組織を提供し、適宜、細胞または組織は、遺伝子操作されてもよく（例えば、細胞または組織は、１以上の天然に存在する突然変異を含む、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）、適宜、レベルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減されてもよい。一部の実施形態では、ヒト細胞または組織は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である。
本開示はまた、一部の態様では、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞も提供する。
別の態様では、そうでなければ同様の未処置細胞と比較して低減されたレベルのＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはあるレベルのＶＥＧＦ－Ａタンパク質を含むヒト眼細胞、例えば、（ＲＰＥ細胞、レチナール細胞、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞または光受容体細胞）が本明細書において提供される。一部の実施形態では、レベルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減される。
一部の態様では、本開示はまた、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ剤を含む、ＶＥＧＦ－Ａをコードする遺伝子の発現を阻害する医薬組成物を提供する。本開示はまた、一部の態様では、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法を提供し、方法は：
（ａ）細胞を、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ剤または本明細書において記載される医薬組成物と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）において生成された細胞を、ＶＥＧＦ－ＡのｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
を含む。
本開示はまた、一部の態様では、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法を提供し、方法は：
（ａ）細胞を、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ剤または本明細書において記載される医薬組成物と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）において生成された細胞を、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
を含む。
本開示はまた、一部の態様では、眼細胞または組織においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法を提供し、方法は：
（ａ）細胞または組織を、ＶＥＧＦ－Ａに結合するｄｓＲＮＡ剤と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）において生成された細胞または組織を、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ－Ａ タンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって、細胞または組織においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
を含む。
本開示はまた、一部の態様では、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害と診断された対象を処置する方法であって、対象に本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ剤または本明細書において記載される医薬組成物の治療上有効量を投与することを含み、それによって、障害を処置する方法を提供する。
本明細書における態様、例えば、上記の組成物および方法のいずれかでは、本明細書における（例えば、以下の）実施形態のいずれかが提供され得る。
一部の実施形態では、ヒトＶＥＧＦ－Ａのコーディング鎖は、配列番号１の配列を有する。一部の実施形態では、ヒトＶＥＧＦ－Ａの非コーディング鎖は、配列番号２の配列を有する。
一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも１７の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも１９の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも２１の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の０または１、２または３つのミスマッチを有する少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、センス鎖の部分は、配列番号１のヌクレオチド１８５５～１８７５、１８５８～１８７８、２１７８～２１９８、２１８１～２２０１、２９４４～２９６４、２９４６～２９６６、２９５２～２９７２、３３６１～３３８１または３３６２～３３８２内の部分である。一部の実施形態では、センス鎖の部分は、配列番号４２００、４２０１、４２０２、４２０３、４２０４、４２０５、４２０６、４２０７、４２０８、４２０９、４２１０または４２１１に対応する部分である。
一部の実施形態では、センス鎖の部分は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおけるセンス鎖内の部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の部分は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおけるアンチセンス鎖内の部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列のうち１つに由来する０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列のうち１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列のうち１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ ８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列のうち１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、少なくとも２３ヌクレオチド長、例えば、２３～３０ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、センス鎖の部分は、ＡＤ－１０２０５７４（CGACAGAACAGUCCUUAAUCA（配列番号４２００））、ＡＤ－９０１０９４（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０１））、ＡＤ－１０２０５７５（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０２））、ＡＤ－９０１１００（AACAGUGCUAAUGUUAUUGGA（配列番号４２０３））、ＡＤ－９０１１０１（AGUGCUAAUGUUAUUGGUGUA（配列番号４２０４））、ＡＤ－９０１１１３（GAGAAAGUGUUUUAUAUACGA（配列番号４２０５））、ＡＤ－９０１１２３（AAAAUAGACAUUGCUAUUCUA（配列番号４２０６））、ＡＤ－９０１１２４（AAAUAGACAUUGCUAUUCUGA（配列番号４２０７））、ＡＤ－９０１１５８（GAAAGUGUUUUAUAUACGGUA（配列番号４２０８））、ＡＤ－９０１１５９（GUUUUAUAUACGGUACUUAUA（配列番号４２０９））、ＡＤ－１０２０５７３（AGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（配列番号４２１０））、またはＡＤ－１０２３１４３（AAAAUAGACATUGCUAUUCUA（配列番号４２１１））から選択される二重鎖に由来するセンス鎖内の部分である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、センス鎖の部分は、ＡＤ－１０２０５７４（CGACAGAACAGUCCUUAAUCA（配列番号４２００））、ＡＤ－９０１０９４（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０１））、ＡＤ－１０２０５７５（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０２））、ＡＤ－９０１１００（AACAGUGCUAAUGUUAUUGGA（配列番号４２０３））、ＡＤ－９０１１０１（AGUGCUAAUGUUAUUGGUGUA（配列番号４２０４））、ＡＤ－９０１１１３（GAGAAAGUGUUUUAUAUACGA（配列番号４２０５））、ＡＤ－９０１１２３（AAAAUAGACAUUGCUAUUCUA（配列番号４２０６））、ＡＤ－９０１１２４（AAAUAGACAUUGCUAUUCUGA（配列番号４２０７））、ＡＤ－９０１１５８（GAAAGUGUUUUAUAUACGGUA（配列番号４２０８））、ＡＤ－９０１１５９（GUUUUAUAUACGGUACUUAUA（配列番号４２０９））、ＡＤ－１０２０５７３（AGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（配列番号４２１０））、またはＡＤ－１０２３１４３（AAAAUAGACATUGCUAUUCUA（配列番号４２１１））のセンス鎖から選択されるセンス鎖である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、センス鎖の部分は、ＡＤ－９５３３７４（配列番号８１３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１２９７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１２９８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号８００）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号２６１）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号７８７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号２６２）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号８４５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号７７９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号８４４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号７８４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号７９０）から選択される二重鎖に由来するセンス鎖内の部分である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、センス鎖の部分は、ＡＤ－９５３３７４（配列番号８１３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１２９７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１２９８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号８００）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号２６１）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号７８７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号２６２）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号８４５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号７７９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号８４４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号７８４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号７９０）のセンス鎖から選択されるセンス鎖である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の部分は、ＡＤ－１０２０５７４（UGAUUAAGGACUGUUCUGUCGAU（配列番号４２１２））、ＡＤ－９０１０９４（UCUGGAUUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１３））、ＡＤ－１０２０５７５（UCUGGATUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１４））、ＡＤ－９０１１００（UCCAAUAACAUUAGCACUGUUAA（配列番号４２１５））、ＡＤ－９０１１０１（UACACCAAUAACAUUAGCACUGU（配列番号４２１６））、ＡＤ－９０１１１３（UCGUAUAUAAAACACUUUCUCUU（配列番号４２１７））、ＡＤ－９０１１２３（UAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUAU（配列番号４２１８））、ＡＤ－９０１１２４（UCAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUA（配列番号４２１９））、ＡＤ－９０１１５８（UACCGUAUAUAAAACACUUUCUC（配列番号４２２０））、ＡＤ－９０１１５９（UAUAAGUACCGUAUAUAAAACAC（配列番号４２２１））、ＡＤ－１０２０５７３（UACACCAAUAACATUAGCACUGU（配列番号４２２２））、またはＡＤ－１０２３１４３（UAGAAUAGCAATGTCTAUUUUAU（配列番号４２２３））から選択される二重鎖に由来するアンチセンス鎖内の部分である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の部分は、ＡＤ－１０２０５７４（UGAUUAAGGACUGUUCUGUCGAU（配列番号４２１２））、ＡＤ－９０１０９４（UCUGGAUUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１３））、ＡＤ－１０２０５７５（UCUGGATUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１４））、ＡＤ－９０１１００（UCCAAUAACAUUAGCACUGUUAA（配列番号４２１５））、ＡＤ－９０１１０１（UACACCAAUAACAUUAGCACUGU（配列番号４２１６））、ＡＤ－９０１１１３（UCGUAUAUAAAACACUUUCUCUU（配列番号４２１７））、ＡＤ－９０１１２３（UAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUAU（配列番号４２１８））、ＡＤ－９０１１２４（UCAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUA（配列番号４２１９））、ＡＤ－９０１１５８（UACCGUAUAUAAAACACUUUCUC（配列番号４２２０））、ＡＤ－９０１１５９（UAUAAGUACCGUAUAUAAAACAC（配列番号４２２１））、ＡＤ－１０２０５７３（UACACCAAUAACATUAGCACUGU（配列番号４２２２））、またはＡＤ－１０２３１４３（UAGAAUAGCAATGTCTAUUUUAU（配列番号４２２３））のアンチセンス鎖から選択されるアンチセンス鎖である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の部分は、ＡＤ－９５３３７４（配列番号９４３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１４２７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１４２８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号９３０）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号３９０）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号９１７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号３９１）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号９７５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号９０９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号９７４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号９１４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号９２０）から選択される二重鎖に由来するアンチセンス鎖内の部分である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の部分は、ＡＤ－９５３３７４（配列番号９４３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１４２７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１４２８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号９３０）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号３９０）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号９１７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号３９１）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号９７５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号９０９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号９７４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号９１４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号９２０）のアンチセンス鎖から選択されるアンチセンス鎖である。
一部の実施形態では、部分は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾された配列の部分である。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ＡＤ－１０２０５７４（配列番号４２００および４２１２）、ＡＤ－９０１０９４（配列番号４２０１および４２１３）、ＡＤ－１０２０５７５（配列番号４２０２および４２１４）、ＡＤ－９０１１００（配列番号４２０３および４２１５）、ＡＤ－９０１１０１（配列番号４２０４および４２１６）、ＡＤ－９０１１１３（配列番号４２０５および４２１７）、ＡＤ－９０１１２３（配列番号４２０６および４２１８）、ＡＤ－９０１１２４（配列番号４２０７および４２１９）、ＡＤ－９０１１５８（配列番号４２０８および４２２０）、ＡＤ－９０１１５９（配列番号４２０９および４２２１）、ＡＤ－１０２０５７３（配列番号４２１０および４２２２）、またはＡＤ－１０２３１４３（配列番号４２１１および４２２３）から選択される二重鎖の対形成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ＡＤ－９５３３７４（配列番号８１３および９４３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１２９７および１４２７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１２９８および１４２８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号８００および９３０）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号２６１および３９０）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号７８７および９１７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号２６２および３９１）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号８４５および９７５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号７７９および９０９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号８４４および９７４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号７８４および９１４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号７９０および９２０）から選択される二重鎖の対形成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表２Ａ、３Ａ、４Ａまたは表１８Ａにおいて提供される対応する化学的に修飾されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方は、１つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域において１つまたは複数の位置にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ｌｏｇＫｏｗによって測定された親油性部分の親油性は、０を超える。一部の実施形態では、一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける未結合フラクションによって測定された二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、０．２を超える。一部の実施形態では、血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖ヌクレオチドの５つ以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの５つ以下は、未修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチドおよび２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、センス鎖ヌクレオチドの５つ以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの５つ以下は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、アンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）以外の修飾を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の連続するヌクレオチドのうち２つの間またはアンチセンス鎖の連続するヌクレオチドのうち２つの間に非ヌクレオチドスペーサーを含む（非ヌクレオチドスペーサーは、Ｃ３－Ｃ６アルキルを含んでもよい）。
一部の実施形態では、各鎖は、３０以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一部の実施形態では、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、各鎖は、１９～２３ヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、各鎖は、２１～２３ヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、薬剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の３’末端においてである。一部の実施形態では、鎖は、アンチセンス鎖である。一部の実施形態では、鎖は、センス鎖である。
一部の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端においてである。一部の実施形態では、鎖はアンチセンス鎖である。一部の実施形態では、鎖はセンス鎖である。
一部の実施形態では、１つの鎖の５’および３’末端の各々は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、鎖はアンチセンス鎖である。
一部の実施形態では、二重鎖のアンチセンス鎖の５’端の１つの位置の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一部の実施形態では、センス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の親油性部分は、少なくとも１つの鎖上の１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、１つまたは複数の親油性部分は、リンカーまたは担体を介して少なくとも１つの鎖における１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、内部位置は、少なくとも１つの鎖の各端からの末端の２つの位置を除く全ての位置を含む。一部の実施形態では、内部位置は、少なくとも１つの鎖の各端からの末端の３つの位置を除く全ての位置を含む。一部の実施形態では、内部位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。一部の実施形態では、内部位置は、センス鎖の５’端から数えて位置９～１２を除く全ての位置を含む。一部の実施形態では、内部位置は、センス鎖の３’端から数えて位置１１～１３を除く全ての位置を含む。一部の実施形態では、内部位置は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く。一部の実施形態では、内部位置は、アンチセンス鎖の５’端から数えて位置１２～１４を除く全ての位置を含む。一部の実施形態では、内部位置は、センス鎖の３’端から数えて位置１１～１３とアンチセンス鎖の５’端から数えて位置１２～１４とを除く全ての位置を含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の親油性部分は、各鎖の５’端から数えて、センス鎖における位置４～８および１３～１８ならびにアンチセンス鎖における位置６～１０および１５～１８からなる群から選択される内部位置の１つまたは複数にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、１つまたは複数の親油性部分は、各鎖の５’端から数えて、センス鎖における位置５、６、７、１５、および１７ならびにアンチセンス鎖における位置１５および１７からなる群から選択される内部位置の１つまたは複数にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、二本鎖領域における位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。
一部の実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長であり、親油性部分は、センス鎖の位置２１、位置２０、位置１５、位置１、位置７、位置６、もしくは位置２またはアンチセンス鎖の位置１６にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、センス鎖の位置２１、位置２０、位置１５、位置１または位置７にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、センス鎖の位置２１、位置２０または位置１５にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、センス鎖の位置２０または位置１５にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、アンチセンス鎖の位置１６にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、センス鎖の５’端から数えて位置６にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。一部の実施形態では、親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される適宜の官能基とを含有する。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する。
一部の実施形態では、親油性部分は、内部位置または二本鎖領域における１つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環状基であるか；またはセリノール骨格もしくはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である。
一部の実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、親油性部分または標的化リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される生物切断性リンカーを介してコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、センス鎖の３’端は、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、標的化リガンド、例えば、眼組織または肝組織を標的化するリガンドをさらに含む。一部の実施形態では、眼組織は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である。
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端または５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。一部の実施形態では、標的化リガンドは、１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。一部の実施形態では、リガンドは、一価リンカーまたは二価、三価または四価分岐リンカーによって付着された、１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。一部の実施形態では、リガンドは、
Figure 2023514190000001
 である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の模式図において示されるようにリガンドにコンジュゲートされる
Figure 2023514190000002
 ［式中、Ｘは、ＯまたはＳである］。一部の実施形態では、ＸはＯである。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１、第２、および第３のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第３のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣物をさらに含む。一部の実施形態では、ホスフェート模倣物は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
一部の実施形態では、本明細書において記載される細胞、例えば、ヒト細胞は、ヒト細胞を、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ剤と接触させることを含むプロセスによって生成された。
一部の実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤とを含む。
一部の実施形態（例えば、本明細書において記載される方法の実施形態）では、細胞は、対象内である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのレベルは、少なくとも５０％阻害される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質のレベルは、少なくとも５０％阻害される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの発現は、少なくとも５０％阻害される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害することは、対象由来の生物学的試料（例えば、水性眼液試料）におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質レベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下させる。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの発現遺伝子を阻害することは、対象由来の生物学的試料（例えば、水性眼液試料）におけるＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡレベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下させる。
一部の実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害と診断されている。一部の実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害の少なくとも１つの診断基準を満たす。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ関連 障害は、湿性加齢性黄斑変性症（湿性ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、網膜静脈閉塞後黄斑浮腫（ＭＥｆＲＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または近視性脈絡膜血管新生（ｍＣＮＶ）である。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害は、黄斑浮腫、例えば、糖尿病性黄斑浮腫である。
一部の実施形態では、眼細胞または組織は、ＲＰＥ、網膜細胞、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管の平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である。
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害は、血管新生性眼疾患である。一部の実施形態では、血管新生性眼疾患は、血管の成長または増殖によって引き起こされるか、またはそれと関連する。一部の実施形態では、血管新生性眼疾患は、眼新血管新生によって引き起こされるか、またはそれと関連する。一部の実施形態では、血管新生性眼疾患は、ＡＭＤ、ＤＲ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、ＲＯＰまたはｍＣＮＶである。
一部の実施形態では、処置は、障害の少なくとも１つの兆候または症状の改善を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの兆候または症状は、血管新生、脈絡膜新血管新生、眼の炎症、視力、またはＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）の存在、レベルもしくは活性のうち１つまたは複数の尺度を含む。
一部の実施形態では、参照レベルよりも高いＶＥＧＦ－Ａのレベルは、対象が血管新生性眼疾患を有することを示す。一部の実施形態では、処置は、障害の進行の防止を含む。一部の実施形態では、処置は、（ａ）血管新生を阻害すること、（ｂ）ＶＥＧＦ－Ａの発現または活性を阻害または低減すること、（ｃ）脈絡膜の新血管新生を阻害すること、（ｄ）脈絡毛細管において新規血管の成長を阻害すること、（ｅ）網膜の厚さを低減すること、（ｆ）視力を高めることまたは（ｇ）眼球内炎症を低減することのうち１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、処置は、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管においてＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも３０％の平均低減をもたらす。一部の実施形態では、処置は、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管においてＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも６０％の平均低減をもたらす。一部の実施形態では、処置は、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管においてＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも９０％の平均低減をもたらす。
一部の実施形態では、処置後、対象は、網膜におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回用量後、少なくとも８週間の期間のノックダウンを経験する。一部の実施形態では、処置は、網膜におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回用量後、少なくとも１２週間の期間のノックダウンをもたらす。一部の実施形態では、処置は、網膜におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回用量後、少なくとも１６週間の期間のノックダウンをもたらす。
一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に眼内に投与される。一部の実施形態では、眼球内投与は、硝子体内投与、例えば、硝子体内注射、経強膜投与、例えば、経強膜注射、結膜下投与、例えば、結膜下注射、球後投与、例えば、球後注射、前房内投与、例えば、前房内注射または網膜下投与、例えば、網膜下注射を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に静脈内に投与される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に局所的に投与される。
一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、対象におけるＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）のレベルを測定することをさらに含む。一部の実施形態では、対象におけるＶＥＧＦ－Ａのレベルを測定することは、対象から得た生物学的試料（例えば、水性眼液試料）におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質のレベルを測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、血液検査、画像検査または眼房水生検（例えば、房水タップ）を実施することをさらに含む。
一部の実施形態では、対象におけるＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）のレベルをさらに測定する本明細書において記載される方法は、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物を用いる処置の前に実施される。一部の実施形態では、対象が参照レベルよりも高いＶＥＧＦ－Ａのレベルを有すると決定されると、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物が対象に投与される。一部の実施形態では、対象におけるＶＥＧＦ－Ａのレベルを測定することは、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物を用いる処置後に実施される。
一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害の処置または予防にとって好適な療法を用いて対象を処置することをさらに含む、例えば、療法は、光線力学的療法、光血液凝固療法または硝子体切除術を含む。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、対象にＶＥＧＦ－Ａ関連障害の処置または予防にとって好適な追加の薬剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬または抗ＶＥＧＦ－Ａ剤を含む。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ剤は、融合タンパク質または抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子）を含む。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
本開示の種々の実施形態の詳細は、以下の説明において示されている。本開示の他の特徴、目的および利点は、記載および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１Ａは、ＡＤ－６４２２８（配列番号４１６２および４１６３）、ＡＤ－９５３３７４（配列番号５５３および６８３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１０３７および１１６７）、ＡＤ－９５３３３６（配列番号５１８および６４８）、ＡＤ－９５３３３７（配列番号５２２および６５２）、ＡＤ－９０１３７６（配列番号４１５７および１３１）、ＡＤ－９５３３６４（配列番号５６７および６９７）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列および化学を表す図である。図１Ｂは、ＡＤ－９５３３４０（配列番号５１７および６４７）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号５４０および６７０）、ＡＤ－９５３３４２（配列番号５２３および６５３）、ＡＤ－９５３３０８（配列番号５７９および７０９）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号５２７および６５７）、ＡＤ－９５３３３９（配列番号５２８および６５８）およびＡＤ－９５３３６３（配列番号５１９および６４９）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列および化学を表す図である。各ｓｉＲＮＡについて、「Ｆ」は、「２’－フルオロ」修飾であり、ＯＭｅは、メトキシ基であり、ＧＮＡは、グリコール核酸を指し、「ＤＮＡ」とは、ＤＮＡ塩基を指し、２－Ｃ１６は、標的化リガンドを指し、ＰＳは、ホスホロチオエート連結を指す。 同上。 図２は、Ｘ軸に示された例示的二重鎖（左から右へ：ＰＢＳ対照、未処置対照、ＡＡＶ陽性対照（ＡＤ－６４２２８）、ＡＤ－９０１３７６．２、ＡＤ－９５３３０８．２、ＡＤ－９５３３３６．２、ＡＤ－９５３３３７．２、ＡＤ－９５３３３９．２、ＡＤ－９５３３４０．２、ＡＤ－９５３３４２．２、ＡＤ－９５３３４４．２、ＡＤ－９５３３５１．２、ＡＤ－９５３３６３．２、ＡＤ－９５３３６４．２、ＡＤ－９５３３７４．２、ＡＤ－９５３５０４．２）を用いる処置後１４日目のマウスにおける、ＰＢＳに対して正規化された、残存するＶＥＧＦ－Ａメッセージのパーセントを表すグラフである。 図３Ａは、ＡＤ－９０１３４９（配列番号４１５６および１３０）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１０３８および１１６８）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号３および１３２）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号４および１３３）、ＡＤ－９５３３６５（配列番号５５２および６８２）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号５８５および７１５）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号５８４および７１４）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列および化学を表す図である。図３Ｂは、ＡＤ－９５３３３８（配列番号５２０および６５０）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号５２４および６５４）、ＡＤ－９５３３７５（配列番号５３０および６６０）、ＡＤ－９５３３４１（配列番号５３２および６６２）、ＡＤ－９５３３７０（配列番号５３３および６６３）、ＡＤ－９５３３８６（配列番号５４１および６７１）、ＡＤ－６４９５８（配列番号５００３および５００４）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列および化学を表す図である。各ｓｉＲＮＡについて、「Ｆ」は、「２’－フルオロ」修飾であり、ＯＭｅは、メトキシ基であり、ＧＮＡは、グリコール核酸を指し、２－Ｃ１６は、標的化リガンドを指し、ＰＳは、ホスホロチオエート連結を指す。 同上。 図４は、Ｘ軸に示された例示的二重鎖（左から右へ：ＰＢＳ対照、未処置対照、ＡＤ－９０１３４９．１、ＡＤ－９５３４８１．１、ＡＤ－９０１３５６．１、ＡＤ－９０１３５５．１、ＡＤ－９５３３６５．１、ＡＤ－９５３４１０．１、ＡＤ－９５３４１１．１、ＡＤ－９５３３３８．１、ＡＤ－９５３３５０．１、ＡＤ－９５３３７５．１、ＡＤ－９５３３４１．１、ＡＤ－９５３３７０．１、ＡＤ－９５３３８６．１およびＡＤ－６４９５８（ＥＬＦ８ ＴＴＲ対照）を用いる処置後１４日目のマウスにおける、ＰＢＳに対して正規化された、残存するＶＥＧＦ－Ａメッセージのパーセントを表すグラフである。 図５Ａは、ＡＤ－１３９７０５０（配列番号５００５および３９３６）、ＡＤ－１３９７０５１（配列番号５００６および３９１８）、ＡＤ－１３９７０５２（配列番号１０および３９５７）、ＡＤ－１３９７０５３（配列番号５００７および３９２４）、ＡＤ－１３９７０５４（配列番号５００８および２６４０）、ＡＤ－１３９７０５５（配列番号５００９および２７７５）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列及び化学を表す図である。図５Ｂは、ＡＤ－１３９７０５６（配列番号５０１０および２７７６）、ＡＤ－１３９７０５８（配列番号５０１１および３９５３）、ＡＤ－１３９７０５９（配列番号５０１２および３８８９）、ＡＤ－１３９７０６０（配列番号５０１３および３９０２）、ＡＤ－１３９７０６１（配列番号５０１４および３９３２）およびＡＤ－１３９７０６２（配列番号５０１５および３９４４）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列および化学を表す図である。図５Ｃは、ＡＤ－１３９７０６４（配列番号５０１６および３９３８）、ＡＤ－１３９７０６５（配列番号５０１７および３９６５）、ＡＤ－１３９７０６６（配列番号５０１８および３９６２）、ＡＤ－１３９７０６７（配列番号５０１９および３９７１）、ＡＤ－１３９７０６８（配列番号１０４４および３９０１）、ＡＤ－１３９７０６９（配列番号５０２０および３９２８）およびＡＤ－６４９５８（配列番号５００３および５００４）を含む例示的ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの配列および化学を表す図である。各ｓｉＲＮＡについて、「Ｆ」は、「２’－フルオロ」修飾であり、ＯＭｅは、メトキシ基であり、ＧＮＡは、グリコール核酸を指し、「（Ａ２ｐ）」は、アデノシン２’－ホスフェートを指し、「（Ｃ２ｐ）」は、シトシン２’－ホスフェートを指し、「（Ｕ２ｐ）」は、ウラシル２’－ホスフェートを指し、「ＤＮＡ」とは、ＤＮＡ塩基を指し、２－Ｃ１６は、標的化リガンドを指し、ＰＳは、ホスホロチオエート連結を指す。 同上。 同上。 図６は、Ｘ軸に示された例示的二重鎖（左から右へ：ＰＢＳ対照、未処置対照、ＡＤ－１３９７０５０．２、ＡＤ－１３９７０５１．２、ＡＤ－１３９７０５２．２、ＡＤ－１３９７０５３．２、ＡＤ－１３９７０５４．２、ＡＤ－１３９７０５５．２、ＡＤ－１３９７０５６．２、ＡＤ－１３９７０５８．２、ＡＤ－１３９７０５９．２、ＡＤ－１３９７０６０．２、ＡＤ－１３９７０６１．２、ＡＤ－１３９７０６２．２、ＡＤ－１３９７０６４．２、ＡＤ－１３９７０６５．２、ＡＤ－１３９７０６６．２、ＡＤ－１３９７０６７．２、ＡＤ－１３９７０６８．２、ＡＤ－１３９７０６９．２およびＡＤ－６４９５８．１００を用いる処置後１４日目のマウスにおける、ＰＢＳに対して正規化された、残存するＶＥＧＦ－Ａメッセージのパーセントを表すグラフである。
ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを介したｍＲＮＡの配列特異的分解を指示する。ＶＥＧＦ－Ａの発現をモジュレートする（例えば、阻害する）ためのｉＲＮＡおよびそれらを使用する方法が本明細書において記載される。また、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害、例えば、血管新生性眼疾患（例えば、湿性加齢性黄斑変性症（湿性ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、網膜静脈閉塞後黄斑浮腫（ＭＥｆＲＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または近視性脈絡膜血管新生（ｍＣＮＶ））の処置のための組成物および方法も提供される。
ヒトＶＥＧＦ－Ａは、およそ４０ｋＤａの二量体の糖タンパク質であり、新規血管の血管新生成長につながる増殖、遊走および管形成において役割を有する強力な内皮細胞分裂促進因子である。ＶＥＧＦ－Ａは、通常、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜組織、星状細胞、ミュラー細胞、光受容体細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞）、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管および神経節細胞を含む種々の組織によって発現され、分泌される。湿性ＡＭＤ、ＤＲ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、ＲＯＰおよびｍＣＮＶを含むいくつかの血管新生性眼疾患は、病的血管新生と関連している。理論によって制限されることを意図するわけではないが、ＶＥＧＦ－Ａは、例えば、血管透過性を増大することおよび新血管新生を促進することによって、血管新生性眼疾患の病態形成を増悪させ得る。
以下の説明は、ＶＥＧＦ－Ａの発現をモジュレートする（例えば、阻害する）ためのｉＲＮＡを含有する組成物を作製および使用する方法ならびにＶＥＧＦ－Ａの発現と関連する障害を処置するための組成物および方法を開示する。
一部の態様では、ＶＥＧＦ－Ａ ｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するために組成物を使用する方法およびＶＥＧＦ－Ａの発現と関連する障害（例えば、血管新生性眼疾患）を処置するために医薬組成物を使用する方法が、本明細書において特徴とされる。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるある特定の用語および語句の意味は、以下に提供される。本明細書の他の部分における用語の使用とこの節において提供されるその定義の間に明らかな矛盾がある場合には、この節における定義が優先されるものとする。
用語「約」は、数または数的範囲に言及する場合、言及される数または数的範囲は、実験的可変性内の（または総計的実験誤差内の）近似であり、従って、数または数的範囲は、例えば、記載された数または数的範囲の１％から１５％の間で変わる場合があることを意味する。
数または一連の数の前の用語「少なくとも」は、文脈から明白な場合、用語「少なくとも」に隣接する数、および論理的に含まれ得るその後の全ての数または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子におけるヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２０ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１７ヌクレオチド」は、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。少なくとも、なる用語が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連における数および範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
本明細書において使用される場合、「以下」または「未満」は、当該語句に隣接する値およびその値より論理的により小さい値または整数から、文脈から論理的である場合、ゼロまでとして理解される。例えば、「２以下のヌクレオチド」の標的部位に対してミスマッチを有する二重鎖は、２、１または０のミスマッチを有する。「以下」が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「以下」は、一連における数または範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
本明細書において使用される場合、「最大１０」におけるような「最大」は、最大１０および１０を含む、すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０と理解される。
本明細書において提供される範囲は、全ての個々の整数値およびその範囲内の全ての部分範囲を含むと理解される。
用語「活性化する」、「増強する」、「の発現を上方制御する」、「の発現を増大する」などは、それらがＶＥＧＦ－Ａ遺伝子を指す限り、本明細書において、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子が転写され、第１の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第２の細胞または細胞の群（対照細胞）と比較してＶＥＧＦ－Ａ遺伝子の発現が増大するように処置されている第１の細胞または細胞の群から単離され得る、または検出され得るＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡの量の増大によって示されるような、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指す。
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子の発現は、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡの投与によって少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％活性化される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子は、本開示において特徴とされるｉＲＮＡの投与によって少なくとも約６０％、７０％または８０％活性化される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子の発現は、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡの投与によって少なくとも約８５％、９０％または９５％またはそれより多く活性化される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子発現は、未処置細胞における発現と比較して、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡを用いて処置された細胞において少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれより大きく増大する。小さいｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42において、ならびにＵＳ２００７／０１１１９６３およびＵＳ２００５／２２６８４８において記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「サイレンシングする」、「の発現を阻害する」、「の発現を下方制御する」、「の発現を抑制する」などは、それらがＶＥＧＦ－Ａ遺伝子を指す限り、本明細書において、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ発現、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質発現またはＶＥＧＦ－Ａ発現と機能的に関連付けられた別のパラメータに基づいて評価されるようなＶＥＧＦ－Ａの発現の少なくとも部分的な抑制を指す。例えば、ＶＥＧＦ－Ａ発現の阻害は、ＶＥＧＦ－Ａが転写され、ＶＥＧＦ－Ａの発現が対照と比較して阻害されるように処置されている第１の細胞または細胞の群において単離され得る、または検出され得るＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡの量の低減によって示される場合がある。対照は、第２の細胞または細胞の群がそのように処置されていない点を除いて第１の細胞または細胞の群と実質的に同一の第２の細胞または細胞の群（対照細胞）であり得る。阻害の程度は、普通、対照レベルのパーセンテージ、例えば、
Figure 2023514190000003
として表される。
あるいは、阻害の程度は、ＶＥＧＦ－Ａ発現と機能的に関連付けられているパラメータ、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質の量の低減の点で示すことができる。ＶＥＧＦ－Ａ発現と機能的に関連付けられているパラメータの低減は、対照レベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。原理上は、ＶＥＧＦ－Ａサイレンシングは、任意の適当なアッセイによって、構成的またはゲノムエンジニアリングによってＶＥＧＦ－Ａを発現する任意の細胞において決定できる。
例えば、ある特定の例では、ＶＥＧＦ－Ａの発現は、本明細書において開示されるｉＲＮＡの投与によって少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％抑制される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａは、本明細書において開示されるｉＲＮＡの投与によって少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％または８０％抑制される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａは、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡの投与によって少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより多く抑制される。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」とは、標的配列と実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書において使用される場合、用語「相補性の領域」とは、配列、例えば、本明細書において定義されるような標的配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に対して十分に相補的ではない場合ある、ミスマッチは、分子の内部または末端領域中であり得る。一部の実施形態では、相補性の領域は、０、１または２つのミスマッチを含む。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」とは、本明細書において使用される場合、用語が本明細書において定義されるようなアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
用語「ブラント（ｂｌｕｎｔ）」または「ブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）」は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書において使用される場合、ｄｓＲＮＡの所定の末端において無対ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの片端または両端は、ブラントであり得る。ｄｓＲＮＡの両端がブラントである場合、ｄｓＲＮＡは、ブラントエンドであると言われる。明瞭化のため、「ブラントエンド」ｄｓＲＮＡは、両端がブラントであるｄｓＲＮＡ、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、そのような分子は、その長さ全体にわたって二本鎖であろう。
本明細書において使用される場合、特に明記されない限り、用語「相補的」は、当業者によって理解されるように、第２のヌクレオチド配列との関連において第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、ある特定の条件下において、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖を形成する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を意味する。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件である場合があり、ストリンジェントな条件として、以下を挙げることができる：１２～１６時間の４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃と、それに続く洗浄。生物の内側で遭遇する可能性があるような生理学的に関連する条件などの他の条件が適用される場合がある。当業者ならば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従って２つの配列の相補性の試験にとって最も適切な条件のセットを決定できるであろう。
ｉＲＮＡ内、例えば、本明細書において記載されるようなｄｓＲＮＡ内の相補的配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたっての、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書において、お互いに関して「完全に相補的」であると呼ぶことができる。しかしながら、本明細書において、第１の配列が、第２の配列に対して「実質的に相補的」であると見なされる場合、２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらは、３０までの塩基対の二重鎖の場合、それらの最終的な用途、例えば、ＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の阻害に最も適した条件下においてハイブリダイズする能力を維持しつつ、ハイブリダイゼーションの際に１つまたは複数、しかし、概して、５、４、３、または２以下のミスマッチの塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関して、ミスマッチとは見なされない。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むようなｄｓＲＮＡは、依然として、本明細書において記載される目的に対して、「完全に相補的」と見なすことができる。
相補的配列はまた、本明細書において使用される場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、またはそれらから完全に形成され得る。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるわけではないが、Ｇ：ＵＷｏｂｂｌｅまたはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対合が挙げられる。
用語「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」は、本明細書において、それらの使用との関連から理解できるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間における塩基マッチングに関連して使用することができる。
本明細書において使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の連続部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＶＥＧＦ－ＡをコードするｍＲＮＡの割り込みされていない部分に対して実質的に相補的である場合、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。用語「相補性」とは、第１の核酸と第２の核酸の核酸塩基の間で対形成する能力を指す。
本明細書において使用される場合、用語「相補性の領域」とは、本明細書において定義されるような、もう一方の配列に対して実質的に相補的である一方のヌクレオチド配列剤の領域、例えば、ｄｓＲＮＡのセンス配列の領域および対応するアンチセンス配列 またはｉＲＮＡのアンチセンス鎖および標的配列、例えば、ＶＥＧＦ－Ａヌクレオチド配列を指す。相補性の領域が、標的配列に対して完全には相補的でない場合、そのミスマッチは、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部領域または末端領域においてであり得る。一般に、最も許容できるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡ剤の５’末端または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド以内においてである。
「接触させること」は、本明細書において使用される場合、細胞を直接接触させることならびに細胞を間接的に接触させることを含む。例えば、ｉＲＮＡを含む組成物が、対象に（例えば、眼内に、局所的にまたは静脈内に）投与される場合に、対象内の細胞を接触させることができる。
「細胞中に導入すること」とは、ｉＲＮＡに言及する場合、細胞中への取り込みまたは吸収を促進または達成することを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的拡散性のもしくは活性な細胞プロセスによって、または助剤もしくはデバイスによって生じ得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に制限されない、ｉＲＮＡはまた、生きている生物の一部である「細胞中に導入される」場合もある。このような例では、細胞中に導入することは、生物へのデリバリーを含む。例えば、インビボデリバリーのために、ｉＲＮＡを組織部位中に注射できる、または全身投与できる。インビボデリバリーはまた、β－グルカンデリバリーシステム、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３２，４０１号および同５，６０７，６７７号および米国特許公開第２００５／０２８１７８１号に記載されるものによってであり得る。細胞へのインビトロ導入は、当技術分野で公知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを含む。さらなるアプローチが、本明細書において以下に記載される、または当技術分野で公知である。本明細書において使用される場合、「ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害」、「ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する疾患」、「ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する病的プロセス」、「ＶＥＧＦ－Ａ関連障害」、「ＶＥＧＦ－Ａ関連疾患」などは、ＶＥＧＦ－Ａ発現が変更されている（例えば、参照レベル、例えば、非疾患対象に特徴的なレベルに対して減少または増大している）任意の状態、障害または疾患を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ発現は、減少される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ発現は、増大する。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ発現の減少または増大は、対象由来の組織試料において（例えば、水性眼液試料において）検出可能である。減少または増大は、障害の発生前の同一個体において観察されたレベルに対して、または障害を有さない他の個体（複数可）に対して評価することができる。減少または増大は、特定の臓器、組織または身体の領域（例えば、眼）に限定される場合がある。ＶＥＧＦ－Ａ関連障害には、それだけには限らないが、血管新生性眼疾患が含まれる。
用語「血管新生性眼疾患」とは、本明細書において使用される場合、血管の成長もしくは増殖または血管漏出によって引き起こされるか、またはそれと関連する眼の任意の疾患を意味する。本明細書において提供される方法を使用して処置可能である血管新生性眼疾患の限定されない例には、加齢性黄斑変性症（例えば、湿性ＡＭＤ、滲出性ＡＭＤなど）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ；例えば、ＲＶＯ後黄斑浮腫（ＭＥｆＲＶＯ））、分岐網膜静脈閉塞（ＢＲＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、脈絡膜の新血管新生（ＣＮＶ；例えば、近視性ＣＮＶ）、虹彩新血管新生、新血管緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、視神経乳頭新血管新生、角膜新血管新生、網膜新血管新生、硝子体新血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、フォンヒッペル・リンダウ病、ヒストプラスマ症および糖尿病性網膜症が含まれる。
用語「二本鎖ＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、本明細書において使用される場合、標的ＲＮＡに関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると呼ばれる２本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を有する、ＲＮＡ分子または分子の複合体を含むｉＲＮＡを指す。二重鎖領域は、例えば、ＲＩＳＣ経路による、所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするが、通常、９～３６塩基対の長さ、例えば、１５～３０塩基対の長さの範囲となる任意の長さのものであり得る。９から３６塩基対の間の二重鎖を考慮して、二重鎖は、この範囲中の任意の長さのもの、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６およびそれだけには限らないが、１５～３０塩基対、１５～２６塩基対、１５～２３塩基対、１５～２２塩基対、１５～２１塩基対、１５～２０塩基対、１５～１９塩基対、１５～１８塩基対、１５～１７塩基対、１８～３０塩基対、１８～２６塩基対、１８～２３塩基対、１８～２２塩基対、１８～２１塩基対、１８～２０塩基対、１９～３０塩基対、１９～２６塩基対、１９～２３塩基対、１９～２２塩基対、１９～２１塩基対、１９～２０塩基対、２０～３０塩基対、２０～２６塩基対、２０～２５塩基対、２０～２４塩基対、２０～２３塩基対、２０～２２塩基対、２０～２１塩基対、２１～３０塩基対、２１～２６塩基対、２１～２５塩基対、２１～２４塩基対、２１～２３塩基対または２１～２２塩基対を含む間のその任意の部分範囲であり得る。Ｄｉｃｅｒおよび同様の酵素によるプロセシングによって細胞において生成されるｄｓＲＮＡは、一般に、１９～２２塩基対の長さの範囲にある。ｄｓＤＮＡの二重鎖領域の一方の鎖は、標的ＲＮＡの実質的に相補的である領域である配列を含む。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子に由来する場合も、２つまたはそれより多い別個のＲＮＡ分子から形成される場合もある。二重鎖領域が単一分子の２つの鎖から形成される場合には、分子は、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、それぞれのもう一方の鎖の５’末端の間に一本鎖の鎖のヌクレオチドによってわけられた二重鎖領域（本明細書において「ヘアピンループ」と呼ばれる）を有することができる。ヘアピンループは、少なくとも１つの無対のヌクレオチドを含むことができ、一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれより多い無対のヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって含まれる場合には、それらの分子は、必ずしも必要ではないが共有結合によって接続され得る。一部の実施形態では、２つの鎖は、ヘアピンループ以外の手段によって共有結合によって接続され、接続構造はリンカーである。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物中に導入される「一本鎖ｓｉＲＮＡ」であり得る。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるアルゴノート２に結合でき、これは、次いで、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、概して、１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾されてもよい。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載されており、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において記載されるアンチセンスヌクレオチド配列（例えば、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される配列）はいずれも、本明細書において記載されるような一本鎖ｓｉＲＮＡとして、および例えば、本明細書において記載されるように、例えば、Lima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載される方法によって化学的に修飾されてもよい一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡの切断を指示する、標的ＲＮＡ配列と相互作用する一本鎖ＲＮＡを含む。理論によって制限されることを意図するわけではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485）。Ｄｉｃｅｒ、リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする［Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363］。ｓｉＲＮＡは、次いで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、そこで、１つまたは複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二重鎖を解き、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする［Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309］。適切な標的ｍＲＮＡへの結合の際に、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、サイレンシングを誘導するために、標的を切断する［Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188］。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して、標的遺伝子のサイレンシングを行う一本鎖ＲＮＡに関する。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」はそれぞれ、一般的に、それぞれ塩基としての、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「デオキシリボヌクレオチド」、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代理の置換部分を指す場合もあるということは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変更することなく、他の部分で置き換えることができることを十分に意識している。例えば、これらに限定されるものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置換し得る。別の例において、オリゴヌクレオチドのいずれかにおけるアデニンおよびシトシンは、標的ｍＲＮＡとＧ－ＵＷｏｂｂｌｅ塩基対合を形成するために、それぞれ、グアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示において特徴とされる組成物および方法にとって好適である。
本明細書において使用される場合、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ」、「ｉＲＮＡ剤」または「ＲＮＡｉ剤」または「ＲＮＡｉ分子は、本明細書において用語が定義されるＲＮＡを含有し、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、ＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する薬剤を指す。一部の実施形態では、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡは、例えば、細胞または哺乳動物においてＶＥＧＦ－Ａ発現の阻害を達成する。ＶＥＧＦ－Ａ発現の阻害は、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのレベルの低減またはＶＥＧＦ－Ａタンパク質のレベルの低減に基づいて評価できる。
用語「リンカー」または「連結基」とは、化合物の２つの部分を接続する、例えば、化合物の２つの部分を共有結合によって付着させる有機部分を意味する。
用語「親油性」または「親油性部分」は、脂質に対して親和性を有する任意の化合物または化学部分を広く意味する。親油性部分の親油性を特徴付ける方法の１つは、オクタノール－水分配係数ｌｏｇＫｏｗによってであり、この場合、Ｋｏｗは、平衡状態の２相系における水相の化学物質の濃度に対するオクタノール相の化学物質の濃度の比である。オクタノール－水分配係数は、物質における実験室測定された特性である。しかしながら、それは、第１原理または経験的方法を使用して算出される化学物質の構造成分に起因する係数を使用することによっても予想され得る［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)を参照されたい］。それは、水よりもむしろ非水性または油性環境を好む物質の傾向の熱力学的尺度（すなわち、親水性／親油性のバランス）を提供する。原則として、化学物質は、ｌｏｇＫｏｗが０を超える場合、親油性の性質である。典型的には、親油性部分は、１を超える、１．５を超える、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、または１０を超えるｌｏｇＫｏｗを有する。例えば、６－アミノヘキサノールのｌｏｇＫｏｗは、およそ０．７であることが予想される。同じ方法を使用することにより、コレステリルＮ－（ヘキサン－６－オール）カルバメートのｌｏｇＫｏｗは、１０．７であることが予想される。
分子の親油性は、分子が有する官能基に関して変更することができる。例えば、親油性部分の末端にヒドロキシル基またはアミン基を加えることにより、親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫｏｗ）値を増加または減少させることができる。
あるいは、１つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定することができる。例えば、ある特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイの非結合フラクションは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に正に相関し得る、二本鎖ＲＮＡｉ剤の相対的疎水性に正に相関することを判定することができる。
一部の実施形態では、判定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的プロトコールは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１１７０において詳細に説明される。結合アッセイにおける非結合ｓｉＲＮＡのフラクションによって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、増強されたｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏデリバリーの場合、０．１５を超える、０．２を超える、０．２５を超える、０．３を超える、０．３５を超える、０．４を超える、０．４５を超える、または０．５を超える。
したがって、親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ剤の内部位置にコンジュゲートすることにより、ｓｉＲＮＡにおける増強されたｉｎ ｖｉｖｏデリバリーに対する最適の疎水性が提供される。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、薬学的に活性な分子、例えば、核酸分子、例えば、ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤の転写元のプラスミドを封入する脂質層を含むベシクルである。ＬＮＰは、例えば、米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２、８，１５８，６０１号、および同第８，０５８，０６９号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、用語「の発現をモジュレートする」とは、対照細胞における対応する遺伝子の発現と比較した、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡ組成物を用いて処置された細胞における遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子）発現の少なくとも部分的な「阻害」または部分的な「活性化」を指す。対照細胞には、未処置細胞または非標的化対照ｉＲＮＡを用いて処置された細胞が含まれる。
当業者ならば、用語「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」が、天然に発現されるまたは見出されるようなＲＮＡ分子だけでなく、本明細書において記載されるような、または当技術分野で公知であるような１つまたは複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体または誘導体を含むＲＮＡの類似体および誘導体も包含することは認識するであろう。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基およびリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、１、２もしくは３つのリン酸部分もしくはその類似体（例えば、ホスホロチオエート）を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、同等であると考えることができる。ＲＮＡは、例えば、本明細書において以下に記載されるように、核酸塩基構造において、リボース構造において、またはリボース－リン酸骨格構造において修飾され得る。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は、二重鎖を形成する能力を保持しなくてはならない。限定されない例として、ＲＮＡ分子はまた、それだけには限らないが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオシドまたはドデカン酸ビスデシルアミド基、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、非環式ヌクレオシド、グリコールヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミデートまたは非天然塩基を含むヌクレオシドまたはそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つの修飾リボヌクレオシドも含むことができる。あるいは、組合せで、ＲＮＡ分子は、少なくとも２つの修飾リボヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれより多くまでの全長のｄｓＲＮＡ分子を含み得る。修飾は、ＲＮＡ分子中のこのような複数の修飾リボヌクレオシドの各々について必ずしも同一ではない。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物において使用するために考慮される修飾ＲＮＡは、必要な二重鎖構造を形成する能力を有する、および例えば、ＲＩＳＣ経路による標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする、または媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。明確にするために、用語「ｉＲＮＡ」は、天然に存在する二本鎖ＤＮＡ分子または１００％デオキシヌクレオシド含有ＤＮＡ分子を包含しないということは理解される。
一部の態様では、修飾リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。このような例では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、デオキシヌクレオシドオーバーハング（複数可）を含む１つもしくは複数のデオキシヌクレオシドまたはｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の１つもしくは複数のデオキシヌクレオシドを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えば、一方または両方の鎖中に、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれより高い（ただし、１００％ではない）デオキシリボヌクレオシドのデオキシリボヌクレオシドのパーセンテージを含む。
本明細書において使用される場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」とは、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する少なくとも１つの無対のヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’端が、他方の鎖の５’端を越えて延びる場合、その逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含むことができ；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、または少なくとも５つのヌクレオチド、またはそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むことができる、またはそれらからなり得る。オーバーハング（複数可）は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組合せの上にあり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチド（複数可）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかの５’端、３’端、またはその両方に存在し得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’端および／または５’端に１～１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’端および／または５’端に１～１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。一部の実施形態では、オーバーハングにおけるヌクレオチドの１つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量の治療薬（例えば、ｉＲＮＡ）と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療上有効量」または簡単に「有効量」とは、意図される薬理学的、治療的または予防的結果をもたらすのに有効な薬剤（例えば、ｉＲＮＡ）の量を指す。例えば、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害（例えば、血管新生性眼疾患）を処置する方法において、有効量は、１つまたは複数の障害と関連する症状を低減するのに有効な量（例えば、（ａ）血管新生を阻害する、（ｂ）ＶＥＧＦ－Ａの発現または活性を阻害または低減する、（ｃ）脈絡膜の新血管新生を阻害する、（ｄ）脈絡毛細管において新規血管の成長を阻害する、（ｅ）網膜の厚さを低減する、（ｆ）視力を高める、または（ｇ）眼球内炎症を低減するのに有効な量）または障害と関連する状態を発生するリスクを低減するのに有効な量を含む。例えば、疾病または障害と関連している測定可能なパラメータの少なくとも１０％の低減がある場合に、所与の臨床処置が有効と考えられる場合、疾患または障害の処置のための薬物の治療上有効量とは、そのパラメータにおいて少なくとも１０％の低減を得るために必要な量である。例えば、ＶＥＧＦ－Ａを標的化するｉＲＮＡの治療上有効量は、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのレベルまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質のレベルを、任意の測定可能な量だけ、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減できる。
用語「薬学的に許容される担体」とは、治療薬の投与のための担体を指す。このような担体には、それだけには限らないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。この用語は、細胞培養培地を具体的に排除する。経口投与される薬物のためには、薬学的に許容される担体として、それだけには限らないが、薬学的に許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存料が挙げられる。適した不活性希釈剤として、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウムおよびラクトースが挙げられ、コーンスターチおよびアルギン酸は適した崩壊剤である。結合剤として、デンプンおよびゼラチンを挙げることができ、滑沢剤は、存在する場合には、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクとなる。必要に応じて、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングして、消化管における吸収を遅延できる。薬物製剤中に含まれる薬剤は、本明細書において以下にさらに記載される。
本明細書において使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」とは、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、核酸、例えば、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡの転写元のプラスミドを含む還元水性内部をコーティングする脂質のベシクルを表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開番号第２００６／０２４００９３号、同２００７／０１３５３７２号に、および国際出願番号ＷＯ２００９／０８２８１７に記載されている。これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、ＳＰＬＰである。本明細書において使用される場合、用語「ＳＰＬＰ」とは、脂質ベシクル内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。
本明細書において使用される場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的ヌクレオチド用語体系を使用して言及される配列によって説明されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書において使用される場合、本明細書において記載される方法に従って処置されるべき「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）または霊長類（例えば、サル）であり得る。一部の実施形態では、対象はヒトである。
「それを必要とする対象」は、ＶＥＧＦ－Ａ発現、例えば、過剰発現と関連する障害（例えば、血管新生性眼疾患）を有する、それを有すると疑われるまたはそれを発生するリスクにある対象を含む。一部の実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ－Ａ発現または過剰発現と関連する障害を有する、またはそれを有すると疑われる。一部の実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ－Ａ発現または過剰発現と関連する障害を発生するリスクにある。
本明細書において使用される場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、遺伝子、例えば、ＶＥＧＦ－Ａの転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する一部分を指す。配列の標的部分は、少なくとも、その部分でのまたはその付近でのｉＲＮＡによって指示される切断の基質として働くに十分なほど長いであろう。例えば、標的配列は、一般に、９～３６ヌクレオチド長、例えば、１５～３０ヌクレオチド長となり、その間の全ての部分範囲を含む。限定されない例として、標的配列は、１５～３０ヌクレオチド、１５～２６ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１５～２２ヌクレオチド、１５～２１ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、１５～１９ヌクレオチド、１５～１８ヌクレオチド、１５～１７ヌクレオチド、１８～３０ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２１ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１９～３０ヌクレオチド、１９～２６ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、１９～２２ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、１９～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２５ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２３ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２１ヌクレオチド、２１～３０ヌクレオチド、２１～２６ヌクレオチド、２１～２５ヌクレオチド、２１～２４ヌクレオチド、２１～２３ヌクレオチドまたは２１～２２ヌクレオチドであり得る。
本明細書において使用される場合、語句「治療上有効量」および「予防上有効量」などは、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する任意の障害または病的プロセス（例えば、血管新生性眼疾患）の処置、予防または管理において治療的利益を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、例えば、障害または病的プロセスの種類、患者の病歴および年齢、障害または病的プロセスのステージおよび他の療法の投与などの当技術分野で公知の因子に応じて変わる。
本開示との関連で、用語「処置する」、「処置」などは、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害と関連する少なくとも１つの症状を防止、遅延、軽減もしくは緩和すること、またはこのような障害の進行もしくは予測される進行を減速もしくは逆転させることを意味する。例えば、本明細書において特徴とされる方法は、血管新生性眼疾患を処置するために使用される場合、本明細書において記載されるような血管新生性眼疾患の１つもしくは複数の症状を低減もしくは防止するのに、または関連状態のリスクもしくは重症度を低減するのに役立ち得る。したがって、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、用語「処置する」、「処置」などは、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害および／または障害の症状の予防、例えば、防止を包含するものとする。処置はまた、処置の不在下で予測される生存と比較して、生存を延長することを意味する場合もある。
疾患マーカーまたは症状との関連で「より低い」とは、任意の減少、例えば、このようなレベルの統計的または臨床的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。減少は、このような障害を有さない個体の正常の範囲内と認容されるレベルまで下げることができる。
本明細書において使用される場合、「ＶＥＧＦ－Ａ」とは、「血管内皮増殖因子Ａ」、対応するｍＲＮＡ（「ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ」）または対応するタンパク質（「ＶＥＧＦ－Ａタンパク質」）を指す。ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ転写物の配列は、配列番号１に見出すことができる。
ＩＩ．ｉＲＮＡ剤
ＶＥＧＦ－Ａの発現をモジュレートする（例えば、阻害する）ｉＲＮＡ剤が、本明細書において記載される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞または哺乳動物におけるＶＥＧＦ－Ａの発現を活性化する。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞において、または対象において（例えば、哺乳動物において、例えば、ヒトにおいて）ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、ｄｓＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａの発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド長またはそれ以下、一般に、１９～２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａを発現する細胞と接触すると、ＶＥＧＦ－Ａの発現を例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％阻害する。
ＶＥＧＦ－Ａの発現のモジュレーション（例えば、阻害）は、例えば、ＰＣＲまたは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によって、またはタンパク質－ベースの方法によって、例えば、ウエスタンブロットによってアッセイできる。細胞培養物における、例えば、ＣＯＳ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１細胞、ＨｅＬａ細胞、一次肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、一次培養細胞における、または対象から得た生物学的試料におけるＶＥＧＦ－Ａの発現は、ｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎアッセイなどによってＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡレベルを測定することによって、または例えば、ウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光などによってタンパク質レベルを測定することによってアッセイできる。
ｄｓＲＮＡは、通常、ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして、二重鎖構造を形成するのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、実質的に相補的で、ＶＥＧＦ－Ａの発現の際に形成されたｍＲＮＡの配列から得られる標的配列に対して概して完全に相補的である、相補性の領域を通常含む。ことができる。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的な領域を通常含み、それにより、２つの鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。一般に、二重鎖構造は、１５から３０の間（両端を含む）、より一般には、１８から２５の間（両端を含む）、いっそうより一般には、１９から２４の間（両端を含む）および最も一般には、１９から２１塩基対長の間（両端を含む）である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１５から３０の間（両端を含む）、より一般には、１８から２５の間（両端を含む）、いっそうより一般には、１９から２４の間（両端を含む）、最も一般には１９から２１ヌクレオチド長の間（両端を含む）である。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５から２０ヌクレオチド長の間（両端を含む）であり、他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２５から３０ヌクレオチド長の間（両端を含む）である。当業者ならば認識するように、切断のために標的化されるＲＮＡの標的化される領域は、より大きなＲＮＡ分子、しばしば、ｍＲＮＡ分子の一部であることが最も多いであろう。関連する場合には、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉによって指示される切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）の基質であるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。９塩基対という短い二重鎖を有するｄｓＲＮＡは、一部の状況下では、ＲＮＡｉによって指示されるＲＮＡ切断を媒介することができる。標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、１５～３０ヌクレオチド長となることが最も多い。
当業者ならば、二重鎖領域は、ｄｓＲＮＡの主な機能的部分、例えば、９～３６、例えば、１５～３０塩基対の二重鎖領域であるということは認識するであろう。したがって、一部の実施形態では、切断のための所望のＲＮＡを標的化する例えば、１５～３０塩基対の機能的二重鎖までプロセシングされる程度まで、３０を超える塩基対の二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者ならば、一部の実施形態では、次いで、ｍｉＲＮＡはｄｓＲＮＡであるということは認識するであろう。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡではない。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きなｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞において生成されない。
本明細書において記載されるようなｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。ｄｓＲＮＡは、以下にされに論じられるような当技術分野で公知の標準方法によって、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザーの使用によって合成できる、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から市販されている。
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－ＡはヒトＶＥＧＦ－Ａである。
具体的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供されるセンス配列から選択されるセンス配列を含むまたはからなるセンス鎖および表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列を含むまたはからなるアンチセンス鎖を含む。
一部の態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される配列から選択され、対応するアンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される配列から選択される。
これらの態様では、２つの配列のうち一方は、２つの配列のうち他方と相補的であり、配列のうち一方は、ＶＥＧＦ－Ａの発現によって生成されたｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。そのようなものとして、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、センス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖として記載される。本明細書の他の箇所で説明され、当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列は、別々のオリゴヌクレオチド上において相対するように、単一の核酸分子の自己相補領域として含ませることもできる。
２０と２３の間、具体的には２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効と認められているということは、当業者はよく承知している（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。しかしながら、他のものは、より短いまたはより長いＲＮＡ二重鎖構造が同様に有効である場合もあるということを見出した。
上記の実施形態では、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび８Ｂにおいて提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡは、最小で１９ヌクレオチドの長さの少なくとも１つの鎖を含み得る。片端または両端の少数のみのヌクレオチドを差し引いた表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂの配列のうち１つを有するより短い二重鎖は、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であろうということは合理的に予測できる。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂの配列のうち１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い連続するヌクレオチドの部分配列を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８または１９の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列および表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８または１９の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列および表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を含む。
一部のこのような実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される配列の一部分のみを含むが、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａまたは１８Ｂにおいて提供される全長配列を含むｄｓＲＮＡのように、ＶＥＧＦ－Ａ発現のレベルの阻害において同等に有効である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、本明細書において開示される全配列を含むｄｓＲＮＡと比較して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％以下の阻害だけ、ＶＥＧＦ－Ａの発現のレベルのその阻害において異なる。
表５Ａおよび５ＢのｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａ配列に基づいて設計された。理論によって制限されることを意図するわけではないが、ＶＥＧＦ－Ａ配列は、種間で十分に保存され、その結果、げっ歯類配列に基づいて設計されたある特定のｉＲＮＡは、霊長類ＶＥＧＦ－Ａに対して活性を有する。本明細書における作業例２は、げっ歯類配列に基づいて設計され、カニクイザルＶＥＧＦ－Ａに対する活性を有するｉＲＮＡの証拠を与える。
結果として、一部の実施形態では、表５Ａおよび５ＢのｉＲＮＡは、細胞においてＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡレベルを低下させる。一部の実施形態では、細胞は、げっ歯類細胞（例えば、ラット細胞）または霊長類細胞（例えば、カニクイザル細胞またはヒト細胞）である。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ｆ ｍＲＮＡレベルは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低減する。一部の実施形態では、ヒト細胞においてＶＥＧＦ－Ａを阻害する表５Ａおよび５ＢのｉＲＮＡは、ヒトＶＥＧＦ－Ａの対応する部分に対して５、４、３、２または１未満のミスマッチを有する。一部の実施形態では、ヒト細胞においてＶＥＧＦ－Ａを阻害する表５Ａおよび５ＢのｉＲＮＡは、ヒトＶＥＧＦ－Ａの対応する部分に対してミスマッチを有さない。
げっ歯類配列に基づいて設計されたｉＲＮＡは、例えば、治療目的のためのヒト細胞におけるＶＥＧＦ－Ａの阻害にとって、または例えば、げっ歯類モデルにおいてＶＥＧＦ－Ａを特徴づける研究のためのげっ歯類細胞におけるＶＥＧＦ－Ａの阻害にとって有用性を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０または１、２または３つのミスマッチを有する少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡは、本明細書において提供される配列番号１の配列を有し得る。
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、転写物変異体１、ｍＲＮＡ
TCGCGGAGGCTTGGGGCAGCCGGGTAGCTCGGAGGTCGTGGCGCTGGGGGCTAGCACCAGCGCTCTGTCGGGAGGCGCAGCGGTTAGGTGGACCGGTCAGCGGACTCACCGGCCAGGGCGCTCGGTGCTGGAATTTGATATTCATTGATCCGGGTTTTATCCCTCTTCTTTTTTCTTAAACATTTTTTTTTAAAACTGTATTGTTTCTCGTTTTAATTTATTTTTGCTTGCCATTCCCCACTTGAATCGGGCCGACGGCTTGGGGAGATTGCTCTACTTCCCCAAATCACTGTGGATTTTGGAAACCAGCAGAAAGAGGAAAGAGGTAGCAAGAGCTCCAGAGAGAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGGGGTCAGAGAGAGCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAGCGACAGGGGCAAAGTGAGTGACCTGCTTTTGGGGGTGACCGCCGGAGCGCGGCGTGAGCCCTCCCCCTTGGGATCCCGCAGCTGACCAGTCGCGCTGACGGACAGACAGACAGACACCGCCCCCAGCCCCAGCTACCACCTCCTCCCCGGCCGGCGGCGGACAGTGGACGCGGCGGCGAGCCGCGGGCAGGGGCCGGAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGGAGGGGGTCGGGGCTCGCGGCGTCGCACTGAAACTTTTCGTCCAACTTCTGGGCTGTTCTCGCTTCGGAGGAGCCGTGGTCCGCGCGGGGGAAGCCGAGCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGTGCTAGCTCGGGCCGGGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAGTGGCGACTCGGCGCTCGGAAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGCAGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCTCCCCAGGCCCTGGCCCGGGCCTCGGGCCGGGGAGGAAGAGTAGCTCGCCGAGGCGCCGAGGAGAGCGGGCCGCCCCACAGCCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAAAAAATCAGTTCGAGGAAAGGGAAAGGGGCAAAAACGAAAGCGCAAGAAATCCCGGTATAAGTCCTGGAGCGTGTACGTTGGTGCCCGCTGCTGTCTAATGCCCTGGAGCCTCCCTGGCCCCCATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGAGCCGGGCAGGAGGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCGGGAACCAGATCTCTCACCAGGAAAGACTGATACAGAACGATCGATACAGAAACCACGCTGCCGCCACCACACCATCACCATCGACAGAACAGTCCTTAATCCAGAAACCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGCACTTTGGGTCCGGAGGGCGAGACTCCGGCGGAAGCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCACGGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCCATTTTATTTTTCTTGCTGCTAAATCACCGAGCCCGGAAGATTAGAGAGTTTTATTTCTGGGATTCCTGTAGACACACCCACCCACATACATACATTTATATATATATATATTATATATATATAAAAATAAATATCTCTATTTTATATATATAAAATATATATATTCTTTTTTTAAATTAACAGTGCTAATGTTATTGGTGTCTTCACTGGATGTATTTGACTGCTGTGGACTTGAGTTGGGAGGGGAATGTTCCCACTCAGATCCTGACAGGGAAGAGGAGGAGATGAGAGACTCTGGCATGATCTTTTTTTTGTCCCACTTGGTGGGGCCAGGGTCCTCTCCCCTGCCCAGGAATGTGCAAGGCCAGGGCATGGGGGCAAATATGACCCAGTTTTGGGAACACCGACAAACCCAGCCCTGGCGCTGAGCCTCTCTACCCCAGGTCAGACGGACAGAAAGACAGATCACAGGTACAGGGATGAGGACACCGGCTCTGACCAGGAGTTTGGGGAGCTTCAGGACATTGCTGTGCTTTGGGGATTCCCTCCACATGCTGCACGCGCATCTCGCCCCCAGGGGCACTGCCTGGAAGATTCAGGAGCCTGGGCGGCCTTCGCTTACTCTCACCTGCTTCTGAGTTGCCCAGGAGACCACTGGCAGATGTCCCGGCGAAGAGAAGAGACACATTGTTGGAAGAAGCAGCCCATGACAGCTCCCCTTCCTGGGACTCGCCCTCATCCTCTTCCTGCTCCCCTTCCTGGGGTGCAGCCTAAAAGGACCTATGTCCTCACACCATTGAAACCACTAGTTCTGTCCCCCCAGGAGACCTGGTTGTGTGTGTGTGAGTGGTTGACCTTCCTCCATCCCCTGGTCCTTCCCTTCCCTTCCCGAGGCACAGAGAGACAGGGCAGGATCCACGTGCCCATTGTGGAGGCAGAGAAAAGAGAAAGTGTTTTATATACGGTACTTATTTAATATCCCTTTTTAATTAGAAATTAAAACAGTTAATTTAATTAAAGAGTAGGGTTTTTTTTCAGTATTCTTGGTTAATATTTAATTTCAACTATTTATGAGATGTATCTTTTGCTCTCTCTTGCTCTCTTATTTGTACCGGTTTTTGTATATAAAATTCATGTTTCCAATCTCTCTCTCCCTGATCGGTGACAGTCACTAGCTTATCTTGAACAGATATTTAATTTTGCTAACACTCAGCTCTGCCCTCCCCGATCCCCTGGCTCCCCAGCACACATTCCTTTGAAATAAGGTTTCAATATACATCTACATACTATATATATATTTGGCAACTTGTATTTGTGTGTATATATATATATATATGTTTATGTATATATGTGATTCTGATAAAATAGACATTGCTATTCTGTTTTTTATATGTAAAAACAAAACAAGAAAAAATAGAGAATTCTACATACTAAATCTCTCTCCTTTTTTAATTTTAATATTTGTTATCATTTATTTATTGGTGCTACTGTTTATCCGTAATAATTGTGGGGAAAAGATATTAACATCACGTCTTTGTCTCTAGTGCAGTTTTTCGAGATATTCCGTAGTACATATTTATTTTTAAACAACGACAAAGAAATACAGATATATCTTAAAAAAAAAAAAGCATTTTGTATTAAAGAATTTAATTCTGATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号１）
配列番号１の逆相補体は、本明細書において配列番号２として提供される：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATCAGAATTAAATTCTTTAATACAAAATGCTTTTTTTTTTTTAAGATATATCTGTATTTCTTTGTCGTTGTTTAAAAATAAATATGTACTACGGAATATCTCGAAAAACTGCACTAGAGACAAAGACGTGATGTTAATATCTTTTCCCCACAATTATTACGGATAAACAGTAGCACCAATAAATAAATGATAACAAATATTAAAATTAAAAAAGGAGAGAGATTTAGTATGTAGAATTCTCTATTTTTTCTTGTTTTGTTTTTACATATAAAAAACAGAATAGCAATGTCTATTTTATCAGAATCACATATATACATAAACATATATATATATATATACACACAAATACAAGTTGCCAAATATATATATAGTATGTAGATGTATATTGAAACCTTATTTCAAAGGAATGTGTGCTGGGGAGCCAGGGGATCGGGGAGGGCAGAGCTGAGTGTTAGCAAAATTAAATATCTGTTCAAGATAAGCTAGTGACTGTCACCGATCAGGGAGAGAGAGATTGGAAACATGAATTTTATATACAAAAACCGGTACAAATAAGAGAGCAAGAGAGAGCAAAAGATACATCTCATAAATAGTTGAAATTAAATATTAACCAAGAATACTGAAAAAAAACCCTACTCTTTAATTAAATTAACTGTTTTAATTTCTAATTAAAAAGGGATATTAAATAAGTACCGTATATAAAACACTTTCTCTTTTCTCTGCCTCCACAATGGGCACGTGGATCCTGCCCTGTCTCTCTGTGCCTCGGGAAGGGAAGGGAAGGACCAGGGGATGGAGGAAGGTCAACCACTCACACACACACAACCAGGTCTCCTGGGGGGACAGAACTAGTGGTTTCAATGGTGTGAGGACATAGGTCCTTTTAGGCTGCACCCCAGGAAGGGGAGCAGGAAGAGGATGAGGGCGAGTCCCAGGAAGGGGAGCTGTCATGGGCTGCTTCTTCCAACAATGTGTCTCTTCTCTTCGCCGGGACATCTGCCAGTGGTCTCCTGGGCAACTCAGAAGCAGGTGAGAGTAAGCGAAGGCCGCCCAGGCTCCTGAATCTTCCAGGCAGTGCCCCTGGGGGCGAGATGCGCGTGCAGCATGTGGAGGGAATCCCCAAAGCACAGCAATGTCCTGAAGCTCCCCAAACTCCTGGTCAGAGCCGGTGTCCTCATCCCTGTACCTGTGATCTGTCTTTCTGTCCGTCTGACCTGGGGTAGAGAGGCTCAGCGCCAGGGCTGGGTTTGTCGGTGTTCCCAAAACTGGGTCATATTTGCCCCCATGCCCTGGCCTTGCACATTCCTGGGCAGGGGAGAGGACCCTGGCCCCACCAAGTGGGACAAAAAAAAGATCATGCCAGAGTCTCTCATCTCCTCCTCTTCCCTGTCAGGATCTGAGTGGGAACATTCCCCTCCCAACTCAAGTCCACAGCAGTCAAATACATCCAGTGAAGACACCAATAACATTAGCACTGTTAATTTAAAAAAAGAATATATATATTTTATATATATAAAATAGAGATATTTATTTTTATATATATATAATATATATATATATAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTACAGGAATCCCAGAAATAAAACTCTCTAATCTTCCGGGCTCGGTGATTTAGCAGCAAGAAAAATAAAATGGCGAATCCAATTCCAAGAGGGACCGTGCTGGGTCACCCGCCCGGGAATGCTTCCGCCGGAGTCTCGCCCTCCGGACCCAAAGTGCTCTGCGCAGAGTCTCCTCTTCCTTCATTTCAGGTTTCTGGATTAAGGACTGTTCTGTCGATGGTGATGGTGTGGTGGCGGCAGCGTGGTTTCTGTATCGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAGAGATCTGGTTCCCGAAACCCTGAGGGAGGCTCCTTCCTCCTGCCCGGCTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTCAAGCTGCCTCGCCTTGCAACGCGAGTCTGTGTTTTTGCAGGAACATTTACACGTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGCTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGCCCACAGGGATGGGGGCCAGGGAGGCTCCAGGGCATTAGACAGCAGCGGGCACCAACGTACACGCTCCAGGACTTATACCGGGATTTCTTGCGCTTTCGTTTTTGCCCCTTTCCCTTTCCTCGAACTGATTTTTTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATGTGCTGGCCTTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCCCTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGTACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACTTCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAAGGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCATGGTTTCGGAGGCCCGACCGGGGCCGGCGCGGCTCGCGCTCCCTCTCCGGCTCGGGCTGTGGGGCGGCCCGCTCTCCTCGGCGCCTCGGCGAGCTACTCTTCCTCCCCGGCCCGAGGCCCGGGCCAGGGCCTGGGGAGCGCGCGCGGCTGGAGCACTGTCTGCGCACACCGCCGCCTCACCCGTCCATGAGCCCGGCTTCCGAGCGCCGAGTCGCCACTGCGGCCCCCTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCCTCCTCCCCCTCCTCCGGCTGCGGCTCCTCCCGGCCCGAGCTAGCACTTCTCGCGGCTCCGCTCGGCTCGGCTTCCCCCGCGCGGACCACGGCTCCTCCGAAGCGAGAACAGCCCAGAAGTTGGACGAAAAGTTTCAGTGCGACGCCGCGAGCCCCGACCCCCTCCACCCCGCCTCCGGGCGCGGGCTCCGGCCCCTGCCCGCGGCTCGCCGCCGCGTCCACTGTCCGCCGCCGGCCGGGGAGGAGGTGGTAGCTGGGGCTGGGGGCGGTGTCTGTCTGTCTGTCCGTCAGCGCGACTGGTCAGCTGCGGGATCCCAAGGGGGAGGGCTCACGCCGCGCTCCGGCGGTCACCCCCAAAAGCAGGTCACTCACTTTGCCCCTGTCGCTTTCGCTGCTCGCACGCCCGCGCGCTCTCTCTGACCCCGTCTCTCTCTTCCTCGACTTCTCTCTGGAGCTCTTGCTACCTCTTTCCTCTTTCTGCTGGTTTCCAAAATCCACAGTGATTTGGGGAAGTAGAGCAATCTCCCCAAGCCGTCGGCCCGATTCAAGTGGGGAATGGCAAGCAAAAATAAATTAAAACGAGAAACAATACAGTTTTAAAAAAAAATGTTTAAGAAAAAAGAAGAGGGATAAAACCCGGATCAATGAATATCAAATTCCAGCACCGAGCGCCCTGGCCGGTGAGTCCGCTGACCGGTCCACCTAACCGCTGCGCCTCCCGACAGAGCGCTGGTGCTAGCCCCCAGCGCCACGACCTCCGAGCTACCCGGCTGCCCCAAGCCTCCGCGA（配列番号２）
一部の実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂにおいて提供される配列のうち１つに由来する少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、ＶＥＧＦ－Ａ中の選択された配列に連続する領域から取られる追加のヌクレオチド配列にカップリングされてもよい。
標的配列は、一般に、１５～３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を指示するために、この範囲中の特定の配列の適合性において幅広い変動がある。本明細書において記載される種々のソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的の最適標的配列の同定のためのガイダンスを提供するが、標的配列として働くことができるサイズ範囲の配列を同定するために、所与の大きさ（限定されない例として、２１ヌクレオチド）の「ウィンドウ」または「マスク」が標的ＲＮＡ配列上に文字通りまたは比喩的に（例えば、インシリコを含む）配置される、経験的なアプローチもとることができる。最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に配列「ウィンドウ」を漸進的に移動させることによって、選択された任意の所与の標的サイズについてあり得る配列の完全なセットが同定されるまで、次の可能性ある標的配列を同定することができる。このプロセスは、最適に実行する配列を同定するための体系的な合成および同定された配列の試験（本明細書において記載されるまたは当技術分野で公知のアッセイを使用する）と相まって、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化される場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定できる。したがって、阻害効率のさらなる最適化は、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に漸進的に「ウィンドウのウォーキングを行うこと」によって達成して、同等またはより良い阻害特徴を有する配列を同定できると企図される。
さらに、例えば、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂにおいて同定される任意の配列について、さらなる最適化を、ヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を生成するならびにそれらおよびその点から標的ＲＮＡを上または下により長いまたはより短いサイズのウィンドウのウォーキングを行うことによって生成した配列を試験することによって達成できると企図される。やはり、新規候補標的を生成するためのこのアプローチを、当技術分野で公知のようなまたは本明細書において記載されるような阻害アッセイにおいてそれらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性について試験することと合わせることは、阻害の効率のさらなる改善につながり得る。さらにいっそう、このような最適化された配列は、例えば、本明細書において記載されるようなまたは当技術分野で公知のような修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングにおける付加もしくは変更、または発現阻害剤として分子をさらに最適化する（例えば、血清安定性または循環半減期を増大する、熱安定性を増大する、膜貫通デリバリーを増強する、特定の位置または細胞種へ標的化する、サイレンシング経路酵素との相互作用を増大する、エンドソームからの放出を増大するなど）ための当技術分野で公知のおよび／または本明細書において論じられるような他の修飾によって調整できる。
一部の実施形態では、本開示は、未修飾の、またはコンジュゲートされていない、表２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、８Ｂ、１０Ｂ、１４または１８ＢのいずれかのｉＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、表２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、８Ａ、１０Ａ、１２、１３ １４および１８Ａのいずれかにおいて提供されるようなヌクレオチド配列を有するが、表に示される１つまたは複数のリガンドまたは部分を欠く。リガンドまたは部分（例えば、親油性リガンドまたは部分）を、本願において提供される位置のいずれかに含めることができる。
本明細書において記載されるようなｉＲＮＡは、標的配列に対する１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡは、３以下のミスマッチを含有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合は、ミスマッチの領域は、相補性の領域の中心に位置しない。一部の実施形態では、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対するミスマッチを含有する含有する場合は、ＶＥＧＦ－Ａの領域と相補的である２３ヌクレオチドのｉＲＮＡ剤 ＲＮＡ鎖について、ミスマッチは、例えば、相補性の領域の５’または３’末端から最後の５ヌクレオチド内であるように制限され、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心の１３ヌクレオチド内にはミスマッチを全く含有しない。本明細書において記載される方法または当技術分野で公知の方法は、標的配列に対してミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＶＥＧＦ－Ａの発現の阻害において有効であるか否かを決定するために使用できる。ＶＥＧＦ－Ａの発現の阻害におけるミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性の考慮は、特に、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子中の相補性の特定の領域が集団内に多型配列変動を有すると知られている場合には重要である。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１～４、一般に、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、そのブラントエンド対応物に対して優れた阻害特性を有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）のＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に修飾されている。本開示において特徴とされる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されたものによって合成および／または修飾され得る。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結など）３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対形成する塩基との置き換え、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）またはコンジュゲートされた塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位置または４’位置での、または非環式糖を有する）もしくは糖の置き換え、ならびにホスホジエステル結合の修飾もしくは置き換えを含む骨格修飾が含まれる。本開示において有用なＲＮＡ化合物の具体例として、それだけには限らないが、修飾された骨格を含有する、または天然ヌクレオシド間連結を含有しないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとして、中でも、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、時には、当技術分野で言及されるように、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾されたＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。特定の実施形態では、修飾されたＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾されたＲＮＡ骨格として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、２’－５’連結されたこれらの類似体およびヌクレオシド単位の隣接する対が、３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結される逆極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第３，６８７，８０８号、４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９５；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３１６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，６２５，０５０；６，０２８，１８８；６，１２４，４４５；６，１６０，１０９；６，１６９，１７０；６，１７２，２０９；６，２３９，２６５；６，２７７，６０３；６，３２６，１９９；６，３４６，６１４；６，４４４，４２３；６，５３１，５９０；６，５３４，６３９；６，６０８，０３５；６，６８３，１６７；６，８５８，７１５；６，８６７，２９４；６，８７８，８０５；７，０１５，３１５；７，０４１，８１６；７，２７３，９３３；７，３２１，０２９；および米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号が挙げられ、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
中にリン原子を含まない修飾されたＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとして、モルホリノ連結（幾分かはヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するものならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第５，０３４，５０６号、同５，１６６，３１５号、同５，１８５，４４４号、同５，２１４，１３４号、同５，２１６，１４１号、同５，２３５，０３３号、同５，６４，５６２号、同５，２６４，５６４号、同５，４０５，９３８号、同５，４３４，２５７号、同５，４６６，６７７号、同５，４７０，９６７号、同５，４８９，６７７号、同５，５４１，３０７号、同５，５６１，２２５号、同５，５９６，０８６号、同５，６０２，２４０号、同５，６０８，０４６号、同５，６１０，２８９号、同５，６１８，７０４号、同５，６２３，０７０号、同５，６６３，３１２号、同５，６３３，３６０号、同５，６７７，４３７号および同５，６７７，４３９号が挙げられ、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡにおける使用のために適した、または企図される他のＲＮＡミメティクスでは、ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間連結、すなわち、骨格の両方が、新規基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているＲＮＡミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は、保持され、直接的または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第５，５３９，０８２号、同５，７１４，３３１号および同５，７１９，２６２号が挙げられ、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
本開示において特徴とされるいくつかの実施形態には、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格、特に、上記で参照された米国特許第５，４８９，６７７号の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然のホスホジエステル骨格は、－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］および上記で参照された米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドが含まれる。一部の実施形態では、本明細書において特徴とされるＲＮＡは、上記で参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾されたＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含有し得る。本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位置に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニルまたはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうち１つを含む場合があり、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適した修飾として、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎおよびｍは、１～約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位置に以下：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基またはｉＲＮＡの薬動力学特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基のうち１つを含む。一部の実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的修飾として、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野で公知の）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２がある。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１つまたは複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）非環式ヌクレオチド（またはヌクレオシド）を含む。ある特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、鎖あたり５未満の非環式ヌクレオチド（鎖あたり例えば、４、３、２または１つの非環式ヌクレオチド）を含む。１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、例えば、ｉＲＮＡ剤の、センスまたはアンチセンス鎖、または両鎖の二本鎖領域において、センスまたはアンチセンス鎖、または両鎖の５’末端、３’末端、５’および３’末端の両方で見出すことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス鎖、または両方の位置１～８に存在する。一部の実施形態では、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端から位置４～１０（例えば、位置６～８）でアンチセンス鎖において見出される。一部の実施形態では、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤の一方または両方の３’末端オーバーハングで見出される。
用語「非環式ヌクレオチド」または「非環式ヌクレオシド」とは、本明細書において使用される場合、非環式糖、例えば、非環式リボースを有する任意のヌクレオチドまたはヌクレオシドを指す。例示的非環式ヌクレオチドまたはヌクレオシドとして、核酸塩基、例えば、天然に存在する、または修飾された核酸塩基（例えば、本明細書において記載されるような核酸塩基）が挙げられる。ある特定の実施形態では、リボース炭素のうちいずれか（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５）の間の結合は、独立に、または組み合わせて、ヌクレオチドに存在しない。一部の実施形態では、リボース環のＣ２－Ｃ３炭素間の結合が存在しない、例えば、非環式２’－３’－セコ－ヌクレオチドモノマー。他の実施形態では、Ｃ１－Ｃ２、Ｃ３－Ｃ４またはＣ４－Ｃ５の間の結合は、存在しない（例えば、１’－２’、３’－４’または４’－５’－セコヌクレオチドモノマー）。例示的非環式ヌクレオチドは、その全体が本明細書に組み込まれるＵＳ８，３１４，２２７に開示されている。例えば、非環式ヌクレオチドは、ＵＳ８，３１４，２２７の図１～２中のモノマーＤ～Ｊのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、以下のモノマー：
Figure 2023514190000004
 ［式中、塩基は、核酸塩基、例えば、天然に存在する、または修飾された核酸塩基（例えば、本明細書において記載されるような核酸塩基）である］
を含む。
ある特定の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、例えば、非環式ヌクレオチドを、別の部分、例えば、中でも、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ、コレステロールリガンド）、アルキル、ポリアミン、糖、ポリペプチドにカップリングすることによって修飾または誘導体化することができる。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドおよび１つまたは複数のＬＮＡ（例えば、本明細書において記載されるようなＬＮＡ）を含む。例えば、１つもしくは複数の非環式ヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数のＬＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方中に存在し得る。一方の鎖中の非環式ヌクレオチドの数は、反対の鎖中のＬＮＡの数と同一である場合も異なっている場合もある。ある特定の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハング中に位置する５未満のＬＮＡ（例えば、４、３、２または１つのＬＮＡ）を含む。他の実施形態では、１つまたは２つのＬＮＡは、センス鎖の二本鎖領域または３’オーバーハング中に位置する。あるいは、または組み合わせて、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハング中に５未満の非環式ヌクレオチド（例えば、４、３、２または１つの非環式ヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’オーバーハング中に１つまたは２つのＬＮＡを、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の二本鎖領域（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から位置４～１０（例えば、位置６～８））中に１つまたは２つの非環式ヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤中に１つまたは複数の非環式ヌクレオチド（単独で、または１つもしくは複数のＬＮＡに加えて）を含むことは、以下：（ｉ）オフターゲット効果の低減、（ｉｉ）ＲＮＡｉにおけるパッセンジャー鎖関与の低減、（ｉｉｉ）その標的ｍＲＮＡに対するガイド鎖の特異性の増大、（ｉｖ）ｍｉｃｒｏＲＮＡオフターゲット効果の低減、（ｖ）安定性の増大または（ｖｉ）ｉＲＮＡ分子の分解に対する抵抗性の増大のうち１つまたは複数（または全て）をもたらす。
他の修飾として、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－５アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’－５’連結ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、糖ミメティック、例えば、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分を有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第４，９８１，９５７号、同５，１１８，８００号、同５，３１９，０８０号、同５，３５９，０４４号、同５，３９３，８７８号、同５，４４６，１３７号、同５，４６６，７８６号、同５，５１４，７８５号、同５，５１９，１３４号、同５，５６７，８１１号、同５，５７６，４２７号、同５，５９１，７２２号、同５，５９７，９０９号、同５，６１０，３００号、同５，６２７，０５３号、同５，６３９，８７３号、同５，６４６，２６５号、同５，６５８，８７３号、同５，６７０，６３３号および同５，７００，９２０号が挙げられ、これらのうちある特定のものは、本出願と共通に所有され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野で簡単に「塩基」と呼ばれることも多い）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび（ａｎａｌ）他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれる。
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008において開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990において開示されるもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されるものおよびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちある特定のものは、本開示において特徴とされるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するために特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃だけ増大するとわかっており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにより詳しくは、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に例示的塩基置換である。
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のある特定のものの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、同５，１３０，３０号、同５，１３４，０６６号、同５，１７５，２７３号、同５，３６７，０６６号、同５，４３２，２７２号、同５，４５７，１８７号、同５，４５９，２５５号、同５，４８４，９０８号、同５，５０２，１７７号、同５，５２５，７１１号、同５，５５２，５４０号、同５，５８７，４６９号、同５，５９４，１２１号、同５，５９６，０９１号、同５，６１４，６１７号、同５，６８１，９４１号、同６，０１５，８８６号、同６，１４７，２００号、同６，１６６，１９７号、同６，２２２，０２５号、同６，２３５，８８７号、同６，３８０，３６８号、同６，５２８，６４０号、同６，６３９，０６２号、同６，６１７，４３８号、同７，０４５，６１０号、同７，４２７，６７２号および同７，４９５，０８８号ならびに同様に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，６９２号が挙げられる。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）二環式糖部分を含むように修飾できる。「二環式糖」は、２つの原子を架橋することによって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続し、それによって二環式環構造を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続する。したがって、一部の実施形態では、本開示の薬剤は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）（本明細書では「ロックドヌクレオチド」とも呼ばれる）を含み得る。一部の実施形態では、ロックド核酸は、リボース部分が、例えば、２’および４’炭素を接続する追加の橋を含む、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’－エンド構造立体配座に効率的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清におけるｓｉＲＮＡ安定性を増大し、オフターゲット効果を低減するとわかっている［Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447、Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843、Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193］。
本開示のポリヌクレオチドにおいて使用するための二環式ヌクレオシドの例として、制限するものではないが、４’と２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスポリヌクレオチド剤として、４’から２’への架橋を含む１つまたは複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４’から２’へ架橋された二環式ヌクレオシドの例として、それだけには限らないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは保護基である）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい）および４’－ＣＨ２－Ｃ（－ＣＨ２）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）が挙げられる。前記のものの各々の内容は、本明細書において提供される方法のために参照によって本明細書に組み込まれる。ロックド核酸の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、以下：米国特許第６，２６８，４９０号、同６，６７０，４６１号、同６，７９４，４９９号、同６，９９８，４８４号、同７，０５３，２０７号、同７，０８４，１２５号、同７，３９９，８４５号および同８，３１４，２２７号が挙げられ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的ＬＮＡとして、それだけには限らないが、２’、４’－Ｃメチレンビシクロヌクレオチドが挙げられる（例えば、Wengel et al.、国際ＰＣＴ ５公開番号ＷＯ００／６６６０４およびＷＯ９９／１４２２６）。
例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つまたは複数の立体化学的糖立体配置を有する前記の二環式ヌクレオシドのいずれも、調製できる（ＷＯ９９／１４２２６を参照されたい）。
本開示のＲＮＡｉ剤をまた、１または複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾できる。本明細書で使用される場合、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０～２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一部の実施形態では、拘束エチルヌクレオチドは、Ｓ立体配座にあり、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれる。
本開示のＲＮＡｉ剤はまた、１つまたは複数の「立体配座制限ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’とＣ４’炭素を、またはリボースのＣ３と－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配座にロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環パッカリングを少なくなる。
上記のＣＲＮのある特定のものの調製を教示する代表的な刊行物として、それだけには限らないが、ＵＳ２０１３／０１９０３８３およびＷＯ２０１３／０３６８６８が挙げられ、それらの各々の内容は、本明細書において提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである１つまたは複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロックド非環式核酸であり、糖の結合のいずれも除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’とＣ４’炭素の間の共有結合の炭素－酸素－炭素結合）が除去されているモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’とＣ３’炭素の間の共有結合の炭素－炭素結合）が除去されている［Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたい］。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、それだけには限らないが、ＵＳ８，３１４，２２７および米国特許公開第２０１３／００９６２８９号、同２０１３／００１１９２２号および同２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、それらの各々の内容は、本明細書において提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１つまたは複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）Ｇクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、修飾が、二重鎖内で相補的グアニンのワトソン－クリックおよびフーグスティーン面の両方に水素結合する能力を付与する修飾シトシン類似体である、例えば、Lin and Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc., 120, 8531-8532を参照されたい。オリゴヌクレオチド内の単一のＧクランプ類似体置換は、実質的に増強されたヘリックス熱安定性および相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされた場合にミスマッチ識別をもたらすことができる。ｉＲＮＡ分子中にこのようなヌクレオチドを含めることによって、核酸標的、相補的配列または鋳型鎖に対する親和性および特異性の増強をもたらすことができる。
ＲＮＡ分子の末端への潜在的に安定化する修飾として、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）および他のものを挙げることができる。この修飾の開示内容は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／００５８６１に見出すことができる。
本開示のＲＮＡｉ剤の他の修飾として、５’ホスフェートまたは５’ホスフェートミミック、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェートまたはホスフェートミミックが挙げられる。適したホスフェートミミックは、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０１５７５１１に本明細書において提供される方法のために開示されている。
ｉＲＮＡモチーフ
本開示のある特定の態様では、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０７５０３５において本明細書において提供される方法のために開示されるような化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書に、およびＷＯ２０１３／０７５０３５において示されるように、３連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを、切断部位でまたはその付近でＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖中に導入することによって優れた結果を得ることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうでなければ完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入は、存在する場合にはセンスまたはアンチセンス鎖の修飾パターンを妨げる。ＲＮＡｉ剤を、親油性部分またはリガンド、例えば、センス鎖上の例えば、Ｃ１６部分またはリガンドとコンジュゲートしてもよい。ＲＮＡｉ剤を、例えば、アンチセンス鎖の１つまたは複数の残基で（Ｓ）－グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾で修飾してもよい。得られたＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
一部の実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉ）
［式中、
ｉおよびｊは各々独立に、０または１であり、
ｐおよびｑは各々独立に、０～６であり、
各Ｎａは独立に、０～２５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂは独立に、０～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐおよびｎｑは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＮｂおよびＹは、同一修飾を有さず、ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］
によって表すことができる。一部の実施形態では、ＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾されたヌクレオチドである。
一部の実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一部の実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合には、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその近傍に生じ得る（例えば、位置６、７、８、７、８、９、８、９、１０、９、１０、１１、１０、１１、１２または１１、１２、１３に生じ得る）、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよい。
一部の実施形態では、ｉは１であり、ｊは０である、またはｉは０であり、ｊは１である、またはｉおよびｊは両方とも１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｂ）、
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｃ）、または
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｄ）
によって表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｂ）によって表される場合は、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｃ）として表される場合は、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合もある。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合には、各Ｎｂは独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。一部の実施形態では、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合もある。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
他の実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり、センス鎖は、次式：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合には、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’ ３’ （ＩＩ）
［式中、
ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ’およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各Ｎａ’は独立に、０～２５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂ’独立に、０～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
Ｎｂ’およびＹ’は、同一修飾を有さず、
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つを表す］
によって表すことができる。
一部の実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合には、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の位置９、１０、１１、位置１０、１１、１２、位置１１、１２、１３、位置１２、１３、１４または位置１３、１４、１５で生じる場合があり、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよい。一部の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、位置１１、１２、１３で生じる。
一部の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾されたヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１であり、ｌは０であるか、またはｋは０であり、ｌは１であるか、または５ｋおよびｌは両方とも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、次式：
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｂ）、
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｃ）、または
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－ Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－ Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｄ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表される場合には、Ｎｂ ’は、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）として表される場合には、各Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。一部の実施形態では、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０であり、アンチセンス鎖は、次式：
５’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－ Ｎａ’－ｎｑ’ ３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合には、各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、ＧＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで独立に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表す場合がある。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔである場合に、鎖の位置９、１０および１１で生じるＹＹＹモチーフを含有し得る、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよく、Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の対向端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有する場合があり、ＸＸＸおよびＺＺＺは各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の位置１１、１２、１３で生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得る、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよく、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の対向端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有する場合があり、Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本開示の方法において使用するためのある特定のＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができ、各鎖は１４～３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）によって表される：
センス：５’ ｎｐ －Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ －Ｎｂ－ Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ －（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’
（ＩＩＩ）
［式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ ’は独立に、０～２５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ ’は独立に、０～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは、それらの各々は存在する場合も存在しない場合もあるが、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］
によって表される。
一部の実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であるか、またはｉは１であり、ｊは０であるか、またはｉは０であり、ｊは１であるか、またはｉおよびｊは両方とも０であるか、またはｉおよびｊは両方とも１である。一部の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０であるか、またはｋは１であり、ｌは０であり、ｋは０であり、ｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方とも０であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的組合せは、以下の式：
５’ ｎｐ － Ｎａ －Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’ －Ｎａ ’ｎｑ ’ ５’
（ＩＩＩａ）
５’ ｎｐ －Ｎａ －Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ －Ｚ Ｚ Ｚ －Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ ｎｐ－Ｎａ－ Ｘ Ｘ Ｘ －Ｎｂ －Ｙ Ｙ Ｙ － Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’
（ＩＩＩｃ）
５’ ｎｐ －Ｎａ －Ｘ Ｘ Ｘ －Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ－ Ｚ Ｚ Ｚ －Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合には、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表される場合には、各Ｎｂは独立に、１～１０、１～７、１～５または１～４の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）として表される場合には、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表される場合には、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ ’の各々は独立に、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）中のＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｙ’ヌクレオチドのうち１つと塩基対を形成することができる。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する、またはＹヌクレオチドの３つ全てが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を全て形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドのうち１つと塩基対を形成することができる。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する、またはＺヌクレオチドの３つ全てが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を全て形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドのうち１つと塩基対を形成することができる。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する、またはＸヌクレオチドの３つ全てが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を全て形成する。
一部の実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾とは異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾とは異なり、および／またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾とは異なる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結によって隣接するヌクレオチドに連結される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結によって隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して付着された、１つまたは複数の部分またはリガンド（例えば、１つまたは複数の親油性部分、適宜、１つもしくは複数のＣ１６部分または１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結によって隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して付着された、１つまたは複数の部分またはリガンド（例えば、１つまたは複数の親油性部分、適宜、１つもしくは複数のＣ１６部分または１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結によって隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して付着された、１つまたは複数の部分またはリガンド（例えば、１つまたは複数の親油性部分、適宜、１つもしくは複数のＣ１６部分または１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二重鎖を含有する多量体であり、二重鎖は、リンカーによって接続される。リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、２つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される、３、４、５、６またはそれより多い二重鎖を含有する多量体であり、二重鎖は、リンカーによって接続される。リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、２つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’端で互いに連結され、３’端の一方または両方は、リガンドにコンジュゲートされてもよい。薬剤の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、２つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または薬剤の各々は、２つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
種々の刊行物には、本開示の方法において使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。このような刊行物として、ＷＯ２００７／０９１２６９、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０ならびにＵＳ７８５８７６９が挙げられ、これらの各々の内容は、本明細書において提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み得る。
以下により詳細に記載されるように、１つまたは複数の炭水化物部分の、ＲＮＡｉ剤へのコンジュゲーションを含有するＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分を、ＲＮＡｉ剤の修飾されたサブユニットに付着させる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を別の部分、例えば、炭水化物リガンドが付着される非炭水化物（好ましくは、環式）担体と置き換えることができる。サブユニットのリボース糖がそのように置き換えられているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置き換え修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環式担体は、炭素環系であり得る、すなわち、全ての環原子は、炭素原子であるか、または複素環式環構造、すなわち、１つまたは複数の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環式担体は、単環式環構造であり得る、または２つ以上の環、例えば、縮合環を含有し得る。環式担体は、完全飽和環構造であり得る、または１つもしくは複数の二重結合を含有し得る。
リガンドを、担体を介してポリヌクレオチドに付着させることができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点」、好ましくは、２つの「骨格付着点」ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの「繋留付着点」を含む。「骨格付着点」とは、本明細書で使用される場合、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または、一般的に、骨格、例えば、リボ核酸のリン酸または修飾されたリン酸、例えば、硫黄含有骨格への担体の組み込みのために利用可能な、およびそれに適している結合を指す。「繋留付着点」（ＴＡＰ）とは、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環式担体の構成物環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは別個）を指す。部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。選択された部分は、介在するテザーによって環式担体に接続されてもよい。したがって、環式担体は、官能基、例えば、アミノ基を含む、または一般的に、構成物環への、別の化学実体、例えば、リガンドの組み込みもしくは繋留に適している結合を提供することが多いであろう。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされる場合があり、担体は、環式基または非環式基であり得る、好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され、好ましくは、非環式群は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
ある特定の具体的実施形態では、本開示の方法において使用するためのＲＮＡｉ剤は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８および１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドをさらに含み得る。リガンドを、３’末端、５’末端または両端でセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖に付着できる。例えば、リガンドをセンス鎖に、特に、センス鎖の３’末端にコンジュゲートできる。
ｉＲＮＡコンジュゲート
本明細書において開示されるｉＲＮＡ剤は、コンジュゲートの形態である場合がある。コンジュゲートは、ｉＲＮＡ分子中の任意の適した位置に、例えば、センスまたはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端に付着できる。コンジュゲートは、リンカーを介して付着されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡ剤は、１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートに化学的に連結され、これは、例えば、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みに影響を及ぼす（例えば、増強する）ことによって機能性を付与し得る。このような部分として、それだけには限らないが、コレステロール部分などの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330、Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）が挙げられる。
一部の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変更する。一部の実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較されるように、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞種、コンパートメント、例えば、細胞のまたは臓器のコンパートメント、組織、器官または身体の領域に対する親和性の増強を提供する。通常のリガンドは、二本鎖核酸において二重鎖対形成に関与しない。
リガンドとして、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸であるポリアミノ酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドにはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、特定の細胞種、例えば、腎臓細胞に結合する抗体が含まれ得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチドミメティックであり得る。
リガンドの他の例として、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子または抗体、例えば、眼細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースが含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーターまたはＮＦ－κＢのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維および／または中間径線維を破壊することによってｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増大し得る物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡに付着されるリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターには、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが含まれる。例示的ＰＫモジュレーターとして、それだけには限らないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合すると知られており、従って、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドはまた、リガンドとして（例えば、ＰＫモジュレーティングリガンドとして）本開示に適している。さらに、血清構成成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書において記載される実施形態においてＰＫモジュレーティングリガンドとして使用するのに適している。
本開示のリガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、ペンダント反応性官能性を有する、例えば、オリゴヌクレオチド上への連結分子の付着に由来する（以下に記載される）オリゴヌクレオチドの使用によって合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されているリガンドまたはそれに付着された連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。
本開示のコンジュゲートにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の公知の技術によって好都合に、日常的に作製できる。このような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（カリフォルニア州、フォスターシティ）を含むいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段をさらに、または代わりに使用してもよい。他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を調製するために同様の技術を使用することも公知である。
本開示のリガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドおよび配列特異的な連結されたヌクレオシドを有するリガンド分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準ヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体または連結部分をすでに有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに有するリガンド－ヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体またはビルディングブロックを有する非ヌクレオシドリガンドを利用して適したＤＮＡシンセサイザーで組み立てることができる。
連結部分をすでに有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合には、配列特異的な連結されたヌクレオシドの合成が通常完了され、次いで、リガンド分子が連結部分と反応されて、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドが形成される。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドまたは連結されたヌクレオシドは、市販されており、オリゴヌクレオチド合成において日常的に使用される標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホラミダイトを使用して自動化シンセサイザーによって合成される。
Ａ．親油性部分
ある特定の実施形態では、親油性部分は、脂環式などの脂肪族、環式、または多脂環式などの多環式化合物、例えば、ステロイド（例えば、ステロール）または直鎖もしくは分岐脂肪族炭化水素である。親油性部分は、一般に、環式であっても、非環式であってもよい炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、種々の置換基または１つもしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素もしくは窒素原子を含み得る。このような親油性脂肪族部分には、制限するものではないが、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素（例えば、Ｃ６～Ｃ１８炭化水素）、飽和または不飽和脂肪酸、ワックス（例えば、脂肪酸および脂肪ジアミドの一価アルコールエステル）、テルペン（例えば、Ｃ１０テルペン、Ｃ１５セスキテルペン、Ｃ２０ジテルペン、Ｃ３０トリテルペンおよびＣ４０テトラテルペン）および他の多脂環式炭化水素が含まれる。例えば、親油性部分は、Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖（例えば、Ｃ４～Ｃ３０アルキルまたはアルケニル）を含有し得る。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ６～Ｃ１８アルキルまたはアルケニル）を含有する。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ１６アルキルまたはアルケニル）を含有する。
親油性部分は、親油性部分中にすでに存在する、またはＲＮＡｉ剤中に導入された官能基、例えば、ヒドロキシ基（例えば、－ＣＯ－ＣＨ２－ＯＨ）を介して、当技術分野で公知の任意の方法によってＲＮＡｉ剤に付着させることができる。親油性部分中にすでに存在する、またはＲＮＡｉ剤中に導入された官能基として、それだけには限らないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンが挙げられる。
ＲＮＡｉ剤および親油性部分のコンジュゲーションは、例えば、ヒドロキシと、アルキル基Ｒ－、アルカノイル基ＲＣＯ－または置換カルバモイル基ＲＮＨＣＯ－の間のエーテルまたはカルボキシもしくはカルバモイルエステル結合の形成によって生じ得る。アルキル基Ｒは、環式（例えば、シクロヘキシル）または非環式（例えば、直鎖または分岐および飽和または不飽和）であり得る。アルキル基Ｒは、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシルまたはオクタデシル基などであり得る。
一部の実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物（例えば、アジド－アルキン環化付加に由来するトリアゾール）、またはカルバメートを含有するリンカーであるリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。
別の実施形態では、親油性部分は、ステロイド、例えば、ステロールである。ステロイドは、ペルヒドロ－１，２－シクロペンタノフェナントレン環構造を含有する多環式化合物である。ステロイドには、制限するものではないが、胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸およびデヒドロコール酸）、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロールおよびカチオン性ステロイド、例えば、コルチゾンが含まれる。「コレステロール誘導体」とは、例えば、置換、置換基の付加または除去によるコレステロールに由来する化合物を指す。
別の実施形態では、親油性部分は、芳香族部分である。この関連で、用語「芳香族」とは、広く、単環－および多環芳香族炭化水素を指す。芳香族基として、制限するものではないが、適宜置換されてもよい１～３つの芳香環を含むＣ６～Ｃ１４アリール部分；いずれも独立に適宜置換されてもよい、または非置換であってもよいアルキル基に共有結合によって連結されたアリール基を含む、「アラルキル」または「アリールアルキル」基；および「ヘテロアリール」基が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「ヘテロアリール」とは、５～１４個の環原子、好ましくは、５、６、９または１０個の環原子を有する；環式アレイにおいて共有される６、１０または１４個のπ電子を有する、および炭素原子に加えて、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）および硫黄（Ｓ）からなる群から選択される１～約３個のヘテロ原子を有する基を指す。
本明細書において使用されるように、「置換」アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環式基は、１～約４の、好ましくは、１～約３の、より好ましくは、１または２の非水素置換基を有するものである。適した置換基として、制限するものではないが、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノおよびウレイド基が挙げられる。
一部の実施形態では、親油性部分は、アラルキル基、例えば、２－アリールプロパノイル部分である。アラルキル基の構造的特徴は、インビボで親油性部分が少なくとも１つのタンパク質に結合するように選択される。ある特定の実施形態では、アラルキル基の構造的特徴は、親油性部分が血清性、血管性または細胞性タンパク質に結合するように選択される。ある特定の実施形態では、アラルキル基の構造的特徴は、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、α－２－マクログロブリン（ｍａｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）またはα－１－糖タンパク質への結合を促進する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ナプロキセンまたはナプロキセンの構造的誘導体である。ナプロキセンの合成のための手順は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，９０４，６８２号および米国特許第４，００９，１９７号に見出すことができる。ナプロキセンは、化学名（Ｓ）－６－メトキシ－α－メチル－２－ナフタレン酢酸を有し、構造は以下である
Figure 2023514190000005
ある特定の実施形態では、リガンドは、イブプロフェンまたはイブプロフェンの構造的誘導体である。イブプロフェンの合成のための手順は、本明細書において提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれるＵＳ３，２２８，８３１に見出すことができる。イブプロフェンの構造は以下である
Figure 2023514190000006
さらなる例示的アラルキル基は、本明細書において提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，６２６，０１４に例示されている。
別の実施形態では、適した親油性部分として、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール（ｇｅｒａｎｙｌｏｘｙｈｅｘｙａｎｏｌ）、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、イブプロフェン、ナプロキセン、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンが挙げられる。
ある特定の実施形態では、特に、親油性部分が低い親油性または疎水性を有する場合に、二本鎖ＲＮＡｉ剤中に１つより多い親油性部分を組み込むことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の同一鎖中に２つ以上の親油性部分が組み込まれる。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の各鎖は、組み込まれた１つまたは複数の親油性部分を有する。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の同一位置（すなわち、同一核酸塩基、同一糖部分または同一ヌクレオシド間連結）中に２つ以上の親油性部分が組み込まれる。これは、例えば、２つ以上の親油性部分を担体を介してコンジュゲートすること、または２つ以上の親油性部分を分岐リンカーを介してコンジュゲートすること、または２つ以上の親油性部分を、親油性部分を連続的に連結する１つもしくは複数のリンカーを用いてコンジュゲートすることによって達成できる。
親油性部分は、ＲＮＡｉ剤のリボ糖への直接付着によってＲＮＡｉ剤にコンジュゲートできる。あるいは、親油性部分は、リンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートできる。
ある特定の実施形態では、親油性部分は、１つまたは複数のリンカー（テザー）を介してＲＮＡｉ剤にコンジュゲートできる。
一部の実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物（例えば、アジド－アルキン環化付加に由来するトリアゾール）、またはカルバメートを含有するリンカーであるリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。
Ｂ．脂質コンジュゲート
一部の実施形態では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、通常、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合できる。ＨＳＡ結合性リガンドによって、標的組織へのコンジュゲートの血管性分布が可能となる。例えば、標的組織は、眼である場合がある。ＨＳＡに結合できる他の分子も、リガンドとして使用できる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリンを使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増大できる、（ｂ）標的細胞または細胞膜中への標的化または輸送を増大できる、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用できる。
脂質ベースのリガンドは、標的組織へのコンジュゲートの結合をモジュレートする、例えば、管理する（例えば、阻害する）ために使用できる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓へ標的化される可能性が低く、したがって、身体から排除される可能性が低くなる。あまり強力にＨＳＡに結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用できる。
一部の実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。例えば、リガンドは、十分な親和性でＨＳＡに結合でき、その結果、非腎臓組織へのコンジュゲートの分布が増強される。しかし、親和性は、通常、ＨＳＡ－リガンド結合を元に戻すことができないほど強力ではない。
一部の実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、全く結合せず、その結果、腎臓へのコンジュゲートの分布が増強される。脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的化する他の部分も使用できる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖している細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性種、例えば、がん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の処置にとって特に有用である。例示的ビタミンとして、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他の例示的ビタミンとして、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたはがん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えば、ヘリックス細胞透過剤である。一部の実施形態では、これらの細胞透過剤は、両親媒性である。例示的細胞透過剤として、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）がある。薬剤がペプチドである場合は、修飾される場合があり、ぺプチジルミメティック、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド連結およびＤ－アミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、通常、α－ヘリックス剤であり、親油性および疎油性相を有し得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチドミメティックであり得る。ペプチドミメティック（本明細書においてオリゴペプチドミメティックとも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似する規定の三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチドミメティックのｉＲＮＡ剤への付着は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチドミメティック部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチドミメティックは、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代替法では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的疎水性ＭＴＳ含有ペプチドとして、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号４１５８）を有するＲＦＧＦがある。ＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４１５９））含有疎水性ＭＴＳも、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を横切ってペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号４１６０））およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質に由来する配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４１６１））は、デリバリーペプチドとして機能化可能であると見出されている。ペプチドまたはペプチドミメティックは、ファージディスプレイライブラリーまたは１－ビーズ－１－化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991）から同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。通常、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に繋留されるペプチドまたはペプチドミメティックとして、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤミミックがある。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体配座特性を増大する構造修飾を有し得る。以下に記載される構造修飾のいずれも利用できる。
本開示の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、線状である場合も、環状である場合もあり、特定の組織（複数可）への標的化を促進するように修飾される、例えば、グリコシル化またはメチル化される場合もある。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチドミメティックは、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤミミックを含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用できる。一部の実施形態では、このリガンドのコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的化する。
ＲＧＤペプチド部分を、特定の細胞種、例えば、腫瘍細胞、例えば、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞を標的化するために使用できる（Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002）。ＲＧＤペプチドは、ｄｓＲＮＡ剤の肺、腎臓、脾臓または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍への標的化を促進できる（Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001）。通常、ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓への標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、線状である場合も、環状である場合もあり、特定の組織（複数可）への標的化を促進するように修飾される、例えば、グリコシル化またはメチル化される場合もある。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞へデリバリーできる（Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001）。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌もしくは真菌細胞または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）または１つもしくは２つの優性アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドはまた、核局在性シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）。
炭水化物コンジュゲートおよびリガンド
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物がコンジュゲートされたｉＲＮＡは、本明細書において記載されるような、核酸ならびにインビボ治療的使用に適した組成物のインビボ送達にとって有利である。本明細書で使用される場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも６個の炭素原子（線状、分岐または環状であり得る）を有する１つもしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体またはその一部として、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々少なくとも６個の炭素原子（線状、分岐または環状であり得る）を有する１または複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分を有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物として、糖（単糖、二糖、三糖および約４、５、６、７、８または９つの単糖単位を含有するオリゴ糖）ならびに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムが挙げられる。特定の単糖として、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）の糖が挙げられ、二糖および三糖として、２つまたは３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を有する糖が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、Ｃ１６リガンドを含む。例示的実施形態では、本開示のＣ１６リガンドは、以下の構造を有し（ウラシル塩基について本明細書において以下に例示されるが、２’リボ付着が保たれる限り、任意の塩基（Ｃ、Ｇ、Ａなど）を提示する、または本明細書において提示されるような任意の他の修飾を有するヌクレオチドについてＣ１６リガンドの付着が企図される）、そのように修飾されている残基内のリボの２’位置に付着される：
Figure 2023514190000007
上記で示されるように、Ｃ１６リガンド修飾された残基は、修飾されている例示的残基（本明細書ではウラシル）の２’－リボ位置で直鎖アルキルを示す。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤の炭水化物コンジュゲートは、上記のような１つまたは複数の追加のリガンド、例えば、それだけには限らないが、ＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドをさらに含む。
本開示において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲート（およびリンカー）として、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１７９６２０およびＷＯ２０１４／１７９６２７に記載されるものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、本明細書において記載されるようなＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的実施形態では、本開示のビニルホスホネートは、以下の構造：
Figure 2023514190000008
 を有する。
本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに付着させることができる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のビニルホスホネートを、適宜、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’端でｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に付着させる。
本開示の組成物および方法のためにビニルホスフェート修飾も企図される。例示的ビニルホスフェート構造として：
Figure 2023514190000009
 がある。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、単糖を含む。一部の実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０６，０２２号に記載されている。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡを特定の細胞に標的化するリガンドとして働く。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして働くことによってｉＲＮＡを肝臓細胞に標的化する。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば、二価または三価分岐リンカーを介して付着させることができる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書において記載されるようなリンカーを介してｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’端に）コンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、以下である。
Figure 2023514190000010
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＸがＯまたはＳである以下の模式図：
Figure 2023514190000011
 において示されるようにリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに付着される。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１において定義されるＬ９６に、以下に示されるようにコンジュゲートされる：
Figure 2023514190000012
一部の実施形態では、本開示の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される：
Figure 2023514190000013
Figure 2023514190000014
Figure 2023514190000015
Figure 2023514190000016
Figure 2023514190000017
本明細書において記載される実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる
Figure 2023514190000018
 式中、ＸまたはＹの一方は、オリゴヌクレオチドであり、もう一方は、水素である。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、上記のような１つまたは複数の追加のリガンド、例えば、それだけには限らないが、ＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本開示の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの限定されない例として、それだけには限らないが、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであり、もう一方が水素である場合に、以下が挙げられる
Figure 2023514190000019
Figure 2023514190000020
Ｅ．熱的不安定化修飾
ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９）中に熱的不安定化修飾を組み込んで、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することによって、ｄｓＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉のために最適化できる。アンチセンス鎖の５’端から数えて最初の９ヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことが発見されている。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチド位置内に少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５またはそれより多い）二重鎖の熱的不安定化修飾を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’端から位置２～９、または好ましくは、位置４～８中に位置する。一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾（複数可）は、アンチセンス鎖の５’端から位置６、７または８に位置する。さらに一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’端から位置７に位置する。「熱的不安定化修飾（複数可）」という用語は、より低い全体の融解温度（Ｔｍ）を有するｄｓＲＮＡをもたらすであろう修飾（複数可）を含む（好ましくは、このような修飾（複数可）を有さないｄｓＲＮＡのＴｍよりも１、２、３または４度低い。一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’端から位置２、３、４、５または９に位置する。
熱的不安定化修飾として、それだけには限らないが、脱塩基修飾、対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および糖修飾、例えば、２’－デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えば、アンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を挙げることができる。
例示される脱塩基修飾として、それだけには限らないが、以下：
Figure 2023514190000021

［式中、Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ”＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ］
Figure 2023514190000022
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基である］
が挙げられる。
例示される糖修飾として、それだけには限らないが、以下：
Figure 2023514190000023
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基である］
が挙げられる。
一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下：
Figure 2023514190000024
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す］
からなる群から選択される。
「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えば、リボース炭素間の結合のいずれか（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’またはＣ１’－Ｏ４’）が存在しないか、またはリボース炭素もしくは酸素のうち少なくとも１つ（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’またはＯ４’）が独立に、もしくは組み合わせてヌクレオチドに存在しない、非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、
Figure 2023514190000025
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３またはアルキルであり；ならびにＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である］。「ＵＮＡ」という用語は、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックド「糖」残基を形成するアンロックド非環式核酸を指す。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーを包含する（すなわち、Ｃ１’とＣ４’炭素の間の共有結合の炭素－酸素－炭素結合）。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’とＣ３’炭素の間の共有結合の炭素－炭素結合）が除去される［参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)を参照されたい］。非環式誘導体は、ワトソン－クリック対形成に影響を及ぼすことなく、より大きな骨格柔軟性を提供する。非環式ヌクレオチドは、２’－５’または３’－５’連結を介して連結され得る。
「ＧＮＡ」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡと類似のポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復するグリセロール単位から構成される点でその「骨格」の組成が異なっているグリコール核酸を指す：
Figure 2023514190000026
二重鎖の熱的不安定化修飾は、熱的不安定化ヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ二本鎖内の対向鎖中の対向するヌクレオチドの間のミスマッチ（すなわち、非相補的塩基対）であり得る。例示的ミスマッチ塩基対として、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔまたはそれらの組合せが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対形成も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間に生じ得る、すなわち、ミスマッチ塩基対形成は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは独立してそれぞれのヌクレオチドに由来する核酸塩基間で生じ得る。ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－デオキシ核酸塩基である、ミスマッチ対形成中の少なくとも１つの核酸塩基を含有する、例えば、２’－デオキシ核酸塩基は、センス鎖中にある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域中の二重鎖の熱的不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基とのＷ－Ｃ Ｈ結合が損なわれたヌクレオチド、例えば：
Figure 2023514190000027
 を含む。
脱塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）およびミスマッチ修飾のより多くの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１３３８７６に詳細に記載されている。
熱的不安定化修飾はまた、対向する塩基と水素結合を形成する能力が低減または消失したユニバーサル塩基およびリン酸修飾を含み得る。
一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾には、非正準塩基を有するヌクレオチド、例えば、それだけには限らないが、対向鎖中の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれた、または完全に消失した核酸塩基修飾が含まれる。これらの核酸塩基修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／００１１８９５に記載されるように、ｄｓＲＮＡ二重鎖の中心領域の不安定化について評価されている。例示的核酸塩基修飾として、以下：
Figure 2023514190000028
 がある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域における二重鎖の熱的不安定化修飾には、標的ｍＲＮＡ上の塩基と相補的である１つまたは複数のα－ヌクレオチド、例えば、以下：
Figure 2023514190000029
 ［式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ－アルキルである］
が含まれる。
天然のホスホジエステル結合と比較して、ｄｓＲＮＡ二重鎖の熱的安定性を低下させると知られている例示的リン酸修飾として：
Figure 2023514190000030
 がある。
Ｒ基のアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとして、それだけには限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
当業者は認識するであろうが、核酸塩基の機能的役割が本開示のＲＮＡｉ剤の特異性を定義していることを考慮して、核酸塩基修飾は、例えば、オフターゲット効果に対してオンターゲット効果を増強する目的のために、例えば、本開示のＲＮＡｉ剤中に不安定化修飾を導入するために、本明細書において記載されるような種々の方法で実施できるが、利用可能な、一般に、本開示のＲＮＡｉ剤上に存在する修飾の範囲は、非核酸塩基修飾、例えば、ポリリボヌクレオチドの糖基またはリン酸骨格への修飾についてより大きいものとなる傾向がある。このような修飾は、本開示の他の節においてより詳細に記載されており、上記または本明細書において他の場所で記載されるような、天然の核酸塩基または修飾された核酸塩基のいずれかを有する本開示のＲＮＡｉ剤のために明確に企図される。
熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、ｄｓＲＮＡはまた、１または複数の安定化修飾を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）安定化修飾を含み得る。制限するものではないが、安定化修飾は全て、一方の鎖中に存在する場合がある。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖両方が、少なくとも２つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる場合があり、各安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じる場合があり、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンで安定化修飾を含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンと比較してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の安定化修飾を含む。制限するものではないが、アンチセンス鎖中の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’端から位置２、６、８、９、１４および１６に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’端から位置２、６、１４および１６に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’端から位置２、１４および１６に安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも１つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’端または３’端の、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１または＋１のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’端および３’端の各々、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１および＋１に安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’端に、すなわち、不安定化修飾の位置から位置＋１および＋２に少なくとも２つの安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の安定化修飾を含む。制限するものではないが、センス鎖中の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、５’端から位置７、１０および１１に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’端から位置７、９、１０および１１に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２および１５に対して対向するまたは相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２、１３および１５に対して対向するまたは相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３または４つの安定化修飾のブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱的不安定化修飾に対抗するまたは相補的な位置に安定化修飾を含まない。
例示的な熱的安定化修飾として、それだけには限らないが、２’－フルオロ修飾が挙げられる。他の熱的安定化修飾として、それだけには限らないが、ＬＮＡが挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの（例えば、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）２’－フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、２’－フルオロヌクレオチドは全て、一方の鎖中に存在する場合がある。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖両方が、少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる場合があり、各２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じる場合があり、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンで２’－フルオロ修飾を含む。センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンと比較してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、アンチセンス鎖中の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’端から位置２、６、８、９、１４および１６に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’端から位置２、６、１４および１６に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’端から位置２、１４および１６に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’端または３’端の、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１または＋１のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’端および３’端の各々、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１および＋１に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’端に、すなわち、不安定化修飾の位置から位置＋１および＋２に少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、センス中の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’端から位置７、１０および１１に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’端から位置７、９、１０および１１に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２および１５に対して対向するまたは相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２、１３および１５に対して対向するまたは相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３または４つの２’－フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱的不安定化修飾に対抗するまたは相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）生じ、ｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑であり、もう一方の末端は２ｎｔのオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’端に平滑末端を含む。好ましくは、２ｎｔのオーバーハングは、アンチセンスの３’端にある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖中のどのヌクレオチドも修飾され得る。各ヌクレオチドは、非連結性リン酸酸素の、または連結性リン酸酸素の１つもしくは複数の一方または両方の１つまたは複数の変更、リボース糖の構成成分の、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、リン酸部分の「デホスホ」リンカーとの大規模な置き換え、天然に存在する塩基の修飾または置き換え、およびリボース－リン酸骨格の置き換えまたは修飾を含み得る同一または異なる修飾で修飾され得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じる、例えば、塩基またはリン酸部分またはリン酸部分の非連結性Ｏの修飾。一部の場合には、修飾は、核酸中の対象位置の全てで生じるが、多くの場合、生じない。例として、修飾は、３’または５’末端位置でのみ生じる場合があり、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置で、または最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じる場合がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じる場合がある。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域においてのみ生じる場合があり、またはＲＮＡの一本鎖領域においてのみ生じる場合がある。例えば、非連結性Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じる場合があり、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置で、または最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じる場合があり、または二本鎖および一本鎖領域において、特に、末端で生じる場合がある。５’端または両端がリン酸化され得る。
例えば、安定性を増強すること、オーバーハング中に特定の塩基を含めること、または一本鎖オーバーハング中、例えば、５’もしくは３’オーバーハング中、または両方中に修飾されたヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態では、３’または５’オーバーハング中の塩基の全てまたは一部が、例えば、本明細書において記載される修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位置での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された、デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチルの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシまたは２’－フルオロで独立に修飾される。鎖は、２以上の修飾を含有し得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。やはり、これらの修飾は、アンチセンス鎖中に存在する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾に追加されるということは理解されるべきである。
少なくとも２つの異なる修飾は通常、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それらの２つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、非環式ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシから選択される２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチドまたは２’－アラ－Ｆヌクレオチドで独立に修飾される。やはり、これらの修飾は、アンチセンス鎖中に存在する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾に追加されるということは理解されるべきである。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、特に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域における交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾は、１つの鎖の交互ヌクレオチドで生じる。交互ヌクレオチドとは、１つおきのヌクレオチド毎に１つまたは３ヌクレオチド毎に１つまたは同様のパターンを指す場合がある。例えば、Ａ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドへの修飾の１つのタイプを表す場合には、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
交互モチーフ中に含有される修飾のタイプは、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の修飾の１つのタイプを表す場合には、交互ターン、すなわち、１つおきのヌクレオチド上の修飾は、同一である場合があるが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」または「ＣＤＣＤＣＤ…」などといった交互モチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対してシフトされているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なって修飾された基に対応するようなものであり得る、逆もまた同様。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖中のアンチセンス鎖と対形成される場合には、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始する場合があり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始する場合がある。別の例として、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始する場合があり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’に「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始する場合があり、その結果、センス鎖とアンチセンス鎖の間で修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトがある。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置においてセンス鎖またはアンチセンス鎖または両方の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる可能性があり、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得る、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も、異なっている場合もあり、センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域中にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の対形成されるヌクレオチドと連結するように行われ得る。例えば、少なくとも２、３、４または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結でき、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対形成されるヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結があってもよい。例えば、３ヌクレオチドのうち２つがオーバーハングヌクレオチドであり、３番目は、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対形成されるヌクレオチドである、末端の３ヌクレオチドの間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結があり得る。好ましくは、これらの末端の３ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端であり得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、２～１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の１～１０のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むアンチセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７または８つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５または６つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３または４つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の位置１～１０の末端位置内に１つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センスまたはアンチセンス鎖の一方の末端または両端でホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結され得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の各々の二重鎖の内部領域の位置１～１０内に１つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センス鎖の５’端から数えて二重鎖領域の位置８～１６でホスホロチオエートメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結され得る。ｄｓＲＮＡ分子は、位置１～１０の末端位置内に１つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１～５つ（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つ（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つ（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２０および２１に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つ（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２０および２１に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１および２２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１および２２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２２および２３に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２３および２３に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも５つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも６つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも７つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも８つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも９つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１０のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１１のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１２のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１３のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１４のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１５のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１６のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１７のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１８のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１９のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において８つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において７つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において６つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において５つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において４つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において３つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において２つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において１つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、８つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む（限定されない例として、ホスホジエステル）。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、７つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、６つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、５つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、４つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、３つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、２つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、１つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１０のヌクレオチド間連結および８つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１１のヌクレオチド間連結および７つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１２のヌクレオチド間連結および６つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１３のヌクレオチド間連結および６つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１４のヌクレオチド間連結および５つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１５のヌクレオチド間連結および４つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、Ｓｐ立体配置におけるヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。一部の実施形態では、Ｒｐ立体配置におけるヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。一部の実施形態では、キラルではないヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＲｐである点でＲｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、Ｒｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、Ｒｐブロックである。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＳｐである点でＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲｐおよびＳｐブロックの両方を含む。一部の実施形態では、提供されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＲｐを含むが、Ｓｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＳｐを含むが、Ｒｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の、各ヌクレオチド間連結が天然リン酸連結であるＰＯブロックを含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである５’－ブロックを含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、修飾されたヌクレオチド間連結であり、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、ホスホロチオエート連結であり、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、修飾されたヌクレオチド間連結であり、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、ホスホロチオエート連結であり、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、領域中にあるタイプのヌクレオシドを含み、またはオリゴヌクレオチドに、特定のタイプのヌクレオチド間連結、例えば、天然のリン酸連結、修飾されたヌクレオチド間連結、Ｒｐキラルヌクレオチド間連結、Ｓｐキラルヌクレオチド間連結などが続く。一部の実施形態では、Ａに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ａに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ａに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、Ｕに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ｕに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ｕに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、Ｃに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ｃに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ｃに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、Ｇに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ｇに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ｇに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、ＣおよびＵに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、ＣおよびＵに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、ＣおよびＵに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、ＡおよびＧに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、ＡおよびＧに、Ｒｐが続く。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、標的との、二本鎖内のミスマッチ（複数可）またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域中に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいてランク付けできる（例えば、特定の対形成の会合または解離の自由エネルギーで、最も簡単なアプローチは、個々の対に基づいて対を調べることであるが、次の隣接分析または同様の分析も使用できる）。解離の促進の点では：Ａ：ＵはＧ：Ｃを上回って好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃを上回って好ましく、Ｉ：ＣはＧ：Ｃを上回って好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のもの（本明細書において別の場所で記載されるような）は、正準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対形成を上回って好ましく、ユニバーサル塩基を含む対形成は正準対形成を上回って好ましい。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖の５’端でのアンチセンス鎖の解離を促進するために、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃおよびミスマッチ対、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のものまたはユニバーサル塩基を含む対形成の群から独立に選択され得る、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５つの塩基対のうち少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’端から二重鎖領域内の１位置のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の１、２または３つの塩基対のうち少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置で、ジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）連結の３’端に、４’－修飾されたまたは５’－修飾されたヌクレオチドを導入することは、ヌクレオチド間連結に対して立体的効果を発揮し、ひいては、それをヌクレアーゼから保護し、安定化できるということが見出された。
一部の実施形態では、５’－修飾されたヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入される。例えば、５’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入できる。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとして、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－修飾されたヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入される。例えば、４’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入できる。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入できる。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドがある。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、５’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改良する。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的５’－アルキル化ヌクレオシドとして、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改良する。４’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的４’－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改良する。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドがある。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２’－５’連結（２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有し、Ｐ＝ＯまたはＰ＝Ｓである）を含み得る。例えば、２’－５’連結修飾を、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用できる、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’端で使用できる。
別の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ－アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾を、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用できる、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’端で使用できる。
種々の刊行物に多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、これらは全て、本開示のｄｓＲＮＡとともに使用できる。このような刊行物には、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０９１２６９、ＵＳ７８５８７６９、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０が含まれる。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合するものを含む。適した修飾として、５’－モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－グアノシンキャップ（７－メチル化されたものまたはメチル化されていないもの）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）および任意の修飾または未修飾のヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－モノチオリン酸（ホスホロチオエート、（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート、（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）、酸素／硫黄置換された一リン酸、二リン酸および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’－アルファ－チオ三リン酸、５’－ガンマ－チオ三リン酸など）、５’－ホスホロアミダイト（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）が挙げられる。一例では、修飾は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖中に配置できる。
リンカー
一部の実施形態では、本明細書において記載されるコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着させることができる。
リンカーは、通常、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位またはそれだけには限らないが、１つもしくは複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）によって中断または終結され得る、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、へテロアリールアルケニル、へテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）、Ｒ８が、水素、アシル、脂肪族もしくは置換脂肪族である、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環式などの原子の鎖を含む。一部の実施形態では、リンカーは、約１～２４個原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６または８～１６個の原子である。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）のいずれかにおいて示される構造の群から選択される二価または三価分岐リンカーにコンジュゲートされる：
Figure 2023514190000031
 ［式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各出現について独立に、０～２０を表し、反復単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現について各々独立に、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり、
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現について独立に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうち１つまたは複数によって中断または終結され得る、
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現について各々独立に、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、または
Figure 2023514190000032
 であり、
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、リガンド、すなわち、各出現について各々独立に、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖を表し、Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である］。
式（ＸＸＸＶ）のもの：
Figure 2023514190000033
 などの三価コンジュゲート性ＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉ剤とともに使用するために特に有用である。
［式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表す］
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする適した二価および三価分岐リンカー基の例として、それだけには限らないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩのような上記で列挙された構造が挙げられる。
切断可能な連結基とは、細胞の外側で十分に安定であるが、標的細胞中に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。一部の実施形態では、切断可能な連結基は、対象の血液において、または第２の参照条件下（血液または血清において見出される条件を模倣または表すように選択され得る）よりも、標的細胞において、または第１の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る）で、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれより多く、または少なくとも約１００倍速く切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液においてよりも細胞の内側で、より一般的であるか、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。このような分解剤の例として、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤が挙げられ、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、メルカプタンなどの還元剤、エステラーゼ、エンドソームまたは酸性環境を作出できる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの、一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素を含む。
切断可能な連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、適したｐＨで切断され、それによって、細胞の内側でリガンドからカチオン性脂質を細胞の所望のコンパートメント中に放出する切断可能な連結基を有するであろう。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的化されるべき細胞に応じて変わり得る。
一般に、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤（または条件）の、候補連結基を切断する能力を試験することによって評価できる。また、血液中で、または他の非標的組織と接触する場合に、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することも望ましいであろう。したがって、第１および第２の条件の間の切断に対する相対的感受性を決定でき、第１のものは、標的細胞において切断を示すように選択され、第２のものは、他の組織または生物学的流体、例えば、血液もしくは血清において切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養物において、臓器においてまたは組織培養物において、または動物全体において実施できる。細胞不含または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全体におけるさらなる評価によって確認することは、有用であり得る。一部の実施形態では、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く切断される。
酸化還元切断可能な連結基
一部の実施形態では、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例として、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）がある。候補の切断可能な連結基が適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書において記載される方法に目を向けることができる。例えば、細胞、例えば、標的細胞において観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオトレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価できる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価できる。あるものでは、候補化合物は、血液において最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態学アッセイを使用して決定できる。
リン酸ベースの切断可能な連結基
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な連結基を含む。リン酸ベースの切断可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞中のリン酸基を切断する薬剤の例として、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。リン酸ベースの連結基の例として、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－がある。一部の実施形態では、リン酸ベースの連結基として、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－がある。一部の実施形態では、リン酸ベースの連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
酸切断可能な連結基
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。一部の実施形態では、酸切断可能な連結基は、約６．５以下の（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０またはそれより低い）ｐＨを有する酸性環境において、または一般酸として作用できる酵素などの薬剤によって切断される。細胞では、特定の低ｐＨオルガネラ、例えば、エンドソームおよびリソソームは、酸切断可能な連結基のための切断環境を提供できる。酸切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏまたは－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。一部の実施形態では、エステルの酸素と結合している炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
エステルベースの切断可能な連結基
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な連結基を含む。エステルベースの切断可能な連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ペプチドベースの切断可能な連結基
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な連結基を含む。ペプチドベースの切断可能な連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成され、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドをもたらすペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらすアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらす、ペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－（式中、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である）を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第４，８２８，９７９号、同４，９４８，８８２号、同５，２１８，１０５号、同５，５２５，４６５号、同５，５４１，３１３号、同５，５４５，７３０号、同５，５５２，５３８号、同５，５７８，７１７号、同５，５８０，７３１号、同５，５９１，５８４号、同５，１０９，１２４号、同５，１１８，８０２号、同５，１３８，０４５号、同５，４１４，０７７号、同５，４８６，６０３号、同５，５１２，４３９号、同５，５７８，７１８号、同５，６０８，０４６号、同４，５８７，０４４号、同４，６０５，７３５号、同４，６６７，０２５号、同４，７６２，７７９号、同４，７８９，７３７号、同４，８２４，９４１号、同４，８３５，２６３号、同４，８７６，３３５号、同４，９０４，５８２号、同４，９５８，０１３号、同５，０８２，８３０号、同５，１１２，９６３号、同５，２１４，１３６号、同５，０８２，８３０号、同５，１１２，９６３号、同５，２１４，１３６号、同５，２４５，０２２号、同５，２５４，４６９号、同５，２５８，５０６号、同５，２６２，５３６号、同５，２７２，２５０号、同５，２９２，８７３号、同５，３１７，０９８号、同５，３７１，２４１号、同５，３９１，７２３号、同５，４１６，２０３号、同５，４５１，４６３号、同５，５１０，４７５号、同５，５１２，６６７号、同５，５１４，７８５号、同５，５６５，５５２号、同５，５６７，８１０号、同５，５７４，１４２号、同５，５８５，４８１号、同５，５８７，３７１号、同５，５９５，７２６号、同５，５９７，６９６号、同５，５９９，９２３号、同５，５９９，９２８号および同５，６８８，９４１号、同６，２９４，６６４号、同６，３２０，０１７号、同６，５７６，７５２号、同６，７８３，９３１号、同６，９００，２９７号、同７，０３７，６４６号、同８，１０６，０２２号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物において全ての位置について均一に修飾される必要はなく、実際、前記修飾のうち２つ以上を単一化合物中に、またはさらにｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。本開示はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物を含む。
本開示との関連で「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」とは、各々、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチドで構成されている、２つ以上の化学的に別個の領域を含有する、ｉＲＮＡ化合物例えば、ｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは通常、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するようにＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質として働き得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果的に、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合により短いｉＲＮＡで比較できる結果を得ることができることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出できる。
ある特定の例では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾できる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。このような非リガンド部分には、コレステロールなどの脂質部分［Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553］、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306、Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）が含まれていた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列挙されている。通常のコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基が、コンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡがまだ固体支持体に結合している状態で、または溶液相でＲＮＡが切断された後に実施し得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製によって、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。
ｉＲＮＡのデリバリー
それを必要とする対象へのｉＲＮＡのデリバリーは、いくつかの異なる方法において達成することができる。ｉｎ ｖｉｖｏデリバリーは、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施することができる。あるいは、デリバリーは、ｉＲＮＡをコードしその発現を誘導する１つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施することができる。これらの代替策は、下記においてさらに説明される。
直接デリバリー
概して、核酸分子をデリバリーする任意の方法（は、ｉＲＮＡの使用に適合させることができる［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたい］。しかしながら、インビボでｉＲＮＡ分子を成功裏にデリバリーするために考慮することが重要である以下の３つの要因がある：（ａ）デリバリーされた分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の防止および（３）標的組織におけるデリバリーされた分子の蓄積。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与、例えば、組織への直接注入もしくは移植（限定されない例として、眼）または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。処置部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化し、薬剤によって害され得るかまたは薬剤を分解し得る全身組織への薬剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子のより少ない合計用量を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合での遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルでの硝子体注入によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内デリバリー［Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138］およびマウスでの網膜下注入［Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216］は、両方とも、加齢黄斑変性症の実験モデルにおいて、新生血管形成を予防することが示された。加えて、マウスへのｄｓＲＮＡの直接的腫瘍内注入は、腫瘍体積を減少させ［Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274］、ならびに腫瘍を有するマウスの生存を長引かせることができる［Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15:515-523］。ＲＮＡ干渉は、直接注入によるＣＮＳへの［Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93 :594-602］、および鼻腔内投与による肺への［Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11:50-55］、局所デリバリーによる成功も示している。疾患の処置のためにｉＲＮＡを全身投与する場合、ＲＮＡを修飾することができ、またはその代わりに、薬物デリバリーシステムを使用してデリバリーすることができ；両方の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐように機能する。
ＲＮＡまたは医薬担体の修飾も、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にすることができ、望ましくないオフターゲット効果を避けることができる。ｉＲＮＡ分子は、他の基、例えば、本明細書において記載されるような脂質または炭水化物基への化学的コンジュゲーションによって修飾することができる。このようなコンジュゲートは、ｉＲＮＡを特定の細胞、例えば、肝臓細胞、例えば、肝細胞へ標的化するために使用できる。例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは脂質（例えば、ＬＮＰ）製剤は、ｉＲＮＡを特定の細胞、例えば、肝臓細胞、例えば、肝細胞へ標的化するために使用できる。
ｉＲＮＡ分子はまた、細胞取り込みを増強し、分解を防ぐように、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾できる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたＡｐｏＢへと誘導されたｉＲＮＡを、マウスに全身的に注入したところ、結果として、肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを生じた［Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178］。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害し、腫瘍縮小を媒介することが分かっている［McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015］。代替の実施形態では、ｉＲＮＡは、薬物デリバリーシステム、例えば、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性デリバリーシステムなどを使用してデリバリーすることができる。正に帯電したカチオン性デリバリーシステムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、負に帯電した細胞膜での相互作用も高め、それにより、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合することができるか、またはｉＲＮＡを封入するベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる［例えば、Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい］。ベシクルまたはミセルの形成はさらに、全身投与したときのｉＲＮＡの分解を防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい］。ｉＲＮＡの全身デリバリーにとって有用な薬物デリバリーシステムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ［Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra］、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、「固体核酸脂質粒子」［Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441:111-114］、カルジオリピン［Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091］、ポリエチレンミン［Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659］、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド［Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487］、およびポリアミドアミン［Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804］が挙げられる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。投与の方法およびｉＲＮＡとシクロデキストリンとによる医薬組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２７，６０５号に見出すことができる。
ベクターによってコードされるｉＲＮＡ
別の態様では、ＶＥＧＦ－Ａを標的化するｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写物ユニットから発現され得る［例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10；Skillern, A., et al.,国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１３、Conrad、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／２２１１４、およびConrad、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい］。発現は、使用される特定のコンストラクトならびに標的組織または細胞タイプに応じて、一過性である（数時間から数週間ほど）場合も、継続される（数週間～数ヶ月またはそれ以上）場合もある。これらの導入遺伝子は、直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、それらは、統合ベクターまたは非統合ベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれることを可能にするように構築することもできる［Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)92:1292］。
ｉＲＮＡの個々の鎖（単数または複数）は、発現ベクター上のプロモーターから転写させることができる。２つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡを産生するように発現される場合、２つの別々の発現ベクターを、標的細胞中に共導入することができる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個別の鎖を、両方が同じ発現プラスミド上に位置されたプロモーターによって転写させることができる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、通常、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞に対して、例えば、脊椎動物細胞に対して適合性の発現ベクターを使用して、本明細書において記載されるｉＲＮＡの発現のための組換えコンストラクトを生成することができる。真核細胞発現ベクターは、当技術分野で公知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。通常、このようなベクターは、所望の核酸セグメントの挿入のために好都合な制限部位を含有する。ｉＲＮＡ発現ベクターのデリバリーは、例えば、静脈内または筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞への投与とその後の患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって、全身性であり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、または非カチオン性の脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞中にトランスフェクトできる。１週間またはそれより長い期間にわたる、標的ＲＮＡの異なる領域を標的化するｉＲＮＡ媒介性ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも、本開示によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、種々の既知方法を使用してモニタリングできる。例えば、一過性トランスフェクションは、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーターを用いて信号を送ることができる。エキソビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞に特定の環境要因（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を提供するマーカーを使用して確実にすることができる。
本明細書において記載される方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるわけではないが、（ａ）アデノウィルスベクター；（ｂ）レトロウイルスベクター、例えば、これらに限定されるわけではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）水泡ウイルスベクター、例えば、オルソポックス、例えば、ワクチンウイルスベクターまたはトリポックス、例えば、カナリアポックスまたは鶏痘；ならびに（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるかまたは組み込まれないであろう。コンストラクトは、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含むことができる。あるいは、コンストラクトは、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクター中に組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、概して、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とするであろう。ベクターおよびコンストラクトについて考慮する他の態様は、以下にさらに記載される。
ｉＲＮＡのデリバリーにとって有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるｉＲＮＡの発現にとって十分である調節エレメント（プロモーター、エンハンサーなど）を含むであろう。調節エレメントは、構成的または調節された／誘導可能な発現のいずれかを提供するように選択できる。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、ある特定の生理学的レギュレーター、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンに対して感受性である誘導可能な調節配列を使用することによって正確に調節できる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞における、または哺乳動物におけるｄｓＲＮＡ発現の管理に適したこのような誘導可能な発現システムには、例えば、エクジソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的インデューサーおよびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者ならば、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択できるであろう。
具体的な実施形態では、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用できる。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる［Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照されたい］。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡ中への組込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、１つまたは複数のベクター中にクローニングされ、これが、患者への核酸のデリバリーを容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細については、例えば、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするためにｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞へデリバリーするためにレトロウイルスベクターの使用を記載するBoesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出すことができる。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の参考文献として以下がある：Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)；Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994)；Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)；およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)。使用するために企図されるレンチウイルスベクターはとして、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４３，５２０号、同５，６６５，５５７号および同５，９８１，２７６号に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルスはまた、ｉＲＮＡのデリバリーにおいて使用するために企図される。アデノウイルスは、例えば、呼吸上皮に遺伝子をデリバリーするための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、呼吸上皮に自然に感染し、そこで軽度疾患を引き起こす。アデノウイルスベースのデリバリーシステムの他の標的として、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉がある。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染可能であるという利点を有する。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)には、アデノウイルスベースの遺伝子療法の概要が示されている。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)は、アカゲザルの呼吸上皮への遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991);Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)；Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９；およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)に見出すことができる。本開示において特徴とされるｉＲＮＡを発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法および標的細胞中にベクターをデリバリーする方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される［Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)；米国特許第５，４３６，１４６号］。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現させることができる。本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡを発現させるための適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法標的細胞中にベクターをデリバリーする方法は、Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101；Fisher K J et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532；Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願番号ＷＯ９４／１３７８８；および国際特許出願番号ＷＯ９３／２４６４１に記載されており、それらの全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
別の通常のウイルスベクターとして、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、例えば、弱毒化ワクシニア、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣおよびトリポックス、例えば、鶏痘またはカナリアポックスがある。
ウイルスベクターの向性は、ベクターを他のウイルスに由来するエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原を用いてシュードタイピングすることよって、または必要に応じて異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって修飾できる。例えば、レンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどに由来する表面タンパク質を用いてシュードタイピングすることができる。ＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することによって、異なる細胞を標的化するように作製することができる；例えば、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれるRabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中にベクターを含み得る、または遺伝子デリバリー媒体が埋め込まれている遅延放出マトリックスを含み得るあるいは、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、完全な遺伝子デリバリーベクターが無傷で生成され得る場合には、医薬品は、遺伝子デリバリーシステムを生成する１種または複数の細胞を含み得る。
ＩＩＩ．ｉＲＮＡを含有する医薬組成物
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＶＥＧＦ－Ａの発現または活性と関連する疾患または障害（例えば、血管新生性眼疾患）を処置するのに有用である。このような医薬組成物は、デリバリーの様式に基づいて製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、例えば、眼球内デリバリー（例えば、硝子体内投与、例えば、硝子体内注射、経強膜投与、例えば、経強膜注射、結膜下投与、例えば、結膜下注射、球後投与、例えば、球後注射、前房内投与、例えば、前房内注射または網膜下投与、例えば、網膜下注射）による局在化デリバリーのために製剤化できる。他の実施形態では、組成物は、局所デリバリーのために製剤化できる。別の例では、組成物は、非経口デリバリーによる、例えば、静脈内（ＩＶ）デリバリーによる全身投与のために製剤化できる。一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物（例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたはＬＮＰ製剤を含む組成物）は、静脈内デリバリーのために製剤化される。
本明細書において特徴とされる医薬組成物は、ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。一般に、ｉＲＮＡの適した用量は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムあたり０．０１～２００．０ミリグラムの範囲となる。医薬組成物は、１日１回投与され得る、またはｉＲＮＡは、１日を通じて適当な間隔で、２、３またはそれより多い部分用量として、またはさらに連蔵注入または徐放性製剤によるデリバリーを使用して投与され得る。その場合には、各部分用量中に含有されるｉＲＮＡは、総１日投与量を達成するために相応に少ないものでなくてはならない。投与量単位はまた、例えば、数日の期間にわたるｉＲＮＡの徐放を提供する従来の徐放性製剤を使用する数日にわたるデリバリーのために配合できる。徐放性製剤は、当技術分野では公知であり、本開示の薬剤とともに使用できるなど、特定の部位での薬剤のデリバリーにとって特に有用である。この実施形態では、投与量単位は、１日用量の対応する倍数を含有する。
ＶＥＧＦ－Ａレベルに対する単回用量の効果は、長く持続する場合があり、その結果、その後の用量が３、４もしくは５日以下の間隔で、または１、２、３、４、１２、２４もしくは３６週間以下の間隔で投与される。
当業者ならば、それだけには限らないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全身の健康および／または年齢ならびに存在する他の疾患を含むある特定の要因が、対象を有効に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼす場合があるということは理解するであろう。その上、治療有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置または一連の処置を含み得る。本開示によって包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量およびインビボ半減期の推定は、従来方法論を使用して、適した動物モデルを使用するインビボ試験に基づいて行うことができる。
適した動物モデル、例えば、マウスまたはカニクイザル、例えば、ヒトＶＥＧＦ－Ａを発現する導入遺伝子を含有する動物を使用して、ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡの治療上有効用量および／または有効投与計画投与を決定できる。
本開示はまた、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、ならびに処置されるエリアに応じて、いくつかの方法において投与され得る。投与は、局所（ｌｏｃａｌ）（例えば、眼球内注射による）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）（例えば、点眼薬溶液による）または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹膜内または筋肉内注射または注入、皮下、例えば、移植されたデバイスによるもの、または頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内または脳室内投与によるものが含まれる。
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末状、または油性基剤、増粘剤などが、必要である場合がある、または望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。適した局所用製剤としては、本開示において特徴とされるｉＲＮＡが、局所デリバリー剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性物質との混合物であるものが挙げられる。好適な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本開示において特徴とされるｉＲＮＡは、リポソーム内においてカプセル化し得、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成し得る。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体化し得る。好適な脂肪酸およびエステルとしては、これらに限定されるわけではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプロエート、１－ドデシルアザシクロヘプタナ－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセライド、ディグリセライド、またはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。局所用製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に説明されている。
リポソーム製剤
薬物の製剤化のために研究および使用されてきたマイクロエマルジョン以外に、多数の組織化された界面活性剤構造がある。これらとして、単層、ミセル、二層およびベシクルが挙げられる。リポソームなどのベシクルは、薬物デリバリーの観点から、それらが提供するその特異性および作用の持続期間のために高い関心を集めてきた。本開示において使用されるように、用語「リポソーム」とは、球状の二層（単数または複数）に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルを意味する。
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層または多重層ベシクルである。水性部分は、デリバリーされるべき組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合可能であるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合可能ではないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
無傷の哺乳動物皮膚を通過するために、脂質ベシクルは、適した経皮勾配の影響下で各々５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通り抜けなければならない。したがって、高度に変形可能な、このような微細孔を通り抜けることが可能なリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点として、以下が挙げられる；天然のリン脂質から得られるリポソームは生体適合性および生分解性である；リポソームは、様々な水および脂質溶解性薬物を取り込むことができる；リポソームは、それらの内部コンパートメント内の被包された薬物を、代謝および分解から保護することができる［Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245中のRosoff］。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事柄は、脂質表面の電荷、ベシクルのサイズ、およびリポソームの水の量である。
リポソームは、作用部位への活性成分の移送およびデリバリーにとって有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜と併合し始め、リポソームと細胞の併合が進行するにつれ、リポソーム内容物は細胞内へと流れ込み、そこで、活性薬剤が作用できる。
リポソーム製剤は、多くの薬物のデリバリー様式として広範な研究の焦点となってきた。局所投与のためには、リポソームが他の製剤を上回る利点を示すという証拠が増えている。このような利点として、投与された薬物の高い全身吸収と関連する副作用の低減、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増大および親水性および疎水性両方の広範な薬物を皮膚中に投与する能力が挙げられる。
いくつかの報告によって、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚中にデリバリーするリポソームの能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物は、皮膚に投与されてきた。適用の大部分は、結果として表皮上部の標的化した。
リポソームは、２つの広いクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正に帯電したリポソームであり、負に帯電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正に帯電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中へと放出する［Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147:980-985］。
リポソームは、ｐＨ感応性（ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であるかまたは負に帯電しており、それとの複合体ではなくＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質の両方が、同じように荷電されるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、いくらかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部へと捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層にデリバリーするために、ｐＨ感応性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的遺伝子において検出された［Zhou et al. Journal of Controlled Release, 1992, 19:269-274］。
リポソーム組成物の主要なタイプの１つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなど、から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究が、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所デリバリーを評価してきた。モルモット皮膚へのインターフェロンを含有するリポソームの適用は、皮膚ヘルペススコアの低減をもたらし、他の手段（例えば、溶液として、またはエマルジョンとして）によるインターフェロンのデリバリーは無効であった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410）。さらに、追加の研究によって、水性システムを使用するインターフェロンの投与に対して、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、リポソーム製剤は水性投与よりも優れていたと結論付けられた（du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265）。
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系、も、皮膚への薬物のデリバリーにおけるそれらの有用性を判定するためにも調べられている。ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）（商標） Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびノバソーム（商標） ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮中にシクロスポリン－Ａをデリバリーするために使用された。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリン－Ａの蓄積を促進することにおいて有効であることを示した［Hu et al., S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466］。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、当該用語は、本明細書において使用される場合、リポソームに組み込まれた場合に、結果としてそのような特化された脂質を欠くリポソームと比較して増強された循環寿命を生じるような１つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームを意味する。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）１つまたは複数の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１を含むもの、または（Ｂ）：１つまたは複数の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などによって誘導体化されるものである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームの場合、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への減少した取り込みに由来すると、当技術分野において考えられる［Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223:42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765］。
１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら［Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64］は、リポソームの血液半減期を改善する、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドサルフェート、およびホスファチジルイノシトールの能力について報告している。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949］によって解説されている。米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４（両方ともＡｌｌｅｎらによる）では、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）では、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示されている。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）において開示されている。
１つまたは複数の親水性ポリマーを用いて誘導体化された脂質を含む多数のリポソームおよびその調製方法は、当技術分野で公知である。Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn.,1980, 53, 2778)には、非イオン性界面活性剤である２Ｃ１２１５Ｇを含み、ＰＥＧ部分を含有するリポソームが記載された。Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79)には、高分子グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングは、有意に増強された血液半減期をもたらすと注記された。Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同４，５３４，８９９号）によって、ポリアルキレングリコオール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の付着によって修飾された合成リン脂質が記載されている。Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235)には、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートを用いて誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血液循環半減期の有意な増大を有することを実証する実験が記載された。Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)は、このような観察結果を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組合せから形成されたＤＳＰＥ－ＰＥＧに拡張した。その外表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームが、Fisherの欧州特許番号ＥＰ０４４５１３１Ｂ１およびＷＯ９０／０４３８４に記載されている。１～２０モルパーセントのＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム組成物およびその使用方法は、Woodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号および同５，３５６，６３３号）およびMartin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許番号ＥＰ０４９６８１３Ｂ１）によって記載されている。いくつかの他の脂質－ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともMartin et al.の）において、およびＷＯ９４／２００７３（Zalipsky et al.）において開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Choi et al）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al.）および米国特許第５，５５６，９４８号（Tagawa et al.）には、その表面上で機能的部分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームが記載されている。
核酸を含むいくつかのリポソームは、当技術分野で公知である。Thierry et al.のＷＯ９６／４００６２には、高分子量核酸をリポソーム中に被包する方法が開示されている。Tagawa et al.の米国特許第５，２６４，２２１号には、タンパク質が結合したリポソームが開示され、このようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含み得ると断定されている。Rahman et al.の米国特許第５，６６５，７１０号には、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドを被包するある特定の方法が記載されている。Love et al.のＷＯ９７／０４７８７には、ｒａｆ遺伝子に標的化されるｄｓＲＮＡを含むリポソームが開示されている。
トランスファーソームは、別のタイプのリポソームであり、薬物デリバリーシステムの魅力的な候補である、非常に変形可能な脂質集合体である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、脂質滴より小さい孔を通って容易に浸透することができる、脂質滴として説明し得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応し、例えば、それらは、自己最適性（皮膚における孔の形状に適応性のある）であり、自己修復性であり、断片化することなく頻繁にそれらの標的に達し、多くの場合、自動装填性である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤を標準的リポソーム組成物に加えることができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンをデリバリーするために使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介デリバリーは、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同じくらい有効であることが分かっている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームのような製剤においてにおいて、広い応用を見い出す。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による方法である。親水性基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用される様々な界面活性剤をカテゴライズするための最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧製品において広い応用を見い出し、広い範囲のｐＨ値において使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなど、も、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーである。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、例えば、石鹸など、アシルラクチレ－ト、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなど、スルホネート、例えば、アキルベンゼンスルホネート、など、アシルイセチオネート、アシルタウレート、ならびにスルホスクシネートおよびホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーは、アルキル硫酸エステルおよび石鹸である。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用は、概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
核酸脂質粒子
一部の実施形態では、本開示において特徴とされるＶＥＧＦ－Ａ ｄｓＲＮＡは、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸－脂質粒子を形成するために脂質製剤中に十分に被包される。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内注射（ｉ．ｖ．）後に、延長された循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）において蓄積するため、全身投与にとって非常に有用である。ＳＰＬＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含み、それは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０３６８３において詳しく説明されるようなカプセル化された縮合剤－核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には、約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍから約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍから約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸は、本開示の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を有する。核酸－脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９６４において開示されている。
一部の実施形態では、脂質と薬物の比率（質量／質量比）（例えば、脂質とｄｓＲＮＡの比率）は、約１：１から約５０：１、約１：１から約２５：１、約３：１から約１５：１、約４：１から約１０：１、約５：１から約９：１、または約６：１から約９：１の範囲であるだろう。
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジレノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジレノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジレノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジレノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジレノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）または３－（Ｎ，Ｎ－ジレノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジレノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジレノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）またはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約４０ｍｏｌ％を構成し得る。
一部の実施形態では、化合物２，２－ジレノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製できる。２，２－ジレノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０７，９９８に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジレノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン、１０％のＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、６３．０±２０ｎｍ粒子サイズおよび０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質である場合があり、それだけには限らないが、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロールまたはそれらの混合物が含まれる。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の、約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％またはコレステロールが含まれる場合には約５８ｍｏｌ％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、例えば、制限するものではないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質は、粒子中に存在する総脂質の、０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％または約２ｍｏｌ％であり得る。
一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の、約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％または約４８ｍｏｌ％のコレステロールをさらに含む。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。
ＬＮＰ０１
一部の実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（参照により本明細書に組み込まれる２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（例えば、ＬＮＰ０１粒子）を調製できる。エタノール中の各々の保存溶液は、以下のとおりに調製できる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次いで、ＮＤ９８、コレステロールおよびＰＥＧ－セラミドＣ１６保存溶液を、例えば、４２：４８：１０モル比で組み合わせることができる。組み合わされた脂質溶液を、最終エタノール濃度が、約３５～４５％であり、最終酢酸ナトリウム濃度が、約１００～３００ｍＭであるように、水性ｄｓＲＮＡ（例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５中）と混合できる。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、通常、混合すると自発的に形成される。所望の粒径分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を、例えば、サーモバレル押し出し機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。一部の場合には、押し出し工程は省くことができる。エタノール除去および同時のバッファー交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成できる。バッファーは、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換できる。
Figure 2023514190000034
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、国際出願公開番号ＷＯ２００８／０４２９７３に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる例示的脂質－ｄｓＲＮＡ製剤は、以下の表に提供される。
［表１］
Figure 2023514190000035
Figure 2023514190000036
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１４）（ＰＥＧは２０００の平均分子量を有する）
ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１８）（ＰＥＧは２０００の平均分子量を有する）
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（ＰＥＧは２０００の平均分子量を有する）
ＳＮＡＬＰ（ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、２００９年４月１５日に出願された国際公開番号ＷＯ２００９／１２７０６０に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年１月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１４８，３６６号、２００９年３月２日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１５６，８５１号、２００９年６月１０日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１８５，７１２号、２００９年７月２４日に出願された米国仮特許出願番号第６１／２２８，３７３号、２００９年９月３日に出願された米国仮特許出願番号第６１／２３９，６８６号および２０１０年１月２９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、２００９年９月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１８５，８００号および２０１０年６月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、例えば、２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃ１２－２００を含む製剤は、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１７５，７７０号および２０１０年５月５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
カチオン性脂質の合成
本開示において特徴とされる核酸－脂質粒子において使用される化合物、例えば、カチオン性脂質などのいずれかは、公知の有機合成技術によって調製できる。全ての置換は、別に断りのない限り、以下に定義される通りである。
「アルキル」とは、１～２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐、非環式または環式、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとして、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどが挙げられ、一方で、飽和分岐アルキルとして、イソプロピル、ｓ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとして、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ、一方で、不飽和環式アルキルとして、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
「アルケニル」とは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上記で定義されるようなアルキルを意味する。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。代表的な直鎖および分岐アルケニルとして、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」とは、隣接する炭素の間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上記で定義されるような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐アルキニルとして、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどが挙げられる。
「アシル」とは、以下で定義されるような、結合点の炭素がオキソ基で置換されている、任意のアルキル、アルケニルまたはアルキニルを意味する。例えば、－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニルおよび－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
「複素環」とは、飽和、不飽和または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５～７員の単環式または７～１０員の二環式複素環式環を意味し、ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は、四級化されてもよく、上記のヘテロ原子のいずれかが、ベンゼン環に融合されている二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環は、以下で定義されるようなヘテロアリールを含む。複素環には、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
用語「適宜置換されてもよいアルキル」、「適宜置換されてもよいアルケニル」、「適宜置換されてもよいアルキニル」、「適宜置換されてもよいアシル」および「適宜置換されてもよい複素環」とは、置換される場合に、少なくとも１個の水素原子が置換基で置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合には、２個の水素原子が置き換えられる。この関連で、置換基として、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘおよび－ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、ここでｎは、０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同一であるかまたは異なっており、独立に水素、アルキルまたは複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘおよび－ＳＯｎＮＲｘＲｙのうち１つまたは複数でさらに置換され得る。
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
一部の実施形態では、本開示において特徴とされる方法は、保護基の使用を必要とする場合がある。保護基方法論は、当業者に公知である（例えば、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照されたい）。手短には、本開示の文脈内で保護基とは、官能基の不要の反応性を低減するか、または排除する任意の基である。保護基を官能基に付加して、ある特定の反応の間その反応性をマスクし、次いで、除去して元の官能基を明らかにすることができる。一部の実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の不要の反応性を低減するか、または排除する任意の基である。保護基は、当技術分野で公知の技術を使用して付加および除去できる。
式Ａの合成
一部の実施形態では、本開示において特徴とされる核酸－脂質粒子は、式Ａのカチオン性脂質を使用して製剤化される：
Figure 2023514190000037
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、各々は、適宜置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は独立に低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は一緒になって、適宜置換されてもよい複素環式環を形成する場合もある。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジレノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般に、上記の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２によって作製でき、全ての置換基は、特に断りのない限り上記で定義のとおりである。
Figure 2023514190000038
Ｒ１およびＲ２が独立に、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、各々は、適宜置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は独立に低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は一緒になって、適宜置換されてもよい複素環式環を形成する場合もある脂質Ａは、スキーム１に従って調製できる。ケトン１およびブロミド２は、当業者に公知の方法に従って購入または調製できる。１および２の反応は、ケタール３をもたらす。アミン４を用いるケタール３の処置は、式Ａの脂質をもたらす。式Ａの脂質は、Ｘがハロゲン、ヒドロキシド、ホスフェート、スルフェートなどから選択されるアニオン対イオンである式５の有機塩基を用いて、対応するアンモニウム塩に変換できる。
Figure 2023514190000039
あるいは、ケトン１出発材料は、スキーム２に従って調製できる。グリニャール試薬６およびシアン化物７は、購入できる、または当業者のものに公知の方法に従って調製できる。反応６と７の反応によって、ケトン１が得られる。ケトン１の、対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１に記載されるとおりである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は、以下のとおりとした。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸ハイドロクロライド（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。希塩酸と、続いて。希重炭酸ナトリウム水溶液で溶液を洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。残渣を１～５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を使用してシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製された生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を除去し、無色のオイル（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を、以下のスキーム３を使用して実施した：
Figure 2023514190000040
５１５の合成：
２ネックのＲＢＦ（１Ｌ）中の２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下０℃でゆっくりと添加した。完全に添加した後、反応混合物を室温に加温し、次いで、還流に４時間加熱した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後（ＴＬＣによる）、混合物を０℃に冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を注意深く添加してクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾別した。残渣をＴＨＦで十分に洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃ＨＣｌを用いて希釈し、室温で２０分間撹拌した。真空下で揮発分をストリッピングして、５１５の塩酸塩を白色固体として仕上げた。収量：７．１２ｇ。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (広幅, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
５１６の合成：
２５０ｍＬの２ネックのＲＢＦ中の１００ｍＬの無水ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。５０ｍＬの無水ＤＣＭ中のＮ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと添加した後、反応混合物を室温に加温させた。反応が完了した後（ＴＬＣによって、２～３時間）、１Ｎ ＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）を用いて混合物を連続的に洗浄した。次いで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗材料を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、５１６を粘着性塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
１ネックの５００ｍＬ ＲＢＦ中の２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液に、シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を溶解し、それに、室温で、Ｎ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）と、続いて、ｔ－ブタノール中のＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の７．６％溶液４．２ｍＬを添加した。反応が完了した後（約３時間）、固体Ｎａ２ＳＯ３を添加して混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）と、続いて、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）を用いて、および最後にブライン（１×５０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で溶媒を除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製によってジアステレオマーの混合物を得、これを分取ＨＰＬＣによって分離した。収量：－６ｇ粗物質。
５１７Ａ－ピーク－１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5 存在, HPLC-97.86%.
Ｘ線によって立体化学的に確認された。
５１８の合成：
化合物５０５の合成について記載されたものと類似の手順を使用して、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色のオイルとして得た。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
化合物５１９の合成のための一般的な手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液に、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷溶液を滴加様式で添加した。完全に添加した後、混合物を４０℃に０．５時間かけて加熱し、次いで、氷浴上で再度冷却した。混合物を飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液を用いて注意深く加水分解し、セライトを通して濾過し、オイルに還元した。カラムクロマトグラフィーによって、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）が提供され、これは、無色のオイルとして得られた。13C NMR = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; electrospray MS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+の分子量 計算値654.6, 実測値654.6.
標準法または押し出しのない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の方法で特性決定できる。例えば、製剤は、通常、目視検査によって特性決定される。凝集物または沈殿物のない白色を帯びた半透明の溶液でなければならない。脂質－ナノ粒子の粒子サイズおよび粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＳＡ）を使用して光散乱によって測定できる。粒子は、約２０～３００ｎｍ、例えば、４０～１００ｎｍのサイズでなければならない。粒径分布は、単様式でなくてはならない。製剤中の総ｄｓＲＮＡ濃度ならびに捕捉された画分は、色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化ｄｓＲＮＡの試料は、製剤破壊性界面活性剤、例えば、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００の存在下または非存在下で、ＲＮＡ結合性色素、例えば、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートできる。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線に対する、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定できる。捕捉された画分は、総ｄｓＲＮＡ含量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含量（界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定されるような）を差し引くことによって決定される。捕捉されたｄｓＲＮＡのパーセントは、通常、＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤については、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、少なくとも１２０ｎｍである。適した範囲は、通常、約少なくとも５０ｎｍ～約少なくとも１１０ｎｍ、約少なくとも６０ｎｍ～約少なくとも１００ｎｍまたは約少なくとも８０ｎｍ～約少なくとも９０ｎｍである。
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末剤または粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体における懸濁剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サッシェ、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましくあり得る。一部の実施形態では、経口製剤は、本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併せて投与される、製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプロエート、１－ドデシルアザシクロヘプタナ－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセライド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などが使用される。例示的組合せの１つは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらに、浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡは、噴霧された乾燥粒子などの粒状において、経口によりデリバリーし得、またはマイクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化し得る。ｄｓＲＮＡ複合剤としては、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化されたゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロース、およびデンプンが挙げられる。好適な複合剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリーＬリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミン、およびＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に説明されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳中へ）、くも膜下腔内、硝子体内、網膜下、経強膜、結膜下、球後、前房内、脳室内または肝内投与のための組成物および製剤として、バッファー、希釈剤および他の適した添加物、例えば、それだけには限らないが、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む場合もある滅菌水溶液を挙げることができる。
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤を含む。これらの組成物は、これらに限定されるわけではないが、予め形成された液体、自己乳化性固体、および自己乳化性半固体を含む様々な成分から生成し得る。
好都合には単位投与形で提示できる、本開示において特徴とされる医薬製剤は、医薬品産業において公知の従来技術に従って調製できる。そのような技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と混合する工程を含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化された固体担体またはその両方と均一にかつ密接に混合し、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
本開示において特徴とされる組成物は、例えば、これらに限定されるわけではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、軟質ゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化し得る。組成物は、水性媒質、非水性媒質、または混合媒質における懸濁液としても製剤化し得る。水懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランなどをさらに含有し得る。懸濁液は、安定化剤も含有し得る。
Ｃ．さらなる製剤
エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化し得る。エマルションは、典型的には、一方の液体が通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態において別の液体に分散された不均質系である［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照されたい］。エマルションは、多くの場合、お互いに十分に混合され分散された２つの不混和性液相を含む二相系である。一般的に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）種または水中油（ｏ／ｗ）種のどちらかであり得る。水相が、微細化されて微細な液滴として大量の油相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が、微細化されて微細な液滴として大量の水相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相および、水相中また油相中のどちらかの溶液としてまたはそれ自体別々の相として存在し得る活性薬物に加えて、追加の成分を含有し得る。乳化剤、安定化剤、染料、および抗酸化剤などの医薬品賦形剤も、必要であれば、エマルション中に存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３相以上で構成される多相エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二相エマルションでは提供することができないある特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さい水滴を封入する多相エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、連続油相中において安定化された水の小滴中に封入された油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことによって特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中によく分散されており、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態に維持される。エマルション様式の軟膏基剤およびクリーム剤の場合と同様に、エマルションの相のいずれかは、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化するその他の手段は、乳化剤の使用を伴い、それらは、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る。乳化剤は、以下の４つのカテゴリ：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体に大きく分類し得る［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの製剤化において広い適用可能性を見出しており、文献において概説されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照されたい］。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性性質に対する親水性性質の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類し得る［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照されたい］。
エマルション製剤において使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。脱水ラノリンおよび親水性ワセリンなどの吸収基剤は、親水特性を有し、そのため、それらは、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し、それでもなお、それらの半固体の稠度を維持することができる。微粒子固体も、とりわけ界面活性剤との組合せにおいて、および粘性調製物において、良好な乳化剤として使用されている。これらは、極性無機固体、例えば、重金属水酸化物など、膨潤クレー、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど、顔料、および非極性固体、例えば、炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどを含む。
非常に多様な非乳化材料も、エマルション製剤に含まれ、エマルションの特性に貢献する。そのようなものとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる［Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199］。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムおよび合成ポリマー、例えば、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などが挙げられる。これらは、水に分散または膨潤して、コロイド状溶液を形成し、それは、分散相液滴の周囲に強力な界面フィルムを形成すること、および外部相の粘度を増加することによって、エマルションを安定化する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支援し得る多くの成分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどを含有するため、これらの製剤は、多くの場合、保存料が組み込まれている。エマルション製剤に含まれる一般的に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防ぐために、抗酸化剤も、一般的に、エマルション製剤に加えられる。使用される抗酸化剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなど、ならびに酸化防止相乗剤、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンなどであり得る。
皮膚、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において概説されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。経口デリバリー用のエマルション製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性により、非常に広く使用されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。鉱油系緩下剤、脂溶性ビタミン、および高脂肪栄養製剤は、ｏ／ｗエマルションとして一般的に経口投与されている材料の１つである。
本開示の一部の実施形態では、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として定義し得る［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照されたい］。典型的には、マイクロエマルションは、油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで、十分な量の第４の成分、概して中鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される、２つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に澄明な分散液として説明されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエマルションは、一般的に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質を含む３つから５つの成分を組み合わせることによって調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプまたは水中油（ｏ／ｗ）タイプのどちらであるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何学的パッキングに依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271）。
状態図を利用する現象論的アプローチが、広く研究されており、それは、マイクロエマルションをどのようにして製剤化するかの包括的な知識を当業者にもたらした［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335を参照されたい］。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を、自然発生的に形成された熱力学的に安定な液滴の製剤に可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤としては、これらに限定されるわけではないが、単独での、または補助界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプロエート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。補助界面活性剤は、通常はエタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールであり、界面活性剤フィルムに浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生じるボイドスペースにより、乱れたフィルムを作り出すことによって、界面の流動性を増加させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を用いずに調製し得、アルコール不含自己乳化性マイクロエマルション系は、当技術分野で公知である。水相は、典型的には、これらに限定されるわけではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相は、これらに限定されるわけではないが、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料を含み得る。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物の吸収増強の見地から、特に興味深い。脂質系マイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドなどの薬物の経口バイオアベイラビリティを増強すると提唱されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物の可溶化の向上、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤によって誘導される膜流動性および浸透性の変化に起因する、薬物吸収における可能な増強、調製の容易さ、固体剤形よりも経口投与の容易さ、臨床効力の向上、および毒性の減少の利点を提供する（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度において一緒にされたとき、自然発生的に形成され得る。これは、昜熱分解性の薬物であるペプチドまたはｉＲＮＡを製剤化する場合に、特に有利であり得る。さらに、マイクロエマルションは、美容および医薬的適用の両方における、活性成分の経皮デリバリーにとっても効果的であった。本開示のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのｉＲＮＡおよび核酸の全身吸収の増加、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所細胞取り込みの向上を促進するであろうことが予想される。
本開示のマイクロエマルションは、製剤の性質を向上させるため、および本開示のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高めるために、追加の成分および添加剤、例えば、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透促進剤など、も含有し得る。本開示のマイクロエマルションにおいて使用される浸透促進剤は、５つのカテゴリ：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するとして分類し得る（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらのクラスのそれぞれは、上記において説明されている。
浸透促進剤
一部の実施形態では、本開示は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的なデリバリーを実施するために、様々な浸透促進剤を採用する。ほとんどの薬物は、イオン化状態および非イオン化状態の両方において存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が、浸透促進剤で処置されている場合、非親油性薬物も、細胞膜を横断し得るができることが分かっている。非親油性薬物が細胞膜を横断して拡散するのを支援することに加えて、浸透促進剤も、親油性薬物の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広いカテゴリ、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するとして分類し得る（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照されたい）。浸透促進剤の上記において言及されたクラスのそれぞれについては、以下においてより詳細に説明される。
界面活性剤：本開示と関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解された場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の液体の間の界面張力を低減し、結果として、粘膜によるｉＲＮＡの吸収が増強される化学的実体である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); and perfluorochemical emulsions, such as FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252を参照されたい）。
脂肪酸：浸透促進剤としての役割を果たす様々な脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプロエート、１－ドデシルアザシクロヘプタナ－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、ならびにそれらのモノ－およびジ－グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプロエート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照されたい）。
胆汁酸塩：胆汁の生理的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照されたい）。様々な天然の胆汁塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤としての役割を果たす。したがって、用語「胆汁塩」は、胆汁の天然に存在する成分の全て、ならびにそれらの合成誘導体の全てを包含する。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照されたい）。
キレート化剤：キレート化剤は、本開示に関連して使用される場合、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を高める化合物として定義することができる。本開示における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴的なＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、結果として、キレート化剤によって阻害されるため、キレート化剤は、ＤＮａｓｅ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。好適なキレート化剤としては、これらに限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチレート、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトンのＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照されたい）。
非キレート化比界面活性剤：本明細書において使用される場合、非キレート化非界面活性剤である浸透促進化合物は、キレート化剤または界面活性剤としてはわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通してのｉＲＮＡの吸収を高める化合物として定義することができる（例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；ならびに非ステロイド性抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなどが挙げられる（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）。
細胞レベルでのｉＲＮＡの取り込みを増強する薬剤も、本開示の医薬組成物および他の組成物に加え得る。例えば、カチオン性脂質、例えば、リポフェクチンなど（Junichi et al, U.S. Pat. No. 5,705,188）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えば、ポリリジンなど（Lollo et al.、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを増強することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例として、例えば、中でも、リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、リポフェクタミン２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、リポフェクタミン（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州、カールスバッド）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ；スイス、グレンツァッハ通り）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（スイス、グレンツァッハ通り）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（スイス、グレンツァッハ通り）またはＦｕｇｅｎｅ（スイス、グレンツァッハ通り）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州、マディソン）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州、マディソン）、Ｔｆｘ（商標）－２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州、マディソン）、Ｔｆｘ（商標）－５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州、マディソン）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；フランス、マルセイユ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；フランス、マルセイユ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；米国、マサチューセッツ州、イプスウィッチ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；米国、マサチューセッツ州、トーントン）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；米国、マサチューセッツ州、トーントン）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）が挙げられる。
投与された核酸の浸透を高めるために、他の薬剤、例えば、グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなど、ピロール、例えば、２－ピロールなど、アゾン、ならびにテルペン、例えば、リモネンおよびメントンなどを用い得る。
担体
本開示のある特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物を組み込む。本明細書において使用される場合、「担体化合物」とは、例えば、生物学的に活性の核酸を分解することまたは循環からのその除去を促進することによって生物活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低減するインビボプロセスによって、不活性である（すなわち、それ自体生物活性を有さない）が、核酸として認識される核酸またはその類似体を指す場合がある。核酸および担体化合物の同時投与は、通常、過剰の後者の物質を有し、おそらくは共通の受容体についての担体化合物と核酸の間の競合のために、肝臓、腎臓または他の循環外リザーバーにおいて回収される核酸の量の実質的な低減をもたらす場合がある。例えば、肝臓組織における部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）または４－アセトアミド－４’イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与される場合に低減する場合がある（Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、医薬品担体または賦形剤は、例えば、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性の媒体を含み得る。賦形剤は、液体または固体であり得、ならびに、核酸および所定の医薬組成物お他の成分を組み合わせたときに、所望の体積、稠度などを提供するように計画された投与の様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体としては、これらに限定されるわけではないが、結着剤（例えば、予めゼラチン化されたウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非経静脈投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤も、本開示の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒における非水溶液、または液体もしくは固体油基剤における核酸の溶液を含み得る。溶液はまた、バッファー、希釈剤および他の適した添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非経静脈投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を、使用することができる。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
他の成分
本開示の組成物は、さらに、医薬組成物中に従来的に見出される他の補助成分を、例えば、確立されたそれらの使用レベルにおいて含有し得る。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の、薬学的に活性な材料、例えば、止痒剤、収斂剤、局部麻酔薬、もしくは抗炎症剤などを含有し得、または、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料、例えば、染料、矯臭剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤などを含有し得る。ただし、そのような材料は、添加したときに、本開示の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌することができ、所望の場合は、製剤の核酸と有害に相互作用しない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味剤、および／または芳香族物質などと混合することができる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液はまた、安定化剤も含み得る。
一部の実施形態では、本開示において特徴とされる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉメカニズムによって機能する１つまたは複数の生物剤を含む。このような生物剤の例として、ＶＥＧＦ－Ａと、少なくとも１つのＶＥＧＦ－Ａ結合パートナーの相互作用を干渉する薬剤が挙げられる。
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、５０％致死量（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的有効な用量）を判定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって判定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療係数を示す化合物が通常である。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトにおける使用のために様々な投薬量を製剤化する際に使用することができる。本開示における特徴とされる組成物の投薬量は、概して、わずかな毒性かまたは毒性が全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更し得る。本開示において特徴とされる方法で使用される任意の化合物に対して、最初に、細胞培養アッセイから治療有効用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の１／２最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または、適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）ように、用量を動物モデルにおいて製剤化し得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定し得る。
上記で論じられるようなその投与に加えて、本開示において特徴とされるｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する疾患または障害（例えば、血管新生性眼疾患）の処置において有効な他の既知薬剤と組み合わせて投与できる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書において説明された、有効性の標準的尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＶＥＧＦ－Ａの発現と関連する障害を処置する方法
本開示は、ＶＥＧＦ－Ａ発現を阻害する、および／またはＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する疾患、障害もしくは病的プロセス（例えば、血管新生性眼疾患）を処置するための、ＶＥＧＦ－Ａを標的化するｉＲＮＡの使用に関する。
一部の態様では、ＶＥＧＦ－Ａの発現と関連する障害の処置の方法が提供され、方法は、本明細書において開示されるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）をそれを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａ発現を阻害する（減少させる）。
一部の実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害、例えば、血管新生性眼疾患、例えば、ＡＭＤ、ＤＲ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、ＣＶＯ、ＲＯＰまたはｍＣＮＶのモデルとして役立つ動物である。
血管新生性眼疾患
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害は、血管新生性眼疾患である。本明細書において記載される方法を使用して処置可能である血管新生性眼疾患の限定されない例には、ＡＭＤ（湿性ＡＭＤ、滲出性ＡＭＤなどを含む）、ＲＶＯ（例えば、ＣＲＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または分岐網膜静脈閉塞（ＢＲＶＯ）、ＤＭＥ、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、虹彩新血管新生、新血管の緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、視神経乳頭新血管新生、角膜新血管新生、網膜新血管新生、硝子体新血管新生、パンヌス、翼状片、血管の網膜症、フォンヒッペル・リンダウ病、ヒストプラスマ症および糖尿病性網膜症が含まれる。
血管新生性眼疾患の臨床的および病的特徴として、それだけには限らないが、視力の低下（例えば、浮遊斑点、視野の縁周辺または中心のぼやけ（例えば、暗点）、変形視症および色覚の障害を特徴とする）、ＣＮＶからの漏出の増大、眼の血管透過性の増大、黄斑の下の体液または血液の集まり、異常な眼血管新生および網膜内出血が挙げられる。
一部の実施形態では、血管新生性眼疾患の対象は、１８歳未満である。一部の実施形態では、血管新生性眼疾患の対象は、成人である。一部の実施形態では、対象は、参照レベルに対してＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの上昇（例えば、参照レベルよりも高いＶＥＧＦ－Ａのレベル）を有するか、または有すると同定される。
一部の実施形態では、血管新生性眼疾患は、対象から得た試料（例えば、水性眼液試料）の分析を使用して診断される。一部の実施形態では、試料は、以下：蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学、ＶＥＧＦ－Ａイムノアッセイ、免疫測定法、電子顕微鏡、マイクロダイセクションおよび質量分析のうち１つまたは複数から選択される方法を使用して分析される。一部の実施形態では、血管新生性眼疾患は、任意の適した診断検査または技術、例えば、血管造影（例えば、フルオレセイン血管造影またはヨードシアニングリーン 血管造影）、網膜電図検査、超音波検査、角膜厚測定、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、眼圧測定、色覚検査、視野検査、細隙灯検査、検眼鏡検査および理学的検査（例えば、視力を評価するための（例えば、眼底検査または光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による）を使用して診断される。
併用療法
一部の実施形態では、本明細書において開示されるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ＶＥＧＦ－Ａ発現と関連する障害（例えば、血管新生性眼疾患）またはこのような障害の症状の処置において有効であると知られている第２の療法（例えば、１つまたは複数の追加の療法）と組み合わせて投与される。ｉＲＮＡは、第２の療法の前、後または同時に投与できる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、第２の療法の前に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、第２の療法の後に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、第２の療法と同時に投与される。
第２の療法は、追加の治療薬であり得る。ｉＲＮＡおよび追加の治療薬は、同一組成物中で組み合わせて投与できる、または追加の治療薬は、別個の組成物の一部として投与できる。
一部の実施形態では、第２の療法は、障害または障害の症状を処置するのに有効である非ｉＲＮＡ治療薬である。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、療法とともに投与される。
例示的併用療法として、それだけには限らないが、光線力学的療法、光血液凝固療法、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬、抗ＶＥＧＦ剤および硝子体切除術が挙げられる。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ剤は、融合タンパク質を含む。例示的抗ＶＥＧＦ融合タンパク質として、それだけには限らないが、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ融合タンパク質は、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１９０５）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するその変異体を有する。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ剤は、抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子）である。例示的抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子として、それだけには限らないが、ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））およびブロルシズマブ（ＢＥＯＶＵ（登録商標））が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、ＶＥＧＦ－Ａへの結合について、ラニビズマブまたはブロルシズマブと競合する。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のうち１つまたは複数の（例えば、３つ全て）を含む。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）のうち１つまたは複数の（例えば、３つ全て）を含む。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）（または１、２、３もしくは４つ以下の突然変異、例えば、置換、付加もしくは欠失を有する配列）、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体のＨＣＤＲ２またはその抗体断片（または１、２、３もしくは４つ以下の突然変異、例えば、置換、付加もしくは欠失を有する配列）および例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体のＨＣＤＲ３またはその抗体断片（または１、２、３もしくは４つ以下の突然変異、例えば、置換、付加もしくは欠失を有する配列）のち１つまたは複数（例えば、３つ全て）を含むＶＨを含む。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）（または１、２、３もしくは４つ以下の突然変異、例えば、置換、付加もしくは欠失を有する配列）、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のＬＣＤＲ２（または１、２、３もしくは４つ以下の突然変異、例えば、置換、付加もしくは欠失を有する配列）および例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のＬＣＤＲ３（または１、２、３もしくは４つ以下の突然変異、例えば、置換、付加もしくは欠失を有する配列）を含むＶＬを含む。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列（またはそれに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含むＶＨおよび例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列（またはそれに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含むＶＬを含む。
一実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖを含む。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの修飾（例えば、置換）であるが、３０、２０もしくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列または例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域および／あるいは例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子の重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの修飾（例えば、置換）であるが、３０、２０もしくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列または例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子はｓｃＦｖであり、例えば、表７中の本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば、本明細書において記載されるリンカーを介して本明細書において記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着される。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子は、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは、３または４である）（配列番号１９５１）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかにあり得る：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域。
［表２］
Figure 2023514190000041
投与の投与量、経路およびタイミング
対象（例えば、ヒト対象、例えば、患者）に治療量のｉＲＮＡを投与することができる。治療量は、例えば、０．０５～５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、標的臓器への、例えば、眼へのデリバリーのために製剤化される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、本明細書において記載されるような脂質製剤、例えば、ＬＮＰ製剤として製剤化される。一部のこのような実施形態では、治療量は、０．０５～５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡである。一部の実施形態では、脂質製剤、例えば、ＬＮＰ製剤は、静脈内に投与される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、本明細書において記載されるようなＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態である。一部のこのような実施形態では、治療量は、０．５～５０ｍｇのｄｓＲＮＡである。一部の実施形態では、例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、皮下に投与される。
一部の実施形態では、投与は、例えば、定期的に、例えば、毎日、隔週で（すなわち、２週間毎に）、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、６ヶ月間またはそれより長く反復される。最初の処置レジメン後、処置は、より少ない頻度で投与できる。例えば、３ヶ月間の隔週投与後、１ヶ月あたり１回、６ヶ月間またはそれより長く、投与を反復できる。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２またはそれより多い用量で投与される。一部の実施形態では、その後の用量の数または量は、例えば、（ａ）血管新生を阻害する、（ｂ）ＶＥＧＦ Ａの発現もしくは活性を阻害もしくは低減する、（ｃ）脈絡膜の新血管新生を阻害する、（ｄ）脈絡毛細管において新規血管の成長を阻害する、（ｅ）網膜の厚さを低減する、（ｆ）視力を高める、もしくは（ｇ）眼球内炎症を低減する所望の効果の達成、または治療効果若しくは予防効果、例えば、障害と関連する１つもしくは複数の症状の低減もしくは防止の達成に応じて変わる。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、スケジュールに従って投与される。例えば、ｉＲＮＡ剤は、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回または週に５回投与される場合がある。一部の実施形態では、スケジュールは、定期的な間隔の投与、例えば、１時間毎、４時間毎、６時間毎、８時間毎、１２時間毎、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、隔週または毎月を含む。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、所望の効果を達成するのに必要な頻度で投与される。
一部の実施形態では、スケジュールは、密接な間隔の投与と、それに続く、薬剤が投与されない長い期間を含む。例えば、スケジュールは、比較的短い期間（例えば、約６時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎または約７２時間毎）で投与される用量の最初のセットと、それに続く、ｉＲＮＡ剤が投与されない長期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間または約８週間）を含む場合がある。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、最初に１時間毎に投与され、後により長い間隔で（例えば、毎日、毎週、隔週または毎月）投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、最初に毎日投与され、後により長い間隔（例えば、毎週、隔週または毎月）で投与される。ある特定の実施形態では、より長い間隔は、経時的に増大するか、または所望の効果の達成に基づいて決定される。
ｉＲＮＡの完全用量の投与の前に、患者に、より少ない用量、例えば、５％注入用量を投与し、有害作用、例えば、アレルギー反応について、または脂質レベルもしくは血圧の上昇についてモニタリングできる。別の例では、不要な効果について患者をモニタリングできる。
ＶＥＧＦ－Ａの発現をモジュレートする方法
一部の態様では、本開示は、例えば、細胞において、組織において、または対象においてＶＥＧＦ－Ａの発現をモジュレートする（例えば、阻害または活性化する）方法を提供する。一部の実施形態では、細胞または組織は、エキソビボ、インビトロまたはインビボである。一部の実施形態では、細胞または組織は、眼中にある（例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管）。一部の実施形態では、細胞または組織は、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなど）中にある。一部の実施形態では、対象（例えば、ヒト）は、本明細書において記載されるようなＶＥＧＦ－Ａの発現の発現と関連する障害のリスクにある、またはそれを診断されている。
一部の実施形態では、方法は、細胞を、細胞におけるＶＥＧＦ－Ａの発現を低下させるのに有効な量の本明細書において記載されるようなｉＲＮＡと接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることは、インビトロで細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることまたはインビボで細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、方法を実施する個人によって細胞と物理的に接触される、またはＲＮＡｉ剤は、その後に細胞と接触するようになることを可能にするまたはそれを引き起こす状況に置かれる場合もある。インビトロで細胞を接触させることは、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤とともにインキュベートすることによって行うことができる。インビボで細胞を接触させることは、例えば、細胞が位置する組織中またはその付近にＲＮＡｉ剤を注射することによって、またはＲＮＡｉ剤を別の領域、例えば、眼組織中に注射することによって行うことができる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、リガンド、例えば、以下に記載され、例えば、目的の部位にＲＮＡｉ剤を向かわせるか、そうでなければ安定化する親油性部分を説明する節を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１１７０においてさらに詳述されるような親油性部分（単数または複数）を含有するか、またはそれにカップリングできる。接触させるインビトロおよびインビボ法の組合せもあり得る。例えば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡｉ剤と接触させ、その後に対象に移してもよい。
ＶＥＧＦ－Ａの発現は、ＶＥＧＦ－Ａの発現ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質のレベルまたはＶＥＧＦ－Ａの発現のレベルと機能的に関連する別のパラメータのレベルに基づいて評価できる。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの発現は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、０．００１～０．０１ｎｍ、０．００１～０．１０ｎｍ、０．００１～１．０ｎｍ、０．００１～１０ｎｍ、０．０１～０．０５ｎｍ、０．０１～０．５０ｎｍ、０．０２～０．６０ｎｍ、０．０１～１．０ｎｍ、０．０１～１．５ｎｍ、０．０１～１０ｎｍの範囲のＩＣ５０を有する。ＩＣ５０値は、適切な対照値、例えば、非標的化ｉＲＮＡの ＩＣ５０に対して正規化することができる。
一部の実施形態では、方法は、細胞または組織中に、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡを導入することおよび細胞または組織をＶＥＧＦ－ＡのｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、細胞または組織におけるＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害することを含む。
一部の実施形態では、方法は、例えば、長期間の間、例えば、少なくとも２、３、４日間もしくはそれより長く、例えば、１週間、２週間、３週間または４週間もしくはそれより長く標的ＶＥＧＦ－Ａの発現が減少するように、本明細書において記載される組成物、例えば、ＶＥＧＦ－Ａに結合するｉＲＮＡを含む組成物を哺乳動物に投与することを含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの発現の低下は、第１の投与の１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間または２４時間以内に検出可能である。
一部の実施形態では、方法は、標的ＶＥＧＦ－Ａの発現が、未処置動物と比較して例えば、少なくとも１０％増大するように本明細書において記載されるような組成物を哺乳動物に投与することを含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａの活性化は、長期間、例えば、少なくとも２、３、４日またはそれよりも長く、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間またはそれよりも長くにわたって生じる。理論によって制限されることを意図するわけではないが、ｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ転写物を安定化すること、ゲノム中のプロモーターと相互作用することまたはＶＥＧＦ－Ａ発現の阻害剤を阻害することによってＶＥＧＦ－Ａ発現を活性化できる。
本開示において開示される方法および組成物にとって有用なｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ－ＡのＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的化する。ｉＲＮＡを使用してＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための組成物および方法は、本開示において別の場所に記載されるように調製および実施できる。
一部の実施形態では、方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み、ｉＲＮＡは、処置されるべき対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトのＶＥＧＦ－Ａ のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。組成物は、それだけには限らないが、眼（例えば、眼球内）、局所および静脈内投与を含む当技術分野で公知の任意の適切な手段によって投与され得る。
ある特定の実施形態では、組成物は、眼内に（例えば、硝子体内投与、例えば、硝子体内注射、経強膜投与、例えば、経強膜注射、結膜下投与、例えば、結膜下注射、球後投与、例えば、球後注射、前房内投与、例えば、前房内注射または網膜下投与、例えば、網膜下注射によって）投与される。他の実施形態では、組成物は局所投与される。他の実施形態では、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。
ある特定の実施形態では、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。一部のこのような実施形態では、組成物は、静脈内注入のための脂質製剤化されたｓｉＲＮＡ（例えば、ＬＮＰ製剤、例えば、ＬＮＰ１１製剤）を含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を、本開示において特徴とされるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験に使用できるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。本明細書において提示される二重鎖の列挙された位置と、列挙された配列に対する二重鎖のアラインメントの間に矛盾がある事象では、列挙された配列に対する二重鎖のアラインメントが支配する。さらに、材料、方法および例は、単に例示的なものであり、制限であるように意図されない。
具体的な実施形態
１．血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、ヒトＶＥＧＦ－Ａのコーディング鎖の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、ヒトＶＥＧＦ－Ａの非コーディング鎖の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも１５の連続するヌクレオチドと相補的である、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
２．ヒトＶＥＧＦ－Ａのコーディング鎖が、配列番号１の配列を含む、実施形態１のｄｓＲＮＡ剤。
３．ヒトＶＥＧＦ－Ａの非コーディング鎖が、配列番号２の配列を含む、実施形態１または２のｄｓＲＮＡ剤。
４．ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖は、アンチセンス鎖中の少なくとも１５の連続するヌクレオチドと相補的である、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
５．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態４のｄｓＲＮＡ剤。
６．ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖が、アンチセンス鎖中の少なくとも１７の連続するヌクレオチドと相補的である、前記の実施形態のいずれかのｄｓＲＮＡ。
７．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態６のｄｓＲＮＡ。
８．ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖が、アンチセンス鎖中の少なくとも１９の連続するヌクレオチドと相補的である、前記の実施形態のいずれかのｄｓＲＮＡ。
９．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態８のｄｓＲＮＡ。
１０．ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列の一部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、その結果、センス鎖が、アンチセンス鎖中の少なくとも２１の連続するヌクレオチドと相補的である、前記の実施形態のいずれかのｄｓＲＮＡ。
１１．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むｓヌクレオチド配列を含む、実施形態１０のｄｓＲＮＡ。
１２．センス鎖の部分が、配列番号１のヌクレオチド１８５５～１８７５、１８５８～１８７８、２１７８～２１９８、２１８１～２２０１、２９４４～２９６４、２９４６～２９６６、２９５２～２９７２、３３６１～３３８１または３３６２～３３８２内の部分である、実施形態１～１１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１３．センス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（CGACAGAACAGUCCUUAAUCA（配列番号４２００））、ＡＤ－９０１０９４（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０１））、ＡＤ－１０２０５７５（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０２））、ＡＤ－９０１１００（AACAGUGCUAAUGUUAUUGGA（配列番号４２０３））、ＡＤ－９０１１０１（AGUGCUAAUGUUAUUGGUGUA（配列番号４２０４））、ＡＤ－９０１１１３（GAGAAAGUGUUUUAUAUACGA（配列番号４２０５））、ＡＤ－９０１１２３（AAAAUAGACAUUGCUAUUCUA（配列番号４２０６））、ＡＤ－９０１１２４（AAAUAGACAUUGCUAUUCUGA（配列番号４２０７））、ＡＤ－９０１１５８（GAAAGUGUUUUAUAUACGGUA（配列番号４２０８））、ＡＤ－９０１１５９（GUUUUAUAUACGGUACUUAUA（配列番号４２０９））、ＡＤ－１０２０５７３（AGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（配列番号４２１０））、またはＡＤ－１０２３１４３（AAAAUAGACATUGCUAUUCUA（配列番号４２１１））から選択される二重鎖に由来するセンス鎖内の部分である、実施形態１～１２のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１４．センス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（CGACAGAACAGUCCUUAAUCA（配列番号４２００））、ＡＤ－９０１０９４（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０１））、ＡＤ－１０２０５７５（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０２））、ＡＤ－９０１１００（AACAGUGCUAAUGUUAUUGGA（配列番号４２０３））、ＡＤ－９０１１０１（AGUGCUAAUGUUAUUGGUGUA（配列番号４２０４））、ＡＤ－９０１１１３（GAGAAAGUGUUUUAUAUACGA（配列番号４２０５））、ＡＤ－９０１１２３（AAAAUAGACAUUGCUAUUCUA（配列番号４２０６））、ＡＤ－９０１１２４（AAAUAGACAUUGCUAUUCUGA（配列番号４２０７））、ＡＤ－９０１１５８（GAAAGUGUUUUAUAUACGGUA（配列番号４２０８））、ＡＤ－９０１１５９（GUUUUAUAUACGGUACUUAUA（配列番号４２０９））、ＡＤ－１０２０５７３（AGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（配列番号４２１０））、またはＡＤ－１０２３１４３（AAAAUAGACATUGCUAUUCUA（配列番号４２１１））のセンス鎖から選択されるセンス鎖である、実施形態１～１３のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１５．アンチセンス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（UGAUUAAGGACUGUUCUGUCGAU（配列番号４２１２））、ＡＤ－９０１０９４（UCUGGAUUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１３））、ＡＤ－１０２０５７５（UCUGGATUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１４））、ＡＤ－９０１１００（UCCAAUAACAUUAGCACUGUUAA（配列番号４２１５））、ＡＤ－９０１１０１（UACACCAAUAACAUUAGCACUGU（配列番号４２１６））、ＡＤ－９０１１１３（UCGUAUAUAAAACACUUUCUCUU（配列番号４２１７））、ＡＤ－９０１１２３（UAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUAU（配列番号４２１８））、ＡＤ－９０１１２４（UCAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUA（配列番号４２１９））、ＡＤ－９０１１５８（UACCGUAUAUAAAACACUUUCUC（配列番号４２２０））、ＡＤ－９０１１５９（UAUAAGUACCGUAUAUAAAACAC（配列番号４２２１））、ＡＤ－１０２０５７３（UACACCAAUAACATUAGCACUGU（配列番号４２２２））、またはＡＤ－１０２３１４３（UAGAAUAGCAATGTCTAUUUUAU（配列番号４２２３））から選択される二重鎖に由来するアンチセンス鎖内の部分である、実施形態１～１４のいずれか１つのｄｓＲＮＡ。
１６．アンチセンス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（UGAUUAAGGACUGUUCUGUCGAU（配列番号４２１２））、ＡＤ－９０１０９４（UCUGGAUUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１３））、ＡＤ－１０２０５７５（UCUGGATUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１４））、ＡＤ－９０１１００（UCCAAUAACAUUAGCACUGUUAA（配列番号４２１５））、ＡＤ－９０１１０１（UACACCAAUAACAUUAGCACUGU（配列番号４２１６））、ＡＤ－９０１１１３（UCGUAUAUAAAACACUUUCUCUU（配列番号４２１７））、ＡＤ－９０１１２３（UAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUAU（配列番号４２１８））、ＡＤ－９０１１２４（UCAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUA（配列番号４２１９））、ＡＤ－９０１１５８（UACCGUAUAUAAAACACUUUCUC（配列番号４２２０））、ＡＤ－９０１１５９（UAUAAGUACCGUAUAUAAAACAC（配列番号４２２１））、ＡＤ－１０２０５７３（UACACCAAUAACATUAGCACUGU（配列番号４２２２））、またはＡＤ－１０２３１４３（UAGAAUAGCAATGTCTAUUUUAU（配列番号４２２３））のアンチセンス鎖から選択されるアンチセンス鎖である、実施形態１～１５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ。
１７．センス鎖およびアンチセンス鎖が、ＡＤ－１０２０５７４（配列番号４２００および４２１２）、ＡＤ－９０１０９４（配列番号４２０１および４２１３）、ＡＤ－１０２０５７５（配列番号４２０２および４２１４）、ＡＤ－９０１１００（配列番号４２０３および４２１５）、ＡＤ－９０１１０１（配列番号４２０４および４２１６）、ＡＤ－９０１１１３（配列番号４２０５および４２１７）、ＡＤ－９０１１２３（配列番号４２０６および４２１８）、ＡＤ－９０１１２４（配列番号４２０７および４２１９）、ＡＤ－９０１１５８（配列番号４２０８および４２２０）、ＡＤ－９０１１５９（配列番号４２０９および４２２１）、ＡＤ－１０２０５７３（配列番号４２１０および４２２２）、またはＡＤ－１０２３１４３（配列番号４２１１および４２２３）から選択される二重鎖の対形成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つのｄｓＲＮＡ。
１８．センス鎖の部分が、ＡＤ－９５３３７４（配列番号８１３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１２９７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１２９８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号８００）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号２６１）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号７８７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号２６２）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号８４５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号７７９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号８４４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号７８４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号７９０）から選択される二重鎖に由来するセンス鎖内の部分である、実施形態１～１１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１９．センス鎖の部分が、ＡＤ－９５３３７４（配列番号８１３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１２９７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１２９８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号８００）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号２６１）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号７８７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号２６２）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号８４５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号７７９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号８４４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号７８４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号７９０）のセンス鎖から選択されるセンス鎖である、実施形態１～１１または１８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２０．アンチセンス鎖の部分が、ＡＤ－９５３３７４（配列番号９４３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１４２７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１４２８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号９３０）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号３９０）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号９１７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号３９１）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号９７５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号９０９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号９７４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号９１４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号９２０）から選択される二重鎖に由来するアンチセンス鎖内の部分である、実施形態１～１１または１８～１９のいずれか１つのｄｓＲＮＡ。
２１．アンチセンス鎖の部分が、ＡＤ－９５３３７４（配列番号９４３），ＡＤ－９５３５０４（配列番号１４２７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１４２８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号９３０）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号３９０）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号９１７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号３９１）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号９７５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号９０９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号９７４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号９１４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号９２０）から選択されるアンチセンス鎖である、実施形態１～１１または１８～２０のいずれか１つのｄｓＲＮＡ。
２２． のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ＡＤ－９５３３７４（配列番号８１３および９４３）、ＡＤ－９５３５０４（配列番号１２９７および１４２７）、ＡＤ－９５３４８１（配列番号１２９８および１４２８）、ＡＤ－９５３３５１（配列番号８００および９３０）、ＡＤ－９０１３５６（配列番号２６１および３９０）、ＡＤ－９５３３４４（配列番号７８７および９１７）、ＡＤ－９０１３５５（配列番号２６２および３９１）、ＡＤ－９５３４１０（配列番号８４５および９７５）、ＡＤ－９５３３６３（配列番号７７９および９０９）、ＡＤ－９５３４１１（配列番号８４４および９７４）、ＡＤ－９５３３５０（配列番号７８４および９１４）、またはＡＤ－９５３３７５（配列番号７９０および９２０）から選択される二重鎖の対形成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１１または１８～２１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ。
２３．センス鎖の部分が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおけるセンス鎖内の部分である、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２４．アンチセンス鎖の部分が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおけるアンチセンス鎖内の部分である、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２５．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列の１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２６．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２７．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列の１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチドを含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２８．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１７の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
２９．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列の１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
３０．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
３１．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列の１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
３２．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列に由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも２１の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
３３．ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つにおいて列挙されるセンス配列のヌクレオチド配列を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
３４．アンチセンス鎖が、表２Ａに列挙されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表２Ａに列挙されるセンス配列のヌクレオチド配列を含む、実施形態３３のｄｓＲＮＡ剤。
３５．アンチセンス鎖が、表３Ａに列挙されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表３Ａに列挙されるセンス配列のヌクレオチド配列を含む、実施形態３３のｄｓＲＮＡ剤。
３６．アンチセンス鎖が、表４Ａに列挙されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表４Ａに列挙されるセンス配列のヌクレオチド配列を含む、実施形態３３のｄｓＲＮＡ剤。
３７．アンチセンス鎖が、表１８Ａに列挙されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表１８Ａに列挙されるセンス配列のヌクレオチド配列を含む、実施形態３３のｄｓＲＮＡ剤。
３８．ｄｓＲＮＡ剤が、ＡＤ－１０２０５７４、ＡＤ－９０１０９４、ＡＤ－１０２０５７５、ＡＤ－９０１１００、ＡＤ－９０１１０１、ＡＤ－９０１１１３、ＡＤ－９０１１２３、ＡＤ－９０１１２４、ＡＤ－９０１１５８、ＡＤ－９０１１５９、ＡＤ－１０２０５７３またはＡＤ－１０２３１４３である、実施形態３３または３７のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
３９．（ｉ）センス鎖が、配列番号４１６４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７６の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｉ）センス鎖が、配列番号１４６５の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７７の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｉｉ）センス鎖が、配列番号１４６６の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７８の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｖ）センス鎖が、配列番号１４６７の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７９の配列および全ての修飾を含む、
（ｖ）センス鎖が、配列番号１４６８の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８０の配列および全ての修飾を含む、
（ｖｉ）センス鎖が、配列番号１４６９の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８１の配列および全ての修飾を含む、
（ｖｉｉ）センス鎖が、配列番号１４７０の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８２の配列および全ての修飾を含む、
（ｖｉｉｉ）センス鎖が、配列番号１４７１の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８３の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｘ）センス鎖が、配列番号１４７２の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８４の配列および全ての修飾を含む、
（ｘ）センス鎖が、配列番号１４７３の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８５の配列および全ての修飾を含む、
（ｘｉ）センス鎖が、配列番号１４７４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８６の配列および全ての修飾を含む、または
（ｘｉｉ）センス鎖が、配列番号１４７５の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８７の配列および全ての修飾を含む、
実施形態３３または３７～３８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４０．ｄｓＲＮＡ剤が、ＡＤ－９５３３７４、ＡＤ－９５３５０４、ＡＤ－９５３４８１、ＡＤ－９５３３５１、ＡＤ－９０１３５６、ＡＤ－９５３３４４、ＡＤ－９０１３５５、ＡＤ－９５３４１０、ＡＤ－９５３３６３、ＡＤ－９５３４１１、ＡＤ－９５３３５０またはＡＤ－９５３３７５である、実施形態３３～３６のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４１．（ｉ）センス鎖が、配列番号５５３の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号６８３の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｉ）センス鎖が、配列番号１０３７の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１１６７の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｉｉ）センス鎖が、配列番号１０３８の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１１６８の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｖ）センス鎖が、配列番号５４０の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号６７０の配列および全ての修飾を含む、
（ｖ）センス鎖が、配列番号３の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１３２の配列および全ての修飾を含む、
（ｖｉ）センス鎖が、配列番号５２７の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号６５７の配列および全ての修飾を含む、
（ｖｉｉ）センス鎖が、配列番号４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１３３の配列および全ての修飾を含む、
（ｖｉｉｉ）センス鎖が、配列番号５８５の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号７１５の配列および全ての修飾を含む、
（ｉｘ）センス鎖が、配列番号５１９の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号６４９の配列および全ての修飾を含む、
（ｘ）センス鎖が、配列番号５８４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号７１４の配列および全ての修飾を含む、
（ｘｉ）センス鎖が、配列番号５２４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号６５４の配列および全ての修飾を含む、または
（ｘｉｉ）センス鎖が、配列番号５３０の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号６６０の配列および全ての修飾を含む、
実施形態３３～３６または４０のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４２．センス鎖が、少なくとも２３ヌクレオチド長、例えば、２３～３０ヌクレオチド長である、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４３．センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、１つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされている、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４４．親油性部分が、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域において１つまたは複数の位置にコンジュゲートされている、実施形態４３のｄｓＲＮＡ剤。
４５．親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされている、実施形態４３または４４のｄｓＲＮＡ剤。
４６．ｌｏｇＫｏｗによって測定された親油性部分の親油性が、０を超える、実施形態４３～４５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４７．二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける未結合フラクションによって測定された二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性が、０．２を超える、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
４８．血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである、実施形態４７のｄｓＲＮＡ剤。
４９．ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５０．センス鎖ヌクレオチドの５つ以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの５つ以下が、未修飾ヌクレオチドである、実施形態４９のｄｓＲＮＡ剤。
５１．センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む、実施形態５０のｄｓＲＮＡ剤。
５２．修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチドおよび２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４９～５１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５３．センス鎖ヌクレオチドの５つ以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの５つ以下は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、アンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）以外の修飾を含む、実施形態４９～５１のいずれかのｄｓＲＮＡ剤。
５４．センス鎖の連続するヌクレオチドのうち２つの間またはアンチセンス鎖の連続するヌクレオチドのうち２つの間に非ヌクレオチドスペーサーを含む（非ヌクレオチドスペーサーは、Ｃ３－Ｃ６アルキルを含んでもよい）、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５５．各鎖が、３０以下のヌクレオチド長である、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５６．少なくとも１つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５７．少なくとも１つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５８．二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
５９．二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、実施形態５８のｄｓＲＮＡ剤。
６０．二本鎖領域が、１７～２５ヌクレオチド対の長さである、実施形態５８のｄｓＲＮＡ剤。
６１．二本鎖領域が、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、実施形態５８のｄｓＲＮＡ剤。
６２．二本鎖領域が、１９～２１ヌクレオチド対の長さである、実施形態５８のｄｓＲＮＡ剤。
６３．二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、実施形態５８のｄｓＲＮＡ剤。
６４．各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
６５．各鎖が、１９～２３ヌクレオチドを有する、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
６６．各鎖が、２１～２３ヌクレオチドを有する、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
６７．少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
６８．ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の３’末端においてである、実施形態６７のｄｓＲＮＡ剤。
６９．鎖が、アンチセンス鎖である、実施形態６８のｄｓＲＮＡ剤。
７０．鎖が、センス鎖である、実施形態６８のｄｓＲＮＡ剤。
７１．ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端においてである、実施形態６７のｄｓＲＮＡ剤。
７２．鎖が、アンチセンス鎖である、実施形態７１のｄｓＲＮＡ剤。
７３．鎖が、センス鎖である、実施形態７１のｄｓＲＮＡ剤。
７４．１つの鎖の５’および３’末端の各々が、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む、実施形態６７のｄｓＲＮＡ剤。
７５．鎖が、アンチセンス鎖である、実施形態７４のｄｓＲＮＡ剤。
７６．二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の位置１の塩基対が、ＡＵ塩基対である、前記の実施形態のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
７７．センス鎖が、合計２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計２３ヌクレオチドを有する、実施形態７４のｄｓＲＮＡ剤。
７８．１つまたは複数の親油性部分が、少なくとも１つの鎖上の１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされている、実施形態４３～７７のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
７９．１つまたは複数の親油性部分が、リンカーまたは担体を介して少なくとも１つの鎖上の１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされている、実施形態７８のｄｓＲＮＡ剤。
８０．内部位置が、少なくとも１つの鎖の各末端のから末端の２つの位置を除くすべての位置を含む、実施形態７９のｄｓＲＮＡ剤。
８１．内部位置が、少なくとも１つの鎖の各末端のから末端の３つの位置を除くすべての位置を含む、実施形態７９のｄｓＲＮＡ剤。
８２．内部位置が、センス鎖の切断部位領域を除外する、実施形態７９～６１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
８３．内部位置が、センス鎖の５’端から数えて位置９～１２を除くすべての位置を含む、実施形態８２のｄｓＲＮＡ剤。
８４．内部位置が、センス鎖の３’末端から数えて位置１１～１３を除くすべての位置を含む、実施形態８２のｄｓＲＮＡ剤。
８５．内部位置が、アンチセンス鎖の切断部位領域を除外する、実施形態７９～８１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
８６．内部位置が、アンチセンス鎖の５’末端から数えて位置１２～１４を除くすべての位置を含む、実施形態８５のｄｓＲＮＡ剤。
８７．内部位置が、３’末端から数えてセンス鎖上の位置１１～１３および５’末端から数えてアンチセンス鎖上の位置１２～１４を除くすべての位置を含む、実施形態７９～８１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
８８．１つまたは複数の親油性部分が、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の位置４～８および１３～１８ならびにアンチセンス鎖上の位置６～１０および１５～１８からなる群から選択される内部位置のうち１つまたは複数にコンジュゲートされている、実施形態４３～８７のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
８９．各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の位置５、６、７、１５および１７ならびにアンチセンス鎖上の位置１５および１７からなる群から選択される内部位置のうち１つまたは複数にコンジュゲートされている、実施形態８８のｄｓＲＮＡ剤。
９０．二本鎖領域中の位置は、センス鎖の切断部位領域を除外する、実施形態４４のｄｓＲＮＡ剤。
９１．センス鎖が、２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチド長であり、親油性部分が、センス鎖の位置２１、位置２０、位置１５、位置１、位置７、位置６または位置２およびアンチセンス鎖の位置１６にコンジュゲートされている、実施形態４３～９０のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
９２．親油性部分が、センス鎖の位置２１、位置２０、位置１５、位置１または位置７にコンジュゲートされている、実施形態９１のｄｓＲＮＡ剤。
９３．親油性部分が、センス鎖の位置２１、位置２０または位置１５にコンジュゲートされている、実施形態９１のｄｓＲＮＡ剤。
９４．親油性部分が、センス鎖の位置２０または位置１５にコンジュゲートされている、実施形態９１のｄｓＲＮＡ剤。
９５．親油性部分が、アンチセンス鎖の位置１６にコンジュゲートされている、実施形態９１のｄｓＲＮＡ剤。
９６．親油性部分が、センス鎖の５’端から数えて位置６にコンジュゲートされている、実施形態９１のｄｓＲＮＡ剤。
９７．親油性部分が、脂肪族、脂環式または多脂環式化合物である、実施形態４３～９６のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
９８．親油性部分が、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンからなる群から選択される、実施形態９８のｄｓＲＮＡ剤。
９９．親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖ならびにヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジドおよびアルキンからなる群から選択される任意選択の官能基を含有する、実施形態９８のｄｓＲＮＡ剤。
１００．親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する、実施形態９９のｄｓＲＮＡ剤。
１０１．親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、実施形態９９のｄｓＲＮＡ剤。
１０２．親油性部分が、内部位置または二本鎖領域における１つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされている、実施形態４３～１０１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１０３．担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環状基であるか、あるいはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である、実施形態１０２のｄｓＲＮＡ剤。
１０４．親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされている、実施形態４３～１０１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１０５．親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされている、実施形態４３～１０４のいずれか１つの二本鎖ｉＲＮＡ剤。
１０６．親油性部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、およびそれらの組合せからなる群から選択される生物切断性リンカーを介してコンジュゲートされている、実施形態４３～１０５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１０７．センス鎖の３’末端が、アミンを有する環状基である末端キャップを介して保護され、前記環状基が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される、実施形態４３～１０６のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１０８．標的化リガンド、例えば、眼組織または肝組織を標的化するリガンドをさらに含む、実施形態４３～１０７のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１０９．リガンドが、センス鎖にコンジュゲートされている、実施形態１０８のｄｓＲＮＡ剤。
１１０．リガンドが、センス鎖の３’末端または５’末端にコンジュゲートされている、実施形態１０８または１０９のｄｓＲＮＡ剤。
１１１．リガンドが、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、実施形態１０８または１０９のｄｓＲＮＡ剤。
１１２．眼組織が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である、実施形態１０８～１１１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１１３．標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、実施形態１０８～１１１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１１４．標的化リガンドが、１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、実施形態１０８～１１１のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１１５．１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体が、一価リンカーまたは二価、三価または四価分岐リンカーによって付着されている、実施形態１１４のｄｓＲＮＡ剤。
１１６．リガンドが、
Figure 2023514190000042
 である、実施形態１１４のｄｓＲＮＡ剤。
１１７．ｄｓＲＮＡ剤が、以下の模式図で示されるようにリガンドにコンジュゲートされている
Figure 2023514190000043
 ［式中、Ｘは、ＯまたはＳである］、実施形態１１６のｄｓＲＮＡ剤。
１１８．ＸがＯである、実施形態１１７のｄｓＲＮＡ剤。
１１９．Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、
Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、実施形態１～１１８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１２０．Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、
Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、実施形態１～１１８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１２１．Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１、第２および第３のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、
Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、実施形態１～１１８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１２２．Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、
Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第３のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、
Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、実施形態１～１１８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１２３．Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、
Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における、第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における、第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、実施形態１～１１８のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１２４．アンチセンス鎖の５’末端にホスフェートまたはホスフェートミミックをさらに含む、実施形態１～１２３のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤。
１２５．ホスフェートミミックが、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、実施形態１０４のｄｓＲＮＡ剤。
１２６．実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞。
１２７．そうでなければ同様の未処置細胞と比較して低減されたレベルのＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはあるレベルのＶＥＧＦ－Ａタンパク質を含むヒト眼細胞、例えば（ＲＰＥ細胞、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞または光受容体細胞）であって、レベルが、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減されてもよい、ヒト眼細胞。
１２８．ヒト細胞を、実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤と接触させることを含むプロセスによって生成される、実施形態１２７のヒト細胞。
１２９．実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤を含む、ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための医薬組成物。
１３０．実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤とを含む医薬組成物。
１３１．細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法であって、
（ａ）細胞を、実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤または実施形態１２９もしくは１３０の医薬組成物と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）において生成された細胞を、ＶＥＧＦ－ＡのｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
を含む方法。
１３２．細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法であって、
（ａ）細胞を、実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤または実施形態１２９もしくは１３０の医薬組成物と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）において生成された細胞を、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
を含む方法。
１３３．細胞が対象内にある、実施形態１３１または１３２の方法。
１３４．対象がヒトである、実施形態１３３の方法。
１３５．ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのレベルが、少なくとも５０％阻害される、実施形態１３１～１３４のいずれか１つの方法。
１３６．ＶＥＧＦ－Ａタンパク質のレベルが、少なくとも５０％阻害される、実施形態１３１～１３４のいずれか１つの方法。
１３７．ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害することが、対象由来の生物学的試料（例えば、水性眼液試料）におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質レベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下させる、実施形態１３４～１３６のいずれか１つの方法。
１３８．対象が、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害、例えば、滲出性加齢性黄斑変性症（湿性ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、網膜静脈閉塞後黄斑浮腫（ＭＥｆＲＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または近視性脈絡膜血管新生（ｍＣＮＶ）と診断されている、実施形態１３４～１３７のいずれか１つの方法。
１３９．眼細胞または組織においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法であって、
（ａ）細胞または組織を、ＶＥＧＦ－Ａに結合するｄｓＲＮＡ剤と接触させること、および
（ｂ）工程（ａ）において生成された細胞または組織を、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって、細胞または組織においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
を含む方法。
１４０．眼細胞または組織が、ＲＰＥ細胞、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管を含む、実施形態１３９の方法。
１４１．ＶＥＧＦ－Ａ関連障害と診断された対象を処置する方法であって、対象に実施形態１～１２５のいずれか１つのｄｓＲＮＡ剤または実施形態１２９もしくは１３０の医薬組成物の治療上有効量を投与し、それによって、障害を処置することを含む方法。
１４２．ＶＥＧＦ－Ａ関連障害が血管新生性眼疾患である、実施形態１３８または１４１の方法。
１４３．血管新生性眼疾患が、ＡＭＤ、ＤＲ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＣＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、ＲＯＰまたはｍＣＮＶからなる群から選択される、実施形態１４２の方法。
１４４．処置が、障害の少なくとも１つの兆候または症状の改善を含む、実施形態１４１～１４３のいずれか１つの方法。
１４５．血管新生性眼疾患の少なくとも１つの兆候または症状が、血管新生、脈絡膜の新血管新生、眼の炎症、視力またはＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）の存在、レベルもしくは活性のうち１つまたは複数の尺度を含む、実施形態１４４の方法。
１４６．処置が、障害の進行の防止を含む、実施形態１４１～１４３のいずれか１つの方法。
１４７．処置が、（ａ）血管新生を阻害すること、（ｂ）ＶＥＧＦ－Ａの発現または活性を阻害または低減すること、（ｃ）脈絡膜の新血管新生を阻害すること、（ｄ）脈絡毛細管において新規血管の成長を阻害すること、（ｅ）網膜の厚さを低減すること、（ｆ）視力を高めることまたは（ｇ）眼球内炎症を低減することのうち１つまたは複数を含む、実施形態１４４～１４６のいずれか１つの方法。
１４８．処置が、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管においてＶＥＧＦ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも３０％の平均低減をもたらす、実施形態１４７の方法。
１４９．処置が、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管においてＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも６０％の平均低減をもたらす、実施形態１４８の方法。
１５０．処置が、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管においてＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも９０％の平均低減をもたらす、実施形態１４９の方法。
１５１．処置後、対象が、網膜におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回用量後、少なくとも８週間の期間のノックダウンを経験する、実施形態１４４～１４９のいずれか１つの方法。
１５２．処置が、網膜におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回用量後、少なくとも１２週間の期間のノックダウンをもたらす、実施形態１５１の方法。
１５３．処置が、網膜におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回用量後、少なくとも１６週間の期間のノックダウンをもたらす、実施形態１５２の方法。
１５４．対象がヒトである、実施形態１３３～１５３のいずれか１つの方法。
１５５．ｄｓＲＮＡ剤が約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１３４～１５４のいずれか１つの方法。
１５６．ｄｓＲＮＡ剤が、眼内に、静脈内に、または局所的に対象に投与される、実施形態１３４～１５５のいずれか１つの方法。
１５７．眼球内投与が、硝子体内投与（例えば、硝子体内注射）、経強膜投与（例えば、経強膜注射）、結膜下投与（例えば、結膜下注射）、球後投与（例えば、球後注射）、前房内投与（例えば、前房内注射）または網膜下投与（例えば、網膜下注射）を含む、実施形態１５６の方法。
１５８．対象におけるＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）のレベルを測定することをさらに含む、実施形態１３４～１５７のいずれか１つの方法。
１５９．対象におけるＶＥＧＦ－Ａのレベルを測定することが、対象から得た生物学的試料（例えば、水性眼液試料）におけるＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、実施形態１５８の方法。
１６０．血液検査、画像検査または眼房水生検を実施することをさらに含む、実施形態１３４～１５９のいずれか１つの方法。
１６１．対象におけるＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）のレベルをさらに測定することが、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物を用いる処置の前に実施される、実施形態１５８～１６８のいずれか１つの方法。
１６２．対象が参照レベルよりも高いＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）のレベルを有すると決定されると、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物が対象に投与される、実施形態１６１の方法。
１６３．対象におけるＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ－Ａタンパク質）のレベルを測定することが、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物を用いる処置後に実施される、実施形態１５９～１６２のいずれか１つの方法。
１６４．対象に、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害の処置または予防にとって好適な追加の薬剤および／または療法を投与することをさらに含む、実施形態１４１～１６３のいずれか１つの方法。
１６５．追加の薬剤および／または療法が、光線力学的療法、光血液凝固療法、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬、抗ＶＥＧＦ－Ａ剤および／または硝子体切除術のうち１つまたは複数を含む、実施形態１６４の方法。
１６６．抗ＶＥＧＦ－Ａ剤が、融合タンパク質または抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子）である、実施形態１６５の方法。
［実施例１］
ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡ
本明細書において提供される核酸配列は、標準命名法を使用して表される。表１の略語を参照されたい。
［表３］
Figure 2023514190000044
Figure 2023514190000045
 1 L96の化学構造は、以下のとおりである:
Figure 2023514190000046
実験方法
生物情報科学
転写物
ヒトＶＥＧＦ－Ａ、「血管内皮増殖因子Ａ」（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤｎｍ＿００１１７１６２３；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：７４２２）を標的化する３セットのｓｉＲＮＡを生成した。ヒトＮＭ＿００１１７１６２３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン１は、３６７７塩基の長さを有する。生命情報科学的方法を使用してオリゴの対を生成し、ランク付けし、オリゴの例示的対は、表２Ａ、表２Ｂ、表３Ａ、表３Ｂ、表４Ａ、表４Ｂ、表８Ａ、表８Ｂ、表１０Ａ、表１０Ｂ、表１８Ａおよび表１８Ｂに示されている。修飾された配列は、表２Ａ、表３Ａ、表４Ａ、表８Ａ、表１０Ａ、表１８Ａに示されている。未修飾配列は、表２Ｂ、表３Ｂ、表４Ｂ、表８Ｂ、表１０Ｂ、表１８Ｂに示されている。
同様に、ラットＶＥＧＦ－Ａ（ラット：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤｎｍ＿００１１１０３３３；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ８３７８５を標的化する１セットのｓｉＲＮＡを生成した。ラットＮＭ＿００１１１０３３３．２ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン２は、３４７４塩基対の長さを有する。オリゴの対は、生命情報科学的方法を使用して生成し、ランク付けし、オリゴの例示的対は、表５Ａおよび表５Ｂに示されている。修飾さえた配列は、表５Ａに示されている。未修飾配列は、表５Ｂに示されている。
［表４］
Figure 2023514190000047
Figure 2023514190000048
Figure 2023514190000049
Figure 2023514190000050
Figure 2023514190000051
Figure 2023514190000052
Figure 2023514190000053
Figure 2023514190000054
Figure 2023514190000055
［表５］
Figure 2023514190000056
Figure 2023514190000057
Figure 2023514190000058
Figure 2023514190000059
Figure 2023514190000060
Figure 2023514190000061
Figure 2023514190000062
Figure 2023514190000063
Figure 2023514190000064
［表６］
Figure 2023514190000065
Figure 2023514190000066
Figure 2023514190000067
Figure 2023514190000068
Figure 2023514190000069
Figure 2023514190000070
Figure 2023514190000071
Figure 2023514190000072
Figure 2023514190000073
［表７］
Figure 2023514190000074
Figure 2023514190000075
Figure 2023514190000076
Figure 2023514190000077
Figure 2023514190000078
Figure 2023514190000079
Figure 2023514190000080
［表８］
Figure 2023514190000081
Figure 2023514190000082
Figure 2023514190000083
Figure 2023514190000084
Figure 2023514190000085
Figure 2023514190000086
Figure 2023514190000087
Figure 2023514190000088
Figure 2023514190000089
［表９］
Figure 2023514190000090
Figure 2023514190000091
Figure 2023514190000092
Figure 2023514190000093
Figure 2023514190000094
Figure 2023514190000095
Figure 2023514190000096
［表１０］
Figure 2023514190000097
Figure 2023514190000098
Figure 2023514190000099
Figure 2023514190000100
Figure 2023514190000101
Figure 2023514190000102
Figure 2023514190000103
［表１１］
Figure 2023514190000104
Figure 2023514190000105
Figure 2023514190000106
Figure 2023514190000107
Figure 2023514190000108
［表１２］
Figure 2023514190000109
Figure 2023514190000110
Figure 2023514190000111
Figure 2023514190000112
Figure 2023514190000113
Figure 2023514190000114
Figure 2023514190000115
Figure 2023514190000116
Figure 2023514190000117
Figure 2023514190000118
Figure 2023514190000119
Figure 2023514190000120
Figure 2023514190000121
Figure 2023514190000122
Figure 2023514190000123
Figure 2023514190000124
Figure 2023514190000125
Figure 2023514190000126
Figure 2023514190000127
Figure 2023514190000128
Figure 2023514190000129
Figure 2023514190000130
Figure 2023514190000131
Figure 2023514190000132
Figure 2023514190000133
Figure 2023514190000134
Figure 2023514190000135
Figure 2023514190000136
Figure 2023514190000137
Figure 2023514190000138
Figure 2023514190000139
［表１３］
Figure 2023514190000140
Figure 2023514190000141
Figure 2023514190000142
Figure 2023514190000143
Figure 2023514190000144
Figure 2023514190000145
Figure 2023514190000146
Figure 2023514190000147
Figure 2023514190000148
Figure 2023514190000149
Figure 2023514190000150
Figure 2023514190000151
Figure 2023514190000152
Figure 2023514190000153
Figure 2023514190000154
Figure 2023514190000155
Figure 2023514190000156
Figure 2023514190000157
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Figure 2023514190000169
Figure 2023514190000170
［表１４］
Figure 2023514190000171
Figure 2023514190000172
Figure 2023514190000173
Figure 2023514190000174
Figure 2023514190000175
Figure 2023514190000176
Figure 2023514190000177
［表１５］
Figure 2023514190000178
Figure 2023514190000179
Figure 2023514190000180
Figure 2023514190000181
Figure 2023514190000182
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Figure 2023514190000184
［表１６］
Figure 2023514190000185
［表１７］
Figure 2023514190000186
 ［実施例２］
ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
実験方法
細胞培養およびトランスフェクション：
Ｃｏｓ ７細胞トランスフェクション
Ｃｏｓ－７（ＡＴＣＣ）を、ウェルあたり５μｌの、カニクイザル（ＸＭ＿００５５５２８８７）またはマウス（ＮＭ＿００１０２５２５０）のいずれかを含有する１ｎｇ／μｌ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、０．１μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１１６６８－０１９）および５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖を、３８４ウェルプレート中に添加することによってトランスフェクトした。室温で１５分のインキュベーション後、次いで、ｓｉＲＮＡ－トランスフェクション混合物に３５μｌの、約５×１０３個細胞を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。細胞を４８時間インキュベートし、続いて、ホタル（トランスフェクション対照）およびウミシイタケ（標的配列に融合された）ルシフェラーゼ測定を行った。実験は、１０ｎｍ、１ｎｍおよび０．１ｎｍで実施した。
ＡＰＲＥ－１９細胞、ｈＴＥＲＴ ＲＥＰ－１および一次ヒト肝細胞の細胞トランスフェクション
３８４ウェルプレート中に、各ｓｉＲＮＡ二重鎖の４つの複製を有する、ウェルあたり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に、ウェルあたり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭおよび０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることによって、ＡＲＰＥ－１９細胞、ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１または一次ヒト肝細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトした。次いで、ｓｉＲＮＡ－トランスフェクション混合物に、４０μｌの、約５×１０３個細胞を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後、ＲＮＡ精製した。実験は、５０ｎｍ、１０ｎｍ、１ｎｍおよび０．１ｎｍで実施した。
自由取り込みトランスフェクション：
低温保存された一次ヒト肝細胞を、使用の直前に水浴中３７℃で解凍し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ（プレーティング）培地（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｚ９９０２９）で０．２６×１０６個細胞／ｍＬに再懸濁した。トランスフェクションの際、細胞を、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ ９６ウェルコラーゲンプレート（ＢＤ、３５６４０７）上にウェルあたり２５，０００個細胞でプレーティングし、５％ ＣＯ２の雰囲気中、３７℃でインキュベートした。９６ウェルプレート中に、ウェルあたり１０μＬの、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡ二重鎖を添加することによって、自由取り込み実験を実施した。次いで、ｓｉＲＮＡに、９０μＬの、細胞にとって適切な細胞数を含有する完全増殖培地を添加した。細胞を２４時間インキュベートし、次いで、ＲＮＡ精製を行った。単回用量実験は５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭの最終二重鎖で実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用する全ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用するＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームで自動化プロトコールを使用してＲＮＡを単離した。手短には、細胞を有するプレートに、７０μＬの溶解／結合バッファーおよび３μＬの磁性ビーズを含有する１０μＬの溶解バッファーを添加した。プレートを、電磁シェーカー上で室温で１０分間インキュベートし、次いで、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズが結合しているＲＮＡを、１５０μＬの洗浄バッファーＡを用いて２回および洗浄バッファーＢを用いて１回洗浄した。次いで、１５０μＬの溶出バッファーを用いてビーズを洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、フォスターシティ、カタログ番号４３６８８１３）を使用するｃＤＮＡ合成：
上記で単離されたＲＮＡに、反応あたり１μＬの１０×バッファー、０．４μＬの２５× ｄＮＴＰ、１μＬの１０×ランダムプライマー、０．５μＬの逆転写酵素、０．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤および６．６μＬのＨ２Ｏを含有する１０μＬのマスターミックスを添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁シェーカー上で室温で１０分間、続いて、３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）中でウェルあたり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）および０．５μｌのＶＥＧＦＡヒトプローブ（Ｈｓ００９０００５５＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ）のいずれかに、２μｌのｃＤＮＡおよび５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）においてリアルタイムＰＣＲを行った。各二重鎖を少なくとも２回試験し、データを非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。相対変化倍数を算出するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を用いて実施されたアッセイに対して正規化した。
結果
３セットの例示的ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡを用いる、ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）およびヒトｈＴＥＲＴ不死化網膜色素上皮細胞（ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１）における複数回用量スクリーニングの結果は、表６Ａ（表２Ａおよび表２Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）、表６Ｂ（表３Ａおよび表３Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）および６Ｃ（表４Ａおよび表４Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）に示されている。複数回用量実験は、５０ｎｍ、１０ｎｍ、１ｎｍおよび０．１ｎｍの最終二重鎖濃度で実施し、データは、非標的化対照に対する、残存するメッセージパーセントとして表されている。１０ｎｍの濃度で投与された場合にＡＲＰＥ－１９細胞において、評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、２８個が≧９０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１０８個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、２２９個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表１８]
Figure 2023514190000187
Figure 2023514190000188
Figure 2023514190000189
Figure 2023514190000190
［表１９]
Figure 2023514190000191
Figure 2023514190000192
Figure 2023514190000193
Figure 2023514190000194
Figure 2023514190000195
［表２０]
Figure 2023514190000196
Figure 2023514190000197
Figure 2023514190000198
Figure 2023514190000199
Figure 2023514190000200
１セットの例示的ラットＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡを用いる、カニクイザルＶＥＧＦ－Ａでトランスフェクトされたアフリカミドリザル腎臓細胞（Ｃｏｓ－７）における複数回用量スクリーニングの結果は、表７Ａ（表５Ａおよび表５Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）に示されている。１セットの例示的ラットＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡを用いる、マウスＶＥＧＦ－ＡでトランスフェクトされたＣｏｓ－７細胞における複数回用量スクリーニングの結果は、表７Ｂ（表５Ａおよび表５Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）に示されている。複数回用量は、１０ｎｍ、１ｎｍおよび０．１ｎｍ最終二重鎖濃度で実施し、データは、非標的化対照に対する、残存するメッセージパーセントとして表されている。
［表２１]
Figure 2023514190000201
Figure 2023514190000202
Figure 2023514190000203
Figure 2023514190000204
Figure 2023514190000205
［表２２]
Figure 2023514190000206
Figure 2023514190000207
Figure 2023514190000208
Figure 2023514190000209
Figure 2023514190000210
１セットの例示的ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞における複数回用量スクリーニングの結果は、表９Ａ（表８Ａおよび８Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）において示されている。複数回用量実験は、５０ｎｍ、１０ｎｍ、１ｎｍおよび０．１ｎｍの最終二重鎖濃度で実施し、データは、非標的化対照に対する、残存するメッセージパーセントとして表されている。
５０ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ａにおける評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、１個が≧８０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１１９個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３６３個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１０ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ａにおける評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、２個が≧８０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１０３個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３６４個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ａにおける評価される例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、１３個が≧７０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、５２個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３１２個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
０．１ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ａにおける評価される例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、８個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、７５個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１７０個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表２３]
Figure 2023514190000211
Figure 2023514190000212
Figure 2023514190000213
Figure 2023514190000214
Figure 2023514190000215
Figure 2023514190000216
Figure 2023514190000217
Figure 2023514190000218
１セットの例示的なヒトＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡを自由に取り込ませた一次ヒト肝細胞における複数回用量スクリーニングの結果は、表９Ｂ（表８Ａおよび８Ｂ中のｓｉＲＮＡに対応する）に示されている。複数回用量実験は、５００ｎｍ、１００ｎｍ、１０ｎｍおよび１ｎｍの最終二重鎖濃度で実施し、データは、非標的化対照に対する、残存するメッセージパーセントとして表されている。
５００ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ｂにおける評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、２個が≧８０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、５３個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、２３９個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１００ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ｂにおける評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、４個が≧７０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３３個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、２３５個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１０ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ｂにおける評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、３個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、５２個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１１３個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１ｎｍの濃度で投与された場合に、表９Ｂにおける評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、１３個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、８８個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１４６個が≧２０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表２４]
Figure 2023514190000219
Figure 2023514190000220
Figure 2023514190000221
Figure 2023514190000222
Figure 2023514190000223
Figure 2023514190000224
Figure 2023514190000225
Figure 2023514190000226
追加のセットの例示的ヒトＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞における複数回用量スクリーニングの結果は、表１１（表１０Ａ中の修飾されたｓｉＲＮＡに対応する）に示されている。複数回用量実験は、５０ｎｍ、１０ｎｍ、１ｎｍおよび０．１ｎｍの最終二重鎖濃度で実施し、データは、非標的化対照に対する、残存するメッセージパーセントとして表されている。
５０ｎｍの濃度で投与された場合に、表１１における評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、６個が≧７０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３４個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、４９個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、６２個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、７５個が≧２０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１０ｎｍの濃度で投与された場合に、表１１における評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、２個が≧７０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１８個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３５個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、６６個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、７７個が≧２０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
１ｎｍの濃度で投与された場合に、表１１における評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、１３個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、３３個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、４９個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、６２個が≧２０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、７４個が≧１０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
０．１ｎｍの濃度で投与された場合に、表１１における評価された例示的ｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、２個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、７個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、２５個が≧２０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、４６個が≧１０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、５５個が≧５％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表２５]
Figure 2023514190000227
Figure 2023514190000228
 ［実施例３］
ＶＥＧＦ－Ａ ｓｉＲＮＡのインビボスクリーニング
この実施例は、ＡＡＶマウスにおけるヒトＶＥＧＦ－Ａノックダウンのインビボ有効性に対する、例示的ＶＥＧＦ－Ａ標的化ｓｉＲＮＡの効果を調査する。調査されたＶＥＧＦ－Ａ標的化ｓｉＲＮＡの第１の例示的セットには、ＡＤ－６４２２８、ＡＤ－９５３３７４、ＡＤ－９５３５０４、ＡＤ－９５３３３６、ＡＤ－９５３３３７、ＡＤ－９０１３７６、ＡＤ－９５３３６４、ＡＤ－９５３３４０、ＡＤ－９５３３５１、ＡＤ－９５３３４２、ＡＤ－９５３３０８、ＡＤ－９５３３４４、ＡＤ－９５３３３９およびＡＤ－９５３３６３（表１２および図１Ａ～１Ｂに要約される）が含まれる。調査された例示的ＶＥＧＦ－Ａ標的化ｓｉＲＮＡの第２のセットには、ｉｎｃｌｕｄｅｄ ＡＤ－９０１３４９、ＡＤ－９５３４８１、ＡＤ－９０１３５６、ＡＤ－９０１３５５、ＡＤ－９５３３６５、ＡＤ－９５３４１０、ＡＤ－９５３４１１、ＡＤ－９５３３３８、ＡＤ－９５３３５０、ＡＤ－９５３３７５、ＡＤ－９５３３４１、ＡＤ－９５３３７０、ＡＤ－９５３３８６、ＡＤ－６４９５８（表１３および図３Ａ～３Ｂに要約される）が含まれていた。調査された例示的ＶＥＧＦ－Ａ標的化ｓｉＲＮＡの最終セットには、ＡＤ－１３９７０５０、ＡＤ－１３９７０５１、ＡＤ－１３９７０５２、ＡＤ－１３９７０５３、ＡＤ－１３９７０５４、ＡＤ－１３９７０５５、ＡＤ－１３９７０５６、ＡＤ－１３９７０５８、ＡＤ－１３９７０５９、ＡＤ－１３９７０６０、ＡＤ－１３９７０６１、ＡＤ－１３９７０６２、ＡＤ－１３９７０６４、ＡＤ－１３９７０６５、ＡＤ－１３９７０６６、ＡＤ－１３９７０６７、ＡＤ－１３９７０６８、ＡＤ－１３９７０６９およびＡＤ－６４９５８（表１４および図５Ａ～５Ｃに要約される）が含まれていた。
［表２６]
Figure 2023514190000229
［表２７]
Figure 2023514190000230
［表２８]
Figure 2023514190000231
Figure 2023514190000232
Figure 2023514190000233
実験方法
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスにヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＶＥＧＦ－Ａを有するＡＡＶベクターを注射し（２×１０１１ウイルス粒子／マウス）、ＡＡＶ投与後１４日目に、選択されたｓｉＲＮＡまたは対照剤を、マウス（群あたりｎ＝３）において３ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。ｓｉＲＮＡまたは対照の注射後１４日目に、マウスを屠殺し、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡレベルについて肝臓を評価した。
結果
表１５および図２は、表１２中のｓｉＲＮＡ配列に対応するｓｉＲＮＡ二重鎖を用いたインビボスクリーニングの結果を実証する。表１５におけるインビボで評価されたｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、２個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、４個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、９個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１１個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１３個が≧１５％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表２９]
Figure 2023514190000234
表１６および図４は、表１３中のｓｉＲＮＡ配列に対応するｓｉＲＮＡ二重鎖を用いた、インビボスクリーニングの結果を実証する。表１６におけるインビボで評価されたｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、３個が≧７０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、６個が≧６０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、９個が≧５０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１２個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１３個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表３０]
Figure 2023514190000235
表１７および図６は、表１４中のｓｉＲＮＡ配列に対応するｓｉＲＮＡ二重鎖を用いたインビボスクリーニングの結果を実証する。表１７におけるインビボで評価されたｓｉＲＮＡ二重鎖のうち、５個が≧４０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１０個が≧３０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１５個が≧２０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成し、１７個が≧１０％のＶＥＧＦ－Ａのノックダウンを達成した。
［表３１]
Figure 2023514190000236

Claims (46)

  1. 血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列の１つに由来する、０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１２、１３、１４、１８Ａおよび１８Ｂのいずれか１つに列挙されたセンス配列に由来する０、１、２または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  2. センス鎖の部分が、配列番号１のヌクレオチド１８５５～１８７５、１８５８～１８７８、２１７８～２１９８、２１８１～２２０１、２９４４～２９６４、２９４６～２９６６、２９５２～２９７２、３３６１～３３８１または３３６２～３３８２内の部分である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  3. センス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（CGACAGAACAGUCCUUAAUCA（配列番号４２００））、ＡＤ－９０１０９４（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０１））、ＡＤ－１０２０５７５（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０２））、ＡＤ－９０１１００（AACAGUGCUAAUGUUAUUGGA（配列番号４２０３））、ＡＤ－９０１１０１（AGUGCUAAUGUUAUUGGUGUA（配列番号４２０４））、ＡＤ－９０１１１３（GAGAAAGUGUUUUAUAUACGA（配列番号４２０５））、ＡＤ－９０１１２３（AAAAUAGACAUUGCUAUUCUA（配列番号４２０６））、ＡＤ－９０１１２４（AAAUAGACAUUGCUAUUCUGA（配列番号４２０７））、ＡＤ－９０１１５８（GAAAGUGUUUUAUAUACGGUA（配列番号４２０８））、ＡＤ－９０１１５９（GUUUUAUAUACGGUACUUAUA（配列番号４２０９））、ＡＤ－１０２０５７３（AGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（配列番号４２１０））、またはＡＤ－１０２３１４３（AAAAUAGACATUGCUAUUCUA（配列番号４２１１））から選択される二重鎖に由来するセンス鎖内の部分である、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  4. センス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（CGACAGAACAGUCCUUAAUCA（配列番号４２００））、ＡＤ－９０１０９４（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０１））、ＡＤ－１０２０５７５（CAGAACAGUCCUUAAUCCAGA（配列番号４２０２））、ＡＤ－９０１１００（AACAGUGCUAAUGUUAUUGGA（配列番号４２０３））、ＡＤ－９０１１０１（AGUGCUAAUGUUAUUGGUGUA（配列番号４２０４））、ＡＤ－９０１１１３（GAGAAAGUGUUUUAUAUACGA（配列番号４２０５））、ＡＤ－９０１１２３（AAAAUAGACAUUGCUAUUCUA（配列番号４２０６））、ＡＤ－９０１１２４（AAAUAGACAUUGCUAUUCUGA（配列番号４２０７））、ＡＤ－９０１１５８（GAAAGUGUUUUAUAUACGGUA（配列番号４２０８））、ＡＤ－９０１１５９（GUUUUAUAUACGGUACUUAUA（配列番号４２０９））、ＡＤ－１０２０５７３（AGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（配列番号４２１０））、またはＡＤ－１０２３１４３（AAAAUAGACATUGCUAUUCUA（配列番号４２１１））のセンス鎖から選択されるセンス鎖である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  5. アンチセンス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（UGAUUAAGGACUGUUCUGUCGAU（配列番号４２１２））、ＡＤ－９０１０９４（UCUGGAUUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１３））、ＡＤ－１０２０５７５（UCUGGATUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１４））、ＡＤ－９０１１００（UCCAAUAACAUUAGCACUGUUAA（配列番号４２１５））、ＡＤ－９０１１０１（UACACCAAUAACAUUAGCACUGU（配列番号４２１６））、ＡＤ－９０１１１３（UCGUAUAUAAAACACUUUCUCUU（配列番号４２１７））、ＡＤ－９０１１２３（UAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUAU（配列番号４２１８））、ＡＤ－９０１１２４（UCAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUA（配列番号４２１９））、ＡＤ－９０１１５８（UACCGUAUAUAAAACACUUUCUC（配列番号４２２０））、ＡＤ－９０１１５９（UAUAAGUACCGUAUAUAAAACAC（配列番号４２２１））、ＡＤ－１０２０５７３（UACACCAAUAACATUAGCACUGU（配列番号４２２２））、またはＡＤ－１０２３１４３（UAGAAUAGCAATGTCTAUUUUAU（配列番号４２２３））から選択される二重鎖に由来するアンチセンス鎖内の部分である、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. アンチセンス鎖の部分が、ＡＤ－１０２０５７４（UGAUUAAGGACUGUUCUGUCGAU（配列番号４２１２））、ＡＤ－９０１０９４（UCUGGAUUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１３））、ＡＤ－１０２０５７５（UCUGGATUAAGGACUGUUCUGUC（配列番号４２１４））、ＡＤ－９０１１００（UCCAAUAACAUUAGCACUGUUAA（配列番号４２１５））、ＡＤ－９０１１０１（UACACCAAUAACAUUAGCACUGU（配列番号４２１６））、ＡＤ－９０１１１３（UCGUAUAUAAAACACUUUCUCUU（配列番号４２１７））、ＡＤ－９０１１２３（UAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUAU（配列番号４２１８））、ＡＤ－９０１１２４（UCAGAAUAGCAAUGUCUAUUUUA（配列番号４２１９））、ＡＤ－９０１１５８（UACCGUAUAUAAAACACUUUCUC（配列番号４２２０））、ＡＤ－９０１１５９（UAUAAGUACCGUAUAUAAAACAC（配列番号４２２１））、ＡＤ－１０２０５７３（UACACCAAUAACATUAGCACUGU（配列番号４２２２））、またはＡＤ－１０２３１４３（UAGAAUAGCAATGTCTAUUUUAU（配列番号４２２３））のアンチセンス鎖から選択されるアンチセンス鎖である、請求項１から５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. センス鎖およびアンチセンス鎖が、ＡＤ－１０２０５７４（配列番号４２００および４２１２）、ＡＤ－９０１０９４（配列番号４２０１および４２１３）、ＡＤ－１０２０５７５（配列番号４２０２および４２１４）、ＡＤ－９０１１００（配列番号４２０３および４２１５）、ＡＤ－９０１１０１（配列番号４２０４および４２１６）、ＡＤ－９０１１１３（配列番号４２０５および４２１７）、ＡＤ－９０１１２３（配列番号４２０６および４２１８）、ＡＤ－９０１１２４（配列番号４２０７および４２１９）、ＡＤ－９０１１５８（配列番号４２０８および４２２０）、ＡＤ－９０１１５９（配列番号４２０９および４２２１）、ＡＤ－１０２０５７３（配列番号４２１０および４２２２）、またはＡＤ－１０２３１４３（配列番号４２１１および４２２３）から選択される二重鎖の対形成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. アンチセンス鎖が、表１８Ａに列挙されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス配列に対応する、表１８Ａに列挙されるセンス配列のヌクレオチド配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. ＡＤ－１０２０５７４、ＡＤ－９０１０９４、ＡＤ－１０２０５７５、ＡＤ－９０１１００、ＡＤ－９０１１０１、ＡＤ－９０１１１３、ＡＤ－９０１１２３、ＡＤ－９０１１２４、ＡＤ－９０１１５８、ＡＤ－９０１１５９、ＡＤ－１０２０５７３またはＡＤ－１０２３１４３である、請求項１から８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、１つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされている、請求項１から９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. 親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされている、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. １つまたは複数の親油性部分が、少なくとも１つの鎖上の１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされている、請求項１０または１１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. １つまたは複数の親油性部分が、リンカーまたは担体を介して少なくとも１つの鎖上の１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされている、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 親油性部分が、脂肪族、脂環式または多脂環式化合物である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. 親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. 親油性部分、内部位置または二本鎖領域における１つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされている、請求項１０から１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介してセンス鎖またはアンチセンス鎖にコンジュゲートされている、請求項１０から１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされている、請求項１０から１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、前記の請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. センス鎖ヌクレオチドの５つ以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの５つ以下が、未修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチドおよび２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記の請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、前記の請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、前記の請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. 少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む、前記の請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. 標的化リガンド、例えば、眼組織または肝組織を標的化するリガンドをさらに含む、請求項１０から２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. 眼組織が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. アンチセンス鎖の５’末端にホスフェートまたはホスフェートミミックをさらに含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. ホスフェートミミックが、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. （ｉ）センス鎖が、配列番号４１６４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７６の配列および全ての修飾を含む、
    （ｉｉ）センス鎖が、配列番号１４６５の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７７の配列および全ての修飾を含む、
    （ｉｉｉ）センス鎖が、配列番号１４６６の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７８の配列および全ての修飾を含む、
    （ｉｖ）センス鎖が、配列番号１４６７の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１７９の配列および全ての修飾を含む、
    （ｖ）センス鎖が、配列番号１４６８の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８０の配列および全ての修飾を含む、
    （ｖｉ）センス鎖が、配列番号１４６９の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８１の配列および全ての修飾を含む、
    （ｖｉｉ）センス鎖が、配列番号１４７０の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８２の配列および全ての修飾を含む、
    （ｖｉｉｉ）センス鎖が、配列番号１４７１の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８３の配列および全ての修飾を含む、
    （ｉｘ）センス鎖が、配列番号１４７２の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８４の配列および全ての修飾を含む、
    （ｘ）センス鎖が、配列番号１４７３の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８５の配列および全ての修飾を含む、
    （ｘｉ）センス鎖が、配列番号１４７４の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８６の配列および全ての修飾を含む、または
    （ｘｉｉ）センス鎖が、配列番号１４７５の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１８７の配列および全ての修飾を含む、
    前記の請求項のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 請求項１から３２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞。
  34. ＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１から３２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
  35. 細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害する方法であって、
    （ａ）細胞を、請求項１から３２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項３４に記載の医薬組成物と接触させること、および
    （ｂ）工程（ａ）において生成された細胞を、ＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはＶＥＧＦ－Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって、細胞においてＶＥＧＦ－Ａの発現を阻害すること
    を含む方法。
  36. 細胞が対象内にある、請求項３５に記載の方法。
  37. 対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
  38. 対象が、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害、例えば、滲出性加齢性黄斑変性症（湿性ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、網膜静脈閉塞後黄斑浮腫（ＭＥｆＲＶＯ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または近視性脈絡膜血管新生（ｍＣＮＶ）と診断されている、請求項３７に記載の方法。
  39. ＶＥＧＦ－Ａ関連障害と診断された対象を処置する方法であって、対象に請求項１から２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項２５に記載の医薬組成物の治療上有効量を投与し、それによって、障害を処置することを含む方法。
  40. ＶＥＧＦ－Ａ関連障害が、血管新生性眼疾患である、請求項３９に記載の方法。
  41. 血管新生性眼疾患が、ＡＭＤ、ＤＲ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＭＥｆＲＶＯ、ＲＯＰおよびｍＣＮＶからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 処置が、障害の少なくとも１つの兆候または症状の改善を含む、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 処置が、（ａ）血管新生を阻害すること、（ｂ）ＶＥＧＦ－Ａの発現または活性を阻害または低減すること、（ｃ）脈絡膜の新血管新生を阻害すること、（ｄ）脈絡毛細管において新規血管の成長を阻害すること、（ｅ）網膜の厚さを低減すること、（ｆ）視力を高めることまたは（ｇ）眼球内炎症を低減することを含む、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. ｄｓＲＮＡ剤が、眼内に、静脈内に、または局所的に対象に投与される、請求項３６から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 眼球内投与が、硝子体内投与（例えば、硝子体内注射）、経強膜投与（例えば、経強膜注射）、結膜下投与（例えば、結膜下注射）、球後投与（例えば、球後注射）、前房内投与（例えば、前房内注射）または網膜下投与（例えば、網膜下注射）を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 対象に、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害の処置または予防にとって好適な追加の薬剤または療法（例えば、光線力学的療法、光血液凝固療法、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬、抗ＶＥＧＦ剤または硝子体切除術のうち１つまたは複数）を投与することをさらに含む、請求項３６から４５のいずれか一項に記載の方法。
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