JP2022546570A - Ｌｅｃｔ２遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

Ｌｅｃｔ２遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＬＥＣＴ２遺伝子を標的化する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物、およびそのようなｄｓＲＮＡ組成物を使用してＬＥＣＴ２の発現を変更する（例えば阻害する）方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年９月３日に出願された米国仮出願第６２／８９５，２１７号に対する優先権を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０２０年８月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２０３８－７２３２ＷＯ＿ＳＬ．Ｔｘｔと名付けられ、サイズは２２１，０８６バイトである。
本開示は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現の特異的阻害に関する。
アミロイドーシスは、臓器または組織における、アミロイドと呼ばれる不溶性の線維状タンパク質凝集物の沈着によって特徴付けられる疾患の群である。アミロイドは、突然変異型または野生型タンパク質から形成され得る。アミロイド病の１つの命名法は、文字「Ａ」が先行する、アミロイド沈着を形成するタンパク質の略語を使用する。したがって、例えば、ＡＬＥＣＴ２は、白血球細胞由来走化性因子－２から形成されたアミロイドの沈着を含むアミロイドーシス（ＡＬＥＣＴ２）の略語である。
ＬＥＣＴ２アミロイドーシス（ＡＬＥＣＴ２）は、アミロイドーシスのごく最近発見された型の１つである。ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは腎アミロイドーシスまたは肝アミロイドーシスを有する個体において観察された。アミロイドーシスのこの形態は、ネフローゼ症候群または肝臓の合併症（例えば肝炎、例えば慢性肝炎）を示し得る。これは、特にメキシコ系アメリカ人および／または成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質の５８位）にバリンをコードするＧ対立遺伝子のホモ接合体である個体において特に流行し得る。ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの処置は限定されており、新しい処置が必要である。
本開示は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を調節する方法およびｉＲＮＡ組成物を記載する。ある特定の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現は、ＬＥＣＴ２特異的ｉＲＮＡを使用して減少または阻害される。そのような阻害は、アミロイドーシスなどのＬＥＣＴ２発現と関連する障害、例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス（ＡＬＥＣＴ２）の処置に有用であり得る。
したがって、本明細書に記載されるのは、例えば細胞においてまたは対象において（例えばヒト対象などの哺乳動物において）、ＬＥＣＴ２遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断に影響する組成物および方法である。また、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスなどのＬＥＣＴ２遺伝子の発現と関連する障害を処置する組成物および方法も記載される。
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは腎アミロイドーシスである。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは腎臓におけるアミロイド沈着を含む。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは腎疾患（例えばネフローゼ症候群）と関連する。一部の実施形態では、アミロイドーシスはタンパク尿症と関連する。一部の実施形態では、タンパク尿症は存在しない。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは肝アミロイドーシスである。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは肝臓におけるアミロイド沈着を含む。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは肝臓の炎症（例えば肝炎、例えば慢性肝炎）と関連する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、アミロイド沈着またはアミロイド沈着と関連する症候群を（例えばアミロイド沈着を防止することまたはアミロイド沈着を減少させることにより、例えばアミロイド沈着のサイズ、数、または程度を減少させることにより）阻害するのに有効である。
本明細書で使用される場合、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡｉ剤」、または「ｉＲＮＡ分子」は、その用語が本明細書で定義されるようにＲＮＡを含有する薬剤を指し、それは例えばＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、細胞または哺乳動物においてＬＥＣＴ２発現を阻害する。
本明細書において特徴とされる組成物中に含まれるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＬＥＣＴ２遺伝子（例えばマウスまたはヒトＬＥＣＴ２遺伝子）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域、例えば３０ヌクレオチド以下、一般に１９～２４ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む（本明細書では「ＬＥＣＴ２特異的ｉＲＮＡ」とも呼ばれる）。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物は、ヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物、例えば配列番号１である。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物は、配列番号１の３７３位のヌクレオチドにＡからＧの置換を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ転写物は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）にバリンをコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ転写物は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）にイソロイシンをコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの領域と実質的に相補的である領域を有するアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡは、ＮＭ＿００２３０２．２（配列番号１）の配列を有する。一部の実施形態では、ヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡは、配列番号１の３７３位のヌクレオチドにＡからＧの置換を有する。
他の実施形態では、ｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの一部と実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する。一実施形態では、ｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、例えばヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ［例えばＮＭ＿００２３０２．２（配列番号１）で提供される、または配列番号１の３７３位のヌクレオチドにＡからＧの置換を有するヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ］の一部と実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する。
一実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。ｉＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖および第２の配列を有するアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、ＬＥＣＴ２転写物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補的な領域は３０ヌクレオチド以下、および少なくとも１５ヌクレオチド長である。一般に、ｉＲＮＡは１９～２４ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは１９～２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは１９～２１ヌクレオチド長であり、脂質製剤、例えば脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤（例えばＬＮＰ１１製剤）である。一実施形態では、ＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡは安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に製剤化される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは２１～２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは２１～２３ヌクレオチド長であり、コンジュゲートの形態であり、例えば本明細書に記載される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは約１５～約２５ヌクレオチド長であり、他の実施形態では、ｉＲＮＡは約２５～約３０ヌクレオチド長である。ＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２を発現する細胞と接触すると、当業者に公知の方法によりまたは本明細書に記載されるようにアッセイした場合、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害する（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）。
一実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７の相当するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列、または薬学的に許容されるその塩を含むまたはからなる。
一部の実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に提供するものから選択されるセンスおよび／またはアンチセンス配列、または薬学的に許容されるその塩を含むまたはからなる。一部の実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、実施例において本明細書に開示されるようにＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、ＡＤ－４５４７４６、ＡＤ－８６４５９、またはＡＤ－８６４６０のものから選択されるセンスおよび／またはアンチセンス配列を含むまたはからなる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、またはＡＤ－４５４７４６のものから選択されるセンスおよび／またはアンチセンス配列を有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＡＤ－４５４７８１のセンスおよび／またはアンチセンス配列を有する。
本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドを含むことができ、または限定はされないが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に連結される末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。あるいは、修飾ヌクレオチドは：２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択され得る。そのような修飾配列は、例えば、表２Ａ、３Ａ、または６のセンス配列からなる群から選択される前記ｉＲＮＡの第１の配列および表２Ａ、３Ａ、または６の相当するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列に基づき得る。
一実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号１４３、配列番号２９、または配列番号２３からなる群から選択される配列を含むセンス鎖を含む。一実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号１４４、配列番号３０、または配列番号２４からなる群から選択される配列を含むアンチセンス鎖を含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号１４３の配列を含むセンス鎖を含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号１４４の配列を含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号３７０、配列番号２９４、または配列番号２９０からなる群から選択される配列を含むセンス鎖を含む。一実施形態では、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号３７１、配列番号２９５、または配列番号２９１からなる群から選択される配列を含むアンチセンス鎖を含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号３７０の配列を含むセンス鎖を含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、配列番号３７１の配列を含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、野生型ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物変型を標的化し、別の実施形態では、ｉＲＮＡは突然変異型転写物（例えば対立遺伝子変異体を持つＬＥＣＴ２ ＲＮＡ）を標的化する。例えば、本開示において特徴とされるｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２の多型変異体、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を標的化することができる。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）にバリンをコードするｍＲＮＡを標的化する（例えば減少させる）。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（または非プロセス型タンパク質のアミノ酸５８）にイソロイシンをコードするｍＲＮＡを標的化する（例えば減少させる）。別の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）にバリンをコードするｍＲＮＡとイソロイシンをコードするｍＲＮＡの両方を標的化する（例えば減少させる）。
別の実施形態では、ｉＲＮＡは野生型ＬＥＣＴ２転写物と突然変異型ＬＥＣＴ２転写物の両方を標的化する。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡはＬＥＣＴ２の特定の転写物変異体を標的化する。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は複数の転写物変異体を標的化する。
一実施形態では、本開示において特徴とされるｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物の非コード領域、例えば転写物の５’または３’非翻訳領域を標的化する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、本明細書に記載されるように、標的化部分および／またはリガンドとして寄与し得るコンジュゲート、例えば炭水化物コンジュゲートの形態である。一実施形態では、コンジュゲートは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。一部の実施形態では、コンジュゲートは、リンカーを介して、例えば二価または三価の分岐鎖リンカーを介して結合される。
一部の実施形態では、コンジュゲートは１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含む。そのようなコンジュゲートはまた、本明細書では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートとも呼ばれる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ＲＮＡｉ剤（例えばｄｓＲＮＡ）を特定の細胞、例えば肝臓細胞、例えば肝細胞に標的化する。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば二価または三価の分岐鎖リンカーを介して結合され得る。特定の実施形態では、コンジュゲートは、
Figure 2022546570000001
 である。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、リンカー、例えば以下の概略図に示すリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに結合され、式中ＸはＯまたはＳである。
Figure 2022546570000002
一部の実施形態では、ＸはＯである。一部の実施形態では、ＸはＳである。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は表１に定義し、以下に示すようにＬ９６にコンジュゲートされる。
Figure 2022546570000003
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ（例えばｄｓＲＮＡ）を所望の臓器（例えば肝臓）または特定の細胞型（例えば肝細胞）に標的化するリガンドにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、肝臓にＲＮＡｉ剤（例えばｄｓＲＮＡ）を標的化するリガンド（例えばＧａｌＮＡｃリガンド、例えばＬ９６）にコンジュゲートされる。
一態様では、本明細書に提供されるのは、生物、通常ヒト対象においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物である。組成物は、典型的には、本明細書に記載される１つまたは複数のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体またはデリバリー媒体を含む。一実施形態では、組成物は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害、例えばアミロイドーシス、例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシスを処置するために使用される。
一態様では、本明細書に提供されるｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、１５～３０塩基対長であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、または５～７に開示される二重鎖の標的配列の少なくとも１５ヌクレオチドと相補的である、ｄｓＲＮＡ、または薬学的に許容されるその塩である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、または５～７に開示される二重鎖の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、または５～７に開示される二重鎖の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に開示される二重鎖の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に開示される二重鎖の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、ＡＤ－４５４７４６、ＡＤ－８６４５９、またはＡＤ－８６４６０の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、ＡＤ－４５４７４６、ＡＤ－８６４５９、またはＡＤ－８６４６０の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、またはＡＤ－４５４７４６の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、またはＡＤ－４５４７４６の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１の標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１の標的配列の全てのヌクレオチドと相補的である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ、３Ａ、または６に提供する標的配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ、３Ａ、または７に提供する標的位配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１４５、３１、または２５の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１４５の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１４５の全てのヌクレオチドと相補的である。
さらなる態様では、本明細書に提供されるｉＲＮＡは、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）であって、前記アンチセンス鎖がＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、各鎖が約１４～約３０ヌクレオチドを有し、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’はそれぞれ独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれか、またはそれらの組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれか、またはそれらの組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’ｎｑ、およびｎｑ’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して３つの連続するヌクレオチドの３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎｂの修飾はＹの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾はＹ’の修飾とは異なる）
によって表される、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ｉは１であり；ｊは１であり；またはｉとｊの両方が１である。
一部の実施形態では、ｋは１であり；ｌは１であり；またはｋとｌの両方が１である。
一部の実施形態では、ＸＸＸはＸ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹはＹ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、およびＺＺＺはＺ’Ｚ’Ｚ’と相補的である。
一部の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは５’末端からアンチセンス鎖の１１、１２および１３位に生じる。
一部の実施形態では、Ｙ’は２’－Ｏ－メチルである。
一部の実施形態では、二重鎖領域は１５～３０ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二重鎖領域は１７～２３ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二重鎖領域は１９～２１ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二重鎖領域は２１～２３ヌクレオチド対長である。
一部の実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、ヘキシトールまたはヘキソース核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、または両方であり、グリコール核酸（ＧＮＡ）でもよい。
一部の実施形態では、リガンドは炭水化物を含む。
一部の実施形態では、リガンドはリンカーを介して結合される。
一部の実施形態では、リンカーは二価または三価の分岐鎖リンカーである。
一部の実施形態では、リガンドは、
Figure 2022546570000004
 である。
一部の実施形態では、リガンドおよびリンカーは、式ＸＸＩＶ：
Figure 2022546570000005
 に示す通りである。
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に提供される配列の群から選択されるヌクレオチド配列（例えばセンスおよび／またはアンチセンス配列）を有する（例えば含む）。
さらなる態様では、本明細書に提供されるｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、ｄｓＲＮＡ、または薬学的に許容されるその塩である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと２ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと１ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと２ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つと１ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、実施例において開示される二重鎖ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、ＡＤ－４５４７４６、ＡＤ－８６４５９、またはＡＤ－８６４６０のものから選択される。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、またはＡＤ－４５４７４６のものから選択される。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１のものである。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、例えば本明細書に提供される実施例において開示されたアッセイを使用して評価した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ発現を抑制する本明細書に開示される二重鎖のものである。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５ヌクレオチド以下およびアンチセンス鎖の５ヌクレオチド以下が非修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に連結される末端ヌクレオチドまたはドデカン酸ビスデシルアミド基からなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは：２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、または両方を含み、グリコールヌクレオチドでもよい。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖に少なくとも１、２、３、４またはそれ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の７位、９位、１０位、１１位、またはこれらの組合せに２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の７位、９位、１０位、および１１位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖に少なくとも１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の２位、４位、６位、８位、９位、１４位、１６位、またはこれらの組合せに２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の２位、１４位、および１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の２位、４位、８位、９位、１２位、１４位、および１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡはグリコールヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、グリコールヌクレオチドはアンチセンス鎖に存在する。一部の実施形態では、グリコールヌクレオチドは、アンチセンス鎖の７位に存在する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位と２位の間、２位と３位の間、または両方にホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位と２位の間および２位と３位の間にホスホロチオエート結合を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の１位と２位の間、２位と３位の間、２１位と２２位の間、２２位と２３位の間、またはこれらの組合せにホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の１位と２位の間、２位と３位の間、２１位と２２位の間、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を含む。
一部の実施形態では、相補的な領域は少なくとも１７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、相補的な領域は１９ヌクレオチド長～２３ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、相補的な領域は２１ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、各鎖は３０ヌクレオチド長以下である。一部の実施形態では、各鎖は２１ヌクレオチド長～２３ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、センス鎖は２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは平滑末端を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは３’オーバーハングおよび平滑末端を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、リガンドはＧａｌＮＡｃリガンドである。一部の実施形態では、リガンドは、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を肝臓（例えば肝細胞に）標的化する。一部の実施形態では、リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、相補的な領域は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に提供されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列からなる。一部の実施形態では、相補的な領域は、実施例において開示されるＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、ＡＤ－４５４７４６、ＡＤ－８６４５９、またはＡＤ－８６４６０のものから選択されるアンチセンス配列からなる。一部の実施形態では、相補的な領域は、ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、またはＡＤ－４５４７４６のものから選択されるアンチセンス配列からなる。一部の実施形態では、相補的な領域は、二重鎖ＡＤ－４５４７８１のアンチセンス配列からなる。一部の実施形態では、相補的な領域は、本明細書に開示される二重鎖から選択されるアンチセンス配列からなり、二重鎖はＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または９０％抑制する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７から選択されるセンス鎖配列を含むまたはからなるセンス鎖、および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７から選択されるアンチセンス配列を含むまたはからなるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、または５～７に開示される二重鎖のものから選択される相当するセンス配列とアンチセンス配列の対を含むまたはからなる。ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ、３Ａ、または６に開示される二重鎖のものから選択される相当するセンス配列とアンチセンス配列の対を含むまたはからなる。ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ｂ、３Ｂ、または７に開示される二重鎖のものから選択される相当するセンス配列とアンチセンス配列の対を含むまたはからなる。ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表４Ａまたは４Ｂに開示される二重鎖のものから選択される相当するセンス配列とアンチセンス配列の対を含むまたはからなる。ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表５に開示される二重鎖のものから選択される相当するセンス配列とアンチセンス配列の対を含むまたはからなる。
一態様では、本開示は、ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖がｃｓａｓｕｇｕｇＣｆａＣｆＡｆＵｆｕｇａａａａｃｕｇｕＬ９６（配列番号２３）の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖がａｓＣｆｓａＧｆｕｕ（Ｔｇｎ）ＵｆＣｆａａＵｆｇＵｆｇＣｆａｃａｕｇｓｃｓｇ（配列番号２４）の配列および全ての修飾を含む、ｄｓＲＮＡを提供する。
一態様では、本開示は、ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖がａｓｕｓｇｇｕｃＡｆｇＡｆＵｆＣｆｕｕｃａａａａｕａａＬ９６（配列番号２９）の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖がｕｓＵｆｓａｕｕｕ（Ｔｇｎ）ｇａａｇａｕＣｆｕＧｆａｃｃａｕｓｕｓｇ（配列番号３０）の配列および全ての修飾を含む、ｄｓＲＮＡを提供する。
一態様では、本開示は、ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖がｇｓｇｓｕｃａｇＡｆｕＣｆＵｆＵｆｃａａａａｕａａａｕＬ９６（配列番号１４３）の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖がａｓＵｆｓｕｕａＵｆｕＵｆＵｆｇａａｇＡｆｕＣｆｕｇａｃｃｓｇｓｇ（配列番号１４４）の配列および全ての修飾を含む、ｄｓＲＮＡを提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含有する細胞を提供する。細胞は、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は肝臓細胞（例えば肝細胞）である。
一態様では、本開示は、類似の未処置の細胞と比較した場合、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのレベルまたはＬＥＣＴ２タンパク質のレベルが減少したヒト細胞（例えば本明細書に記載されるヒト細胞）を提供し、レベルは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％減少してもよい。
一部の実施形態では、ヒト細胞はヒト細胞（例えば本明細書に記載されるヒト細胞）をｄｓＲＮＡ、例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと接触させることを含むプロセスによって産生された。
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含む、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物である。
本明細書に記載される医薬組成物の一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は非緩衝溶液中で投与される。一部の実施形態では、非緩衝溶液は生理食塩水または水である。
本明細書に記載される医薬組成物の一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は緩衝溶液によって投与される。一部の実施形態では、緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
本明細書に記載される医薬組成物の一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は肝臓（例えば肝細胞）に標的化される。
本明細書に記載される医薬組成物の一部の実施形態では、組成物は静脈内に投与される。本明細書に記載される医薬組成物の一部の実施形態では、組成物は皮下に投与される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を肝臓細胞、例えば肝細胞に標的化するリガンド（例えばＧａｌＮＡｃリガンド）を含むｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、リガンド（例えばＧａｌＮＡｃリガンド）を含む本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含み、医薬組成物は皮下に投与される。一部の実施形態では、リガンドは、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を肝臓細胞、例えば肝細胞に標的化する。
ある特定の実施形態では、医薬組成物、例えば本明細書に記載される組成物は、脂質製剤を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤はＬＮＰ製剤、例えばＭＣ３製剤である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＲＮＡｉ剤を特定の細胞、例えば肝臓細胞（例えば肝細胞）に標的化する。一部の実施形態では、脂質製剤はＬＮＰ１１製剤である。一部の実施形態では、組成物は静脈内に投与される。
別の実施形態では、医薬組成物は、例えば、４週間ごとに１回以下、３週間ごとに１回以下、２週間ごとに１回以下、または毎週１回以下の、本明細書に記載される投薬量レジメンによる投与用に製剤化される。別の実施形態では、医薬組成物の投与は、１カ月またはそれ以上、例えば、１、２、３、もしくは６カ月、または１年もしくはそれ以上維持され得る。
別の実施形態では、本開示において特徴とされるｉＲＮＡを含有する組成物、例えばＬＥＣＴ２を標的化するｄｓＲＮＡは、ＬＥＣＴ２発現と関連する障害（例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス）の第２の治療と組み合わせて投与される。ｉＲＮＡまたは本明細書に提供されるｉＲＮＡを含む組成物は、第２の治療の前、後、または第２の治療と同時に投与され得る。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは第２の治療の前に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは第２の治療の後に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは第２の治療と同時に投与される。
一部の実施形態では、第２の治療は、障害または障害の症状を処置するのに有効な非ｉＲＮＡ治療剤である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法によって処置される障害は、例えば腎臓におけるアミロイド沈着により、腎臓機能に影響を及ぼすＬＥＣＴ２アミロイドーシスである。一部のそのような実施形態では、ｉＲＮＡは、腎臓機能を補助する治療（例えば透析）と併せて投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、利尿剤、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗薬、および／または例えば腎臓機能を補助または管理するための透析と併せて投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法によって処置される障害は、肝臓におけるアミロイド沈着を含む、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスである。一部のそのような実施形態では、ｉＲＮＡは肝臓機能を補助する治療と併せて投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法によって処置される障害は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスであり、ｉＲＮＡは、アミロイドーシスによって影響を受けた臓器（複数可）の全てまたは一部の除去（例えばアミロイドーシスによって冒された腎臓または肝臓組織の全てまたは一部の切除）と併せて投与される。除去は、除去された臓器の全てまたは一部の置換と併せて（例えば腎臓または肝臓移植と併せて）実施されてもよい。
一態様では、本明細書に提供されるのは、細胞においてＬＥＣＴ２発現を阻害する方法であって、（ａ）本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を細胞に導入すること、および（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＬＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害することを含む方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、細胞（例えば本明細書に記載される細胞）においてＬＥＣＴ２発現を阻害する方法であって、（ａ）本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を細胞に接触させること、例えば導入すること、および（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、ＬＥＣＴ２タンパク質、またはＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡもしくはＬＥＣＴ２タンパク質の両方のレベルの減少を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害することを含む方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、細胞（例えば肝臓細胞、例えば肝細胞）においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する方法である。方法は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと細胞を接触させること、それによりＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害することを含む。本明細書で使用される場合、「接触させること」は、細胞を直接接触させること、ならびに細胞を間接的に接触させることを含む。例えば、ＲＮＡｉを含む組成物が対象に（例えば静脈内または皮下に）投与されると、対象内の細胞（例えば肝臓細胞）は接触され得る。
一部の実施形態では、方法は：
（ａ）互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞へと導入することであって、ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖および第２の配列を有するアンチセンス鎖を有し；アンチセンス鎖は、ＬＥＣＴ２をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補的な領域を有し、相補的な領域は３０ヌクレオチド以下、例えば１５～３０ヌクレオチド長、および一般に１９～２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＬＥＣＴ２を発現する細胞と接触すると、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上阻害する、導入すること；および
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＬＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を減少させるまたは阻害すること
を含む。
細胞においてＬＥＣＴ２発現を阻害する前述の方法の一部の実施形態では、細胞は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で処置される。一部の実施形態では、細胞は肝細胞である。
一部の実施形態では、細胞は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害の処置、防止および／または管理を必要とする対象に存在する。
一部の実施形態では、障害は、本明細書に記載される場合、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスである。
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２の発現は、例えば本明細書に記載される方法によって決定される場合、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害される。
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの発現は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２タンパク質の発現は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０００５～１ｎＭの範囲、例えば０．００１～０．２ｎＭの間、０．００２～０．１ｎＭの間、０．００５～０．０７５ｎＭの間、または０．０１～０．０５ｎＭの間のＩＣ５０を有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０２ｎＭ以下、例えば０．０００５～０．０２ｎＭの間、０．００１～０．０２ｎＭの間、０．００５～０．０２ｎＭの間、または０．０１～０．０２ｎＭの間のＩＣ５０を有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０１～１ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。
一部の実施形態では、細胞（例えば肝細胞）は、哺乳動物細胞（例えばヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類細胞）である。一実施形態では、対象は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する哺乳動物（例えばヒト）である。一実施形態では、導入されたｄｓＲＮＡは、細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡはＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するか、またはアミロイド沈着を阻害する（例えばアミロイド沈着を防止することによりまたはアミロイド沈着を減少させることにより、例えばアミロイド沈着のサイズ、数、または程度を減少させることにより）。阻害は、参照［例えば、処置されないまたは非標的化ｄｓＲＮＡ（例えばＬＥＣＴ２を標的化しないｄｓＲＮＡ）によって処置される対照］と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の阻害を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害することは、対象からの生体試料（例えば血清試料）におけるＬＥＣＴ２タンパク質レベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。
他の態様では、本開示は、ＬＥＣＴ２発現に関連する病態形成過程（例えばアミロイド沈着）を処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、対象、例えばそのような処置を必要とする患者に、有効（例えば治療または予防有効）量の本明細書に提供されるｄｓＲＮＡを投与することを含む。
一態様では、本明細書に提供されるのは、そのような処置を必要とする対象に治療有効量の本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）、または本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含む組成物を投与することを含む、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害（例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス）を処置および／または防止する方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、そのような処置を必要とする対象に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を投与することを含む、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害（例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス）を処置する方法であり、前記ｄｓＲＮＡは、１５～３０塩基対長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物、例えばヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物、例えば配列番号１または配列番号１の３７３位のヌクレオチドにＡからＧの置換を有するヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドと相補的である。一実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）にバリンをコードするｍＲＮＡを標的化する。
一実施形態では、本明細書に提供されるのは、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する対象を処置する方法であり、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を対象に投与することを含み、前記ｄｓＲＮＡは１５～３０塩基対長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物、例えばヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物、例えば配列番号１または配列番号１の３７３位のヌクレオチドにＡからＧの置換を有するヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドと相補的である。一実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、成熟ＬＥＣＴ２タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）にバリンをコードするｍＲＮＡを標的化する。
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡの投与は、患者においてＬＥＣＴ２発現と関連する障害の少なくとも１つの症状の重症度を緩和または軽減する。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害、例えばアミロイドーシス、例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシスの少なくとも１つの兆候または症状は、ある程度のアミロイド沈着またはＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）の存在もしくはレベルを含む。
一実施形態では、対象はＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する。別の実施形態では、対象は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを発症するリスクがある。
一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡまたは医薬組成物、例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡまたは医薬組成物は、対象に皮下または静脈内に投与される。
一部の実施形態では、処置することは障害の進行の防止を含む。一部の実施形態では、処置することは、細胞、例えば肝細胞におけるＬＥＣＴ２の発現または活性を阻害することまたは減少させることを含む。一部の実施形態では、処置することは、細胞におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の平均減少をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象におけるＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを測定することをさらに含む。一部の実施形態では、対象におけるＬＥＣＴ２のレベルを測定することは、対象からの生体試料（例えば、組織、血液、または血清試料）におけるＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２タンパク質またはＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、血液検査、イメージング検査、または肝臓もしくは腎臓生検を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、対象におけるＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを測定することは、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物による処置の前に実施される。一部の実施形態では、対象が参照レベルよりも高いＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを有すると決定されると、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物が対象に投与される。一部の実施形態では、対象におけるＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを測定することは、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物による処置の後に実施される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）はＬＮＰ製剤として製剤化される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）はＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態である。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、対象の０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＬＮＰ製剤として製剤化され、０．０５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＬＮＰ製剤として製剤化され、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態であり、０．５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態であり、１～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、方法は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するか、またはアミロイド沈着を阻害する（例えばアミロイド沈着を防止することによりまたはアミロイド沈着を減少させることにより、例えばアミロイド沈着のサイズ、数、または程度を減少させることにより）。阻害は、参照［例えば、処置されないまたは非標的化ｄｓＲＮＡ（例えばＬＥＣＴ２を標的化しないｄｓＲＮＡ）によって処置される対照］と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の阻害を含んでもよい。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０００５～１ｎＭの範囲、例えば０．００１～０．２ｎＭの間、０．００２～０．１ｎＭの間、０．００５～０．０７５ｎＭの間、または０．０１～０．０５ｎＭの間のＩＣ５０を有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０２ｎＭ以下、例えば０．０００５～０．０２ｎＭの間、０．００１～０．０２ｎＭの間、０．００５～０．０２ｎＭの間、または０．０１～０．０２ｎＭの間のＩＣ５０を有する。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０１～１ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＬＥＣＴ２関連障害（例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス）と関連する症状を改善する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、アミロイド沈着を阻害する（例えばアミロイド沈着を防止することによりまたはアミロイド沈着を減少させることにより、例えばアミロイド沈着のサイズ、数、または程度を減少させることにより）。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含む組成物は、投与レジメンに従って投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含む組成物は、繰り返し、例えば、投与レジメンに従って投与される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含む組成物は、皮下に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡはＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態である。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）はＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態であり、１～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）の少なくとも１つの鎖をコードするベクターである。
一態様では、本明細書に提供されるのは、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするベクターであり、前記ｄｓＲＮＡはＬＥＣＴ２をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な領域を含み、前記ｄｓＲＮＡは３０塩基対長以下であり、前記ｄｓＲＮＡは前記ｍＲＮＡを切断の標的にする。
一部の実施形態では、相補的な領域は少なくとも１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、相補的な領域は１９～２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、相補的な領域は２１～２３ヌクレオチド長である。
一態様では、ベクターは、細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するために提供される。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるようにｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるようにｉＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つの制御配列を含む。一実施形態では、ベクターは、ＬＥＣＴ２ ｉＲＮＡの少なくとも１つの鎖を含む。
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるようにベクターを含む細胞である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含有する細胞である。ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む。
全ての論文、特許出願、特許、および本明細書に記載した他の参照は、その全体が参照によって組み込まれる。
本開示の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
特許または出願ファイルは、色を施された少なくとも１つの図面を含有する。色図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開公報の複製物は、請求および必要な手数料の支払いに際して事務局により提供される。
図１は、ヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物配列（基準配列ＮＭ＿００２３０２．２ ＧＩ：５９８０６３４４、２０１３年４月１７日付の記録；配列番号１）を示す。 図２は、ヒトおよびカニクイザルの両方におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの領域を標的化するように設計された３種の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ：ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３４６１、およびＡＤ－４５４７４６の配列および化学を示す。各ｓｉＲＮＡについて、緑色により示される「Ｆ」は「２’フルオロ」修飾であり、黒色により示されるＯＭｅはメトキシ基であり、紫色により示されるＧＮＡはグリコール核酸であり、ＰＳはホスホノチオエート結合を指す。図２は、それぞれ、出現する順序において、配列番号８９７～９０２を開示する。 図３は、げっ歯類ＡＡＶモデルにおける３種の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの薬物動態を示す。肝臓におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの相対レベル、および血漿中の循環ＬＥＣＴ２タンパク質の相対レベル（残留パーセント）を、実験（ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ）群および対照（ＰＢＳ）群において処置後１４日目に定量した。 図４Ａ～４Ｃは、ＰＢＳ対照と比較した、カニクイザルにおいてＬＥＣＴ２を抑制することにおける３種の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの用量応答を示す。血漿ＬＥＣＴ２の相対レベル（血漿ＬＥＣＴ２タンパク質ノックダウン）を、各個々のサルの処置前タンパク質レベルについての正規化により定量した。 図５Ａ～５Ｂは、実験（ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ）群または対照（ＰＢＳ）群における初回処置の３、６、または１２カ月後の肝臓におけるラット（図５Ａ）またはマウス（図５Ｂ）ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの相対レベル（発現倍数の差）を示す。 図６Ａ～６Ｂは、カニクイザルにおける長期ＬＥＣＴ－２ノックダウンを評価する。図６Ａにおいて、初回処置の６カ月後のサルの肝臓におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの相対レベル（発現倍数の差）を、実験（ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８１７２５）群または対照（ＰＢＳ）群において定量した。図６Ｂにおいて、血漿ＬＥＣＴ２タンパク質の循環レベル（残留タンパク質パーセント）を、実験（ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８１７２５）群および対照（ＰＢＳ）群の処置前および最初の投薬後６カ月間各月に測定した。
ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知であるプロセスを介して、ｍＲＮＡの配列特異的分解を方向付ける。本明細書には、ｉＲＮＡおよびそれらを用いてＬＥＣＴ２遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、阻害する）方法が記載される。また、アミロイドーシス（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシス）などの、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害を処置するための組成物および方法も提供される。
本明細書において特徴とされる組成物のｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド長以下、すなわち１５～３０ヌクレオチド長、一般的に１９～２４ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域はＬＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物（本明細書では「ＬＥＣＴ２特異的ｉＲＮＡ」とも呼ばれる）の少なくとも一部と実質的に相補的である。このようなｉＲＮＡの使用は、本明細書に記載されるように、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的化された分解を可能にする。非常に低用量のＬＥＣＴ２特異的ｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを特異的および効率的に媒介することができ、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現の有意な阻害をもたらす。ＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを特異的および効率的に媒介することができ、例えば、細胞に基づくアッセイにおいて評価することができるＬＥＣＴ２遺伝子の発現の有意な阻害をもたらす。
以下の記載は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、阻害する）ためのｉＲＮＡを含有する組成物の作製および使用方法、ならびにＬＥＣＴ２遺伝子の発現に関連する障害を処置するための組成物および方法を開示する。
本明細書において特徴とされる医薬組成物の実施形態は、３０ヌクレオチド長以下、一般的に１９～２４ヌクレオチド長の領域を含むアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡを含み、この領域はＬＥＣＴ２遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。
一部の態様では、ＬＥＣＴ２ ｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するために組成物を使用する方法、およびＬＥＣＴ２遺伝子の発現に関連する障害（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシス）を処置するために医薬組成物を使用する方法が、本明細書において特徴とされる。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用と本節で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合は、本節における定義を優先するものとする。
本明細書において、「ＬＥＣＴ２」とは、白血球走化性因子２（白血球細胞由来ケモタキシン２、コンドロモジュリン－ＩＩ、ｃｈｍ－ＩＩまたはｃｈｍ２としても公知である）を指す。例えば、Yamagoe S et al. Genomics, 1998 Mar 15; 48(3):324-9を参照されたい。ＬＥＣＴ２は、新規の好中球走化性タンパク質として最初に同定され、軟骨細胞および骨芽細胞の増殖刺激因子であるコンドロモジュリンＩＩと同一である。ヒトＬＥＣＴ２遺伝子は、染色体５ｑ３１．１－ｑ３２にマッピングされた。前掲。
ヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿００２３０２．２（配列番号１）に見出され得る。マウスＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿０１０７０２．１およびＮＭ＿０１０７０２．２に見出され、ラットＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１０８４０５．１に見出され得る。
ヒトＬＥＣＴ２タンパク質は、分泌される１６ｋＤａタンパク質である。ＬＥＣＴ２タンパク質は、肝臓から分泌される。それは、ニワトリｍｙｂ誘導骨髄性１タンパク質のコンドロモジュリン反復領域と高い配列類似性を有する（www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=LECT2；２０１３年８月２９日にアクセスした）。ＬＥＣＴ２遺伝子の多型は、関節リウマチと関連している。前掲。
ＬＥＣＴ２は、脳および胃、ならびに肝臓を含む種々の組織において発現する。Koshimizu, Y & Ohtomi, M. (2010) Brain Res. 1311:1-11。肝臓以外の正常および疾患のヒト臓器ならびに組織におけるＬＥＣＴ２の発現を調べるために間接免疫ペルオキシダーゼ染色を用いた研究において、ＬＥＣＴ２は、一般的に血管、内皮細胞および平滑筋細胞、脂肪細胞、脳神経細胞、頂端扁平上皮細胞、副甲状腺細胞、汗腺および皮脂腺上皮、ハッサル小体および免疫造血組織における一部の単核細胞において発現することが見出された。このタンパク質は、一般的に陰性であったが、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋および骨格筋細胞、消化管の平滑筋細胞、および一部の組織の上皮細胞では時々陽性に染色された。Nagai et al. (1998) Pathol Int. 48(11):882-6。
ヒトＬＥＣＴ２遺伝子は、１８個のアミノ酸のシグナルペプチドを含む１５１個のアミノ酸をコードする。分泌タンパク質は、１３３個の残基を有する。遺伝子のエクソン３でのヌクレオチド１７２におけるＧ／Ａ多型（コドン変化ＧＴＣからＡＴＣ）が同定されており、プロセシングされていないタンパク質の５８位（または成熟タンパク質の４０位）におけるバリンまたはイソロイシンのいずれかの存在を構成する。Ｇ対立遺伝子の全体的な頻度は０．４７７であり、ヨーロッパ系の個体では０．６～０．７の範囲である。Benson, M.D. et al. (2008) Kidney International, 74: 218-222; Murphy, C. L. et al. (2010) Am J Kidney Dis, 56(6):1100-1107を参照されたい。ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの患者は、典型的にはＧ対立遺伝子についてホモ接合性である。理論に拘束されることを望むものではないが、埋め込まれたイソロイシン（Ａ対立遺伝子）側鎖のバリン（Ｇ対立遺伝子）への置換は、タンパク質を不安定にし、おそらくこのＬＥＣＴ２変異体のアミロイド形成傾向を構成し得ることが示唆されている。Murphy, C. L. et al. (2010) Am J Kidney Dis, 56(6):1100-1107。
本明細書で使用される場合、「ＬＥＣＴ２アミロイドーシス」または「ＡＬＥＣＴ２」は、ＬＥＣＴ２タンパク質（例えば、ＬＥＣＴ２タンパク質の任意の多型変異体）またはＬＥＣＴ２タンパク質の一部を含有するアミロイドまたはアミロイド線維の沈着を伴うアミロイドーシスを含む。ＬＥＣＴ２タンパク質は、変異体（例えば、突然変異体）ＬＥＣＴ２タンパク質であり得る。アミロイドーシスは全身性または局所性であり得る。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、腎臓および／または肝臓におけるアミロイド沈着を伴う。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は、各々、一般的に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、さらに後述する修飾ヌクレオチド、または代理置換部分も指し得ることが理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更させることなく、他の部分によって置換され得ることを十分に認識する。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドによって置換され得る。別の例では、オリゴヌクレオチド中のどこかにあるアデニンおよびシトシンを、それぞれグアニンおよびウラシルで置換して、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成することができる。このような置換部分を含有する配列は、本開示において特徴とされる組成物および方法に適している。
本明細書で使用される場合、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ」、「ｉＲＮＡ剤」、または「ＲＮＡｉ剤」とは、本明細書において定義される用語としてＲＮＡを含有し、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２発現の阻害をもたらす。ＡＬＥＣＴ２発現の阻害は、ＡＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡレベルの低減またはＡＬＥＣＴ２タンパク質レベルの低減に基づいて評価することができる。本明細書で使用される場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＡＬＥＣＴ２遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。配列の標的部分は、その部分でまたはその部分の近傍でｉＲＮＡ指向性切断のための基質として役立つのに少なくとも十分な長さである。例えば、標的配列は、一般的に、９～３６ヌクレオチド長、例えば、１５～３０ヌクレオチド長であり、それらの間の全ての下位範囲を含む。非限定的な例として、標的配列は、１５～３０ヌクレオチド、１５～２６ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１５～２２ヌクレオチド、１５～２１ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、１５～１９ヌクレオチド、１５～１８ヌクレオチド、１５～１７ヌクレオチド、１８～３０ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２１ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１９～３０ヌクレオチド、１９～２６ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、１９～２２ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、１９～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２５ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２３ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２１ヌクレオチド、２１～３０ヌクレオチド、２１～２６ヌクレオチド、２１～２５ヌクレオチド、２１～２４ヌクレオチド、２１～２３ヌクレオチド、または２１～２２ヌクレオチドであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「配列を含む鎖」とは、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、および別段の指示がない限り、用語「相補的」とは、第２のヌクレオチド配列に関して第１のヌクレオチド配列を記載するために使用される場合、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｏＣまたは７０ｏＣを１２～１６時間、続いて洗浄することを含み得る。生物体内で遭遇する場合がある生理学的に関連する条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な一組の条件を決定することができる。
ｉＲＮＡ内、例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内の相補的配列には、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成が含まれる。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的」と称することができる。しかしながら、本明細書において第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２個の配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらは、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介する遺伝子発現の阻害に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大３０塩基対の二重鎖についてハイブリダイゼーションの際に、１個または複数であるが、一般的には５、４、３または２個以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの際に、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長である１個のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長である別のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含み、本明細書に記載される目的のために「完全に相補的」とさらに称され得る。
本明細書で使用される場合、「相補的」配列はまた、非ワトソン－クリック塩基対、および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も、それらのハイブリダイズ能力に関する上記の要件が満たされる限り、含み得る、またはそれから全体的に形成され得る。このような非ワトソン－クリック塩基対には、限定されないが、Ｇ：Ｕ ＷｏｂｂｌｅまたはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対形成が含まれる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらの使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基マッチングに関して用いることができる。
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的である」ポリヌクレオチドとは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＡＬＥＣＴ２タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、配列がＬＥＣＴ２をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に対して実質的に相補的である場合、ポリヌクレオチドはＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。別の例として、ポリヌクレオチドは、配列がＬＥＣＴ２をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分と実質的に相補的である場合、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、標的ＲＮＡに関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると呼ばれる、２つのアンチパラレルおよび実質的に相補的な核酸鎖を含む、ハイブリダイズした二重鎖領域を有するＲＮＡ分子または分子複合体を含むｉＲＮＡを指す。二重鎖領域は、例えば、ＲＩＳＣ経路を介して、所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであり得るが、典型的には、９～３６塩基対長、例えば、１５～３０塩基対長の範囲である。９～３６塩基対の二重鎖を考慮して、二重鎖は、この範囲、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６、およびその間の任意の下位範囲、例えば、限定されないが、１５～３０塩基対、１５～２６塩基対、１５～２３塩基対、１５～２２塩基対、１５～２１塩基対、１５～２０塩基対、１５～１９塩基対、１５～１８塩基対、１５～１７塩基対、１８～３０塩基対、１８～２６塩基対、１８～２３塩基対、１８～２２塩基対、１８～２１塩基対、１８～２０塩基対、１９～３０塩基対、１９～２６塩基対、１９～２３塩基対、１９～２２塩基対、１９～２１塩基対、１９～２０塩基対、２０～３０塩基対、２０～２６塩基対、２０～２５塩基対、２０～２４塩基対、２０～２３塩基対、２０～２２塩基対、２０～２１塩基対、２１～３０塩基対、２１～２６塩基対、２１～２５塩基対、２１～２４塩基対、２１～２３塩基対、または２１～２２塩基対の任意の長さであり得る。Ｄｉｃｅｒおよび類似した酵素を用いたプロセシングによって細胞内で生成されるｄｓＲＮＡは、一般的に、１９～２２塩基対長である。ｄｓＤＮＡの二重鎖領域の一方の鎖は、標的ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的である配列を含む。二重鎖構造を形成する二本鎖は、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子由来であり得るか、または２つ以上の別々のＲＮＡ分子から形成され得る。二重鎖領域が単一の分子の二本鎖から形成される場合、分子は、二重鎖構造を形成する、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端の間にヌクレオチドの一本鎖（本明細書では「ヘアピンループ」と称される）によって分離された二重鎖領域を有することができる。ヘアピンループは、少なくとも１個の不対ヌクレオチドを含むことができ；一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別々のＲＮＡ分子によって構成される場合、これらの分子は、必要ないが、共有結合することができる。２本の鎖がヘアピンループ以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と呼ばれる。用語「ｓｉＲＮＡ」はまた、本明細書では、上記のようにｄｓＲＮＡを指すために使用される。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物に導入される「一本鎖ｓｉＲＮＡ」であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、次に標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般的に１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、その各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０１，３４８号およびLima et al., (2012) Cell 150: 883-894に記載される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列（例えば、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供される配列）のいずれも、本明細書に記載されるように、またはLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載される方法によって化学的に修飾されるように、一本鎖ｓｉＲＮＡとして用いることができる。
「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語は、天然に発現または見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されているまたは当技術分野において公知である１つまたは複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシドアナログまたは誘導体を含むＲＮＡのアナログおよび誘導体も含むことを当業者は認識する。厳密には、「リボヌクレオシド」はヌクレオシド塩基およびリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は１、２または３個のリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用されるものと同等であるとみなすことができる。ＲＮＡは、核酸塩基構造、リボース構造、またはリボース－リン酸骨格構造において、例えば本明細書において以下に記載されるように修飾することができる。しかしながら、リボヌクレオシドアナログまたは誘導体を含む分子は、二重鎖を形成する能力を保持しなければならない。非限定的な例として、ＲＮＡ分子はまた、限定されないが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステロール誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、非環式ヌクレオシド、グリコールヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートもしくはヌクレオシドを含む非天然塩基、またはこれらの任意の組合せを含む少なくとも１個の修飾リボヌクレオシドも含むことができる。あるいは、ＲＮＡ分子は、少なくとも２個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上であり、最大でｄｓＲＮＡ分子の全長を含むことができる。修飾は、ＲＮＡ分子中のそのような複数の修飾されたリボヌクレオシドの各々に対して同一である必要はない。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用することが意図される修飾ＲＮＡは、所要の二重鎖構造を形成する能力を有し、例えば、ＲＩＳＣ経路を介して標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするまたは媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
一態様では、修飾リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。そのような例では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、デオキシヌクレオシドオーバーハングを含む１個または複数のデオキシヌクレオシド、またはｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の１個または複数のデオキシヌクレオシドを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えば、一方または両方の鎖において、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上（しかし１００％ではない）のデオキシリボヌクレオシドのパーセンテージを含む。他の実施形態では、用語「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、天然に存在する二本鎖ＤＮＡ分子または１００％デオキシヌクレオシド含有ＤＮＡ分子）を包含しない。
一態様では、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付ける一本鎖ＲＮＡを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサー（Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485）として公知であるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される。ダイサーはリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であり、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡを処置する（Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補的アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることを可能にする（Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188）。したがって、一態様では、本開示は、標的遺伝子のサイレンシングをもたらすためにＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡに関する。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」とは、ｉＲＮＡの二重鎖構造、例えばｄｓＲＮＡから突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる場合、または逆の場合には、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１個のヌクレオチドのオーバーハングを含むことができる；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチドまたはそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含み得るまたはからなり得る。オーバーハング（複数可）は、センス鎖、アンチセンス鎖またはこれらの任意の組合せ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド（複数可）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖もしくはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端または両末端に存在することができる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０個のヌクレオチドオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０個のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１個または複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。
ｄｓＲＮＡに関して本明細書で使用される場合の用語「平滑化」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが存在しないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方または両方の末端は平滑化され得る。ｄｓＲＮＡの両端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは平滑末端と呼ばれる。明瞭にするために、「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、両端で平滑であり、すなわち、分子の両端でヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、このような分子はその全長にわたって二本鎖である。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」とは、ｉＲＮＡ、例えば、標的配列に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される場合、用語「相補的な領域」とは、本明細書で定義されるように、配列、例えば標的配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補的な領域が標的配列に対して完全には相補的でない場合、ミスマッチは分子の内部または末端領域にあり得る。一部の実施形態では、相補的な領域は、０、１、または２個のミスマッチを含む。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」とは、本明細書で使用される場合、その用語が本明細書において定義されるアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」とは、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの核酸を含む還元された水性内部を被覆する脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２４００９３号、第２００７／０１３５３７２号、および国際出願公開第２００９／０８２８１７号に記載される。これらの出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「細胞への導入」とは、ｉＲＮＡに言及する場合、当業者に理解されるように、細胞への取込みまたは吸収を促進するまたはもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取込みは、単独の拡散的もしくは活性な細胞プロセスを介して、または補助剤もしくはデバイスによって起こり得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されない；ｉＲＮＡはまた、「細胞に導入する」こともでき、細胞は生きている生物の一部である。このような場合、細胞への導入は、生物へのデリバリーを含む。例えば、インビボデリバリーのために、ｉＲＮＡを組織部位に注射するまたは全身的に投与することができる。インビボデリバリーはまた、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３２，４０１号および第５，６０７，６７７号、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号に記載されるものなどのβ－グルカンデリバリーシステムによっても可能である。細胞へのインビトロ導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当技術分野において公知である方法を含む。さらなるアプローチは、本明細書において以下に記載されるか、または当技術分野において公知である。
本明細書で使用される場合、用語「の発現をモジュレートする」とは、対照細胞におけるＬＥＣＴ２の発現と比較して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物で処置された細胞におけるＬＥＣＴ２遺伝子発現の少なくとも部分的な「阻害」または部分的な「活性化」を指す。対照細胞は、未処置細胞、または非標的対照ｉＲＮＡで処置された細胞を含む。
用語「活性化する」、「増強する」、「の発現を上方制御する」、「の発現を増加させる」などは、それらがＬＥＣＴ２遺伝子に言及する限り、本明細書では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指し、ＬＥＣＴ２遺伝子が転写され、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現が増加するように処置されている第１の細胞または細胞群から単離または検出され得るＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの量において、そのように処置されていない第１の細胞または細胞群（対照細胞）と実質的に同一である第２の細胞または細胞群と比較して増加することによって表される。
一実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％活性化される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子は、本開示において特徴とされるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％活性化される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、もしくは９５％またはそれ以上活性化される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子発現は、未処置細胞における発現と比較して、本明細書に記載されるｉＲＮＡで処置された細胞において、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上増加される。低分子量ｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42、ならびに米国特許出願公開第２００７／０１１１９６３号および米国特許出願公開第２００５／２２６８４８号に記載される。
用語「サイレンス」、「の発現を阻害する」、「の発現を下方制御する」、「の発現を抑制する」などは、それらがＬＥＣＴ２遺伝子を指す限り、本明細書では、例えば、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ発現、ＬＥＣＴ２タンパク質発現、またはＬＥＣＴ２遺伝子発現に機能的に連結した別のパラメーターに基づいて評価されるＬＥＣＴ２遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。例えば、ＬＥＣＴ２発現の阻害は、ＬＥＣＴ２遺伝子が転写され、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現が対照と比較して阻害されるように処置されている第１の細胞もしくは細胞群から単離または検出され得るＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの量の低減によって表され得る。対照は、第２の細胞または細胞群がそのように処置されていない（対照細胞）ことを除き、第１の細胞または細胞群と実質的に同一である第２の細胞または細胞群であり得る。阻害の程度は、通常、対照レベルのパーセンテージ、例えば、
Figure 2022546570000006
として表される。
あるいは、阻害の程度は、ＬＥＣＴ２遺伝子発現に機能的に連結されるパラメーター、例えば、ＬＥＣＴ２遺伝子によりコードされるタンパク質の量の低減に関して与えられ得る。ＬＥＣＴ２遺伝子発現に機能的に連結されるパラメーターの低減は、同様に、対照レベルのパーセンテージとして表すことができる。原則として、ＬＥＣＴ２遺伝子サイレンシングは、ＬＥＣＴ２を発現する任意の細胞において、構成的にまたはゲノム工学によってのいずれか、および任意の適切なアッセイによって決定することができる。
例えば、ある種の例では、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現は、本明細書に開示されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子は、本明細書に開示されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％抑制される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上抑制される。
本開示の文脈において、用語「処置する」、「処置」などは、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害に関連付けられる少なくとも１つの症状を予防する、低減するもしくは緩和することか、またはこのような障害の進行あるいは予測される進行を遅らせるもしくは逆行させることを意味する。例えば、本明細書において特徴とされる方法は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを処置するために使用される場合、アミロイド沈着を阻害し、アミロイドーシスの１つまたは複数の症状を低減するもしくは予防するか、または関連付けられる状態（例えば、ネフローゼ症候群または肝炎）のリスクもしくは重症度を低減させるのに役立つことができる。したがって、文脈上別の意味が明確に示されない限り、用語「処置する」、「処置」などは、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、例えば、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害および／または障害の症状の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）を包含することが意図される。
疾患マーカーまたは症状の文脈において「より低い」とは、任意の減少、例えば、このようなレベルにおける統計的または臨床的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。この減少は、そのような障害のない個体について正常範囲内であると承認されるレベルまで低下させることができる。
本明細書で使用される場合、語句「治療有効量」および「予防有効量」などは、ＬＥＣＴ２発現に関連する任意の障害もしくは病理学的プロセスの処置、予防または管理において治療利益を提供する量を指す。治療的に有効である特定の量は、例えば、障害または病理学的プロセスのタイプ、患者の病歴および年齢、障害または病理学的プロセスの段階、ならびに他の治療薬の投与など、当技術分野において公知である因子に依存して変化し得る。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬理学的に有効な量」、「治療有効量」または単に「有効量」とは、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じさせるのに有効なｉＲＮＡのその量を指す。例えば、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシス）を処置する方法において、有効量は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスに関連付けられる１つまたは複数の症状を低減させるのに有効な量、アミロイド沈着（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイド沈着）を阻害するのに有効な量、またはＬＥＣＴ２アミロイドーシスに関連付けられる状態を発症するリスクを低減させるのに有効な量を含む。例えば、所与の臨床的処置が、疾患または障害に関連付けられる測定可能なパラメーターの少なくとも１０％の低減がある場合に有効であると考えられる場合、その疾患または障害の処置のための薬物の治療有効量は、そのパラメーターの少なくとも１０％の低減を得るのに必要な量である。例えば、ＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡの治療有効量は、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのレベルまたはＬＥＣＴ２タンパク質のレベルを、測定可能な量、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減させることができる。
用語「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与のための担体を指す。そのような担体には、限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが含まれる。この用語は、特に、細胞培養培地を除外する。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、限定されないが、不活性な希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容される賦形剤を含む。適切な不活性な希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含み得るが、潤滑剤は、存在する場合、一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。所望であれば、錠剤は、消化管における吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの物質でコーティングすることができる。薬物製剤に含まれる薬剤は、さらに本明細書において以下に記載される。
数値または数値範囲を参照する場合、用語「約」とは、参照される数値または数値範囲が、実験的変動性内（または統計的実験誤差内）の近似であり、したがって、数値または数値範囲が、例えば、記述された数値または数値範囲の１％～１５％の間で変化し得ることを意味する。
ＩＩ．ｉＲＮＡ剤
本明細書には、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現をモジュレートする（例えば阻害する）ｉＲＮＡ剤が記載される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞または哺乳動物におけるＬＥＣＴ２遺伝子の発現を活性化する。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞または対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、ｄｓＲＮＡは、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現において形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド長以下であり、一般的に１９～２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＬＥＣＴ２遺伝子を発現する細胞と接触すると、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％阻害する。
ＬＥＣＴ２遺伝子の発現の調節（例えば、阻害）は、例えば、ＰＣＲもしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づく方法によって、またはウエスタンブロットなどのタンパク質に基づく方法によってアッセイすることができる。ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代培養細胞または対象由来の生体試料などの細胞培養におけるＬＥＣＴ２遺伝子の発現は、ｂＤＮＡもしくはＴａｑＭａｎアッセイなどのＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡレベルを測定することによって、または、例えばウエスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質レベルを測定することによって、アッセイすることができる。
ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的である相補性の領域を含む。他方の鎖（センス鎖）は、２つの鎖が、適切な条件下で組み合わされた場合にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である領域を含む。一般的に、二重鎖構造は、１５～３０個（両端を含む）、より一般的には１８～２５個（両端を含む）、さらにより一般的には１９～２４個（両端を含む）、最も一般的には１９～２１個（両端を含む）の塩基対長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１５～３０個（両端を含む）、より一般的には１８～２５個（両端を含む）、さらにより一般的には１９～２４個（両端を含む）、最も一般的には１９～２１個（両端を含む）のヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５～２０ヌクレオチド（両端を含む）長であり、他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２５～３０ヌクレオチド（両端を含む）長である。当業者が認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの標的化された領域は、多くの場合、より大きなＲＮＡ分子、しばしばｍＲＮＡ分子の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介する切断）のための基質となるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。９塩基対程度の短い二重鎖を有するｄｓＲＮＡは、ある状況下ではＲＮＡｉ指向性ＲＮＡ切断を媒介することができる。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、１５～３０ヌクレオチド長である。
当業者はまた、二重鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能的部分、例えば、９～３６の二重鎖領域、例えば、１５～３０塩基対であることを認識する。したがって、一実施形態では、切断のための所望のＲＮＡを標的化する、例えば、１５～３０塩基対の機能的二重鎖にプロセシングされるようになる程度まで、３０塩基対より大きい二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識する。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは天然に存在するｍｉＲＮＡではない。別の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きなｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞において生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているような例えば自動化ＤＮＡシンセサイザーを使用することにより、以下でさらに検討するように、当技術分野において公知である標準的方法によって合成することができる。
一実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子はヒトＬＥＣＴ２遺伝子である。別の実施形態では、ＬＥＣＴ２遺伝子は、マウスまたはラットＬＥＣＴ２遺伝子である。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供されるセンス配列から選択されるセンス配列を含むまたはからなるセンス鎖、および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列を含むまたはからなるアンチセンス鎖を含む。
一態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み、それによりセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供される配列から選択され、対応するアンチセンス鎖は、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供される配列から選択される。
これらの態様では、２つの配列のうちの１つは、２つの配列の他方と相補的であり、一方の配列は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現によって生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。したがって、ｄｓＲＮＡは２個のオリゴヌクレオチドを含み、１個のオリゴヌクレオチドはセンス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは対応するアンチセンス鎖として記載される。本明細書の他の箇所に記載され、当技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列は、別々のオリゴヌクレオチド上にあるのとは対照的に、単一の核酸分子の自己相補的領域として含有され得る。
当業者は、２０～２３塩基対であるが、特に２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に効果的であると称賛されていることを十分に認識している（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。しかしながら、より短いまたはより長いＲＮＡ二重鎖構造も同様に有効であり得ることを見出す者もいる。
上述の実施形態では、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの少なくとも１本の鎖を含むことができる。表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７の配列のうちの１つを有するより短い二重鎖が、一方または両方の末端においてわずか数ヌクレオチドを差し引いただけで、上述のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であることは合理的に予想することができる。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７の配列のうちの１つからの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８または１９個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８または１９個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂまたは３Ａ～３Ｂに提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６、または７に提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａまたは２Ｂに提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表２Ａまたは２Ｂに提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表３Ａまたは３Ｂに提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表３Ａまたは３Ｂに提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表６または７に提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表６または７に提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を含む。
一部のそのような実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供される配列の一部のみを含むが、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に提供される完全長配列を含むｄｓＲＮＡと同様に、ＬＥＣＴ２発現のレベルを阻害するのに等しく有効である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現レベルの阻害において、本明細書に開示される全配列を含むｄｓＲＮＡと比較して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以下の阻害により異なる。
表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、または５～７に提供されるｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介性切断に感受性であるＬＥＣＴ２転写物中の部位を同定する。したがって、本開示は、このような配列の１つ以内を標的化するｉＲＮＡをさらに特徴付ける。本明細書で使用される場合、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡがその特定の部位内の任意の場所で転写物の切断を促進する場合、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的化すると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般的に、ＬＥＣＴ２遺伝子において選択された配列に連続する領域から得られた付加的なヌクレオチド配列にカップリングされた、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｂ、または５～７に提供される配列のうちの１つからの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般的に１５～３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を方向付けるための、この範囲における特定の配列の適合性には広い変形形態がある。種々のソフトウェアパッケージおよび本明細書に記載されるガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的についての最適な標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１個のヌクレオチド）の「ウインドウ」または「マスク」が、標的配列として役立ち得るサイズ範囲の配列を同定するために標的ＲＮＡ配列上に置かれた文字通りまたは図形的［例えば、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ)を含む］である、経験的アプローチをとることもできる。配列「ウインドウ」を、最初の標的配列位置の上流または下流の１個のヌクレオチドに漸進的に移動させることによって、選択された任意の所与の標的サイズについて可能な配列の完全なセットが同定されるまでに、次の潜在的な標的配列を同定することができる。このプロセスは、同定された配列の系統的な合成および試験（本明細書に記載されるまたは当技術分野において公知であるアッセイを用いる）と組み合わせて、ｉＲＮＡ剤で標的化する場合、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介する、ＲＮＡ配列を最適に同定することができる配列を同定する。したがって、例えば、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７において同定された配列は、有効な標的配列を表すが、阻害効率のさらなる最適化は、所与の配列の上流または下流の１個のヌクレオチドを漸進的に「ウインドウを歩行すること」によって達成し、同等またはより良好な阻害特性を有する配列を同定できることが企図される。
さらに、同定された任意の配列、例えば、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７において、より長いもしくはより短い配列を生成するためのヌクレオチドの付加または除去のいずれか、およびその点から標的ＲＮＡのより長いもしくはより短いサイズのウインドウを上または下に歩行することによって生成されたそれらの配列を試験することによって、さらなる最適化を達成できることが企図される。さらに、このアプローチを、当技術分野において公知であるか、または本明細書に記載される阻害アッセイにおいて、標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験と組み合わせることにより、阻害の効率のさらなる改善をもたらすことができる。さらになお、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されるもしくは当技術分野において公知である修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加もしくは変化、または当技術分野において公知であるかおよび／もしくは本明細書において検討される他の修飾により調整され、発現阻害剤としての分子（例えば、血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通デリバリーの増強、特定の位置または細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加など）をさらに最適化することができる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列に対する１つまたは複数のミスマッチを含むことができる。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は相補的な領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチは、相補的な領域の５’末端または３’末端のいずれかからの最後の５個のヌクレオチド内に制限されることが好ましい。例えば、ＬＥＣＴ２遺伝子の領域に相補的である２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤ＲＮＡ鎖については、ＲＮＡ鎖は、一般的に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを含まない。本明細書に記載される方法または当技術分野において公知である方法を用いて、標的配列に対するミスマッチを含むｉＲＮＡがＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。ＬＥＣＴ２遺伝子の発現阻害における、ミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、ＬＥＣＴ２遺伝子における相補的な特定の領域が集団内で多型配列変形形態を有することが公知である場合に重要である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１～４個、一般的に１または２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端対応物と比較して、予想外に優れた阻害特性を有する。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡのＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に修飾される。本開示において特徴とされる核酸は、参照により本明細書に組み込まれる、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるものなどの、当技術分野において十分に確立された方法によって合成および／または修飾することができる。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆転連結など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆方向連結など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基による置換、不安定化塩基、またはパートナーの拡張レパートリーと塩基対形成する塩基による置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲートされた塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位もしくは４’位、または非環式糖）または糖の置換、ならびに（ｄ）骨格修飾、例えば、ホスホジエステル連結の修飾または置換が含まれる。本開示において有用なＲＮＡ化合物の具体例には、限定されないが、修飾された骨格を含むＲＮＡまたは天然のヌクレオシド間連結を含まないＲＮＡを含む。修飾された骨格を有するＲＮＡには、とりわけ、骨格にリン原子を有しないＲＮＡが含まれる。本明細書の目的のために、また、時として当技術分野において引用されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。特定の実施形態では、修飾ＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結アナログ、ならびに逆方向極性を有するものが含まれ、ヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結されている。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
上記リン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９５号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３１６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，６２５，０５０号；第６，０２８，１８８号；第６，１２４，４４５号；第６，１６０，１０９号；第６，１６９，１７０号；第６，１７２，２０９号；第６，２３９，２６５号；第６，２７７，６０３号；第６，３２６，１９９号；第６，３４６，６１４号；第６，４４４，４２３号；第６，５３１，５９０号；第６，５３４，６３９号；第６，６０８，０３５号；第６，６８３，１６７号；第６，８５８，７１５号；第６，８６７，２９４号；第６，８７８，８０５号；第７，０１５，３１５号；第７，０４１，８１６号；第７，２７３，９３３号；第７，３２１，０２９号；および米国特許ＲＥ３９４６４が含まれ、各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
その中にリン酸原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合したヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間連結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部から形成されている）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有する他のものを含む。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号が含まれ、各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡに使用するのに適したまたは意図された他のＲＮＡ模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格は新規の基により置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイズのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイズ性質を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置換される。核酸塩基は保持されており、直接的または間接的に骨格のアミド部のアザ窒素原子に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が含まれ、各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
本開示において特徴とされる一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格、特に上記で参照する米国特許第５，４８９，６７７号の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格としても公知である］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然のホスホジエステル骨格は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］ならびに上記で参照する米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本明細書において特徴とされるＲＮＡは、上記で参照する米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含むことができる。本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含むことができ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、ｎおよびｍは１から約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態性質を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬力学的性質を改善するための基および類似の性質を有する他の置換基のうちの１つを含む。一部の実施形態では、修飾は２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知である）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、２’－ジメチルアミノキシエトキシ、すなわち２’－ＤＭＡＯＥとしても公知であるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１個または複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）の非環式ヌクレオチド（またはヌクレオシド）を含む。ある種の実施形態では、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、鎖あたり５個未満の非環式ヌクレオチド（例えば、鎖あたり４個、３個、２個または１個の非環式ヌクレオチド）を含む。１個または複数の非環式ヌクレオチドは、例えば、センスもしくはアンチセンス鎖、または両方の鎖の二本鎖領域；ｉＲＮＡ剤のセンスもしくはアンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に見出すことができる。一実施形態では、１個または複数の非環式ヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、または両方の１～８位に存在する。一実施形態では、１個または複数の非環式ヌクレオチドが、アンチセンス鎖の５’末端から４～１０位（例えば、６～８位）でアンチセンス鎖に見出される。別の実施形態では、１個または複数の非環式ヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤の１つまたは両方の３’末端オーバーハングに見出される。
用語「非環式ヌクレオチド」または「非環式ヌクレオシド」は、本明細書で使用される場合、非環式糖を有する任意のヌクレオチドまたはヌクレオシド、例えば、非環式リボースを指す。例示的な非環式ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸塩基、例えば、天然に存在するまたは修飾核酸塩基（例えば、本明細書に記載される核酸塩基）を含むことができる。ある特定の実施形態では、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５）のいずれかの間の結合は、独立してまたは組み合わせて、ヌクレオチドには存在しない。一実施形態では、リボース環のＣ２－Ｃ３炭素間の結合は、例えば、非環式２’－３’－ｓｅｃｏ－ヌクレオチドモノマーは存在しない。他の実施形態では、Ｃ１－Ｃ２、Ｃ３－Ｃ４、またはＣ４－Ｃ５の間の結合は存在しない（例えば、１’－２’、３’－４’または４’－５’－ｓｅｃｏヌクレオチドモノマー）。例示的な非環式ヌクレオチドは、米国特許第８，３１４，２２７号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、非環式ヌクレオチドは、米国特許第８，３１４，２２７号の図１～２におけるモノマーＤ～Ｊのいずれかを含むことができる。一実施形態では、非環式ヌクレオチドは、以下のモノマーを含む：
Figure 2022546570000007
［式中、塩基は、核酸塩基、例えば、天然に存在するまたは修飾核酸塩基（例えば、本明細書に記載される核酸塩基）である］。
ある特定の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、特に、非環式ヌクレオチドを、別の部分、例えば、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ、コレステロールリガンド）、アルキル、ポリアミン、糖、ポリペプチドにカップリングさせることによって、修飾または誘導体化することができる。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤には、１個または複数の非環式ヌクレオチドおよび１個または複数のＬＮＡ（例えば、本明細書に記載されるＬＮＡ）が含まれる。例えば、１個または複数の非環式ヌクレオチドおよび／または１個または複数のＬＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方に存在し得る。一方の鎖中の非環式ヌクレオチドの数は、対向する鎖中のＬＮＡの数と同じでありまたは異なり得る。ある特定の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハングに位置する５個未満のＬＮＡ（例えば、４個、３個、２個または１個のＬＮＡ）を含む。他の実施形態では、１個または２個のＬＮＡは、センス鎖の二本鎖領域または３’オーバーハングに位置する。あるいは、または組み合わせて、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハングに５個未満の非環式ヌクレオチド（例えば、４個、３個、２個または１個の非環式ヌクレオチド）を含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’オーバーハングの１個または２個のＬＮＡ、およびｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の二重鎖領域（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から４～１０（例えば、６～８位））の１個または２個の非環式ヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、１個または複数の非環式ヌクレオチド（単独で、または１個または複数のＬＮＡに加えて）のｉＲＮＡ剤への包含は、（ｉ）オフターゲット効果の低減；（ｉｉ）ＲＮＡｉにおけるパッセンジャー鎖の関与の低減；（ｉｉｉ）その標的ｍＲＮＡに対するガイド鎖の特異性の増加；（ｉｖ）マイクロＲＮＡオフターゲット効果の低減；（ｖ）安定性の増加；または（ｖｉ）ｉＲＮＡ分子の分解に対する抵抗性の増加のうちの１つまたは複数（または全て）をもたらす。
他の修飾には、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－５アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）がある。同様の修飾はまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、または２’－５’連結ｄｓＲＮＡおよび５’末端ヌクレオチドの５’位置においても行うことができる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号が含まれ、本出願に共通して所有されるうちのいくつかのもの、およびこれらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野においてはしばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（疑似ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルならびに他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれる。
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に開示されるもの、The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されるもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されるもの、およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993に開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、本開示において特徴とされるオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、０．６～１．２℃だけ核酸二重鎖安定性を増加させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにより特には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、例示的な塩基置換である。
上述した修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のある特定の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、各々が参照により本明細書に組み込まれる、上述した米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；第６，０１５，８８６号；第６，１４７，２００号；第６，１６６，１９７号；第６，２２２，０２５号；第６，２３５，８８７号；第６，３８０，３６８号；第６，５２８，６４０号；第６，６３９，０６２号；第６，６１７，４３８号；第７，０４５，６１０号；第７，４２７，６７２号；および第７，４９５，０８８号、ならびに同様に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，６９２号が含まれる。
また、ｉＲＮＡのＲＮＡは、１個または複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上）のロックされた核酸（本明細書では「ロックドヌクレオチド」とも称される）を含むように修飾することができる。一実施形態では、ロックド核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、例えば、２’および４’炭素を接続する余分な架橋を含む。この構造は、効果的にリボースを３’－エンド構造に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の添加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増加させ、熱安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。
ロックド核酸の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、以下の：米国特許第６，２６８，４９０号；第６，６７０，４６１号；第６，７９４，４９９号；第６，９９８，４８４号；第７，０５３，２０７号；第７，０８４，１２５号；第７，３９９，８４５号、および第８，３１４，２２７号が含まれ、各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＬＮＡは、限定されないが、２’、４’－Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えば、Wengel et al.、国際ＰＣＴ出願国際公開第００／６６６０４号および国際公開第９９／１４２２６号を参照されたい）。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１個または複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上）のＧ－クランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、修飾シトシンアナログであり、この修飾は、二重鎖内の相補的グアニンのＷａｔｓｏｎ－ＣｒｉｃｋとＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面の両方を水素結合する能力を付与する。例えば、Lin and Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc., 120, 8531-8532を参照されたい。オリゴヌクレオチド内の単一のＧクランプアナログ置換は、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合、実質的に増強された螺旋熱安定性およびミスマッチ識別をもたらすことができる。そのようなヌクレオチドのｉＲＮＡ分子への包含は、核酸標的、相補的配列、または鋳型鎖に対する親和性および特異性の増大をもたらすことができる。
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定化する修飾は、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’’－リン酸、逆方向塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などを含むことができる。この修飾の開示は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１１／００５８６１号に記載される。
ｉＲＮＡモチーフ
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
によって表すことができ、
［式中、
ｉおよびｊは、各々独立して０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立して０～６であり；
各Ｎａは、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＮｂおよびＹは、同一の修飾を有さず；ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾のうちの１つのモチーフを表す。好ましくは、ＹＹＹは全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである］。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍で起こる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位（例えば、６、７、８；７、８、９；８、９、１０；９、１０、１１；１０、１１、１２；または１１、１２、１３位で起こり得る）でまたはその近傍で起こり得、カウントは、５’末端から１番目のヌクレオチドから開始し；または、５’末端から二重鎖領域内の１番目の対になったヌクレオチドから開始してもよい。
一実施形態では、ｉは１でありｊは０であり、またはｉは０でありｊは１であり、またはｉとｊはともに１である。したがって、センス鎖は以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）
によって表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｃ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｄ）で表される場合、各Ｎｂは、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは０、１、２、３、４、５または６個である。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じでありまたは異なり得る。
他の実施形態では、ｉは０でありｊは０であり、センス鎖は、式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）
によって表すことができる。
センス鎖が式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（ＩＩ）
によって表すことができ、
［式中、
ｋおよびｌは、各々独立して、０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々独立して、０～６であり；
各Ｎａ’は、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ’およびＹ’は、同一の修飾を有さず；
ならびに
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾のうちの１つを表す］。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍で起こる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１；１０、１１、１２；１１、１２、１３；１２、１３、１４；または１３、１４、１５位で起こり得、カウントは、５’末端から１番目のヌクレオチドから開始し；または、５’末端から二重鎖領域内の１番目の対になったヌクレオチドから開始してもよい。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位で起こる。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは全て２’－Ｏｍｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１でありｌは０である、ｋは０でありｌは１である、またはｋとｌの両方は１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｄ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態では、ｋは０でありｌは０であり、アンチセンス鎖は以下の式：
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉａ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同じでありまたは異なり得る。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、ＧＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで独立して修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表すことができる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔである場合、鎖の９、１０、および１１位で起こるＹＹＹモチーフを含み得、カウントは、５’末端から１番目のヌクレオチドから開始し、または、５’末端から二重鎖領域内の１番目の対になったヌクレオチドから開始してもよく、Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、さらに、二重鎖領域の反対側の末端におけるウイング修飾として、ＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフを含むことができ；ＸＸＸおよびＺＺＺは、各々独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位で起こるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフであることができ、カウントは、５’末端から１番目のヌクレオチドから開始し、または、５’末端から二重鎖領域内の１番目の対になったヌクレオチドから開始してもよく、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、さらに、二重鎖領域の反対側の末端におけるウイング修飾として、Ｘ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを含むことができ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のうちのいずれか１つによって表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のうちのいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本開示の方法において使用するＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は１４～３０個のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
によって表され、
［式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’は、各々独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
式中、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、各々独立して存在してもよくまたは存在しなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを表し；ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］。
一実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり；またはｉは１であり、ｊは０であり；またはｉは０であり、ｊは１であり；またはｉとｊはともに０であり；またはｉとｊはともに１である。別の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０であり；またはｋは１であり、ｌは０であり；ｋは０であり、ｌは１であり；またはｋとｌはともに０であり；またはｋおよびｌはともに１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式を含む：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立して、１～１０、１～７、１～５または１～４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ’の各々は、独立して、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）におけるＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じでありまたは異なり得る。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｙ’ヌクレオチドのうちの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成するか、またはＹヌクレオチドのうちの３つ全てが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドのうちの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成するか、またはＺヌクレオチドのうちの３つ全てが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドのうちの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成するか、またはＸヌクレオチドのうちの３つ全てが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾とは異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾とは異なり、および／またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾とは異なる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオネート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結される。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’はホスホロチオネート連結を介して隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’はホスホロチオエート連結を介して隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’がホスホロチオエート連結を介して隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二重鎖を含む多量体であり、二重鎖はリンカーによって接続される。リンカーは切断可能または切断不可能であり得る。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化することができる；または、二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位で同じ遺伝子を標的化することができる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される３、４、５、６つまたはそれ以上の二重鎖を含む多量体であり、二重鎖はリンカーによって連結される。リンカーは切断可能または切断不可能であり得る。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化することができる；または、二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位で同じ遺伝子を標的化することができる。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに連結され、３’末端の一方または両方は、リガンドにコンジュゲートされてもよい。薬剤の各々は、同一の遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化することができる；または薬剤の各々は、２つの異なる標的部位で同一の遺伝子を標的化することができる。
ｉＲＮＡコンジュゲート
本明細書に開示されるｉＲＮＡ剤は、コンジュゲートの形態であり得る。コンジュゲートは、ｉＲＮＡ分子内の任意の適切な位置、例えば、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端に結合され得る。コンジュゲートは、リンカーを介して結合されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、例えば、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みに影響する（例えば、増強する）ことによって、機能性を付与することができる、１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートに化学的に連結される。このような部分には、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－３－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）が含まれる。
一実施形態では、リガンドは、それが取り込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。一部の実施形態では、リガンドは、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞または臓器のコンパートメント、組織、臓器または生体の領域に対する増強した親和性を、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して提供する。典型的なリガンドは、二重鎖核酸における二重鎖対合に関与しない。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などの天然に存在する物質を含むことができる。リガンドはまた、組換えまたは合成の分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸でもあり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコライド）共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド重合体、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、疑似ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四塩、またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体も含むことができる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
一部の実施形態では、リガンドは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃリガンドである。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンドは、ｉＲＮＡを肝臓（例えば、肝細胞）に標的化するために使用される。ＧａｌＮＡｃリガンドのさらなる説明は、「炭水化物コンジュゲート」と題する節に記載される。
リガンドの他の例には、色素、インターカレーティング剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（例えば、ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが含まれる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的な親和性を有する分子、または、がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。それらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースも含むことができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ－κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、ミクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞への取込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スインホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
一部の実施態様では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターには、脂溶性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが含まれる。例示的なＰＫモジュレーターには、限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた血清タンパク質に結合することが公知であり、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中の多数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドはまた、リガンド（例えば、ＰＫ調節リガンド）として本開示に従うことができる。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）と結合するアプタマーはまた、本明細書に記載される実施形態におけるＰＫ調節リガンドとしての使用に適している。
本開示のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド（後述）への連結分子の結合に由来するものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドを使用することによって合成することができる。この反応性オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なリガンド、種々の保護基のいずれかを有するように合成されるリガンド、またはそれに結合した連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。
本開示のコンジュゲートにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術を介して、都合よく、日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかのベンダーによって販売される。当技術分野において公知であるそのような合成のための任意の他の手段を、追加的または代替的に使用することができる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することも知られている。
本開示のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド、およびリガンド－分子を有する配列特異的連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、またはすでに連結分子を有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、すでにリガンド部分を有するリガンド－ヌクレオチドもしくはヌクレオシド－コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有するビルディングブロックを利用して、適切なＤＮＡシンセサイザー上に組み立てることができる。
すでに連結部分を有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合、配列特異的連結ヌクレオシドの合成は、典型的に完了し、次に、リガンド分子を連結部分と反応させて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、標準的なホスホロアダイト、および市販され、通常オリゴヌクレオチド合成に使用される非標準的なホスホロアミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されたホスホロアミダイトを使用する自動シンセサイザーによって合成される。
脂質コンジュゲート
一実施形態では、リガンドは、脂質または脂質に基づく分子である。そのような脂質または脂質に基づく分子は、典型的には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合することができる。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートの標的組織への分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子はまた、リガンドとして用いることもできる。例えば、ネフロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増加させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化もしくは輸送を増加させることができ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。
脂質に基づくリガンドを用いて、コンジュゲートの標的組織への結合をモジュレートする、例えば、制御する（例えば、阻害する）ことができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓に標的化される可能性が低く、したがって、生体から除去される可能性が低い。ＨＳＡにより弱く結合する脂質または脂質に基づくリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に標的化することができる。
一実施形態では、脂質に基づくリガンドはＨＳＡと結合する。例えば、リガンドは、コンジュゲートの非腎臓組織への分布が増強されるように、十分な親和性でＨＳＡと結合することができる。しかしながら、親和性は、典型的には強くないため、ＨＳＡ－リガンド結合を逆行させることができない。
別の実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに弱く結合しまたは全く結合せず、その結果、コンジュゲートの腎臓への分布が増強される。腎細胞を標的化する他の部分はまた、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば、悪性型または非悪性型の、例えば、がん細胞の望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、またはがん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が含まれる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）もまた含まれる。
細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えば、らせん状細胞透過剤である。一実施形態では、薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはアンテナペティアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、インバートマー、非ペプチドまたは疑似ペプチド連結、およびＤ－アミノ酸の使用を含めて、それを修飾することができる。ヘリックス剤は、典型的にはαヘリックス剤であり、脂溶性および親油性相を有することができる。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも称される）は、天然ペプチドに類似した、定義された三次元構造にフォールディングすることができる分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチドおよびペプチド模倣体の結合は、例えば、細胞認識および吸収を増強することによって、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主としてＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、制約されたペプチドまたは架橋されたペプチドであり得る。別の代替において、ペプチド部分は、疎水性膜転座配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号９０３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦアナログ［例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９０４）］もまた、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を細胞膜を横切って運ぶことができる「デリバリー」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質［ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号９０５）］およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質［ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号９０６）］からの配列は、デリバリーペプチドとして機能し得ることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーから同定されたペプチド、または１ビーズ－１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991）などのＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。典型的には、取り込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に係留されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などの細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸から約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接的な配座特性を増加させるような構造的修飾を有することができる。以下に記載される構造的修飾のいずれかを利用することができる。
本開示の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状または環状であり得、特定の組織（複数可）への標的化を容易にするために、修飾され、例えば、グリコシル化またはメチル化され得る。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣薬は、合成ＲＧＤ模倣体と同様にＤ－アミノ酸を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的化する。
ＲＧＤペプチド部分を使用して、特定の細胞型、例えば、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的化することができる（Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍へのｄｓＲＮＡ剤の標的化を容易にすることができる（Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001）。典型的には、ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓への標的化を容易にする。ＲＧＤペプチドは、直鎖状または環状であり得、修飾され、例えば、グリコシル化またはメチル化されて、特定の組織への標的化を容易にし得る。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤をαＶβ３を発現する腫瘍細胞にデリバリーすることができる（Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001）。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、αヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１もしくは２個の優勢アミノ酸（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン、およびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）。
炭水化物コンジュゲート
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載されるように、核酸のインビボデリバリー、ならびにインビボでの治療的使用に適した組成物に有利である。本明細書で使用される場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を有する少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝鎖または環状であり得る）を有する１個または複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；またはその一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を有する少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝鎖または環状であり得る）を有する１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分を有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物は、糖（約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有する単糖、二糖、三糖、およびオリゴ糖）、および多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムを含む。具体的な単糖には、Ｃ５またはそれ以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖が含まれ；二糖および三糖には、２個または３個の単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）を有する糖が含まれる。
一実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、単糖を含む。一実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０６，０２２号に記載される。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡを特定の細胞に標的化するリガンドとして役立つ。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして役立つことによって、ｉＲＮＡを肝臓細胞に標的化する。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば、二価または三価の分枝鎖リンカーを介して結合され得る。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書に記載されるリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’末端に）コンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、下記である。
Figure 2022546570000008
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図に示されるように、リンカーを介して炭水化物コンジュゲートに結合され、ＸはＯまたはＳである。
Figure 2022546570000009
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１に定義され、下記に示されるように、Ｌ９６にコンジュゲートされる。
Figure 2022546570000010
一部の実施形態では、Ｌ９６は、以下の通りである。
Figure 2022546570000011
一部の実施形態では、本開示の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される。
Figure 2022546570000012
Figure 2022546570000013
Figure 2022546570000014
Figure 2022546570000015
Figure 2022546570000016
本明細書に記載される実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートは、限定されないが、以下を含む：
Figure 2022546570000017
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、限定されないが、ＰＫモジュレーターおよび／または細胞透過性ペプチドなどの、上述される１つまたは複数のさらなるリガンドをさらに含む。
一実施形態では、本開示のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本開示の組成物のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートおよび方法の非限定的な例としては、限定されないが、以下が挙げられる：
Figure 2022546570000018
Figure 2022546570000019
リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートまたはリガンドは、切断性または非切断性であり得る種々のリンカーを有するｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。
用語「リンカー」または「連結基」は、化合物の２つの部分を接続する、例えば、化合物の２つの部分を共有結合する有機部分を意味する。リンカーは、通常、直接結合、または原子、例えば、酸素や硫黄、単位、例えば、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、または原子の鎖、例えば、限定されないが、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリル、アルキニル複素環式アルケニル、アルキニル複素環式アルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリールを含み、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環式によって中断または終了することができ、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６、または８～１６個の原子である。
一実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）のいずれかに示される構造の基から選択される二価または三価の分枝鎖リンカーにコンジュゲートされる：
Figure 2022546570000020
［式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、独立して、各々の出現について０～２０を表し、繰り返し単位は、同一でありまたは異なり得；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々独立して、各々の出現について、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立して、各々の出現について、存在しない、アルキレン、置換アルキレンコリンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうちの１つまたは複数によって中断または停止することができ；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々独立して、各々の出現について、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－ＣＨ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 2022546570000021
またはヘテロシクリルであり］；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、リガンド、すなわち、各々の出現について、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し、ＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である。三価のコンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＸＸＶ）などの標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤との使用に特に有用である。
Figure 2022546570000022
［式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す］。
適切な二価および三価の分枝鎖リンカー基をコンジュゲートしているＧａｌＮＡｃ誘導体の例としては、限定されないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして上述した構造が挙げられる。
切断性連結基は、細胞外で十分に安定であるが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーが互いに保持している２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断性連結基は、標的細胞においてまたは第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するまたは表すように選択され得る）下で、対象の血液において、または第２の参照条件（例えば、血液または血清中に見出される条件を模倣するまたは表すように選択され得る）下よりも、標的細胞において、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍もしくはそれ以上、または少なくとも約１００倍速く切断される。
切断性連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解性分子の存在に対して感受性である。一般的に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内でより一般的であるか、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。そのような分解剤の例には、特定の基質に対して選択されるか、または基質特異性を有さない酸化還元剤、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または細胞内に存在するメルカプタンなどの還元剤であって、還元により酸化還元切断性連結基を分解することができるものを含む；エステラーゼ；酸性環境を生成することができるエンドソームまたは剤、例えば、ｐＨが５以下になるもの；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、およびホスファターゼとして作用することにより、酸切断性連結基を加水分解または分解することができる酵素が含まれる。
ジスルフィド結合などの切断性連結基は、ｐＨに感受性であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４であり、一方、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲で、より酸性が高いｐＨを有し、リソソームは、約５．０でさらに酸性が高いｐＨを有する。一部のリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断性連結基を有し、それによって、細胞内のリガンドから、または細胞の所望のコンパートメント内にカチオン性脂質を放出する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断性連結基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断性連結基のタイプは、標的化される細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結させることができる。肝臓細胞はエステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞よりも肝臓細胞において効率的に切断される。エステラーゼが豊富である他の細胞型には、肺、腎皮質、および精巣の細胞が含まれる。
ペプチド結合を含むリンカーは、肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富である細胞型を標的化する場合に用いることができる。
一般的に、候補切断性連結基の適切性は、候補連結基を切断する分解剤の能力（または条件）を試験することによって評価することができる。また、候補切断性連結基を、血液中での切断に抵抗する能力について、または他の非標的組織と接触した場合に、試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件の間の切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第１の条件は、標的細胞における切断を示すように選択され、第２の条件は、他の組織または生体液、例えば、血液または血清における切断を示すように選択される。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器もしくは組織培養、または全動物において行うことができる。無細胞または培養条件下での初期評価を行い、全動物におけるさらなる評価によって確認することは有用である。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）において、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く切断される。
酸化還元切断性連結基
一実施形態では、切断性連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断性連結基である。還元的切断性連結基の例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。候補切断性連結基が適切な「還元的切断性連結基」であるかどうか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤との使用に適しているかどうかを決定するために、本明細書に記載される方法を見つけることができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞、例えば、標的細胞において観察される切断速度を模倣する、当技術分野において公知である試薬を使用する他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価され得る。１つには、候補化合物は、血中で最大約１０％だけ切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）において、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内培地を模倣するように選択された条件下で、および細胞外培地を模倣するように選択された条件と比較して、標準酵素動力学アッセイを用いて決定することができる。
リン酸に基づく切断性連結基
別の実施形態では、切断性リンカーは、リン酸に基づく切断性連結基を含む。リン酸に基づく切断性連結基は、リン酸基を分解または加水分解する物質によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する物質の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸に基づく連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
酸切断性連結基
別の実施形態では、切断性リンカーは、酸切断性連結基を含む。酸切断性連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断性連結基は、ｐＨが約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、またはそれ未満）の酸性環境において、または一般的な酸として作用し得る酵素などの物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特異的な低ｐＨの細胞小器官が、酸による切断性連結基のための切断環境を提供することができる。酸切断性連結基の例としては、限定されないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸による切断性基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有することができる。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、または第三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、上述の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
エステルに基づく切断性連結基
別の実施形態では、切断性リンカーは、エステルに基づく切断性連結基を含む。エステルに基づく切断性連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルに基づく切断性連結基の例としては、限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断性連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ペプチドに基づく切断性連結基
さらに別の実施形態では、切断性リンカーは、ペプチドに基づく切断性連結基を含む。ペプチドに基づく切断性連結基は、細胞内でのペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドに基づく切断性連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生成するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドに基づく切断性基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成することができる。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を生成するためにアミノ酸間で形成される特別なタイプのアミド結合である。ペプチドに基づく切断性基は、一般的に、ペプチドおよびタンパク質を生成するアミノ酸間で形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドに基づく切断性連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述の方法と類似した方法を用いて評価することができる。ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；および第５，６８８，９４１号；第６，２９４，６６４号；第６，３２０，０１７号；第６，５７６，７５２号；第６，７８３，９３１号；第６，９００，２９７号；第７，０３７，６４６号；第８，１０６，０２２号が含まれ、それらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、上述の修飾のうちの１つより多い修飾が、単一の化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいてさえ取り込まれ得る。本開示はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物を含む。
本開示の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物、または「キメラ」は、各々が少なくとも１つのモノマー単位、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合のヌクレオチドで構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含むｉＲＮＡ化合物、例えば、ｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的には、ｉＲＮＡにヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増加、細胞取込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を付与するように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含む。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として役立つことができる。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に増強させる。結果として、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオネートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用した場合、より短いｉＲＮＡで同程度の結果がしばしば得られる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要に応じて、当技術分野において公知である関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出することができる。
ある特定の例では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みを増強するために、多数の非リガンド分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを行うための手順が、科学文献で利用可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えば、コレステロール（Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－３－Ｈ－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、 ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、もしくはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）を含んでいる。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列挙されている。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に、アミノ基を、適切なカップリング試薬または活性化試薬を用いてコンジュゲートされる分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体に依然として結合したＲＮＡを用いて、またはＲＮＡの切断後、溶液相で行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製は、典型的には、純粋なコンジュゲートを与える。
ｉＲＮＡのデリバリー
それを必要とする対象へのｉＲＮＡのデリバリーは、多数の異なる方法において達成することができる。インビボでのデリバリーは、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接的に行うことができる。あるいは、ｉＲＮＡをコードし、その発現を方向付ける１つまたは複数のベクターを投与することによって間接的にデリバリーを行うことができる。これらの代替案については、以下でさらに検討する。
直接的デリバリー
一般的に、核酸分子をデリバリーする任意の方法は、ｉＲＮＡとの使用に適合することができる（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144および国際公開第９４／０２５９５号を参照されたい）。しかしながら、ｉＲＮＡ分子をインビボで成功裏にデリバリーするために考慮すべき重要な３つの因子がある：（ａ）デリバリーされる分子の生物学的安定性、（２）非特異的な作用の防止、および（３）標的組織におけるデリバリーされた分子の蓄積。ｉＲＮＡの非特異的な作用は、局所投与、例えば、組織（非限定的な例として、腫瘍）への直接注射もしくは移植、または調製物の局所投与によって最小限にすることができる。処置部位への局所投与は、薬物の局所濃度を最大にし、薬剤によって害され得るもしくはさもなければ薬剤を分解し得る全身組織への作用物質の曝露を制限し、および投与されるｉＲＮＡ分子のより低い総用量を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡを局所的に投与した場合、遺伝子産物のノックダウンが成功したことを示している。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射（Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138）およびマウスにおける網膜下注射（Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216）によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内デリバリーはいずれも加齢黄斑変性の実験モデルにおいて血管新生を防止することが示された。さらに、マウスにｄｓＲＮＡの直接的な腫瘍内注射は腫瘍容積を低減し（Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274）、腫瘍担持マウスの生存を延長させることができる（Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523）。ＲＮＡ干渉はまた、直接的注射によるＣＮＳへの局所デリバリー（Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602）、および鼻腔内投与による肺への局所デリバリー（Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55）に成功したことも示されている。疾患の処置のためにｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡを修飾するか、または、代替として薬物デリバリーシステムを用いてデリバリーすることができ；両方の方法は、インビボにおけるエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防止するように作用する。
ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし、望ましくないオフターゲット効果も回避することができる。ｉＲＮＡ分子は、他の基、例えば、本明細書に記載される脂質または炭水化物基への化学的コンジュゲーションによって修飾することができる。このようなコンジュゲートを用いて、特定の細胞、例えば、肝臓細胞、例えば、肝細胞にｉＲＮＡを標的化することができる。例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは脂質（例えば、ＬＮＰ）製剤を用いて、ｉＲＮＡを特定の細胞、例えば、肝臓細胞、例えば、肝細胞に標的化することができる。
細胞への取込みを増強し、分解を防止するためのコレステロールなどの親油性基。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされたＡｐｏＢに対して方向付けられたｉＲＮＡをマウスに全身的に注射し、肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをもたらした（Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178）。ｉＲＮＡのアプタマーへのコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて、腫瘍成長を阻害し、腫瘍退縮を媒介することが示されている（McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015）。代替の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性デリバリーシステムなどの薬物デリバリーシステムを用いてデリバリーすることができる。正に帯電した陽イオンデリバリーシステムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電している）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜での相互作用も増強して、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合するか、またはｉＲＮＡを包む小胞もしくはミセル（例えば、Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい）を形成するように誘導され得る。小胞またはミセルの形成は、全身的に投与された場合、ｉＲＮＡの分解をさらに防止する。陽イオン性ＲＮＡ複合体を作製し、投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内にある（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身デリバリーに有用な薬物デリバリーシステムのいくつかの非限定的な例には、ＤＯＴＡＰ（Sorensen, DR., et al (2003), 前掲; Verma, UN., et al (2003), 前掲), Oligofectamine, "solid nucleic acid lipid particles" (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-11）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」（Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114）、カルジオリピン (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091）、ポリエチレンイミン（Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487）、およびポリアミドアミン（Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804）が含まれる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０号に記載される。
ｉＲＮＡをコードしたベクター
別の態様では、ＬＥＣＴ２遺伝子を標的化するｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., 国際ＰＣＴ出願公開第００／２２１１３号、Conrad、国際ＰＣＴ出願公開第００／２２１１４号、およびConrad、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に依存して、一過性（数時間から数週間のオーダーで）または持続性（数週間から数カ月またはそれ以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、組込みベクターまたは非組込みベクターであり得る。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミド（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）として遺伝することを可能にするように構築することができる。
ｉＲＮＡの個々の鎖または複数の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写され得る。例えば、ｄｓＲＮＡを生成するために２つの別々の鎖を発現させる場合、２つの別々の発現ベクターを（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）標的細胞に同時導入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、両方とも同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接続された逆方向反復として発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、典型的には、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞、例えば、脊椎動物細胞と適合性の発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡを発現させるための組換え構築物を生成することができる。真核細胞発現ベクターは、当技術分野において周知であり、多数の商業的供給源から入手可能である。典型的には、このようなベクターは、所望の核酸セグメントを挿入するための便利な制限部位を含む。ｉＲＮＡ発現ベクターのデリバリーは、例えば、静脈内または筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞への投与、続いて患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって全身性となり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質に基づく担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトすることができる。１週間またはそれ以上の期間にわたる標的ＲＮＡの異なる領域を標的化するｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションもまた、本開示によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、種々の公知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性のトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーのようなレポーターでシグナル伝達させることができる。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する抵抗性を、トランスフェクトされた細胞に与えるマーカーを用いて確実にすることができる。
本明細書に記載される方法および組成物とともに利用することができるウイルスベクターシステムには、限定されないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レトロウイルスベクター、例えば、限定されないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックスなどのポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリア痘または鶏痘；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが含まれる。複製欠損ウイルスはまた有利でもあり得る。異なるベクターが細胞のゲノムに取り込まれるまたは取り込まれないようになる。構築物は、所望であれば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含むことができる。あるいは、構築物を、エピソーム複製を可能にするベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物は、一般的に、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクターおよび構築物について考慮すべき他の態様は、以下にさらに記載される。
ｉＲＮＡのデリバリーに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるｉＲＮＡの発現に十分な調節エレメント（プロモーター、エンハンサーなど）を含む。調節エレメントは、構成的発現または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択され得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、ある特定の生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンに感受性である誘導性調節配列を用いることによって正確に制御することができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適したそのような誘導性発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学的誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による制御を含む。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図された使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。
特定の実施形態では、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要な成分を含む。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸のデリバリーを促進する１つまたは複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについてのより詳細は、例えば、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出すことができ、化学療法に対して幹細胞をより抵抗性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞にデリバリーするためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の参考文献は、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)である。使用が意図されるレンチウイルスベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１４３，５２０号；同第５，６６５，５５７号；および同第５，９８１，２７６号に記載されるＨＩＶに基づくベクターを含む。
アデノウイルスはまた、ｉＲＮＡのデリバリーに使用することが意図される。アデノウイルスは、特に魅力的な媒体であり、例えば、呼吸上皮に遺伝子をデリバリーするためのものである。アデノウイルスは、自然に呼吸器上皮に感染し、軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づくデリバリーシステムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を提示する。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入するためにアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT Publication WO94/12649; およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)に見出すことができる。本開示において特徴とされるｉＲＮＡを発現させるための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞にデリバリーするための方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用はまた意図される（Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); U.S. Pat. No. 5,436,146；米国特許第５，４３６，１４６号）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターからの２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡを発現させるための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、および標的細胞にベクターをデリバリーする方法は、Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願公開第９４／１３７８８号；および国際特許出願公開第９３／２４６４１号に記載され、全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
別の典型的なウイルスベクターは、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルスであり、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスである。
ウイルスベクターの向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることによって、または適宜、異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって修飾することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。ＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することにより、異なる細胞を標的化するように作製され得る；例えば、全体開示が参照により本明細書に組み込まれるRabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801を参照されたい。
ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中にベクターを含むことができるか、または遺伝子デリバリービヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子デリバリーベクターを組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子デリバリーシステムを産生する１つまたは複数の細胞を含むことができる。
ＩＩＩ．ｉＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシス）の処置に有用である。このような医薬組成物は、デリバリーの様式に基づいて処方製剤化される。例えば、組成物は、非経口デリバリー、例えば、静脈内（ＩＶ）デリバリーによる全身投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物（例えば、ＬＮＰ製剤）は、静脈内デリバリーのために製剤化される。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物（例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを含む組成物）は、皮下デリバリーのために製剤化される。
本明細書において特徴とされる医薬組成物は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与される。一般的に、ｉＲＮＡの適切な用量は、０．０１～２００．０ミリグラム／レシピエント体重ｋｇ／日の範囲であり、一般的に１～５０ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、１回用量あたり０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。医薬組成物は、１日１回投与することができ、またはｉＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で２回、３回、またはそれ以上の下位用量として投与することができ、さらには、持続注入または放出制御製剤を介したデリバリーを用いることもできる。その場合、１日の総投薬量を達成するために、各下位用量に含まれるｉＲＮＡはそれに対応して小さくなければならない。投薬単位はまた、数日間にわたるデリバリーのために、例えば、数日間にわたってｉＲＮＡの持続的放出を提供する従来の徐放性製剤を使用して、配合することもできる。持続放出製剤は、当技術分野において周知であり、本開示の薬剤とともに使用できるような、特定の部位における薬剤のデリバリーに特に有用である。この実施形態では、投薬単位は、対応する１日用量の倍数を含む。
ＬＥＣＴ２レベルにおける１回用量の効果は長く持続することができ、その後の投薬は、３、４、もしくは５日間隔以下、または１、２、３、もしく４週間間隔以下で行う。
当業者は、限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、および存在する他の疾患を含む、ある特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要な投薬量および時期に影響し得ることを理解する。さらに、組成物の治療有効量を用いた対象の処置は、単一の処置または一連の処置を含むことができる。開示により包含される個々のｉＲＮＡの有効投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法を用いて、または適切な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて行うことができる。
適切な動物モデル、例えば、ヒトＬＥＣＴ２を発現する導入遺伝子を含むマウスを用いて、ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの治療有効用量および／または有効な投薬量レジメンを決定することができる。
本開示はまた、本明細書において特徴とされるｉＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置が所望されるかどうか、および処置される領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は、局所的（例えば、経皮パッチによる）、肺、例えば、ネブライザーによるものを含めた粉末またはエアロゾルの吸入または通気；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射または注入；皮下、例えば、埋込みデバイスを介して；または頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内または脳室内投与が含まれる。
ｉＲＮＡは、赤血球を生成する組織などの特定の組織を標的化する方法でデリバリーすることができる。例えば、ｉＲＮＡは、骨髄、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）、リンパ腺、脾臓、肺（例えば、肺の胸膜）または脊椎にデリバリーされ得る。一実施形態では、ｉＲＮＡは骨髄にデリバリーされる。
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液剤および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉末剤または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。適切な局所製剤には、本開示において特徴とされるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所デリバリー剤と混合されているものが含まれる。適切な脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアリルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本開示において特徴とされるｉＲＮＡは、リポソーム内に封入され得るか、またはそれに複合体、特にカチオン性リポソームを形成し得る。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化され得る。適切な脂肪酸およびエステルには、限定されないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１－２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容されるそれらの塩が含まれる。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
リポソーム製剤
薬剤の製剤化のために研究され、使用されてきた微小エマルション以外にも、多くの組織化された界面活性剤構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、それらの特異性、および薬物デリバリーの観点からそれらが提供する作用の持続時間のために、大きな関心を集めている。本開示において使用される場合、用語「リポソーム」とは、球形二重層または複数の二重層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成された膜を有する単層または多層小胞である。水性部分は、デリバリーされるべき組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することができないが、インビボではマクロファージに取り込まれる。
無傷の哺乳動物の皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、このような細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点には、以下が含まれる；天然リン脂質から得られるリポソームは生体適合性および生分解性である；リポソームは広範囲の水および脂溶性薬物を取り込むことができる；リポソームは、それらの内部コンパートメント内のカプセル化薬物を代謝および分解から保護することができる（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水性容量である。
リポソームは、活性成分の作用部位への移動およびデリバリーに有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用した場合、リポソームは細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進行につれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用し得る細胞内で空になる。
リポソーム製剤は、多くの薬物のデリバリーの様式として広範な研究の焦点となっている。局所投与に関して、リポソームは、他の製剤よりもいくつかの利点を提示するという証拠が増えている。そのような利点には、投与された薬物の高い全身吸収に関連する副作用の低減、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、および皮膚に親水性と疎水性の両方の広範な薬物を投与する能力が含まれる。
いくつかの報告は、高分子量ＤＮＡを含む薬物を皮膚にデリバリーするリポソームの能力を詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。応用の大部分は、上部表皮の標的化をもたらした。
リポソームは大きく２つに分類される。陽イオン性リポソームは、負に帯電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂され、それらの内容物を細胞質に放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985）。
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、ＤＮＡとの複合体ではなくＤＮＡを取り込む。ＤＮＡと脂質はともに同じように帯電しているため、複合体形成ではなく反発が起こる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層にデリバリーするために使用されている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞において検出された（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）。
リポソーム組成物の１つの主要なタイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣ、および卵ＰＣから形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究は、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所デリバリーを評価している。インターフェロンを含有するリポソームの、モルモットの皮膚への適用は、皮膚ヘルペス潰瘍の低減をもたらしたが、他の手段（例えば、溶液またはエマルションとして）によるインターフェロンのデリバリーは効果がなかった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410）。さらに、追加の研究は、水性システムを用いてインターフェロンの投与に対するリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を試験し、リポソーム製剤は水性投与より優れていると結論付けた（du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265）。
非イオン性リポソーム系はまた、皮膚への薬物のデリバリー、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系におけるそれらの有用性を決定するためにも試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を用いて、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮にデリバリーした。結果は、このような非イオン性リポソーム系は、皮膚の異なる層へのシクロスポリン－Ａの沈着を促進するのに有効であることが示された（Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466）。
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細書で使用される場合、リポソームに取り込まれると、このような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命を増強させる、１つまたは複数の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソーム（Ａ）の小胞形成脂質部分の一部がモノシアログアングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含むもの、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、当技術分野において、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増強が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取込みの低減に由来するものと考えられる（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765）。
１つまたは複数の糖脂質を含む種々のリポソームが当技術分野において公知である。Papahadjopoulos et al.（Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Gabizon et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949）によって説明された。ともにAllen et al.の米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開第８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Webb et al.）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号（Lim et al.）に開示される。
１つまたは複数の親水性ポリマーを用いて誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当技術分野において公知である。Sunamoto et al.(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Illum et al.（FEBS Lett., 1984, 167, 79）は、ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングが、血中半減期の有意な増強をもたすことに留意した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Sears （米国特許第４，４２６，３３０号および第４，５３４，８９９号）に記載される。Klibanov et al.（FEBS Lett., 1990, 268, 235）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血液循環半減期の有意な増加を有することを実証する実験を記載した。Blume et al.（Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91）は、このような観察を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成される、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧに拡張した。それらの外表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、Fisherの欧州特許第０４４５１３１号Ｂ１および国際公開第９０／０４３８４号に記載される。ＰＥＧで誘導体化された１～２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Woodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）、およびMartin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第０４９６８１３号Ｂ１）により記載される。多数の他の脂質－ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、国際公開第９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（ともにMartin etal.）および国際公開第９４／２００７３号（Zalipsky et al.）に開示される。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al.）および米国特許第５，５５６，９４８号（Tagawa et al.）は、表面上に機能性部分を用いてさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載する。
核酸を含む多数のリポソームが当技術分野において公知である。Thierry et al.の国際公開９６／４００６２号は、リポソーム中に高分子量の核酸をカプセル化する方法を開示する。Tagawa et al.の米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質を結合させたリポソームを開示し、このようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることを主張する。Rahman et al.の米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化するある特定の方法を記載する。Love et al.の国際公開第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子に標的化されるｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。
トランスフェルソームはさらに別のタイプのリポソームであり、薬物デリバリービヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスフェルソームは、液滴よりも小さい孔を容易に透過することができるほど変形性が非常に高い脂質液滴として記載することができる。トランスフェルソームは、それらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは、自己最適化（皮膚の孔の形状に適応する）、自己修復、しばしば断片化せずに標的に到達し、しばしば自己負荷である。トランスフェルソームを作製するために、表面エッジ活性剤、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスフェルソームは、血清アルブミンを皮膚にデリバリーするために使用されている。トランスフェルソームを介した血清アルブミンのデリバリーは、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同程度に有効であることが示されている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームなどの製剤に広く適用される。天然と合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類しおよびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（「頭部」としても公知である）の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品における広い適用を見出し、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般的に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシル化物、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルはまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
界面活性剤分子が水に溶解または分散される場合に負電荷を担持する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤には、カルボキシレート、例えば、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキル硫酸塩およびエトキシル化アルキル硫酸塩、スルホネート、例えば、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホコハク酸塩、およびリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキル硫酸塩および石鹸である。
界面活性剤分子が水に溶解または分散された場合に正電荷を担持する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン界面活性剤には、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスで最もよく使われる化合物である。
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを担持する能力を有する場合、界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。
薬物製品、製剤およびエマルション中の界面活性剤の使用が概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 28）。
核酸脂質粒子
一実施形態では、本開示において特徴とされるＬＥＣＴ２ ｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化され、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」とは、ＳＰＬＰを含む安定な核酸－脂質粒子を指す。本明細書で使用される場合、用語「ＳＰＬＰ」とは、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長い循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与に極めて有用である。ＳＰＬＰには、ＰＣＴ出願国際公開第００／０３６８３号に記載されるカプセル化凝縮剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が含まれる。本開示の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。さらに、本開示の核酸－脂肪粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。核酸－脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；第５，９８１，５０１号；第６，５３４，４８４号；第６，５８６，４１０号；第６，８１５，４３２号；およびＰＣＴ出願国際公開第９６／４０９６４号に開示される。
一実施形態では、脂質対薬物比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲内である。
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリール－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソラン－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザネジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％または約４０モル％を含むことができる。
別の実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製することができる。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載される。
一実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％ＤＳＰＣ：４０％コレステロール：１０％ ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、６３．０±２０ｎｍの粒径、および０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質であり、限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物が含まれる。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、またはコレステロールが含まれる場合には約５８モル％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であり得、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物が含まれる。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧジステアリルオキシプロピル（Ｃ）８であり得る。粒子の凝集を妨げるコンジュゲートされた脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％または約２モル％であり得る。
一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、さらに、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％または約４８モル％のコレステロールを含む。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。
ＬＮＰ０１
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０５６，２３０号）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（例えば、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。エタノール中の各々の保存溶液は、下記：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌとして調製することができる。次に、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６ストック溶液を、例えば、４２：４８：１０モル比で合わせることができる。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％であり、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭであるように、水性ｄｓＲＮＡ（例えば、酢酸ナトリウムｐＨ ５中）と混合され得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合すると自然に形成される。所望の粒径分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）などの熱バレル押出機を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。いくつかの場合、押出工程を省略することができる。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４でリン酸緩衝生理食塩水と交換することができる。
Figure 2022546570000023
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際出願公開第２００８／０４２９７３号に記載される。
さらなる例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤は、以下の表に提供される。
Figure 2022546570000024
Figure 2022546570000025
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧまたはＰＥＧ－Ｃ１４）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧまたはＰＥＧ－Ｃ１８）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））含む製剤は、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年１月２９日に出願された米国仮出願第６１／１４８，３６６号；２００９年３月２日に出願された米国仮出願第６１／１５６，８５１号；２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第６１／１８５，７１２号；２００９年７月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２８，３７３号；２００９年９月３日に出願された米国仮出願第６１／２３９，６８６号；および２０１０年１月２９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、２００９年９月２２日に出願された米国仮出願第６１／２４４，８３４号、および２０１０年６月１０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、例えば、２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＣ１２－２００は、２００９年５月５日に出願された米国仮出願第６１／１７５，７７０号、および２０１０年５月５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
カチオン性脂質の合成
本開示において特徴とされる核酸－脂質粒子にて使用される化合物、例えば、カチオン性脂質などのいずれも、公知の有機合成技法により調製することができる。全ての置換基は、別に示されない限り、以下に定義される通りである。
「アルキル」とは、１～２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐、非環状または環状、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどを含み；一方で、飽和分岐アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどを含む。代表的な飽和環状アルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含み；一方で、不飽和環状アルキルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどを含む。
「アルケニル」とは、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上記に定義されるアルキルを意味する。アルケニルは、シスおよびトランスアイソマーの両方を含む。代表的な直鎖および分岐アルケニルは、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどを含む。
「アルキニル」とは、隣接炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上記に定義される任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１－ブチニルなどを含む。
「アシル」とは、以下に定義される通り、結合点における炭素がオキソ基により置換されている、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
「複素環」とは、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ窒素、酸素、および硫黄から独立的に選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５～７員単環式、または７～１０員二環式、複素環式環を意味し、ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は、酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよく、複素環式環は、上記複素環のいずれかがベンゼン環に融合されている二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合していてもよい。複素環は、以下に定義されるヘテロアリールを含む。複素環は、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル（ｈｙｄａｎｔｏｉｎｙｌ）、バレロラクタミル（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍｙｌ）、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。
「適宜置換されるアルキル」、「適宜置換されるアルケニル」、「適宜置換されるアルキニル」、「適宜置換されるアシル」、および「適宜置換される複素環」という用語は、置換された場合、少なくとも１つの水素原子が置換基により置換されていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置換されている。この点において、置換基は、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙを含み、ここで、ｎは、０、１、または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じまたは異なり、独立的に水素、アルキル、または複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つまたは複数によりさらに置換され得る。
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
一部の実施形態では、本開示において特徴とされる方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基法は、当業者に周知である（例えば、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照されたい）。簡潔に説明すると、本開示の関係における保護基は、官能基の不必要な反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、官能基に付加されて、ある特定の反応中その反応性を覆い隠し、その後、除去されて、元の官能基を曝露し得る。一部の実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の不必要な反応性を減少または除去する任意の基である。保護基は、当技術分野において周知の技法を使用して付加または除去することができる。
式Ａの合成
一実施形態では、本開示において特徴とされる核酸－脂質粒子は、式Ａのカチオン性脂質：
Figure 2022546570000026
｛式中、Ｒ１およびＲ２は、独立的に、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々は、適宜置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は、独立的に低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、共に、適宜置換される複素環式環を形成してもよい｝
を使用して製剤化される。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般的に、上記式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２により作製することができ、ここで、全ての置換基は、別に示されない限り、上記に定義される通りである。
Figure 2022546570000027
Ｒ１およびＲ２が、独立的に、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々が、適宜置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４が、独立的に低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４が、共に、適宜置換される複素環式環を形成してもよい、脂質Ａは、スキーム１に従って調製することができる。ケトン１および臭化物２は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができる。１および２の反応は、ケタール３を産生する。ケタール３の、アミン４による処理は、式Ａの脂質を産生する。式Ａの脂質は、式５の有機塩により対応するアンモニウム塩に変換することができ、ここで、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、ホスフェート、サルフェート、その他から選択されるアニオン対イオンである。
Figure 2022546570000028
あるいは、ケトン１出発材料は、スキーム２に従って調製することができる。グリニャール試薬６およびシアン化物７は、購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製することができる。６および７の反応は、ケトン１を産生する。ケトン１の、対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１において説明される通りである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ［すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート］の調製は、以下の通りであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温において一晩撹拌した。溶液を、希塩酸、続いて希水性重炭酸ナトリウムにより洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上において乾燥させ、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーター上にて除去した。残留物を、１～５％のメタノール／ジクロロメタン溶離勾配を使用してシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製した生成物を含有する画分を混合し、溶媒を除去し、無色の油（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を、以下のスキーム３を使用して行った。
Figure 2022546570000029
５１５の合成：
０℃において窒素気体下にて、２ネックＲＢＦ（１Ｌ）中の２００ｍｌ無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２モル）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６モル）の溶液をゆっくりと添加した。完全な添加後、反応混合物を室温まで温め、その後４時間加熱還流した。反応の進行を、ＴＬＣによりモニターした。反応完了（ＴＬＣによる）後、混合物を０℃まで冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の慎重な添加により抑制した。反応混合物を、室温において４時間撹拌し、濾過した。残留物を、ＴＨＦにより十分に洗浄した。濾過物および洗浄物を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃塩酸により希釈し、室温において２０分間撹拌した。真空下において揮発性物質を除去して、５１５の塩酸塩を白色固体として得た。収量: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (広幅, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
５１６の合成：
２５０ｍＬの２ネックＲＢＦ中の１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９モル）を添加し、窒素気体下において０℃まで冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７モル）の緩慢な添加後、反応混合物を室温まで温めた。反応完了（ＴＬＣにより２～３時間）後、混合物を、１Ｎ ＨＣｌ溶液（１ｘ１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１ｘ５０ｍＬ）により逐次的に洗浄した。その後、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上において乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗物質を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、５１６を粘着性の塊として得た。収量: 11g (89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４モル）を、シングルネック５００ｍＬ ＲＢＦ中の２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液に溶解し、それにＮ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２モル）、続いて４．２ｍＬのｔｅｒｔ－ブタノール中のＯｓＯ４の７．６％溶液（０．２７５ｇ、０．００１０８モル）を室温において添加した。反応の完了（約３時間）後、混合物を固体Ｎａ２ＳＯ３の添加により抑制し、得られる混合物を室温において１．５時間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（３００ｍＬ）により希釈し、水（２ｘ１００ｍＬ）、続いて飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ５０ｍＬ）溶液、水（１ｘ３０ｍＬ）により、最後に食塩水（１ｘ５０ｍＬ）により洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上において乾燥させ、溶媒を真空中において除去した。粗物質のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製により、ジアステレオマーの混合物を得、これを分取ＨＰＬＣにより分離した。収量: - 6 g粗製物
517A - ピーク-1 (白色固体), 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5が存在, HPLC-97.86%.
Ｘ－線により確認された立体化学。
５１８の合成：
化合物５０５の合成について説明された手技と類似した手技を使用して、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色の油として得た。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
化合物５１９の合成についての一般手技：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ中のＬＡＨの氷冷溶液（１Ｍ、２当量）に一滴ずつの様式にて添加した。完全な添加後、混合物を、４０℃において０．５時間にわたり加熱し、その後、氷浴上において再び冷却した。混合物を、飽和水性Ｎａ２ＳＯ４により慎重に加水分解し、その後、セライトを通して濾過し、油になるまで低減させた。カラムクロマトグラフィーにより、無色の油として得られた純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）を得た。13C NMR = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; エレクトロスプレー MS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+の分子量 計算値654.6, 実測値654.6.
標準法または押出フリー（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ）法のいずれかにより調製した製剤は、同様の様式において特徴付けることができる。例えば、製剤は、典型的に、目視により特徴付けられる。それらは、凝集物または沈殿物を含まない白みがかった半透明の溶液であるはずである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、米国）を使用する光散乱により測定することができる。粒子は、約２０～３００ｎｍ、例えば、４０～１００ｎｍの大きさであるべきである。粒径分布は、単様式であるべきである。製剤および捕捉した画分中の総ｄｓＲＮＡ濃度は、染料排除アッセイを使用して見積もられる。製剤化ｄｓＲＮＡの試料を、製剤破壊界面活性剤、例えば、０．５％トリトン－Ｘ１００の存在下または非存在下において、ＲＮＡ結合染料、例えば、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とインキュベートしてもよい。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線と比較した、界面活性剤を含有する試料からのシグナルにより決定することができる。捕捉した画分は、総ｄｓＲＮＡ含有量から、「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の非存在下におけるシグナルにより測定される）を引くことにより決定される。捕捉したｄｓＲＮＡのパーセントは、典型的に、８５％超である。ＳＮＡＬＰ製剤について、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的に、少なくとも約５０ｎｍ～少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ～少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ～少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与のための組成物および製剤は、粉末もしくは顆粒、微細粒子、ナノ微粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ、錠剤、または小型錠剤を含む。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤は、望ましい場合がある。一部の実施形態では、経口製剤は、本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡが１つまたは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート剤と共に投与される経口製剤である。好適な界面活性剤は、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩を含む。好適な胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムを含む。好適な脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそれらのモノグリセリド、ジグリセリド、もしくは薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）を含む。一部の実施形態では、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルを含む。本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含むか、または微粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体形成された顆粒状形態において経口デリバリーしてもよい。ｄｓＲＮＡ複合体形成剤は、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅ）、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンを含む。好適な複合体形成剤は、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ：ｐｏｌｙｔｈｉｏｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ｄｓＲＮＡについての経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国公開公報第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に説明されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳への）、髄腔内、脳室内、または肝内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤、ならびに他の好適な添加物、例えば、非限定的に、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、非限定的に、既製液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含む様々な成分から生成することができる。
本開示において特徴とされる医薬製剤は、単位剤形において便利に提示され得るが、医薬産業において周知の従来技法に従って調製され得る。そのような技法は、活性成分を医薬担体（複数可）または賦形剤（複数可）と関連させる工程を含む。一般的に、製剤は、活性成分を、液体担体もしくは細分された固形担体または両方と均一にかつ密接に関連させ、その後、必要であれば、製品を形作ることにより調製される。
本開示において特徴とされる組成物は、非限定的に、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ剤、ソフトゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかに製剤化され得る。また、組成物は、水性、非水性、または混合媒体中の懸濁液として製剤化してもよい。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加させる物質をさらに含有し得る。また、懸濁液は、安定化剤を含有し得る。
追加の製剤
エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化され得る。エマルションは、典型的には、別の通常直径０．１μｍを超える液滴の形態中に分散された液体の不均一系である（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335；Higuchi et al., in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照）。エマルションは、密に混合して互いに分散する、２つの非混和性液相を含む二相系であることが多い。一般に、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相がバルク油相中に微細分散して、微小な液滴として分散される場合、生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。あるいは、油相がバルク水相中に微細分散して、微小な液滴として分散される場合、生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相と、水相、油相のいずれか中の溶液として、またはそれ自体が別々の相として存在し得る、活性薬物に加えて、追加の成分を含有し得る。医薬賦形剤、例えば乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤も必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬エマルションは、２相以上を含む、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合、多重エマルションでもあり得る。そのような複合製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さい水滴を封入する多重エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入され、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかであるまたは無いことによって、特徴付けられる。エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内によく分散し、乳化剤または製剤の粘度の手段によりこの形態に維持される。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する他の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリーに分類され得る：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照）。
表面活性剤としても公知の合成界面活性剤は、エマルションの製剤において幅広い用途が見出されており、文献で概説されている（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類して選択する上で有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285参照）。
エマルション製剤で使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなど、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸着剤は、それらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わせて、粘稠な調製物中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固体が挙げられる。
多種多様な非乳化材料も、エマルション製剤に含まれ、エマルションの性質に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤および抗酸化剤が挙げられる（Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、天然に存在するガムおよび合成ポリマー、例えば、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相液滴周囲に強力な界面膜を形成することによって、および外部相の粘度を増大させることによって、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、いくつかの成分、例えば炭水化物、タンパク質、ステロールおよびリン脂質を含有することが多いため、これらの製剤には防腐剤を組み込むことが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経腸経路を介したエマルション製剤の適用、およびそれらを製造する方法が文献に概説されている（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199参照）。経口デリバリーのためのエマルション製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの観点からの効率のために、幅広く使用されている（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199参照）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料である。
本開示の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性であり、熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムとして定義され得る（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散し、次いで通常中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することによって、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化される、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体としても記載されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエマルションは、一般に、油、水、界面活性剤、共同界面活性物質、および電解質を含む３～５成分の組合せを介して調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填による（Schott, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271）。
状態図を利用する現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの製剤法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、限定はされないが、単独のまたは共同界面活性物質と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共同界面活性物質は、界面活性剤フィルムに浸透することにより界面流動性を増加させるのに働き、結果として界面活性剤分子間に生じる隙間による不規則フィルムを作り出す。しかしながら、マイクロエマルションは、共同界面活性物質の使用なしで調製され、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は当技術分野で公知である。水相は、典型的には、限定はされないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相としては、限定はされないが、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８－Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物吸収の増強の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）が、ペプチドを含む、薬物の経口バイオアベイラビリティを高めるために提案されている（例えば、米国特許第６１９１１０５号；同第７０６３８６０号；同第７０７０８０２号；同第７１５７０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205）。マイクロエマルションは、薬物可溶化改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化による予想される薬物吸収の増強、調製の容易さ、固体剤形よりも経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば、米国特許第６１９１１０５号；同第７０６３８６０号；同第７０７０８０２号；同第７１５７０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143参照）。マイクロエマルションは、それらの成分を環境温度で共に合わせた場合に、自然発生的に形成できることが多い。これは、熱不安定性薬物、ペプチドまたはｉＲＮＡを製剤する場合に、特に有利になり得る。マイクロエマルションはまた、美容および医薬用途の両方で、活性成分の経皮デリバリーに効果的であった。本開示のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身吸収の増大を促進し、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取込みを改善することが期待される。
本開示のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加の成分および添加剤も含有し、製剤の特性を改善し、本開示のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本開示のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらの各クラスについては、上記に考察した。
浸透促進剤
一実施形態では、本開示は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物の皮膚への効果的なデリバリーをもたらす。ほとんどの薬物は、イオン化および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されると、非親油性薬物でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜を横切る非親油性薬物の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤は親油性薬物の透過性も高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の１つに属するとして分類され得る（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92参照）。上記の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳細に記載する。
界面活性剤：本開示に関して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を減少させて、粘膜を通じたｉＲＮＡの吸収の増強をもたらす化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,； p.92参照）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化学エマルションが挙げられる。Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１ー２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、ならびにそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えばTouitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654参照）。
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935参照）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、用語「胆汁酸塩」は、胆汁の天然に存在する成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロナトリウム－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583参照）。
キレート化剤：本開示との関連で使用される場合、キレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、金属イオンを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡの吸収の増強をもたらす化合物と定義され得る。本開示における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを必要とし、したがってキレート化剤によって阻害されるため、キレート化剤はＤＮａｓｅ阻害剤としても寄与するというさらなる利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。好適なキレート化剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられる（例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51参照）。
非キレート化非界面活性剤：本明細書で使用される場合、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化剤としてまたは界面活性剤として優位でない活性を実証するが、にもかかわらず消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物として定義され得る（例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33参照）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）が挙げられる。
細胞レベルでのｉＲＮＡ取込みを増強する薬剤も、本開示の医薬および他の組成物に添加され得る。例えば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Junichi et al、米国特許第５７０５１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシンなどのポリカチオン性分子（Lollo et al.、国際公開第９７／３０７３１号）も、ｄｓＲＮＡの細胞内取込みを増強することが公知である。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば中でも、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１トランスフェクション試薬（ＮＥＷ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２－ピロールなどのピロール、アゾン、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含む、他の薬剤が、投与された核酸の浸透を増強するために利用され得る。
担体
本開示の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書で使用される場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわちそれ自体は生物活性を持たない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することにより、生物活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを減少させる、インビボ過程によって核酸として認識される、核酸またはその類似体を指すことができる。核酸および担体化合物の、典型的には後者の物質の過剰量での同時投与は、おそらく一般的な受容体に対する担体化合物と核酸間の競合により、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵器で回収される核酸量の実質的な減少をもたらし得る。例えば、肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）酸または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合、減少し得る（Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物にデリバリーするための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であってもよく、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせると、所望のバルク、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式をもとに選択される。典型的な薬学的担体としては、限定はされないが、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害反応しない、非経口投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用して、本開示の組成物を製剤化することもできる。好適な薬学的に許容される担体としては、限定はされないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与のための製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体もしくは固体油基剤中の核酸の溶液を含み得る。溶液は、緩衝液、希釈剤、およびその他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害反応しない、非経口投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤が使用され得る。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、限定はされないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
その他の成分
本開示の組成物は、医薬組成物中に従来見出される他の補助剤成分を、当技術分野で確立されたそれらの利用レベルでさらに含有し得る。したがって、例えば組成物は、さらなる適合性の薬学的に活性な材料、例えば痒み止め、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤を含有することができるか、または本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用なさらなる材料、例えば色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、濃化剤、および安定化剤を含有し得る。しかしながら、このような材料は、添加した場合、本開示の組成物の成分の生物活性に過度に干渉すべきではない。製剤は滅菌することができ、所望であれば、製剤の核酸（複数可）と有害に相互作用しない、例えば潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、香味料および／または芳香族物質などの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁液の粘土を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
一部の実施形態では、本開示において特徴とされる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能する１つまたは複数の生物剤を含む。そのような生物剤の例としては、ＬＥＣＴ２および少なくとも１つのＬＥＣＴ２結合パートナーの相互作用と干渉する薬剤を含む。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物で、標準的な薬学的手段によって決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が典型的である。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定するのに使用され得る。本開示において特徴とされる組成物の投与量は、通常、毒性がわずかであるまたは無いＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本開示において特徴とされる方法で使用される任意の化合物について、治療有効量は最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養中で決定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、または適当な場合には、標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデル中で策定されてもよい（例えばポリペプチドの濃度の低下を達成する）。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本開示において特徴とされるｉＲＮＡは、上記で考察されるそれらの投与に加えて、ＬＥＣＴ２発現に関連する疾患または障害の処置に有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与され得る。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＬＥＣＴ２遺伝子の発現に関連する障害を処置する方法
本開示は、ＬＥＣＴ２発現を阻害するためおよび／またはＬＥＣＴ２発現に関連する疾患、障害、もしくは病理学的プロセスを処置するためのＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡの使用に関する。
一態様では、ＬＥＣＴ２の発現に関連する障害の処置の方法であって、本明細書において開示されるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２発現を阻害する（減少させる）。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２発現を増加させる。
本明細書において使用される場合、「ＬＥＣＴ２発現に関連する障害」、「ＬＥＣＴ２発現に関連する疾患」、「ＬＥＣＴ２発現に関連する病理学的プロセス」その他は、ＬＥＣＴ２発現が変更している（例えば、正常レベルと比較して減少または増加している）任意の状態、障害、または疾患を含む。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現は、減少している。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現は、増加している。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現の減少または増加は、対象の血中において（例えば、血漿中において）検出可能である。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現の減少または増加は、対象からの組織試料において（例えば、腎臓試料または肝臓試料において）検出可能である。減少または増加は、障害の発症前の同じ個体において観察されたレベルと比較して、または障害を有しない他の個体（複数可）と比較して、評価してもよい。減少または増加は、身体の特定の器官、組織、または領域（例えば、腎臓または肝臓）に限定してもよい。
本明細書において使用される場合、本明細書において説明される方法に従って処置されるべき「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）または霊長類（例えば、サル）であってもよい。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
「それを必要とする対象」は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害を有するか、有することが疑われるか、または発症するリスクがある対象を含む。一部の実施形態では、対象は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害を有するか、または有することが疑われる。一部の実施形態では、対象は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害を発症するリスクがある。
一部の実施形態では、対象は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスについてのモデルとして働く動物である。
ＬＥＣＴ２アミロイドーシス
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害は、アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスである。ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、いくつかの臨床研究において説明されている。例えば、Benson, M.D. et al (2008) Kidney International, 74: 218-222；Murphy, C. L. et al. (2010) Am J Kidney Dis, 56(6):1100-1107；Larsen, C.P. et al. (2010) Kidney Int., 77(9):816-819；Holanda, D.G. et al. (20011) Nephrol. Dial. Transplant., 26 (1): 373-376；およびSethi, S. et al. (2012) Kidney International 82, 226-234（以下Sethi et al.)を参照されたい。
ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの臨床的および病理学的特徴は、アミロイド軽鎖（ＡＬ：ａｍｙｌｏｉｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）アミロイドーシスの臨床的および病理学的特徴に似ている。これらの症状は、例えば、腎臓疾患および腎不全の症状、例えば、体液貯留、膨化、および息切れを含む。アミロイドーシスは、心臓、末梢神経系、胃腸管、血液、肺、および皮膚に影響を及ぼし得る。心臓合併症は、例えば、心不全および不整脈を含む。他の症状は、例えば、卒中、胃腸障害、肝腫大、脾臓機能の低下、副腎および他の内分泌腺の機能低下、皮膚の色変化または増殖、肺の問題、出血および挫傷の問題、疲労、ならびに体重減少を含む。一部の実施形態では、本明細書において説明される方法は、本明細書において説明される１つまたは複数の症状の改善と関連付けられる。
アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの診断のための方法は、例えば、Leung, N. et al. (2010) Blood, published online September 4, 2012; DOI 10.1182/blood-2012-03-413682；Shiller, S.M. et al. (2011). Laboratory Methods for the Diagnosis of Hereditary Amyloidoses, Amyloidosis - Mechanisms and Prospects for Therapy, Dr. Svetlana Sarantseva (Ed.), ISBN: 978-953-307-253-1；Sethi et al.（上記を参照されたい）において、および米国特許出願公開第２０１００３２３３８１号において説明されている。
Sethi et al.により提供される結果に基づくと、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、腎アミロイドーシスの症例の顕著な割合を占める。腎生検および／または腎摘除術標本のレーザー顕微解剖および質量分析により研究した腎アミロイドーシスの１２７症例のうちの２６症例は、ＬＥＣＴ２アミロイド型の腎アミロイドーシスであると決定されたことを示す、Sethi et al.の表１を参照されたい。Sethi et al.は、また、アポリポタンパク質Ｅタンパク質および血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ：ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）が、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの全ての症例において存在したことをさらに報告している。
一部の実施形態では、アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、全身性アミロイド沈着に関与する。一部の実施形態では、アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、特定の組織または器官に（例えば、腎臓または肝臓に）完全にまたは優勢に局在化している。
一部の実施形態では、アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、遺伝性である。
一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、対象からの試料（例えば、生検試料）の分析を使用して診断される。一部の実施形態では、生検試料は、腎生検である。一部の実施形態では、試料は、腎摘除術試料である。一部の実施形態では、試料は、肝臓生検からまたは他の切除された肝臓組織からの試料である。一部の実施形態では、試料は、免疫組織化学、ＬＥＣＴ２イムノアッセイ、電子顕微鏡、レーザー顕微解剖、および質量分析のうちの１つまたは複数から選択される方法を使用して分析される。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、レーザー顕微解剖および質量分析を使用して診断される。
一部の実施形態では、アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、腎臓に影響を及ぼす、例えば、腎臓におけるアミロイド沈着に関与する。一部の実施形態では、腎臓機能は、アミロイドーシスの結果として損なわれている。一部の実施形態では、対象は、体液貯留、膨化、および息切れのうちの１つまたは複数に罹患している。一部の実施形態では、対象は、ネフローゼ症候群を有する。一部の実施形態では、対象は、タンパク尿に罹患している。一部の実施形態では、対象は、腎不全を有する。
一部の実施形態では、アミロイドーシス、例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、肝臓に影響を及ぼす、例えば、肝臓におけるアミロイド沈着に関与する。一部の実施形態では、肝臓機能は、アミロイドーシスの結果として損なわれている。一部の実施形態では、対象は、肝炎、例えば、慢性肝炎を有する。一部の実施形態では、肝炎は、ウイルス性肝炎である。
ＬＥＣＴ２アミロイドーシスは、メキシコ系アメリカ人において特に優勢であることが分かっており、また、成熟タンパク質の４０位（プロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）においてバリンをコードする、ＬＥＣＴ２遺伝子のＧ対立遺伝子についてのホモ接合性と関連付けられている。例えば、Benson, M.D. et al. (2008) Kidney International, 74: 218-222；Murphy, C. L. et al. (2010) Am J Kidney Dis, 56(6):1100-1107を参照されたい。
一部の実施形態では、対象は、メキシコ系の対象である。一部の実施形態では、対象は、メキシコ系アメリカ人である。
一部の実施形態では、対象は、成熟タンパク質の４０位（プロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）においてバリンをコードする、ＬＥＣＴ２遺伝子のＧ対立遺伝子を保有する。一部の実施形態では、対象は、Ｇ対立遺伝子についてホモ接合（Ｇ／Ｇ遺伝子型）である。一部の実施形態では、対象において発現するＬＥＣＴ２タンパク質は、成熟タンパク質の４０位において（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８において）バリンを有する。
一部の実施形態では、方法は、ＬＥＣＴ２発現を減少させる。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２発現における減少は、処置前の同じ個体のレベルと比較して、評価される。一部の実施形態では、方法は、処置した対象（または対象群）のＬＥＣＴ２発現レベルを、対照の対象（または対象群）、例えば、処置していない対象（または対象群）または対照の処置［例えば、ＬＥＣＴ２を標的化しないｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）］により処置した対象（または対象群）のレベルと比較することにより、ＬＥＣＴ２発現を減少させることが示される。
一部の実施形態では、方法は、アミロイド沈着、例えば、ＬＥＣＴ２タンパク質またはその部分を含むアミロイドの沈着を減少させる。一部の実施形態では、タンパク質は、野生型タンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、４０位において（本明細書において説明される通り、成熟分泌タンパク質の４０位、またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８において）バリンを含むヒトＬＥＣＴ２タンパク質またはその部分である。一部の実施形態では、方法は、アミロイド沈着物の大きさ、数、および／または程度を減少させる。
一部の実施形態では、方法は、アミロイド沈着と関連付けられる１つまたは複数の症状を減少させる。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、器官または組織におけるアミロイド沈着を阻害するためにｄｓＲＮＡを特定の器官または組織に標的化する形態において投与される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、肝臓に標的化される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを肝臓に（例えば、肝細胞に）標的化するリガンド、例えば、ＧａｌＮａｃリガンド（例えば、本明細書において説明されるＧａｌＮａｃリガンド）にコンジュゲートされる。
また、アミロイド沈着を減少させる方法であって、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡを、それを必要とする対象（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有するか、有することが疑われるか、または発症するリスクがある対象）に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、アミロイド沈着の大きさ、数、および／または程度を減少させる（例えば、防止または低下させる）。アミロイド沈着物の大きさ、数、および／または程度は、当技術分野において公知の任意の方法（例えば、イムノアッセイ、免疫組織化学、質量分析）を使用して評価することができる。アミロイド沈着の低減は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上のアミロイド沈着（例えば、アミロイド沈着物の大きさ、数、および／または程度）の減少に関与し得る。
本明細書において提供される方法において、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）およびその組成物は、治療有効量において投与される。ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの投与の治療効果は、例えば、適切な対照との比較により確立することができる。例えば、アミロイド沈着の阻害は、例えば、アミロイドーシス（例えば、ＬＥＣＴ２アミロイドーシス）を有する患者群において、任意の適切なパラメーター（例えば、アミロイド沈着の大きさ、数、または程度を評価するパラメーター）の、適切な対照群における同じパラメーターとの比較により、確立することができる。対照群（例えば、交差設計における同様の個体群または同じ個体群）は、例えば、処置していない集団、従来型処置により処置した集団；プラセボまたは非標的化ｉＲＮＡにより処置した集団；等を含み得る。
リウマチ性関節炎
また、リウマチ性関節炎は、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害である。特に、日本人集団において、成熟タンパク質の４０位（またはプロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）においてイソロイシンをコードする、ＬＥＣＴ２遺伝子の１つのＡ対立遺伝子を所有すると、リウマチ性関節炎を発症する全体的リスクが増加することが見出されたことが分かった。２つのＡ対立遺伝子を所有することは、疾患重症度と強く関連付けられた。Kameoka, Y. et al. (2000) Arth Rheum, 43(6):1419-20を参照されたい。
本明細書において提供される方法の１つの実施形態では、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害は、リウマチ性関節炎である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リウマチ性関節炎を有する対象においてＬＥＣＴ２発現を阻害する。一部のそのような実施形態では、ｄｓＲＮＡは、滑膜組織において、および／または滑液由来細胞（例えば、単核細胞および線維芽細胞）においてＬＥＣＴ２発現を阻害する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、成熟タンパク質の４０位（プロセシングされていないタンパク質のアミノ酸５８）においてイソロイシンをコードするｍＲＮＡを標的化する。
肝損傷
ＬＥＣＴ２発現は、急性肝損傷中に増加し得る。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害は、急性肝損傷である。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ＬＥＣＴ２発現をモジュレートする（例えば、増加または減少させる）。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、肝臓においてＬＥＣＴ２発現をモジュレートする。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、肝臓においてＬＥＣＴ２発現を減少させる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、肝臓においてＬＥＣＴ２発現を増加させる。
併用療法
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＬＥＣＴ２発現と関連する障害（例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス）またはそのような障害の症状の処置に有効であることが公知の第２の治療（例えば１つまたは複数の追加の治療）と組み合わせて投与される。ｉＲＮＡは、第２の治療の前、後、または第２の治療と同時に投与され得る。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは第２の治療の前に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは第２の治療の後に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは第２の治療と同時に投与される。
第２の治療は、追加の治療剤であり得る。ｉＲＮＡおよび追加の治療剤は、同じ組成物内で組み合わせて投与され得、または追加の治療剤は別々の組成物の一部として投与され得る。
一部の実施形態では、第２の治療は、障害または障害の症状を処置するのに有効な非ｉＲＮＡ治療剤である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法によって処置される障害は、例えば腎臓におけるアミロイド沈着により、腎臓機能に影響を及ぼすＬＥＣＴ２アミロイドーシスである。一部のそのような実施形態では、ｉＲＮＡは、腎臓機能を補助する治療（例えば透析、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、または透析）と併せて投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法によって処置される障害は、肝臓におけるアミロイド沈着を含むＬＥＣＴ２アミロイドーシスである。一部のそのような実施形態では、ｉＲＮＡは肝臓機能を補助する治療と併せて投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法によって処置される障害は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスであり、ｉＲＮＡは、アミロイドーシスによって影響を受けた臓器（複数可）の全てまたは一部の除去（例えばアミロイドーシスによって影響を受けた腎臓または肝臓組織の全てまたは一部の切除）と併せて投与される。除去は、除去された臓器の全てまたは一部の置換と併せて（例えば腎臓または肝臓移植と併せて）実施されてもよい。
投与量、経路、およびタイミング
対象（例えばヒト対象、例えば患者）は、治療量のｉＲＮＡを投与され得る。治療量は、例えば０．０５～５０ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、治療量は、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、または２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡであり得る。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、標的臓器、例えば肝臓へのデリバリーのために製剤化される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、脂質製剤、例えば本明細書に記載されるＬＮＰ製剤として製剤化される。一部のそのような実施形態では、治療量は、０．０５～５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡである。一部の実施形態では、脂質製剤、例えばＬＮＰ製剤は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）はＬＮＰ製剤として製剤化され、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される（例えば静脈内に投与される）。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、一定時間、例えば５分、１０分、１５分、２０分、または２５分間にわたり静脈内注入によって投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態である。一部のそのような実施形態では、治療量は、０．５～５０ｍｇ、例えば０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡである。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは皮下に投与される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態であり、１～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される（例えば皮下に投与される）。
一部の実施形態では、投与は、例えば定期的に、例えば１カ月、２カ月、３カ月、４カ月またはそれ以上の間毎日、隔週（つまり２週間ごと）繰り返される。最初の処置レジメン後、処置は、より少ない頻度で投与され得る。例えば、３カ月間隔週での投与後、投与は１カ月、６カ月、または１年もしくはそれ以上あたり１回繰り返され得る。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は２以上の用量で投与される。一部の実施形態では、次の用量の数または量は、所望の効果、例えばアミロイド沈着の阻害の達成、または治療もしくは予防効果、例えば障害と関連する１つまたは複数の症状の減少または防止の達成による。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤はスケジュールに従って投与される。例えば、ｉＲＮＡ剤は、１週間あたり１回、１週間あたり２回、１週間あたり３回、１週間あたり４回、または１週間あたり５回投与され得る。一部の実施形態では、スケジュールは定期的に間隔を空けた投与、例えば１時間に１度、４時間ごと、６時間ごと、８時間ごと、１２時間ごと、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、毎週、隔週、または毎月を含む。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、所望の効果を達成するのに必要とされる頻度で投与される。
一部の実施形態では、スケジュールは、間隔を空けない投与の後、薬剤が投与されない長期間を含む。例えばスケジュールは、比較的短い期間（例えば約６時間ごと、約１２時間ごと、約２４時間ごと、約４８時間ごと、または約７２時間ごと）で投与される用量の最初のセット後、ｉＲＮＡ剤が投与されない長期間（例えば約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、または約８週間）を含み得る。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、始めは１時間ごとに投与され、後に、長い間隔で（例えば毎日、毎週、隔週、または毎月）投与される。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、始めは毎日投与され、後に、長い間隔で（例えば毎週、隔週、または毎月）投与される。ある特定の実施形態では、長い間隔は経時的に増加し、または所望の効果の達成に基づいて決定される。
ｉＲＮＡの全用量の投与前に、患者は少ない用量、例えば５％注入用量を投与され、有害効果、例えばアレルギー反応、または脂質レベルもしくは血圧の上昇をモニターされ得る。別の例では、患者は、望ましくない効果をモニターされ得る。
ＬＥＣＴ２遺伝子の発現をモジュレートする方法
さらに別の態様では、本開示は、例えば細胞においてまたは対象において、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現をモジュレートする（例えば阻害または活性化する）方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、エクスビボ、インビトロ、またはインビボである。一部の実施形態では、細胞は肝臓にある（例えば肝細胞）。一部の実施形態では、細胞は対象にある（例えばヒトなどの例えば哺乳動物、）。一部の実施形態では、対象（例えばヒト）は、本明細書に記載されるＬＥＣＴ２発現と関連する障害のリスクがあるまたはＬＥＣＴ２発現と関連する障害であると診断される。
一実施形態では、方法は、細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で、細胞を本明細書に記載されるｉＲＮＡと接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「接触させること」は、細胞を直接接触させること、ならびに細胞を間接的に接触させることを含む。例えば、ｉＲＮＡを含む組成物が対象に（例えば静脈内または皮下に）投与されると、対象内の細胞は接触され得る。
ＬＥＣＴ２遺伝子の発現は、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、ＬＥＣＴ２タンパク質の発現のレベル、またはＬＥＣＴ２遺伝子の発現のレベルと機能的に関連する別のパラメーターのレベルに基づいて評価され得る。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２の発現は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、０．００１～０．０１ｎＭ、０．００１～０．１０ｎＭ、０．００１～１．０ｎＭ、０．００１～１０ｎＭ、０．０１～０．０５ｎＭ、０．０１～０．５０ｎＭ、０．０２～０．６０ｎＭ、０．０１～１．０ｎＭ、０．０１～１．５ｎＭ、０．０１～１０ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。ＩＣ５０値は、適切な対照値、例えば非標的化ｉＲＮＡのＩＣ５０に対して正規化され得る。
一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるｉＲＮＡを細胞に導入すること、および細胞を、ＬＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害することを含む。
一実施形態では、方法は、延長された期間、例えば少なくとも２、３、４日またはそれ以上、例えば１週間、２週間、３週間、または４週間もしくはそれ以上の間など、標的ＬＥＣＴ２遺伝子の発現が低下するように、本明細書に記載される組成物、例えばＬＥＣＴ２を標的化するｉＲＮＡを含む組成物を、哺乳動物に投与することを含む。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２の発現の低下は、１回目の投与の１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、または２４時間以内に検出可能である。
別の実施形態では、方法は、標的ＬＥＣＴ２遺伝子の発現が、例えば未処置の動物と比較して少なくとも１０％増加するように、本明細書に記載される組成物を、哺乳動物に投与することを含む。一部の実施形態では、ＬＥＣＴ２の活性化が、延長された期間、例えば少なくとも２、３、４日またはそれ以上、例えば１週間、２週間、３週間、４週間またはそれ以上にわたり起こる。理論に縛られることを望まないが、ｉＲＮＡは、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ転写物を安定化すること、ゲノムのプロモーターと相互作用すること、および／またはＬＥＣＴ２発現の阻害剤を阻害することによってＬＥＣＴ２発現を活性化することができる。
方法に有用なｉＲＮＡおよび本開示において特徴とされる組成物は、ＬＥＣＴ２遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的化する。ｉＲＮＡを使用するＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書に他に記載されるように調製および実施され得る。
一実施形態では、方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み、ｉＲＮＡは、処置される対象、例えば哺乳動物、例えばヒトのＬＥＣＴ２遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。組成物は、限定はされないが、経口、腹腔内、または頭蓋内（例えば脳室内、実質内および髄腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、気道（エアロゾル）、鼻腔内、直腸、および局所（バッカルおよび舌下）投与を含む非経口経路を含む、当業者に公知の任意の適切な手段によって投与され得る。
ある特定の実施形態では、組成物は静脈内注入または注射によって投与される。一部のそのような実施形態では、組成物は、静脈内注入のための脂質製剤化されたｓｉＲＮＡ（例えばＬＮＰ１１製剤などのＬＮＰ製剤）を含む。
他の実施形態では、組成物は皮下に投与される。一部のそのような実施形態では、組成物は、ＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡを含む。一部のそのような実施形態では、リガンドはｉＲＮＡを肝臓（例えば肝細胞）に標的化する。
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する当技術分野の業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価な方法および材料を、本開示において特徴とされるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書に記載される全ての論文、特許出願、特許、および他の参照は、その全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は例示のみであり、限定されることを意図しない。
特定の実施形態
１．ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に列挙したアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、ｄｓＲＮＡ、または薬学的に許容されるその塩。
２．ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、１５～３０ヌクレオチド長であるセンス鎖、および１５～３０ヌクレオチド長であり、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６、または７に列挙した標的配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドと相補的であるアンチセンス鎖を含む、ｄｓＲＮＡ、または薬学的に許容されるその塩。
３．少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１または２に記載のｄｓＲＮＡ。
４．センス鎖の５ヌクレオチド以下およびアンチセンス鎖の５ヌクレオチド以下が非修飾ヌクレオチドである、実施形態３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５．センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、実施形態３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６．１５～３０塩基対長である二重鎖領域を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
７．二重鎖領域が１７～２５塩基対長である、実施形態６に記載のｄｓＲＮＡ。
８．二重鎖領域が１９～２２塩基対長である、実施形態６または７に記載のｄｓＲＮＡ。
９．二重鎖領域が２１塩基対長である、実施形態６～８のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１０．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つから、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１１．センス鎖が、アンチセンス配列に相当する、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂのいずれか１つに列挙したセンス配列から、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１２．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つから、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも１７連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１３．センス鎖が、アンチセンス配列に相当する、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂのいずれかに１つ列挙したセンス配列から、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも１７連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１４．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つから、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも１９連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１５．センス鎖が、アンチセンス配列に相当する、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂのいずれか１つに列挙したセンス配列から、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも１９連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１６．アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６、または７のいずれか１つに列挙したアンチセンス配列の１つから、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも２１連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１７．センス鎖が、アンチセンス配列に相当する、表２Ａ、２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂのいずれか１つに列挙したセンス配列から、０、１、２、または３個のミスマッチを有する、少なくとも２１連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１８．相補的な領域が少なくとも１７ヌクレオチド長である、実施形態１～１７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１９．相補的な領域が２１ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長の間である、実施形態１～１８のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２０．相補的な領域が２３ヌクレオチド長である、実施形態１～１９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２１．各鎖が３０ヌクレオチド長以下である、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２２．少なくとも１つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２３．平滑末端を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２４．少なくとも１つの前記修飾ヌクレオチドが：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結される末端ヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態３～２３のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２５．少なくとも１つの前記修飾ヌクレオチドが：２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、グリコールヌクレオチド（ＧＮＡ）、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、実施形態３～２４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２６．ヌクレオチドの修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、ヘキシトールまたはヘキソース核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態３～２５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２７．ヌクレオチドの修飾が２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、または両方であり、およびＧＮＡでもよい、実施形態３～２６のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２８．センス鎖の５ヌクレオチド以下およびアンチセンス鎖の５ヌクレオチド以下が、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、非ロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）以外の修飾を含む、実施形態３～２７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
２９．薬剤が少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３０．ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が１つの鎖の３’端にある、実施形態２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３１．鎖がアンチセンス鎖である、実施形態３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３２．鎖がセンス鎖である、実施形態３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３３．ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が１つの鎖の５’端にある、実施形態３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３４．鎖がアンチセンス鎖である、実施形態３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３５．鎖がセンス鎖である、実施形態３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３６．１つの鎖の５’端および３’端のそれぞれが、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を含む、実施形態２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３７．鎖がアンチセンス鎖である、実施形態３６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３８．二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位の塩基対がＡＵ塩基対である、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３９．センス鎖が全部で２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が全部で２３ヌクレオチドを有する、実施形態３６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４０．センス鎖が少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
４１．リガンドがセンス鎖の３’末端に結合される、実施形態４０に記載のｄｓＲＮＡ。
４２．リガンドが炭水化物を含む、実施形態４０または４１に記載のｄｓＲＮＡ。
４３．リガンドがＧａｌＮＡｃリガンドである、実施形態４０～４２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
４４．リガンドが
Figure 2022546570000030
 である、実施形態４０～４３のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
４５．リガンドがリンカーを介して結合される、実施形態４０～４４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
４６．リンカーが二価または三価の分岐鎖リンカーである、実施形態４５に記載のｄｓＲＮＡ。
４７．リガンドおよびリンカーが式ＸＸＩＶ：
Figure 2022546570000031
 に示す通りである、実施形態４５に記載のｄｓＲＮＡ。
４８．リガンドがｄｓＲＮＡを肝細胞に標的化する、実施形態４０～４７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
４９．相補的な領域が、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に開示されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列からなる、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
５０．ｄｓＲＮＡが、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に開示されるセンス配列から選択されるセンス配列からなるセンス鎖、および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に開示されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖を含む、前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
５１．ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖がｇｓｇｓｕｃａｇＡｆｕＣｆＵｆＵｆｃａａａａｕａａａｕＬ９６（配列番号１４３）の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖がａｓＵｆｓｕｕａＵｆｕＵｆＵｆｇａａｇＡｆｕＣｆｕｇａｃｃｓｇｓｇ（配列番号１４４）の配列および全ての修飾を含む、ｄｓＲＮＡ。
５２．ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補的な領域が配列番号１のヌクレオチド６６９～６９１と実質的に相補的である、ｄｓＲＮＡ。
５３．前記実施形態のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
５４．類似の未処置の細胞と比較した場合、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのレベルまたはＬＥＣＴ２タンパク質のレベルが減少したヒト細胞であって、レベルが少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％減少してもよい、ヒト細胞。
５５．ヒト細胞を実施形態１～５２のいずれか１つに記載されるｄｓＲＮＡ剤と接触させることを含む方法によって産生された、実施形態３０に記載のヒト細胞。
５６．実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを含む、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
５７．ｄｓＲＮＡが非緩衝溶液中で投与される、実施形態５６に記載の医薬組成物。
５８．前記非緩衝溶液が生理食塩水または水である、実施形態５７に記載の医薬組成物。
５９．前記ｄｓＲＮＡが緩衝溶液によって投与される、実施形態５６に記載の医薬組成物。
６０．前記緩衝溶液が酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態５９に記載の医薬組成物。
６１．前記緩衝溶液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、実施形態５９または６０に記載の医薬組成物。
６２．脂質製剤を含む、実施形態５６～６１のいずれかに記載の医薬組成物。
６３．脂質製剤がＬＮＰ製剤である、実施形態６２に記載の医薬組成物。
６４．脂質製剤がＬＮＰ１１製剤である、実施形態６２または６３に記載の医薬組成物。
６５．ｄｓＲＮＡが肝臓細胞または肝細胞に標的化される、実施形態５６～６４のいずれかに記載の医薬組成物。
６６．静脈内に投与される、実施形態５６～６５のいずれかに記載の医薬組成物。
６７．皮下に投与される、実施形態５６～６５のいずれかに記載の医薬組成物。
６８．脂質製剤を含み、静脈内に投与される、実施形態６６に記載の医薬組成物。
６９．炭水化物リガンドまたはＧａｌＮＡｃリガンドから選択されるリガンドにコンジュゲートされるｄｓＲＮＡを含む、実施形態５６～６８のいずれか記載の医薬組成物。
７０．細胞においてＬＥＣＴ２発現を阻害する方法であって、
（ａ）実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを細胞に接触させること、例えば導入すること、および
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＬＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害すること
を含む、方法。
７１．細胞においてＬＥＣＴ２発現を阻害する方法であって、
（ａ）実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを細胞に接触させること、例えば導入すること、および
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、ＬＥＣＴ２ タンパク質、またはＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡもしくはＬＥＣＴ２タンパク質の両方のレベルを減少させるのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害すること
を含む、方法。
７２．細胞が、エクスビボ、インビトロ、またはインビボで処置される、実施形態７０または７１に記載の方法。
７３．細胞が、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害の処置、防止および／または管理を必要とする対象に存在する、実施形態７０～７２のいずれかに記載の方法。
７４．対象がヒトである、実施形態７３に記載の方法。
７５．前記障害がアミロイドーシスである、実施形態７３に記載の方法。
７６．アミロイドーシスがＬＥＣＴ２アミロイドーシスである、実施形態７５に記載の方法。
７７．細胞が肝臓細胞または肝細胞である、実施形態７０～７６のいずれかに記載の方法。
７８．ＬＥＣＴ２の発現が少なくとも２０％阻害される、実施形態７０～７７のいずれかに記載の方法。
７９．ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡおよび／またはＬＥＣＴタンパク質の発現が少なくとも５０％阻害される、実施形態７０～７８のいずれかに記載の方法。
８０．ＬＥＣＴ２の発現が少なくとも９０％阻害される、実施形態７０～７９のいずれかに記載の方法。
８１．ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害することが、対象からの生体試料（例えば血清試料）におけるＬＥＣＴ２タンパク質レベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる、実施形態７０～８０に記載の方法。
８２．ＬＥＣＴ２発現に関連する障害を処置する方法であって、治療有効量の
（ｉ）実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ、または
（ｉｉ）実施形態５６～５９のいずれかに記載の医薬組成物
を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
８３．ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを処置する方法であって、治療有効量の
（ｉ）実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ、または
（ｉｉ）実施形態５６～５９のいずれかに記載の医薬組成物
を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
８４．対象がアミロイド－シスを有するまたはアミロイドーシスを発症するリスクがある、実施形態８２または８３に記載の方法。
８５．アミロイドーシスがＬＥＣＴ２アミロイドーシスである、実施形態８２～８４のいずれかに記載の方法。
８６．処置することが、障害の少なくとも１つの兆候または症状の改善を含む［例えば障害がアミロイドーシス（例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシス）である］、実施形態８２～８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．アミロイドーシス、例えばＬＥＣＴ２アミロイドーシスの少なくとも１つの兆候または症状が、ある程度のアミロイド沈着またはＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）の存在もしくはレベルを含む、実施形態８６に記載の方法。
８８．処置することが、障害の進行の防止を含む、実施形態８２～８７のいずれかに記載の方法。
８９．処置することが、細胞、例えば肝細胞におけるＬＥＣＴ２の発現または活性を阻害するまたは減少させることを含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載の方法。
９０．処置することが、細胞におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも３０％の平均減少をもたらす、実施形態８９に記載の方法。
９１．処置することが、細胞におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも６０％の平均減少をもたらす、実施形態８９に記載の方法。
９２．処置することが、細胞におけるＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのベースラインからの少なくとも９０％の平均減少をもたらす、実施形態８９に記載の方法。
９３．対象がヒトである、実施形態８２～９２のいずれかに記載の方法。
９４．ｄｓＲＮＡが、対象に皮下または静脈内に投与される、実施形態７３～９３のいずれかに記載の方法。
９５．ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む組成物が投与レジメンに従って投与される、実施形態７０～９４のいずれかに記載の方法。
９６．投与レジメンが毎週、隔週、または毎月である、実施形態９５に記載の方法。
９７．ＬＥＣＴ２アミロイド沈着を減少させる、実施形態７０～９６のいずれかに記載の方法。
９８．対象においてＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを測定することをさらに含む、実施形態７３～９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．対象においてＬＥＣＴ２のレベルを測定することが、対象からの生体試料（例えば組織、血液、または血清試料）におけるＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２タンパク質またはＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、実施形態９８に記載の方法。
１００．血液検査、画像検査、または肝臓もしくは腎臓生検を実施することをさらに含む、実施形態７３～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．対象におけるＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを測定することが、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物による処置の前に実施される、実施形態９８～１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．対象が参照レベルよりも高いＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを有すると決定されると、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物が対象に投与される、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．対象におけるＬＥＣＴ２（例えばＬＥＣＴ２遺伝子、ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡ、またはＬＥＣＴ２タンパク質）のレベルを測定することが、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物による処置の後に実施される、実施形態９８～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する対象においてＬＥＣＴ２アミロイド沈着を減少させる方法であって、
（ｉ）実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ、または
（ｉｉ）実施形態５６～４９のいずれかに記載の医薬組成物
を対象に投与することを含む、方法。
１０５．ｄｓＲＮＡが０．０５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態８２～１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．ｄｓＲＮＡが対象の０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、実施形態８２～１０５のいずれかに記載の方法。
１０７．ｄｓＲＮＡがＬＮＰ製剤として製剤化され、０．１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態８２～１０６のいずれかに記載の方法。
１０８．ｄｓＲＮＡがＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされる、実施形態８２～１０７のいずれかに記載の方法。
１０９．ｄｓＲＮＡがＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量でもよい、実施形態８２～１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．実施形態１～５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするベクター。
１１１．実施形態１１０に記載のベクターを含む細胞。
実施例１ ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ
本明細書において提供される核酸配列は、標準の命名法を使用して表される。表１の略称を参照されたい。
Figure 2022546570000032
Figure 2022546570000033
Figure 2022546570000034
実験方法
バイオインフォマティクス
転写物
ヒトＬＥＣＴ２、「白血球由来ケモタキシン２」（ヒト：ＮＣＢＩ標準配列番号ＮＭ＿００２３０２．２；ＮＣＢＩ遺伝子番号：３９５０）および毒性学用種ＬＥＣＴ２オルソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５５７８４０；マウス：ＮＭ＿０１０７０２；ラット：ＮＭ＿００１１０８４０５）を標的化する１組のｓｉＲＮＡを、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＮＭ＿００２３０２ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン２は、１０７７塩基の長さを有する。ｓｉＲＮＡ組の設計についての原理および方法は、以下の通りである：１０位～１０７７位の全ての潜在的１９マーｓｉＲＮＡについての予測される有効性を、多数の脊椎動物遺伝子を標的化する２０，０００超の別個のｓｉＲＮＡ設計からのｍＲＮＡノックダウンの直接的測定に由来する直線モデルにより決定した。ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡのサブセットを、ヒトとカニクイザルとの完全なまたは完全に近い適合により設計した。さらなるサブセットを、ヒト、カニクイザル、およびマウスＬＥＣＴ２オルソログへの完全なまたは完全に近い適合により設計した。さらなるサブセットを、ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットＬＥＣＴ２オルソログへの完全なまたは完全に近い適合により設計した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを力まかせ探索（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）において使用して、ｓｉＲＮＡと標的種のトランスクリプトームにおける全ての潜在的整列との間のミスマッチの数および位置を測定した。本実施例においてアンチセンスオリゴヌクレオチドの２～９位として定義されるシード領域のミスマッチ、および本明細書においてアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０～１１位として定義されるｓｉＲＮＡの切断部位のミスマッチに余分な重みを与えた。ミスマッチの相対的重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位までの他の位置について２．８；１．２：１であった。最初の位置におけるミスマッチは無視した。各重み付けしたミスマッチの値を合計することにより、各鎖について特異性スコアを計算した。ヒトにおけるアンチセンススコアが２．２以上であり、予測される有効性が５０％以上のＬＥＣＴ２転写物ノックダウンであるｓｉＲＮＡに、優先度を与えた。例示的なオリゴ対を、表２Ａおよび表２Ｂ（１組）、ならびに表３Ａおよび表３Ｂ（別の組）において明示する。各組についての修飾配列を、それぞれ、表２Ａおよび表３Ａにおいて示す。各組についての非修飾配列を、それぞれ、表２Ｂおよび表３Ｂにおいて示す。
Figure 2022546570000035
Figure 2022546570000036
Figure 2022546570000037
Figure 2022546570000038
Figure 2022546570000039
Figure 2022546570000040
Figure 2022546570000041
Figure 2022546570000042
Figure 2022546570000043
Figure 2022546570000044
Figure 2022546570000045
Figure 2022546570000046
Figure 2022546570000047
Figure 2022546570000048
Figure 2022546570000049
Figure 2022546570000050
Figure 2022546570000051
Figure 2022546570000052
実施例２ ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
実験方法
細胞培養およびトランスフェクション：
カニクイザル初代肝細胞を、１ウェル当たり５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭおよび０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ． カタログ番号１３７７８－１５０）を、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり５．１μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に添加することにより、独立的にトランスフェクトし、室温において１５分間インキュベートした。その後、５ｘ１０３個のカニクイザル初代肝細胞を含有する４０μｌのＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ Ｍｅｄｉｕｍ（ＢｉｏＩＶＴカタログ番号Ｚ９９０２９）を、ｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後ＲＮＡ精製を行った。単一用量実験を、１０ｎＭ最終二重鎖濃度において行った。
ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用するＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットホームの自動化プロトコールを使用して、トータルＲＮＡを単離した。簡潔に説明すると、３μｌの磁気ビーズを含有する７０μｌのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒおよび１０μｌの溶解緩衝液を、細胞を含むプレートに添加した。プレートを電磁振盪機において室温にて１０分間インキュベートし、その後、磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。その後、ビーズに結合したＲＮＡを、１５０μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａにより２回、およびＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂにより１回洗浄した。その後、ビーズを、１５０μｌのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒにより洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ｃＤＮＡ合成：
ＡＢＩ ＨｉｇｈキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用してｃＤＮＡを合成した。１反応当たり１．２μｌの１０Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ、０．４８μｌの２５Ｘ ｄＮＴＰ、１．２μｌの１０ｘ Ｒａｎｄｏｍプライマー、０．６μｌのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、０．６μｌのＲＮアーゼ阻害剤、および７．９２μｌのＨ２Ｏを含有する１２μｌのマスターミックスを、上記において単離したＲＮＡに添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁振盪機において室温にて１０分間、続いて３７℃にて２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）の１ウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ９９９９９９０５）、０．５μｌのＬＥＣＴ２プローブ、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに添加した。カニクイザル初代肝細胞ｑＰＣＲを、カスタムカニクイザルＧＡＰＤＨプローブおよびカニクイザルＬＥＣＴ２プローブ（Ｍｆ０２８０３６７３＿ｍ１）によりプローブした。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用するＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）において、リアルタイムＰＣＲを行った。各二重鎖を、２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞について正規化した。相対的な倍の変化を計算するために、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を使用して分析し、２０ｎＭ ＡＤ－１９５５をトランスフェクトした細胞、または模擬トランスフェクト細胞により行ったアッセイについて正規化した。
結果
２組の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡによるサル初代肝細胞における単一用量スクリーニングの結果を、表４Ａ（表２Ａおよび表２ＢのｓｉＲＮＡに対応する）および表４Ｂ（表３Ａおよび表３ＢのｓｉＲＮＡに対応する）に示す。単一用量実験を、１０ｎＭ最終二重鎖濃度において行い、データを、ＡＤ－１９５５非標的化対照に対する残留メッセンジャーパーセントとして表す。
Figure 2022546570000053
Figure 2022546570000054
Figure 2022546570000055
Figure 2022546570000056
Figure 2022546570000057
実施例３ ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡのインビボスクリーニング
げっ歯類ＡＡＶモデルにおける３種の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの薬物動態
げっ歯類ＡＡＶモデルにおいて調査した３種の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ、ＡＤ－４５４７８１、ＡＤ－１３３３４６１、およびＡＤ－４５４７４６の配列および化学を、図２において示す。野生型Ｂ６／Ｃ５７マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ＡＡＶ８ウイルス粒子（２ｘ１０１１ｇｃ／マウス）中にパッケージングした、肝特異的プロモーター、ＴＢＧ下のヒトＬＥＣＴ２コンストラクトを静脈内注射した。２週間後、マウスに、図２において示される２ｍｇ／ｋｇの３種のＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡのうちの１種、またはＰＢＳ対照を皮下注射した。処置後１４日目に、肝臓を回収し、ｑＰＣＲ分析（実施例２において説明される通りに行った）を、ＬＥＣＴ２を特異的に認識するプローブにより行った。マウスＧＡＰＤＨを、正規化対照として使用した。肝臓におけるヒトＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの相対レベルを、デルタ／デルタＣｔ法により計算し、ＰＢＳ対照群について正規化し、図３のＹ軸において残留ＬＥＣＴ２パーセントとして示す。図３において見られる通り、ＡＤ－４５４７４６ ｓｉＲＮＡの投与は、肝臓ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの約７０％減少をもたらし；ＡＤ－１３３４６１ ｓｉＲＮＡは、６０％減少をもたらし；ＡＤ４５４７８１ ｓｉＲＮＡは、約８０％の最も大きな減少をもたらした。
また、ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳ対照のいずれかにより処置したマウスから、全血を回収した。処置前および処置後１４日目の両方に、全血をヘパリン処理した管に収集してヘパリン血漿を生成した。血漿を１：５０～１：７５に希釈し、ＬＥＣＴ２特異的ＥＬＩＳＡに供して、タンパク質の循環レベルを定量した。ＥＬＩＳＡを行うために、プレートを、１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した１００μＬのマウス抗ヒトＬＥＣＴ２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＭＡＢ７２２）により、４℃において一晩事前コーティングした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔにより洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡにより室温にて１時間ブロッキングし、その後、さらに５回洗浄した。その後、血漿試料（１ウェル当たり１００μＬ）をプレートに添加し、振盪（約６００ｒｐｍ）しながら室温にて１時間インキュベートした。ヒト血漿標準（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８４６７、５００μｇ／ｍｌ、ロット番号ＧＲ３２０２５２６－３）を対照として使用した。その後、プレートを５回洗浄し、検出抗体（ＡｂＤ３１０３８．２ 抗ｃｏｌ＿ｈＬＥＣＴ２、Ｆａｂ－Ｍａｘ－ＦＨ ＢｉｏＲａｄ）をプレートに添加し（１ウェル当たり１００μＬ）、その後、プレートを振盪（約６００ｒｐｍ）しながら室温にて１時間インキュベートした。続いて、プレートを５回洗浄し、ヒト抗細菌アルカリホスファターゼ：ＨＲＰ抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号ＨＣＡ２７５Ｐ）をウェルに添加し（１ウェル当たり１００μＬ）、その後、プレートを振盪（約６００ｒｐｍ）しながら室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いてＴＭＢ試薬（ＴＭＢ Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ カタログ番号ＴＭＢＳ－０１００－０１）を添加し、１０分間インキュベートした。その後、この反応を１００μＬの硫酸停止溶液（Ｎｏｖａ－Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ カタログ番号ＡＳＴＰ－０１００－０１）により抑制し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＬＥＣＴ２特異的ＥＬＩＳＡからの値を使用して、血漿ＬＥＣＴ２タンパク質の相対レベルを、投薬前タンパク質レベルについての正規化により計算し、これを図３のＹ軸において残留ＬＥＣＴ２パーセントとして示す。図３において見ることができる通り、ＡＤ－４５４７４６ ｓｉＲＮＡの投与は、血漿ＬＥＣＴ２タンパク質レベルの約７５％減少をもたらし；ＡＤ－１３３４６１ ｓｉＲＮＡは、７０％減少をもたらし；ＡＤ４５４７８１ ｓｉＲＮＡは、約８０％の最も大きな減少をもたらした。
カニクイザルにおける３種の例示的なＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの薬物動態
図２において示される３種のＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡを、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、図４Ａ～４Ｃ）の増大する用量においてカニクイザルに皮下注射した。処置前および図４Ａ～４ＣのＸ軸において示される処置後の様々な時点において、血漿をヘパリン処理した管に収集した。血漿ＬＥＣＴ２タンパク質の循環レベルを、ＥＬＩＳＡにより定量した。血漿ＬＥＣＴ２タンパク質の相対レベルを、処置前のタンパク質レベルについて正規化することにより計算し、これを図４Ａ～４ＣのＹ軸において血漿ＬＥＣＴ２タンパク質ノックダウンとして示す。図４Ａ～４Ｃにおいて見ることができる通り、３種のＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの全てが、３ｍｇ／ｋｇにおいて投与されたとき、タンパク質レベルの最も大きなノックダウンが観察されたように（図４Ｃ）、サイレンシングの用量依存的増加があった。しかしながら、０．３ｍｇ／ｋｇほどの低い各ｓｉＲＮＡを投与すると、ＬＥＣＴ２タンパク質の一部のノックダウンをもたらした（図４Ａ）。加えて、投与した全ての３つの用量にわたり、ＡＤ－４５４７８１ ｓｉＲＮＡは、処置後の全ての時点においてタンパク質レベルの最も大きなノックダウンをもたらした（図４Ａ～４Ｃおよび表５）。また、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／のいずれかにおいて投与したＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡの各々について、サルにおいて処置後２９日目に定量した血漿ＬＥＣＴ２タンパク質ノックダウンを、以下の表５に要約する。
Figure 2022546570000058
ＡＤ－８６４５９およびＡＤ－８６４６０ ｓｉＲＮＡによるげっ歯類におけるＬＥＣＴ２ノックダウンの評価
ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ、ＡＤ－８６４５９およびＡＤ－８６４６０（表６および７）、またはＰＢＳ対照を、ＳＤ－１ラット（図５Ａ）およびＣＤ－１マウス（図５Ｂ）に皮下注射した。実験処置および対照処置を、１０ｍｇ／ｋｇにおいて毎月投与した。最初の投薬後３、６、または１２カ月において肝臓を回収した。肝ＲＮＡを単離して、マウス／ラットＬＥＣＴ２に特異的なプライマーおよびプローブ、ならびにまた正規化対照であるマウス／ラットＧＡＰＤＨを使用して、ｑＰＣＲ分析（実施例２において説明される通りに行った）を行った。肝臓におけるげっ歯類ＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの相対レベルを、ΔΔＣｔ法を使用して計算し、ＰＢＳ対照について正規化し、これを図５Ａ～５ＢのグラフのＹ軸において発現倍数の差として示す。データは、図５において平均値±標準偏差により示し、各点は、個々のげっ歯類を表す。ラット（図５Ａ）およびマウス（図５Ｂ）の両方において、ＡＤ－８６４５９ ｓｉＲＮＡおよびＡＤ－８６４６０ ｓｉＲＮＡは、試料採取した、初回処置後の全ての時点において、肝臓におけるＬＥＣＴ２ ｍｉＲＮＡのほぼ完全なノックダウンをもたらした。
Figure 2022546570000059
Figure 2022546570000060
ＡＤ－８１７２５ ｓｉＲＮＡによるカニクイザルにおけるＬＥＣＴ２ノックダウンの評価
カニクイザルに、ＬＥＣＴ２ ｓｉＲＮＡ、ＡＤ－８１７２５、またはＰＢＳ対照を皮下注射した（図６Ａ～６Ｂ）。実験処置および対照処置を、３ｍｇ／ｋｇにおいて毎月投与した。最初の投薬後６カ月において肝臓を回収した。肝ＲＮＡを単離して、カニクイザルＬＥＣＴ２に特異的なプライマーおよびプローブ、ならびにまた正規化対照であるカニクイザルＧＡＰＤＨを使用して、ｑＰＣＲ分析（実施例２において説明される通りに行った）を行った。肝臓におけるカニクイザルＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの相対レベルを、ΔΔＣｔ法を使用して計算し、ＰＢＳ対照について正規化し、これを図６ＡのＹ軸において発現倍数の差として示す。データは、図６Ａにおいて平均値±標準偏差により示し、各点は、個々のサルを表す。ＡＤ－８１７２５ ｓｉＲＮＡは、初回投薬後６カ月においてサルの肝臓におけるＬＥＣＴ２ ｍｉＲＮＡのほぼ完全なノックダウンをもたらした。
また、処置前および初回処置後６カ月間の各月に、全血をヘパリン処理した管に収集した（図６Ｂ）。血漿を単離し、ヒト／カニクイザルＬＥＣＴ２タンパク質について特異的なＥＬＩＳＡによりＬＥＣＴ２タンパク質の循環レベルを測定するために使用した。ＬＥＣＴ２タンパク質の相対レベルを、処置前タンパク質レベルについて正規化することにより計算し、これを図６ＢのＹ軸において残留血漿ＬＥＣＴ２タンパク質として示す。ＡＤ－８１７２５ ｓｉＲＮＡは、サルにおいて血漿ＬＥＣＴ２タンパク質レベルの９９％超の減少をもたらし、これは、最初の投薬後に試料採取した各時点において観察された（図６Ｂ）。
均等物
当業者は、本明細書において説明される本開示の特定の実施形態についての多くの均等物を認識するか、またはルーチン実験に過ぎない実験を使用して確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されると意図される。

Claims (67)

  1. ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に列挙したアンチセンス配列の１つと３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、ｄｓＲＮＡ、または薬学的に許容されるその塩。
  2. ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、１５～３０ヌクレオチド長であるセンス鎖および１５～３０ヌクレオチド長であり、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６、または７に列挙した標的配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドと相補的であるアンチセンス鎖を含む、ｄｓＲＮＡ、または薬学的に許容されるその塩。
  3. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. １５～３０塩基対長である二重鎖領域を含む、前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 二重鎖領域が１７～２５塩基対長である、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. 二重鎖領域が１９～２２塩基対長である、請求項４または５に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. 二重鎖領域が２１塩基対長である、請求項４～６のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  8. 相補的な領域が少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１または３～７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  9. 相補的な領域が２１ヌクレオチド長～２５ヌクレオチド長の間である、請求項１または３～８のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  10. 相補的な領域が２３ヌクレオチド長である、請求項１または３～９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 平滑末端を含む、前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 少なくとも１つの前記修飾ヌクレオチドが：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結される末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３～１２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  14. 少なくとも１つの前記修飾ヌクレオチドが：２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、グリコールヌクレオチド（ＧＮＡ）、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、請求項３～１２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  15. ヌクレオチドの修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、ヘキシトールまたはヘキソース核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３～１２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  16. ヌクレオチドの修飾が２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、または両方、およびＧＮＡでもよい、請求項３～１２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  17. センス鎖が少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる、前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  18. リガンドがセンス鎖の３’端に結合される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. リガンドが炭水化物を含む、請求項１７または１８に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. リガンドがＧａｌＮＡｃリガンドである、請求項１７～１９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  21. リガンドが
    Figure 2022546570000061
     である、請求項１７～２０のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  22. リガンドがリンカーを介して結合される、請求項１７～２１のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  23. リンカーが二価または三価の分岐鎖リンカーである、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. リガンドおよびリンカーが式ＸＸＩＶ：
    Figure 2022546570000062
     に示す通りである、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ。
  25. リガンドがｄｓＲＮＡを肝細胞に標的化する、請求項１７～２４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  26. 相補的な領域が、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に開示されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列からなる、前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  27. ｄｓＲＮＡが、表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に開示されるセンス配列から選択されるセンス配列からなるセンス鎖、および表２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、６または７に開示されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖を含む、前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
  28. ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖がｇｓｇｓｕｃａｇＡｆｕＣｆＵｆＵｆｃａａａａｕａａａｕＬ９６（配列番号１４３）の配列および全ての修飾を含み、アンチセンス鎖がａｓＵｆｓｕｕａＵｆｕＵｆＵｆｇａａｇＡｆｕＣｆｕｇａｃｃｓｇｓｇ（配列番号１４４）の配列および全ての修飾を含む、ｄｓＲＮＡ。
  29. ＬＥＣＴ２の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、センス鎖および、ＬＥＣＴ２ ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補的な領域が配列番号１のヌクレオチド６６９～６９１と実質的に相補的である、ｄｓＲＮＡ。
  30. 前記請求項のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
  31. 請求項１～２９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを含む、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  32. ｄｓＲＮＡが非緩衝溶液中で投与される、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 前記非緩衝溶液が生理食塩水または水である、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 前記ｄｓＲＮＡが緩衝溶液によって投与される、請求項３１に記載の医薬組成物。
  35. 前記緩衝溶液が酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 前記緩衝溶液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項３４または３５に記載の医薬組成物。
  37. 脂質製剤を含む、請求項３１～３６のいずれかに記載の医薬組成物。
  38. 脂質製剤がＬＮＰ製剤である、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 脂質製剤がＬＮＰ１１製剤である、請求項３７または３８に記載の医薬組成物。
  40. ｄｓＲＮＡが肝臓細胞または肝細胞に標的化される、請求項３１～３９のいずれかに記載の医薬組成物。
  41. 静脈内に投与される、請求項３１～４０のいずれかに記載の医薬組成物。
  42. 皮下に投与される、請求項３１～４０のいずれかに記載の医薬組成物。
  43. 脂質製剤を含み、静脈内に投与される、請求項４１に記載の医薬組成物。
  44. 炭水化物リガンドまたはＧａｌＮＡｃリガンドから選択されるリガンドにコンジュゲートされるｄｓＲＮＡを含む、請求項３１～４３のいずれかに記載の医薬組成物。
  45. 細胞においてＬＥＣＴ２発現を阻害する方法であって、
    （ａ）請求項１～２９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡを細胞に接触させること、例えば導入すること、および
    （ｂ）工程（ａ）の細胞を、ＬＥＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞においてＬＥＣＴ２遺伝子の発現を阻害すること
    を含む、方法。
  46. 細胞が、エクスビボ、インビトロ、またはインビボで処置される、請求項４５に記載の方法。
  47. 細胞が、ＬＥＣＴ２発現に関連する障害の処置、防止および／または管理を必要とする対象に存在する、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記障害がアミロイドーシスである、請求項４７に記載の方法。
  49. アミロイドーシスがＬＥＣＴ２アミロイドーシスである、請求項４８に記載の方法。
  50. 細胞が肝臓細胞または肝細胞である、請求項４５～４９のいずれかに記載の方法。
  51. ＬＥＣＴ２の発現が少なくとも２０％阻害される、請求項４５～５０のいずれかに記載の方法。
  52. ＬＥＣＴ２の発現が少なくとも９０％阻害される、請求項４５～５１のいずれかに記載の方法。
  53. ＬＥＣＴ２発現に関連する障害を処置する方法であって、治療有効量の
    （ｉ）請求項１～２９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ、または
    （ｉｉ）請求項３１～４４のいずれかに記載の医薬組成物
    を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
  54. ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを処置する方法であって、治療有効量の
    （ｉ）請求項１～２９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ、または
    （ｉｉ）請求項３１～４４のいずれかに記載の医薬組成物
    を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
  55. 対象がアミロイド－シスを有するまたはアミロイドーシスを発症するリスクがある、請求項５２または５３に記載の方法。
  56. アミロイドーシスがＬＥＣＴ２アミロイドーシスである、請求項５３～５５のいずれかに記載の方法。
  57. ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む組成物が投与レジメンに従って投与される、請求項４５～５６のいずれかに記載の方法。
  58. 投与レジメンが毎週、隔週、または毎月である、請求項５７に記載の方法。
  59. ＬＥＣＴ２アミロイド沈着を減少させる、請求項４５～５８のいずれかに記載の方法。
  60. ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する対象においてＬＥＣＴ２アミロイド沈着を減少させる方法であって、
    （ｉ）請求項１～２９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ、または
    （ｉｉ）請求項３１～４４のいずれかに記載の医薬組成物
    を対象に投与することを含む、方法。
  61. ｄｓＲＮＡが０．０５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５３～６０のいずれかに記載の方法。
  62. ｄｓＲＮＡが対象の０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、請求項５３～６１のいずれかに記載の方法。
  63. ｄｓＲＮＡがＬＮＰ製剤として製剤化され、０．１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５３～６２のいずれかに記載の方法。
  64. ｄｓＲＮＡがＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされる、請求項５３～６３のいずれかに記載の方法。
  65. ｄｓＲＮＡがＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量でもよい、請求項５３～６４のいずれかに記載の方法。
  66. 請求項１～２９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするベクター。
  67. 請求項６６に記載のベクターを含む細胞。
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